AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIHIPERKOLESTEROLEMIA EKSTRAK DAUN CENGKEH (Eugenia aromatica O.K) PADA KELINCI
A. MU’NISA G361030071
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
i
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Agustus 2009
A. Mu’nisa NRP G361030071
ii
ABSTRACT A. MU’NISA. Antioxidant and Antihypercholesterolemic Activities of Clove Leave Extract (Eugenia aromatica O.K) in Rabbits. Under the directions of WASMEN MANALU, TUTIK WRESDIYATI, and NASTITI KUSUMORINI. Clove components and their active principles are potential antioxidants. There has been limited report on the total phenol components of clove leave extract and the potency of clove leave extract as an antioxidant, antihypercholesterolemic, and its function as an antiatherosclerosis in rabbit has not been explored. The objectives of this research were: (1) To study the effective method of extraction that can provide the highest yield, total phenol, and antioxidant activities of water, methanol, and ethanol extracts of clove leave, and phytochemical components methanol extracts of clove leave, (2) To study serum lipid profiles, intracellular antioxidant profiles, histological changes in liver and kidney and atherosclerosis lesion on the aorta of hypercholesterolemic rabbits fed clove leave extract. The research was divided into two stages. (1) In vitro experiment, analyzing total phenol, yield, and antioxidant activities of water, methanol, ethanol extract of clove leave, and phytochemical components of methanol extracts of clove leave. (2) In vivo experiments, using twenty seven male New Ze aland rabbits. The rabbits were divided into nine groups; (1) negative control group, (2) positive control (hypercholesterolemic) group, which were fed diet containing 1% cholesterol for 50 days; (group 3 to group 5) preventive groups, (group 6 to group 8) curative group, and (9) group give n clove leaf extract and cholesterol simultaneously. The dose of clove leaf extract was 1 g/kg/bw/day. The result indicated that methanol ext ract of clove leave contained total phenol and antioxidant activity that was higher than water extract, ethanol extract, and α-tokoferol. The effects of clove leaf extract were investigated in vivo for their antioxidant and antihypercholesterolemic activities. In general, clove leaf extract treatment showed a significant decrease MDA, and a significant increase in SOD, catalase, and GPX level, and Cu-Zn-SOD content in liver and kidney tissue . This suggested that clove leaf extract reduced oxidative stress, thereby prevented the generation of free radical. The present study demonstrated that clove leaf extract reduced the cholesterol level wih a significant increase in antioxidant activity, as evident of significant reduction in LDL parameter, and finally inhibited development of atherosclerosis. The optimum effects were showed in both preventive and curative groups for 30 days of clove leaf extract and in the group that was simultaneously treated with clove leaf extract and fed 1% cholesterol for 50 days. This results indicated that clove leaf extract had significant antioxidant activities, and the clove leaf extract diet exhibited antihypercholesterolemic action in hipercholesterolemic rabbits, which was accompanied by modulation of cholesterol metabolism and increase in liver and kidney antioxidant activities. Key Words: Eugenia aromatica, antihypercholesterolemic, intracellular antioxidant, atherosclerosis, Cu,Zn-SOD iii
RINGKASAN A.MUNISA. Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci. Dibimbing oleh WASMEN MANALU, TUTIK WRESDIYATI, dan NASTITI KUSUMORINI. Cengkeh adalah salah satu jenis tanaman rempah khas Indonesia. Setiap bagian tanaman cengkeh baik pada bunga, tangkai bunga, dan daun mengandung beberapa komponen bioaktif fenol, yaitu eugenol, asetil eugenol, kariofelin, eugenia, vanillin, dan asam galotanin. Komponen bioaktif fenol pada tanaman cengkeh khususnya pada daun cengkeh belum banyak dilaporkan dan potensinya sebagai antioksidan, antihiperkolesterolemia, dan antiaterosklerosis secara in vivo belum banyak diketahui. Sehubungan dengan ketersediaan daun cengkeh yang cukup banyak dan lebih bersifat ekonomis dibanding bila menggunakan kuncup bunga , maka dilakukan kajian secara ilmiah untuk mengetahui aktivitas antioksidatif komponen total fenol yang terkandung dalam ekstrak daun cengkeh baik secara in vitro maupun in vivo dalam mencegah dan memperbaiki kerusakan jaringan yang ditimbulkan akibat kondisi hiperkolesterolemia. Tujuan penelitian ini adalah untuk (1) menentukan komponen fitokimia daun cengkeh dan ekstraknya, (2) menentukan jenis pelarut ekstraksi yang dapat menghasilkan ekstrak daun cengkeh dengan aktivitas antioksidan paling tinggi, (3) menge valuasi secara in vivo daya antihiperkolesterolemia dan kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh baik secara kimiawi (katalase, superoksida dismutase, dan glutatio n peroksidase) maupun secara imunohistokimia (Cu, Zn-SOD) pada kelinci hiperkolesterolemia, (4) menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh dalam melindungi oksidasi LDL jaringan hati dan ginjal kelinci, dan (5) menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh sebagai pencegah aterosklerosis dan kelainan histologi hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia. Penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap utama, yaitu: (1) Uji in vitro ekstrak daun cengkeh, (2) Uji in vivo ekstrak metanol daun cengkeh pada kelinci. Penelitian secara in vitro diawali dengan penentuan rendemen, total fenol, dan aktivitas antioksidan dari ekstrak akuades, metanol, dan etanol daun cengkeh. Kemudian dilakukan analisis kandungan fitokimia dan dilanjutkan analisis kandungan eugenol dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak metanol daun cengkeh. Pengujian secara in vivo menggunakan 27 ekor kelinci jantan tipe New Zealand . Kelinci dibagi ke dalam 9 kelompok perlakua n. Kelompok kontrol negatif (kelompok 1), diberi pakan standar. Kelompok kontrol positif (kelompok 2) diberi pakan yang mengandung 1% kolesterol selama 50 hari. Kelompok preventif, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari selama 10 hari (kelompok 3), 20 hari (kelompok 4), dan 30 hari (kelompok 5) sebelum mengkonsumsi kolesterol 1% selama 50 hari. Kelompok kuratif, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari selama 10 hari (kelompok 6), 20 hari (kelompok 7), dan 30 hari (kelompok 8) setelah mengkonsumsi kolesterol 1% selama 50 hari, dan kelompok 9, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari dan kolesterol 1% secara bersamaan selama 50 hari. iv
Pada akhir pemberian perlakuan, kelinci dikorbankan, segera setelah mati, organ hati, ginjal, dan aorta dikoleksi. Organ hati dan ginjal diuji kadar malondialdehid (MDA), uji aktivitas enzim antioksidan baik secara kimiawi (superoksida dismutase, katalase, dan glutatio n peroksidase) maupun secara imunohistokimia (Cu, Zn-SOD), serta gambaran histologi ha ti dan ginjal dengan pewarnaan hematoksilin- eosin. Organ aorta digunakan untuk melihat adanya pembentukan plak aterosklerosis dengan pewarnaan Verhoeff-von Gieson. Ekstrak metanol daun cengkeh mengandung total fenol sebesar 63.14±1.86 mg/ml lebih tinggi dibanding ekstrak etanol (56.58±3.80 mg/ml) dan ekstrak ak uades (32.42±3.86 mg/ml), serta mengandung senyawa eugenol, flavonoid, tannin, triterpenoid, dan saponin. Potensi antioksidan ekstrak metanol lebih tinggi dari αtokoferol, ekstrak akuades, dan etanol dengan faktor protektif berturut-turut 10.56, 8.42, 6.25, dan 7.39. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa kelompok kelinci preventif dan kuratif yang diberi ekstrak daun cengkeh selama 30 hari dan 50 hari yang diberi kolesterol secara bersamaan mampu mencegah hiperkolesterolemia, dengan penurunan secara nyata (P<0.05) kadar kolesterol total, low density lipoprotein (LDL), dan trigliserida serta meningkatkan high density lipoprotein (HDL) serum. Demikian pula halnya dengan enzim antioksidan (katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase) meningkat secara nyata (P <0.05) dan kadar MDA menurun secara nyata (P<0.05) baik pada hati maupun ginjal kelinci. Hasil pewarnaan secara imunohistokimia menunjukkan terjadinya penurunan secara nyata (P<0.05) kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia sementara kelompok kelinci preventif dan kuratif yang diberi ekstrak daun cengkeh selama 30 hari dan 50 hari diberi kolesterol secara bersamaan memperlihatkan peningkatan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang terlihat pada inti dan sitoplasma sel hati dan sel tubuli renalis. Selain itu juga kejadian aterosklerosis, perlemakan hati, dan pengendapan protein pada ginjal dapat dicegah. Secara umum dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun cengkeh dengan kandungan total fenolnya berpotensi sebagai senyawa antioksidatif, antihiperkolesterolemia, serta dapat mencegah kejadian aterosklerosis, perlemakan hati, dan pengendapan protein pada ginjal. Kata kunci : Eugenia aromatica, antihiperkolesterolemia, antioksidan intrasel, aterosklerosis, Cu,Zn-SOD
v
Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruhnya karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruhnya karya tulis dalam bentuk laporan apa pun tanpa izin IPB.
vi
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIHIPERKOLESTEROLEMIA EKSTRAK DAUN CENGKEH (Eugenia aromatica O.K) PADA KELINCI
A. MU’NISA G361030071
Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
vii
Judul Disertasi
: Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci
Nama
: A. Mu’nisa
NRP
: G361030071
Program Studi
: Biologi
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Ir. Wasmen Manalu, Ph.D Ketua
Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D Anggota
Nastiti Kusumorini, Ph.D Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
viii
PRAKATA Puji syukur penulis sampaikan ke hadirat Allah SWT, karena izinNya pene litian dan penulisan disertasi ini dapat diselesaikan. Disertasi ini ditulis dalam rangka memenuhi persyaratan bagi penulis dalam memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana IPB Bogor. Disertasi ini diberi judul “Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci”. Ucapan terima kasih penulis sampaik an kepada Prof. Ir. Wasmen Manalu, Ph.D sebagai ketua pembimbing, drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D dan Nastiti Kusumorini, Ph.D sebagai anggota pembimbing atas arahan, bimbingan, dan bantuan baik moril maupun materil sebelum, selama maupun setelah penelitian dilaksanakan sampai selesainya penulis mendapatkan gelar Doktor di SPs IPB. Ucapan terima kasih juga kepada penulis sampaikan kepada Dr. drh. Hera Maheswari, MS dan Dr. drh. Wiwin Winarsih, M.Si sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup dan Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadin, MS dan drh. Yulv ian Sani, Ph.D sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka, atas segala masukan dan tambahan bagi kelengkapan disertasi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh kepala dan staf laboratorium di lingkungan IPB, yaitu Laboratorium Fisiologi dan Histologi Departemen Anatomi Fsisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Biokimia Pangan di Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium kimia analitik Departemen Kimia Fakultas MIPA, dan Kandang Hewan Percobaan FKH. Kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta yang telah menanamkan dasar pendidikan sejak kecil yang begitu berarti sampai penulis menyelesaikan pendidikan studi S3, untuk semua bimbingan, doa, dan restu penulis ucapkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada beliau. Ucapan yang sama penulis juga sampaikan kepada kakakku tersayang A. Muflihunna, S.Si, M.Si., Apt. Selain itu juga ucapan terima kasih penulis kepada Pama nda di Bekasi Kol. (Purn) A. Faishal Rusmah dan seluruh keluarga besar beliau. Tidak lupa juga penulus ucapkan terima kasih kepada teman-teman, kepada drh. Yulia Yellita, MS. dan keluarga, Dr Sussi Astuti dan keluarga, Dr Yusfiana Fitrial dan ix
keluarga, Dr. Ruqiah Ganda Putri Panjaitan, Dr. Wiharto C dan keluarga, Muhammad Wijaya MSi, dan juga teman-teman lainnya khususnya dari Program Studi Biologi SPs IPB. Untuk suami tercinta Surahmat Anwar SH dan anakku terkasih Afifah Luthfiati yang selama ini telah mendampingi dan mendukung setiap langkah penulis selama menyelesaikan studi. Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua teman dan kerabat yang tidak dapat saya sebutklan satu persatu yang telah banyak memberi bantuan baik moril dan materi, semoga disertasi ini dapat memperkaya khasana ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang Biologi dan berguna bagi bangsa dan negara.
Bogor, Agustus 2009
Penulis
x
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Makassar pada tanggal 26 Mei 1972, anak dari Bapak Drs. Tuang Radja Syamsu (Alm) dan Ibu A. St. Farida Rusma. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Pada tahun 2005 penulis menikah dengan Surahmat SH dan dikaruniai seorang putri bernama Afifah Luthfiati pada tahun 2006. Pada tahun 1990, penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas Negeri 11 di Makassar, kemudian melanjutkan studi pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin di Makassar pada tahun 1991 dan menyelesaikan sarjana (S.Si) pada tahun 1997. Pada tahun 1999 penulis melanjutkan studi pada Program Studi Biologi Pascasarjana Universitas Gadja Mada di Yogyakarta dan menyelesaikan Magister Sains (M.Si) pada tahun 2002. Selanjutnya penulis mengikuti studi Program Doktor S3 pada Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana IPB di Bogor pada bulan Agustus 2003. Dan penulis bekerja sebagai staf pengajar Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Negeri Makassar di Makassar dari tahun 1998 sampai sekarang. Karya ilmiah dengan judul “Pemanfaatan Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia Aromatika) untuk Mengatasi Kelainan Antioksidan pada Hati dan Ginjal Di Bawah Kondisi Hiperkolesterolemia” telah diseminarkan pada Seminar Nasional
XIII
PERSADA di Bogor pada tanggal 9 Agustus 2007. Karya ilmiah dengan judul “Perbaikan Aktivitas Antioksidan pada
Jaringan
Kelinci di
Bawah
Kondisi
Hiperkolesterolemia dengan Pemberian Ekstrak Daun Cengkeh” telah diterbitkan pada Jurnal Veteriner Volume 9, Nomor 4, Desember 2008. Kedua karya tersebut merupakan bagian dari disertasi penulis.
xi
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ……………………………………………………….
ix
DAFTAR TABEL ………………………………………………….
xii
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………
xii xiv
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………… PENDAHULUAN …………………………………………………. Latar Belakang …………………………………………….. Tujuan Penelitian …………………………………………... Hipotesis Penelitian ………………………………………… Kegunaan Penelitian ……………….…….………… .……...
1 1 5 5 6
TINJAUAN PUSTAKA …………………… .……………………… Hiperkolesterolemia….……………… .……………………... Aterosklerosis ……………………………………………… Hubungan Hiperkolesterolemia dan Radikal Bebas………… Peroksidasi Lipid ……………………………..…………….. Antioksidan …………………………………………………. Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) ..……………………….
7 7 9 12 15 18 21
BAHAN METODE…………………………………………………. Waktu dan Tempat Penelitian ……………………………. Bahan dan Alat …………………………………………… Metode Penelitian ………………………………………… A. Uji in vitro Ekstrak Daun Cengkeh …………….……… I. Ekstraksi Daun Cengkeh……………..……….......... Rendemen dan Total Fenol Ekstrak Daun Cengkeh …………………………………….. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Cengkeh…………….…………………………….. II. Komponen Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Cengkeh…………………………… ..………………
26 26 26 28 28 28
B. Uji In vivo Ekstrak Metanol Daun Cengkeh pada Kelinci I. Analisis Profil Lipid Serum Kelinci …...……………. Kadar Kolesterol Total Serum ………………………. Kadar HDL Serum……………….…………..………. Kadar Trigliserida……………….…………… ...……. Kadar LDL …………………………………… ..……. Indeks Aterogenik ……………………………………
32 35 35 36 36 36 37
29 29 30
xii
II. Kapasitas Antioksidatif Ekstrak Daun Cengkeh pada Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci …………………… II.1 Kadar Malondialdehid (MDA)……………………… II.2 Aktivitas Enzim Antioksidan……………………….. Superoksida Dismutase (SOD)………………….… Aktivitas Katalase……………………… ...……….. Aktivitas Glutation Peroksidase (GPx)……………… III. Kandungan Antioksidan Cu,Zn-SOD pada Jaringan Hati dan Ginjal Secara Imunohistokimia……………………. IV. Pengamatan Histologi Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci………………………………………………..…. V. Pemeriksaan Lesi Aterosklerosis Aorta Kelinci… ……… Analisis Data…………………………………………………. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………. A. Uji in vitro Ekstrak Daun Cengkeh……………………… I. Ekstraksi Daun Cengkeh …………………………….. Rendemen dan Total Fenol Ekstrak Daun Cengkeh…. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Cengkeh………. II. Komponen Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Cengkeh………………………………………………
37 37 38 38 39 40 41
B. Uji In vivo Ekstrak Metanol Daun Cengkeh pada Kelinci I. Analisis Profil Lipid Serum…………………….. II. Kapasitas Antioksidatif Ekstrak Daun Cengkeh pada Jaringan Hati dan Ginjal …………………………….. Kadar Malonaldehid (MDA)……………………… Aktivitas enzim antioksidan…..………………….. III. Kandungan Antioksidan Copper, Zinc-Superoxida Dismutase (Cu, Zn-SOD) pada Jaringan Hati dan Ginjal……………………………………………… IV. Gambaran Histologi Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci V. Kejadian Aterosklerosis pada Aorta Kelinci ………..
50 50
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………...
87
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………
89
LAMPIRAN ………………………………………………………..
97
42 43 43 44 44 44 44 45 48
58 58 61
66 69 79
xiii
DAFTAR TABEL Halaman 1. Susunan ransum standar per 200 kg bahan (BPT Ciawi, Bogor)…….
27
2. Kandungan nutrisi ransum standar per 100 g bahan ……….…………
27
3. Perolehan sediaan rendemen dan total fenol pada daun cengkeh dengan menggunakan pelarut aquades, metanol, dan etanol… ….…….
45
4. Hasil uji fitokimia ekstrak dan simplisia daun cengkeh…….………….
48
5. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada kadar kolesterol total dan LDL serum darah kelinci …….…...
52
6. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada kadar kolesterol HDL dan trigliserida serum darah kelinci ……………………………………
55
7. Indeks Aterogenik pada Kelinci……………………………………….
57
8. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaa n dengan kolesterol pada kadar MDA hati dan ginjal kelinci ………………………………………………..……..
59
9. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada aktivitas enzim antioksidan SOD, katalase, dan GPx pada hati kelinci ………………
62
10. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada aktivitas enzim antioksidan SOD, katalase, dan GPx ginjal kelinci ………………….
63
11. Rataan jumlah sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD per lapang pandang ……………………….…………………………
67
12. Rataan jumlah sel tubulus renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu, Zn-SOD per lapang pandang ……..……………………………..
69
13. Rataan jumlah butiran lemak pada jaringan hati per lapang pandang …………………………………………………………….…….…..
73 xiv
14. Rataan jumlah corpus renalis dengan pengendapan protein pada jaringan ginjal per lapang pandang (40x)………………………..…
75
15. Rataan pembentukan lesi aorta…...……………………………….
79
xv
DAFTAR GAMBAR .
Halaman
1. Awal kejadian aterosklerosis ………………………………………….
11
2. Reaksi peroksidasi lipid ………………………………………………..
17
3. Eugenia aromatica O.K……………………………………………….
22
4. Proses ekstraksi daun cengkeh secara refluks………………………….
29
5. Skema pembagian kelompok perlakuan pada kelinci………………….
34
6. Nilai absorbansi kontrol (PBS), α-tokoferol, dan ekstrak daun cengkeh dengan pelarut akuades, metanol, dan etanol………………….………
46
7. Nilai periode induksi dan faktor protektif antioksidan kontrol (PBS), α-tokoferol, dan daun cengkeh dengan pelarut akuades, metanol, dan etanol………………………………………………………………….
47
8. Kromatogram hasil fraksinasi komponen nonvolatil ekstrak metanol daun cengkeh dengan kromatografi lapis tipis (KLT)………………
49
9. Mekanisme penghambatan eugenol terhadap peroksidasi lipid ……… .
50
10. Fotomikrograf jaringan hati kelinci perlakuan. Pewarnaan imunohistokimia terhadap kandungan Cu,Zn-SOD. Skala 50 µm..........
71
11. Fotomikrograf jaringan ginjal kelinci. Pewarnaan imunohistokimia kandungan Cu,Zn-SOD. Skala 50 µm.....................................................
72
12. Fotomikrograf jaringan hati kelinci. Pewarnaan Hematoksilin Eosin. Skala 50 µm.…………………………………………………………
76
13. Fotomikrograf jaringan ginjal kelinci. Pewarnaan Hematoksilin Eosin. Skala 50 µm. ………………………………………………..
78
14. Fotomikrograf aorta kelinci. Pewarnaan Verhoeff–von Gieson. Skala 100 µm.........................................................................................
82
xvi
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Proses pembuatan sediaan ……………………………………………..
97
2. Pereaksi dan prosedur analisis MDA…………………………………..
97
3. Kurva standar MDA …………………………………………………
98
4. Prosedur dan pereaksi untuk analisis SOD……………………………..
99
5. Kurva standar SOD……………………………………………………
100
6. Pereaksi dan prosedur analisis katalase ………………………………
100
7. Kurva standar katalase ………………………………………………..
102
8. Pereaksi dan prosedur analisis aktivitas glutation peroksidase……….
102
9. Prosedur pewarnaan Cu-ZnSOD secara imunohistokimia ………….
104
10. Proses pewarnaan hemotoxylin eosin (HE) ………………………...
105
11. Pemeriksaan lesi aterosklerosis……………………………………….
106
12. Analisis ragam pengaruh jenis pelarut akuades, metanol, dan etanol pada kadar total fenol daun cengkeh………………………………
107
13. Aktivitas antioksidan ekstrak akuades, metanol, dan etanol jika dibanding dengan α-tokoferol………………………………………
108
14. Regresi linear, periode induksi dan faktor protektif…………………..
109
15. Analisis ragam periode induksi ekstrak akuades, metanol, dan etanol………………………………………………………………….
109
16. Uji beda Duncan periode induksi ekstrak akuades, metanol, etanol, dan α-tokoferol ……………………………………………………..
109
17. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol total serum darah kelinci pada tahap awal………..
110
18. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol total serum darah kelinci pada tahap akhir ………
111 xvii
19. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol LDL serum darah kelinci pada tahap awal….……....
111
20. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol LDL serum darah kelinci pada tahap akhir..……….
112
21. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol HDL serum darah kelinci pada tahap awal………..
113
22. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar kolesterol HDL serum darah kelinci pada tahap akhir………
113
23. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar trigliserida serum darah kelinci pada tahap awal…………….
114
24. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar trigliserida serum darah kelinci pada tahap akhir…………....
115
25. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar MDA hati kelinci……………………………………………….
115
26. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kadar MDA ginjal kelinci……………………………………………..
116
27. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas SOD hati kelinci …………………………………………
117
28. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas SOD ginjal kelinci …………………………………………
117
29. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas katalase hati kelinci ………………………………………..
118
30. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas katalase ginjal kelinci ………………………………………
119
31. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas GPx hati kelinci ……………………………………………
119
32. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk aktivitas GPx ginjal kelinci …………………………………………..
120
33. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD hati (negatif)……………………………….
121 xviii
34. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD hati (positif 1)……………………………….
121
35. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD hati (positif 2) ……………………………...
122
36. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD hati (positif 3) ……………………………...
123
37. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (negatif) …………………………….
123
38. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 1)…………………………….
124
39. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 2) ……………………………
125
40. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 3) …………………………..
125
41. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk perlemakan hati ……………………………………………………..
126
42. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk jumlah corpusculus renalis dengan endapan protein ……………………………………………………………………..…
127
43. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk plak aterosklerosis…………………………………………………..
127
44. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk indeks aterogenik ……………………………………………………………….. 128 45. Histogram Bobot Kelinci…………………………………………..
129
xix
