AKTIVITAS ANTIFUNGI EKSTRAK BUAH SELEDRI ANTIFUNGAL ACTIVITY OF CELERY FRUITS EXTRACT Indah Purwantini, Djoko Santosa, Heru Agus Cahyanto Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
ABSTRAK Tanaman seledri (Apium graveolens L.) secara empiris telah digunakan untuk pencegahan atau pengobatan fluor albus yang disebabkan oleh fungi Candida albicans. Untuk mendukung penggunaannya di masyarakat luas maka perlu dilakukan penelitian sebagai dasar ilmiah. Buah seledri yang telah diambil minyak atsirinya diekstraksi secara bertingkat menggunakan petroleum eter dan metanol dengan menggunakan Soxhlet. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuji aktivitas antifunginya terhadap C. albicans menggunakan metode difusi agar dan dilusi cair. Untuk mengetahui senyawa aktif antifungi digunakan metode bioautografi. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak petroleum eter lebih aktif dalam menghambat pertumbuhan C. albicans dibandingkan ekstrak metanol dengan rata-rata diameter hambatan masing-masing 25 mm dan 12 mm. Dengan metode dilusi cair diketahui harga KBM ekstrak petroleum eter sebesar 5 mg %. Hasil bioautografi menunjukkan bahwa terdapat 2 senyawa aktif dalam ekstrak petroleum eter, yaitu senyawa dengan hRf 44 dan 78 yang merupakan senyawa terpenoid dan komponen minyak atsiri. Kata kunci: seledri, antifungi, C. albicans
ABSTRACT Celery (Apium graveolens L.) have been used empirically to prevent or cure fluor albus which caused by fungi C. albicans. This research had been conducted to give a scientific background to develop this plant as a source of traditional medicine Celery fruit was distilled to obtain its essential oil then the fruit was extracted with wash benzene and continued with methanol by using Soxhlet. These extracts were tested for antifungal activity against C. albicans using agar diffusion and broth dilution method. Bioautography method was used to identify the active compound. Result showed that wash benzene extract was more active against C. albicans than methanol extract with zone of inhibition 25 mm and 12 mm respectively. MBC value of wash benzene extract was 5 mg %. Bioautography showed that there were 2 active spots with hRf values of 44 and 78. Those compounds were terpenoid and one of the essential oil component. Key words: celery, antifungal, C. albicans
PENDAHULUAN Fluor albus merupakan gejala yang timbul akibat vaginitis. Penyakit ini terutama disebabkan oleh fungi C. albicans (Krieger dan Alderete, 1999). Beberapa obat modern yang biasa digunakan untuk terapi penyakit ini adalah obat-obat antifungi golongan azol, diantaranya ketokonazol, flukonazol dan mikonazol (Siswandono dan Sukardjo, 1995). Walaupun telah banyak obat-obat modern yang beredar, banyak masyarakat yang masih menggunakan obat tradisional untuk terapi penyakit. Bahkan penggunaan tanaman sebagai alternatif pengobatan mengalami peningkatan. Beberapa negara di Eropa seperti Jerman, juga mengalami peningkatan dalam konsumsi obat tradisional. Nilai penjualan sediaan obat dari tanaman pada apotek-apotek di Jerman mencapai sekitar 30 % dari total nilai penjualan obat-obat bebas (Sampurno, 2002). Di Amerika Serikat jumlah pengguna tumbuhan dan produk tumbuhan obat juga mengalami pertumbuhan yang sangat pesat (Suganda, 2002). Sebagai negara yang memiliki keanekaragaman hayati terbesar nomor 2 di dunia, Indonesia sangat kaya akan sumber-sumber bahan yang bisa dimanfaatkan dan dikembangkan sebagai obat tradisional. Hal ini merupakan peluang yang harus dapat dimanfaatkan karena hampir 119 senyawa obat modern merupakan hasil pengembangan dari senyawa yang terdapat dalam tanaman obat (Sampurno, 2002). Tanaman seledri merupakan salah satu tanaman yang telah banyak digunakan sebagai obat tradisional. Menurut Sudarsono dkk. (1996), tanaman seledri telah digunakan oleh masyarakat untuk mengatasi gejala fluor albus. Selain itu, tanaman ini juga telah dikenal luas dalam terapi hipertensi, pemacu enzim pencernaan, diuretik, mengurangi rasa sakit, dan sedatif. Tanaman ini merupakan tanaman yang populer sebagai sayuran, dengan bau yang sedap dan khas. Seluruh herba mengandung minyak atsiri, apiin, isokuersetin, umbeliferon, asparagin,
glutamin, kholin, provitamin A, vitamin B, dan C. Buahnya mengandung bergapten,
seselin, isoimperatorin, astenol, isopimpinelin, dan apigrafin (Sudarsono dkk., 1996). METODOLOGI PENELITIAN Bahan penelitian: Buah seledri yang diambil dari Cangkringan, Sleman; petroleum eter dan metanol berderajat teknik, fungi C. albicans, media Sabouroud’s dekstrosa, tween 20 konsentrasi 5%, silika gel GF254 (E. Merck), n-heksana dan etilasetat berderajat pro analysis, pereaksi semprot: anisaldehid-asam sulfat, besi (III) klorida, Dragendorff, dan Sitroborat. Alat penelitian : seperangkat alat Soxhlet, waterbath, seperangkat alat untuk KLT, piring Petri, LAF cabinet, inkubator, autoclave, alatalat gelas. Jalannya penelitian: Pembuatan ekstrak petroleum eter dan ekstrak metanol. Buah seledri yang telah kering ditimbang sebanyak 30 gram, kemudian didestilasi untuk mengambil minyak atsirinya. Setelah minyak atsiri terambil semua, buah diambil dan dikeringkan kembali. Sedikit demi sedikit buah dimasukkan ke dalam selongsong yang terbuat dari kertas saring dan diekstraksi dengan petroleum eter menggunakan Soxhlet. Apabila penyarian telah sempurna, ekstraksi dihentikan. Cairan yang diperoleh diuapkan di atas waterbath dan dibantu dengan kipas angin sampai semua pelarut menguap. Ekstrak kental yang diperoleh ini disebut dengan ekstrak petroleum eter. Sisa buah seledri di atas kemudian diuapkan pelarutnya dan dikeringkan, kemudian diekstraksi kembali dengan metanol untuk mendapatkan ekstrak metanol. Uji aktivitas antifungi. Uji aktivitas dilakukan menggunakan 3 metode, yaitu difusi agar, dilusi cair dan bioautografi. Untuk metode difusi agar dan dilusi cair, kedua ekstrak
disuspensikan ke dalam tween 20 5% dengan konsentrasi 100 mg/ml. a. Metode difusi agar. Dibuat media Sabouroud’s dekstrosa agar yang telah dicampur dengan C. albicans dengan konsentrasi 106 CFU/ml di dalam piring Petri, dan dibiarkan sampai membeku. Setelah beku, di atas media dipasang silinder besi, kemudian tiap silinder besi diisi dengan sampel sebanyak 20µl dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Zone jernih yang tampak di sekeliling silinder besi kemudian diukur menggunakan jangka sorong. b. Metode dilusi cair. Dibuat suspensi sampel dengan konsentrasi 2, 3, 4, 5 dan 6 mg %. Pada masing-masing sampel dimasukkan suspensi C. albicans dalam media Sabouroud’s dekstrosa cair sehingga konsentrasi fungi 106 CFU/ml. Sampel diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian diamati adanya kekeruhan pada tiap sampel yang menunjukkan adanya pertumbuhan fungi. Untuk memastikan adanya pertumbuhan fungi tersebut, tiap sampel diinokulasikan pada media Sabouroud’s dekstrosa agar dan diinkubasi kembali selama 24 jam. c. Metode bioautografi. Ekstrak yang mempunyai aktivitas sebagai antifungi difraksinasi menggunakan n-heksana, sehingga diperoleh 2 fraksi yaitu fraksi larut dalam n-heksana dan fraksi tidak larut dalam n-heksana. Kedua fraksi dilarutkan dalam pelarut yang sesuai hingga larut sempurna, kemudian dilakukan pemisahan menggunakan metode KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-heksana:etilasetat (2:1). Hasil KLT dikeringkan dengan menggunakan kipas angin sampai semua pelarut menguap semua, kemudian lempeng KLT ditempelkan selama 30 menit pada media Sabouroud’s dekstrosa agar dalam piring Petri yang telah tersuspensikan dengan C. albicans. Lempeng diambil, kemudian media diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Adanya zone jernih yang timbul dicatat harga hRfnya. Untuk
Nama ekstrak Ekstrak petroleum eter
mengidentifikasi golongan senyawa yang aktif sebagai antifungi, lempeng KLT disemprot menggunakan beberapa pereaksi semprot. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi bertingkat menggunakan petroleum eter dan metanol ditujukan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai kepolaran yang berbeda, yaitu untuk memisahkan senyawa yang non polar dan senyawa yang polar. Dari ekstraksi bertingkat terhadap buah seledri diperoleh hasil bahwa ekstrak metanol mempunyai rendemen yang lebih besar, sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa senyawa polar yang terdapat dalam buah seledri lebih banyak dibandingkan dengan senyawa-senyawa non polar (Tabel I). Kedua ekstrak diuji aktivitas antifungi menggunakan metode difusi agar untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas antifungi di dalam ekstrak tersebut. Hasil uji aktivitas selengkapnya tercantum dalam Tabel 2. Dari data pada tabel 2 di atas dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak petroleum eter mempunyai aktivitas antifungi yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak metanol, sehingga diduga senyawa aktif antifungi yang terdapat dalam buah seledri adalah senyawa non polar. Untuk mengetahui potensi aktivitas antifungi ekstrak, dilakukan uji aktivitas menggunakan metode dilusi cair terhadap ekstrak aktif yaitu ekstrak petroleum eter. Parameter potensi aktivitas antifungi adalah harga Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Penggunaan metode dilusi cair ini mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode yang lain, diantaranya dapat menjamin homogenitas yang lebih besar antara media, bahan uji, dan suspensi jamur karena interaksi antara ketiganya dapat lebih sempurna. Disamping itu, media dan bahan uji yang digunakan lebih sedikit jumlahnya sehingga dapat lebih menghemat media dan bahan uji.
Tabel 1. Hasil ekstraksi buah seledri menggunakan petroleum eter dan metanol Bobot ekstrak (g) Rendemen (%) Bentuk ekstrak 0,68 2,27 Semi cair, warna
Ekstrak metanol
1,83
kuning kecoklatan Padat kering, warna kuning kehitaman
6,1
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antifungi ekstrak terhadap C. albicans Nama ekstrak Petroleum eter Metanol
25,00 10,00
Diameter zone jernih (mm) 22,00 28,00 14,00 12,00
Rata-rata (mm) 25,00 12,00
Tabel 3. Hasil penentuan harga KHM dan KBM ekstrak petroleum eter dengan metode dilusi cair Replikasi 2 mg % ++ ++ ++ Tumbuh
1 2 3 Hasil inokulasi Keterangan: + : agak keruh ++ : keruh +++ : keruh sekali
Pertumbuhan fungi 3 mg % 4 mg % 5 mg % ++ ++ + ++ ++ + ++ ++ + Tumbuh Tumbuh Tidak tumbuh
6 mg % + + + Tidak tumbuh
Kontrol jamur + + + Tumbuh
Kontrol ekstrak +++ +++ +++ Tidak tumbuh
100
50
Keterangan: A : minyak atsiri B : fraksi tidak larut n-heksana C : fraksi larut n-heksana
0 A
B
C
Gambar 1. Hasil bioautografi
Berdasarkan hasil pengamatan, ternyata sulit untuk menentukan harga KHM karena suspensi ekstrak petroleum eter keruh kecoklatan. Penentuan nilai KHM ini berdasarkan pada kadar terendah ekstrak yang masih mampu menghambat pertumbuhan fungi (ditandai dengan kejernihan tabung). Untuk menentukan nilai KBM, masing-masing konsentrasi ekstrak pada uji dilusi cair diinokulasikan pada media agar. Nilai KBM didasarkan pada kadar terendah ekstrak yang masih mampu membunuh fungi yang ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan fungi pada media. Dari uji tersebut diperoleh harga KBM ekstrak petroleum eter adalah 5 mg %. Untuk mengetahui senyawa yang mempunyai aktivitas terhadap fungi, maka dilakukan bioautografi. Metode ini dengan cepat dapat mendeteksi bercak pada kromatogram yang memberikan aktivitas antifungi. Metode ini menggunakan bahan uji yang sedikit dan cara kerja yang sederhana. Adanya aktivitas antifungi ditunjukkan dengan adanya zone jernih pada lapisan media agar dengan latar belakang keruh karena adanya pertumbuhan fungi. Bioautografi dilakukan terhadap ekstrak petroleum eter yang telah difraksinasi menggunakan n-heksana. Fraksinasi ini ditujukan untuk mendapatkan pemisahan yang lebih baik ketika dilakukan KLT, sehingga senyawa-senyawa dalam ekstrak petroleum eter ini dipisahkan terlebih dahulu berdasarkan polaritasnya. Sebagai pembanding dalam bioautografi ini adalah minyak atsiri, karena dalam penelitian ini ingin diketahui senyawa aktif antifungi yang terdapat dalam buah seledri tetapi bukan golongan minyak atsiri. Walaupun sebelum diekstraksi buah seledri telah diambil minyak atsirinya tetapi masih ada kemungkinan ada sejumlah minyak atsiri yang tidak ikut terdestilir dan akan terdapat dalam ekstrak petroleum eter. Hasil bioautografi terhadap fraksi larut n-heksana, fraksi tidak larut n-heksana dan minyak atsiri terlihat pada gambar 1. Dari hasil bioautografi tampak adanya zone jernih
yang menunjukkan adanya aktivitas antifungi pada minyak atsiri dan fraksi larut n-heksana, sedangkan fraksi tidak larut n-heksana tidak menunjukkan adanya aktivitas tersebut. Zone jernih pada minyak atsiri mempunyai harga hRf 78, dan pada fraksi larut n-heksana pada hRf 44 dan 78. Dari hasil ini dapat diketahui bahwa senyawa aktif pada ekstrak petroleum eter fraksi larut n-heksana ada yang merupakan komponen minyak atsiri, yaitu senyawa dengan harga hRf 78. Dari hasil ini juga dapat diketahui bahwa minyak atsiri dalam buah seledri belum dapat terdestilir sempurna, sehingga ada sebagian yang masuk ke dalam ekstrak petroleum eter karena minyak atsiri larut dalam petroleum eter. Senyawa aktif dengan harga hRf 44 dalam fraksi larut nheksana dapat diduga bukan merupakan komponen minyak atsiri. Identifikasi senyawa aktif antifungi yang terdapat di dalam ekstrak petroleum eter fraksi larut dalam n-heksana dilakukan dengan beberapa detektor, yaitu sinar UV254, UV365, pereaksi semprot anisaldehid-asam sulfat, besi (III) klorida, sitroborat dan Dragendorff. Hasil identifikasi dengan detektor tersebut tersaji pada tabel IV. Apabila dibandingkan antara hasil bioautografi dengan hasil identifikasi di atas, maka senyawa aktif yang mempunyai harga hRf 44 pada bioautografi dimungkinkan sama dengan senyawa dengan hRf 45 pada KLT identifikasi senyawa. Perbedaan harga hRf ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan kondisi elusi lempeng KLT yang tidak mungkin dikendalikan. Dari hasil identifikasi tersebut, dapat diambil kesimpulan bahwa senyawa aktif antifungi yang terdapat dalam ekstrak petroleum eter buah seledri adalah senyawa terpenoid. Hal ini terlihat dari penampakan warna setelah lempeng disemprot dengan anisaldehid asam sulfat, yang menunjukkan bahwa warna bercak pada hRf 45 adalah ungu. Menurut Stahl (1985), senyawa terpenoid apabila disemprot menggunakan pereaksi anisaldehid-asam
sulfat akan membentuk warna yang bervariasi seperti violet, biru, merah, abu-abu atau hijau. KESIMPULAN 1. Ekstrak petroleum eter buah seledri mempunyai aktivitas sebagai antifungi yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak metanol, dengan harga KBM sebesar 5 mg %. 2. Senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antifungi dalam buah seledri, selain komponen minyak atsiri adalah senyawa golongan terpenoid. DAFTAR PUSTAKA Krieger, J.N., Alderete, J.F., 1999, Trichomoniasis, dalam Holmes, K.K., Sparling, P.F., Mardh, P.A., Lemon, S.M., Stamm, W.E., Wasserheit, J.N. (eds), Sexually Transmitted Diseases, edisi ketiga, Mc Graw Hill, USA Siswandono, Soekardjo, B., 1995, Kimia Medisinal, 302, 308-310, Airlangga University Press, Surabaya Stahl, E., 1985, Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerbit ITB, Bandung Sampurno, 2002, Sambutan Simposium dalam Sukrasno, Adnyana, I. K., Damayanti, S (Tim redaksi), Prosiding Simposium Standarisasi Jamu dan Fitofarmaka: Meningkatkan Jamu dan Fitofarmaka menjadi Obat Pilihan, Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam ITB, Bandung Sudarsono, Pudjoarinto, A., Gunawan, D., Wahyuono, S., Donatus, I. A., Drajad, M., Wibowo, S., Ngatidjan, 1996, Tumbuhan Obat, Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, 44-54, Pusat Penelitian Obat dan Tanaman, UGM, Yogyakarta Suganda, A. G., 2002, Standarisasi Simplisia, Ekstrak, dan Produk Obat Bahan Alam, dalam Sukrasno, Adnyana, I. K., Damayanti, S (Tim redaksi), Prosiding Simposium Standarisasi Jamu dan Fitofarmaka: Meningkatkan Jamu dan Fitofarmaka menjadi Obat Pilihan, Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam ITB, Bandung
