AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAUN JAWER KOTOK (Coleus scutellarioides [L.] Benth.)
RATNAWATI YUNINGSIH
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
ABSTRAK RATNAWATI YUNINGSIH. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Jawer Kotok (Coleus scutellaroides (L.) Benth.). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan EMAN KUSTAMAN. Penelitian ini mempelajari aktivitas antibakteri dan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dari ekstrak daun jawer kotok terhadap bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus & Bacillus subtilis) dan bakteri Gram negatif (Escherchia coli & Pseudomonas aeruginosa), serta penentuan senyawa metabolit pada jawer kotok. Filtrat daun muda dan tua diuji aktivitas antibakterinya. Daun jawer kotok tua secara umum memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar. Daun jawer kotok tua diekstraksi menggunakan tiga pelarut, yaitu heksana, air, dan aseton. Ekstrak daun jawer kotok diuji aktivitas antibakterinya. Ekstrak aseton memiliki zona hambat paling besar terhadap bakteri uji. Ampisilin 0.4 mg/mL digunakan sebagai kontrol positif. Uji kualitatif fitokimia ekstrak aseton menunjukkan hasil positif untuk uji senyawa alkaloid dan steroid. Zona hambat yang dihasilkan memiliki korelasi positif dengan konsentrasi ekstrak daun jawer kotok. Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum ekstrak daun jawer kotok terhadap bakteri B. Subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa adalah 0,1 mg/mL dengan zona hambat berturut-turut adalah 6.6438, 6.5, 6.8062, dan 6.6188 mm. Zona hambat ampisilin 0.4 mg/mL terhadap B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa masing-masing sebesar 26.2, 25.6042, 24.7708, dan 25.5292 mm. .
ABSTRACT RATNAWATI YUNINGSIH. Antibacterial Activity from Extract of Jawer Kotok (Coleus scutellaroides [L] Benth.) Leaves. Under the supervisor MARIA BINTANG dan EMAN KUSTAMAN. This research studied antibacterial activity and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) from jawer kotok leaves extract to positive Gram bacteria (Staphylococcus aureus & Bacillus subtilis) and negative Gram bacteria (Escherchia coli & Pseudomonas aeruginosa), and also qualitative determination of secondary metabolite from jawer kotok. Antibacterial activity from old and young leaves filtrate were tested. Old leaves generally have higher antibacterial activity. Old jawer kotok leaves extracted using 3 solvent, hexane, water, and acetone. Antibacterial activity from leaves extract was tested. Acetone extract has the biggest inhibitory zone after testified at those bacteria. Ampicillin 0.4 mg/mL is used as positive control. Phytochemical test to acetone extract showed positive result for alkaloid and steroid. The resulted inhibition zone has a positive correlation with the leaves exctract concentration. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of jawer kotok leaves extract to B. Subtilis, S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa are 0.1 mg/mL with inhibitory zone 6.6438, 6.5000, 6.8062, and 6.6188 mm respectively. Ampicillin hambat zone (0.4 mg/mL) to B. subtilis, S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa are 26.2, 25.6042, 24.7708, and 25.5292 mm respectively
AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAUN JAWER KOTOK (Coleus scutellarioides (L.) Benth.)
RATNAWATI YUNINGSIH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
Judul Skripsi : Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Jawer Kotok (Coleus scutellaroides [L.] Benth.) Nama : Ratnawati Yuningsih NIM : G44103029
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Ketua
Ir. Eman Kustaman Anggota
Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131 473 999
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya dalam menyelasaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini merupakan salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai Juni 2007 dengan judul Aktivitas Antibakteri Daun Jawer Kotok (Coleus scutellarioides (L.) Benth.). Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. dan Bapak Ir. Eman Kustaman selaku pembimbing atas segala kesabarannya dan pengarahannya selama penelitian dan penulisan skripsi. Ucapan terima kasih penulis sampaikan juga kepada Ibu Iis, Ibu Mery, Pak Arya, Pak Yadi, Pak Nana serta seluruh staf Laboratorium Biokimia atas fasilitas dan kemudahan yang diberikan dan teman-teman penelitian Nia, Huri, Ka Novan, Eka, Dewi, Meti, dan Henry atas bantuannya selama penelitian serta Ka Waras yang telah membantu dalam pengolahan data. Tak lupa ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Mih, Bapak, Mama, Bapak Engkus, kakak-kakak, dan seluruh keluarga atas segala materi, dukungan, perhatian, kasih sayang, dan doanya. Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna karena keterbatasan pengalaman dan pengetahuan yang dimiliki penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang sekiranya dapat digunakan untuk perbaikan. Semoga karya ilmiah ini dapat berguna bagi pihak yang membutuhkan. Amin. Bogor, Agustus 2007
Ratnawati Yuningsih
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Karawang pada tanggal 13 April 1985 dari pasangan Daim dan Yanah. Penulis merupakan putri keenam dari enam bersaudara. Tahun 2003 penulis berhasil menyelesaikan sekolah di SMU Negeri 1 Ciamis. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biokimia, Jurusan Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Tahun 2006, penulis melaksanakan Praktek Lapangan di Balai Besar Industri Agro (BBIA), Bogor. Tema yang diambil adalah Penentuan Kadar Natrium Klorida dan Kalium Iodat pada Garam Konsumsi dengan Titrasi Argentometri dan Iodometri. Tahun 2006-2007 penulis memperoleh beasiswa dari Yayasan Toyota Astra. Tahun 2006 penulis menjadi asisten praktikum Biokimia 1 Program Studi Kimia. Selama kuliah, penulis aktif di Himpro CREBs (Community of Research and Education in Biochemistry) periode 2005/2006.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii DAFTAR GAMBAR . ....................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN . ..................................................................................... ix PENDAHULUAN . ........................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Jawer Kotok (Coleus scutellarioides). .......................................................... Ekstraksi . ..................................................................................................... Bakteri Gram Positif dan Negatif ................................................................. Antibakteri .................................................................................................. Bakteri Uji ..................................................................................................
1 2 3 3 5
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ............................................................................................. 6 Metode Penelitian ...................................................................................... 6 HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Kadar Air dan Ekstraksi ................................................................ 8 Aktivitas Antibakteri Filtrat Daun Jawer Kotok ........................................ 9 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Jawer Kotok .............................. 10 Analisis Fitokimia Ekstrak Aseton Daun Jawer Kotok ................................ 11 Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) .................... 12 Perbandingan Penghambatan Ekstrak Daun Jawer Kotok Terhadap Ampisilin....................................................................................................... 13 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ..................................................................................................... 13 Saran ........................................................................................................... 14 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 14 LAMPIRAN ...................................................................................................... 16
DAFTAR TABEL Halaman 1 Polaritas pelarut organik ................................................................................
2
2 Beberapa ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif ...................................
4
3 Aktivitas antibakteri menurut David Stout. ................................................. 10 4 Aktivitas antibakteri filtrat daun tua tanaman jawer kotok ........................... 10 5 Aktivitas antibakteri filtrat daun muda tanaman jawer kotok ....................... 10 6 Hasil analisis fitokimia ekstrak aseton daun jawer kotok .............................. 11 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman jawer kotok (Coleus scutellarioides) .............................................
2
2 Aktivitas antibakteri filtrat daun muda dan daun tua tanaman jawer kotok.. 10 3 Aktivitas antibakteri ekstrak aseton, heksana, dan akuades daun jawer kotok 0.2 g/mL ..................................................................................................... ... 11 4 Daya hambat ekstrak aseton daun jawer kotok pada berbagai konsentrasi ... 12 5 Daya hambat ampisilin 0.4 mg/mL................................................................ 13 6 Perbandingan daya hambat ekstrak aseton daun jawer kotok terhadap ampisilin ..................................................................................................... ... 13
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian
................................................................................... 16
2 Proses ekstraksi ............................................................................................ 17 3 Uji aktivitas antibakteri metode Bintang (1993) ......................................... 18 4 Kadar air daun jawer kotok.......................................................................... 19 5 Nilai rendemen ekstrak daun jawer kotok ................................................... 19 6 Diameter zona hambat filtrat daun jawer kotok segar ................................. 20 7 Foto diameter zona hambat filtrat daun jawer kotok ................................... 20 8 Diameter zona hambat ekstrak daun jawer kotok kering 0.2 g/mL ............. 21 9 Foto diameter zona hambat ekstrak daun jawer kotok kering 0.2 g/mL. .. 21 10 Diameter zona hambat ampisilin 0.4 mg/mL ............................................. 22 11 Foto zona hambat ampisilin 0.4 mg/mL .................................................... 22 12 Diameter zona hambat ekstrak aseton daun jawer kotok .......................... 22 13 Foto zona hambat ekstrak aseton daun jawer kotok ................................. 24 14 ANOVA diameter zona hambat
............................................................... 26
15 Analisis Tukey diameter zona hambat ....................................................... 26 16 Kurva hubungan konsentrasi dengan diameter zona hambat ...................... 29 17 Foto hasil uji fitokimia ............................................................................... 30
PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara yang dikenal memiliki keanekaragaman hayati. Dari sekian juta tanaman yang dapat tumbuh di Indonesia, banyak di antaranya yang dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Masyarakat Indonesia sejak zaman dahulu telah mengenal dan menggunakan tumbuhan obat sebagai salah satu upaya penanggulangan masalah kesehatan. Pengetahuan masyarakat mengenai obat tradisional merupakan budaya bangsa Indonesia secara turun-menurun. Tumbuhan obat asli Indonesia pada kenyataannya sampai saat ini masih banyak dipakai oleh masyarakat dalam pengobatan berbagai jenis penyakit. Adanya keanekaragaman sumber hayati di Indonesia dapat dimanfaatkan secara optimal sehingga dapat mengurangi ketergantungan bahan baku obat-obatan dari luar negeri dalam memenuhi kebutuhan obat dalam negeri. Bakteri patogen merupakan salah satu penyebab penyakit pada manusia dan makhluk hidup lainnya. Banyak usaha yang telah dilakukan untuk melawan bakteribakteri patogen tersebut yaitu dengan menemukan senyawa-senyawa kimia yang mampu membunuh bakteri. Senyawasenyawa tersebut dikenal dengan nama antibiotik. Antibiotik tersebut terdiri atas antibiotik alami dan sintetika. Banyak yang menyadari akan efek buruk antibiotik sintesis jika digunakan sembarangan. Antibiotik tidak hanya mematikan bakteri patogen (yang menimbulkan penyakit) tetapi juga bakteri-bakteri yang berguna bagi tubuh. Meski demikian, minat masyarakat untuk menggunakan antibiotik secara bebas makin tinggi. Padahal alam telah menyediakan senyawa pelawan bakteri alternatif sebagai antibiotik yang terdapat dalam tumbuhan. Tumbuhan tersebut selain manjur juga mudah didapatkan di sekitar kita. Jawer kotok merupakan salah satu tanaman yang dikenal sebagai tanaman obat. Tumbuhan ini memiliki fungsi ganda, yaitu selain sebagai tanaman hias juga sebagai tanaman obat. Daun jawer kotok mengandung minyak atsiri, antara lain karvakrol yang bersifat antibiotik, eugenol bersifat menghilangkan nyeri, etil salisilat menghambat iritasi. Daunnya juga mengandung zat-zat alkaloida, mineral dan sedikit lendir.
Beberapa penelitian menyebutkan tanaman ini memiliki khasiat pengobatan ambeien dan diabetes melitus. Masyarakat sering menggunakan tanaman ini untuk berbagai pengobatan misalnya diare, pengobatan pasca melahirkan dan terlambat datang bulan, demam, diare (sakit perut), dan bisul. Namun penelitian secara ilmiah tentang khasiat obat dari tanaman ini sebagai antibakteri belum dilakukan. Penelitian ini akan mempelajari aktivitas antibakteri dan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dari filtrat daun jawer kotok terhadap dua jenis bakteri yaitu bakteri Gram positif (Staphylococcs aureus dan Bacillus subtilis) dan bakteri Gram negatif (Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa). Keempat jenis bakteri ini merupakan bakteri yang umumnya menyebabkan penyakit pada masyarakat seperti diare, penyakit kulit, dan lain-lain. Penelitian ini bertujuan mendapatkan informasi ilmiah tentang aktivitas antibakteri dan konsentrasi hambat minimum ekstrak daun jawer kotok terhadap pertumbuhan bakteri. Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak daun jawer kotok memiliki senyawa aktif yang bersifat antibakteri. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antibakteri filtrat dan ekstrak daun jawer kotok. Selain itu hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat bahwa tanaman ini mempunyai efek antibakteri, sehingga dapat meningkatkan nilai guna bagi tanaman tersebut.
TINJAUAN PUSTAKA Jawer Kotok (Coleus scutellarioides [L.] Benth.) Jawer kotok (Coleus scutellarioides [L.] Benth.) (Gambar 1) umumnya ditanam di pekarangan sebagai tanaman hias atau tanaman obat. Herba yang berasal dari Asia Tenggara ini ditemukan tumbuh liar pada tempat-tempat yang lembab dan terbuka seperti di pinggir selokan, pematang sawah, atau di tepi jalan pedesaan pada ketinggian 1-1.300 di atas permukaan air laut (dpl). Corak, bentuk, dan warna daun ini beraneka ragam, tetapi yang berkhasiat obat adalah daun yang berwarna merah kecoklatan (Dalimartha 2000).
Gambar 1 Tanaman jawer kotok (Coleus scutellarioides. Jawer kotok tumbuh tegak atau berbaring pada pangkalnya. Bagian yang menyentuh tanah mengeluarkan akar. Tinggi tanaman ini 0.5-1.5 m. Jika seluruh bagian tanaman diremas akan mengeluarkan bau yang harum. Daun bersegi empat dengan alur yang agak dalam pada masing-masing sisinya, berambut, percabangan banyak. Helaian daun berbentuk bulat telur, pangkal membulat atau melekuk menyerupai bentuk jantung, ujung meruncing, tepi bergerigi, tulang daun menyirip jelas (berupa alur) berbentuk gambaran seperti jala, permukaan daun agak mangkilap, berambut halus, panjang 7-11 cm, lebar 3.5-6 cm (Dalimartha 2000). Nama lain dari tanaman ini adalah iler, kentangan, dhin kamandhinan, gresing, adang-adang, miana, pilado, rangon tati, serewung, ati-ati, panci-panci, saru-saru, dan majana. Jawer kotok diklasifikasi ke dalam kingdom Plantae (tumbuh-tumbuhan), divisi (divisio) Spermatophyta (tumbuhan berbiji), anak divisi (sub-divisio) Angiospermae (berbiji tertutup), bangsa (ordo) Solanales, suku (family) Lamiaceae, marga (genus) Solenostemon, dan jenis (species) Coleus scutellarioides (Depkes 2000). Daun jawer kotok mengandung minyak atsiri, antara lain karvakrol yang bersifat antibiotik, eugenol bersifat menghilangkan nyeri, etil salisilat menghambat iritasi. Daunnya juga mengandung zat-zat alkaloida, mineral dan sedikit lendir 2000). Daun ini juga (Asiamaya mengandung thymol yang memiliki sifat antelmintik (mematikan cacing) dan antiseptik (Praptiwi 1999). Ekstraksi Ekstraksi adalah peristiwa pemindahan zat terlarut (solut) diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Adijuwana & Nur 1989). Ekstraksi dapat diartikan juga cara untuk memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen-komponen yang terpisah (Winarno, Fardiaz D & Fardiaz S 1973).
Ekstraksi dapat dilakukan dengan dua cara fase air (aqueus phase) dan fase organik (organic phase). Ekstraksi fase air menggunakan air sebagai pelarut sedangkan ektraksi fase organik menggunakan pelarut organik seperti kloroform, eter dan sebagainya. Kelarutan zat di dalam pelarut dan tergantung dari kepolarannya. Zat yang polar hanya larut dalam pelarut polar, sedangkan zat yang non polar hanya larut dalam pelarut non polar. Bahan-bahan organik tidak selalu larut dalam air, oleh karena itu dapat dipisahkan dengan corong pemisah. Pelarut yang dapat digunakan untuk ekstraksi harus memenuhi dua syarat, yaitu pelarut tersebut harus merupakan pelarut yang terbaik untuk bahan yang diekstraksi dan pelarut tersebut harus terpisah dengan cepat setelah pengocokan (Winarno, Fardiaz D & Fardiaz S 1973). Hal lain yang harus diperhatikan adalah selektivitas, kemampuan untuk mengekstrak, toksisitas, kemudahan untuk diuapkan, dan harga pelarut (Harborne 1996). Nilai polaritas beberapa pelarut tersebut dapat dilihat pada Tabel 1. Pelarut organik yang biasa digunakan untuk memproduksi konsentrat, ekstrak minyak atsiri dari bunga, daun, biji, akar, dan bagian lain dari tanaman adalah etil asetat, heksana, eter, benzena, toluena, etanol, isopropanol, aseton, dan air (Mukhopadhyay 2002). Metode ekstraksi dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu ekstraksi sederhana dan ekstraksi khusus. Ekstraksi sederhana terdiri dari maserasi, perkolasi, reperkolasi, evakolasi, dan dialokasi. Ekstraksi khusus terdiri dari sokletasi, arus balik, dan ultrasonik (Harborne 1996). Penelitian ini menggunakan metode maserasi. Tabel 1 Polaritas pelarut organik No
Pelarut
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Etanol Aseton Etil asetat Heksana Pentena Diklorometana Isopropanol Air Propilen glikol Dietil eter
Titik didih (oC) 78,3 56,2 77,1 68,7 36,2 40,8 82,2 100 187,4 34,6
Sumber: Mukhopadhyay (2002)
Polaritas (EoC) 0,68 0,47 0,38 0 0 0,32 0,63 >0,73 0,73
Maserasi digunakan untuk mengekstrak sampel yang relatif tidak tahan panas. Metode ini dilakukan hanya dengan merendam sampel dalam suatu pelarut dengan lama waktu tertentu, biasanya dilakukan selama sehari semalam (24 jam) tanpa menggunakan pemanas. Kelebihan metode maserasi diantaranya metodenya sederhana, tidak memerlukan alat-alat yang rumit, dan relatif murah. Selain itu metode ini dapat menghindari kerusakan komponen senyawa karena tidak menggunakan panas sehingga baik untuk sampel yang tidak tahan panas. Kelemahan metode ini diantaranya dari segi waktu dan penggunaan pelarut yang tidak efektif dan efisien karena jumlah pelarut yang digunakan relatif banyak dan membutuhkan waktu yang lebih lama (Meloan 1999).
Bakteri Gram Positif dan Negatif Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, bersel tunggal (uniseluler) dan tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Bakteri memiliki diameter 0.5-1.0 μm dan panjangnya 1.5-2.5 μm. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang, atau spiral (heliks). Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Sel bakteri berbentuk silindris atau seperti batang dinamakan basilus sedangkan sel bakteri berbentuk spiral disebut spirilum (Pelczar & Chan 1986). Kebanyakan bakteri bermultiplikasi dengan pembelahan biner melintang, yaitu pambelahan menjadi dua sel yang sama. Setiap keturunan secara individual dapat melanjutkan proses produksi secara tidak terbatas dengan cara yang sama dengan induknya atau individu sebelumnya dengan syarat tersedianya makanan dan energi yang cukup dan keadaan lingkungan (pH, suhu) bebas polusi oleh sisa buangan yang beracun dan sebagainya (Irianto 2006). Bakteri berdasarkan komposisi dinding selnya dapat dibedakan menjadi dua jenis, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Tebalnya peptidoglikan ini menyebabkan bakteri tahan terhadap sifat osmosis yang dapat memecah sel bakteri itu. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif lebih tipis tetapi memiliki membran luar yang tebal sehingga bersama-sama dengan
peptidoglikan membentuk mantel pelindung yang kuat untuk sel (Mekanne & Kandel 1996). Untuk membedakan Gram negatif dan Gram positif dapat dilakukan pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif dapat menahan zat warna ungu (metilviolet, kristalviolet, gentianviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol atau aseton. Sebaliknya, bakteri Gram negatif tidak dapat menahan zat warna. Setelah dekolorisasi dengan alkohol maka akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat warna kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna tersebut (Irianto 2006). Bakteri Gram positif cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibakteri. Hal ini disebabkan oleh struktur dinding selnya yang lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja, sedangkan struktur dinding sel Gram negatif lebih kompleks dan berlapis tiga, yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa lipopolisakarida, dan lapisan dalam peptidoglikan (Pelczar & Chan 1986). Perbedaan bakteri Gram positif dan negatif dapat dilihat pada tabel 2. Antibakteri Antimikrob adalah obat untuk membasmi mikroba, khususnya mikroba yang merugikan manusia (Gan et.al 1980). Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab penyakit infeksi pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif yang tinggi, artinya obat tersebut harus bersifat sangat toksik untuk mikroba tetapi relatif tidak toksik untuk inang (Gan et al.1980). Antimikrob meliputi antibakteri, antiprotozoa, antifungi, dan antivirus. Antibakteri termasuk ke dalam antimikrob yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri (Schunack et.al. 1990) Antibakteri adalah zat yang menghambat pertumbuhan bakteri dan digunakan secara khusus untuk mengobati infeksi (Pelczar & Chan 1986). Berdasarkan cara kerjanya antibakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteriostatik dan bakterisida. Antibakteri bakteriostatik bekerja dengan cara menghambat perbanyakan populasi bakteri dan tidak mematikan sedangkan bakterisida bekerja membunuh bakteri. Bakteriostatik bisa bertindak sebagai bakterisida dalam konsentrasi yang tinggi (Schunack et. al. 1990).
Tabel 2 Beberapa ciri bakteri gram positif dan gram negatif Ciri Struktur dinding sel Komposisi dinding sel
Kerentanan terhadap penisilin Pertumbuhan dihambat oleh zat-zat warna dasar, misalnya ungu kristal Persyaratan nutrisi Resistensi terhadap gangguan fisik
Perbedaan Gram positif Gram negatif Tebal (12-80 nm) Tipis (10-15nm) Berlapis tunggal (mono) Berlapis tiga (multi) Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi (114%) 22%) Peptidoglikan ada sebagai Peptidoglikan ada di dalam lapisan tunggal, komponen lapisan kaku sebelah dalam, utama merupakan lebih dari jumlahnya sedikit, merupakan 50% berat kering pada sekitar 10% berat kering beberapa sel bakteri Asam tekoat Tidak ada asam tekoat Lebih rentan Kurang rentan Pertumbuhan dihambat dengan Pertumbuhan tidak begitu nyata dihambat Relatif rumit pada banyak spesies Lebih resisten
Relatif sederhana Kurang resisten
Sumber: Pelczar & Chan (1986)
Faktor-faktor yang mempengaruhi penghambatan atau pembasmian mikroorganisme oleh bahan atau proses mikrobial adalah konsentrasi atau intensitas zat antimikrobial, jumlah mikroorganisme, suhu, spesies mikroorganisme, adanya bahan organik, dan pH. Senyawa kimia utama yang memiliki sifat antibakteri adalah fenol dan persenyawaan fenolat, alkohol, halogen, logam berat, deterjen, dan aldehida. Fenol bekerja terutama dengan cara mendenaturasi protein sel dan merusak membran sel. Persenyawaan fenolat dapat bersifat bakterisida atau bakteriostatik tergantung pada konsentrasi yang digunakan. Alkohol bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel, selain itu alkohol merupakan pelarut lipid sehingga dapat juga merusak membran sel (Pelczar & Chan 1988). Antibakteri dibagi menjadi lima kelompok berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu antibakteri yang menghambat metabolisme sel, sintesis dinding sel, mengganggu keutuhan membran sel, menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel bakteri. Antibakteri yang menghambat metabolisme sel. Asam folat yang disintesis dari asam paraaminobenzoat (PABA) sangat dibutuhkan oleh bakteri untuk kelangsungan hidupnya. Penghambatan metabolisme sel untuk menghasilkan asam folat terjadi dengan dua cara: (1) antibakteri menang bersaing dengan PABA, maka akan terbentuk asam folat yang bersifat nonfungsional, (2) antibakteri menghambat enzim dihidrofolat
reduktase sehingga asam dihidrofolat tidak dapat direduksi menjadi asam tetrahidrofolat (THFA) yang merupakan bentuk aktif dari asam folat. Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel. Dinding sel bakteri secara kimia adalah peptidoglikan, yaitu suatu kompleks polimer glikopeptida. Antibakteri dapat menghambat reaksi yang paling dini dalam proses sintesis dinding sel, diikuti oleh antibakteri yang menghambat reaksi terakhir dalam rangkaian reaksi tersebut. Antibakteri yang mengganggu keutuhan membran sel. Antibakteri membran sel setelah bereaksi dengan fosfat pada fosfolipid membran, sehingga jumlah fosfornya menurun. Hal ini dapat merubah tegangan permukaan dan dapat mempengaruhi permeabilitas selektif dari membran sel bakteri. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel. Bakteri mensintesis protein dengan bantuan mRNA dan tRNA. Sintesis tersebut berlangsung di ribosom unit 30S dan 50S. Agar berfungsi pada sintesis protein, kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 70S. Penghambatan sintesis protein terjadi dengan dua cara: (1) antibakteri berikatan dengan ribosom 30S, menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis akibatnya akan menghalangi masuknya kompleks tRNA asam amino pada lokasinya, (2) antibakteri berikatan dengan ribosom 50S yang menyebabkan terhambatnya pengikatan
asam amino baru pada rantai polipeptida oleh enzim peptida transferase. Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat. Antibakteri berikatan dengan enzim RNA polimerase sehingga menghambat sintesis RNA dari DNA oleh enzim tersebut. Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan atau diturunkan oleh organisme hidup termasuk struktur analognya dibuat secara sintetik, yang dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono & Soekardjo 1995). Pada penelitian ini digunakan antibiotik ampisilin sebagai kontrol positif. Ampisilin adalah antibiotik dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan infeksi pada saluran napas dan saluran seni, gonorhe, gastroentritis, meningitis, dan infeksi karena Salmonella sp. Seperti demam tipoid. Ampisilin adalah turunan penisilin yang tahan asam tapi tidak tahan terhadap enzim penisilinase. Bentuk D-isomer lebih aktif dibanding L-isomer (Siswandono & Soekardjo 1995). Ampisilin merupakan antibiotik yang bekerja menghambat sintesis dinding sel bakteri. Pada tingkat molekul ampisilin menyerang nukleofil dari gugus hidroksil serin serta enzim transpeptidase pada karbonil karbon cincin beta-laktam yang bermuatan positif, hal ini menyebabkan penghambatan bisintesis peptidoglikan yang menyebabkan lemahnya dinding sel dan karena tekanan turgor dari dalam sel akan pecah (Siswandono & Soekardjo 1995).
Bakteri Uji Pada penelitian ini digunakan empat jenis bakteri uji standar, yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa (Bauer et al. 1968). Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus termasuk famili Micrococcaceae dan merupakan Gram positif, tidak berspora, bersifat katalase positif yang dapat tersusun secara tunggal, berpasangan, tetrad, atau kelompok kecil. Micrococci ini tersebar luas di alam bergabung dengan tanah, permukaan air, tanaman, dan hewan. Walaupun bakteri ini merupakan pencemar bahan pangan segar, tetapi jarang merupakan penyebab utama kerusakan, sebagian besar disebabkan oleh ketidakmampuan bersaing
dengan jenis bakteri yang lebih cepat tumbuh seperti kelompok Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, dan Bacillaceae. Tetapi jenis bakteri ini lebih tahan terhadap tekanan lingkungan seperti suhu, garam dan kekeringan jika dibandingkan dengan jenis bakteri lain (Buckle et.al. 1985). S. aureus merupakan penyebab berbagai infeksi yang bernanah dan toksik pada manusia dan hewan. Bakteri ini pada manusia menyebabkan pneumonia (infeksi paru-paru), osteomyelitis (radang tulang), sinusitis, tonsilitis (radang amandel), abses penimbunan nanah akibat infeksi bakteri), dan endokarditis. S. aureus pada hewan menyebabkan penyakit seperti masitis (pembengkakan payudara) pada sapi, pustular dermatitis (radang kulit) pada anjing, serta abses pada semua spesies termasuk unggas.
Bacillus subtilis Bacillus subtilis merupakan famili Bacillaceae. Mikroorganisme ini penting dalan mikrobiologi pangan terutama karena kemampuannya dalam membentuk endospora. Sel-selnya berbentuk batang dan umumnya cukup besar, merupakan Gram positif dan sering bergerak dengan flagella peritrichous. Bacillus bersifat aerobik dan fakultatif anaerobik (katalase positif). Genus mikroorganisme ini tersebar luas dalam air dan tanah serta mencemari banyak jenis bahan pangan. B. subtilis dikenal sebagai penyebab keasaman dari makanan kaleng karena fermentasi gula yang dikandung bahan pangan tersebut (Buckle et.al. 1985). Bakteri ini menggunakan sumber N dan C untuk energi pertumbuhan. Spora resisten terhadap panas, kering, dan desinfektan kimia tertentu selama waktu yang cukup lama dan tetap ada selama bertahun-tahun dalam tanah yang kering. Bakteri ini mempunyai panjang 2-3 μm dan lebar 0.7-0.8 μm. Bakteri ini dapat tumbuh pada suhu maksimum 45-55 oC, minimum 5-20 oC dan suhu optimum bervariasi antara 25-37 oC. B. subtilis menyebabkan penyakit pada orang dengan fungsi imun terganggu, misalnya meningitis (radang selaput otak dan saraf tunjang) dan gastroenteritis (radang perut dan usus) akut (Jewetz 1986).
Escherichia coli Escherichia coli termasuk famili Enterobacteriaceae. Golongan bekteri ini
merupakan sekelompok besar dari bakteri Gram negatif, tidak berspora, dan berbentuk batang kecil. Kelompok ini mempunyai sifat khas yaitu mampu tumbuh secara aerobik maupun anaerobik (anaerobik fakultatif) pada beraneka macam karbohidrat (Buckle et.al. 1985). E. coli pada umumnya merupakan mikroba yang secara normal terdapat pada saluran pencernaan hewan dan manusia. Bakteri ini memiliki panjang 2,0-6,0 μm dan lebar 1,1-1,5 μm. Suhu optimum bakteri ini adalah 37 oC. E. coli sangat tidak sensitif terhadap panas (Fardiaz 1983). Beberapa strain bakteri ini dapat menyebabkan gastroentritis pada manusia dan ternak, juga dapat menyebabkan terjadinya infeksi pada saluran urin dan diare. Bakteri ini menyebabkan infeksi pada daerah bokong dan paha (Anderson 1961). Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa termasuk famili Pseudomonadaceae. Mikroorganisme ini adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang kecil, dapat bergerak, umumnya berflagella polar tunggal dan mempunyai tipe metabolisme yang bersifat oksidatif. Bakteri ini merupakan penyebab berbagai jenis kerusakan bahan pangan yang sebagian besar berhubungan dengan kemampuan spesies ini dalam memproduksi enzim yang dapat memecah baik komponen lemak maupun protein dari bahan pangan (Buckle et.al. 1985). Bakteri ini dapat menginfeksi manusia dan dapat menimbulkan nanah di bagian tengah telinga (Schlegel & Schmidt 1994). Bakteri ini dapat hidup secara aerobik dan sering ditemukan pada makanan, merupakan flora normal pada tanah dan air. P. Aeruginosa dapat tumbuh pada suhu 37 oC dan tidak tahan terhadap panas dan kering. Oleh karena itu, bakteri ini mudah dibunuh dengan proses pemanasan dan pengeringan (Fardiaz 1989).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun jawer kotok, bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis), bakteri Gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa), yeast extract, bacto pepton,
bacto agar, nutrient broth, nutrient agar, glukosa, heksana, aseton, akuades, pereaksipereaksi uji fitokimia (kloroform, H2SO4, amoniak, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, pereaksi Wagner, metanol, pereaksi Lieberman Burchard, dan FeCl3 1%). Alat-alat yang digunakan adalah laminar air flow hood, spektrofotometer, inkubator, inkubator bergoyang, oven, hot plate stirrer, lemari es, pHmeter, cawan petri, jarum ose, autopipet, neraca analitik, alat-alat gelas, dan evaporator vakum.
Metode Pembuatan Filtrat daun Jawer Kotok Daun jawer kotok segar dicuci bersih kemudian dipotong-potong dan dihaluskan dengan mortar. Daun ini dibagi menjadi dua, yaitu daun muda dan daun tua. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk uji pendahuluan antibakteri. Pembuatan Ekstrak Daun Jawer Kotok Pada tahap ini digunakan tiga pelarut, yaitu heksana, aseton, dan air. Daun jawer kotok segar dikeringkan dalam oven ± 50 oC hingga bobotnya konstan lalu diblender. Serbuk daun jawer kotok yang telah diketahui bobotnya direndam dengan masing-masing pelarut dengan perbandingan 1:10 selama 3x24 jam pada suhu ruang,. Sampel tersebut disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas dan diganti dengan pelarut yang sama setiap 24 jam. Masing-masing filtrat dievaporasi menggunakan evaporator vakum 40 oC untuk menguapkan pelarut. Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk uji antibakteri.
Penentuan Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan dengan cara mengeringkan daun dalam oven suhu 105 oC selama 3 jam selanjutnya didinginkan dalam eksikator. Daun ditimbang setelah dingin. Hal ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh bobot yang konstan. Pinggan porselin yang digunakan harus dikeringkan terlebih dahulu dalam oven 105 oC selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator. Pinggan ini kemudian ditimbang. Kadar air dihitung dengan persamaan: Kadar air = W1 – W2 dengan W
W1 : bobot pinggan porselin ditambah bobot daun sebelum dikeringkan W2 : bobot pinggan porselin ditambah bobot daun sebelum dikeringkan W : bobot daun Pembuatan Media Pembuatan media Nutrient Agar (NA). Media ini merupakan media agar miring. NA sebanyak 23 gram dilarutkan dalam 1 L akuades, dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer hingga homogen. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setiap tabung reaksi diisi dengan 5 mL larutan. Tabung-tabung ini ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Media ini disterilkan menggunakan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, 121 oC selama 15 menit. Sebelum mengeras tabung-tabung tersebut dimiringkan lalu biarkan selama 24 jam hingga mengeras. Media ini digunakan untuk pertumbuhan bakteri, formulasi perliter NA DIFCO adalah beef extract 3 g, bacto pepton 5 g , dan bacto agar 15g. Pembuatan media cair Nutrient Broth (NB). Tiga gram beef ekstract dan 5 gram bacto peptone, 5 gram NaCl dilarutkan dalam 1 liter akuades dan dipanaskan sambil dikocok dengan menggunakan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer sebanyak 10 mL dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Media ini disterilkan menggunakan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, 121 oC selama 15 menit. Pembuatan Media Peptone Yeast Glucose (PYG). Sebanyak 10 gram bacto pepton, 10 gram yeast extract, 20 gram glukosa, 20 gram bacto agar dilarutkan dalam 1 liter akuades, dipanaskan dan diaduk hingga larut. Larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 20 mL. Selanjutnya media tersebut disterilkan menggunakan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, 121 oC selama 15 menit. Media ini digunakan untuk pembuatan agar cawan petri.
Regenerasi Bakteri Bakteri harus diregenerasi terlebih dahulu sebelum digunakan untuk uji antibakteri. Bakteri dibiakkan pada agar miring yang telah disterilkan, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Biakan tersebut diambil sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke labu Erlenmeyer yang berisi 10 mL media cair NB steril. Kemudian diinkubasi pada inkubator
bergoyang selama 24 jam pada suhu 37 oC dengan kecepatan 100 rpm. Setelah diinkubasi, kerapatan optik (Optical density, OD) 25 % T bakteri ini diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum. Uji Aktivitas Antibakteri (Bintang 1993) Filtrat daun muda dan daun tua segar serta ekstrak daun jawer kotok kering diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode Bintang (1993). Biakan bakteri yang telah diregenerasi dengan OD ± 0,5 diambil sebanyak 100 μL ke dalam cawan petri steril. Biakan tersebut dicampurkan dengan media agar PYG yang masih cair (± 45 oC), lalu didinginkan pada suhu kamar hingga memadat. Media tersebut dilubangi dengan diameter 5.5 mm menggunakan pangkal pipet tetes. Ekstrak daun jawer kotok dengan konsentrasi 200 mg/mL kemudian dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 μL dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur zona bening yang menunjukkan bakteri tidak tumbuh di sekitar lubang yang berisi ekstrak sampel. Antibiotik ampisilin digunakan sebagai kontrol positif.
Analisis Fitokimia (Harborne 1987) Analisis fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini hanya dilakukan secara kualitatif, analisis ini dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak jawer kotok. Analisis dilakukan berdasarkan metode Harborne (1987). Senyawa yang diidentifikasi adalah alkaloid, saponin, flavonoid, steroid dan triterpenoid, minyak atsiri, dan tanin. Uji Akaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak jawer kotok ditambahkan 5 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih ada pereaksi Meyer, endapan merah pada perekasi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak jawer kotok ditambahkan dengan 5 metanol 30% kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat ditambahkan dengan H2SO4, Senyawa flavonoid ditunjukkan dengan
terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4. Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak jawer kotok ditambahkan 5 mL akuades lalu dipanaskan selama 5 menit. Kemudian dikocok selama 5 menit. Uji saponin menunjukkan hasil positif jika terbentuk busa setinggi kurang lebih 1 cm dan tetep stabil setelah didiamkan selama 15 menit. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak jawer kotok ditambahkan 5 mL etanol 30% lalu selama 5 menit dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan dengan eter. Lapisan eter ditambahkan dengan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu yang terbentuk menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunujukkan adanya steroid. Uji Tanin. Ekstrak jawer kotok sebanyak 0.1 gram ditambahkan 5 mL akuades kemudian dididihkan selama 5 menit. Larutan ini disaring dan filtratnya ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Uji Minyak Atsiri. Sampel ekstrak jawer kotok dilarutkan dalam alkohol lalu diuapkan hingga kering. Jika berbau aromatis yang spesifik maka sampel mengandung minyak atsiri. Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) Penentuan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) dilakukan setelah diketahui filtrat daun jawer kotok memilliki aktivitas antibakteri. KHTM adalah konsentrasi terendah komponen antibakteri yang menyebabkan tidak terjadinya pertumbuhan bakteri sekitar lubang pada masa inkubasi 24 jam. Metode analisis yang digunakan dalam penentuan ini adalah metode Bintang (1993) yang merupakan modifikasi dari metode perforasi. Biakan bakteri uji ditanam satu ose dalam 10 mL media cair kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang selama 24 jam pada suhu 37 °C. Sebanyak 100 μL biakan bakteri dengan OD ± 0,5 dicampurkan ke dalam 20 mL media agar PYG pada suhu 45°C, lalu dibiarkan sampai memadat. Kemudian pada media agar tersebut dibuat lubang dengan diameter ± 5.5 mm menggunakan ujung pipet tetes. Sampel yang digunakan adalah ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri paling besar. Ekstrak
jawer kotok ditimbang sebanyak 1.0 g kemudian dilarutkan dalam 2 mL akuades steril. Campuran yang dihasilkan selanjutnya diencerkan sehingga diperoleh konsentrasi yang bervariasi yaitu 500, 125, 75, 30, 15, dan 10, 5, 2, 1, 0.8, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 mg/mL. Sampel dengan konsentrasi ini kemudian akan diuji pada lubang media PYG yang telah diinkubasi dengan bakteri uji. Masing-masing sampel dengan konsentrasi di atas dimasukkan ke dalam lubang sebanyak 50 µL. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur zona hambat, yaitu zona atau daerah bening yang menunjukkan bakteri tidak tumbuh di sekitar filtrat tersebut. Zona bening diukur dengan menggunakan jangka sorong sebanyak empat kali pengukuran diagonal dan nilainya dirata-ratakan. Analisis Statistik Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan percobaan dua faktor dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Model rancangannya: Yij = µ + τi + εij Yij = Diameter zona hambat pada dosis ke-i dan ulangan ke-j µ = Pengaruh rataan umum τ = Pengaruh dosis ke-i ε =Pengaruh acak pada dosis ke-i ulangan ke-j dengan i: 1 = 500 mg/mL 2 = 250 mg/mL 3 = 125 mg/mL 4 = 75 mg/mL 5 = 30 mg/mL 6 = 15 mg/mL 7 = 10 mg/mL 8 = 5 mg/mL 9 = 2 mg/mL 10 = 1 mg/mL 11= 0.8 mg/mL 12= 0.5 mg/mL 13= 0.2 mg/mL 14= 0.1 mg/mL 15= 0.05 mg/mL J: 1,2. Rancangan ini digunakan pada uji antibakteri penentuan KHTM menggunakan cara perforasi metode Bintang. Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0.05. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Tukey. Semua data dianalisis dengan program SPSS 12.0.
HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Kadar Air dan Ekstraksi Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini sebelumnya diukur kadar airnya. Menurut Harjadi (1993) penentuan kadar air
berguna untuk menyatakan kandungan zat dalam tumbuhan sebagai % bahan kering, dan juga untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanan. Sampel yang baik untuk disimpan dalam jangka waktu panjang adalah sampel dengan kadar air kurang dari 10%. Pada kadar ini kemungkinan rusak terkena jamur saat penyimpanan sangat kecil (Tiagarna 2004). Kadar air yang diperoleh dari daun jawer kotok sebesar 89.30%. Karena kadar airnya tinggi maka ekstraksi daun jawer kotok menggunakan daun kering agar bisa disimpan dalam jangka waktu yang lama. Alasan lain dipilihnya daun kering untuk proses ekstraksi adalah agar rendemen yang diperoleh lebih banyak. Sebelum ekstraksi dilakukan perlu dilakukan beberapa perlakuan khusus. Daun jawer kotok yang baru dipetik dikeringudarakan terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk mematikan enzim guna mencegah terjadinya oksidasi enzimatik atau hidrolisis senyawaan yang akan diisolasi. Proses penyeleksian dilakukan untuk mendapatkan hanya bagian daun saja dari tanaman jawer kotok yang selanjutnya akan diolah. Selain itu, penyeleksian ini juga bertujuan untuk menghindari pencemaran oleh tanaman jawer kotok yang busuk (rusak) oleh organisme atau tanaman lainnya. Hal ini harus dilakukan dengan cermat untuk menghindari terjadinya penyimpangan data analisis yang disebabkan oleh terekstraknya senyawa dari bahan pencemar tersebut (Harborne 1987). Ekstraksi daun jawer kotok menggunakan teknik maserasi. Maserasi digunakan untuk mengekstrak sampel yang relatif tidak tahan panas. Teknik ini digunakan karena relatif sederhana tapi menghasilkan produk yang baik (Meloan 1999). Maserasi ini dilakukan dengan merendam daun kering jawer kotok dengan pelarut selama 3x24 jam dengan mengganti pelarut setiap 24 jam. Hal ini dilakukan untuk memperoleh hasil ekstrak yang maksimal. Perbandingan bahan dan pelarut dapat mempengaruhi hasil ekstraksi. Menurut Melawati (2006) perbandingan yang baik antara pelarut dan bahan adalah 1:10. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan perbandingan tersebut Pelarut yang digunakan untuk maserasi pada penelitian ini adalah heksana, air, dan aseton. Pemilihan pelarut berdasarkan prinsip kelarutan yaitu ”like disolve like” artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar, demikian juga sebaliknya pelarut nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar, pelarut organik akan melarutkan senyawa organik
(Khopkar 1990). Penggunaan berbagai jenis pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda ini bertujuan agar senyawa yang belum diketahui jenisnya dapat terekstrak secara optimal, baik secara kualitatif maupun kuantitatif pada salah satu jenis pelarut yang digunakan (Murni 1998). Ketiga ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan untuk mengetahui persen rendeman. Pemekatan dilakukan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu untuk mencegah kemungkinan 40oC terjadinya kerusakan komponen yang terkandung dalam ekstrak. Ekstrak yang dihasilkan dihitung nilai rendemennya. Rendemen paling tinggi diperoleh dari ekstraksi dengan menggunakan air yaitu sebesar 25.94%. Ekstraksi dengan menggunakan aseton dan heksana menghasilkan rendemen masing-masing sebesar 11.19% dan 6.37%. Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terdapat pada daun jawer kotok cenderung bersifat polar berdasarkan jumlah ekstrak dari jenis pelarut yang menghasilkan rendemen terbesar. Nilai rendemen yang diperoleh cukup tinggi untuk tanaman yang mengandung air seperti jawer kotok. Tanaman lain yang kandungan airnya cukup tinggi adalah cocor bebek. Gani (2007) dalam penelitiannya mendapatkan ekstrak heksana dari cocor bebek sebesar 2.09%. Hasiul ini lebih rendah dibandingkan hasil rendemen yang diperoleh oleh peneliti.
Aktivitas Antibakteri Filtrat Daun Jawer Kotok Penelitian pendahuluan yang dilakukan adalah pengujian aktivitas antibakteri filtrat daun jawer kotok terhadap bakteri uji dengan menggunakan metode Bintang. Filtrat yang digunakan adalah filtrat daun muda dan daun tua tanaman jawer kotok. Penelitian pendahuluan ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas antibakteri daun muda dan daun tua. Daun yang memiliki aktivitas antibakteri lebih besar akan digunakan untuk proses ekstraksi. Gambar 2 menunjukkan bahwa daun muda dan daun tua memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji. Ini ditunjukkan dengan adanya zona bening disekitar lubang yang telah diisi oleh filtrat daun jawer kotok. Zona hambat bakteri yang dihasilkan oleh filtrat daun muda dan daun tua berbeda-beda terhadap keempat bakteri uji.
Tabel 3 Aktivitas antibakteri menurut David Stout 16
Aktivitas Antibakteri Lemah Sedang Kuat Sangat kuat
14 12 10 zona hambat8 (mm) 6 4 2 0 B. subtilis S.aureus
E. coli P. aeruginosa
bakteri uji
Gambar 2 Aktivitas antibakteri filtrat daun muda ( ) dan daun tua ( ) tanaman jawer kotok. Aktivitas antibakteri daun muda dan daun tua sama dalam menghambat bakteri S. aureus. Zona hambat yang dihasilkan daun muda dan daun tua terhadap bakteri ini masing-masing sebesar 14.4583 mm. Daun muda memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar dibandingkan daun tua dalam menghambat bakteri B. subtilis Zona hambat yang dihasilkan oleh daun muda dan daun tua masing-masing sebesar 10.3750 mm dan 9.8333 mm. Berbeda halnya dengan bakteri E. coli dan P. aeruginosa, aktivitas antibakteri daun tua lebih besar dibandingkan daun muda. Zona hambat daun tua dan daun muda terhadap E. coli masing-masing sebesar 14.5833 mm dan 13.5833 mm sedangkan terhadap P. aeruginosa masing-masing sebesar 13.5 mm dan 13.125 mm. Pembagian aktivitas antibakteri menggunakan metode David Stout berdasarkan atas ukuran diameter zona hambat (Suryawiria 1978). Pembagiannya dapat dilihat pada Tabel 3. Berdasarkan metode David Stout, aktivitas antibakteri filtrat daun jawer kotok terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5. Pada bakteri B. subtilis, filtrat daun tua tanaman jawer kotok menghasilkan zona hambat 5-10 mm maka filtrat daun tua jawer kotok tersebut termasuk ke dalam antibakteri berkekuatan sedang, sedangkan daun jawer kotok muda memiliki zona hambat 10-20 mm sehingga bersifat antibakteri dengan kekuatan kuat. Filtrat daun muda maupun daun tua pada ketiga jenis bakter uji lainnya yaitu S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa memiliki zona hambat antara 10-20 mm sehingga termasuk ke dalam antibakteri kuat.
Diameter Zona Hambat (mm) <5 5-10 10-20 >20
Tabel 4 Aktivitas antibakteri filtrat daun tua tanaman jawer kotok Bakteri uji B. subtilis S. aureus E .coli P. aeruginosa Tabel 5
Diameter zona hambat (mm) 9,8333 14,4583 14,5833 13,5000
Aktivitas Antibakteri Sedang Kuat Kuat Kuat
Aktivitas antibakteri filtrat daun muda tanaman jawer kotok
Bakteri uji B. subtilis S. aureus E .coli P. aeruginosa
Diameter zona hambat (mm) 10,3750 14,4583 13,5833 13,1250
Aktivitas Antibakteri Sedang Kuat Kuat Kuat
Daun tua selanjutnya digunakan untuk proses ekstraksi karena secara umum aktivitas antibakteri daun tua lebih besar dibandingkan daun muda terhadap bakteri uji terutama P. aeruginosa. Bakteri ini merupakan bakteri yang paling patogen dibandingkan bakteri uji yang lain. Alasan lain dipilihnya daun tua karena daun tua lebih banyak tersedia daripada daun muda. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Jawer Kotok Ekstrak heksana, aseton, dan akuades daun jawer kotok kering yang diperoleh dari proses maserasi diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri uji. Ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar akan digunakan untuk uji selanjutnya yaitu uji Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan analisis fitokimia. Gambar 3 menunjukkan bahwa ekstrak aseton memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar terhadap keempat jenis bakteri uji yang digunakan.
20 18 16 14 12 zona hambat 10 (mm) 8 6 4 2 0 B. subtilis
S.aureus
E. coli
P. aeruginosa
bakteri uji
Gambar 3 Aktivitas antibakteri ekstrak aseton ( ), heksana ( ), dan akuades ( ) daun jawer kotok 0.2 g/mL. Diameter zona hambat ekstrak aseton 0.2 g/mL terhadap bakteri B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa berturut-turut adalah 20, 19.0833, 18.2083, dan 17.2333 mm. Diameter zona hambat ekstrak air 0.2 g/mL terhadap terhadap bakteri B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa berturutturut adalah 11.25, 10.8333, 10.5417, dan 10.2083 mm. Sedangkan zona hambat untuk heksana paling kecil dibandingkan kedua ekstrak lainnya. Diameter zona hambat ekstrak heksana terhadap B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa masingmasing adalah 9.5417, 10.1667, 9.9167, dan 7.2917 mm. Ekstrak aseton dan akuades memiliki kekuatan antibakteri yang kuat terhadap bakteri B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa karena memiliki diameter zona hambat antara 10-20 mm. Ekstrak heksana memiliki kekuatan antibakteri sedang terhadap bakteri B. subtilis karena memiliki zona hambat antara 5-10 mm. Ekstrak ini berkekuatan kuat terhadap bakteri S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa. Analisis Fitokimia Ekstrak Aseton Daun Jawer Kotok Analisis fitokimia dilakukan pada ekstrak aseton daun jawer kotok kering. Analisis fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit pada suatu tanaman secara kualitatif. Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa metabolit yang diharapkan dapat berperan sebagai antibakteri. Senyawa-senyawa yang diuji antara lain alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid, steroid, tanin, dan minyak atsiri. Hasil analisis fitokimia dapat dilihat pada Tabel 5. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak aseton daun jawer kotok mengandung senyawa alkaloid dan steroid. Pada uji
alkaloid hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan coklat dengan pereaksi Wagner, terbentuk endapan putih dengan pereaksi Mayer, dan adanya endapan merah dengan pereaksi Dragendorf. Adanya steroid ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau. Kedua senyawa ini diduga sebagai senyawa antibakteri pada ekstrak aseton daun jawer kotok.Hasil analisis fitokimia ini sesuai dengan Asiamaya (2000) yang menyatakan bahwa daun jawer kotok mengandung minyak atsiri (karvakrol, eugenol, dan etil salisilat), zat-zat alkaloida, mineral serta sedikit lendir. Namun analisis fitokimia pada penelitian ini tidak menunjukkan adanya minyak atsiri. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh sifat minyak atsiri yang mudah menguap sehingga senyawa ini kemungkinan menguap karena pemanasan pada saat pengeringan daun. Alkaloid merupakan golongan terbesar dari senyawaan hasil metabolit sekunder pada tumbuhan Alkaloid dapat ditemukan dalam berbagai bagian tanaman seperti biji, daun, ranting, dan kulit kayu. Alkaloid umumnya dinyatakan sebagai senyawa basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, yang biasanya merupakan bagian dari sistem siklik (Suradikusumah 1989) Alkaloid adalah senyawa turunan asam amino dan dibagi berdasarkan kerangka asam amino yang menyusunnya. Alkaloid dianggap turunan asam amino diindikasikan dengan terdapatnya atom nitrogen di dalam kerangka suatu senyawa. Atom nitrogen merupakan donor elektron (kelebihan 1 pasang elektron) dan bersifat basa atau alkali. Sehingga senyawa-senyawa golongan ini disebut alkaloid (Saefudin 2006). Alkaloid dapat beracun bagi manusia dan banyak mempunyai kegiatan fisiologis yang menonjol sehingga dapat digunakan secara luas dalam bidang pengobatan. Alkaloid biasanya tidak berwarna, bersifat optis aktif, berbentuk kristal dan hanya sedikit yang berupa cairan pada suhu kamar (Harborne 1987). Tabel 5
Hasil analisis fitokimia ekstrak aseton daun jawer kotok
Senyawa Alkaloid Saponin Flavonoid Triterpenoid Steroid Tanin Minyak Atsiri
Hasil + + -
Alkaloid diterpenoid yang diisolasi dari tanaman memiliki sifat antimikrob (Naim 2004). Mekanisme penghambatan senyawa alkaloid terhadap bakteri belum jelas. Namun Robinson (1998) menyatakan bahwa alkaloid dapat mengganggu terbentuknya jembatan seberang silang komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel. Sterol pada umumnya dianggap hanya ada pada binatang sebagai hormon seks, asam empedu dan sebagainya. Akhir-akhir ini semakin bertambah jumlah senyawa sterol yang terdapat dalam jaringan tumbuhan. Sterol tersebut dinamakan sebagai fitosterol. Tiga fitosterol yang banyak terdapat dalam tumbuhan tingkat tinggi adalah sitosterol, stigmasterol, dan kampesterol. Sterol adalah triterpen yang bentuk dasarnya sistem cincin siklopentana perhidrofenantren, fitosterol berbeda secara struktural dengan sterol binatang. Perbedaannya dengan kolesterol terutama adalah adanya substitusi gugus metil, etil, atau etiliden pada atom C24 (Suradikusumah 1989). Menurut Zhu et al. (2000) dan Varricchio et.al (1967) steroid dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif. Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) adalah konsentrasi terendah suatu antibiotik atau antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Nilai KHTM akan spesifik untuk setiap kombinasi dari antibiotik dan mikroba. KHTM sebuah antibiotik terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitivitas mikroba terhadap antibiotik. Nilai KHTM berlawanan dengan sensitivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai KHTM dari sebuah antibiotik, maka sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. Menurut Wattimena (1991) suatu antibakteri dikatakan mempunyai aktivitas yang tinggi bila KHTM terjadi pada kadar antibiotik yang rendah tapi mempunyai daya bunuh/daya hambat yang besar. Konsentrasi yang digunakan untuk uji KHTM bervariasi antara 0.05 mg/mL sampai 500 mg/mL. Zona hambat yang dihasilkan oleh ekstrak daun jawer kotok dengan berbagai konsentrasi tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.
25 20 zona hambat 15 (mm) 10 5 0 B. subtilis S.aureus
E. coli
P. aeruginosa
bakteri uji
Gambar 4 Daya hambat ekstrak aseton daun jawer kotok pada berbagai konsentrasi. 500 125 75 30 15 10 5 2 1 0.8 0.5 0.3 0.2 0.1 0.05 Variasi konsentrasi yang digunakan menghasilkan aktivitas antibakteri yang berbeda-beda terhadap keempat bakteri uji. Konsentrasi 500 mg/mL memiliki zona hambat yang paling besar. Konsentrasi ini memiliki kekuatan aktivitas antibakteri yang sangat kuat karena diameter zona hambatnya lebih dari 20 mm. Zona hambat ekstrak ini terhadap bakteri B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa berturut-turut adalah 21.2875, 23.1375, 20.8875, dan 20.7188 mm. Konsentrasi 0.1 mg/mL merupakan konsentrasi paling rendah yang dapat menghambat pertumbuhan keempat bakteri uji. Konsentrasi ini memiliki kekuatan aktivitas antibakteri yang sedang karena memiliki diameter zona hambat 5-10 mm. Diameter zona hambat yang dihasilkan terhadap bakteri B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa berturut-turut adalah 6.6438, 6.5, 6.8062, dan 6.6188 mm. Diameter zona hambat bakteri P. aeruginosa paling kecil dibandingkan ketiga bakteri uji lainnya. Hal ini mungkin disebabkan karena P. aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif yang lebih tahan terhadap berbagai jenis antibakteri karena struktur dinding selnya yang lebih kompleks. Menurut Lay & Hastowo (1992) infeksi oleh bakteri ini tidak selalu bisa disembuhkan dengan obat. Selain memiliki enzim β-laktamase, bakteri ini juga memiliki berbagai protein pada membran luar yang berperan dalam pertahanan terhadap molekul berbahaya termasuk antibakteri.
Hasil uji statistik menunjukkan bahwa pada keempat bakteri uji terdapat korelasi positif antara konsentrasi ekstrak dengan aktivitas antibakteri, yaitu semakin besar konsentrasi ekstrak yang ditambahkan maka aktivitas antibakteri semakin besar pula yang ditunjukkan dengan semakin besarnya diameter zona hambat Hasil uji statistik juga menunjukkan bahwa aktivitas antibibakteri ekstrak dengan konsentrasi 500 mg/mL ternyata tidak berbeda nyata dengan ekstrak 125 mg/mL terhadap keempat bakteri uji. Sedangkan konsentrasi lainnya memiliki diameter zona hambat yang berbeda nyata. Perbandingan Penghambatan Ekstrak Daun Jawer Kotok Terhadap Ampisilin Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah ampisilin 0.4 mg/mL. Ampisilin digunakan sebagai kontrol positif dalam penentuan aktivitas antibakteri daun jawer kotok karena ampisilin merupakan turunan dari penisilin yang mempunyai spektrum antibakteri yang luas. Gambar 5 menunjukkan zona hambat ampisilin konsentrasi 0.4 mg/mL terhadap bakteri uji. Zona hambat ampisilin terhadap B. subtilis, S. aureus, E. coli, dan P. aeruginosa masingmasing sebesar 26.2, 25.6042, 24.7708, dan 25.5292 mm. Diameter zona hambat yang dihasilkan oleh ekstrak aseton daun jawer kotok pada semua konsentrasi (0.05-500 mg/mL) terhadap keempat bakteri uji belum sebanding dengan dengan ampisilin 0.4 mg/mL. Zona hambat dari ampisilin sebagai kontrol mempunyai diameter zona hambat yang lebih besar jika dibandingkan dengan ekstrak daun jawer kotok walaupun konsentrasi kontrol jauh lebih rendah dari konsentrasi ekstrak. Hal ini dapat disebabkan ekstrak daun jawer kotok merupakan ekstrak kasar yang masih mengandung bahan organik lain selain senyawa antibakteri Perbandingan diameter zona bening ampisilin dan ekstrak daun jawer kotok dapat dilihat pada Gambar 6. 26.5 26 zona hambat (mm)
25.5 25 24.5 24 B. subtilis
S.aureus
E. coli
P. aeruginosa
bakteru uji
Gambar 5
Daya hambat ampisilin 0.4 mg/mL.
30 25 20 zona hambat 15 10 5 0 500
30
5
0.8
0.2
Ampisilin
konsentrasi (mg/mL)
Gambar 6 Perbandingan daya hambat ekstrak aseton daun jawer kotok terhadap ampisilin 0.4 mg/mL. ( ) B. subtilis,( ) S. aureus ( )E. coli ( ) P. aeruginosa Hasil penelitian ini secara umum menunjukkan bahwa bakteri Gram positif (B. subtilis dan S. aureus) lebih mudah dihambat oleh ekstrak daun jawer kotok. Hal ini disebabkan oleh struktur dinding sel bakteri Gram positif yang relatif sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja. Sedangkan struktur dinding sel bakteri Gram negatif lebih kompleks, berlapis tiga yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa lipopolisakarida, dan lapisan dalam berupa peptidoglikan (Pelczar & Chan 1986). Membran terluar bakteri Gram negatif dapat menghalangi penembusan senyawa antibakteri (Siswandono & Soekardjo 1995)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Daun jawer kotok (Coleus scutellaroides (L.) Benth. ) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus) dan bakteri Gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa). Aktivitas filtrat daun tua lebih besar jika dibandingkan dengan filtrat daun muda. Ekstrak aseton memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar dibandingkan dengan ekstrak air dan heksana. Uji fitokimia menunjukkan ekstrak aseton daun jawer kotok mengandung alkaloid dan steroid. Konsentrasi ekstrak berbanding lurus dengan zona hambat yang dihasilkan. Semakin tinggi konsentrasi maka zona hambat yang dihasilkan lebih besar pula. Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) bakteri
B. subtilis, S. aureus, E. coli dan S. aureus adalah sebesar 0.1 mg/mL dengan zona hambat masing-masing adalah 6.6438 6.500, 6.8062, dan 6.6188 mm. Saran Saran untuk penelitian lanjutan adalah perlu dilakukan penelitian aktivitas antibakteri dari bagian tanaman jawer kotok yang lain serta spesies tanaman jawer kotok yang lain. Selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui jumlah bakteri yang mampu dibunuh atau dihambat oleh ekstrak kasar daun jawer kotok serta perlu dilakukan pemurnian dan identifikasi senyawa kimia yang berperan sebagai antibakteri pada tanaman ini
DAFTAR PUSTAKA Adijuwana, Nur MA. 1989. Teknik Spektroskopi dalam Analisis Biologi. Bogor: Pusat Antar Universitas IPB.
Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Gan S et al. 1980 Farmakologi dan Terapi. Ed ke-2. Jakarta: Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia. Gani A. 2007. Aktivitas antibakteri ekstrak kasar daun cocor bebek (Kalanchoe gastonis-bonnieri) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Mathode. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Anderson WAD. 1961. Pathology. Fourth Edition.USA: The Mosby CV.
Irianto K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Jilid I. Bandung: Yrama Widya.
Asiamaya. 2000.Ileur (Coleus atropurpureus [L.]). [terhubung berkala]. http://www.asiamaya.comjamuisiilr_col eusatropurpureus.htm. [9Desember 2006].
Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptohardjo A, penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Bauer
Lay W & Hastowo S. 1992. Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali.
AN et al. 1968. Antibiotic susceptibility testing by standardize single disc method. Am of Clin Panthol. 45:493-496.
Bintang M. 1993. Studi antimikroba dari Streptococcus lactis BCC 2259 [disertasi]. Bandung: Program Doktor Institut Teknologi Bandung. Buckle KA, et.al. 1985. Ilmu Pangan. Purnomo H, Adiono, penerjemah; Jakarta UI Pr. Dalimarta S. 2000. Atlas Tumbuhan Indonesia. Jilid ke-2. Jakarta: Trubus Agriwidya. [Depkes]. Departemen Kesehatan. 2000. Coleus blumei Benth. [terhubung berkala].http://bebas.vlsm.orgv12artike lttg_tanaman_obat/depkesbuku22072.pdf) [8 Maret 2007]. Fardiaz S. 1983. Bakteriologi Keamanan Pangan. Jilid I. Bogor: Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor.
Mckanne L, Kandel J. 1996. Microbiology Essentials and Aplication. Ed ke-2. New York: McGraw Hill. Melawati. 2006. Optimasi proses maserasi Paniilli (Vanilla planifolia A) hasil modifikasi proses kuring [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Meloan CE. 1999. Chemical Separation. New York: J. Willey. Mukhopadhyay M. 2002. Natural Extract Using Supercritical Carbondioxide. London: CRC Pr. Murni
A. 1998. Penapisan senyawa antibakteri dari ekstrak daun babadotan (Ageratum conyzoides [L.]) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Naim R. 2004. Senyawa antimikroba dari tanaman. [terhubung berkala].
http://www.kompas.com/kompascetak/0 409/15/sorotan/1265264.htm. [28 Juni 2007].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Volume ke-1.2. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Varricchio F, Norman JD, Audrey S. 1967. Fffect of azasteroids on Gram-positive bacteria. Journal of Bacteriology. 93(2):627-635
Praptiwi. 1999. Jawer kotok bikin wasir terpojok. [terhubung berkala]. http://www.indomedia.com/intisari/199 9/juli/jawer.htm. [9 Desember 2006]. Saifudin A. 2006. Alkaloid: Golongan paling prospek menghasilkan obat baru. [terhubung berkala]. http://www.ums. ac.id/fakultas/farmasi/?pilih=lihat&id= 11. [27 Juni 2007]. Schunack W, Mayer K, Haake M. 1990. Senyawa Obat. Ed ke-2. Wattimena JR, Subino, penerjemah; Yogyakarta: UGM Pr. Sclegel HG, Schmidt K. 1994. Mikrobiologi Umum. Tedjo RM, Baskoro, penerjemah; Yogyakarta: UGM Pr. Siswandono, Soekardjo B. 1995. Kimia Medisinal. Surabaya: Erlangga. Suradikusumah E. 1989. Kimia Tumbuhan. Bogor: Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati, Institut Pertanian Bogor. Suryawiria U. 1978. Mikroba Lingkungan. Ed ke-2. Bandung: ITB Pr. Tiagarna P. 2004. Uji toksisitas akut ekstrak air dan ekstrak etanol 30% dari buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) pada mencit [skripsi].
Wattimena, et al. 1991. Farmakodinamik dan Terapi Antibiotik. Yogyakarta: UGM Pr. Widyaratib A. 2003. Interaksi antara immunoglobulin G (IgG) berbagai jenis serum mamalia dengan protein A Staphylococcus aureus menggunakan metode hambatan pertumbuhan [skripsi]. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Winarno, Fardiaz D, Fardiaz S. 1973. Ekstraksi, Kromatografi, dan Elektroforesis. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Wulandari NDM. 2005. Perbandingan metode ekstraksi buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) dan uji toksisitas subkronis pada tikus putih [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Zhu Y et al. 2000. Epoxide sesquiterpenes and steroids from cremanthodium discoideum. Australian Journal of Chemistry 53(10):831-834.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Daun Jawer Kotok
Ekstrak
Asetonn
Air
Analisis Kadar Air
Heksana
Filtrat
Daun Tua
Daun Muda
Aktivitas Antibakteri
Ekstrak
KHTM
Uji Fitokimia
Lampiran 2 Proses ekstraksi Daun jawer kotok
Maserasi dengan heksana
Maserasi dengan air
filtrasi
filtrasi
filtrat
filtrat
evaporasi
evaporasi
ekstrak
ekstrak
Uji antibakteri
Maserasi dengan aseton dingin
filtrasi
filtrat
evaporasi
ekstrak
Lampiran 3 Uji aktivitas antibakteri metode Bintang (1993)
Shaker 24 jam, 37°C
Media cair (NB) 50 µL
PYG Biarkan sampai padat
lubangi dengan ujung pipet tetes
Zona bening diukur
Filtrat dan ekstrak daun jawer kotok (50µL)
Inkubasi 24 jam 27°C
Lampiran 4 Kadar air daun jawer kotok segar Ulangan
1 2 3
Bobot cawan + sampel Bobot cawan + sampel sebelum dikeringkan setelah dikeringkan W1 W2 (g) (g) 37,7717 36,7325 32,5912 31,5621 32,6789 31,5795 Rataan
Bobot sampel W (g) 1,1579 1,1521 1,2378
Contoh perhitungan: % kadar air = W1 + W2 x 100% W Nilai kadar air ulangan 1 = (37,7717-36,7325) x 100% = 89,75% 1,1579
Lampiran 5 Nilai rendemen ekstrak daun jawer kotok Pelarut Aseton Heksana Akuades
Bobot kering sampel (g) 30,0634 30,0264 30,0712
Bobot kosong labu (g) 79,5360 118,6750 109,6013
Bobot labu + ekstrak (g) 82,8996 120,5871 117,4032
Rendemen (%) 11,19 6,37 25,94
Contoh perhitungan ►Rendemen aseton Rendemen = (Bobot labu + ekstrak) - (Bobot kosong labu) x 100 % Bobot sampel = 82,8996- 79,5360 x 100% 30,0634 = 11,19 %
Kadar air (%)
89,75 89,32 88,82 89,30 ± 0,46
Lampiran 6 Diameter zona hambat filtrat daun jawer kotok segar Bakteri
Ulangan
Bacillus subtilis
1 2 3 Rataan
Staphylococcus aureus
1 2 3 Rataan
Escherichia coli
1 2 3 Rataan
Pseudomonas aeruginosa
1 2 3 Rataan
Diameter zona hambat (mm) Daun Tua Daun Muda 9,1250 9,3750 10,3750 10,8750 10,0000 10,8750 9,8333 ± 0,64 10,3750 ± 0,87 13,2500 13,0000 15,2500 15,8750 14,8750 14,5000 14,4583 ± 1,06 14,4583 ± 1,44 16,2500 12,3750 10,7500 15,5000 16,7500 12,8750 14,5833 ± 3,33 13,5833 ± 1,68 13,7500 13,3750 13,3750 12,7500 13,3750 13,2500 13,5000 ± 0,22 13,1250 ± 0,33
Lampiran 7 Foto diameter zona hambat filtrat daun jawer kotok
`B. subtilis
E.coli Keterangan: M: Filtrat daun muda T : Filtrat daun tua
S. aureus
P. aeruginosa
Lampiran 8 Diameter zona hambat ekstrak daun jawer kotok kering 0,2 g/mL Bakteri
Pelarut
Bacillus subtilis
Aseton Heksana Akuades Aseton Heksana Akuades Aseton Heksana Akuades Aseton Heksana Akuades
Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Diameter zona hambat (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 18,7500 21,0000 20,2500 9,2500 9,3750 10,0000 9,7500 12,7500 11,2500 19,8750 18,1250 19,2500 10,8750 9,6250 10,0000 11,3750 10,1250 11,0000 16,7500 19,0000 18,8750 7,6250 11,3750 10,7500 10,2500 10,6250 10,7500 17,1250 16,3750 18,5000 7,3750 7,5000 7,0000 9,5000 10,8750 10,2500
Rataan (mm) 20,000 ± 1,15 9,5417 ± 0,40 11,2500 ± 1,5 19,0833 ± 0,89 10,1667± 0,64 10,8333 ± 0,64 18,2083 ± 1,26 9,9167 ± 2,00 10,5417 ± 0,26 17,2333 ± 1,08 7,2917 ± 0,26 10,2083 ± 0,69
Lampiran 9 Foto zona hambat ekstrak daun jawer kotok
S. aureus
B. subtilis
P. aeruginosa
E.coli
Keterangan: Ak : Ekstrak akuades As : Ekstrak aseton H : Ekstrak heksana KH : Kontrol heksana KAs : Kontrol aseton
Lampiran 10 Diameter zona hambat ampisilin 0,04 mg/mL Bakteri Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Diameter Zona Hambat (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 26,5250 26,6750 25,4000 25,2750 26,1250 25,4125 25,9750 23,1625 25,1750 24,8125 25,5750 26,2000
Rataan (mm) 26,2000 ± 0,70 25,6042 ± 0,46 24,7708 ± 1,45 25,5292 ± 0,69
Lampiran 11 Foto diameter zona hambat ampisilin
S.aureus
B. subtilis
E. coli
P. aeruginosa
E. coli
Lampiran 12 Diameter zona hambat ekstrak aseton daun jawer kotok Bakteri Bacillus subtilis
Konsentrasi (mg/mL) 500 125 75 30 15 10 5 2 1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05
Diameter zona hambat (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 20.7750 21.8000 19.125 21.0500 18.325 20.4500 15.375 15.2500 15.1500 12.4750 14.8750 11.7250 9.7750 11.4500 12.3250 10.6250 9.0500 9.7750 11.2000 10.3750 8.3625 8.3750 7.8750 8.1000 7.3000 7.7750 6.8125 6.4750 0,0000 0,0000
Rataan (mm) 21.2875 ± 0.72 20.0875 ± 1.36 19.3875 ± 1.50 15.3125 ± 0.09 13.8125 ± 1.89 13.3000 ± 2.23 10.6125 ± 1.18 11.4750 ± 1.20 9.4125 ± 0.51 10.7875 ± 0.58 8.3688 ± 0.01 7.9875 ± 0.16 7.5375 ± 0.34 6.6438 ± 0.24 0,0000 ± 0,00
Lanjutan lampiran 12 Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
500 125 75 30 15 10 5 2 1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 500 125 75 30 15 10 5 2 1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 500 125 75 30 15 10 5 2 1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05
23.1250 22.7750 20.9250 17.2250 18.1250 17.0750 15.2500 13.0000 10.0000 10.0500 8.9250 8.6750 8.1750 6.4250 0,0000 20.3000 19.1000 18.2000 15.3250 14.8750 14.9000 14.6750 10.7750 9.6500 9.0250 8.5125 8.2875 7.8750 6.8000 0,0000 19.9625 18.6750 17.4000 17.7000 17.4250 17.7000 14.3875 12.1250 8.3125 9.4000 8.0750 7.4750 6.4000 7.2125 0,0000
23.1500 20.7000 19.5750 17.4000 15.6000 15.7750 12.8250 12.3250 10.7750 10.7125 9.4500 7.1250 8.4750 6.5750 0,0000 21.4750 18.9500 18.2375 14.8750 15.0750 14.7500 10.9500 10.5750 9.7875 10.3750 8.3625 8.1000 7.7750 6.8125 0,0000 21.4750 20.2250 18.8750 15.2500 13.9500 13.6000 11.8500 9.6500 8.4500 8.8500 8.0250 7.2250 5.6000 6.0250 0,0000
23.1375 ± 0.02 21.7375 ± 1.47 20.2500 ± 0.95 17.3125 ± 0.12 16.8625 ± 1.79 16.4250 ± 0.92 14.0375 ± 1.71 12.6625 ± 0.48 10.3875 ± 0.55 10.3812 ± 0.47 9.1875 ± 0.37 7.8995 ± 1.10 8.3250 ± 0.21 6.500 ± 0.11 0,0000 ± 0,00 20.8875 ± 0.83 19.0250 ± 0.11 18.2188 ± 0.03 15.1000 ± 0.32 14.9750 ± 0.14 14.8250 ± 0.11 12.8125 ± 2.64 10.6750 ± 0.14 9.7188 ± 0.10 9.7000 ± 0.95 8.4375 ± 0.11 8.1938 ± 0.13 7.8250 ± 0.07 6.8062 ± 0.01 0,0000 ± 0,00 20.7188 ± 1.07 19.4500 ± 1.10 18.1375 ± 1.04 16.4750 ± 1.73 15.6875 ± 2.46 15.6500 ± 2.90 13.1188 ± 1.79 10.8875 ± 1.75 8.3812 ± 0.10 9.1250 ± 0.39 8.0500 ± 0.04 7.3500 ± 0.17 6.0000 ± 0.57 6.6188 ± 0.84 0,0000 ± 0,00
Lampiran 13 Foto zona hambat ekstrak aseton daun jawer kotok 500
30
2
5 1
125
75
15
10
5x 10-5
0,05 5x 10-6
0,005
5x10-4
5
10
B. subtilis
75
125 1 15
30
2
500
5x 10-5
0,05 5x 10-6
S. aureus
Lanjutan lampiran 13
30
10
500
5 15
75
2
125
1
0.2
0.8
E.coli
500
10
15
30 1 125
75
2
5
5x 10-5
0,05 5x 10-6 0,005 P. aeruginosa
5x10-4
Lampiran 14 ANOVA diameter zona hambat
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Sum of Squares 908.512
Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square 14
64.894
16.632
15
1.109
925.144 1130.892
29 14
80.778
12.196
15
.813
1143.087 842.848
29 14
60.203
8.747
15
.583
851.596 969.811
29 14
69.272
28.378
15
1.892
998.188
29
F
Sig.
58.527
.000
99.352
.000
103.239
.000
36.616
.000
Lampiran 15 Analisis Tukey diameter zona hambat B. subtillis konsent rasi
N
Subset for alpha = .05 1
.05
2
2
3
4
5
6
7
8
.0000
.10
2
6.6438
.20
2
7.5375
7.5375
.30
2
7.9875
7.9875
.50
2
8.3688
8.3688
1.00
2
9.2313
9.2313
9.2313
5.00
2
10.6125
10.6125
10.6125
10.6125
.80
2
10.7875
10.7875
10.7875
10.7875
2.00
2
11.4750
11.4750
11.4750
10.00
2
13.3000
13.3000
15.00
2
30.00
2
13.8125
11.475 0 13.300 0 13.812 5 15.312 5
15.3125
75.00
2
125.00
2
20.0875
500.00
2
21.2875
Sig.
19.3875
1.000
.055
.078
.063
.240
.091
.062
19.3875
.864
Lanjutan lampiran 15 S. aureus konsentrasi
N
.05 .10 .30 .20 .50 .80
2 2 2 2 2 2
1.00
2
2.00
2
5.00 10.00 15.00 30.00 75.00 125.00 500.00 Sig.
2 2 2 2 2 2 2
Subset for alpha = .05 1 .0000
2
3
6.5000 7.9000 8.3250 9.1875
4
7.9000 8.3250 9.1875 10.3813
5
9.1875 10.381 3 10.387 5 12.662 5
10.3875
6
.262
.356
.064
14.0375 16.4250 16.8625 17.3125
.952
16.8625 17.3125 20.2500
.093
.076
E.coli konsentrasi .05 .10 .20 .30 .50 .80 1.00 2.00 5.00 10.00 15.00 30.00 75.00 125.00 500.00 Sig.
N
Subset for alpha = .05 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
1 .0000
2 6.8063 7.8250 8.1938 8.4375 9.7000 9.7188
1.000
.068
3
7.8250 8.1938 8.4375 9.7000 9.7188 10.6750
.079
8
12.6625 14.0375
1.000
7
4
10.6750 12.8125
.337
5
6
12.8125 14.8250 14.9750 15.1000
.256
18.2188 19.0250 20.8875 .117
20.2500 21.7375 23.1375 .188
Lanjutan lampiran 15 P. aeruginosa konsentrasi .05 .20 .10 .30 .50 1.00 .80 2.00 5.00 10.00 15.00 30.00 75.00 125.00 500.00 Sig.
N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Subset for alpha = .05 1 .0000
2 6.0000 6.6188 7.3500 8.0500 8.3813 9.1250 10.8875
1.000
.107
3
8.0500 8.3813 9.1250 10.8875 13.1188
.085
4
10.8875 13.1188 15.6500 15.6875
.118
5
13.1188 15.6500 15.6875 16.4750 18.1375
.091
6
15.6500 15.6875 16.4750 18.1375 19.4500 20.7188 .085
30
30
20
20
M e a n o f VAR 0 0 0 0 3
M ea n o f VAR 0 00 0 2
Lampiran 16 Kurva hubungan konsentrasi dengan diameter zona hambat
10
0 .05
.20 .10
.50 .30
1.00 .80
5.00 2.00
15.00 10.00
75.00
30.00
10
0 .05
500.00
30
20
20
Mean of VAR00005
Mean of VAR00004
30
10
0 .20 .10
VAR00001
.50 .30
1.00 .80
5.00 2.00
15.00 10.00
75.00
30.00
500.00
125.00
VAR00001
VAR00001
.05
.20 .10
125.00
.50 .30
1.00 .80
5.00 2.00
15.00 10.00
75.00
30.00
500.00
125.00
10
0 .05
.20 .10
VAR00001
Keterangan: VAR00001: Konsentrasi VAR00002: Diameter zona hambat terhadap B.subtilis VAR00003: Diameter zona hambat terhadap S. Aureus VAR00004: Diameter zona hambat terhadap E.coli VAR00005: Diameter zona hambat terhadap P.aeruginosa
.50 .30
1.00 .80
5.00 2.00
15.00 10.00
75.00
30.00
500.00
125.00
Lampiran 17 Foto hasil uji fitokimia
Dragendorf Flavonoid
Mayer
Wagner
Alkaloid
Flavonoid
steroid
saponin
Saponin
Steroid
tanin
Tanin
