A vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggése újszülöttekben és koraszülöttekben. Dr Szabó Miklós

A vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggése újszülöttekben és koraszülöttekben

Dr Szabó Miklós

Témavezeto: Dr Vásárhelyi Barna

Semmelweis Egyetem Budapest I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika 2005

Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola

Tartalomjegyzék

Összefoglalás Summary oldalszám 1.

Rövidítések jegyzéke

6

2.

Bevezetés

7

3.

Irodalmi áttekintés

8

3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.2.

Szabadgyökök képzodése Lipidperoxidáció Oxigéntartalmú szabadgyökök képzodése A reaktív oxigéngyökök mediálta betegségek újszülöttkorban Reaktív oxigéngyökök szerepe a BPD kialakulásában Reaktív oxigéngyökök szerepe a HIE kialakulásában ROP és szabadgyökök. Az oxigénkezelés hatása Transzfúziók szerepe a BPD és a ROP kialakulásában Az antioxidáns védelem A vasháztartásban és az antioxidáns védekezésben egyaránt szerepet játszó plazma faktorok Ceruloplazmin A ceruloplazmin antioxidáns hatása Transzferrin Ferritin A ferritin szerepe a szabadgyök reakciókban Vasmetabolizmus és vérképzés újszülöttekben és koraszülöttekben A szérumvas szint változásai a perinatális idoszakban A vérképzés változásai a méhen belüli idoszakban A vérképzés és a vasháztartás akut változásai a megszületést követoen Anémia a perinatális idoszakot követoen Rekombináns humán eritropoetin alkalmazása kissúlyú koraszülöttekben Rekombináns humán eritropoetin (rhuEPO) hatása koraszülöttek vasháztartá-sára, vaspótlás rhuEPO kezelés alatt Az EPO és eritroid hatásai Az EPO nem-eritroid hatásai

3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.3. 3.3.1. 3.3.1.1. 3.3.1.2. 3.3.2. 3.3.3. 3.3.3.1. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. 3.4.3. 3.4.4. 3.4.4.1. 3.4.4.2. 3.4.4.3. 3.4.4.4.

1

8 8 9 11 11 12 13 13 14 16 17 17 17 18 18 19 19 19 19 20 21 23 23 23

4.

Célkituzések

25

5.

Betegek és módszer

26

5.1.1.

26

5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.3.

A szérumvas és extracelluláris (EC) antioxidáns kapacitás akut perinatális változásainak vizsgálata. A szabadvas és a vasháztartásban szerepet játszó antioxidáns faktorok összefüggése érett egészséges újszülöttekben a perinatális idoszakban Koraszülöttek rhuEPO kezelésének hatása a transzfúzió igényre és a vasháztartásra. A vasháztartás változás összefüggése az antioxidáns kapacitással Laboratóriumi vizsgálatok Vasanyagcsere és vérkép vizsgálatok Antioxidáns védekezoképesség vizsgálatok Statisztikai módszerek

6.

Eredmények

33

6.1

A vasháztartás és az EC antioxidáns kapacitás változásai érett egészséges újszülöttekben a korai posztnatális idoszakban A szérumvas szintjének változásai A fehérjéhez nem kötött vas frakció, a szabadvas (NPBI) változásai Antioxidánsok változása Ferroxidáz aktivitás (ceruloplazmin) Ferritin változásai Szekunder antioxidánsok hatását tükrözo antioxidáns kapacitás változása Vasredukáló képesség (FRAP) posztnatális változása Lipidperoxidáció gátló képesség változása Az antioxidáns kapacitás és a vas-metabolizmus összefüggése A rhuEPO kezelés hatásai koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására és az EC antioxidáns kapacitásra RhuEPO hatása a vérképzésre és transzfúzió igényre Relatív retikulocita szám változásai A hematokrit értékek változásai Transzfúziók száma Szövodményállapotok gyakorisága és mellékhatások Vasháztartás paramétereinek változása rhuEPO kezelés hatására Szérumvas változása rhuEPO kezelés hatására A szérum transzferrin szint rhuEPO kezelés során Számított szabad vasköto kapacitás Ferritin változása 1 hetes rhuEPO kezelés hatása koraszülöttek EC antioxidáns kapacitására

33

5.1.2.

6.1.1.1. 6.1.1.2 6.1.2 6.1.2.1. 6.1.2.2. 6.1.2.3. 6.1.2.4. 6.1.2.5. 6.1.3. 6.2

6.2.1. 6.2.1.1. 6.2.1.2. 6.2.1.3. 6.2.1.4. 6.2.2. 6.2.2.1. 6.2.2.2. 6.2.2.3. 6.2.2.4. 6.2.3.

2

27

29 29 29 32

33 34 35 35 36 37 37 38 39 40

41 41 42 42 44 45 45 46 47 48 48

7.

Megbeszélés

50

7.1.

Újszülöttek perinatális vasanyagcsere változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel A rhuEPO kezelés hatásai koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére és vasháztartására

50

8.

Tézisek és gyakorlati jelentoség

57

9.

Publikációs lista

59

10.

Irodalomjegyzék

60

11.

Köszönetnyilvánítás

69

7.2.

3

53

Összefoglalás

Vizsgálataimmal a vasháztartás és az EC antioxidáns kapacitás összefüggéseit tanulmányoztam újszülöttekben és koraszülöttekben. Elsoként egészséges újszülöttek megszületés utáni vérmintáinak vizsgálatával arra a kérdésre kerestem a választ, hogy az EC antioxidáns védekezo képesség hogyan változik a korai neonatális adaptáció idoszakában. Az antioxidáns kapacitás vizsgálatokat a vasháztartás paramétereinek egyideju mérésével végeztem el. Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottam, hogy az újszülöttek EC antioxidáns kapacitása röviddel a megszületés után megemelkedik, jelezve, hogy az újszülött szervezete az oxidatív terhelés ellenére, képes fokozni antioxidáns védekezését. A primer és a szekunder antioxidánsok aktivitása egyaránt növekszik posztnatálisan. A szérum vas és ferritin szintjében bekövetkezo hasonló ütemu, gyors változások részben magyarázatul szolgálnak az antioxidáns védekezo képesség posztnatális javulására. Eredményeim arra utalnak, hogy az oxidatív környezet, születés okozta, megváltozásához történo gyors alkalmazkodásban, a vas-metabolizmus szélsoséges változásai lényeges szerepet töltenek be. További vizsgálataimmal igazoltam, hogy a rhuEPO kezelés csökkenti a nagy morbiditású koraszülöttek transzfúzió igényét és mérsékeli a kóros szöveti vasraktározást. A rhuEPO kezeléssel kapcsolatban a BPD és ROP szövodménybetegségek csökkeno elofordulásának tendenciáját észleltem. A rhuEPO kezelés kezdeti szakaszában, a fokozott celluláris vasfelhasználás ellenére, rövidtávon sem a vas- metabolizmus paraméterei, sem az antioxidáns védekezo képesség nem változnak számottevoen. Eredményeim alapján azt a következtetést vontam le, hogy amennyiben a rhuEPO kedvezo hatást gyakorol az antioxidáns rendszerre, akkor az csak hosszabb kezelési idoszak után válik kimutathatóvá. A rhuEPO BPD-ra és ROP-ra gyakorolt esetleges kedvezo hatását nagy esetszámú, további vizsgálatokkal lehet tisztázni.

4

Summary

The aim of our work was to investigate the association between iron metabolism and extracellular antioxidant capacity in human neonates. First, I tested the alteration of antioxidant capacity in blood specimens during the early postnatal adaptation. Simultaneously, I also measured parameters of iron metabolism. Our results indicate that extracellular antioxidant capacity of the neonate is increasing dramatically shortly after birth, indicating that neonates are able improve their antioxidant defence mechanisms in spite of oxidative stress. Both primary and secondary antioxidant activities increase during the early postnatal period. Similar kinetics of serum iron and ferritin may be an explanation for the postnatal improvement of antioxidant capacity. Our results indicate that alterations of iron metabolism may play an important role in early postnatal adaptation to extrauterine oxidative conditions. In clinical studies I demonstrated that treatment with rhuEPO decreases the transfusion requirements of preterm infants with high morbidity. Treatment with rhuEPO is also protective against abnormal iron deposition in tissues. I observed a decreased tendency for BPD and ROP in preterm infants treated with rhuEPO. In spite of accelerated cellular iron consumption I could not, however, demonstrate any short-term impact of rhuEPO on the parameters of iron metabolism and antioxidant capacity. These results indicate that any effect of rhuEPO on antioxidant capacity may be anticipated after a longer treatment period. Possible impact of rhuEPO on the risk of BPD and ROP should be tested with meta-analysis of the results of large clinical trials.

5

1. Rövidítések jegyzéke

BPD

Bronchopulmonális diszplázia

CRIB

Clinical risk index for babies

EC

Extracelluláris tér

EPO

Eritropoetin

FRAP

Ferric reducing activity of the plasma

Hgb

Hemoglobin

HIE

Hypoxiás ischaemiás encephalopathia

HSAA

Hem-specifikus antioxidáns aktivitás

Htk

Hematokrit

MDA

Malondialdehyd

NPBI

Non-protein bound iron, ( fehérjéhez nem kötött, szabadvas)

NEC

Nekrotizáló enterocolitis

PDA

Perzisztáló ductus arteriosus

PVL

Periventrikuláris leukomalacia

Randox TAS

Randox total antioxidant status

rhuEPO

Rekombináns humán eritropoetin

ROP

Koraszülött retinopátia

sTfR

Szolubilis transzferrin receptor

TVK

Teljes vasköto kapacitás

TcSat

Transzkután oxigén-szaturáció

6

2. Bevezetés Fél évszázadra tekint vissza az a megfigyelés, hogy az inadekvát oxigénterápia súlyos megbetegedést okozhat koraszülöttekben. A maradandó szervkárosodással járó neonatológiai szövodménybetegségek, mint a retrolentáris fibroplázia (ROP), bronchopulmonális diszplázia (BPD), a periventrikuláris leukomalacia (PVL) és hypoxiás- ischaemiás encephalopathia (HIE) keletkezésében nagy jelentoséggel bírnak a szabadgyökök közvetítette patológiás folyamatok. Az intenzív kutatás ellenére a mai napig nem sikerült a mindennapi gyógyítás számára hatékony antioxidáns kezelést vagy terápiát kidolgozni. Ennek a hátterében az állhat, hogy az antioxidáns rendszer perinatális fiziológiája is csak részletekben ismert. A sejtmembrán károsodása szempontjából a szabadgyökök közül kitüntetett szereppel bír a legtoxikusabb hatású szabad hidroxilgyök. Keletkezése a Fenton-reakció során a szabad, fehérjéhez nem kötött vas jelenlététol függ. Így a szervezet számos, a szabadgyök képzést meghatározó mechanizmusa közül a vasforgalomban résztvevo proteinek aktivitása, és koncentrációja nagy szerepet játszik abban, hogy a szabadgyök terhelés nyomán létrejön-e szervkárosodás. Az újszülöttek és koraszülöttek vasforgalmának perinatális fiziológiás változásai a vasháztartást jellemzo paraméterek rövidtávú, szélsoséges változásait eredményezik. Korábban nem történt olyan átfogó, klinikai szintu vizsgálat, amely a vasháztartás és a vasfüggo antioxidáns tulajdonságok perinatális, egyideju változásait, és ezek lehetséges kapcsolatát vizsgálta volna újszülötteken. Ezen összefüggések mélyebb megismerése két szempontból is indokolt. Egyre világosabban körvonalazódik, hogy az érett újszülöttek hypoxiás ischaemiás károsodásainak, elsosorban az encephalopathiának egyik lehetséges jövobeni terápiája a reperfúzió során keletkezett extrém mennyiségu szabadvas semlegesítésében rejlik. Másrészt egyre kiterjedtebben kerül alkalmazásra koraszülöttekben a vasháztartás mélyreható változásait okozó eritropoetin kezelés. Kutatómunkám során ezért az újszülöttkori vasháztartás perinatális változásának a leírását tuztem ki célul. Ennek során elemeztem a vasháztartás és az antioxidáns kapacitás változásainak összefüggését, illetve kitértem a vasháztartás és az azt alapvetoen befolyásoló rekombináns humán eritropoetin (rhuEPO) kezelés közötti kapcsolatra.

7

3. Irodalmi áttekintés 3.1. Szabadgyökök képzodése

A szabadgyökök olyan molekulák, amelyeknek külso elektronhéján egy vagy több párosítatlan elektron található, és ennek köszönhetoen igen reakcióképesek. Fiziológiás körülmények között is keletkeznek szabadgyökök, ezek azonban nem jelentenek veszélyt az organizmus számára, mindaddig, amíg a védekezo mechanizmusok megfelelo egyensúlyt tartanak fenn. Az emberi szervezetben legrészletesebben ismert két szabadgyök keletkezési út a lipidperoxidáció és az oxigén tartalmú szabadgyökök képzodése. 1

3.1.1. Lipidperoxidáció

A lipidperoxidáció során a többszörösen telítetlen zsírsavakból reaktív molekulák képzodhetnek, amelyek láncreakció-szeruen további szabadgyökök képzodését eredményezik. A folyamat három szakaszra osztható.

2

1. Iniciáció: valamilyen szabadgyök hatására a lipid (R) hidrogénelvonással lipidszabadgyökké (R.) alakul X. + R? R. + XH

2. Propagáció : a keletkezett lipid-szabadgyök könnyen reagál molekuláris oxigénnel, és így lipidperoxid (ROO.) képzodik (a), amely a környezetében lévo molekulákat, többek között újabb többszörösen telített zsírsavakat képes oxidálni. Az oxidált molekuláról elvont hidrogén segítségével átmenetileg lipid-hidroperoxid (ROOH) alakul ki (b). Spontán, de még inkább valamilyen

katalizáló fém ion (vas, réz)

jelenlétében hidroxil (OH.) és alkoxid (RO .) gyökök keletkeznek (c), másrészt lipidperoxidok keletkezhetnek (d).

8

a,

R.

+

O2

?

ROO.

b,

ROO.

+

RH

?

ROOH + R.

c,

ROOH ?

OH.

+

RO .

d,

ROOH +

fémion(n)+ ?

ROO. + fémion(n-1)+ H+

3. Termináció: a folyamat befejezo részeként stabil végtermékek jönnek létre (pl. malondialdehid). A korábbi folyamatok során kialakult gyökök egymással reagálva a reakciók a folyamat befejezodését eredményezik. 2 ROO. ?

ROOR + O2

ROO. +

R.

2 R.

RR

?

?

ROOR

3.1.2. Oxigéntartalmú szabadgyökök képzodése

Az aerob energiatermelés során az oxigén redukciója vízzé bekövetkezhet egy lépésben, citokróm-oxidáz hatására, de az oxigén kisebb hányada más enzimatikus és nem enzimatikus utakon igen reaktív molekulákká – például szabadgyökökké, illetve hidrogénperoxiddá – redukálódik. A részlegesen redukált oxigén- metabolitok kialakulásának enzimatikus útjai

A részlegesen redukált oxigén- metabolitok képzodésének nem enzimatikus útjai Haber-Weiss reakció O2 .- + H2O2

?

O2 + OH- + OH.-

Fe2+ + H2 O2

?

Fe3+ + OH- + OH.-

Fenton-reakció

O2 ?- + Men+1

Men + O2

Men + H2 O2

Men+1 + ?OH + OH-

O2 ?- + H2 O2

fém

O2 + ?OH + OH-

1. sz. ábra: A Fenton- és a Haber-Weiss reakció egyenlete

9

Az oxigénmetabolitok közül a legagresszívabb és egyben a legrövidebb élettartamú a hidroxilgyök. Keletkezése in vivo a Haber-Weiss reakció révén termodinamikailag lehetséges, de a szervezetben általában eloforduló alacsony szuperoxid anion és hidrogénperoxid koncentráció mellett nem játszódhat le. Így a hidroxilgyök keletkezése elsosorban vas jelenlétében, a Fenton reakció révén következik be a kevésbé hatékony szuperoxid anionból, s a még gyengébb oxidáns hidrogénperoxidból.

A biológiai rendszerekben a vas kitüntetett szerepet játszik a fenti szabadgyök-képzési folyamatokban és így a szabadgyök okozta szövetkárosodásban. A Fenton-reakció során a vas, miközben ferro-ionból ferri- formává alakul, hidroxilgyök képzését teszi lehetové. Ferriferro átalakulás esetén a lipidperoxidáció során kevésbé hatékony lipid-hidroperoxidból agresszívabb alkoxilgyököt, illetve lipidperoxidot alakít ki. 3 Ezen reakciók katalizálására csak a kémiai kötésben nem lévo, úgynevezett szabadvas (non-protein bound iron) képes. Azok a molekulák, ill. rendszerek, amelyek a vasat kötött formában tartják, antioxidáns hatásúak, mert a fenti reakciókhoz nem engedik hozzáférni a vasat. Emiatt a vas- metabolizmusból ismert fehérjék: a transzferrin, ceruloplazmin, ferritin mind antioxidáns hatásúak.

10

3.2. A reaktív oxigéngyökök mediálta betegségek újszülöttkorban

A

reaktív

oxigéngyökök

jelentoségét

három

perinatális

betegség

-

a

bronchopulmonális diszplázia (BPD), a koraszülött retinopátia (ROP) és az újszülöttek hypoxiás

ischaemiás encephalopathiájának

(HIE)

-

kialakulásában

korábban

már

bizonyították. Kimutatták, hogy az egyéb tényezok mellett a szabadgyök-károsodás hozzájárul a sejt- és szövetkárosodások kialakulásához. Ezért igen nagy a jelentosége a perinatális szabadgyök-terhelés hátterében álló folyamatok és így a potenciális kezelési lehetoségek megismerésének. 4

3.2.1. Reaktív oxigéngyökök szerepe a BPD kialakulásában

A szabadgyökök protein denaturációt, DNS károsodást és lipidperoxidációt okoznak, így cytotoxikus hatásúak a tüdo alveoláris-, endothel- és parenchyma-sejtjeire és az alveoláris makrofágokra. A szabadgyökök gátló hatást fejtenek ki a surfactant szintézisre is, gátolják a hypoxiára adott pulmonális vaszkuláris válaszreakciót, csökkentik a tüdo fibroblasztjainak regenerálódását, kóros kollagén depozíciót okoznak, csökkent alveolarizációt és a tüdo csökkent növekedését eredményezik. Fokozzák az alveoláris membrán permeabilitását, az alveoláris térbe történo plazma-beáramlást, amely végül surfactant-degradációt eredményez. 5 Klinikai szintu bizonyíték a szabadgyökök BPD kialakulásában játszott centrális szerepére vonatkozóan az, hogy beteg koraszülöttekben, akiknél késobb BPD alakul ki, korai markerként a kilélegzett gázkeverékben megemelkedik a hidrokarbonok (lipidperoxidációs végtermékek) mennyisége, illetve no a szérum malondialdehid szint. A BPD kialakulásának fontos korai eseménye, hogy gyulladásos sejtek, döntoen neutrofil granulociták migrálnak az alveoláris térbe, amelyek a toxikus oxigénmetabolitok képzodését tovább fokozzák. Állatkísérletben pusztán oxigén belélegeztetéssel a fenti patofiziológiai történések eloidézhetoek. A tüdo alveoláris antioxidáns védekezését a lokális tényezok kifejezettebben befolyásolják, amit tükröz, hogy a glutation koncentrációja az alveoláris folyadékban 100-szorosa

a

plazmáénak. Az alveoláris mosófolyadékban az 1. életnapon mért glutation koncentrációja és a BPD kockázata között fordított összefüggést igazoltak. 6 A lokális tényezok mellett a vas mediálta szabadgyök-reakcióknak is nagy jelentosége van a korai tüdokárosodás kialakulásában. A korai tüdokárosodás során az alveoláris térbe történo 11

plazma beáramlásnál a plazma surfactant degradáló hatása annál kifejezettebb, minél kisebb annak apotranszferrin tartalma. Minél éretlenebb a koraszülött, annál kevesebb az apotranszferrinje, annál jobban degradálódik a surfactant. Állatkísérletben a vasdepléció csökkenti a kísérletesen kiváltott tüdokárosodás mértékét.

3.2.2. Reaktív oxigéngyökök szerepe a HIE kialakulásában

A maradandó idegrendszeri károsodáshoz vezeto szülési asphyxia (HIE) patomechanizmusában, az inzultust követo vazoregulációs zavar, a másodlagos energiaválság, az excitátoros neurotranszmitter- felszabadulás, az aktiválódó gyulladásos- és apoptózis válasz kiváltásában dönto szerepet játszik az oxigén-túlkínálat ill. a reaktív oxigén gyökök felszabadulása. Az elmúlt évek szüloszobai reszuszcitációval kapcsolatos vizsgálatai rávilágítanak arra, hogy a mérsékelt hypoxiás inzultust követo reperfúzió során akár rövid ideig fe nnálló hyperoxiának, és a következményes szabadgyök-túlkínálatnak hosszú távú biokémiai és klinikai következményei vannak. Vento vizsgálatai szerint, ha a szüloszobai reszuszcitáció100 %-os oxigénnel történik, hetekig kimutatható a vörösvérsejteket ért fokozott oxidatív stressz. 7 Állatkísérletek tanúsága szerint a 100 % oxigénnel történt élesztést követoen a kísérleti állatok mortalitása

és neurológiai

státusza rosszabb, mintha 21 % oxigénnel történik a reszuszcitáció. A HIE kialakulásában a legrégebben felismert szabadgyökös mechanizmus az asphyxia során a hypoxantin felhalmozódás, amely aztán a reperfúzió során uráttá oxidálódik további szabadgyökök felszabadulásának kíséretében. A xantin-oxidáz enzim ill. az aktivált leukociták által termelt szuperoxid gyök hatására ferritinbol vas szabadul fel. A felszabaduló, fehérjéhez nem kötött vas hatására a Fenton-reakció során lipidperoxidációt okozó szabad hidroxilgyök

termelodik.

A

szabadvas

szintje

mind

szülési

asphyxiában,

mind

koraszülötteknél igazoltan no. Az asphyxia után a plazmában ill. a vörösvérsejtekben kimutatható szabadvas mennyisége az egyik legjobb, ma ismert biokémiai indikátora a késobb kialakuló maradandó neurológiai károsodásnak. 8,

9

Az oxigéntartalmú szabadgyökök

patofiziológiai szerepét bizonyítja az is, hogy egyes antioxidánsok hatásosnak bizonyultak kísérletesen kiváltott asphyxia neuronkárosító hatásának kivédésében. A szuperoxid dizmutáz kezelés csökkentette kutyakölykök asphyxia okozta agyvérzését.A xantin-oxidázt gátló allopurinol terápia állatkísérletben csökkentette az ischaemiás agykárosodás mértékét.

11

Humán vizsgálatban az allopurinol az újszülöttek szülési asphyxiáját követoen javította az 12

agyi elektromos funkciót és az agyi vérátáramlást. 12 Végül a szabadvasat elimináló kelátor terápiák hatásosnak bizonyultak állatkísérletekben a kísérletesen okozott asphyxia neuronkárosító hatásának kivédésére. 13

3.2.3. ROP és szabadgyökök. Az oxigénkezelés hatása

A koraszülöttek kezelésében 1930-as évektol vezették be az oxigén használatát. Az 50-es, 60as években egyértelmuvé vált az oxigén etio-patológiai szerepe a ROP-ban; az oxigénadás korlátozása a ROP kialakulásának csökkenését eredményezte. A 70-80-as években azonban annak ellenére, hogy a biztonságosnak tekintett oxigén szintek alkalmazásának technikai lehetoségei jelentosen javultak, újra emelkedett a ROP elofordulási gyakorisága. Az ok legvalószínubben az extrém éretlen koraszülöttek túlélésének növekedése volt. 14 Bár a fiziológiásnak hitt transzkután oxigénszaturációs (TcSat) értékeknél alacsonyabb TcSat értékek mellett kisebb a ROP kialakulásának rizikója 15, 16 , mára világossá vált, hogy nemcsak az oxigén expozíció, hanem a gyulladás és az éretlenségbol fakadó csökkent antioxidáns védelem egyaránt hozzájárulnak a betegség kialakulásához. 17

3.2.4. Transzfúziók szerepe a BPD és a ROP kialakulásában

A terápiásan alkalmazott oxigén egyértelmu patofiziológiai szerepe mellett számos vizsgálat hívta fel a figyelmet a koraszülötteknél alkalmazott transzfúziók mennyisége és a ROP kialakulása közötti pozitív korrelációra. 20 Inder a ROP kialakulása és az elso élethéten kapott transzfúziók mennyisége, továbbá a 7. életnapi magas szérum vas és transzferrin szaturáció között talált összefüggést.

21

emelkedett

Cooke és mtsai a transzfúziók és a BPD

kialakulásának összefüggését kutatva azt mutatták ki, hogy a BPD-s koraszülöttek kétszer több transzfúzióra szorultak, ferritin szintjük magasabb, transzferrin szintjük alacsonyabb volt azokhoz képest, akiknél nem alakult ki BPD. A BPD-s csoportban a koraszülöttek többségében szabadvas volt kimutatható. 22 Korábban a ROP kockázatának emelkedésében a HgbA-t tartalmazó transzfundált felnott vér oxigén disszociációs sajátosságának, az így elért magasabb szöveti oxigén szinteknek tulajdonítottak kóroki szerepet.

Ezzel szemben Sullivan elmélete szerint a transzfúziók

adásakor az amúgy is kóros szöveti vasraktározás fokozódik, és növekedik a toxikus szabadvas megjelenésének kockázata, amely tovább súlyosbítja a ROP-ot. 23

13

3.3. Az antioxidáns védelem

Az élo szervezet oxidációval szembeni legfobb védekezési mechanizmusa az oxigén alacsony szöveti nyomása (mintegy 29 Hgmm körüli). Ezen kívül az emberi szervezetnek hatékony antioxidánsok állnak rendelkezésére a nemkívánatos oxidáció megakadályozására. Az antioxidáns olyan molekula, amely az oxidálandó szubsztráthoz képest kis koncentrációban van jelen, és szignifikánsan lassítja, vagy teljesen gátolja annak oxidációját. A fiziológiás szabadgyökös reakciók szigorúan kontrollált körülmények között zajlanak. A szabadgyök-fogók jelentos mértékben szelektívek azokra a szabadgyökökre, amelyekkel reagálnak, míg a szukebb értelemben vett antioxidánsok az oxigénbol keletkezo reaktív intermedierek toxikus hatásaival szemben védenek. Ezeket oldékonyságuk

szerint

csoportosíthatjuk: 1. Lipidoldékony (pl. béta-karotin, E-vitamin, természetes kinonok-ubikinon). 2. Vízoldékony (pl. glutation, C-vitamin, szabad purinok-húgysav, NADPH / NADPrendszer). A nem enzimatikus antioxidánsokhoz tartoznak a zsír-, illetve vízoldékony vitaminok (különösen E és C vitamin, melyeknek szinergista hatása ismert), a táplálkozással felvett antioxidáns jellegu anyagok (flavonoidok, polifenolok, stb.) és az intracelluláris térben a legfontosabb vízoldható rendszer, a redukált / oxidált glutation (GSH/GSSG). Az enzimatikus antioxidánsok közül a legfontosabb a szuperoxid dizmutáz (SOD), amely a szuperoxid aniont, a kataláz, amely a H2 O2 -t, és a peroxidázok, melyek más egyéb peroxil-, alkoxilgyököket képesek eliminálni (2. ábra).

24

Ezek a fehérjék olyan fémiont tartalmaznak, melyek

oxidációra / redukcióra képesek (SOD – Mn++, Fe++, Cu++ /Zn++, kataláz – Fe, peroxidáz, stb.).

SOD:

2 O2? ? + 2 H+

H2O2 + O 2

kataláz:

2 H2O2

2 H2O + O2

peroxidáz: H2O2 + RH2

2 H2O + R

2. ábra: Antioxidáns enzimek példái és reakciói a szervezetben

14

A szabadgyökök eliminálására az antioxidánsoknak mindenütt jelen vannak, így beszélhetünk sejten belüli, sejten kívüli és membrán antioxidánsokról (1. táblázat)

1. táblázat. Antioxidánsok példái az emberi szervezetben

Inracelluláris antioxidánsok: Szuperoxid dizmutáz (Cu, Zn, Mn) Kataláz Glutation-peroxidáz Citokróm-oxidáz (Cu)

EC

antioxidánsok:

Transzferrin Ceruloplazmin Bilirubin Húgysav Albumin Laktoferrin Hemopexin Haptoglobinok Ferritin Aszkorbinsav Glükóz EC szuperoxid dizmutáz EC glutation-peroxidáz Lipoprotein antioxidánsok (? -tokoferol, ? -karotin stb.)

Membrán antioxidánsok: Vitamin E (? -tokoferol) ? -karotin Coenzim Q

Az antioxidáns hatás erossége az indukciós idovel jellemezheto. Minél hatékonyabb egy antioxidáns, annál hosszabb az indukciós periódus, vagyis annál késobb következik be a szubsztrát oxidációja. Az antioxidánsok hatásmechanizmus szerinti csoportosítás alapján primer vagy szekunder antioxidánsok lehetnek. A primer, más néven láncmegszakító antioxidánsok olyan vegyületek, amelyek semlegesíteni képesek a lipid-szabadgyököket, elsosorban azáltal, hogy hidrogén átadásával megszüntetik a gyökállapotukat, s kevésbé reaktív vegyületeket hoznak létre. Ezek a viszonylag stabil vegyületek már nem vesznek részt a lipidperoxidációban, ezért a láncreakció megszakad. Az elsorendu antioxidánsok (foleg fenolos szerkezetu molekulák, tokoferolok, galluszsav és származékai, flavonoidok és egyéb komponensek) az indukciós periódusban hatnak, jelenlétükben az oxidáció késobb kezdodik el. A másodrendu antioxidánsok például azáltal hatnak, hogy a lipidmolekulák helyett önmaguk oxidálódnak, vagy a reakciók során keletkezo átmeneti és végtermékeket alakítják

15

át nem toxikus formává. A szekunder antioxidánsok a tiszta lipidrendszerben általában nem igazán aktívak, de egyéb mikrokomponensek jelenlétében hatásosak: növelik a primer antioxidánsok hatásosságát, vagy gátolják a prooxidáns hatású vegyületek muködését. A természetes antioxidánsoknak ezen csoportjába tartoznak a foszfolipidek, amelyek az elsorendu antioxidánsokkal szinergizálnak, valamint a citromsav, amely komplexbe köti a prooxidáns hatású átmeneti fémionokat, amelyek már igen kis mennyiségben is képesek katalizálni a lipidperoxidációt. Az antioxidánsokra tehát jellemzo, hogy többféle hatásmechanizmus révén képesek gátolni az oxidációt, és sok esetben egymással szinergizálva hatnak. A szabadgyökös reakciókkal szembeni antioxidáns védelmi mechanizmus egy része (vitaminok, flavonoidok) csak a növényekben szintetizálódik, s ezekhez az emberi szervezet csak a táplálékkal jut hozzá, míg másokat – elsosorban enzimeket, glukózt és húgysavat – az ember szervezete is képes eloállítani. Fontosak azok a molekulák is, amelyek a mérgezo anyagokat eltávolítják, ilyenek például a glutation-S-transzferázok és a kinonreduktáz, valamint a biomolekulák szerkezetében bekövetkezett károsodásokat helyrehozó, úgynevezett javító enzimek. A kis molekulájú antioxidánsok közé tartozik a vitaminok közül a C-, az E- és az A-vitamin, valamint az utóbbi provitaminja, a bétakarotin.

3.3.1. A vasháztartásban és az antioxidáns védekezésben egyaránt szerepet játszó plazmafaktorok

Azokat a molekulákat, amelyek gátolják a szabadgyökök kialakulását preventív, vagy primer antioxidánsoknak nevezik. Ezek elsosorban a ceruloplazmin, a transzferrin és a ferritin, amelyek egyben a vas transzportjáért és tárolásáért felelos proteinek. Azzal, hogy oxidálják és / vagy

kötésben tartják illetve tárolják a vasat, a legtoxikusabb szabad

hidroxilgyök képzodését

akadályozzák meg.

25, 26

lipidperoxidációval szembeni ellenálló képességet.

3.3.1.1. Ceruloplazmin 16

Mindezzel nagymértékben növelik a

Réztartalmú alfa-2 glikoprotein (1948 Holmberg és Laurell) plazmafehérje, amely ferroxidáz aktivitása révén a vasmetabolizmust szabályozó faktor. A ceruloplazmin döntoen a májban termelodik, a magzatban és megszületéskor plazmaszintje és aktivitása jóval kisebb, mint a felnottkori értékek. A gesztáció elorehaladásával a szintje arányosan no. 27 A ceruloplazmin aktivitását elsosorban a máj érettsége határozza meg28 , s a megszületéskori szintet a méhen belüli stressz állapot vagy a megszületés elott alkalmazott kortikoszteroid adása jelentosen megemeli. 29 A posztnatálisan alkalmazott szintetikus glukokortikoid hormon és / vagy pajzsmirigy-hormon adás egyaránt emeli a ceruloplazmin plazmaszintjét és aktivitását. A megszületést követoen a plazmaszint 3-6 hónapos korig folyamatosan emelkedik, ekkor eléri, majd a késobbiekben meghaladja a felnottkori értékeket. 30

3.3.1.2. A ceruloplazmin antioxidáns hatása

A ceruloplazmin ferroxidáz aktivitása révén antioxidáns tulajdonságú. A ferro- ion ferri- vassá történo redukciójával a vas transzferrinbe való beépülését teszi lehetové. Az Fe3+/ Fe2+ arány emelése transzferrin jelenléte nélkül is antioxidáns hatású, mert a Fe3+ kevésbé effektív a lipidperoxidáció elosegítésében. A ceruloplazminnak jelentos szerepe van a vas raktározott formájának a transzportformába való átalakulásában, azaz a ferritin – transzferrin vas donációjában. A ceruloplazmin perinatális adaptációjában játszott szerepe azonban kétséges: az elso élethét során sem a ceruloplazmin, sem a transzferrin szint nem változik oly mértékben, hogy azt a megszületést követo lipidperoxidáció gátlás megemelkedéséért felelossé lehetne tenni. 31

3.3.2. Transzferrin

A májban termelodo béta-1 globulin típusú fehérje, mely a keringo vas szállításáért felelos (2 mol Fe3+ / 1 mol transzferrin). A vas felhasználási helyén a transzferrin receptormediált endocitózissal kerül a sejtekbe. A lizoszóma savas pH-jának hatására a vas disszociál a transzferrinrol, és a receptor-transzferrin komplex újra a sejtfelszínre jut. Itt a transzferrin és a receptora szétválnak, és a transzferrin újra a keringésbe kerül, ahol újabb vasatom megkötésére és szállítására alkalmas állapotban van. Normális körülmények között a transzferrin vasköto helyeinek mintegy harmada szaturált. A vashiányos állapot a transzferrin17

szintet növeli. A fokozott vaskínálat, infekció, protein malnutríció, májbetegség a transzferrin- szintet csökkenti. Hasonlóan a ceruloplazminhoz, a transzferrin szintek megszületéskor alacsonyabbak, mint felnottkorban. A gesztáció elorehaladtával a szérum szint emelkedik. A transzferrin szintek az egészséges

újszülöttben

az

élet

elso

3

hónapjában

lényegesen

nem

változnak.

Koraszülötteknél a 40. posztkoncepcionális hét eléréséig fokozatosan növekednek, de a szérum szint erosen tápláltság függo. Perinatális változására vonatkozóan irodalmi adatok nem álltak rendelkezésre.

3.3.3. Ferritin

A sejtekben a ferritinhez kötve raktározódik a vas. A vastárolás elsodleges helyei a máj és a lép. A ferritin 24 alegységbol épül fel, és micelláris elrendezodésben 3000-4500 vasatomot képes tárolni. A plazmában mért ferritin-szintet általában a raktározott vasmennyiség indikátorának tartják és vashiányos állapot ill. a kóros vasraktározás diagnózisában használják fel. A ferritin koncentráció emelkedik gyulladásos állapotokban. Az újszülöttek szérum ferritin szintje magas a felnott értékekhez képest, tükrözve az elso élethónapok

hyporegeneratív

vérképzését.

Az

ismételt

transzfúzióra

szoruló

beteg

koraszülöttek ferritin-szintjei extrém magas értékeket mutathatnak

3.3.3.1. A ferritin szerepe a szabadgyök reakciókban

Szuperoxid jelenlétében a ferritinbol vas szabadul fel, így a ferritin potenciális vasforrást képez a Fenton-reakció számára patológiás állapotokban. Például súlyos traumát követoen a ferritin-szint megemelkedése arányos a respiratorikus disztressz (ARDS) kialakulásának kockázatával.

32

Ugyanakkor a ferritin két különbözo láncának biokémiai

tulajdonságai eltéroek: az L lánc, amely a plazmában eloforduló fo forma, igen sok vas felvételére képes, és nincs ferroxidáz aktivitása, míg a H lánc ferroxidáz aktivitást mutat, így antioxidáns hatása valószínusítheto. Korábban az újszülöttekre vonatkozó szabadgyök kutatások során nem vették figyelembe a ferritin esetleges protektív hatását a vas indukálta oxidatív károsodásban. Jóllehet a plazmában döntoen L- ferritin található, szövetkárosodást követoen a sejtekbol H- ferritin szabadulhat fel, hozzájárulva a plazma preventív antioxidáns kapacitásához. 33 3.4. Vasmetabolizmus és vérképzés újszülöttekben és koraszülöttekben 18

3.4.1. A szérumvas szint változásai a perinatális idoszakban

A szérumvas szintjét elsosorban a felhasználás (eritropoezis és sejtproliferáció) valamint a felszívódott vas (placentáris, enterális) mennyisége közötti egyensúly határozza meg. A méhen belüli idoszakban a placenta anyai felszínén nagy suruségben elhelyezkedo transzferrin-receptoroknak köszönhetoen bo a magzat vasellátottsága. A vérképzés igen aktív, ennek ellenére a magzati szérumvas-értékek jellemzoen magasak.

A magzati életet,

pontosabban az utolsó trimesztert jellemzi a megszületés pillanatában észlelheto polyglobulia, magas szérumvas, normális szérum ferritin, s alacsonyabb teljes vasköto kapacitás (transzferrin-szint). Újszülöttkorban csökkent aktivitású a vérképzés. Ebbol fakadóan a külso vasigény és az enterális felszívódás az elso élethónap során kismértéku. A szérumvas szintek a felnottkori normál tartományon belüliek.

3.4.2. A vérképzés változásai a méhen belüli idoszakban

A méhen belüli élet során a vérképzés mindvégig hiperregeneratív jellegu, döntoen a relatív hypoxiás környezet, a folyamatos testtömeg gyarapodás és kisebb részben a magzati vörösvérsejtek rövidebb élettartama miatt.

34

Az eritropoezis mértékét jól tükrözi a

keringésben található retikulociták aránya, amely a terhesség idejével fordítottan változik: a 20. gesztációs hét körül 10-20 % közötti, de még a terminusra született újszülöttekben is 3-7 %.

35

A harmadik trimesztertol kezdodoen a magzat illetve az újszülött a felnotthöz képest

polyglobuliássá válik.

3.4.3. A vérképzés és a vasháztartás akut változásai a megszületést követoen

A megszületés a szöveti oxigénellátottság hirtelen megemelkedését eredményezi.

36

Emiatt, az ekkor még döntoen a májban termelodo eritropoetin szintézise órák alatt bazális szintre csökken.

37

Érett újszülött esetében kb. 3 hónapos korig változatlanul alacsony szinten

is marad. 38 Az eritropoetin termelodésének megszunése nyomán a méhen belüli életre jellemzo magas retikulocita szám azonban csak a 4. életnap után csökken Ennek oka, hogy a retikulociták kiérése nagy valószínuséggel érési gátlást szenved, az anya feloli vasellátás

19

hirtelen megszunése miatt.

39

Mindezek együttesen az elso életnapok idejére korlátozódóan

vasdepléciót okoznak, amely egyébként nem jellemzo az újszülöttkor egészére. Vahlquist már 1941-ben leírta, hogy a megszületés pillanatában (a köldökzsinórban) detektálható szérumvas szint magasabb a felnottkori értékekhez képest, amely azonban hirtelen és szélsoségesen mély szintre csökken közvetlenül a megszületés után. A szérumvas változásának mélypontja a 6. életóra elotti idoszakban kialakul, második élethétig folyamatosan emelkedik.

41

40

majd a továbbiakban a

Vahlquist mérései alapján arra az azóta is

helytálló következtetésre jutott, hogy a méhen belüli életben olyan magas a szérumvas szintje, amilyen fiziológiás körülmények között nem fordul elo többet az élet folyamán. Ugyanakkor pár órával a megszületés után az újszülött szérumában olyan alacsony a vas mennyisége, amely szintén nem tapasztalható a késobbi élet során. 37 Langley 1950-ben kórszövettani módszerekkel, a májban található eritropoetikus gócok surusége alapján mutatta ki, hogy az újszülöttben a megszületést követo elso 12 órában a hemopoezis fokozódik, de a 3. életnapra gyakorlatilag meg is szunik. Ezzel párhuzamosan a 2. és 3. életnapon a hemosziderin mennyisége mind a lépben, mind a májszövetben csökken, szemben a méhen belüli életet és a késobbi újszülöttkort egyaránt jellemzo fokozott szöveti vasraktározással. 42

3.4.4. Anémia a perinatális idoszakot követoen

Az egészséges újszülött hosszú idore elegendo vasraktárakkal jön a világra. Jóllehet az elso élethónapokban a testtömeg-gyarapodás nagyarányú, a csecsemok mégsem szorulnak számottevo külso vasbevitelre. Ebben az idoszakban az endogén, elsosorban a lebomló hemoglobinból származó vasraktárak boségesen fedezik a szerény ütemu vérképzés szükségleteit. Az elso élethónapokat hiporegenerativ vérképzés, folyamatosan csökkeno hemoglobin és hematokrit érték, normális szérum vas, alacsonyabb transzferrin és viszonylag magas ferritin-szintek jellemzik. Idovel ez az egyensúly vezet az újszülöttek fiziológiás hiporegeneratív anémiájához a 3. élethónap táján. A koraszülötteknél ugyanezzel a mechanizmussal, de korábban, és súlyosabb formában, gyakran jelentos klinikai tüneteket okozva alakul ki anémia. Az anémiát számos egyéb faktor: a vérvételek, krónikus gyulladásos állapot súlyosbítják és gyakran transzfúziós kezelést tesznek szükségessé. Kóros állapotokban, elsosorban gyakori infekciók és a gyakran alkalmazott transzfúziós kezelés hatására a ferritin szint további jelentos emelkedése következik be, ami vélhetoleg már kóros mértéku szöveti vasraktározást jelent. Ezt az

20

állapotot nevezik a koraszülöttek anémiájának, 43 ami döntoen a 32. gesztációs hétnél éretlenebb koraszülötteket érinti. Az anémia normociter, normokróm, általában 100 g/l alatti hemoglobin értékeket eredményez, alacsony retikulocita számmal jár. Az anémia nem szükségszeruen, de gyakran tüneteket okoz. Ezek a tachycardia, apnoés epizódok gyakoribbá válása, csökkent súlygyarapodás, fokozott oxigénigény. A laktát koncentráció megemelkedik. A koraszülöttek anémiája spontán megszunik 3-6 hónapos kor között. Az anémia mechanizmusa nem teljesen ismert. Az eritroid progenitorok EPO érzékenysége normális, és más eritroid növekedési faktorok, mint az IL-3, GM-CSF koncentrációja is megfelelo. Ugyanakkor az anémia következtében kialakuló vénás oxigén-tenzió csökkenés és a következményes klinikai tünetek ellenére az EPO koncentráció mégis alacsony marad.

3.4.4.1. Rekombináns humán eritropoetin alkalmazása kissúlyú koraszülöttekben

A rekombináns technikával eloállított humán eritropoetint (rhuEPO) a 90-es évek közepétol kezdve alkalmazzák a kis születési súlyú koraszülöttek hiporegeneratív és iatrogén anémiájának kezelésére. Az alkalmazott hatékony dózis 500 – 1400 E / kg / hét, heti 2-3 részletre elosztva. Azon koraszülöttek rhuEPO kezelése jön szóba, akiknél a transzfúzió iránti igény már a megszületéskor biztosan prognosztizálható. Ezért elsosorban a 30. terhességi hétnél éretlenebb illetve az 1250 g-nál kisebb születési súlyú koraszülöttek esetében jön szóba a kezelés, amit már az elso élethéten érdemes elkezdeni. A rhuEPO kezelésnek koraszülöttek körében eddig nincs ismert kontraindikációja. A kezelés hatására pár napon belül retikulocita krízis alakul ki, a „fiziológiás” Htk, Hgb szintcsökkenés lassul, vagy megáll, esetleg (hosszabb távon) emelkedni kezd. Az anémia akut korrekcióját rhuEPO-val nem lehet elérni.

A terápia hatékonysága kevésbé a vérképi

értékekkel, mintsem a várt transzfúzió igény - standard transzfúziós indikációk melletti redukciójával mérheto. A kezelés költséghatékonysága attól függ, hogy az egyes országokban a vérkészítmények mennyibe kerülnek, így a költséghatékonysági vizsgálatok eredményei és szakmai értékelések nagyon különböznek. A rhuEPO hatása függ a tápláltsági állapottól és a testtömeg gyarapodás mértékétol, a megfelelo vaspótlástól, az interkurrens infekciók számától, súlyosságától. A koraszülötteken alkalmazott rhuEPO kezeléssel kapcsolatosan nem jellemzoek a felnotteknél relatíve gyakori mellékhatások, mint a hipertónia, vagy ritkábban görcsrohamok. A rhuEPO terápiával összefüggésbe hozható jelentos mellékhatást több száz koraszülött 21

kezelése után sem azonosítottak eddig, leszámítva, hogy a kezeltek súlygyarapodása valamelyest elmarad a kontroll betegekhez képest. A rhuEPO terápia kapcsán egyes szerzok klinikai jelentoséggel nem bíró neutropénia elofordulásáról számoltak be. A vérvételek számának redukciója és a laboratóriumi mikrometodikák alkalmazása mellett a rhuEPO kezelés, a jelenlegi ismeretek szerint hatékony és biztonságos eszköz a koraszülöttek anémiájának, transzfúzió igényének, így a transzfúzióval asszociált betegségek rizikójának csökkentésére.

44

Az eddig megjelent rhuEPO kezeléssel kapcsolatos klinikai

tanulmányok többsége a koraszülöttek transzfúzió igény csökkenésérol számolt be, jóllehet a vizsgálatok elrendezése, betegpopulációja, és elsodleges célkituzése jelentos különbségeket mutatott. A rhuEPO kezelés hatékonyságát az anémia és a transzfúzió igény csökkentésében számos tényezo befolyásolja. Minél korábban kezdodik a terápia annál nagyobb mértéku transzfúzió igény csökkenés várható. Nem kielégíto fehérje tápláltság, vashiány, fertozések és hypotireózis egyaránt a rhuEPO kezelés hatásosságának csökkenéséhez vezetnek.

3.4.4.2. Rekombináns humán eritropoetin hatása koraszülöttek vasháztartására, vaspótlás rhuEPO kezelés alatt.

Az összes publikált vizsgálatban a rhuEPO kezelés mellett, számolva a fokozott vasfelhasználással, többlet vaspótlásról is gondoskodtak. Ennek jogosultságát igazolja, hogy azon klinikai tanulmányokban ahol ezt nyomon követték, a rhuEPO indukálta fokozott vérképzés a vas szupplementációval együtt is a szérum vas, és ferritin szint csökkenését eredményezte.

45

RhuEPO kezelés során a szükséges vaspótlást individuálisan kell

meghatározni, esetenként annak mértéke akár igen magas is lehet (4-16 mg/kg/nap). A kielégíto vas-ellátottság laboratóriumi diagnosztikája ill. értékelése a rhuEPO kezelt koraszülöttek körében még nem teljesen tisztázott. Jóllehet a koraszülöttek körében nem elterjedt, néhány klinikai kísérletben intravénás vasbevitelt alkalmaztak az eritropoetikus hatás maximalizálásának reményében. Pollak és mtsai vizsgálatában az intravénásan adagolt vas nem eredményezett kedvezobb klinikai hatást, ugyanakkor a ferritin szintek növekedtek és a transzferrin szint csökkent, ami fokozott szöveti vasraktározást jelez. Azon felül a vas intravénás beadását követoen a teljes vasköto kapacitást meghaladó szérum vas szintet észleltek néhány esetben, ami a lipidperoxidáció fokozódását jelzo emelkedett malondialdehid (MDA) szérumszintekkel járt.

46

Mindez

járulékos, klinikai bizonyítéka annak, hogy a fehérjéhez nem kötött szabadvas, függetlenül a kialakulásáért felelos mechanizmusoktól, in vivo fokozza a lipidperoxidációt. 22

3.4.4.3. Az EPO és eritroid hatásai

Az EPO 30400 dalton tömegu glikoprotein, amely hypoxia hatására a vese peritubuláris sejtjeiben, illetve, foleg a magzati életben, nagyobb mennyiségben a májban is termelodik. A keringésbe került EPO hatására a csontveloben a vörösvérsejt prekurzorok kiérése és proliferációja következik be. Az eritroid sejtek (BFU-E, CFU-E) maturációja a felszínükön levo EPO receptorhoz történo EPO kötodés indukálta intracelluláris

Ras

/mitogén aktivációs kináz út beindításával jön létre. A sejtek maturációja döntoen az EPO indukálta antiapoptotikus protein család muködésének hatására alakul ki. Az EPO szinergista hatást fejt ki más olyan növekedési faktorokkal, mint a GM-CSF, IL-3, IGF-1. Mindez a keringo vörösvérsejtek számának növekedését eredményezi. A vörösvérsejtképzés fokozott vasfelhasználással jár, amely a szérum vasszint, majd a szöveti vasraktárak csökkenését idézi elo, amennyiben a külso vasbevitel nem fedezi a stimulált vörösvérsejtképzés igényeit.

3.4.4.4. Az EPO nem-eritroid hatásai

Az EPO számos nem eritroid hatással is rendelkezik, Az EPO nagy adagban potens vazokonstriktor, fokozza az endotelin szintézist, a keringo vértömegre gyakorolt hatásától függetlenül emeli a szisztémás vérnyomást, stimulálja az angiogenezist és a simaizom proliferációt. Több olyan szerv van, amely a vérképzésben nem vesz részt, ugyanakkor egyaránt képes valamelyes EPO termelésre és rendelkezik EPO- receptorokkal is. Mindez az EPO további autokrin, parakrin funkcióinak lehetoségét veti fel. A központi idegrendszerben EPO- és EPO-receptor produkció egyaránt kimutatható.

47

Számos területen azonosítottak EPO-receptorokat, így a hippocampusban, az amygdalában és a temporális kéreg területén. Hasonlóan a veséhez, a központi idegrendszerben is hypoxia hatására következik be az EPO termelodése, amelynek lokális neuroprotektív hatása van.

48

A

központi idegrendszerben termelodo EPO biológiai jelentoségét bizonyítja, hogy exogén rhuEPO nagy dózisú adásával is hasonló neuroprotekció érheto el. Az EPO–nak szerepet tulajdonítanak továbbá azokban a protektív mechanizmusokban, amelyek a prekondicionálás során jönnek létre.

49

23

hypoxiás

Az EPO sejtprotektiv hatását a szöveti inzultust követoen az alábbi fobb mechanizmusokkal fejti ki. (1) Az EPO antiapoptotikus szignál mehanizmust triggerel a janus kináz -2 és a STAT5 aktiválásával, amelyek ún. survival fehérjék, mint a Bc1-xL termelodését eredményezik. (2) In vitro vizsgálatok szerint kalcium -dependens mechanizmus révén közvetlen és azonnali gátló hatást gyakorol a toxikus glutamát-kiáramlásra. (3) Az EPO mitogén-aktiválta proteinkináz indukciója révén fokozza az érújdonképzodést és ezzel is hozzájárul a sérült szövet regenerációjához. (4) Az EPO fokozza egyes antioxidáns enzimek (kataláz, glutation-peroxidáz, szuperoxid dizmutáz) expresszióját.

52

Az EPO növekedési faktor szerepét igazolják azok az állatkísérletek, amelyekben az EPO-gén knock-out embrióknál szív és agyi fejlodés zavart észleltek.

53

Az EPO receptorok

nagy számban találhatóak az agyi kapillárisok endotheljében és a gliasejteken, ezzel szemben csak egyes neuronokban mutathatók ki EPO-receptorok.

54

Az uterusban a glanduláris

epitheliális sejtekben található EPO és EPO-receptor termelodés, amelynek révén azek a sejtek szabályozó szerepet játszanak a myometrium angiogenezisében.

55

Mindezen hatások

felvetik, hogy az EPO potenciális terápiás szereppel bír olyan kórállapotokban, mint egyes szervek hipoperfúziós károsodása, vagy ahol az angiogenezis zavart szenved, mint pl. a ROP és BPD betegség.

24

4.

Célkituzések Az újszülött perinatális adaptációjának lényeges részjelensége a méhen belüli

alacsonyabb oxigenizációs környezet és metabolikus státusz gyors ütemu megváltozása. Az oxigén-kínálat (parciális artériás oxigénnyomás) a megszületést követoen pillanatok alatt, a metabolikus ráta az elso életnapok során fokozatosan no, csaknem megduplázódik.

56

Vizsgálat-sorozatommal az újszülött-kori vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns védekezoképesség összefüggéseit vizsgáltam két kérdéskör kapcsán, és az alábbi kérdések megválaszolását tuztem ki célul.

1. Újszülöttek perinatális vasanyagcsere-változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel. ?

Érett újszülöttek korai posztnatális adaptációja során a vasháztartásban milyen változások figyelhetok meg az elso 3 életnap alatt?

?

Ezek összefüggenek-e az EC antioxidáns kapacitás változásaival?

?

Érett újszülöttek posztnatális adaptációja során a vasháztartást meghatározó antioxidáns hatású fehérjék milyen hatással vannak az EC térben kimutatható szabadvas megjelenésére, illetve eliminációjára?

2. Rekombináns humán eritropoetin (rhuEPO) hatása koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, a vasanyagcserére és az antioxidáns védekezoképességére ?

Az rhuEPO kezelés milyen hatást gyakorol a koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására és szövodmény-betegségeire?

?

Az rhuEPO által stimulált vérképzés és a következményes EC vasdepléció befolyásolja-e rövidtávon az EC antioxidáns kapacitást koraszülöttekben?

25

5.

Betegek és módszer

5.1.1. A szérum vas és EC antioxidáns kapacitás akut perinatális változásainak vizsgálata. A szabad vas és a vasháztartásban szerepet játszó antioxidáns faktorok összefüggése érett egészséges újszülöttekben a perinatális idoszakban

A kérdés teljes köru megválaszolásához szükséges vérmennyiség, etikai okok miatt, nem állt rendelkezésre, így vizsgálatunkat két szakaszban végeztük. A vizsgálat elso szakasza: 14 olyan egészséges, érett újszülött, átlagosan a 47. életórában levett vénás vérmintáját analizáltuk, akiknél valamilyen klinikai jel vagy a szülési anamnézis alapján gyanított kórállapot miatt laboratóriumi vérvizsgálatra volt szükség (sárgaság 12 esetben, infekció 2 esetben), de betegség nem igazolódott. Köldökzsinórból vett vérminta minden esetben rendelkezésre állt. A mintavételek a Kistarcsai Flór Ferenc Kórház Patológiás Újszülött osztályán történtek. A mintavételt követoen a szérumot (4000 g 10 perc, 4 C°) centrifugálás után –80 C° fokon tároltuk a laboratóriumi meghatározások elvégzésig. Kórállapot késobbi igazolódása ill. hemolítikus minta miatt 4 mintapárt zártunk ki a vizsgálatból. A fennmaradó 10 újszülött születési súlya (átlag ± szórás) 3546 ± 371 g gesztációs kora 39.6 ±0.9 hét volt. A vizsgálat második szakasza: 25 olyan egészséges, érett újszülött, átlagosan a 42. (± 22,7) életórában levett vénás vérmintáját

vizsgáltuk,

akiknél

valamilyen

klinikai

gyanújel

(sárgaság,

infekció,

hipoglikémia) és / vagy a szülési anamnézis alapján gyanított kórállapot miatt laboratóriumi vérvizsgálatra volt szükség, de a feltételezett betegség nem igazolódott. Köldökzsinórból vett vérminta minden esetben rendelkezésre állt. A mintavételek a Kistarcsai Flór Ferenc Kórház Patológiás Újszülött osztályán történtek. A mintavételt követoen a szérumot (4000 g 10 perc, 4 C°) centrifugálás után –80 C° fokon tároltuk a laboratóriumi meghatározások elvégzésig. Kórállapot késobbi igazolódása ill. hemolítikus minta miatt 4 mintapárt zártunk ki a vizsgálatból. A fennmaradó 21 újszülött születési súlya 3303 ± 401 g, gesztációs kora 39,6 ± 1,0 hét volt. A mintavételek a Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottság (TUKEB 192/1998.) és a Kórházi Etikai Bizottság engedélye, valamint minden egyes esetben elozetes írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában történtek.

26

5.1.2. Koraszülöttek rekombináns humán eritropoetin kezelésének hatása a transzfúzió igényre és a vasháztartásra. A vasháztartás-változás összefüggése az antioxidáns kapacitással

A rhuEPO vérképzésre és transzfúzió igényre gyakorolt hatását 1994. február és 1995. márciusa között 46 koraszülött bevonásával prospektív, randomizált, kontrollált

klinikai

vizsgálat keretében végeztük a Semmelweis Egyetem I. sz. Nogyógyászati Klinika, az I. sz. Gyermekklinika, valamint a Budapesti Önkormányzat Péterfy Sándor Utcai Kórház, Pest Megyei Önkormányzat Szent Rókus Kórház, és Kistarcsai Flór Ferenc Kórház koraszülött intenzív osztályain. A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Regionális Kutatási Etikai Bizottsága engedélyezte. RhuEPO kezelést csak írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában kezdtünk. Felvételi kritériumok voltak: 1250 g-nál kisebb születési súly, a 32. hétnél kisebb gesztációs kor, 7. életnapnál fiatalabb életkor. Kizártuk a vizsgálatból azon újszülötteket, akiknél III, IV stádiumú intrakraniális vérzés, izoimmunizáció, intrauterin vírus infekció, cianotikus szívhiba, vagy jelentos fejlodési rendellenesség állt fent. Az 1:1 arányú randomizációt, a tervezett betegszámnak (46) megfelelo elore megírt, lezárt borítékok sorshúzásával végeztük. Placebót nem alkamaztunk. A rhuEPO-t (Eprex l000, Janssen-Cilag) hetente 3 alkalommal 200 E/ttkg adagban, szubkután injekció formájában alkalmaztuk. A kezelést a 3-7. életnapon indítottuk, és 6 héten keresztül folytattuk. Kiegészíto kezelésként enterálisan 6 mg/ttkg/nap elemi vas adagolását kezdtük el, amennyiben a megelozo 2 hétben nem történt transzfúzió, a szérum ferritin érték 100 µg/l alatt volt, és nem állt fenn infekció. Mindkét csoportban 15 mg/ttkg/2 nap i.m. E vitamin (Ephynal, Roche) szupplementációt folytattunk. A vizsgálatban résztvevo intézetekben a transzfúziós kezelést standardizált indikációs kritériumok szerint végezték. A transzfúzió indikációi a következok voltak: 1. életnapon 40 % Htk érték alatt, késobb 30% FiO2 igény, szimptómás PDA esetén 35 % alatti Htk érték, anémiával asszociált klinikai tünetek (tartós tachcardia, apnoés epizódok, táplálási intolerancia, súlygyarapodás hiánya) és 30 % alatti Htk érték. Naponta mértük a testhomérséklet, vérnyomás, pulzusszám, légzésszám értékeit, a testsúlygyarapodás, kalória, fehérjebevitel adatait rögzítettük.

A

rhuEPO kezelés megkezdése elott, majd hetente vizsgáltuk a kvalitatív és kvantitatív vérkép (Hgb, Htk), a relatív retikulocita szám, a szérum vas, ferritin és transzferrin változásait. Folyamatosan rögzítettük a diagnosztikus célból levett és a terápiás céllal beadott vér illetve vörösvérsejt koncentrátum számát és mennyiségét, valamint az oxigén terápia idotartamát. 27

A tartós lélegeztetés igénye szerint mindkét vizsgálati csoportot további alcsoportokra osztottuk, melyet a 14. életnapon túl fennálló gépi lélegezetés szükségességével definiáltunk. Retrospektíven, az orvosi dokumentáció alapján, vizsgáltuk még az iniciális mortalitási rizikót (CRIB),

57

a NEC, PDA, BPD ill. ROP elofordulási gyakoriságát

az egyes vizsgálati

csoportokban. A rhuEPO antioxidáns rendszerre gyakorolt akut hatását 17, 1500 g-nál kisebb születési súlyú és a 30. gesztációs hétnél éretlenebb koraszülött vizsgálatával végeztük el. A születési súlyok átlaga (tartomány) 950 (750-1490) g, a gesztációs kor átlaga 28 (26-29) hét volt. Az evidencián alapuló klinikai gyakorlatnak megfeleloen alkalmazott rhuEPO kezelés megkezdésének átlagos ideje a 17. (10-26) életnap volt. Felvételi kritériumok voltak: ferritin szint 100 µg/l felett, szepszis ill. bakteriális fertozés hiánya. (Az enterális vas szupplementáció indikációja a 100 µg/l alatti ferritin érték volt). Minden beteg 3 x 200 E /ttkg /hét rhuEPO (Neorecormon, Roche) kezelésben részesült. A kezelés megkezdése elott ill. 1 hetes kezelési periódus után vérmintát (500 ? l) vettünk, ill. retikulocita meghatározás történt. E vitamin (15 E/nap) és C-vitamin 50 mg/nap adását leszámítva nem történt célzott antioxidáns kezelés. A vizsgálati periódusban a fenti indikációk alapján nem volt olyan beteg akinél parenterális vagy enterális vaskezelésre szükség lett volna. A betegek kezelése és a mintavételek a Semmelweis Egyetem I. és II. sz. Szülészeti és Nogyógyászati Klinikáinak Neonatális Intenzív Centrumaiban történtek. A vérvételt követoen a mintákat centrifugáltuk (4000 g 10 perc, 4 C°) és a szérumot -80 C° fokon tároltuk a meghatározások idejéig. Három beteget kizártunk a vizsgálatból, kettot a vizsgálati idoszakban manifesztálódó

bakteriális infekció miatt, egyet pedig transzfúziós

kezelés miatt. Végül 14 koraszülött mintáit értékeltük. A vizsgálat és a mintavételek a Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottság (TUKEB 57/2002) engedélye, illetve írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában történtek.

28

5.2.Laboratóriumi vizsgálatok

5.2.1. Vasanyagcsere- és vérképvizsgálatok

Hagyományos rutin laboratóriumi eljárásokkal határoztuk meg a szérum összbilirubin, vas, transzferrin és ferritin szinteket. A szérum vas, transzferrin, ferritin, bilirubin, összfehérje, húgysav, LDH mérések a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekklinikájának Kémiai

illetve

a

Fovárosi

Önkormányzat

Heim

Pál

Gyermekkórház

Központi

Laboratóriumaiban standardizált laboratóriumi módszerekkel, Hitachi 912 labor-automatával történtek. A kvalitatív és kvantitatív vérkép vizsgálatok a Semmelweis Egyetem I. sz. Nogyógyászati Klinikájának és I. sz. Gyermekklinikájának Kémiai Laboratóriumaiban történtek. A relatív retikulocita szám meghatározása 1 %- s alkoholos brillant-krezil-kékkel történt szupravitális festést követoen 900-szoros nagyítással, fénymikroszkópban történt leolvasással történt a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekklinika Haematológiai Laboratóriumában.

5.2.2. Antioxidáns védekezoképesség-vizsgálatok

A szérum teljes antioxidáns kapacitást Randox Total Antioxidant Status (Randox Laboratories)

kit

segítségével

határoztuk

meg.

Ez

a

mérés

a

2,2-azinobis

ethylbenzothiazoline-6-sulphonate, ABTS) nevu kation abszorbanciájának jelenlétében bekövetkezo változásán alapul.

(3-

antioxidánsok

58

A mérések a Fovárosi Önkormányzat Heim Pál Gyermekkórház Központi Laboratóriumában történtek.

A hem-specifikus antioxidáns kapacitás (HSAA) azt tükrözi, hogy a szérum minta milyen mértékben képes gátolni a lipid peroxidációt. A HSAA meghatározás során 6 µl szérumot, 200 µg/ml LDL proteint, 5 µmol/L hemint, 75µmol/l hidrogén peroxidot és 40 mmol/l Hepes puffert

(pH=7.4)

tartalmazó

keverékhez

mértük.

Az

LDL

hem-katalizálta

lipidperoxidációjának kinetikáját 405 nm-en és 37 °C –on monitorizáltuk. Az LDL oxidativ rezisztenciáját a hemin degradáció maximális sebességének kialakulásáig eltelt idovel jellemeztük (deltaT at Vmax). A szérum minta által okozott deltaT at Vmax változás reprezentálja a szérum minta antioxidáns aktivitását. A deltaT megnyúlása (> 100%) a vizsgált szérum antioxidáns hatását tükrözi, míg a deltaT rövidülése (> 100%) prooxidáns 29

tulajdonságra utal. 59 A mérések a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Neonatológiai Tanszék Szabadgyök Laboratóriumában történtek. Szabadvas mérés: Savman et al., 60 elve alapján a batofenantrolin-diszulfonát (BPS) segítségével kelátot képez a Fe2+ ionokkal. Az így képzodo komplex spektrofotometriásan vizsgálható. A kalibráló görbe lineáris 50 µM koncentrációig. A jelenlevo cink és réz atomok nem zavarják a vas mérését. Az érzékelési szint 0,5 µM. Kalibrálás: 50 mM- os alapoldatot készítünk a Fe2+ ion kelátképzojébol, úgy, hogy 28,2 mg 4,7-difenil-1,10-fenantrolin diszulfonátot feloldunk desztillált vízben. 196 mg FeNH4 SO4 -ot feloldunk 500 ml desztillált vízben, így 1 mM Fe2+ ion koncetrációjú alapoldatot kapunk. További hígítás után megkapjuk a 0.1, 1, 5, 10, 12.5, 25, 40, 50 µM- os oldatokat. Ezután 10–10 µl BPS oldatokhoz hozzáadunk 490 µl-t a hígítási sor minden tagjából. Keverés és 15 perc várakozás után 50 µlt pipettázunk minden egyes mintából a 96 lukú microplate-be, és 535 nm- en megmérjük az abszorbanciákat. A kapott adatokkal kiszámítható a kalibráló egyenes. Mérés: 49 µl vérplazma mintát pipettázunk a microplate-be, és 535 nm- en leolvasott abszorbancia adja a vakot. Majd 1µl BPS alapoldatot pipettázunk minden egyes mintához. Keverés és 15 perc állás után megint leolvassuk az abszorbanciát 535 nm- en. Miután ezen értékekbol levonjuk a vak értékeit a szabadvas koncentrációk meghatározhatók a kalibráló egyenes alapján. A mérések a MTA KK Biooxidációs Kutatócsoport Laboratóriumában történtek.

A ceruloplazmin monoamino-oxidáz aktivitásának meghatározását a ceruloplazmin hatására az o-dianizidint lila színu festékké alakulásával mértük, 540 nm- en, fotometriás úton. Mérés: 750 µl 0,1 M acetát puffert és 200 µl 7,88 mM o-dianizidin oldatot 2 csoben elokészítünk és 15 percig eloinkubáljuk 37 ?Celsius fokon. Ezután a mintából 50–50 µl-t mérünk a csövekbe és 5 illetve 15 perc inkubálás után a mérést 2 ml 9 M-os kénsavval leállítjuk. A lila színu oldatot fotometrálásig jégen tarjuk. A fotometrálást 540 nm-en, reagens vakkal szemben végezzük el.

61

Ceruloplazmin aktivitás ( U ) = ( A15’ – A5’ ) / (0,00250 * 10 * Vminta ) ahol: – A15’ illetve A5’ a 15 és 5 perc után leolvasott abszorbancia – 0,00250 az extinnkciós koefficiens – 10: a reakció ideje (15 perc – 5 perc) – Vminta : 50 µl A mérések a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont (MTA KK) Biooxidációs Kutatócsoport Laboratóriumában történtek. 30

A plazma vas redukáló képességének (FRAP) meghatározása: Oxidációs reakció általában akkor következik be egy sejtben, ha az antioxidánsok nem képesek meggátolni a ROS képzodését (mint pl. fém kelátképzodés, vagy enzim katalizálta potenciális oxidáns eltávolítása). A különbség az, hogy a „szubsztrát? helyett az antioxidánssal fog reagálni az oxidatív gyök, vagyis az antioxidáns redukálja az oxidatív hatású anyagokat. Ezen összefüggés analógiájára az antioxidáns képesség vonatkozhat a redukáló képességre. Egy redox állapottól függo kolorimetriás eljárással egyszeru úton megállapítható ez a redukáló képesség. A módszerrel jellemezni tudjuk a plazma vas redukáló képességét (Ferric Reducing Ability of Plasma, FRAP). Alacsony pH-n, amikor a vas- tripiridiltriazin (Fe3+–TPTZ) komplex redukálódik Fe2+ formává, egy 593 nm- en abszorpciós maximumot mutató intenzív kék szín alakul ki.

62

Reagensek: 300 mM, 3,6 pH-s acetát puffer [3,1 g CH3 COONa x 3 H2 O és 16 ml CH3 COOH/ L puffer oldat]; 10 mM TPTZ (2,4,6-tripiridil-s- triazin) 40 mM- os sósavban; 20 mM FeCl3 x 6 H2 O (Reanal). A FRAP reagens eloállítása: 25 ml acetát puffer, 2,5 ml TPTZ oldat és 2,5 ml FeCl3 x 6 H2 O oldat. A kalibrációt az alább leírtak szerint végeztük el: a kalibráló sor 100, 250, 500, 750, 1000 µM- os FeSO4 x 7 H2 O oldat volt. Mérés: 300 µl friss FRAP reagenst felmelegítünk 37 °C-ra és 593 nm-en vak reagenssel leolvassuk az abszorbanciát. A vérplazma mintából 10 µl-t, valamint hígításként további 30 µl vizet hozzáadunk a reakcióelegyhez. Az abszorpciót kinetikusan a következo 5 percben leolvassuk. Egy lineáris szakaszon (?t = 50 sec.) leolvassuk az abszorbancia változását, mely egyenes arányban van a Fe2+ koncentációval. A kapott abszorbancia adatok és a kalibráló egyenes segítségével megkapjuk a Fe2+ koncentációját. A mérések a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont (MTA KK) Biooxidációs Kutatócsoport Laboratóriumában történtek.

31

5.3.

Statisztikai módszerek

5.3.1. Az adatok eloszlását Kolmogorov-Szmirnov és Shapiro-Wilks tesztekkel vizsgálatuk, az adatok a fehérjéhez nem kötött, szabadvas (NPBI) és a ferroxidáz aktivitás szintek kivételével normál eloszlást mutattak. A szérumvas, szérum ferritin, Randox totál antioxidant státusz, szérum hem-specifikus antioxidáns aktivitás (HSAA) szintek 0. és átlagosan a 47. életórában mért értékeit egymintás t-próbával hasonlítottuk össze. A fehérjéhez nem kötött vas (NPBI) és a ferroxidáz aktivitások 0, 24, 48, 72 órás értékei közötti különbséget Friedmann-teszttel és Holm- féle posztteszttel hasonlítottuk össze. Repeated measures ANOVA-t alkamaztunk a FRAP vizsgálatokhoz. Az összefüggés nem volt szignifikáns, így poszttesztet nem alkalmaztunk. A szérum ferritin és hem-specifikus antioxidáns kapacitás (HSAA) változások összefüggését lineáris korrelációval vizsgáltuk.

5.3.2. Az adatok eloszlását Kolmogorov-Szmirnov és Shapiro-Wilks tesztekkel vizsgálatuk, az adatok nem normál eloszlást mutattak. A CRIB score-ok összehasonlításakor MannWhitney próbát alkalmaztunk. A kontroll és az EPO kezelt csoportokban az adott vizsgálati héten a relatív retikulocita számokat, a szérum vas, a szérum transzferrin és a számított vasköto kapacitás értékeket Mann- Whitney próbával hasonlítottuk össze. Az egy fore jutó transzfundált volumenek és transzfúziók számát Mann- Whitney próbával hasonlítottuk össze. A BPD és a szövodmény-állapotok elofordulási gyakoriságát a két csoportban Fisher-exakt teszttel hasonlítottuk össze. Az 1 hetes rekombináns humán EPO kezelés hatására kialakuló antioxidáns kapacitás és szérum vasparaméterek változását Kruskall-Wallis teszttel és Holféle posztteszttel vizsgáltuk.

32

6.

Eredmények

6.1.

A vasháztartás és az EC antioxidáns kapacitás változásai érett egészséges

újszülöttekben korai posztnatális idoszakban

6.1.1.1. A szérumvas szintjének változásai

A megszületéskor a köldökzsinórban mérheto (0. óra) szérumvas értékek kifejezetten magasak. A megszületést követoen, az átlagosan a 42. (tartomány 18-90) életórában vett mintákban (a továbbiakban 2. életnap) viszont hirtelen csökkenést követoen olyan alacsony értéket mutattak, mint amilyenek súlyos vashiányban vagy krónikus gyulladásos állapotokban fordul elo (3. ábra).

szérum vas szint (umol/l)

40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

0.óra

2.életnap 2

1

3. ábra. A szérumvas csökkenése a megszületést követoen ( p<0,001)

33

3

6.1.1.2. A fehérjéhez nem kötött vas frakció, a szabadvas (NPBI) változásai

NPBI a köldökzsinór és a posztnatális minták mintegy 25 %-ában volt kimutatható. A minta-párok többségében a NPBI csökkenését, illetve eltunését észleltük a megszületést követoen, de kisebb számban voltak olyan minta-párok, amelyekben a megszületés idején nem, de a posztnatális mintában NPBI volt kimutatható. A posztnatális mintavételi ido szerinti további analízis során (4. ábra) a születés utáni 24, 48 és 72 órás korban mért NPBI koncentráció, köldökzsinórban mért értékekhez képest történt változásának mértéke került összehasonlításra. A NPBI koncentráció növekedése annál

Nem fehérjéhez kötött vas változása (µg/mg összfehérje)

kisebbnek mutatkozott, minél késobbi idopontban történt a vérvétel.

átlag ± szórás átlag

1.2 0.8 0.4

*

0.0 -0.4 -0.8 -1.2 -1.6 24 ± 4

48 ± 8

72 ± 12

Születés után eltelt idõ (óra) * vs. 24 órás változás

4. ábra: Szabadvas (NPBI) koncentráció posztnatális változása (* p < 0,05).

34

6.1.2. Antioxidánsok változása

6.1.2.1. Ferroxidáz aktivitás (ceruloplazmin)

A megszületéskor levett mintákban és az átlagosan a 42. életórában vett mintákban mért ferroxidáz aktivitás nem mutatott különbséget. A posztnatális minták mintavételi ido szerinti további analízise során (5. ábra) a születés utáni 24, 48 és 72 órás korban mért ferroxidáz aktivitás a köldökzsinórban mért értékhez képest történt változásának mértékét hasonlítottuk össze. A ferroxidáz aktivitás a születést követoen az elso 24 órában még nem

Ferroxidáz aktivitás változása (U/mg összfehérje)

változik, azonban 48, de még inkább 72 óra elteltével emelkedik.

2.6 2.2 1.8

Maximum Minimum 75% kvartilis 25% kvartilis Medián

*

§

1.4

*

1.0 0.6 0.2 -0.2 -0.6 24 ± 4

48 ± 8 Születés után eltelt idõ (óra)

72 ± 12 * vs. 24 órás változás § vs. 48 órás változás

5. ábra: A ferroxidáz aktivitás posztnatális változása (* p < 0,005 ; § p <0,05 )

35

6.1.2.2. Ferritin változásai

szérum ferritin szint (ug/l)

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0

0. életóra 1

2.életnap 2

3

6. ábra. A szérum ferritin szint változása a megszületést követoen (p < 0,001)

A megszületéskor mért szérum ferritin értékek mindegyike a normális referencia tartományban volt, az intrauterin idoszak kielégíto vasellátottságát tükrözve. A ferritin értékek mindkét vizsgálati szakaszban meghatározásra kerültek, és kivétel nélkül minden mintapárban emelkedést: a megszületéskor észlelt érték megduplázódását mutatták (6. ábra).

36

6.1.2.3. Szekunder antioxidánsok hatását tükrözo antioxidáns kapacitás változása

A Randox TAS értékek a megszületéskor a mások által mért egészséges felnott értékekhez képest alacsonyabb szintet mutattak 63 . A megszületést követoen kivétel nélkül minden mintában az aktivitás emelkedését detektáltuk (7. ábra)

szérum Randox (mmol/l)

1,8

1,6

1,4

1,2

1 0

megszületéskor 1

2.életnap 2

3

7. ábra. A Randox total antioxidáns státusz (Randox TAS) változása a megszületés után ( p< 0,01)

6.1.2.4 Vasredukáló képesség (FRAP) posztnatális változása

A FRAP érték megszületéskor mért átlaga nem különbözött a posztnatális minták átlagértékétol. A mintavételi ido szerinti további analízis a FRAP értékek stabilitását mutatta az elso 3 életnap folyamán, jóllehet az értékek feltunoen nagy szórást mutattak (8.sz. ábra).

37

4.5

Plazma vasredukáló képességének változása (µM/mg összfehérje)

átlag ± szórás átlag 3.5

2.5

1.5

0.5

-0.5 24 ± 4

48 ± 8

72 ± 12

Születés után eltelt idõ (óra)

8. ábra. A plazma vasredukáló képességének (FRAP) posztnatális változása a születés utáni 24, 48 és 72 órában.

6.1.2.5. Lipidperoxidáció gátló képesség változása

200

HSAA aktivitás (%)

175 150 125 100 75 50 0

0. 1óra

2. életnap 2

3

9. ábra A szérum hem-specifikus antioxidáns kapacitásának (HSAA) változása a megszületést követoen ( p< 0,001)

38

A köldökzsinór vérminták HSAA értékének átlaga 100%-nál kisebb értéket mutat, ami arra utal, hogy a standard mintához képest a szérum fokozza a hem kiváltotta lipidperoxidációt. A megszületéskor a minták több mint 80 %- a volt ilyen, prooxidáns hatású. A 2. életnapon a lipidperoxidáció gátlóképesség jelentos emelkedése észlelheto, a minták antioxidáns hatást tükröznek, csupán egyetlen mintában mértünk prooxidáns aktivitást.

6.1.3. Az antioxidáns kapacitás és a vas-metabolizmus összefüggése

A fentebb vizsgált változók korreláció analízise során nem találtunk összefüggést az antioxidáns változások és a szérum vas csökkenés, vagy a szabad vasköto kapacitás változása között. Ugyanakkor a ferritin szint emelkedésének mértéke pozitív korrelációt mutatott a lipidperoxidáció gátlóképességet jellemzo HSAA érték posztnatális növekedésével (10.ábra).

HSAA változás mértéke (%)

100 y = 0.23x + 12.3 r=0.66, n=10, p<0.05

50

0 0

50

100

150

200

250

300

Szérum ferritinváltozásának mértéke (ug/l) 10. ábra. A szérum ferritin és a hem-specifikus antioxidáns kapacitás (HSAA) változások összefüggése az elso 2 életnap folyamán.

39

3. táblázat. Összefoglaló táblázat a szabadvas (NPBI), oxidatív stessz-markerek és primer antioxidánsok változásairól újszülöttekben az elso 2 életnap folyamán.

0. életóra

2. életnap

hematológiai változások Rel. retikulocita szám (%)

4,41±1,25

3,60±0,76

Oxidatív stressz-markerek LDH (U/l)

753,8 ± 354,4

1012,5 ± 302,9

Urát (µmol/l )

259,7 ± 71,8

331,4 ± 63,3

NPBI kimutatható (esetszám)

6 / 21

7 /21

NPBI (µgl/l)

0 (0-307)

0 (0-160)

Vasanyagcsere szérum vas (µmol/l)

23,2±11,2

7,2±1,7**

transzferrin (g/l)

2,07±0,29

2,07±0,22

Szabad vasköto kapacitás

27,4±12,3

43,5±6,0*

transzferrin szaturáció (%)

60,1 ± 17,6

25,4 ± 8,5*

Ferritin (µg/l)

104±29

225±75**

(µmol/l)

Antioxidáns kapacitás Randox TAS (mmol/l)

1,23±0,12

1,44±0,12*

HSAA (%)

93,8±9,3

133,4±25,6**

FRAP (µmol/mg)

433,1 ± 59,6

469,3 ± 57,1

Primer antioxidánsok Ferroxidáz (U/mg)

37,8 (14,5-108,2)

43,3 (9,6-158,7)

Apotranszferrin (µmol/l)

18,9 ± 9,8

32,4 ± 6,9*

Szekunder antioxidánsok Összfehérje (g/l)

56,9 ± 4,4

56,1 ± 6,1

bilirubin (µmol/l)

38,2±8,9

171,3±56,7**

Értékek: medián és (tartomány), a ferroxidáz és az NBPI esetében, a NPBI gyakoriság (külön jelölve). A többi adatnál átlag és ± szórás. Rövidítések: NBPI: non-protein bound iron : (fehérjéhez nem kötött szabadvas), LDH : laktát dehidrogenáz, FRAP: ferric reducing activity of the plasma, HSAA: hem-specifikus antioxidáns aktivitás, TAS: total antioxidant status * p< 0,01 ; ** p< 0,001.

40

6.2.

A rekombináns humán eritropoetin kezelés hatása koraszülöttek vérképzésére,

transzfúzió igényére, vasháztartására és az EC antioxidáns kapacitásra

6.2.1. RhuEPO hatása a vérképzésre és transzfúzió igényre

A vizsgálati periódusban 6 haláleset történt: 3 a kezelt csoportban (EPO): l esetben szepszis, 1 generalizált CMV infekció, 1 pedig a boncolás során azonosított multiplex endokrinális diszgenezis következtében. A halálesetek nem álltak összefüggésben a rhuEPO terápiával. A kontroll csoportban szintén 3 haláleset történt: l esetben intraventrikuláris vérzés, a másodikban BPD, a harmadikban bakteriális szepszis volt a halál oka. Végül 40 (EPO n = 20, és kontroll n = 20) koraszülött adatait értékeltük és hasonlítottuk össze. Az EPO és kontroll csoport tagjainak átlagos születési súlya, gesztációs ideje, iniciális mortalitási rizikója (CRIB) nem mutatott különbséget: EPO vs. kontroll (átlag ? szórás) születési súly: 1012 ? 164 g vs. 1042 ? 132 (n.s.), gesztációs kor: 28,7 ? 1,7 hét vs. 29,1 ? 1,9 hét (n.s.), CRIB: 6,05 ? 3,6 vs. 6,3 ? 3,26 (n.s.). Mindezek alapján a csoportok összehasonlíthatónak bizonyultak.

6.2.1.1.Relatív retikulocita szám változásai

A rhuEPO kezelés hatására az elso életnapokban még fiziológiásan magas retikulocita szám a következo hetek során is fennmaradt, ill. még tovább emelkedett. A kontroll csoportban az 1. élethetet követoen igen alacsony értékek voltak számlálhatók. A relatív retikulocita számok hetente mért mediánjai a kezelési idoszakban minden mérési alkalommal szignifikánsan magasabbak voltak a kezelt csoportban a kontrollhoz képest (11. ábra). A kontroll csoportban a 2. élethéten mértük a legalacsonyabb értékeket, majd a továbbiakban, a 6-ik élethétig fokozatos kismértéku emelkedést észleltünk. Az EPO csoportban a 3. élethéten (a kezelés 2. hete) észleltük a maximális retikulocita számot, de egészében érdemi ingadozás nélkül, akezelési periódus egész ideje alatt magas retikulocita számokat észleltünk.

41

retikulocitaszám (ezrelék)

140

*

*

*

*

4

5

6

7

120 100 80 EPO

60 40 20 0 1

2

3

hetek

11.ábra. Relatív retikulocitaszá m változás rhuEPO kezelés hatására koraszülöttekben. értékek medián , 25 % és 75% kvartilis* p <0,001

6.2.1.2. A hematokrit értékek változásai

A hetente mért Htk értékek mindkét vizsgálati csoportban a megszületést követo elso 2 hétben, a várakozásnak megfeleloen, magasabb értéket, majd a továbbiakban érdemi ingadozás nélküli alacsonyabb értéket mutattak. A csoportok között a 2. élethéten az EPO csoportban észlelt magasabb érték kivételével sem a kezelés megkezdése elott, sem a terápia során nem mutatkozott különbség.

6.2.1.3.Transzfúziók száma

A kezelés hatására az EPO csoportban mind a szükséges transzfúziók száma, mind az adott transzfúziók összesített volumene a felére csökkent a kontrollhoz képest. Az összes transzfúziók csoportonkénti darabszáma (medián ; tartomány) EPO: 26 (0,5 ;0 - 5), kontroll: 52 (3 ; 0 - 5) p <0,005 volt a megszületéstol a 7. élethét végéig. A kórházi tartózkodás egésze alatt egyáltalán nem kapott transzfúziót 5 beteg az EPO csoportban, míg a kontroll csoportban ilyen beteg nem volt. A terápia 6 hete alatt transzfúziót nem kapott betegek száma: EPO: 10, kontroll: 2 volt. Az adott transzfúziók száma a kezelés megkezdése elott: EPO vs. kontroll: 8 vs 5 , a vizsgálati idoszakban: (2-7. élethét) 18 vs 47 , a kezelési periódus után, azaz a 7. élethéttol hazaadásig: 14 vs 22 (n.s.) , mindösszesen: 40 vs. 74 ( p? 0,005) volt (12. ábra). A kapott transzfúziók volumenének (ml) egy fore jutó átlaga (± szórása) EPO / kontroll: 52,9 (?

42

40,7) / 105 (? 55,3) ml (p ? 0,001) volt. Az EPO csoport tagjai a kórházi tartózkodás egésze alatt átlagosan 2 (? 1,74), míg a kontroll csoport tagjai 3,65 (? 1,72) (p ? 0,001) alkalommal részesültek transzfúzióban.

80 70 60 50 EPO

40

Kontroll

30 20 10 0 pre-EPO

EPO 6

post EPO

összesen

12. ábra. Koraszülöttek transzfúzióinak száma a rhuEPO kezelt és a kontroll csoportban (pre-EPO: kezelés elott, EPO 6: kezelés idoszakában, post EPO: a kezelés befejezésétol hazaadásig , EPO n = 20, kontroll n = 20 )

Elhúzódó respirációs terápia az EPO csoportban 8 a kontroll csoportban 11 koraszülöttnél fordult elo. A tartós respirációs kezelést igénylo koraszülöttek transzfúzióinak (db) átlaga (± szórása) EPO: 2,75 (? 1,58) vs. kontroll: 4,81 (? 1,25) (p <0,01) volt. Míg a jó állapotú koraszülötteknél EPO n=12, kontroll n=9 ez az érték EPO vs kontroll 1,5 (? 1,73) vs 2,3 (? 1,32) (n.s.) volt. A BPD elofordulása gyakorisága EPO n = 4/20, kontroll n = 7/20 volt. Ezen betegek transzfúziói számának mediánja (tartománya) EPO vs. kontroll: 3,0 (2-5) vs (n.s.) volt.

43

4,0 (3 - 5)

6.2.1.4. Szövodményállapotok gyakorisága és mellékhatások

Vizsgálatunkban a koraszülötteket sújtó szövodményállapotok közül kevesebb súlyos stádiumú ROP eset elofordulását észleltük az EPO csoportban, mint a kontroll csoportban (4. táblázat). Érdekes, hogy a ROP enyhébb, III. stádiumában végzett kriokoagulációs kezelés (mely egyenlo számban történt a csoportokban) sikeressége szignifikánsan jobb volt az EPO csoportban. A kezelésben részesített szemek száma 8 volt mindkét csoportban, amely után további progresszió nyomán az EPO csoportban csak 1 szemen alakult ki vakság, míg a kontroll csoportban 6 szemen (p <0,05). A vizsgálat során a rhuEPO kezeléssel kapcsolatos számottevo mellékhatás nem fordult elo.

4. táblázat. Szövodmény állapotok rhuEPO kezelt koraszülöttekben

RhuEPO kezelt

Kontroll

n=

20

20

PDA

5

4

NEC St. III.

0

0

19,4 ± 16,9

26 ± 25

BPD

4

7

Cryo kezelés ROP III. miatt

4

4

ROP St. IV.-V. (betegek száma)

1

3

ROP St. IV.-V. (szervek száma)

1

6 (p < 0,05)

Oxigén terápia ideje napok (átlag ± szórás)

(betegek száma)

Rövidítések: ROP St IV.-V.: IV.-V. stádiumú koraszülött retinopátia; Cryo kezelés: kriokoagulációs kezelés; BPD: bronchopulmonális diszplázia; PDA: nyitott ductus arteriosus; NEC: nekrotizáló enterocolitis III. stádiuma; rhuEPO: rekombináns humán eritropoetin

44

6.2.2. Vasháztartás paramétereinek változása rhuEPO kezelés hatására.

6.2.2.1. Szérum vas változása rhuEPO kezelés hatására A szérum vas szint mediánja (tartomány) a kezelési periódusban szignifikánsan kisebb volt az EPO csoportban. EPO: 9,5 (4,2-37,1) µmol/l, kontroll: 14,8 (7,2-37,1) µmol/l (p < 7 x 10

-5

). A szérum vas szint az elso élethéttol folyamatosan csökkeno tendenciát mutatott a

rhuEPO kezelt koraszülöttekben, míg a kontroll csoportban nem változott. A két csoport közötti különbség a 3. héttol vált szignifikánssá (12. ábra).

35

szérum vas ( umol/l )

30

*

25

*

* Kontroll

20

EPO

15 10 5 0 0

1

2

3

4

5

6

hetek

12. ábra Szérum vas szint változása rhuEPO kezelés alatt koraszülöttekben, medián 25% vés 75% kvartilis (* p <0,05).

A kezelés megkezdése elotti, az elso élethéten random módon vett szérum vas szintek mindkét vizsgálati csoportban feltunoen nagy szórást mutattak. A mintavétel ideje szerinti további analízis eredménye az volt, hogy minél korábbi életnapon történt a mintavétel, annál kisebb volt a szérum vas értéke (13. ábra). A 4. életnap elott extrém alacsony (=3,0 µmol/l) szérum vas érték a minták közel 1/3-ában volt észlelheto. A 2 - 3. életnapon vett minták mediánja nem tért el az ugyanezen posztnatális korú érett újszülöttek eredményeitol.

45

Szérum vas ( umol/l)

Szérum vas változása az 1. élethéten koraszülöttekben 35 30 25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

életnapok 13. ábra. Szérum vas értékek (medián és 25-75% kvartilis) az elso élethéten koraszülöttekben

6.2.2.2. A szérum transzferrin szint rhuEPO kezelés során A szérum transzferrin szintek a felnott- és gyermekkori referencia értékekhez képest kisebb értéket mutattak. Az EPO csoportban a transzferrin szint nem változott, míg a kontroll csoportban valamelyest csökkent a vizsgálati idoszakban. A vizsgálati csoportokban a transzferrin értékek mediánja (tartománya) EPO: 2,0 (1,3-3,1) g/l ; kontroll : 1,80 (0,6-3,0) g/l volt. A két csoport összehasonlításakor azt találtuk, hogy a 2. élethéttol a transzferrin értékek szignifikánsan magasabbak voltak az EPO csoportban a kontrollhoz képest (14. ábra). 3

*

*

*

* kontroll

transzferrin (g/l)

2,5

EPO

2

1,5

1

0

1

2

3

4

5

6

hetek

14. ábra. Szérum transzferrin szint változása rhuEPO kezelés alatt koraszülöttekben; értékek: medián , 25% és 75% kvartilis (* p <0,001). 46

6.2.2.3.

Számított szabad vasköto kapacitás

A számított szabad vasköto kapacitás értéke már a vizsgálati idoszak elso hetét követoen szignifikánsan magasabb volt a rhuEPO kezelt csoportban a kontrollhoz képest; (medián (tartomány)), EPO: 39,9 (13,3-96,4); kontroll:28,9 (6,9-51,4) µmol/l, p < 4,0 x 10

-13

(15.ábra) A szabad vasköto kapacitásban észlelt markáns különbség elsosorban a transzferrin (teljes vasköto kapacitás), és kisebb részben a szérum vas, a két csoportban már elozoleg leírt, különbségének additív hatása okozza.

*

*

*

*

szabad vasköto kapacitás ( umol/l)

70 60 50

Kontroll

40

EPO

30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

hetek

15.ábra. Szérum szabad vasköto kapacitásának változása rhuEPO kezelés alatt koraszülöttekben medián , 25% és 75% kvartilis (* p < 0,001).

6.2.2.4. Ferritin változása A szérum ferritin a kontroll csoportban a vizsgálat utolsó hetéig folyamatos, meredek emelkedést mutatott. A néha rendkívül magas abszolút értékek, a koraszülöttek többségében súlyos hemosziderózisra jellemzo, kóros szöveti vasraktározást jeleztek. Az EPO csoportban ez az emelkedés nem alakult ki, ráadásul a 4. héttol csökkeno tendencia volt észlelheto (16. ábra). A vizsgálati csoportokat összehasonlítva a ferritin érték (medián és (tartomány)) az EPO csoportban kifejezetten kisebb volt. EPO: 199 (21,0-1100) µg/l kontroll: 466 (68-

47

2100) µg/l (p < 0,0005). A kontroll csoport magasabb értéke jelentosen meghaladta az érett egészséges újszülöttek posznatális idoszakban mért ferritin szintjét. 2000

*

*

*

1800 1600 ferritin ( ug/l )

1400 Kontroll

1200

EPO

1000 800 600 400 200 0 0

1

2

3

4

5

6

hetek

16. ábra. Szérum ferritin szint változása rhuEPO kezelés alatt koraszülöttekben értékek: medián , 25% és75% kvartilis (* p <0,001).

6.2.3. 1 hetes rhuEPO kezelés hatása koraszülöttek EC antioxidáns kapacitására

A vizsgálat eredményeit az 5. táblázatban foglaltam össze. A kezdeti, a neonatális idoszakban egyébként fiziológiás, igen alacsony relatív retikulocita szám már a kezelés 2-3. napján megemelkedett a kiindulási értékhez képest. A kezelés 7. napjára a relatív retikulocita szám további növekedése következett be, melyet a szolubilis transzferrin receptor szérum szintjének, a kiindulási értékhez viszonyított szignifikáns megemelkedése kísért. Miközben az elobbi paraméterek a rhuEPO gyors és effektív csontveloi hatását igazolták, a szérum vas, transzferrin és ferritin szintek még nem mutattak változást az egy hetes megfigyelési periódus alatt. A szérum vas, transzferrin és ferritin értékek az igen kis születési súlyú koraszülöttekre jellemzo normál tartományban voltak. A kórosan magas ferritin értékek, fokozott szöveti vasraktározást tükröznek. A HSAA és a Randox TAS metódussal mért antioxidáns kapacitások értékei szignifikánsan kisebb értéket mutattak, mint az érett újszülöttek posztnatálisan mért eredményei. Az antioxidáns kapacitások nem változtak az 1 hétig tartó rhuEPO kezelés ideje alatt.

48

5.táblázat. Az antioxidáns kapacitás és a szérum vasparaméterek változása 1 hetes rekombináns humán eritropoetin kezelés hatására igen kis súlyú koraszülöttekben Kezelés elott

2-3. kezelési nap

7. kezelési nap

(n=14)

(n=8)

(n=12)

Relatív retikulocita szám (%)

0,9 (0,1-4,5)

3,5 (0,2-5,1)*

5,9 (0,1-10,8)**

sTfR

21,8 (8,0-46,9)

19,8 (15,2-29,9)

30,5 (15,9-56,2)*

Szérum vas (? mol/l)

17,2 (6,2-32,0)

12,7 (9,7–28,9)

10,4 (3,5-22,8)

Szérum transzferrin (g/l)

1,73 (1,07–2,13)

1,61 (1,42-2,03)

1,6 (1,2-2,3)

Szérum ferritin (? g/l)

423 (185-933)

432 (193-803)

321 (180-1056)

HSAA (%)

101 (81-188)

94 (77-188)

96 (84-132)

Randox TAS (mmol/l)

1,21 (0,73-1,62)

1,25 (1,12-1,42)

1,15 (0,89-1,33)

Adatok: medián és (tartomány) értékek. Rövidítések: sTfR: szolubilis transzferrin receptor; HSAA hem-specifikus antioxidáns kapacitás; * p < 0,05; ** p < 0,005 a kezelés elotti értékhez képest

49

7.

Megbeszélés

7.1. Újszülöttek perinatális vasanyagcsere-változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel.

A méhen belüli életben uralkodó relatív hypoxiás környezet hirtelen megváltozik a megszületés során. Az egészséges újszülött normális megszületését is fiziológiás oxidatív stressz kíséri, részben a megemelkedo szöveti parciális oxigén-nyomás, másrészt a szüléssel járó mérsékelt hypoxiás inzultus miatt. E rövid ideju változások reaktív oxigén gyökök fokozott képzodésével járnak. A fölöslegben termelodo szabadgyökök eliminációját antioxidáns enzimek és anyagok biztosítják. Ha a szabadgyökök képzodése és az eliminációjukért felelos mechanizmusok egyensúlya megbomlik, akkor oxidatív károsodás alakulhat ki. Az újszülött antioxidáns védekezése részben adaptált a megszületés okozta oxidatív terheléshez. Az érett újszülöttek antioxidáns enzimeinek aktivitása, a lánctöro antioxidáns kapacitás értékei hasonlóak a felnottkori értékekhez.

64

Ezzel szemben az újszülöttek és

különösen a koraszülöttek védtelenebbek a lipidperoxidációval szemben, mert alacsony a szabad vasköto kapacitásuk (transzferrin szintjük) és a ceruloplazmin szintjük.

65

A

ceruloplazmin és a transzferrin mellett, in vitro vizsgálatok alapján, a ferritin szintén jelentos szereppel bírhat a vas katalizálta szabadgyök képzodési folyamatokban.

66, 67

Korábban nem

történt olyan irányú vizsgálat, amely a hirtelen bekövetkezo posztnatális szérum vas csökkenés,

37, 68

valamint szérum ferritin- megemelkedés

69

antioxidáns mechanizmusokban

betöltött szerepét vizsgálta volna a perinatális idoszak során. Vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy a megszületéskor, a fokozott oxidatív stressz részeként számos újszülöttnél toxikus szabadvas megjelenése mutatható ki a szérumban. Az általunk vizsgált egészséges újszülöttek negyedében tudtunk csak kimutatni szabadvasat, ennek nagyságrendje nem érte el a szérum összes vastartalmának 10%-át. A szabadvas koncentrációja a megszületést követoen csökkeno tendenciát mutat, illetve eliminálódik az EC térbol. Ez a megfigyelés hasonló Lindemann és mtsai eredményéhez, amely szerint a megszületéskor gyakran detektálható szabadvas a 3. életnapra eltunik a keringésbol. A szabadvas a megszületéskori és a posztnatális mintákban annak ellenére van jelen, hogy a transzferrin rendelkezik szabad vasköto helyekkel, ugyanakkor csökkenése és eltunése a teljes

50

vastartalom meredek csökkenésével és az EC tér vasfüggo antioxidáns kapacitásának fokozódásával egyidejuleg következik be. Vahlquist és Sturgeon 37, 63 fél évszázaddal ezelott tett megfigyeléséhez hasonlóan mi is az újszülöttek szérum vas értékének drámai csökkenését észleltük röviddel a megszületés után. Ezzel egyidejuleg a szérum transzferrin szint nem változik, ami a transzferrin szabad vasköto kapacitásának jelentos emelkedését eredményezi. A szabad vasköto kapacitás, vagy más terminológiával (vasat nem tartalmazó) apotranszferrin a reaktív szabadvas megkötésének potenciáljával az egyik leghatékonyabb faktor a lipidperoxidáció gátlásában. A megszületést követo feltunoen gyors és nagyon nagy mértéku szérumvas-csökkenés magyarázatául szolgál, hogy a placentáris vasellátás hirtelen megszunik, ugyanakkor a 4. életnapig a keringésben még nagy számban találhatók retikulociták.

36

Vizsgálatunkban

igazoltuk a retikulociták perzisztálását a keringésben az elso 3 életnap folyamán. A még az intrauterin életre jellemzo aktív vörösvérsejtképzés és hemoglobin szintézis jelentos vasfelhasználással jár. A két jelenség együttesen a vas szint szélsoséges csökkenését okozza az elso életóráktól kezdve. A jelenség átmeneti: pár nap elteltével a szérum vas szint normalizálódik, amint a retikulociták kiérése befejezodik, és lényegében nem változik az élet elso 3 hónapja során

62

. A szérum vas szint változásának mélypontja valószínuleg a

megszületést követo egy – két órán belül kialakul. Az antioxidáns kapacitás hirtelen posztnatális megnövekedését kétféle, az antioxidáns rendszer különbözo mechanizmusait jellemzo vizsgálati eljárással egyaránt igazoltuk. Mindkét módszerrel azonos mértéku, mintegy 30%-os aktivitásnövekedést észleltünk. Amíg a Randox teszt a szekunder antioxidánsok hatását jellemzi

53

, addig a HSAA mérési módszer a

vasfüggo lipidperoxidáció gátlásának képességére utal.

70

A Randox méréssel jellemezheto

lánctöro antioxidáns kapacitás emelkedés hasonló változást mutat, mint Miller munkájában, aki ugyanezen módszerrel a lánctöro antioxidáns aktivitás emelkedését észlelte az 5. életnapon koraszülöttekben.

53

Eredményeink alapján feltételezheto, hogy ez a változás

korábban, már a 3. életnap elott bekövetkezik. A köldökzsinórvérben mért HSAA értékek prooxidáns tulajdonságot mutatnak. A köldökzsinór minták valószínuleg részben az intrauterin viszonyokat, részben a vajúdás okozta stressz következményeit tükrözik. Feltételezheto, hogy a méhen belüli alacsonyabb oxigenizációs viszonyok közepette a normális fejlodés és szabadgyök-egyensúly fenntartásához jóval szerényebb antioxidáns hatásokra van szükség, mint a késobbi, extrauterin életszakaszban.

51

A plazma prooxidáns tulajdonsága órákon belül megváltozik a megszületést követoen, és a szérum antioxidáns hatásúvá válik. Ez az eredmény megerosíti Lindemann hasonló módszerrel végzett vizsgálatainak eredményeit 59 Méréseink szerint a ceruloplazmin eredményével egyezoen

28

plazma

koncentrációja

korábbi

szerzok

nem változik az élet elso 2 napja során a megszületéskor mért

étékhez képest. Így a csak 3. életnapon emelkedni kezdo ceruloplazmin nem teheto felelossé a lipidperoxidáció gátlóképesség és az antioxidáns kapacitás hirtelen posztnatális javulásáért. Mások ugyanakkor a ferroxidáz aktivitás folyamatos szignifikáns emelkedését írták le az elso 3 életnap folyamán. 71

Az egymásnak ellentmondó eredmények a különbözo mérési

metódusokból adódhatnak. Mindez felveti annak lehetoségét, hogy a korai neonatális idoszakban a ceruloplazmin fehérje ferroxidáz aktivitását eddig ismeretlen hatások megváltoztatják és/vagy a ceruloplazminnal nem identikus, egyéb ferroxidáz aktivitású anyag jelenik meg a plazmatérben. A ferritin szint megduplázódását észleltük a korai neonatális adaptáció során. A vas tárolásában kulcsszerepet játszó protein szérum szintjének változása azért érdemel különös figyelmet, mert a fentebb részletezett extrém mértéku EC vas deplécióval egyidejuleg lép fel. Ennek a gyulladásos állapotokból megismert, akut fázis reakcióra emlékezteto vasparaméterkonstellációnak a jelentosége nem ismert. A ferritin emelkedés ebben az idoszakban bizonyosan nem a fokozódó szöveti vasraktározást tükrözi. Ezt támasztja alá Langley

72

megfigyelése, aki hisztológiai módszerekkel a szöveti vasraktárak csökkenését írta le az elso életnapokban. A szérum ferritin szint emelkedését okozhatja a megszületéssel járó, akár enyhe fokú hemolízis, mert a fetalis vörösvérsejtek ferritin tartalma igen magas.

63

Másik lehetséges

magyarázat, hogy a születéssel járó oxidatív stressz az endothel ill. más sejtpopulációk ferritin szintézisét indukálja, s ez a keringésben megjelenik.

73

A ferritin szabadgyök reakciókban betöltött szerepe Janus-arcú. Egyfelol hidrogén peroxid hatására a benne tárolt vas felszabadul, így az a katalitikus hatású szabad vas egyik legfobb potenciális forrása. Másfelol maga is (ferritin H lánc) rendelkezik ferroxidáz aktivitással és nyugalmi kondíciók közepette biztonságos formában köti a vasat. Jelenleg még nem tudjuk, hogy a megszületést követo EC ferritin emelkedést döntoen a H vagy az L ferritin láncok szolgáltatják. A megszületést követoen akutan megemelkedo antioxidáns kapacitás eredetét kutatva összefüggést kerestünk ezen változás és az ismert antioxidáns hatású molekulák koncentrációváltozásai között. Az idevágó irodalom alapján a bilirubin kivételével szinte valamennyi szekunder antioxidáns aktivitása és szérum szintje csökken, vagy nem mutat változást a 52

megszületést követo napokban 74, 75, 76, 77, 78 . Emiatt az újszülött korai oxidatív adaptációjában a bilirubint tartják az egyik legjelentosebb EC tényezonek, amelynek szérum szintje közismerten jelentosen megemelkedik újszülöttekben.

79

Az általunk észlelt igen gyors

antioxidáns kapacitásnövekedés azonban nem mutatott összefüggést a bilirubin szintek egyébként fiziológiás, de eltéro kinetikát mutató emelkedésével. Ez a megfigyelés egyfelol arra utal, hogy nem a bilirubin áll az áltatunk igazolt antioxidáns kapacitás emelkedés hátterében. Másfelol azt veti fel, hogy preventív antioxidáns mechanizmusok nagyobb szereppel bírnak az elso életórák és életnapok EC antioxidáns védelmében, mint a bilirubin. A primer antioxidánsok koncentráció változásait vizsgálva az apotranszferrin szint emelkedése nem gyakorolt kimutatható hatást az antioxidáns kapacitásra. Ugyanakkor pozitív korrelációt találtunk a lipidperoxidáció gátló képesség (HSAA) növekedése és a ferritin szint növekedése között. Ezek alapján feltételezheto, hogy a megszületést követoen az EC térbe jutó ferritin önmaga, vagy az azt kiváltó mechanizmus jelentosen hozzájárul az antioxidáns védelemhez. Újszülöttekben

és

különösen

koraszülöttekben

a

preventív

antioxidánsok

koncentrációja a felnottkori értékekhez képest alacsony. Ezek alapján feltételezheto, hogy az újszülöttek lipidperoxidációval szembeni védettsége csökkent. A legtöbb szerzo köldökzsinór vérminták mérési eredményeire alapozva azt a következtetést vonta le, hogy az újszülött vasháztartásában nem történik számottevo változás. 59, 80, 81,

82, 83, 84

Vizsgálatainkkal leírtuk

és igazoltuk, hogy a megszületést követo órákban a neonatális adaptáció részeként olyan szélsoséges változások játszódnak le, amelyek mélyreható, de valószínuleg idoleges változásokat okoznak a vasháztartásban, továbbá az antioxidáns rendszerben. Munkánk felhívja a figyelmet arra, hogy az újszülöttek antioxidáns rendszerének leírására önmagukban nem alkalmasak a köldökzsinórvérbol vett minták analízise révén nyert eredmények.

7.2. A rekombináns humán eritropoetin kezelés hatásai koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió-igényére, vasháztartására

Munkánk másik részében a rekombináns humán eritropoetin kezelés hatásait vizsgáltuk

koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására. A betegek

megválasztásánál elsodleges célunk olyan csoport kijelölése volt, amelyben biztosan prognosztizálható és számottevo a transzfúzió igény. A kontroll csoport adatai (minden beteg részesült transzfúzióban, az átlagos transzfúzió szám 3,65 / beteg a kórházi tartózkodás ideje alatt) igazolták a választás helyességét. 53

A 3-7. életnap között megkezdett rhuEPO adagolás hatására elmaradt a retikulocita szám posztnatális fiziológiás, az elso élethét végén bekövetkezo csökkenése. A terápia egész ideje alatt aktív vérképzést tükrözo magas retikulocita számokat észleltünk. Ez a hatás a beteg, gépi lélegeztetésre szoruló koraszülötteken is létrejött. Az anémiával asszociált klinikai tünetek miatt alkalmazott gyakori transzfúziók folytán nem lehetséges megfigyelni a koraszülöttek anémiájának természetes lefolyását az intenzív kezelést igénylo igen kis súlyú koraszülöttekben. A kvantitatív vérképre gyakorolt hatás inkább a standard indikációk mellett alkalmazott transzfúziók számának különbségén mérheto le. A transzfúzió indikációjának alapja ebben a periódusban elsosorban a klinikai állapot, pl. gépi respiráció igénye, oxigén igény stb., és nem önmagában a Htk vagy Hgb érték volt. Az elso élethetek transzfúzió- igényét az iniciális keringo volumen, a klinikai állapot, ill. az ehhez kapcsolódó nagyszámú vérvételek determinálják.

Az elso élethét magasabb

transzfúzió igénye, a rhuEPO kezelést megelozoen, ezekkel a tényezokkel állhat összefüggésben az EPO csoportban. A kezelési idoszak alatt az EPO csoport

transzfúzió igénye

a kontroll csoport

vérigényének alig 40%-át tette ki. Vizsgálatunk feltuno eredménye, hogy a transzfúzió-igény csökkenése a beteg, gépi lélegeztetést és oxigén terápiát tartósan igénylo koraszülöttek körében nagyobb arányúnak bizonyult, mint a jó állapotúak esetében. Vizsgálatunkkal igazoltuk, hogy a rhuEPO alkalmas koraszülöttek anémiájának kezelésére és a várható transzfúziók számának csökkentésére. A rhuEPO kezelés és az általa indukált vörösvérsejtképzés fokozott vasfelhasználással jár. Mindez vizsgálatunkban is jól nyomon követheto volt: a rhuEPO hatására a szérum vas szint csökkent, a transzferrin emelkedett, s a ketto eredojeként a szabad vasköto kapacitás nott. A koraszülötteknél kórosan magas ferritin szintek csökkentek. Mindez a beteg koraszülöttekre jellemzo kóros szöveti vasraktározás csökkentése révén kedvezo hatású. Koraszülöttek elso élethéten elkezdett rhuEPO kezelésével kapcsolatosan nem észleltünk a felnott betegek körében ismeretes EPO mellékhatásokat. Szintén nem fordult elo vércsere kezelést szükségessé tevo hyperbilirubinémia/polyglobulia, továbbá mások által korábban leírt neutropénia. Ezek alapján a koraszülöttek rhuEPO kezelése rövidtávon biztonságosnak bizonyult. A BPD-s esetek csökkeno tendenciáját észleltük rhuEPO kezeléssel összefüggésben. A kriokoagulációs kezelést szükségessé tevo, elorehaladott ROP (St III) incidenciája nem különbözött az EPO és a kontroll csoportban. Ugyanakkor a kriokoagulációs beavatkozás kezelés sikeressége az EPO csoportban kedvezobben alakult. Jóllehet az esetszám kevés, 54

megfigyelésünk felveti, hogy a rhuEPO kezelés jótékony hatású lehet a BPD és a súlyos stádiumú ROP lefolyására. Ez a hatás a csökkeno transzfúzió szám, a mérsékeltebb fokú vasterhelés, kisebb fokú szöveti vasraktározás és valószínuleg kedvezobb antioxidáns státusz révén jöhet létre. Az EPO non-eritroid hatásai szintén módosíthatják a ROP kialakulását meghatározó patofiziológiai folyamatokat. Az EPO apoptózis gátló és neovaszkularizációt fokozó hatása kedvezo lehet a ROP proliferatív szakaszát megelozo idoszakban, amikor a retina vaszkularizációja gátlást szenved a megszületés okozta relatív szöveti hiperoxia miatt. Ugyanezen hatás a pulmoná lis erek növekedésének serkentésével csökkentheti a BPD súlyosságát. Más szerzok hasonló klinikai vizsgálataikban, nem észlelték a rhuEPO hasonló feltételezett kedvezo hatását. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a rhuEPO klinikai hatásvizsgálatok nagy része elsosorban stabil, jó állapotú koraszülötteket vont be a megfigyelésbe, így a BPD-re és ROP-ra magasabb rizikójú betegek alul reprezentáltak voltak a vizsgálati csoportokban.

7.3 A rekombináns humán eritropoetin rövid távú hatása koraszülöttek antioxidáns kapacitására

A koraszülöttek rhuEPO kezelése még intenzifikált vasbevitel mellett is a szérum vas szint csökkenését és a szöveti vasraktárak megkevesbedését okozza, amelyet saját korábbi vizsgálatunkkal is igazoltunk. Hipotézisünk az volt, hogy a rhuEPO ezzel a mechanizmussal és a csökkeno transzfúzió igény miatt kedvezoen csökkenti a beteg koraszülöttek telített vasraktárait és csökkenti az extarcellulárisan hozzáférheto vas mennyiségét – azaz közvetve javítja a vasfüggo EC antioxidáns kapacitást. elképzelést. Nyulakban az

85

Korábbi megfigyelések támogatták ezt az

elso életnapokban alkalmazott EPO kezelés csökkentette a

kísérletesen kiváltott oxigén okozta tüdokárosodást. 86 Griffith és mtsai krónikusan lélegeztetett koraszülötteknél

a szükséges

oxigénkezeléssel töltött napok számának

csökkenését észlelték rhuEPO kezeléssel összefüggésben. 87 Az említett munkák nem terjedtek ki az EPO kezelés vasháztartásra és az EC antioxidáns rendszerre gyakorolt hatásvizsgálatára. Érett újszülötteken igazoltuk, hogy a megszületés után a szérum vas szint csökkenése az antioxidáns kapacitás megemelkedésével jár együtt. Ezek alapján feltételeztük, hogy a szérum vas szintjének mesterséges csökkentésével a vasfüggo antioxidáns védekezést javítani lehet koraszülöttekben is.

88

Ezért célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a vasháztartás és az EC

antioxidáns védekezoképesség összefüggését koraszülöttek rhuEPO kezelésének iniciális szakaszában. 55

Vizsgálatunkba olyan koraszülötteket vont unk be, akiknél a transzfúzió igény csökkentése végett indokolt a rhuEPO kezelés. Etikai megfontolásokból azt a leheto legkisebb betegpopulációt vizsgáltuk, amellyel az rhuEPO akut hatása kimutatható az EC antioxidáns rendszeren. A rövid megfigyelési idot a populáció várható heterogenitása miatt választottuk, kiküszöbölendo a hosszas terápia során várható komplikációkból, mint például szepszis, adódó hibalehetoségeket. Vizsgálatunkban az 1 hétig tartó rhuEPO kezelés hatására a várakozásnak megfeleloen bekövetkezett az eritropoetikus válasz: a retikulocita szám emelkedett. A sTfR szint növekedése a celluláris vasfelhasználás fokozódását bizonyítja. Mindezek ellenére a kiindulási értékhez képest nem csökkent számottevoen a szérum vas és nem növekedett a szabad vasköto kapacitás értéke. Az antioxidáns kapacitás szintén nem változott 1 hetes rhuEPO kezelés hatására. Eredményeinket magyarázhatja, hogy a szérum vas kiindulási értéke nem volt olyan magas, az antioxidáns kapacitás kiindulási szintje nem volt olyan alacsony, mint amilyen értékeket az érett újszülötteknél a megszületéskor és röviddel késobb tapasztaltunk. Így a rhuEPO eleve nem okozhatott olyan szélsoséges és gyors változást, mint amilyen a megszületéskor játszódik le. Méréseinkbol azt a következtetést vontuk le, hogy 1 hétig tartó rhuEPO kezelés nem változtatja meg az antioxidáns homeosztázist a kórosan telített szöveti vasraktárakkal rendelkezo koraszülöttekben. Amennyiben a rhuEPO kezelés kedvezoen befolyásolja az antioxidáns rendszert, és ez a vasháztartásra gyakorolt hatás következménye, akkor az valószínuleg csak hosszabb expozíciós idot követoen alakul ki. Ezt a megállapítást támogatja. Akisu megfigyelése, aki koraszülöttek 6 hetes rhuEPO kezelését követoen a lipidperoxidációs végtermékek (malondialdehid) csökkenését és az intracelluláris antioxidáns enzimek aktivitásának fokozódását írta le.

89

56

8.

Tézisek, a munka gyakorlati jelentosége

Munkámban egészséges újszülöttek és beteg koraszülöttek vizsgálatával a vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggéseit vizsgáltam a perinatális idoszakban.

A hem-specifikus antioxidáns kapacitás mérést elsoként alkalmaztam újszülött populáción.

Méréseimmel megállapítottam, hogy a megszületést követoen, 48 órán belül, a szérumvas szint rohamosan csökken, a szabad vasköto kapacitás megno és a ferritin-szint megnövekszik. Ezzel egyidoben az EC antioxidáns kapacitás is fokozódik.

Az újszülött vasmetabolizmusának fiziológiás posztnatális változásai közül a ferritin szint emelkedése közvetlenül hozzájárul az antioxidáns védekezoképesség javulásához.

Vizsgálataim

arra

utalnak,

hogy

a

korai

neonatális

antioxidáns-adaptációban

a

vasmetabolizmus változása lényeges szerepet játszik, továbbá, hogy az elso két életnapban jelentosége nagyobb, mint a bilirubin emelkedésé.

Bizonyítottam, hogy nagy transzfúzió igényu, beteg koraszülöttek rekombináns humán eritropoetin (rhuEPO) kezelésével csökkentheto ezen betegek transzfúzióinak száma és a kóros szöveti vasraktározás.

Koraszülöttek rhuEPO kezelésével kapcsolatban a vakságot okozó, súlyos retinopátia (ROP) esetek kisebb elofordulási gyakoriságát észleltem.

További vizsgálataimmal beteg koraszülöttek rhuEPO kezelésének kezdeti szakaszában megállapítottam, hogy a rhuEPO rövidtávon nem befolyásolja az EC antioxidáns rendszert.

57

A vasmetabolizmus fiziológiás perinatális változásaira, fél évszázaddal az elso közlést követoen, elsoként hívtam fel a figyelmet. A vasmetabolizmussal kapcsolatos EC antioxidáns védekezoképesség növekedés, az eddig leírt legkorábban fellépo extracelluláris antioxidáns adaptációs mechanizmus az újszülöttben. Megfigyeléseim tovább erosítik annak az elgondolásnak a helyességét, hogy hypoxiás inzultust követoen a reperfúziós károsodás során megjeleno szabadvas eliminálása hatékony terápiás eljárás lehet a lipidperoxidáció és a szervkárosodás kivédésében. Koraszülötteken tett megfigyeléseim felvetik annak lehetoségét, hogy a rhuEPO kezelés közvetett és/vagy közvetlen nem eritroid hatásai révén befolyásolja a koraszülöttek maradandó károsodást okozó szövodmény betegségeinek lefolyását. Vizsgálatom alapján elsosorban a rhuEPO ROP betegségre gyakorolt kedvezo hatásának lehetosége merül fel, amely

kérdés

tisztázására

nemzetközi

összefogással

kezdeményeztem.

58

epidemiológiai

vizsgálatot

Publikációs lista

Az értekezés témájában megjelent elso szerzos közlemények

Szabó M, Vásárhelyi B, Balla G, Szabó T, Machay T, Tulassay T Acute postnatal increase of extracellular antioxidant defence of neonates: the role of iron- metabolism Acta Pediatrica 2001;90:1167-70 IF: 1,582 Szabó M, Vásárhelyi B Iron supplementation during erythropoietin treatment Pediatrics 2001;108:1390-1

IF: 3,708

Szabó M Leukocyta-mentesített és osztott vörösvérsejt-koncentrátum alkalmazása magyarországi újszülött intenzív osztályokon Gyermekgyógyászat 2004;55:85-91

Az értekezés témájában megjelent nem elso szerzos közlemények Vannai A, Dunai Gy, Bányász I, Szabó M, Vamos R, Treszl A, Hajdú J, Tulassay T, Vásárhelyi B Association of genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor and risk for proliferative retinopathy of prematurity.Pediatr Res 2005 Mar;57 (3):396-8. IF: 3,604 Farkas V, Szabó M, Rényi I, Kohlhéb O Pure Red-cell Aplasia During Valproate Monotherapy: Clinical Observations and Spectral Electroencephalographic Aspects J of Child Neurology 200;15:485-487 IF:1,134

Egyéb nem az értekezés témakörében megjelent közlemények Treszl A, Szabó M, Dumai Gy,Nobilis A,Kovács I,MacahyT, Tulassay T, Vásárhelyi B Angiotensin II Type Receptor A1166C Polymorphism and Prophylactic Indomethacin Treatment Induced Ductus Arteriosus Closure in Very Low Birth Weight Neonates Pediatr Res 2003;54:753-755 IF:3,064 Szatmári M, Vásárhelyi B, Szabó M, Szabó A, Reusz G, Tulassay T Higher Osteocalcin Levels and Cross-Links Excretion in Young Men Born with Low Birth Weight Calcif Tissue Int 2000;67:429-433 IF: 2,189 Várkonyi I, Kis É, Kövi R, Máttyus I, Szabó M Thrombose der V. cava inf. Im Neugeborenenalter: Bildgebende Diagnostik in drei Fallen Radiologe 2000;40:768-783 IF: 0,608 Kádár K, Király L, Fodor F, Szabó M Magzati és újszülöttkori endocarditis Orvosi Hetilap 1994;135:2305-07

59

9.

Felhasznált irodalom

1

Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW Harper s Biochemistry 23nd Edition Appleton & Lange Norwalk, Connecticut 1993

2

Fehér J., Vereckei, A.: Szabadgyökreakciók jelentosége az orvostudományban. Biogal

Gyógyszergyár-Biotéka, Debrecen, 1985.

3

Hardwick T.J.: The Rate Constant of the Reaction between Ferrous Ions and Hydrogen

Peroxide in Acid Solution. Can. J. Chem 1957; 35: 428-436 4

Saugstad O.D.: Mechanism of tissue injury by oxigen radicals: implications for neonatal

diseases. Acta Paediatr 1996; 85: 1–4, 5

Fardy CH, Silverman M Antioxidant in neonatal lung disease. Arch Dis Child 1995; 73:

F112-117 6

Grigg J,Barber A, Silverman M, Bronchoalveolar lavage fluid glutathione in intubated

premature infants. Arch Dis Child 1993; 69: 49-51 7

Vento M, Asensi M, Sartre J, et al, Resuscitation with room air instead of 100% oxygen

prevents oxidative stress in moderately asphyxiated neonates Pediatrics 2001; 107: 624-47 8

Dorrepaal CA, Berger HM, Benders MJ, et al Nonprotein-bound iron in postasphyxial

reperfusion injury in the newborn Pediatrics 1996; 98: 883-889 9

BuonocoreG, Zani S, Sargentini I, et al: Hypoxia induced free iron release in the red cells of

newborn infants Acta Pediatr 1998; 87: 77-812

60

10

Ment LR, Stewart WB, Duncan CC Beagle puppy model of intraventricular hemorrhage:

effect of superoxide dismutase on cerebral blood flow and prostaglandins J Neurosurg 1985; 62: 563-569 11

Whitelaw A. Systematic review of therapy after hypoxic-ischaemic brain injury in the

perinatal period. Semin Neonatol. 2000;(1):33-40. Review. 12

Van Bel F, Shadid M, Moison RM, Dorrepaal CA, Fontijn J, Monteiro L, Van De Bor M,

Berger HM. Effect of allopurinol on postasphyxial free radical formation, cerebral hemodynamics, and electrical brain activity Pediatrics. 1998 ;101(2):185-93 13

Ment LR, Stewart WB, Duncan CC Beagle puppy model of intraventricular hemorrhage:

effect of superoxide dismutase on cerebral blood flow and prostaglandins J Neurosurg 1985; 62: 563-569 14

Gibson DL, Sheps SB, Schechter MT, Wiggins S, McCormick AQ Retinopathy of

prematurity: A new epidemic? Pediatrics 1989; 83: 486-92 15

Tin W Milligan WA, Pennefather P, Hey E Pulse oximetry. Severe retinopathy, and

outcome at one year in babies of less than 28 weeks gestation Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2001; 184: F106-F110 16

The STOP-ROP Multicenter Study Group. Supplemental therapeutic oxygen for

prethreshold retinopathy of prematurity ( STOP-ROP) : a randomized, controlled, trial: primary outcomes Pediatrics 2000; 105: 295-310 17

Silvermann WA Retinopathy of prematurity: oxygen dogma challenged Arch Dis Child

1982; 57: 731-733 18

Tin W Milligan WA, Pennefather P, Hey E Pulse oximetry. Severe retinopathy, and

outcome at one year in babies of less than 28 weeks gestation Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2001; 184: F106-F110

61

19

The STOP-ROP Multicenter Study Group. Supplemental therapeutic oxygen for

prethreshold retinopathy of prematurity ( STOP-ROP) : a randomized, controlled, trial: primary outcomes Pediatrics 2000; 105: 295-310 20

Sacks LM, Schaffer DB, Anday EK, Peckman GJ, Delivoria-Papadopoulos M Retrolental

fibroplasia and blood transfusion in very low-birth-weight infants Pediatrics 1981: 770-774 21

Inder TE, Clemett RS, Austin NC, Graham P, Darlow BA High iron status in very low birth

weight infants is associated with an increased risk of retinopathy of prematutity J Pediatr 1997; 131: 541-4 22

Cooke RWI, Drury JA, Yoxall CW, James C Blood transfusion and chronic lung disease in

preterm infants Eur J Pediatr 1997; 156: 47-50 23

Sullivan JL Retinopathy of prematurity and iron: a modification of the oxygen hypothesis

Pediatrics 1986;78:1171-2 24

Gutteridge J.M.C.: Lipid peroxidation and Antioxidants as Biomarkers of Tissue Damage.

Clin. Chem. 1995; 41/12: 1819-1828,. – European Beckman Conference. 25

Sullivan JL, Newton RB: Serum antioxidant activity in neonates Arch Dis Child 1988; 63:

748-57 26

Evans PJ, Evans R, Kovar IZ, Holton AF, Halliwell B Bleomycin-detectable iron in the

plasma of premature and full-term neonates FEBS Letter 1992; 303:23. 210-12 27

Gitlin D, Biasucci A Development of ?G, ?A, ?M, ß1C/ß1A esterase inhibitor,

ceruloplasmin, transferrin, hemopexin, haptoglobin, fibrinogen, plasminogen, alfa1antitrypsin, orosomucoid, béta ß-ipoprotein, ?2-macroglobulin and prealbumin in the human conceptus J Clin Invest 1969; 48: 1433-46 28

Louro MO,Cocho JA,Tutor JC Specific oxidase activity of cord serum ceruloplasmin int he

newborn Clin Chem Lab Med 2000; 38: 1289-92

62

29

Szabó Teréz Coeruloplasmin aktivitás változások a postnatalis adaptáció idoszakában

Debrecen, Kandidátusi értekezés1989 30

Gutteridge JMC,StocksJ Caeruloplasmin: Physiological and Pathological perspectives CRC

Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 1981; 257-329 31

Lindeman JH, Lentjes EG, van Zieren-Grobben D, Berger HM Postnatal changes in plasma

ceruloplasmin and transferrin antioxidant activities in preterm babies Biol Neonate 2000; 78(2): 73-6 32

Sharkey RA, Donelly SC, Conelly KG, Robertson CE, Haslett C, Repine JE. Initial serum

ferritin levels in patients with multiple trauma and subsequent develpement of acut respiratory distress syndrome Am J Respir Crit Care Med 1999; 159: 1506-9 33

Orino K, Lehman L,Tsuji Y, Ajaki H, Torti SV,Torti FM. Ferritin and the response to

oxidative stress Biochem J 2001; 357: 241-7 34

Pearson HA Life-span of the fetal red blood cell J Pediatr 1967; 70: 166-171

35

Alter BP. Biology of erythropoiesis. Ann N Y Acad Sci. 1994 7;731:36-47

36

Halvorsen S, Plasma erythropoietin levels in cord blood and in blood during the first weeks

of life Acta Paediatr Scand 1963; 52: 425 37

Widness JA,Garcia JF,Schwartz R Cord serum erythropoietin values and disappearance

rates after birth in polycythemic newborns Ped Res 1982; 16: 218A 38

Brown MS, Phibbs RH, Garcia JF, Dallman PR Postnatal changes in erythropoietin levels

in untransfused premature infants J Pediatr 1983; 103: 612-17 39

Seip M, The Reticulocyte Level,and the Erythrocyte Production Judged from Reticulocyte

Studies, in Newborn Infants during the First Week of Life Acta Ped 1955; 44: 355-369

63

40

Vahlquist BC. Das serumeisen eine paediatrisch-klinische und experimentelle studie Acta

Ped Suppl 1941; 28 : 171-89 41

Sturgeon P Studies of iron requirements in infants and children I. Normal Valeues for

Serum Iron,Copper and Free Erythrocyte Protoporphyrin Pediatrics 1954; 13: 107-121 42

Halvorsen S, Bechensteen AG. Physiology of erythropoietin during mammalian

development Acta Paediatr Suppl. 2002;91(438):17-26. Review. 43

Wardrop CA, Holland BM, Anne Veale KE, Jones JG, Gray OP Nonpysiological anaemia

of prematurity Arch Dis Child 1978; 53: 855-860 44

Szabó Miklós Leukocyta-mentesített és osztott vörösvérsejt-koncentrátum alkalmazása

magyarországi újszülött intenzív osztályokon Gyermekgyógyászat 2004; 55: 85-91 45

Donato H, Vain N, Rendo P, Vivas N, Prudent L, Larguia M, Digregorio J, Vecchiarelli C,

Valverde R, Garcia C, Subotovsky P, Solana C, Gorenstein A. Effect of early versus late administration of human recombinant erythropoietin on transfusion requirements in premature infants: results of a randomized, placebo-controlled, multicenter trial. Pediatrics. 2000;105(5):1066-72 46

Pollak A, Hayde M, Hayn M, et al Effect of intravenous iron supplementation on

erythropoiesis in erythropoietin-treated premature infants Pediatrics 2001;107:78-85 47

Tan CC. Eckardt KU, Ratcliffe PJ Organ distribution of eythropoietin messenger RNA in

normal and uremic rats Kidney Int. 1991; 40: 69-76 48

Bernaudin M, Nedelec AS, Divoux D et al, Normobaric hypoxia induces tolerance to focal

permanent cerebral ischemia in association with an icreased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in theadult mouse brain J Cereb Blood Flow Metab 2002; 22: 293-403

64

49

Grasso G Neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin in experimental

subarachnoid hemorrhage J Neurosurg Sci 2001; 45: 7-14 50

Bernaudin M, Nedelec AS, Divoux D et al, Normobaric hypoxia induces tolerance to focal

permanent cerebral ischemia in association with an icreased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in theadult mouse brain J Cereb Blood Flow Metab 2002; 22: 293-403 51

Grasso G Neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin in experimental

subarachnoid hemorrhage J Neurosurg Sci 2001; 45: 7-14 52

Sasaki R, Masuda S, Nagao M, Erythropoietin: multiple physiological functions and

regulation of biosynthesis Biosci Biotechnol Biochem 2000; 64: 1775-1793 53

Yu X, Shacka JJ, Eells JB, et al Erythropoietin receptor signaling is required for normal

brain development Development 2002; 129: 505-516 54

Juul SE, Yachnis AT, Christensen RD Tissue distribution of erythropoietin and

erythropoietin receptor int he developing human fetus Early human development 1998; 52: 235-249 55

Yasuda Y, Masuda S, Chikuma M et al Estrogen-dependent production of erythropoietin

in uterus and its implication in uterin angiogenesis J Biol Chem 1998; 273: 25381-25387 56

Girard J Metabolic Adaptations to Change of Nutrition at Birth Biol Neonate 1990; 58 (

suppl 1): 3-15 57

The International Neonatal Network Cockburn F, Cooke R W I, Gamsu H R , Greenough

A,Hopkins A, McIntosh N, Ogston et al The CRIB (clinical risk index for babies) score : a tool for assessing initial neonatal risk and comparing performance of neonatal intensive care units Lancet 1993; 342: 193-198

65

58

Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ, Gopathan V, Milner A A novel method for

measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates Clinical Science1993; 84: 407-12 59

Ujhelyi L, Balla J, Muszbek L, Kakuk G, Belcher J, Jacob HS, Vercelotti GM, Balla G A

microassay to assess the oxidative resistance of low-density lipoproteins Clin Chem 1998; 44: 1762-64 60

Savman K., Nilson U.A., Blennow M., Kjelmer I., Whitelaw A.: Non-protein-bound iron is

elevated in cerebrospinal fluid from preterm infants with posthemorrhagic ventricular dilatation. Paediatr Res 2001; 49: 208-212 61

Roxborough H.E., Millar C.A., McEnemy J. Young I.S.: Carbamylation inhibits the

ferroxidase activity of caeruloplasmin. Biochem Res Com 1995; 214: 1073-1078, 62

Iris F.F. Benzie, J.J. Strain: The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a measure of

antioxidant power: the FRAP assay Anal Biochem 1996; 239: 71–76, 63

Cao G,Prior RL Comparison of differnet analytical methods for assesing total antioxidant

capacity of human serum Clin Chem 1998 ;44: 1309-15 64

Lindeman JHN, van Zoeren-Grobben, Schrijver J, Speek AJ, Poorthuis BJ,Berger HM The

total free radical trapping ability of cord blood plasma in preterm and term babies Ped Res 1989; 26: 20-24 65

Lindeman JH, Houdkamp E, LentjesEG, PoorthuisBJ, BeregHM Limited protection againts

iron -induced lipid peroxidation by cord blood plasma Free Radic Res Commun 1992; 16: 285-94 66

Cozzi P, Santambrogio P, Levi S, Arosio P Iron detoxifying activity of ferritin. Effects of H

and L human apoferritins in lipid peroxidation in vitro FEBS Letters 1990; 277: 119 -122

66

67

Evans PJ, Evans R, Kovar IZ, Holton AF, Halliwell B. Bleomycin-detectable iron in the

plasma of premature and full-term neonates FEBS Letter 1992; 303:23. 210-12 68

Sturgeon P. Studies on iron requirements in infants and children Pediatrics 1954; 13:107-

124 69

Tcherma G, Archambeaud MP, Yvart J, Diallo D Erythrocyte ferritin in human neonates:

maternofetal iron kinetics revisited Clin Lab Haem 1996; 18: 147-153 70

Balla G, Jacob HS, Eaton JW, Belcher JD, Vercelotti GM, Hemin: A possible

physiological mediator of low density lipoprotein oxidation and endothelial injury Arterioscler Thromb Thrombosis 1991; 11: 1700-11 71

Karg E, Orvos H,Papp A,Beck N,Turi S, Németh I Ferroxidases and Xanthine Oxidase in

Plasma of Healthy Newborn Infants Free Radical Research 2001; 35: 555-561 72

Langley F A Haemopoesis and siderosis int he foetus and newborn Arch Dis Child 1951;

26: 64-75 73

Balla G, Jacob HS, Balla J, Nath K, Apple F, Eaton JW, Vercelotti GM Endothelial cell

heme oxygenase and ferritin induction by heme proteins : A possible mechanism limiting shock damage. Trans Assoc Amer Phys, 1992; CV:1-6 74

van Zoeren-Grobben D, Lindeman JHN, Hodkamp E, Moison RMW, Wijnen JT, Berger

HM Markers of oxidative stress and antioxidant activity in plasma and erythrocytes in neonatal respiratory distress syndrome Acta Paediatr 1997; 86: 1356-62 75

van Zoeren-Grobben D, Lindeman JHN, Hodkamp E, Brand R, Schriver J, Berger HM

Postnatal changes in plasma chein-breaking antioxidants in healthy preterm infants fed formula and/or human milk. Am J Clin Nutr 1994; 60: 900-6 76

Marks JF, Kay J,Baum J,Curry L Uric acid levels in full-term and low-birth-weight infants

J. Pediatr 1968; 73: 609-611

67

77

MCCarthy K, Bhogal M, Nardi M, Hart D Pathogenic factors in bronchopulmonary

dysplasia Ped Res 1984; 18: 483-8 78

Schrod-L, Neuhaus-T, Speer-CP, Girschick-H: Possible role of uric acid as an antioxidant

in premature infants Biol Neonate 1997; 72: 102-111 79

Stocker R, Yamamoto Y, McDonagh AF, Glazer AN, Ames DM Bilirubin is an antioxidant

of possible physiological importance Science 1987; 235: 1043-46 80

Sullivan JL, Newton RB: Serum antioxidant activity in neonates Arch Dis Child 1988; 63:

748-57 81

Evans PJ, Evans R, Kovar IZ, Holton AF, Halliwell B. Bleomycin-detectable iron in the

plasma of premature and full-term neonates FEBS Letter 1992; 303:23. 210-12 82

Moison RM, Palinckx JJ, Roest M et al. Induction of lipid peroxidation of pulmonary

surfactant by plasma of preterm babies Lancet 1993; 341: 79-82 83

Berger HM, Mumby S, Gutteridge JM Ferrous ions detected in iron-overloaded cord blood

plasma from preterm and term babies: implication for oxidative stress Free Radic Res 1995; 22: 555-559 84

Berger HM, Lindeman JH, van-Zoeren-Grobben D, Houdkamp E, Schrijver J, Kanhai HH:

Iron overload, free radical damage, and rhesus haemolytic disease. Lancet. 1990; 335: 933-6. 85

Breuer W, Hershko C, Cabantchik ZI: The importance of non-transferrin bound iron in

disorders of iron metabolism. Transfus Sci. 2000; 23: 185-192. 86

Bany-Mohammed FM, Slivka S, Hallman M Recombinant human erythropoietin: possible

role as an antioxidant in premature rabbits Pediatr Res 1996; 40: 381-7

68

87

Griffiths G, Lall R, Chatfield S, Short A, Mackay P, Williamson P, Brown J, Levene MI:

Randomised controlled double blind study of role of recombinant erythropoietin in the prevention of chronic lung disease Arch Dis Child. 1997; 76: F190-192. 88

Donato H, Vain N, Rendo P, Vivas N, Prudent L, Larguia M, Digregorio J, Vecchiarelli C,

Valverde R, Garcia C, Subotovsky P, Solana C, Gorenstein A: Effect of early versus late administration of human recombinant erythropoietin on transfusion requirements in premature infants: results of a randomized, placebo-controlled, multicenter trial. Pediatrics. 2000; 105: 1066-1072. 89

Akisu M, Tuzun S, Arslanoglu S, Yalaz M, Kultursay N. Effect of recombinant human

erythropoietin administration on lipid peroxidation and antioxidant enzyme(s) activities in preterm infants. Acta Med Okayama. 2001;55:357-362.

10.

Köszönetnyilvánítás Köszönöm prof. Tulassay Tivadarnak, programvezetomnek, hogy a kutatói pályán

elindított és a tudományos munkához nagyfokú önállóságot biztosított. Miközben a kutatói magatartás és felelos gondolkodás területén példát adott, tevékenységemet kezdettol nagyra értékelte. Külön köszönöm, hogy minden körülmények között bátorított, türelemmel bíztatott és hiányaimban mindig segítségemre sietett. Köszönöm prof Machay Tamásnak, munkahelyi vezetomnek, gyógyító orvosi, oktatói és emberi példáját, amellyel elottem járva meghatározó szerepet töltött be pályaválasztásomban, valamint a folyamatos lelki és szellemi támogatást amellyel

tudományos

munkámat

kísérte.

69

Köszönöm

dr

Vásárhelyi

Barnának,

témavezetomnek, hogy elkötelezetten mellém állt, a publikációk és a vizsgálati eredmények értékelésének módszertanába bevezetett. Nemcsak alkotótársként, hanem barátként is számíthattam rá. Köszönöm a klinikai vizsgálatok kivitelezésében nyújtott önzetlen együttmuködést Dr Nobilis András adjunktus úrnak, Dr Hajdú Júlia, Dr Görbe Éva docenseknek, Dr Rónaszéki Ágoston, Dr Téglás Emma, Dr Závodi Erzsébet foorvosoknak, és a mintavételekben segédkezo ápolóknak valamint a szüloknek, és hálával tartozom a gyermekeknek is. Köszönöm a laboratóriumi vizsgálatok kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítséget dr Szabó Teréznek, dr Jakus Juditnak, Dr SC Chem Szabó Antalnak valamint az I. sz. Gyermekklinika, és az I. sz. Szülészeti és Nogyógyászati Klinika laboratóriumaiban dolgozó asszisztenseknek, Molnár Éva haematológiai szakasszisztensnek, Kelen Dorottya és Machon Attila TDK hallgatóknak. Ezen a helyen emlékezem meg Prof Nagy Ivánról, aki a vasháztartás paramétereinek mérését tette lehetové a Heim Pál Kórház Központi laboratóriumában. Hálás vagyok Dr Treszl Andrásnak és Róka Anikónak, akik a statisztikai számítások és a kézirat elkészítésében nyújtottak önzetlen segítséget. Külön köszönettel tartozom prof Balla Györgynek, aki nemcsak biztosította az antioxidáns kapacitás méréseket, hanem elmélyült tudásával, baráti konzultációival hozzájárult a kutatási hipotézis felállításához és az eredmények helyes értelmezéséhez. Köszönöm közvetlen munkatársaimnak, köztük külön dr Szolnoki Juditnak, hogy önfeláldozó munkájukkal a betegellátás feladatait helyettem is hordozták, amikor tudományos tevékenységet végeztem. Végül köszönöm szüleimnek és családomnak, hogy munkámat és életemet imádságukkal és szeretetükkel folyamatosan orzik.

70