A TRICHODERMA REESEI GOMBA ÉS S GENETIKÁJA

A TRICHODERMA REESEI GOMBA CELLULÁZ ENZIM TERMELÉSÉNEK BIOKÉMIÁJA ÉS GENETIKÁJA KARAFFA LEVENTE

Debreceni Egyetem Természettudományi és Technológiai Kar Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék 2009

Trichoderma reesei (teleomorf: Hypocrea jecorina)

A CELLULÁZ ENZIMEK • cellobiohidroláz I (Cel7A fehérje, cbh1 gén), cellobiohidroláz II (Cel6A fehérje, cbh2 gén) • Papíripar; második generációs bioalkoholgyártás; heterológ fehérjetermelés • Legfontosabb ipari termelőjük a Trichoderma reesei fonalas gomba • Ipari körülmények között a celluláz enzimeket laktóz szénforráson állítják elő.

A T. REESEI LAKTÓZ ANYAGCSERÉJE A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan hidrolizálja.

Laktóz

β-galaktozidáz

SEJTMEMBRÁN

Glükóz

Galaktóz

glükóz permeáz

galaktóz permeáz

CITOSZOL

Galaktóz Glükóz

Galaktokináz

D-Galaktóz

ADP

ATP

Aldóz reduktáz

D-galaktóz1-foszfát

Leloir

NADPH

UDP Glükóz

NADP+

Galaktitol

NADH

L-Xilo-3-hexulóz

?

L-Szorbóz Szorbóz reduktáz

UDPGalaktóz-4epimeráz

UDP Galaktóz

D-glükóz1-foszfát

Foszfoglükomutáz

NAD+

L-Arabinitol dehidrogenáz

?

Gal-1-P-uridilil transzferáz

NADPH NADP+

L-Szorbitol

Reduktív

NAD+

A Trichoderma reesei D-galaktóz anyagcseréjének áttekintése NADH

ATP

ADP

D-Fruktóz Xilitol dehidrogenáz

Hexokináz

D-Fruktóz6-foszfát


GLIKOLíZIS

A BÉTA-GALAKTOZIDÁZ ENZIM • D-galaktozidok (pl. laktóz) terminális, nem-redukáló β-D-galaktóz monomerjeit hidrolizálja (EC 3.2.1.23). • Négy különböző Glikozid Hidroláz családnak (GH1, GH2, GH35, GH42) is vannak ‘béta-galaktozidáz’ tagjai strukturális, funkcionális diverzitás. • Biotechnológiai jelentőség (tejipar [laktóz hidrolízis], transzgalaktozilációs reakciók)

BÉTA-GALAKTOZIDÁZ A T. REESEI-BEN • Két db független béta-galaktozidáz gén (bga1, bga2) • Az összes béta-galaktozidáz aktivitás 90 %-ért a bga1 terméke (BGA1; GH 35 család) a felelős. • Bga1 kifejeződése: batch fermentáció során Larabinózon és L-arabinitolon a legerősebb, de laktózon, D-galaktózon, D-xilózon és polioljaikon is.

MUNKAHIPOTÉZIS • A D-galaktóz két útvonalon (Leloir, reduktív) is metabolizálódhat. • Melyik út generálja a bga1 de facto inducerét? • A D-galaktóz poliolja, a galaktitol (dulcitol) képes indukálni a bga1 gén kifejeződését.

A reduktív útvonal működése meghatározó a bga1 gén indukciója szempontjából

KíSÉRLETI STRATÉGIA 1) Olyan T. reesei hiánymutáns törzs fenotípusanalízise, melyben a D-galaktóz hasznosítás Leloir útvonalának első lépése hiányzik.

Galaktokináz

D-Galaktóz

ADP

ATP

Aldóz reduktáz


UDP Glükóz

NADP+


UDP Galaktóz

Foszfoglükomutáz

NAD+


NADH

L-Xilo-3-hexulóz

?



NADPH

Galaktitol

?


NADPH NADP+

L-Szorbitol

NAD+


ATP

ADP


Hexokináz



GLIKOLíZIS

KíSÉRLETI STRATÉGIA 1) Olyan T. reesei hiánymutáns törzs fenotípusanalízise, melyben a D-galaktóz hasznosítás Leloir útvonalának első lépése hiányzik. 2) Olyan T. reesei hiánymutáns törzs fenotípusanalízise, melyben a D-galaktóz hasznosítás reduktív útvonalának első lépése hiányzik.

Galaktokináz

D-Galaktóz

ADP

ATP

Aldóz reduktáz


UDP Glükóz

NADP+


UDP Galaktóz

Foszfoglükomutáz

NAD+


NADH

L-Xilo-3-hexulóz

?



NADPH

Galaktitol

?


NADPH NADP+

L-Szorbitol

NAD+


ATP

ADP


Hexokináz



GLIKOLíZIS

MELYIK ÚT GENERÁLJA AZ INDUCERT? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml-1] – a bga1 kifejeződés riportere!!!

T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz

Vad típus (QM 9414)

4,12

2,97

< 0,01

Δxyl1 (aldóz reduktáz mutáns)


T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz


4,12

2,97

< 0,01


0,06

3,19

< 0,01


T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz


4,12

2,97

< 0,01


0,06

3,19

< 0,01

Δgal1 (galaktokináz mutáns)


T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz


4,12

2,97

< 0,01


0,06

3,19

< 0,01


3,15

4,23

< 0,01

MELYIK KÖZTES AZ INDUCER? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml-1] – a bga1 kifejeződés riportere!!!

T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz


4,12

2,97

< 0,01


0,06

3,19

< 0,01


3,15

4,23

< 0,01

Δlad1 (L-arabinitol dehidrogenáz mutáns)

Galaktokináz

D-Galaktóz

ADP

ATP

Aldóz reduktáz


UDP Glükóz

NADP+


UDP Galaktóz

Foszfoglükomutáz

NAD+


NADH

L-Xilo-3-hexulóz

?



NADPH

Galaktitol

?


NADPH NADP+

L-Szorbitol

NAD+


ATP

ADP


Hexokináz



GLIKOLíZIS

MELYIK KÖZTES AZ INDUCER? Extracelluláris β-galaktozidáz aktivitás [U ml-1] – a bga1 kifejeződés riportere!!!

T. reesei törzsek

D-galaktóz

Galaktitol

D-glükóz


4,12

2,97

< 0,01


0,06

3,19

< 0,01


3,15

4,23

< 0,01

Δlad1 (L-arabinitol dehidrogenáz mutáns)

3,56

6,88

< 0,01

TANULSÁGOK • A Leloir-útvonal nélkülözhető a T. reesei béta-galaktozidáz enzimet kódoló bga1 génjének indukciójában. • A reduktív útvonal nélkülözhetetlen a bga1 gén indukciójában. • A bga1 gén de facto inducere a reduktív út első köztese, a galaktitol.

A CELLULÁZOK INDUKCIÓJA LAKTÓZZAL • A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan hidrolizálja, viszont: • Sem a D-glükóz, sem a D-galaktóz, sem a kettő együtt nem képes indukálni a cellulázokat (cellobiohidroláz I [CBH I] és cellobiohidroláz II [CBH II]) A T. reesei maximális specifikus növekedési rátája (1/h) minimál táptalajon D-glükóz D-galaktóz laktóz 0,110

0,088

0,042

Lehet, hogy lassú D-galaktóz lebontásra van szükség?

• Kemosztát típusú folytonos tenyészetek elemzése D-galaktóz, D-glükóz, laktóz és glükóz + galaktóz szénforrások használatával. • A CBH I illetve CBH II fehérjék extracelluláris felhalmozódásának mérése.

CELLULÁZ KÉPZŐDÉS

A T. REESEI LAKTÓZ ANYAGCSERÉJE A Trichoderma reesei a laktózt extracellulárisan hidrolizálja.

Laktóz

β-galaktozidáz

SEJTMEMBRÁN

Glükóz

Galaktóz

glükóz permeáz

galaktóz permeáz

CITOSZOL

Galaktóz Glükóz

MIÉRT JOBB INDUCER A LAKTÓZ MÉG KIS NÖVEKEDÉSI RÁTA ESETÉN IS? ‘Mi a különbség a laktózból felszabaduló galaktóz és a D-galaktóz szénforrás között?’

Laktóz: 1,4-O-β-D-galaktopiranozil-D-glükóz

AZ ANOMÉRIA JELENTŐSÉGE

α-D-galaktóz

β-D-galaktóz

Az α és β formák aránya vízben 1 : 2 (cca. 6 óra)

α / β-D-galaktóz Galaktóz permeáz β-D-galaktóz

mutarotáz

R E aldóz reduktáz D U K T galaktitol í V D-fruktóz-6-P

SEJTMEMBRÁN α-D-galaktóz galaktokináz L E D-galaktóz-1-P L O I D-glükóz-6-P R GLIKOLíZIS

MUTAROTÁZ AKTIVITÁS • A β-D-galaktóz α-D-galaktóz átalakulást Saccharomyces cerevisiae élesztőben az UDPgalaktóz-4-epimeráz enzim mutarotáz doménje katalizálja. • Trichoderma reesei-ben NINCS mutarotáz domén! • Az α-forma kialakulása a laktóz β-D-galaktopiranóz monomerjéból enzimes katalízis nélkül, spontán, ezért más fajokhoz képest LASSAN megy végbe. • A galaktokináznak CSAK az α-D-galaktóz, az aldóz reduktáznak mindkét anomer a szubsztrátuma.

MUNKAHIPOTÉZIS • A β-D-galaktóz α-D-galaktóz átalakulás lassúsága és a galaktokináz illetve az aldóz reduktáz enzimek eltérő szubsztrátum-kötése miatt a Dgalaktóz anyagcsere fluxusa T. reesei-ben a reduktív útvonal felé tolódik laktóz szénforráson. • A reduktív útvonal fokozott működése T. reesei-ben előnyös a cellulázok indukciója szempontjából (Lszorbóz?).

Galaktokináz

D-Galaktóz

ADP

ATP

Aldóz reduktáz


UDP Glükóz

NADP+


UDP Galaktóz

Foszfoglükomutáz

NAD+


NADH

L-Xilo-3-hexulóz

?



NADPH

Galaktitol

?


NADPH NADP+

L-Szorbitol

NAD+


ATP

ADP


Hexokináz



GLIKOLíZIS

KíSÉRLETI STRATÉGIA • Ha a reduktív út relatív erősödése előnyös, akkor a Leloir-útvonal relatív erősödése hátrányos a cellulázok indukciója szempontjából. • Hozzunk létre egy T. reesei ‘gain-of-function’ mutarotáz mutánst (melyben a galaktokináz kizárólagos szubsztrátumának számító α-Dgalaktóz intracelluláris keletkezése felgyorsul) és teszteljük a fenotípust. • Ha a mutánsban a celluláz génexpresszió visszaesik a re-transzformált törzshöz képest, a munkahipotézis bizonyítást nyer.

A MEGVALÓSíTÁS LÉPÉSEI • A S. cerevisiae élesztő UDP-glükóz-4-epimeráz génjének mutarotáz domént kódoló szakaszát izoláljuk és plazmidba (pRLMEX30) klónozzuk. • Egy konstitutív, erős T. reesei promóter (piruvát kináz, pki1) irányítása alá helyezzük. • T. reesei-be transzformáljuk (pyr4 – uridin auxotrófia). • Fenotípus-vizsgálat: cbh1 és cbh2 gének Northern analízise, laktóz hasznosítás, növekedés

MUTAROTÁZ EXPRESSZIÓS KAZETTA

A S. cerevisiae élesztő Gal10 fehérje C-terminális része (GAL101068– 2100) felelős a D-galaktopiranóz mutarotáz aktivitásért

AZ ÉLESZTŐ GAL101068– 2100 KIFEJEZŐDÉSE

M1: egy kópiás törzs

M2a és M2b: két kópiás törzsek

Specifikus aktivitás U (mg protein)-1

INTRACELLULARIS MUTAROTÁZ AKTIVITÁS M1: egy kópiás törzs 4 3

M2a és M2b: két kópiás törzsek QM: referencia törzs

2 1 0 iae a QM na M1 a M2a a M2b s i v re corin ri corin corin e o c c . e e j S e e H. H. j H. j H. j

Sem extracelluláris, sem sejtfalhoz kötött mutarotáz aktivitást nem találtunk!

18

18 16

QM 9414 Mut_cn I. Mut_cn IIa Mut_cn IIb

14 12 10 8 6 4 2 0

Glükóz koncentráció (g/L)

Laktóz koncentráció (g/L)

SZÉNFORRÁS FELVÉTEL 16

QM 9414 Mut_cn I. Mut_cn IIa Mut_cn IIb

14 12 10 8 6 4 2 0

0

20 40 60 Fermentációs idő (h)

80

0

20

40

60

Fermentációs idő (h)

80

D-fruktóz, glicerin és D-xilóz szénforrásokon sem volt eltérés a felvétel időprofiljában

NÖVEKEDÉS LAKTÓZON Biomassza (DCW; g/L)

18 16

QM 9414 Mut_cn I Mut_cn IIa Mut_cn IIb

14 12 10 8 6 4 2 0 0

20

40

60

Fermentációs idő (h)

80

100

Minden más szénforráson (glükóz,galaktóz, fruktóz, glicerol. L-arabinóz, xilóz) a T. reesei mutánsok és a retranszformált törzs növekedése azonos volt

CELLULÁZOK EXPRESSZIÓJA

RNS lak

lak

lak

CELLULÁZOK EXPRESSZIÓJA

RNS lak

lak

lak

A celluláz génkifejeződés gyengülése a mutarotáz jelenlétében specifikus a laktózra!!!

TANULSÁGOK • A S. cerevisiae UDP-glükóz-4-epimeráz gén mutarotáz egységének jelenléte megváltoztatja a T. reesei laktóz fenotípusát. • A laktóz hasznosítás (és a rajta történő növekedés) gyorsabbá válik. • A cbh1 és cbh2 gének kifejeződése visszaesik. • A D-galaktóz mutarotációja fontos szerepet játszik a T. reesei celluláz génjeinek kifejeződésében és (vélhetően) a celluláz enzimek termelődésében is.

ÖSSZEFOGLALÁS • A laktóz lassan hasznosuló szénforrás (derepresszió!), de a T. reesei cellulázai esetében indukciós szerepe is van. • A laktóz hidrolízise során felszabaduló Dgalaktóz reduktív útvonala kulcsfontosságú: • a laktózt hasító béta-galaktozidázt kódoló bga1 gén induktorát ez az útvonal generálja; • a celluláz gének indukciójában is döntő szerepe van, mivel a mutarotáz enzim hiánya miatt a szénváz fluxusa a reduktív útvonalra terelődik (L-szorbóz?).

HIVATKOZÁSOK • Fekete és mtsai (2004): Archives of Microbiology 18: 35-44. • Ilyés és mtsai (2004): FEMS Microbiology Letters 235: 147-151. • Karaffa és mtsai (2006): Microbiology-SGM 152: 15071514. • Fekete és mtsai (2007): Microbiology-SGM 153: 507-512. • Fekete és mtsai (2008): Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. (PNAS) 105: 7141-7146.

KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS Fekete Erzsébet Christian P. Kubicek (TU Wien) Szentirmai Attila OTKA F042602, OTKA D048617 és TÉT 25/2005 támogatásával

Debreceni Egyetem

A TRICHODERMA REESEI GOMBA ÉS S GENETIKÁJA

Recommend Documents