A thalamus elsőrendű- és magasabbrendű magvainak és extrareticularis gátlórendszerének in vivo elektrofiziológiai elemzése Doktori értekezés
Slézia Andrea Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola
Témavezető:
Acsády László PhD, tudományos tanácsadó, az MTA Doktora
Hivatalos bírálók:
Négyessy László, tudományos főmunkatárs, PhD Karmos György, egyetemi tanár, MD, Ph.D
Szigorlati bizottság elnöke: Kiss József, tudományos tanácsadó, PhD, az MTA Doktora Szigorlati bizottság tagjai: Takács József, tudományos főmunkatárs, PhD, a biológiai, tudományok kandidátusa Détári László, egyetemi tanár, PhD, az MTA Doktora Hájos Norbert, tudományos főmunkatárs, PhD
Budapest 2008
MEGJEGYZÉSEK
A szakszavak és anatómia kifejezések használatakor az Orvosi Helyesírási Szótár 1992-es kiadását vettem alapul. Néhány angol nyelvű szakszó érthető és egyben magyaros fordítása azonban még így is nehézséget okozott, így ezek fordításakor a szakszavak magyar megfelelője után zárójelben mindig feltüntettem az angol szakkifejezést, és gyakran a könnyebb értehetőség kedvéért az angol verziót használtam a továbbiakban, elsősorban rövidsége és a gyakorlatban elterjedt használati módja miatt (pl. burst, Up state). A dolgozat egy társelsőszerzős és egy társszerzős, valamint egy még meg nem jelent tanulámány anyagát tartalmazza. Munkám során az in vivo elektrofiziológiai vizsgálatokat és az egyes idegsejttípusok morfológiai analízisét végeztem.
2
TARTALOMJEGYZÉK MEGJEGYZÉSEK .................................................................................................................................... 2 TARTALOMJEGYZÉK ........................................................................................................................... 3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................................... 6 BEVEZETÉS .............................................................................................................................................. 8 A KÖZTIAGY ........................................................................................................................................... 10 A DORZÁLIS THALAMUS ......................................................................................................................... 10 A DORZÁLIS THALAMUS MAGVAI ........................................................................................................... 11 A DORZÁLIS THALAMUS SEJTTÍPUSAI ..................................................................................................... 12 A thalamocorticalis relésejtek tulajdonságai .................................................................................... 12 A thalamocorticalis relésejtek morfológiai tulajdonságai............................................................................. 12 A thalamocorticalis relésejtek elektrofiziológiai tulajdonságai .................................................................... 14 Alacsony küszöbű Ca2+ áram vagy T típusú Ca2+ áram................................................................................ 16 Burst vs. tonikus tüzelés ............................................................................................................................... 18
AZ ELSŐRENDŰ ÉS A MAGASABBRENDŰ THALAMUS ............................................................................... 19 Az elsőrendű thalamicus magok........................................................................................................ 20 A magasabbrendű thalamicus magok ............................................................................................... 21 Elsőrendű thalamus vs. magasabbrendű thalamus ........................................................................... 22 A DORZÁLIS THALAMUS KAPCSOLATRENDSZERE ................................................................................... 25 A thalamus bemenetei – a thalamicus afferensek.............................................................................. 25 A thalamus kimenete – a thalamicus efferensek ................................................................................ 26 1-es és 2-es típusú vezikuláris glutaminsav transzporter – vGlut1 és vGlut2 ................................... 27 A RETICULARIS GÁTLÁS ......................................................................................................................... 28 Az nRT sejtek tulajdonságai .............................................................................................................. 29 Az nRT sejtek morfológiája ......................................................................................................................... 29 Az nRT sejtek elektrofiziológiai tulajdonságai ............................................................................................ 30 Az nRT sejtek és a TC sejtek elektrofiziológiai tulajdonságainak összehasonlítása .................................... 31
Az nRT felépítése ............................................................................................................................... 32 A THALAMOCORTICALIS OSZCILLÁCIÓK ................................................................................................. 33 A thalamocorticalis kör..................................................................................................................... 34 Lassú hullámú agykérgi aktivitás...................................................................................................... 35 Orsó (spindle) aktivitás ..................................................................................................................... 35 5-9 Hz-es oszcilláció ......................................................................................................................... 36 AZ EXTRARETICULARIS GÁTLÁS ............................................................................................................. 37 Zona incerta ...................................................................................................................................... 37 A ZI sejttípusai ............................................................................................................................................. 37 A ZI kapcsolatrendszere ............................................................................................................................... 38 A ZI szelektíven a magasabbrendű thalamusba küld gátló rostokat ............................................................. 39
3
A ZI-thalamicus terminális jellemzése ......................................................................................................... 41
Anterior pretektum ............................................................................................................................ 44 Az APT sejttípusai ....................................................................................................................................... 45 Az APT kapcsolatrendszere ......................................................................................................................... 45 Az APT szelektíven a magasabbrendű a thalamusba küld gátló rostokat ..................................................... 45 Az APT-thalamicus terminális jellemzése.................................................................................................... 47 Az APT-thalamicus terminális és az nRT-thalamicus terminális összehasonlítása ...................................... 48 Az APT-thalamicus pálya és az nRT-thalamicus pálya funkcionális összehasonlítása in vitro.................... 50
CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................................................... 53 MÓDSZEREK .......................................................................................................................................... 55 IN VIVO ELEKTROFIZIOLÓGIA ................................................................................................................. 55 Helyi, kérgi mezőpotenciálok regisztrálása ...................................................................................... 55 In vivo 24 csatornás elvezetés rétegelektróda segítségével............................................................... 56 In vivo juxtacelluláris egysejt-elvezetés és jelölés ............................................................................ 57 ADATANALÍZIS ....................................................................................................................................... 58 Burst-detekció és burst-analízis ........................................................................................................ 58 Fázisanalízis ..................................................................................................................................... 60 Autokorreláció, keresztkorreláció – MUA index, STA index ............................................................ 60 Az egysejtaktivitás és a kérgi LFP kapcsolata 5-9 Hz-es oszcillációk során .................................... 61 HISZTOLÓGIA ......................................................................................................................................... 62 Perfúzió ............................................................................................................................................. 62 A jelölt sejtek háromdimenziós rekonstrukciója ............................................................................... 62 EREDMÉNYEK ....................................................................................................................................... 63 AZ ELSŐRENDŰ- ÉS A MAGASABBRENDŰ THALAMICUS MAGOK ELEKTROFIZIOLÓGIAI TULAJDONSÁGAINAK JELLEMZÉSE .......................................................................................................... 63
A Po, VB és PoVPM sejtek tüzelési sajátságainak jellemzése .......................................................... 65 A Po, VB és PoVPM sejtek interspike intervallum hosszainak (ISI) válzotása a burstön belüli akciós potenciálok függvényében ................................................................................................................. 69 A Po, VB, és PoVPM sejtek fázisviszonyainak jellemzése a lassú hullámú kérgi aktivitás Up statejeihez képest ...................................................................................................................................... 71 A fázis tulajdonságok és az intraburst tüskeszám kapcsolata ........................................................... 75 A Po, VB, és PoVPM sejtek fázisviszonyainak jellemzése az agykérgi béta aktivitáshoz képest....... 78 A ZI SEJTEK ELEKTROFIZIOLÓGIAI TULAJDONSÁGAINAK JELLEMZÉSE ................................................... 81 A kísérletek során előforduló LFP állapotok jellemzése ................................................................... 81 A ZI sejtek tüzelési mintázata uretán altatásban – az egysejt-aktivitás és a kérgi lassú hullámú oszcillációk kapcsolata ..................................................................................................................... 81 A különböző szektorokban elvezetett ZI sejtek tüzelési mintázatának összehasonlítása ................... 84 ZI és TC sejtek tüzelési mintázatának összehasonlítása szinkronizált kérgi oszcillációk alatt ......... 85
4
ZI sejtek tüzelési aktivitása neuroleptanalgéziában – az egysejt-aktivitás és a kérgi 5-9 Hz-es oszcillációk kapcsolata ..................................................................................................................... 87 A ZI SEJTEK MORFOLÓGIAI TULAJDONSÁGAINAK JELLEMZÉSE............................................................... 91 AZ APT SEJTEK ELEKTROFIZIOLÓGIAI TULAJDONSÁGAINAK JELLEMZÉSE.............................................. 94 Az APT sejtek tüzelési mintázata és a tüzelés fáziskapcsoltsága a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz 94 AZ APT SEJTEK MORFOLÓGIAI SAJÁTSÁGAINAK JELLEMZÉSE ................................................................ 96 AZ APT-THALAMICUS PÁLYA KÉMIAI STIMULÁLÁSA IN VIVO .............................................................. 100 MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................................... 102 AZ ELSŐRENDŰ- ÉS A MAGASABBRENDŰ THALAMICUS MAGOK ELTÉRŐ TÜZELÉSI MINTÁZATA ÉS FÁZISKAPCSOLTSÁGA A LASSÚ HULLÁMÚ KÉRGI OSZCILLÁCIÓKHOZ .................................................... 103
A burst tüzelési mód, mint az információátvitel egyik formája ....................................................... 103 Az első és magasabbrendű thalamicus magok eltérő tüzelési sajátságai........................................ 104 Az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus magok eltérő fáziskapcsoltsága a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz ..................................................................................................................................... 106 AZ EXTRARETICULARIS GÁTLÓRENDSZER MAGJAINAK JELLEMZÉSE TÜZELÉSI MINTÁZAT ÉS KÉRGI LASSÚ OSZCILLÁCIÓKHOZ TÖRTÉNŐ FÁZISKAPCSOLTSÁG TEKINTETÉBEN ....................................................... 107
A ZI sejtjeinek elektrofiziológiai és morfológiai jellemzése ............................................................ 107 A ZI különböző sejttípusainak lehetséges funkciója ........................................................................ 109 Az APT sejtjeinek elektrofiziológiai és morfológai jellemzése ........................................................ 110 Az APT különböző sejttípusainak lehetséges funkciója ................................................................... 111 AZ EXTRARETICULARIS GÁTLÓRENDSZER KÉMIAI STIMULÁLÁSA ......................................................... 113 AZ EXTRARETICULARIS GÁTLÓRENDSZER ÉS A RETICULARIS GÁTLÓRENDSZER ................................... 114 KÖVETKEZTETÉSEK......................................................................................................................... 116 ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................................... 117 SUMMARY............................................................................................................................................. 118 IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................................................ 119 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA ...................................................................................................... 136 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁT ADÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ................................................................................. 136 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁTÓL FÜGGETLEN KÖZLEMÉNYEK .......................................................................... 136 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................................ 138
5
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
3D
három dimenzió
ABC
avidin-biotin peroxidáz komplex
AMPA
alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazolpropionát
APT
anterior pretectum/anterior pretectal nucleus
AV
antero-ventrális thalamicus mag
BDA
biotinilált dextrán amin
CL
centrolaterális thalamicus mag
CM
centromediális thalamicus mag
CT
corticothalamicus
CB
calbindin
DAB
1’3’-diamino-benzidin
DABNi
nikkel-intenzifikált 1’3’-diamino-benzidin
DC
egyenáram
EEG
elektroenkefalogram
EKG
elektrokardiogram
EPSP
serkentő posztszinaptikus potenciál
GABA
gamma-amino-vajsav
GABAA
gamma-amino-vajsav receptor A típusa
GABAB
gamma-amino-vajsav receptor B típusa
i. m.
intramuszkuláris
i.p.
intraperitoneális
IPSC
gátló posztszinaptikus áram
IPSP
gátló posztszinaptikus potenciál
ISI
két akciós potenciál közti időintervallum
LD
laterodorzális thalamicus mag
LFP
helyi mezőpotenciál
LP
laterális poszterior thalamicus mag
LTS
alacsony küszöbű Ca2+ hullám
MD
mediodorzális thalamicus mag
ml
medial lemniscus
6
MUA
soksejt-aktivitás
NMDA
N-metil-D-aszparaginsav
nRT
thalamicus reticularis mag
PA
punctum adhaerens/puncta adhaerentia
PB
foszfátpuffer
PC
paracentrális thalamicus mag
PF
parafascicularis thalamicus mag
Po
poszterior thalamicus mag (nucleus poszterior)
Pul
pulvinár
PV
parvalbumin
S1
primer szomatoszenzoros kéreg
SD
szórás
SE
standard hiba
TC
thalamocorticalis
STA
akciós potenciál által időzített helyi mezőpotenciál átlag
VA
ventrális anterior thalamicus mag
VB
ventrobazális thalamicus komplex
vGLUT1
vezikuláris glutamát transzporter 1-es típus
vGLUT2
vezikuláris glutamát transzporter 2-es típus
VL
ventrolaterális thalamicus mag
VM
ventromediális thalamicus mag
VP
ventroposzterior thalamicus mag
VPL
ventrális poszterolaterális thalamicus mag
VPM
ventrális poszteromediális thalamicus mag
UNIT
egysejt-aktivitás
cZI
zona incerta, kaudális rész
dZI
zona incerta, dorzális rész
rZI
zona incerta, rosztrális rész
vZI
zona incerta, ventrális rész
ZI
zona incerta
A további rövidítések csak az ábrafeliratokban fordulnak elő, melyek azokat tartalmazzák.
7
BEVEZETÉS
1975-ben a 21 éves Karen Ann Quinlan nagy mennyiségű alkohol és drog együttes fogyasztása következtében időleges szívmegállást szenvedett, ezért keringési- és légzőrendszere időlegesen leállt. Karen elvesztette eszméletét. Újraélesztése után keringése és légzése újraindult, Karen állapota stabilizálódott, vegetatív funkciói helyreálltak. Karen képes volt végtagjainak spontán mozgatására, sőt fájdalmas ingerek hatására reflexesen, a végtagok elhúzásával reagált. Hangingerekre a szem kinyitásával válaszolt, képes volt mimikai mozgásokra, ásítani és a fejét elfordítani. Ezek a mozgások azonban mindig véletlenszerűek voltak, Karen nem nyerte vissza eszméletét, a tudatos tevékenység semmi jelét nem mutatta. Ennek ellenére agykérgi EEG-je aktivitást mutatott, sőt az első hat hónap letelte után normális alvás-ébrenléti ciklus alakult ki nála. Karen állapotát egyértelműen nem nevezhetjük tehát agyhalálnak, kómának, mivel kómában nincs EEG aktivitás, és a beteg csak mesterséges lélegeztetéssel és rövid ideig tartható
életben.
Állapota
különbözött
az
olyan
súlyos
paralízisben
és
beszédképtelenségben szenvedő betegekétől, akik megtartják tudatukat (locked in state), hiszen Karen spontán mozdulatai semmiféle tudatos működésre nem utaltak. Karen állapota az úgy nevezett perzisztens vegetatív állapotnak feleltethető meg, amely a vegetatív funkciók megőrzése melletti tartós tudatvesztéssel jellemezhető. Karen kilenc évet töltött perzisztens vegetatív állapotban, miközben állapota változatlan maradt. Végül 1985-ban halt meg tüdőgyulladásban. Az eset jelentős vitákat váltott ki morális, etikai és emberi jogi kérdésekben az eutanázia terén. Részben ennek az esetnek a következtében jöttek létre az Egyesült Államok kórházaiban és egészségügyi szervezeteiben etikai bizottságok. Másfelől azonban Karen agyának posztmortem vizsgálata új utat nyitott a thalamus kutatásának történetében. A poszmortem hisztológiai vizsgálat mérsékelt atrófiát mutatott a parietális kéregben (Brodmann area 5, area 7), illetve a nyakszirti lebenyben (primer vizuális kéreg, area 17). Kismértékű idegsejt pusztulás volt megfigyelhető a kisagy és a törzsdúcok területén, az agytörzsi központok épek maradtak. Nagymértékű károsodás kizárólag Karen thalamusában volt megfigyelhető, amely bilaterálisan, szimmetrikusan súlyos atrófiát mutatott, melyre gliózis és magonként különböző
8
mértékű idegsejt-pusztulás volt jellemző; a mérsékelttől a teljes idegsejt vesztéssel jellemezhető
neurodegeneráció
kialakulásáig.
A
legsúlyosabb
sérülés
az
magasabbrendű thalamicus magvakban volt tapasztalható, melyek közül jelentősen károsodott az anterior, a mediodorzális, a ventrolaterális, a laterodorzális magcsoport, az intralamináris magok rosztrális magcsoportja és a pulvinár. Az elsőrendű szomatoszenzoros magok (ventrális poszterolaterális mag és ventrális poszteromediális mag) viszonylag épek maradtak. Az elsőrendű látó- és halló thalamicus magok mediális része mutatott károsodást (Havton és Ohara 1994, Kinney és mtsai 1994). Karen esetéből levonhatjuk azt a következtetést, hogy az agykéreg belső kapcsolatrendszerének nagymértékű megőrzöttsége mellett sem képes a tudat megtartására a thalamus épsége nélkül, még akkor sem, ha a thalamus elsőrendű – a környezeti hatásokat továbbító – magcsoportjai viszonylagos épségben maradnak, és képesek a külvilágból érkező információk továbbítására. Tehát a thalamus elsősorban dorzálisan és mediálisan elhelyezkedő, magasabbrendű magcsoportjainak épsége szükséges feltétele a tudat kialakulásának és fenntartásának. A 90-es években állatkísérletek során fény derült arra, hogy a thalamus két, működésében alapvetően eltérő magcsoportot tartalmaz (Sherman és Guillery 1996). Megkülönböztetünk elsőrendű magvakat, amelyek a thalamus klasszikus jelfeldolgozó, jeltovábbító
funkciójáért
felelősek
és
magasabbrendű
magvakat,
melyek
magasabbrendű folyamatokban, a figyelem, a percepció, memória kialakulásában játszhatnak fontos szerepet (Kimura és mtsai 1999). Arra is fény derült, hogy e két típusú magcsoport lényegesen különbözik egymástól összeköttetéseik tekintetében, amely megmagyarázza eltérő működésüket. Doktori munkám során e két típusú thalamicus magcsoport működésében lévő különbségeket vizsgáltam, elsősorban a magasabbrendű thalamicus magvakra érkező gátló bemenetek funkciójának vizsgálatát tűzve ki célul.
9
A köztiagy
Az emlős köztiagy (diencephalon) az epithalamusból, a dorzális thalamusból, a ventrális thalamusból és a hypothalamusból tevődik össze. A legújabb, fejlődéstani és genetikai alapon végzett kutatások szerint kaudális előagyi terület három prosomerát (p) képez: p1) pretectum, p2) thalamus és epithalamus (más néven habenula), valamint a p3) prethalamus és az eminentia thalami (Puelles és Rubenstein 2003). A régebbi felosztás és a fejlődéstani alapon elkülönített rendszer jelentősen átfed, a dorzális thalamus a p2-es régiónak feleltethető meg.
A dorzális thalamus
A dorzális thalamus az agy középvonalától bal és jobb oldalra elhelyezkedő, szimmetrikus struktúra. Mérete emberben és főemlősökben viszonylag kicsi, dió nagyságú, míg rágcsálókban és macskában relatíve nagy (1. ábra). 1. ábra: A dorzális thalamus mérete a különböző
emlős
fajokban Szaggitális nézet az ember,
majom,
macska és patkány agyféltekékről.
A
dorzális thalamust a csíkozott rész ábrázolja. (Sherman és Guillery 2006). A klasszikus felfogás szerint a thalamus a perifériáról érkező jelek legfontosabb jeltovábbító, illetve jelfeldolgozó állomása az agykéreg felé. A thalamus a külvilágból az érzékszerveinken át érkező információk közül a lényeges megtartásáért, míg a lényegtelenek kiszűréséért felelős. A szaglás kivételével minden szenzoros, valamint minden motoros információ áthalad rajta.
10
A dorzális thalamus magvai
A thalamus jól körülhatárolható sejtcsoportokra, ún. magokra osztható. A dorzális thalamicus
magvakat
elhelyezkedésük
alapján
magcsoportokra
osztjuk.
Megkülönböztetünk anterior és mediodorzális magokat, ventrális és laterális magcsoportokat, melyeket többek között a ventrolaterális, a ventromediális, ventrális anterior, laterodorzális, lateroposzterior és poszterior magok öveznek. Ezen kívül megkülönböztetjük a belső és az oldalsó térdestestek csoportját, valamint a középvonali és intralamináris magvakat (2. ábra). 2.
ábra:
A
dorzális
thalamus magjai A
sematikus
ábra
a
thalamus magcsoportjainak elhelyezkedését
mutatja
emberben (Wikipedia). A klasszikus felosztás szerint magvakat
a
thalamicus a
keresztül
rajtuk haladó
információ szerint csoportosítjuk. A principális relémagcsoportok mindegyikének bemenetét egy-egy szenzoros, motoros vagy asszociációs pálya képezi, felszálló vagy leszálló rostokat adva az agykéreg megfelelő funkciójú területei felé. Ennek megfelelően az adott magcsoportok egy bizonyos típusú jel továbbításáért felelősek. A principális szenzoros magok közül az oldalsó térdestest vagy oldalsó geniculatus mag (dLGN) a látópályából érkező információt szűri és továbbítja a látókéreg felé, míg a belső térdestest vagy belső geniculátus mag (MGN) a hallópályáról érkező információ relézéséért felelős a hallókéreg felé, a ventroposterior mag (VP) pedig a tapintásért felelős információt küldi a szomatoszenzoros kéregbe. Így funkciójuk szerint is megkülönböztethetünk vizuális, auditoros, szomatoszenzoros, stb. magvakat.
11
A dorzális thalamus sejttípusai
A thalamus legfőbb sejttípusa a thalamocorticalis sejt (TC), mely serkentő idegsejt, neurotranszmittere a glutaminsav. A thalamocorticalis sejtek, melyeket funkciójukra utalva relésejteknek is neveznek, axonjaikat az agykéregbe küldik. Az emlős dorzális thalamus tartalmaz még lokális interneuronokat, melyek axonvégződései GABA tartalmúak, így gátlóak, és az adott thalamicus magon belül szinaptizálnak. Az interneuronok
gyakran
dendro-dendritikus
szinapszisokat
képeznek.
Ezen
interneuronok macskában és főemlősökben jellemzőek, rágcsálókban viszont lényegében hiányoznak. Tengerimalacban csak a ventroposzterior mag (VPM) és a laterális magok, patkányban pedig kizárólag a dLGN tartalmaz lokális interneuronokat.
A thalamocorticalis relésejtek tulajdonságai A thalamocorticalis relésejtek morfológiai tulajdonságai
Ramon y Cajal Golgi technikával készített festésein kívül (3. ábra) a kutatók a legtöbb morfológiai adatot patkány, macska és majom thalamocorticalis sejtek vizsgálatával nyerték. A legtöbb tanulmány rágcsálók, macska és majom kísérletekben a ventrális magcsoportot és dLGN-t vizsgálja (Friedlander és mtsai 1981, Yen és mtsai 1985b, Harris 1986, Bloomfield és mtsai 1987, Condo és Wilson 1990, Ohara és Havton 1994b,1994a). 3.
ábra:
technikával
Néhány
Golgi elsőként
megfestett és kirajzolt sejt a thalamusból A belső térdestest ventrális részének sejtjei néhány napos macskákból A) sejt hosszú axonnal, B,C,D) sejtek rövid axonnal (Cajal 1995).
12
A
thalamocorticalis
relésejtek
sejttestei
változatos
alakkal
bírnak,
speciális
megkülönböztető- jegyüket más idegsejttípusoktól a szómától minden irányban, radiálisan szerteágazó dendritfájuk adja. Ez egy „bokorszerű” szimmetrikus dendritstruktúrát biztosít, amit Kölliker 1886-ban valóban „bokor sejteknek” (Bushzellen) nevezett (4. ábra)(Kölliker 1896). 4. ábra: Relésejtek dendritfájának morfológiája Rekonstruált thalamocorticalis relésejtek patkányból (A-C), macskából (D) és makákóból (E). A nyílak az axonokat mutatják. Mérőléc: 50 μm (Ohara és Havton 1994a). Az eltéréseket a sejt morfológiájában a dendritek hossza, komplexitása és a dendritfa aszimmetriája okozza. Az eltérő morfológiájú sejtek receptív mezejükben és kérgi kapcsolataikban különböznek (Hazlett és mtsai 1976, Pearson és mtsai 1984, Tseng és Royce 1986, Tombol és mtsai 1990). A Golgi festések nagy része a fentiekhez hasonló morfológiával jellemezhető relésejteket írt le az összes vizsgált területen: a ventrális anterior magban (VA) (Scheibel és Scheibel 1966a) macska MGN-ben
(Morest 1964, 1965), macska
ventroposzterior magban (VP) (Kiss és Tombol 1972), az anterior magvakban (Somogyi és mtsai 1973) és macska ventrolaterális magban (VL) (Tombol 1967, 1969, Grofova és Rinvik 1974). Kis eltérések adódtak a szómaméretben és a dendritfa aszimmetriájának mértékében. Más fajok esetében csak kevés Golgi festést végeztek, de ezek szintén radiálisan szerteágazó dendritfáról számoltak be (Pearson és Haines 1980, McAllister és Wells 1981, Harpring és mtsai 1985, Sawyer és mtsai 1989).
13
A thalamocorticalis sejtek axonjai viszonylag vastagok és mielinizáltak, macskákban általában 1-2,5 μm átmérőjűek (Ferster és LeVay 1978, Stanford és mtsai 1983, Yen és mtsai 1985a). Axonkollaterálisok jelenlétéről csak vadászgörény dLGNben számolnak be (Bal és mtsai 1995b), egyéb magvakban macskánál és patkánynál a lokális axonkollaterálisok hiányáról beszélhetünk (Szentagothai és mtsai 1966), a relésejtek tehát egymással közvetlen kapcsolatban nem állnak.
A thalamocorticalis relésejtek elektrofiziológiai tulajdonságai
A thalamocorticalis relésejtek kétféle módban képesek tüzelni; tonikus, illetve kisülés sorozat módban (burst módban), amit mind in vitro, mind in vivo kísérletekben számos fajon bizonyítottak (Andersen és mtsai 1964, Llinas és Jahnsen 1982, Hirsch és mtsai 1983, Deschenes és mtsai 1984, Jahnsen és Llinas 1984a,1984b, Steriade és mtsai 1985, Crunelli és mtsai 1987b, Crunelli és mtsai 1987a, Leresche és mtsai 1991, Ramcharan és mtsai 2000b). In vivo intracelluláris elvezetésekkel kimutatták, hogy ha a beérkező gátló posztszinaptikus potenciálok a relésejteket elegendő ideig és elegendő mértékben hiperpolarizálva tartják, akkor a serkentő bemenetek hatására azok kisüléssorozatokkal válaszolnak (Andersen és mtsai 1964, Bando és mtsai 1980, Roy és mtsai 1984, Domich és mtsai 1986). Bebizonyították, hogy a relésejtek burst tulajdonságuk mellett tonikus tüzeléssel is jellemezhetőek (Jahnsen és Llinas 1984a). A nyugalmi membránpotenciál, kb. -70 mV közelében a relésejtek az injektált áram nagyságától függő frekvenciával tonikus tüzelést mutattak, míg hiperpolarizált membránpotenciál esetén a thalamocorticalis relésejtek közvetlen a negatív áram injektálását követően átléptek burst módba (5. ábra). A thalamocorticalis relésejtek számos ioncsatornát fejeznek ki a sejttestükön, illetve denritfájukon. A thalamocorticalis relésejtek fontosabb ionáramai a következők: 1) Na+ áram (akciós potenciál genezis); 2) feszültség-, illetve Ca2+-függő K+ áramok (repolarizáció); 3) alacsony küszöbű Ca2+ áram vagyT áram (IT) (Ca2+-hullám genezis) és 4) hiperpolarizációra aktiválódó nem szelektív kation áram vagy h áram (Ih) és (Huguenard és mtsai 1991, Huguenard és Prince 1991, Huguenard és McCormick 1992, McCormick és Huguenard 1992, Pape 1994, Sherman és Guillery 2006). A burst
14
módért alapvetően négy ionárom összehangolt működése felelős. A depolarizáló hullámokat a T típusú Ca2+ áramok okozzák, a kisüléssoroztatot a Na+ csatornák, a hiperpolarizációt a K+ áramok, a Ih áram pedig azt a folyamatos depolarizációt okozza, amely hiperpolarizált membránpotenciálnál depolarizációt idéz elő, addig a szintig, míg a sejt el nem éri az aktivációhoz szükséges membránpotenciált. (Coulter és mtsai 1989, Crunelli és mtsai 1989). A tonikus módban, egyéb neuronokhoz hasonlóan, a feszültségfüggő Na+ illetve K+ áramok felelősek az egyszeres akciós potenciálokért (Jahnsen és Llinas 1984a). A burst mód alvás, illetve altatás alatt, míg a tonikus tüzelés ébrenlétben figyelhető meg. Az acetilkolin, noradrenalin, illetve hisztamin neuromodulátorok alacsony, illetve magas szintje határozza meg, hogy a sejt a két mód melyikében tüzel. A neuromodulátorok a K+ áramokat gátolva depolarizálják a sejtet, tonikus tüzelést idézve elő. 5. ábra: A thalamocorticalis relésejtek kétféle módban képesek tüzelni: burst, illetve tonikus módban Felső ábra: In vivo extracelluláris elvezetés. A thalamocorticalis sejtek a burstök mellett (piros) időnként tonikus módban is képesek tüzelni (Sherman, 2001). A) in vitro (tengerimalac, dorzális thalamus) intracelluláris elvezetés A1) alsó regisztrátum (trace) a küszöbalatti áramimpulzus adása alatt egy küszöb alatti depolarizáció létrejöttét mutatja, a felső regisztátum esetében ugyanekkora
stimulus
deplarizációval alkalmazva
DC
együttesen egyszeres
akciós
potenciálok sorozatát, tonikus tüzelést vált
ki.
A2)
Hiperpolarizációt
követően ugyanez a stimulus alacsony küszöbű Ca2+ hullámot (low-treshold Ca2+ spike, LTS) és az azon ülő kisüléssorozatot (burst) váltja ki. A3) Visszacsapó kisüléssorozat (rebound burst)(lásd szintén
15
később)
előfordulhat
hiperpolarizáló áramimpulzusok hatására. B in vivo (macska, ventrolaterális mag, ketamin/xílazin altatás) intracelluláris elvezetés. A felső három regisztrátum a capsula interna három különböző erősségű stimulussal történő ingerlésére adott válasz. Alul a sejt
válasza
depolarizáló-
és
hiperpolarizáló
áramimpulzusokra:
-65
mV
membránpotenciál értéken tonikus, -70 mV-nál passzív, küszöb alatti válasz, -80 mVnál burst, és rebound burst -63 mV-nál a hiperpolarizációt követően. (Llinas és Steriade 2006).
Alacsony küszöbű Ca2+ áram vagy T típusú Ca2+ áram Az IT típusú Ca2+ áramok kivételes jelentőséggel bírnak a burst-genezis szempontjából. A T típusú Ca2+ áram egy befelé irányuló tranziens áram, ami a sejt depolarizációjához vezet (Crunelli és mtsai 1989). Perez-Reyes és kollégai a feszültségfüggő T-csatorna család génszerkezete alapján háromféle T-csatornát határoztak meg (Perez-Reyes 2003) (CaV3.1, CaV3.2 és CaV3.3). A csatornák közül a CaV3.1-t csaknem az összes relésejt kifejezi (Talley és mtsai 1999). A CaV3.1-es génkiütött állatok nem voltak képesek visszacsapó burstök létrehozására, ami egyértelműen bizonyítja e csatorna szerepét a burst-genezisben. A thalamocorticalis relésejtek kivételesen nagy sűrűségben fejeznek ki T típusú Ca2+ csatornákat a sejttestükön és a dendritfájukon (Destexhe és mtsai 1998). Aktivációjuk minden vagy semmi alapon egy Ca2+ hullámot indít, amely végigvonul a szómán és a dendriteken. Ez a sajátosság minden eddig vizsgált állatfajban és a humán thalamocorticalis sejteken is kimutatható volt (Deschenes és mtsai 1984, Jahnsen és Llinas 1984a, Alexander és mtsai 2006, Llinas és Steriade 2006). Az 6. ábra a T típusú Ca2+ csatorna idő- és feszültségfüggését mutatja (Jahnsen és Llinas 1984a, Sherman 2001, Sherman és Guillery 2006). A csatorna feszültségtől függően lehet aktivált, illetve inaktivált állapotban, mindemellett van két feszültség kapuja (voltage gate). Nyugalmi membránpotenciál esetén (kb. -70 mV) az inaktivációs kapu nyitva, az aktivációs kapu zárva van, ezért a csatorna deaktivált és deinaktivált állapotban van (1). Ha a sejt depolarizálódik az aktivációs kapu küszöbéig (kb -65 mV), az aktivációs kapu kinyílik, a Ca2+ ionok beáramlása megindul, ami a Ca2+ hullám kialakulásához vezet. Ebben az állapotban a csatorna aktivált és deinaktivált állapotban
16
van. (2). Nagyjából 100 ms múlva a T-csatorna inaktiválódik, és a kifelé irányuló K+ áram repolarizálja a sejtet (3). Ebben az állapotban a csatorna aktivált és inaktivált. Újabb 100 ms-ig a csatorna inaktivált állapotba kerül (4) (inaktivált és deaktivált állapot), majd e hiperpolarizáció révén visszatér a kiindulási állapotba. A T-csatorna két kapujának feszültségfüggése ellentétes, de míg az aktivációs kapu gyorsan reagál a feszültségváltozásokra, addig az inaktivációs kapu lassabb; kb. 100 ms-ot igényel a csatorna újbóli kinyitása. Valójában az inaktiváció és a deinaktiváció az idő és a feszültség együttes függvénye, így minél nagyobb a depolarizáció mértéke, a csatorna annál gyorsabban inaktiválódik, illetve minél hiperpolarizáltabb a sejt annál gyorsabban deinaktiválódik a T-csatorna (6. ábra). (Llinas és Steriade 2006).
6. ábra: Az alacsonyküszöbű Ca2+ csatorna működési mechanizmusa sematikus ábrázolásban Az események az óra járásával megegyező irányban (1-4), középső ábrán a membránpotenciál változása látható. 1) Viszonylag hiperpolarizált membránpotenciál esetén (kb -70 mV) a T csatorna aktivációs kapuja zárva, az inaktivációs kapuja nyitva van, ezért a csatorna deaktivált és deinaktivált állapotban van. A K+ csatorna szintén deaktivált. 2) A küszöb eléréséhez elegendő depolarizáció hatására a T-csatorna aktivációs kapuja kinyílik, ami Ca2+ beáramlást eredményez a sejtbe. Ez depolarizálja
17
a sejtet, és előidézi az alacsony küszöbű Ca2+ hullám kialakulását (LTS). 3). A Tcsatorna inaktivációs kapuja kb. 100 ms múlva bezáródik inaktiválva a T-csatornát. A K+ csatorna kinyílik. A két esemény együttes hatására a sejt repolarizálódik. 4) Habár a sejt elérte a kezdeti membrán potenciál értéket, a T-csatorna inaktív marad, mivel kb 100 ms-ot vesz igénybe, hogy a hiperpolarizáció deinaktiválja a csatornát, valamint a K+ csatona záródása is időigényes folyamat (Sherman és Guillery 2006).
Burst vs. tonikus tüzelés
A
thalamicus
burstök
igen
nagy
jelentőséggel
bírnak
a
szenzoros
információátvitelben. Korai in vivo kíséreltek feltárták a thalamicus burstök egyedi voltát, majd későbbi in vitro kísérletekben bizonyították, hogy a relésejtek bursttulajdonsága egy speciális ionkonduktancia, az előbbiekben jellemzett alacsonyküszöbű vagy T-típusú Ca2+ csatornák működésének tulajdonítható. A mechanizmust az teszi érdekessé, hogy a csatorna inaktivált állapotban van depolarizációkor, és csak akkor deinaktiválódik, ha egy elég hosszú ideig tartó, elég negatív hiperpolarizáció előzi meg a stimulust. Ha a thalamicus sejtek membránpotenciálja elég közel van az akciós potenciál küszöbéhez, akkor az IT-csatorna inaktív marad, és a relésejt a perifériáról érkező információt egyszeres akciós potenciálok sorozatává, tonikus tüzeléssé alakítja. Ha ugyanez a thalamicus sejt a küszöbtől negatívabb membránpotenciál értéken van, akkor a szenzoros bemenet nem tud választ kiváltani, így az információ nem továbbítódik az agykéreg felé. Ha azonban a relésejt elég ideig van hiperpolarizált membránpotenciálon ahhoz, hogy a Ca2+ csatornák aktívvá váljanak, akkor a szenzoros információ óriási Ca2+ beáramlást okoz, ami akciós potenciálok kisüléssorozatát, burstjét fogja kiváltani (Denning és Reinagel 2005, Reinagel 2007). Ilyen módon az érzékszerveinken keresztül érkező információ hűen továbbítódhat, gátlódhat, de akár fel is erősödhet attól függően, hogy a relésejt az őt érő ingert megelőzően milyen membránpotenciál értéken tartózkodott. A thalamus tehát a tonikus és burst tüzelési mód segítségével a T-csatornák speciális működése révén integrálni és gátolni is képes a szezoros transzmissziót (Guido és Weyand 1995, Ramcharan és mtsai 2000a, Fanselow és mtsai 2001, Castro-Alamancos 2004, Lesica és Stanley 2004, Bezdudnaya és mtsai 2006, Wang és mtsai 2007).
18
Az elsőrendű és a magasabbrendű thalamus
A 90-es években felfedeztek olyan thalamicus agyterületeket, melyeknek funkciója a klasszikus jelszűrő, jeltovábbító felfogástól eltérő lehet (Sherman és Guillery 1996). Megkülönböztettek egyrészt olyan, a klasszikus felfogásnak megfelelő thalamicus magvakat, melyeknek szerepe az információ továbbításában és feldolgozásában van. E folyamat revén az agykéregbe egy új, egyszeresen megszűrt információ kerül. Másrészről megkülönböztettek olyan területeket, melyek szerepe a már egyszer feldolgozott információk további feldolgozása lehet, oly módon, hogy ezen thalamicus területek kapcsolatot tartanak fenn egyes kérgi terültek között, így az agykéregből egyes információk akár többször is visszakerülhetnek a thalamusba, majd ismét a kéregbe, elősegítve ezzel az információ feldolgozást és a jeltovábbítást. Tehát ezen thalamicus területek közreműködésével az agykéregbe egy már többszörösen feldolgozott információ juthat (Sherman és Guillery 1996, Theyel és mtsai 2008). Az előbb említett, a thalamus klasszikus funkciójáért felelős magokat elsőrendű thalamicus magvaknak, míg az utóbb említetteket magasabbrendű thalamicus magvaknak nevezték el (7. ábra, 8. ábra). 7.
ábra:
A
patkány
elsőrendű (sárga) illetve magasabbrendű
(zöld)
thalamicus magvai. Patkány
agy
koronális
metszeti képe (Paxinos és Watson 1998). Zölddel a magasabbrendű, sárgával thalamicus
az
míg
elsőrendű magvakat
ábrazoltam. LPMR: lateroposzterior mag mediorosztrális rész; CL: centrolaterális mag; LPLR: lateroposzterior mag laterorosztrális rész; IGL: intergeniculatus mag,
19
IMA: intramedulláris thalamius area; DLG: oldalsó térdestest; Po: poszterior mag; VPM: ventroposzterior mag;VPL: ventrolaterális mag; VPPC: ventroposzteriro mag parvicelluláris része; Rt: thalamicus reticularis mag; PF: parafascicularis mag stb., (Paxinos és Watson 1998). 8.
ábra:
Majom
elsőrendű
és
magasabbrendű thalamicus magvai Sematikus ábra a majom thalamus elsőrendű (barna) és magasabbrendű (kék)
thalamicus
különböző
magvairol
koronális
metszési
síkokon. nRT (lila). TRN: thalamicus reticularis nucleus; CN: nucleus caudatus; AD: anterior dorzális mag; AV: anterior ventrális mag; AM: anterior mediális mag; VA: ventrális
anterior
intralamináris
mag;
(és
IL:
középvonali)
mag(vak); MD: mediodorzális mag; VL:
ventrolaterális
mag;
VPL:
ventrális poszteriolaterális mag; VPM: ventrális poszteriomediális mag; VPI: inferior poszteriomediális mag; LD: laterodorzális mag, CM: centromediális mag; LGN: oldalsó térdestest; MGNd: belső térdestest dorzális része; MGNv: belső térdestest ventrális része; LP: lateroposzterior mag; PU: pulvinár; PO: poszterior mag; H: habenula (Sherman és Guillery 2006).
Az elsőrendű thalamicus magok
Az elsőrendű thalamicus magok a thalamus jeltovábbító, jelszűrő és jelfeldolgozó funkciójáért felelősek. Ennek megfelelően megkülönböztethetünk a különböző modalitásoknak megfelelő elsőrendű thalamicus magvakat; úgy mint
elsőrendű
szomatoszenzoros mag (VPM), elsőrendű látó mag (dLGN), elsőrendű halló mag (MGN) stb. Ez esetekben a thalamusba az érzékszerveinken keresztül érkező, vagyis a
20
perifériáról jövő információ kerül, szűrődik meg és továbbítódik az adott modalitásért felelős agykérgi részbe. Az adott környezeti információ az adott thalamicus mag fő bemenetét képezi, ez határozza meg elsősorban magon belüli sejtek működését, ezért az ilyen bementeket ún. irányító-, vezérlő bemeneteknek, angol szóval „driver” bemeneteknek nevezzük. Ezen kívül minden thalamicus maghoz érkeznek még ún. „modulátoros” bemenetek, amelyek a meghatározó, driver bementek mellett kis mértékben befolyásolni képesek a jelfeldolgozás menetét (Sherman és Guillery 1996, Reichova és Sherman 2004). Az elsőrendű thalamicus magok fő, driver bemenetüket az érzékszervekből, a perifériáról kapják, míg modulátoros bemenet érkezik rájuk az agykéreg VI. rétegéből. A kapcsolatrendszert a szomatoszenzoros rendszer példáján a 9. ábra szemlélteti. 9. ábra: Az elsőrendű thalamicus magok serkentő összeköttetései a szomatoszenzoros rendszer példáján A
thalamocorticalis
relésejt
fő,
driver
(fekete)
bemenetét a perifériáról kapja, majd megszűrt, részlegesen feldolgozott információt továbbítja az agykéreg felé.
Ugyanakkor az agykéreg VI. rétege
modulátoros (szürke) bement küld az elsőrendű szomatoszenzoros magra. VPM: ventroposterior mag (saját ábra).
A magasabbrendű thalamicus magok
A magasabbrendű thalamicus magok kapcsolatrendszerében a fő különbséget az elsőrendű thalamicus magvakhoz képest az adja, hogy ezen magok driver bemenetüket az agykéreg V. rétegéből kapják, valamint modulátoros bemenet érkezik hozzájuk az agykéreg VI. rétegéből. A perifériáról érkező bemenetet léte és milyensége kérdéses. A magasabbrendű thalamicus magok serkentő összeköttetéseit a 10. ábra szemlélteti a szomatoszenzoros rendszer példáján.
21
10. ábra: A magasabbrendű thalamicus magok serkentő összeköttetése A magasabbrendű magvakban a relésejtek a fő,
driverbemeneteiket
rétegéből
kapják,
az
agykéreg
modulátoros
V.
bemenet
érkezik hozzájuk az agykéreg VI. rétegéből. Po: poszterior thalamicus mag (saját ábra).
Elsőrendű thalamus vs. magasabbrendű thalamus
A driver bemenet alapján tehát megkülönböztethetünk elsőrendű és magasabbrendű thalamicus magokat az emlősök thalamusában. Az elsőrendű magok a perifériáról kapott meghatározó, driver információk megszűréséért felelősek; a retinából érkező információt az dLGN szűri és továbbítja, a VPM felelős a mediális lemniszkuszon érkező szomatoszenzoros információk szűréséért és továbbításáért, míg az MGN ventrális része szűri és továbbítja a colliculus inferior által szállított auditoros jeleket. A magasabbrendű magok driver bemenetét az agykéreg V. rétege képezi. A pulvinar a látórendszer, a poszterior mag a szomatoszenzoros, az MGN magnocelluláris része pedig a hallórendszer magasabbrendű magjai (Sherman és Guillery 1996, Sherman és Guillery 2006). Számos anatómiai, fiziológiai és farmakológiai kísérlet igazolja, hogy a magasabbrendű thalamicus magvakra érkező V. rétegi bemenetek szinaptikus tulajdonságai hasonló, driver tulajdonságokat mutatnak (Hoogland és mtsai 1991, Deschenes és mtsai 1994, Ojima 1994, Bourassa és Deschenes 1995, Bourassa és mtsai 1995, Bartlett és mtsai 2000, Rouiller és Welker 2000, Li és mtsai 2003, Rockland 1996, Guillery és mtsai 2001, Reichova és Sherman 2004). Az elsőrendű és a magasabbrendű thalamicus magok esetén a relésejtek morfológiájában szignifikáns különbséget eddig nem mutattak ki, ezzel szemben néhány elektrofiziológiai adat arra utal, hogy az elsőrendű thalamus és a
22
magasabbrendű thalamus relésejtei tüzelési tulajdonságaikban különbözhetnek. Éber makákókon végzett egysejtelvezetéses kísérleteikben Ramcharan és munkatársai kimutatták, hogy a magasabbrendű thalamicus magok relésejtei (Pul, MD) nagyobb százalékban tüzelnek burst üzemmódban, mint az elsőrendű thalamicus magok relésejtei (LD, VP, MGNv). A burstök számának megnövekedése mellett a magasabbrendű thalamicus magok spontán tüzelési aktivitása jelentősen kisebb volt az elsőrendű magokénál (Ramcharan és mtsai 2005)(11. ábra).
11. ábra: A magasabbrendű thalamicus magok többet burstölnek, mint az elsőrendű magok Az ábra bal oldalán éber makákó LGN-jéből elvezetett sejt autokorrelogramja (alul) és két-dimenziós ISI diagramja (felül) látható. A szaggatott vonallal határolt négyzetben a burstök első akciós potenciáljai találhatóak. A jobb oldali ábra egy pulvinárból elvezetett sejt adatait ábrázolja. Mind az autokorrelogramok mind az ISI-diagrammok jól mutatják, hogy a magasabbrendű, pulvinár mag sejtje relatíve többet burstöl, mint az elsőrendű LGN sejt. ISI: két akciós potenciál közötti intervallum (interspike interval) (Ramcharan és mtsai 2005). Patkány thalamocorticalis szeleten végzett elektrofiziológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az elsőrendű szomatoszenzoros mag, VPM sejtjei szignifikánsan magasabb frekvenciával
jellemezhető
burstökkel
23
tüzeltek,
mint
a
magasabbrendű
szomatoszenzoros Po sejtjei (Landisman és Connors 2007) (12. ábra). Nem ismert azonban, hogy ugyanezek a tulajdonságok in vivo kísérletekben is kimutathatóak-e. 12. ábra: A VPM sejtek magasabb frekvenciás burstökkel tüzelnek, mint a Po sejtek VPM és Po sejt válasza depolarizáló és hiperpolarizáló áramimpulzusokra (-100 pA, +100 pA, +300 pA) intracelluláris elvezetés során. Jól látszik, hogy a VPM sejt magasabb frekvenciával
és
több
akciós
potenciált
tartalmazó burstökkel válaszol ugyakkora mértékű stimuláció esetén (Landisman és Connors 2007). In
vitro
bebizonyították,
intracelluláris hogy
a
mérésekben
magasabbrendű
vizuális magban, a lateroposzterior thalamicus magban
(LP)
lévő
relésejtek
sok
tulajdonságukban megegyeztek az elsőrendű thalamicus relésejtek tulajdonságaival, rendelkeztek alacsony küszöbű Ca2+ csatornával (IT), nem szelektív kation árammal (Ih) és tranziens K+ árammal (IA). Az egyes LP neuronok tüzelési mintázata azonban különbözött egymástól: az LP sejtek egy csoportja növekvő membrán depolarizációra a tüzelési frekvencia növelésével válaszolt, míg a másik csoport növekvő áraminjekció hatására magasfrekvenciás burstöket kezdett generálni (Li és mtsai 2003). Egyes kísérletek arra utalnak, hogy az elsőrendű és a magasabbrendű thalamus magvakat
érő
modulátoros
bemenetek
is
különbözőek
lehetnek.
Sherman
munkacsoportja kimutatta, hogy muszkarinos acetil kolin agonista és a szerotonin agonista alkalmazása más-más hatással van az elsőrendű és a magasabbrendű magokra. Mind a muszkarinos, mind a szerotonerg agonista depolarizálta a kísérletben vizsgált elsőrendű thalamicus relésejteket az LGN, a VP, a vMGN területéről, míg a legtöbb magasabbrendű thalamicus relésejtet (LP, Po) szintén depolarizálta, mégis a magasabbrendű thalamicus relésejtek szignifikáns hányada (muszkarinerg agonistára
24
20%, szerotonerg agonistára 15%) mutatott eltérő, hiperpolarizáló választ az agonista hatására (Varela és Sherman 2007, 2008).
A dorzális thalamus kapcsolatrendszere
A thalamus bemenetei – a thalamicus afferensek
A thalamus fő bemenetét klasszikus értelemben a perifériáról érkező ionotróp glutamáterg jelet közvetítő rostoktól kapja (Reichova és Sherman 2004). Az érzékszervekből érkező információ az adott érzékelésért felelős magvakat idegzi be. A retinából érkező információ a látóidegen, majd a colliculus superioron keresztül a dLGN-be, a hallópálya a colliculus inferioron keresztül az MGN-be érkezik. A primer afferensek terminálisai nagyok (3-10 μm), és a bemenet többszörös szinapszist létesítve a relésejtek proximális dendritjeire érkezik. A thalamus a legtöbb afferenst az agykéreg VI. rétegétől kapja (Jones 1985). A vetítés topografikus, a bemenet abból a kéregrészből érkezik, ahova az adott thalamicus terület vetít (Jones 1985). Ez a pálya is glutamáterg, az ionotróp áramok mellett azonban metabotróp komponenst is tartalmaz. A VI. rétegi afferensek a relésejtek disztális dendritjein egyszeres szinapszissal végződnek, az axonok vékonyabbak, a terminálisok pedig kisebbek (1-2 μm) a perifériáról érkező afferensek axonjainál. Az VI. rétegből érkező axonok kollaterálisokat adnak a thalamicus reticularis magba (lásd később). VI. rétegi bemenetet a thalamus összes magja kap, azonban létezik egy olyan afferens pálya, amely szelektíven a magasabbrendű thalamicus relésejteket idegzi be. Ez a pálya az agykéreg V. rétegéből érkezik, kizárólag ionotróp glutamáterg hatást közvetít, és a magasabbrendű thalamicus relésejtek proximális dendritjén nagy terminálisokkal képez többszörös szinapszist (Hoogland és mtsai 1991, Bourassa és mtsai 1995, Rouiller és Welker 2000, Veinante és mtsai 2000b, Killackey és Sherman 2003). Az V. rétegből érkező afferensek morfológiája, neurokémiai és elektrofiziológiai tulajdonságai a primer afferensekéhez hasonlóak (Reichova és Sherman 2004, Groh és
25
mtsai 2008). Az V. rétegből érkező axonok nem adnak axonkollaterálist a thalamicus reticularis magnak. A agykéreg VI. és V. rétegéből érkező bemenetek funkciójukat tekintve is különböznek: az V. rétegi bemenetek driver tipusúak, nagyfrekvenciás stimulálásra multipulzus depresszióval (paired-pulse depression) reagálnak (Groh és mtsai 2008), míg a VI. rétegből érkező terminálisok modulátorok, nagy frekvenciás ingerekre multipulzus facilitációval (paired-pulse facilitation) válaszolnak. A thalamusba neuromodulátoros afferensek is érkeznek a kéregalatti területekről: a kolinerg pálya az agytörzsből, a noradrenerg pálya a locus coeruleus-ból, a szerotonerg pálya a dorzális raphe-ből a hisztaminerg pálya pedig a hypothalamusból érkezik. Újabban a modulátoros beidegzés tekintetében is különbségeket mutattak ki az elsőrendű és a magasabbrendű thalamicus magok esetén (Varela és Sherman 2007, 2008). Gátló bemenetek tekintetében elmondható, hogy a kizárólag GABAerg sejteket tartalmazó thalamicus reticularis mag (nRT) minden thalamicus magot beidegez. A terminálisok a relésejt dendritfájának mind proximális, mind disztális részére érkeznek, átlagosan 1-2 szinapszissal alkotva kapcsolatot a posztszinaptikus célterülettel. Az nRT sejtek topografikusan a thalamus megfelelő területeire vetítenek vissza (lásd Reticularis gátlás). Ezen pályáknak fontos szerepe van a thalamocorticalis körök, így a kérgi oszillációk kialakulásában is (lásd Thalamocorticalis oszcillációk). A magasabbrendű thalamicus magvakról gátló bemenetek szempontjából is elmondható, hogy különböznek az elsőrendű magoktól. Az nRT-ből érkező gátlás mellett egy rájuk szelektív, extrareticularis eredetű gátlás érkezik az APT és a ZI területéről. A pálya a relésejtek
proximális
dendritjein
többszörös
szinapszist
létesítve
érkezik
a
posztszinaptikus relésejtre (lásd Extrareticularis gátlás).
A thalamus kimenete – a thalamicus efferensek
A thalamus fő kimenete az agykéreg. A thalamicus relésejtek elsősorban az agykéreg IV. és VI. rétegébe, de számos relésejt más rétegekbe diffúzan projiciál. Ezen alapul az ún. „mag-mátrix” (core-matrix) elmélet (Jones 1998, 2001), mely szerint a parvalbumin (PV) tartalmú thalamicus neuronok a kéreg VI. és IV. rétegébe
26
fókuszáltan vetítenek, míg a thalamicus mátrix calbindin (CB) tartalmú sejtjei elszórtan a supragranularis rétegbe küldik a projekciójukat.
1-es és 2-es típusú vezikuláris glutaminsav transzporter – vGlut1 és vGlut2
A glutaminsav a thalamocorticalis rendszer serkentő neurotranszmittere, ürülése a felszálló pályák minden állomásán, a gerincvelőben és a thalamusban is megfigyelhető (Kaneko és Mizuno 1988, Broman 1994). A leszálló corticothalamicus rostok szintén glutamátergek. A glutaminsav vezikulákba történő felvétele a szinaptikus vezikulákban lévő transzport fehérjék, vezikuláris glutaminsav transzporterek segítségével történik (Broman 1994). Nemrégiben a vezikuláris glutaminsav transzporterek több típusát is elkülönítették (Fremeau és mtsai 2001). A vezikuláris glutaminsav transzporter 1-es és 2-es típusa nagy sűrűségben fordul elő az idegrendszerben, azonban eloszlása régióspecificitást mutat és sosem kolokalizál ugyanabban az axonterminálisban (Fremeau és mtsai 2001, Fujiyama és mtsai 2001, Herzog és mtsai 2001, Kaneko és mtsai 2002, Varoqui és mtsai 2002, Landry és mtsai 2004, Zhou és mtsai 2007). Elmondható, hogy a morfológiailag jól elkülönülő, kérgi óriásterminálisok (> 2 μm), melyek a thalamocorticalis rendszerben driver funkciót látnak el, és magasfrekvenciás stimulációra multipulzus depresszióval reagálnak, vGlut 2, míg a kis terminálisok, melyek modulátor funkcióval bírnak és nagyfrekvenciás stimulációra multipulzus facilitációval reagálnak, vGlut1 tartalmúak. Eszerint a vGlut1 tartalmú terminálisok alacsony vezikula ürülési felszabadulási valószínűséggel (release probability) rendelkeznek és hosszú távú potenciálódásra (long term potentiation, LTP) képesek (Castro-Alamancos és Calcagnotto 1999, von Krosigk és mtsai 1999), míg a vGlut2 tartalmúakra a nagy felszabadulási valószinűség és a hosszú távú depresszióra (long term depression, LTD) való képesség jellemző (Lindstrom és Wrobel 1990, Golshani és mtsai 2001, Castro-Alamancos 2002, Varoqui és mtsai 2002, Fremeau és mtsai 2004b, Fremeau és mtsai 2004a, Groh és mtsai 2008).
27
A reticularis gátlás
A thalamusban a klasszikus felfogás szerint a gátlásért a lokális interneuronok és a dorzális thalamust körülölelő magban, a thalamicus reticularis magban (nRT) elhelyezkedő gátló idegsejtek felelősek. Mivel patkány esetén a lokális interneuronok kis számban és kizárólag az elsőrendű vizuális thalamicus magban, a dLGN-ben találhatóak, és dolgozatomban a patkány szomatoszenzoros rendszerével foglalkozom, így az interneuronról a továbbiakban nem teszek említést. A thalamicus reticularis mag a ventrális thalamus eredetű (Jones 1985) kizárólag gátló, GABAerg neuronokat tartalmazó (Houser és mtsai 1980) struktúra. A magot alkotó idegsejtek egy keskeny vonulatként ölelik körül a dorzális thalamus anterior, laterális és ventrális felszínét. Anatómiai pozíciója következtében az nRT-n mind a felszálló thalamocorticalis, mind pedig a leszálló corticothalamicus rostok is áthaladnak, illetve serkentő axonkollaterálisokat adnak (13. ábra). Ennek következtében a mag struktúráját axonok hálózata határozza meg, ezért is kapta a hálózatos (reticularis) elnevezését. 13. ábra: A thalamicus reticularis mag (nRT) összeköttetései Az nRT mind a VI. rétegből érkező leszálló, mind pedig a thalamusból érkező felszálló rostoktól kap kollaterálisokat, így fontos szerepe van thalamocorticalis kör és a thalamocorticalis kialakulásában oszcillációk
oszcillációk (lásd
fejezet).
Thalamocorticalis nRT:
reticularis mag (Pinault 2004).
28
thalamicus
Az nRT sejtek tulajdonságai
Az nRT sejtek morfológiája
Az nRT sejtek viszonylag nagy, általában ovális alakú és viszonylag hosszú sejtmaggal (20-50 μm) és korong alakú dendritfával jellemezhetőek. A dendritfa legnagyobb része a sejtmag síkjában helyezkedik el és a szóma pólusaiból ered (Scheibel és Scheibel 1966b, Lubke 1993)(14. ábra). Az nRt sejtek axonjai viszonylag vékonyak (kb. 1,5 μm), de a dorzális thalamusba jutva mielinizálódnak. Az nRT-n belül az axonok feloszlanak 2-3 gliaborítás nélküli axonkollaterálisra, melyek axonvégződései az adott neuron sejttestére érkeznek vissza, nem messze az axoneredési ponttól (Yen és mtsai 1985b). Néhány szerző megkérdőjelezi ezen magközi kapcsolatok létét patkány nRT-ban (Pinault és mtsai 1995), habár macskában és patkányban más szerzők azonosítottak ilyen kollaterálisokat (Deschenes és mtsai 1984, Yen és mtsai 1985b, Spreafico és mtsai 1988, Lubke 1993). Az nRT sejtek dendritjei között rés kapcsolatok (gap junction) jelenlétét mutatták ki (Landisman és mtsai 2002). A dorzális thalamusba lépve az nRT axonok a preszinaptikus sejt nRT szektorának (lásd később) megfelelő thalamicus magvat innerválnak, de kollaterálisaik segítségével elérnek más, akár több, távolabb elhelyezkedő magcsoportot is. 14. ábra: Az nRT sejtek morfológiája Camera lucida rajz az nRT neuronokról. A jobb alsó
sarokban
dendritfa
a
térbeli
rekonstrukcióját reprezentáló téglatestek láthatóak (Spreafico és mtsai 1991).
29
Az nRT sejtek elektrofiziológiai tulajdonságai Az nRT sejteken eddig hat, fontosabb ioncsatornát mutattak ki: feszültségfüggő Na+ és K+ csatornákat, nem inaktiválódó Na+ csatornát, alacsony küszöbű, T típusú Ca2+ csatornát, Ca2+ függő K+ csatornát és Ca2+ függő nem szelektív kationcsatornát (Mulle és mtsai 1986, Spreafico és mtsai 1988, Avanzini és mtsai 1989, Bal és McCormick 1993). Az nRT sejtek többsége a thalamocorticalis relésejtekhez hasonlóan kétféle aktivitással jellemezhető: a burst mód lassú hullámú alvás alatt, míg a tonikus mód éber állapotban, illetve a gyors szemmozgásos alvás (REM) alatt figyelhető meg (Steriade és mtsai 1986). A kétféle típusú tüzelési mód az idegsejtek membránpotenciáljától függ (Llinas
1988).
Intracelluláris
elvezetést
alkalmazva
viszonylagosan
magas
membránpotenciál érték esetén (-65 mV-nál pozitívabb) depolarizáló áraminjekció egyszeres akciós potenciálok sorozatát váltja ki, míg ugyanekkora depolarizáló áraminjekció hiperolarizált membránpotenciál esetében magas frekvenciás (300-500 Hz) burst aktivitást vált ki az nRT sejtek többségében (Contreras és mtsai 1992, Bal és McCormick 1993, Contreras és mtsai 1993). Csakúgy, mint a relésejtek esetén, a burst aktivitásért az alacsony küszöbű T-típusú Ca2+-áramok tehetők felelőssé, azonban e csatornák tulajdonságai némiképp különböznek a relésejtek T csatornáitól (Huguenard és Prince 1992, Huguenard 1996, Todorovic és Lingle 1998) (15. ábra). 15. ábra: Ritmikus burstök ugyanazon extracelluláris
sejt (A)
és
intracelluláris (B) elvezetése esetén (Mulle és mtsai 1986).
30
Míg
az
nRt
sejtek
morfológiailag
viszonylag
homogénnek
tekinthetőek,
elektrofiziológiai sajátságaikban különbségeket mutattak ki. A legtöbb nRT sejt képes alacsony küszöbű Ca2+ tüskéket (low-threshold spike, LTS) produkálni, így átkapcsolni tonikus módból burst módba, míg más sejtek – vélhetőleg az alacsony küszöbű Tcsatornák hiány miatt – kizárólag tonikus módban tüzelnek és nem képesek burst módba váltani, még hiperpolarizált membránpotenciál érték esetén sem (Contreras és mtsai 1992, Brunton és Charpak 1997, Lee és mtsai 2007).
Az nRT sejtek és a TC sejtek elektrofiziológiai tulajdonságainak összehasonlítása
Míg a burst és tonikus mód megléte hasonlóságot mutat a thalamocorticalis relé- és nRT- sejtek esetében, addig a burst struktúrájában és időtartamában jelentős eltérések mutatkoznak. A lassú hullámú alvás alatt elvezetett burstök struktúrájának kvantitatív analízise rámutatott arra, hogy míg a relésejtek átlagosan 5-20 ms-on át 3-5 tüskét tartalmazó burstökkel tüzelnek, addig az nRT sejtek burstjeinek 90%-a 50 ms-nál hosszabb ideig tart, és az nRt sejtek lényegesen több, átlagosan 5-8 tüskével burstölnek (Domich és mtsai 1986)(18. ábra), de egy burst akár 15 tüskét is tartalmazhat (Avanzini és mtsai 1989, Contreras és mtsai 1993). A Ca2+ áramok nagyrészt a dendriteken keletkeznek (Contreras és mtsai 1996), és lassabban inaktiválódnak, valamint eltérő feszültségfüggést mutatnak a thalamocorticalis relésejtek alacsony küszöbű Ca2+ csatornáihoz képest (Huguenard és Prince 1992). A burst struktúrája szintén eltérést mutat, mivel a thalamocorticalis relésejtek esetén a burstön belüli ISI-k folyamatos növekedést mutatnak, míg az nRT sejtek először egy csökkenő, majd egy növekvő, majd ismét egy csökkenő burstön belüli ISI-vel jellemezhetőek (accelerandodecelerando mintázat) (Domich és mtsai 1986, Steriade és mtsai 1986). A különbség oka lehet a T-csatornák eltérő dendritikus lokalizációja thalamocorticalis relé- és nRTsejtek esetén (Contreras és mtsai 1996). A burst tüskéinek accelerando-decelerando mintázatát gyakran egy elnyújtott tonikus farok (tonic tail) követi, amely egyszeres akciós potenciálok sorozatából áll (Domich és mtsai 1986, Steriade és mtsai 1986) (16. ábra).
31
16.
ábra:
VPM
és
nRT
sejt
burst
karakterisztikája Extracelluláris egysejt-elvezetás VPM (felül) és nRT (alul) sejtből. Jól látszik a két burststruktúra eltérő volta (saját ábra).
Az nRT felépítése
Az nRT hét különböző funkciójú szektorra osztható: öt szenzoros szektorra (vizuális, auditoros, szomatoszenzoros, gusztatoros, viscerális), egy motoros szektorra, illetve egy limbikus szektorra (Jones 1985). Az olfaktoros régió léte kérdéses, azonban patkány mediodorzális thalamicus magjában azonosítottak olfaktoros bemenetet (Price és Slotnick 1983). Az egyes szektorok gyakran átfednek egymással (Fukuda és mtsai 1979, Guillery és mtsai 1998, Stehberg és mtsai 2001). Minden egyes szektor meghatározott anatómiai összeköttetésekkel bír, melyeket meghatározott elsőrendű-, illetve magasabbrendű thalamicus magokkal, illetve agykérgi területekkel létesítenek (Guillery és mtsai 1998, Crabtree 1999). Az egyes anatómiai régiók különböző modalitásokért felelősek. Rágcsálók szomatoszenzoros szektorának felépítése egy tipikus példa, mely jól tükrözi más szektorok általános felépítését. A szomatoszenzoros szektor három rétegre (belső, középső és külső) (internal, intermediate and external tiers) tagolódik. A rétegek rendre kapcsolódnak az elsőrendű szomatoszenzoros magokhoz – ventrális, poszterolaterális és poszteromediális magokhoz –, a magasabbrendű poszterior mag azonban kizárólag a belső réteggel áll kapcsolatban.
32
Azok az nRT szektorok, melyek az elsőrendű thalamicus magvakkal állnak kapcsolatban, jól meghatározott topografikus elrendeződést mutatnak, míg azokban a rétegekben,
amelyek
a
magasabbrendű
thalamicus
magvakkal
létesítenek
összeköttetéseket nem mutatható ki topográfia (Shosaku és mtsai 1984, Crabtree 1996, Pinault 2004)(17. ábra).
17. ábra: Az nRT szomatotopikus elrendeződése Sematikus ábra az nRT szomatoszenzoros, vizuális és auditoros szektorairól. A-E a bajszok sorait mutatja. nRT: thalamicus reticularis mag (Shosaku és mtsai 1984).
A thalamocorticalis oszcillációk
A thalamus és az agykéreg reciprok kapcsolata (Sherman és Guillery 1996, Steriade 1996) ritmikus oszcillációk sokaságának kialakulásáért felelős (Steriade és mtsai 1993, Castro-Alamancos és Connors 1997). Az, hogy a vizsgált állat, vagy akár az ember milyen éberségi állapotában van, befolyásolja azt, hogy milyen típusú jel továbbítódhat a thalamocorticalis rendszerben (Castro-Alamancos 2004). Az agykérgi EEG-t elsősorban a thalamocorticalis kör működése határozza meg; az EEG-t felépítő oszcillációk aránya függ az alvás-ébrenléti és a viselkedési állapottól. Alvásban az EEG meghatározó oszcillációi a lassú hullámok, melyek 1 Hz alatt és delta sávban (1 Hz - 4 Hz) dominálnak, szendergés alatt az orsók (spindle) (7 Hz - 14 Hz) és az 5-9 Hz-es aktivitás megjelenése a gyakori, míg az éber állapotra az alfa (8 Hz -12 Hz), a béta (12 Hz - 20 Hz) és a gamma (30 Hz - 70 Hz) hullámok a jellemzőek.
33
A thalamocorticalis kör
A thalamicus hálózat három alapelemet tartalmaz: 1) a serkentő thalamocorticalis (TC) relésejtet 2) a serkentő corticothalamicus (CT) sejtet és 3) a thalamicus reticularis (nRT) mag gátló sejtjeit (18. ábra). Az nRT sejt serkentő bemenetet kap mind a TC sejttől, mely a kéregbe vetít, mind a CT sejttől, mely a thalamusba vetít, ezért az nRT sejtjei kulcspozíciót töltenek be a thalamocorticalis kör és a thalamocorticalis oszcillációk kialakulásában (Jones 1985). 18. ábra: A thalamocorticalis kör A CT sejt serkentő bementet küld a TC és nRT sejtnek. A TC sejt serkenti a CT és nRT sejtet. Az nRT gátolja a
TC
neuront.
TC:
thalamocorticalis,
CT:
corticothalamicus; nRT: thalamicus reticularis sejt (Steriade és Timofeev 2003). Alvás, illetve altatás során a thalamocorticalis hurok (thalamocortical loop) működése röviden a következő: Az nRT sejtek tüzelése a GABAA és GABAB
receptorok
aktiválása
révén
IPSP-k
kialakulását idézi elő a TC sejteken (von Krosigk és mtsai 1993, Huguenard és Prince 1994, Bal és mtsai 1995a). Az IPSP-k hatására a sejt hiperpolarizálódik, majd aktiválódnak a feszültségfüggő Ca2+ -csatornák, így a relésejt visszacsapó kisülésorozatot (rebound burst) generál. A reciprok összeköttetés miatt a TC sejt burstje szinaptikus serkentésként kerül vissza az nRT sejtre NMDA- és AMPA receptorok kiváltotta komponensek útján (von Krosigk és mtsai 1993, Huguenard és Prince 1994, Bal és mtsai 1995a, Jacobsen és mtsai 2001). Másfelől a TC sejtek burst kisülései a CT sejteket is aktiválják, melyek szintén serkenthetnek más, akár szomszédos nRT sejteket is. Az nRT sejtek rés kapcsolatokkal, vagy a sokak által vitatott dendrodenritikus szinapszisokkal képesek egymást serkenteni. Így ez a hálózat egy folyamatosan megújuló oszcillációt eredményez.
34
Lassú hullámú agykérgi aktivitás
Nyugalmi állapotban, alvásban és egyes altatási típusokban az agykérgi hálózat koránt sincs nyugalomban, hanem spontán szinkronizált aktivitást – lassú hullámú aktivitást – mutat (Metherate és Ashe 1993a, Steriade és mtsai 1993). Alvás alatt a delta hullámok (1 Hz - 4 Hz) és a lassú hullámok (< 1Hz) jelenléte a jellemző. A delta hullámok a thalamus és az agykéreg szinkron működésével jönnek létre (Leresche és mtsai 1991), létrehozásában a Ih áramok és az IT áramok játszanak fontos szerepet. A delta aktivitás egymást ritmikusan követő ciklusokból áll: az EPSP-k és az akciós potenciálok összegződéséből kialakuló depolarizációkból, aktív fázisokból (Up state), valamint az ezt követő bemenő szinaptikus jelcsökkenéséből és a kérgi sejtek tüzelésének megszűnéséből adódó hiperpolarizációkból, mélységi negativitásokból (Down state) áll. Az Up state-ek a thalamocorticalis rendszer szinaptikus hálózatán áthaladó serkentő és gátló áramok összegződéséből, azok egyensúlyából alakulnak ki (Shu és mtsai 2003). Az Up state az agykéregből indulva (Steriade és mtsai 1993, Sanchez-Vives és McCormick 2000) más szubkortikális területek bevonásával, mint a thalamus (Steriade és mtsai 1993) és a striátum (Cowan és Wilson 1994), jönnek létre. A kérgi Up state-ek alatt létrejövő időleges aktivitás az ébrenlét alatt megfigyelhető állapothoz hasonlítható (Moruzzi és Magoun 1949, Steriade és mtsai 1993, CastroAlamancos 2004).
Orsó (spindle) aktivitás
A spindle aktivitás egy 7-14 Hz-es, 1-3 másodpercig tartó, 3-10 másodpercenként ismétlődő növekedést, majd csökkenést (waxing and waning) mutató oszcilláció, mely a szendergés állapotára jellemző. A spindle hullámok kialakulásában az nRT tölti be az oszcillátor szerepét. A folyamat indító lépéseként az nRT sejtek 7-14 Hz-es gyakorisággal, ritmikusan egymást követve kezdenek burstölni. Az nRT sejtek tüzelése IPSP-ket generál, és ez a TC sejtek gátlásához vezet. Ha az IPSP-k érkezése elegendő mértékű és idejű hiperpolarizációt
35
biztosít a IT-csatornák aktivációjához, akkor a relésejtek 7-14 Hz-es frekvenciával kezdenek burst-sorozatokat generálni. Ezután a TC sejtek egyrészt viszavetítenek az nRT sejtekre, elősegítve a ritmikus oszcilláció kialakulását, másrészt a 7-14 Hz-es ritmikus burstök az agykéregbe jutva, EPSP-ket generálnak a CT sejtekben. Végül a 714 Hz-cel tüzelő kérgi TC sejtek hálózata fogja kialakítani az EEG spindle oszcillációját.
5-9 Hz-es oszcilláció
Az
5-9
Hz-es
oszcilláció
frekvenciasávjában
hasonló
ugyan
a
spindle
oszcillációhoz, eredetük azonban eltérő. Míg a spindle-t az nRT, addig az 5-9 Hz-es oszcillációkat a kéreg indítja be (Pinault és mtsai 2001), így valószinűsíthető, hogy az absence epilepszia kialakulásánál inkább ezen hullámok patológiás működése a jellemző (Pinault és mtsai 2006) (19. ábra).
19. ábra: Spindle vs. 5-9 Hz-es oszcilláció Egy nRT sejt tüzelése 5-9 Hz-es és spindle oszcilláció alatt. Az EEG-t az S1-ből vezettük el. A) nRT sejt és S1 EEG 5-9 Hz-es oszcillációk alatt. B) nRT sejt és S1 EEG spindle oszcilláció alatt. Alul az autokorrelogramok láthatóak (Pinault és mtsai 2006).
36
Az extrareticularis gátlás
Kutatócsoportunk anterográd pályajelöléssel igazolta (Bartho és mtsai 2002, Bokor és mtsai 2005), hogy a magasabbrendű thalamocorticalis magok az nRT-ból érkező gátlás mellett egy szelektíven rájuk érkező gátlást is kapnak, melynek eredete extrathalamicus. Mivel a gátlás nem a GABAerg nRT-ból, hanem azon kívüli területekről ered, így ezt az új, szelektív gátlópályát extrareticularis gátlásnak nevezzük. Az eddig leírt extrareticularis gátló magok az anterior pretektális mag, a zona incerta (Bartho és mtsai 2002, Bokor és mtsai 2005), illetve a globus pallidus és a substantia nigra pars reticulata (Kultas-Ilinsky és mtsai 1983, Kuroda és Price 1991, KultasIlinsky és mtsai 1997). Doktori munkám során a szomatoszenzoros rendszerrel foglalkoztam, így a motoros rendszert érintő globus pallidusból és substantia nigra pars reticulatából érkező gátlórendszerre és annak szerepére nem térek ki.
Zona incerta
Az első leírás a ZI-ről Forel nevéhez fűződik 1877-ből (Forel 1877). A ZI a köztiagy, azon belül is a ventrális thalamus része, a dorzális thalamust héjként öleli körül, akárcsak az nRT. Míg az nRT a dorzális thalamust laterálisan, addig a ZI ventrálisan határolja, a ZI mintegy az nRT folytatásaként követi a dorzális thalamus vonulatát. A ZI-t citoarchitektúrája alapján rosztrális, dorzális, ventrális és kaudális részre osztják, míg funkcionálisan szomatoszenzoros, vizuális, auditoros, motor és limbikus szektorokra bontják (Mitrofanis 2005).
A ZI sejttípusai
A ZI sejttípusait citokémiai módszerekkel próbálták elkülöníteni. Egyes kálciumkötő fehérjék, mint a PV és a CB régióspecifitást mutatnak, de egyes neuromodulátorok, a dopamin és a szerotonin jelenléte is szektorfüggő lehet (Lin és
37
mtsai 1990, Kolmac és Mitrofanis 1998). A dorzális ZI (dZI) elsősorban glutamáterg, illetve NO-szintáz pozitív sejteket tartalmaz, míg a ventrális ZI (vZI) legnagyobb részét PV pozitív GABAerg sejtek alkotják (Nicolelis és mtsai 1995, Kolmac és Mitrofanis 1998).
A
sejtek
elektrofiziológiai
tulajdonságai
nem
ismertek,
Nicolelis
bajuszstimulálásra érzékeny sejteket írt le a szomatoszenzoros szektorban (Nicolelis és mtsai 1992).
A ZI kapcsolatrendszere
A ZI kiterjedt kapcsolatrendszerrel rendelkezik, bemenetet kap az agykéregből (cingulus, frontális, parietális területek) (Roger és Cadusseau 1985, Mitrofanis és Mikuletic 1999), a törzsdúcok területéről (substantia nigra, globus pallidus, entopedunkuláris mag) (Ricardo 1981, Roger és Cadusseau 1985, Shammah-Lagnado és mtsai 1985, Kolmac és mtsai 1998, Heise és Mitrofanis 2004), és a kisagyból (Roger és Cadusseau 1985, Shammah-Lagnado és mtsai 1985, Mitrofanis és deFonseka 2001).
27. ábra: A ZI fő összeköttetései Paraszaggitális nézet a ZI főbb össszeköttetéseiről patkányban. Módosítva (Mitofanis 2004) ábrájából. ZI: zona incerta, APT: anterior pretectum (saját ábra).
38
Reciprok kapcsolatban áll az APT-vel (May és mtsai 1997, Bokor és mtsai 2005, Giber és mtsai 2008), a colliculus superiorral, az agytörzzsel (Watanabe és Kawana 1982, Roger és Cadusseau 1985, Romanowski és mtsai 1985, Shammah-Lagnado és mtsai 1985, Kolmac és mtsai 1998) és a gerincvelővel (Ricardo 1981, Watanabe és Kawana 1982, Peschanski és mtsai 1983, Roger és Cadusseau 1985, Romanowski és mtsai 1985, Shammah-Lagnado és mtsai 1985), fő projekcióját a magasabbrendű thalamicus- (Bartho és mtsai 2002) és a hídmagvak alkotják (Ricardo 1981, Terenzi és mtsai 1995). Egyes szerzők szerint a ZI az agykéreg I. rétegébe vetít, de ez jelenleg is vita tárgyát képezi (Lin és mtsai 1990, Nicolelis és mtsai 1992, Power és Mitrofanis 1999a) (27. ábra) A ZI szelektíven a magasabbrendű thalamusba küld gátló rostokat
Kutatócsoportunk bizonyította, hogy a ZI-be anterográd pályajelölő anyagot juttatva jelölt rostok találhatóak a magasabbrendű thalamusban (28. ábra).
39
28. ábra: Az incerto-thalamicus terminálisok eloszlása különböző koronális síkokban Az incerto-thalamicus terminálisok anterográd BDA pályajelölőanyag beadása után elsősorban a magasabbrendű thalamus területén mutattak jelölődést. LDMR: laterodorzális mag mediorosztális rész; LDVL: laterodorzális mag ventrolaterális rész; LDDM: laterodorzális mag dorzomediális rész, LPLR: lateroposzterior mag laterorosztrális
rész;
LPMR:
laterodorzális
mag
mediorosztrális
rész;
CL:
centrolaterális mag; MD: mediodorzális; VPM: ventrális poszteriomediális mag, VPL: ventrális poszteriolaterális mag; VM: ventromediális mag; CM: centromediális mag; VA: ventrális anterior mag; Rt: thalamicus reticularis mag; PF: parafascicularis mag; Re: reuniens mag, VRe: reuniens mag ventrális része, PC: paracsntrális thalamicus mag (Bartho és mtsai 2002). Jelölt terminálisok voltak a poszterior magban (Po) az anguláris mag, ethmoideus mag,
retroethmoideus
és
posterior
trianguláris
magokban
(magasabbrendű
szomatoszenzoros thalamicus magok); a nucleus suprageniculatus limitans és a posterior limitans magok területén, elszórtan az MGN mediális részén (magasabbrendű auditoros thalamicus magok); az LD ventrális és mediális részén, valamint az LP mediodorzális és dorzális részén (magasabbrendű vizuális thalamicus magok) is találtak incerto-thalamicus axonvégződéseket. A magasabbrendű intralamináris magcsoportból a CL, a paracentrális, CM, PF, Po és az intralamináris magcsoportokban találtak jelölődést, míg a középvonali magcsoport közül kizárólag a reuniens mag tartalmazott jelölt rostokat. Elszórt jelölés volt megfigyelhető az MD mag laterális részén és a ventromediális (VM) magban, azonban a VL mag laterális része erős jelölődést mutatott. Néhány jelölt rostot a ventrális oldalsó geniculatus mag is tartalmazott. Az nRT nem tartalmazott jelölt rostokat. Retrográd jelölés az agykéregben nem volt megfigyelhető, azonban egyes esetekben retrográdan jelölődött sejteket találtak az APT területén. A dorzális thalamusban sem mutatatták ki a jelölőanyag jelenlétét, ami a ZIbe érkező thalamicus bemenet hiányát igazolja. (28. ábra) (Bartho és mtsai 2002).
40
A ZI-thalamicus terminális jellemzése
Az incerto-thalamicus terminálisok nagy heterogenitást mutattak méretük és alakjuk tekintetében, jellemzőek voltak az orsó vagy, elnyújtott alakúak, azonban gömb vagy, szabálytalan formák is előfordultak. A terminálisok többsége en passant érkezett az axonra, némelyik azonban rövid nyúlvánnyal rendelkezett. A terminálisok 4-8-as csoportokban helyezkedtek el az axonfelszínen, majd egy terminálismentes szakasz után ismét terminálisok csoportosulása volt megfigyelhető. A terminálisok mérete hossztengely mentén a 2-7 μm-es tartományba esett, a rövidebbik tengely 1-2 μm-nek adódott. A maximális terminális hossz 9 μm volt. Az incerto-thalamicus terminálisok csaknem mindegyike szimmetrikus szinapszist alkotott, a terminálisok gyakorta többszörös szinapszist létesítettek, általában egy posztszinaptikus partnerrel. Az axonvégződések leggyakrabban a relésejtek proximális dendritágain szinaptizáltak. Puncta adhaerentia (PA) a legtöbb esetben megfigyelhető volt (29. ábra) (Bartho és mtsai 2002).
29. ábra: A ZI-be adott anterográd jelölőanyag a magasabbrendű thalamicus magok területén A) Kis nagyítású fénymikroszkópos kép az anterográd jelölőanyag (BDA) beadási helyéről (nyilak). A tájékozódás segítésére a metszetet CB immunfestéssel jelölték, így a CB pozitív relésejt megjelölődőtt. B) CB pozitív relésejt proximális dendritjeire többszörös bemenetet érkezik az óriás incerto-thalamicus terminálisoktól (nyílhegyek).
41
Mérőléc: A) 500 μm; B) 10 μm. (Bartho és mtsai 2002). DLG:belső térdestest; LP: lateroposzterior thalamicus mag; Po: poszterior thalamicus mag; VPL: ventrális poszteriolaterális thalamicus mag; VPM: ventrális poszteriomediális thalamicus mag, Eth: ethmoideus mag, ZID: dorzális zona incerta; ZIV: ventrális zona incerta; cp:cerebrális pedunculus (agykocsány) (Bartho és mtsai 2002). A GABA immunreaktivitást anterográd pályajelölés után posztembedding immunogold
technikával
vizsgálva
kutatócsoportunk
megállapította,
hogy
a
terminálisok nagy többsége (90,4 %) GABA pozitív. A posztszinaptikus partner minden esetben GABA negatív volt (30. ábra). 30. ábra: Az anterográdan jelölt incerto-thalamicus
terminális
GABAerg A)
BDA-t
tartalmazó
terminális
szimmetrikus szinapszisokat (nyilak) létesít a Po sejtek vastag dendritjein. B) A beágyazás utáni GABA-immunarany festés azt jelzi, hogy b1 terminális GABAerg és többszörös szinapszist létesít a posztszinaptikus partnerrel (nyilak). b1 terminális számos punctum adherens-el
kapcsolódik
a
relésejt
dendrithez (kis nyilak). b2 egy nem GABAerg terminálist mutat. Mérőléc: 0,5 μm. b1, b2: axonterminális, d: dendrit (Bartho és mtsai 2002).
42
Az incerto-thalamicus pálya gátlása a Po sejtek gátlásoldását eredményezi Morfológiai adatok arra utalnak, hogy ZI-ből érkező gátló rostok erős gátlást tudnak előidézni a Po sejteken. A GABAerg óriásterminálisok a relésejtek proximális dendritjeit innerválják. Ha lézióval elpusztítjuk a ZI egy jelentős részét, és feloldjuk az extrareticularis gátlás alól a Po sejteket, akkor feltételezhető, hogy azok tüzelése és stimulusra adott válasza jelentősen változni fog. Lavalée és munkatársai (2005) in vivo kísérletükben bizonyították, hogy a ZI léziója után a Po sejtek magasabb frekvenciás tüzelést és bajuszingerlésre rövidebb latenciával érkező, erősebb válaszokat adtak, mint a kontroll kísérletek során (31. ábra). A kísérlet indirekt bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a Po sejtek normál körülmények között erősen depresszált állapotban vannak, és ezért a depresszált állapotért az extrareticularis gátlás tehető felelőssé. 31. ábra: A ZI kainsavas léziója
a
gátlás
Po-ra
érkező
csökkenését
eredményezi A) Kontroll kísérletben a Po sejtek
spontán
frekvenciája
tüzelési viszonylag
alacsony. B) A ZI lézióját követően a Po sejtek az akciós potenciálok ritmikus sorozatával válaszolnak. C) A
stimulus
körüli
idő
hisztogramm (peri stimulus time
histogram,
PSTH)
ugyanabból a patkányból regisztrált
három
sejt
válaszait mutatja kontroll- (piros) és ZI lézió utáni (fekete) állapotban. A fénymikroszkópos kép az egyik megjelölt Po sejtet ábrázolja. D) Populációs PSTH a
43
bajuszstimuláció kiváltotta válaszokra ZI-lézionált patkányoknál. E) A válaszok latenciájának eloszlása ugyanebben a sejtpopulációban (Lavallee és mtsai 2005). Az eddig bemutatott kísérletek alapján képet kaphattunk arról, hogy a ZI egy erős gátlás kifejtésére képes a magasabbrendű thalamus sejtjein, nem ismert azonban az, hogy a egyes ZI sejtek milyen tüzelési aktiviátással rendelkeznek in vivo körülmények között, valamint hogy a kérgi bemenetek milyen mértékben képesek befolyásolni működésüket. A ZI sejtek morfológiájáról sem áll adat rendelkezésünkre.
Anterior pretektum
A másik olyan terület, ahonnan a thalamus magasabbrendű magvaira szelektív gátlás érkezik az anterior pretektális mag (APT). Az APT-ről kevés információ áll rendelkezésre a szakirodalomban. Az APT a kaudális diencephalon része, számos nagyobb fel- és leszálló pálya halad át rajta. Elsőként leginkább a szomatoszenzoros működésekben, antinocicepcióban és averzióban, illetve a fájdalomérzésben betöltött szerepére gyanakodtak, amelyet számos, elsősorban rágcsálókban végzett kísérletben igazoltak (Foster és mtsai 1989, Terenzi és mtsai 1991, Villarreal és Prado 2007)(20. ábra).
PV APT
LP
DLG
20. ábra: Az APT elhelyezkedése immunjelölt koronális metszeten. Koronális parvalbumin (PV) immunjelölt metszeten az
VLG ml
ZI
APT
elhelyezkedése
látható
patkányban.
Megfigyelhető, hogy a PV szépen kijelöli az APT maghatárát.
APT:
anterior
pretectum;
LP:
lateroposzterior mag, DLG: oldalsó térdestest; VLG: ventrális térdestest; ml: medial lemniscus, ZI: zona incerta (saját ábra).
44
Az APT sejttípusai
Az APT-t alkotó sejtekről nem sok információt tudunk. A kálciumkötő fehérje PV erős festődést mutat az APT szinte összes sejtjében, így szépen megfesti a maghatárt (20. ábra). A PV általában a GABA-val kolokalizál, így jelenléte gátló sejtek jelenlétére utal.
Az APT kapcsolatrendszere
Az APT-nek számos agytörzsi mag ad bemenetet, úgymint a spinális trigeminális mag (Veinante és Deschenes 1999, Veinante és mtsai 2000a) és a colliculus superior, valamint bemenetet kap szomatoszenzoros és vizuális agykérgi területekről is (Foster és mtsai 1989, Cadusseau és Roger 1991). Leszálló kapcsolatrendszerét a colliculus superior, a hídmagvak és nyúltvelői érző magok képezi (Terenzi és mtsai 1991, Zagon és mtsai 1995). Az APT-ből induló felszálló pálya rostjai a zona incerta és a thalamus területére érkeznek (May és mtsai 1997, Bokor és mtsai 2005).
Az APT szelektíven a magasabbrendű a thalamusba küld gátló rostokat
Pályajelölőléses kísérletekben kutatócsoportunk bizonyította, hogy az APT a ZI-hez hasonlóan szelektíven a magasabbrendű thalamusba küld gátló rostokat. Anterográd pályajelölőanyagot injektálva az APT különböző területeire, a jelölőanyag megjelent a thalamus területén (21. ábra). Az azonos oldali thalamusban sűrűn elhelyezkedő jelölt rostok csoportja volt megtalálható. A jelölt foltokat lazán rendezett axonok vették körül. Az ellenoldali jelölődés mértéke elhanyagolható volt. Jelölődött axonterminálisok kizárólag a magasabbrendű thalamicus magok területén voltak: az anterográd pályajelölést a Po, az ethmoidális mag és a poszterior trianguláris magok, a laterodorzális mag (LD), a lateroposterior mag (LP), ventromediális mag (VM), a mediodorzális mag (MD), a centrolaterális, paracentrális és parafascicularis magok (intralamináris) és a nucleus suprageniculatus komplex mutatott. Az elsőrendű thalamicus magok, mint a VPM, VPL, dLGN, vMGN és az anterior magcsoport nem
45
jelölődtek. Az nRT-ban sem volt anterográd jelölődés megfigyelhető. Összességében elmondható, hogy az APT terminálisok az azonos oldali, kizárólag a magasabbrendű thalamicus magok területén, kis csoportokban, fokálisan voltak megfigyelhetőek. Az APT beadás mindig erős, magon belüli, rekurrens kollaterális festődést mutatott.
21. ábra: APT projekciója a magasabbrendű thalamus területére A) Beadási helyek az APT-ben; B) Az egyik (függőleges sávozású terület) beadási hely fénymikroszkópos képe; C) Az APT területére BDA-beadást követően megjelent jelölt rostok a Po-ban; D, E, F) A magasabbrendű thalamusban jelölődött rostok a különböző koronális síkokban. Mérőléc: a, d, e, f: 1mm; b, 500 μm; b szatelita ábra, 200 μm. LDMR: laterodorzális mag mediorosztális rész; LDVL: laterodorzális mag ventrolaterális rész; LDDM: laterodorzális mag dorzomediális rész, LPLR: lateroposzterior mag laterorosztrális rész; LPMR: laterodorzális mag mediorosztrális rész; CL: centrolaterális mag; MDL: mediodorzális mag laterális része, MDC: mediodorzális mag kaudálisis része VPM: ventrális poszteriomediális mag, VPL: ventrális poszteriolaterális mag; PC: paracentrális thalamicus mag, Rt: thalamicus reticularis mag. (Bokor és mtsai 2005).
46
Az APT-thalamicus terminális jellemzése
Az APT thalamicus terminálisok ultrastruktúráját anterográd pályajelöléses kísérletben vizsgáltuk. Posztembedding GABA reakcióval igazoltuk, hogy a terminálisok többsége (82%) GABA-erg. A terminálisok alakja nagy és elnyújtott volt, hossztengelyük akár az 5 μm-t is elérte, míg szélességük kb. 1 μm volt (22. ábra). A preszinaptikus APT terminálisok a magasabbrendű thalamus relésejteinek proximális részén végződtek, méghozzá többszörös felszabadulási helyeket létesítve. Csaknem minden terminális rendelkezett számos punctum adhearens-szel (PA), felszíne gliával borított volt. A terminálisok gyakran érkeztek egy dendritre. A többszörös felszabadulási helyek igen erős gátlás jelenlétét feltételezik.
22. ábra: Az APT-thalamicus terminális GABAerg A, B) BDA jelölt APT terminális elektronmikroszkópos képe. A kis nyilak a BDA jelölésre mutatnak (beágyazás előtti ezüst intenzifikált arany jelölés): a kis fekete szemcsék a preszinaptikus terminális GABA immunreaktivitására utalnak (beágyazás utáni immunfestés). A terminális szimmetrikus szinapszist képez, többszörös felszabadulási helyet létesítve (nagy nyilak). Számos punctum adhearens (PA) is
47
megfigyelhető volt a szinapszisban (nyílhegyek). A terminális a szinaptikus felszínen kívül teljes mértékben gliával borított. A csillag egy GABA negatív terminálist jelöl, amely ugyancsak erre a dendritre érkezik. C) Kis nagyítású és D) nagy nagyítású elektronmikroszkópos kép egy proximális dendritre érkező BDA jelölt GABAerg terminálisról. A nyíl a szinapszisra, a tömör nyílhegyek a PA-ra, az üres nyílhegyek a filamentózus kontaktusokra mutatnak (Bokor és mtsai 2005). A sorozatmetszetekből készített háromdimenziós rekonstrukció még jobban feltárja az APT terminális pontos morfológiáját (23. ábra)(Wanaverbecq és mtsai 2008). 23. ábra: APT terminális 3D rekonstrukciója Egy APT terminálisról készült háromdimenziós rekonstrukció 60 nm-es elektronmikroszkópos sorozatmetszetek felhasználásával. A zöld a gliaborítást, a sárga a szinapszist, a kék a PA-t ábrázolja. Jól látszik az összefüggő gliaborítás, mely a terminális szinapszissal ellentétes oldalán helyezkedik el (zöld), a gyűrűszerűen elhelyezkedő felszabadulási helyek nagy mennyisége (sárga) és a PA csoportja (kék)(Wanaverbecq és mtsai 2008).
Az APT-thalamicus terminális és az nRT-thalamicus terminális összehasonlítása
Laboratóriumunk igazolta, hogy a magasabbrendű thalamusba kétféle gátlás érkezik; egyfelől a magasabbrendű thalamus - az elsőrendű thalamushoz hasonlóan – gátló bemenetet kap az nRT-tól, másfelől létezik egy extrareticularis eredetű gátlórendszer, amely szelektíven idegzi be a magasabbrendű thalamicus magvakat (Bartho és mtsai 2002, Bokor és mtsai 2005). Az elektronmikroszkópos technika és az elektronmikroszkópos sorozatmetszetek háromdimenziós analízise lehetőséget biztosított e két eltérő eredetű gátló terminális morfológiájának összehasonlítására. A két típusú terminális kizárólag GABAerg jellegében mutat hasonlóságot. A legszembetűnőbb a két terminális méretbeli különbsége: míg az nRT terminálisok
48
relatíve kisméretűek (< 2 μm), addig az APT terminálisok óriásiak, akár az 5 μm-es hosszt is elérhetik. A nRT terminálisokon nem volt PA, gliával részlegesen voltak borítottak, és legtöbbször 1-2 felszabadulási hellyel létesítettek kapcsolatot a posztszinaptikus relésejt disztális dendritjein. Ezzel ellentétben az APT terminálisokon PA hálózat, összefüggő gliaborítás és gyűrűszerűen elhelyezkedő felszabadulási helyek sokasága volt megtalálható (Wanaverbecq és mtsai 2008) (24. ábra).
24. ábra: APT és nRT terminálisok 3D rekonstrukciójának összehasonlítása A-B) Két nRT terminális a Po területén három nézőpontból. Mindkét terminális többszörös szinapszissal rendelkezik, ezek azonban a terminális más-más oldalán helyezkednek el (S1-S4, sárga). Minden szinapszist gliaborítás választ el, és a szinapszisok mindegyike a relésejt más-más dendritjéhez kapcsolódik. A2-A7) Az elektronmikroszkópos sorozatmetszetek alapján jól látszik, hogy a preszinapszist (S1, sárga) a posztszinaptikus partner megszakítás nélkül követi. C-D) Két APT terminális képe két nézőpontból. Mindkét terminális esetén a szinapszisok sokasága (C 12, D 9) a
49
terminális ugyanazon felszínén helyezkedik el, és egyetlen dendritet innervál. A szinapszisok a PA-k sokaságát gyűrűszerűen ölelik körül. A gliaborítás egybefüggő, nem
képez
határfelületet
a
szinapszisok
között.
Az
elektronmikroszkópos
sorozatmetszetek (C2-C8) a többszörös posztszinaptikus felszíneket (nyilak) és a PA-kat (nyílhegyek) mutatják. A piros szín a terminális membránját mutatja. Mérőléc: A1, B, C1, D: 1 μm; A2-A7, C2-C7: 0,5 μm (Wanaverbecq és mtsai 2008).
Az APT-thalamicus pálya és az nRT-thalamicus pálya funkcionális összehasonlítása in vitro
A morfológiai eredmények alapján az pretecto-thalamicus pálya szelektív, nagyon erős gátlást képes kifejteni a magasabbrendű thalamus relésejtjeire. Ennek funkcionális igazolására in vitro szeletfiziológiai módszereket dolgozott ki kutatócsoportunk egy svájci laboratóriummal kollaborációban. Olyan horizontális szeletpreparátumot készítettek, amely lehetővé tette mind az APT-thalamicus mind az nRT-thalamicus pálya stimulálását. A szeleteket egy hónapnál fiatalabb patkányokból készítették, melyek
APT,
illetve
nRT
magjaiba
előzetesen
floureszcens
anterográd
pályajelölőanyagot, micro-ruby-t juttattak, így lehetőség nyílt mindkét GABAerg pálya vizualizációjára (25. ábra). 25.
ábra:
Fluoreszcens
anterográd pályajelölőanyaggal jelölt APT-thalamicus és nRTthalamicus pályákat tartalmazó szelet egy hónapnál fiatalabb patkányból Az elvezetés a Po területéről történt
(Rec.)
thalamicus
vagy
az az
APTnRT-
thalamicus pálya stimulálása (Stim.) közben. APT: anterior pretectum; nRT: reticularis thalamicus mag, Po: poszterior mag; VPM: ventrális poszteriomediális mag; VPL: ventrális poszteriolaterális mag, DLG:oldalsó térdestest, fr: fasciculus retroflexus (saját ábra).
50
A thalamocorticalis relésejteket teljes-sejt elvezetésben (whole-cell patch clamp) vizsgálták. Mindig olyan relésejtet választottak, amelyet anterográdan jelölt terminálisok sokasága ölelt körül. Gultamáterg blokkolók alkalmazása mellett (APV, NBQX) az APT stimuláció (0.2 Hz, 300-900 μs) IPSP-k sorozatát váltotta ki, ami GABAA típusú receptor antagonistával (bicuculline, 25 μM) blokkolhatónak bizonyult. Korábbi eredmények arra utalnak, hogyha egy célelemre egy terminális több szinapszissal kapcsolódik, akkor megfigyelhető, hogy a nagy frekvenciás (50- 100 Hz) stimulálás során a jelátviteli hatékonyság nem csökken nagymértékben, mivel a vezikularaktárak kisebb mértékben merülnek ki. (Kraushaar és Jonas 2000, Telgkamp és mtsai 2004). Ezt az elképzelést megerősíti, hogy nagy frekvenciás ingerlést követően az APT-thalamicus kapcsolat multipulzus depressziója szignifikánsan kisebb, mint az nRT-thalamicus kapcsolaté. Ez azt jelenti, hogy az APT-thalamicus gátlás egy erősebb és hosszabb ideig tartó gátlást eredményez az nRT-thalamicus gátláshoz képest. Ötven Hz-es stimuláció hatására az APT-thalamicus IPSC-k amplitúdója szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a stimuláció-sorozat végén, mint az nRT-thalamicus IPSC-k amplitúdója. Továbbá az nRT-thalamicus IPSC-k (26. ábra*) jelentős csökkenést mutattak összehasonlítva az APT-thalamicus IPSC-kkel. Ez azt bizonyítja, hogy a sok szinapszissal rendelkező GABAerg APT-thalamicus terminális magas frekvenciás tüzelés esetén is képes hatékony gátlás fenntartására. Ennek tudatában felmerül a kérdés, hogy az APT-thalamicus sejtek vajon képesek-e ilyen magas frekvenciás tüzelésre (26. ábra). 26. ábra: A multipulzus depresszió jellemzése az nRT és APT terminálisból érkező IPSC-k a esetén. Kiváltott IPSC-k a Po-ban az nRT-thalamicus, illetve
APT-thalamicus
terminális
50
Hz-es
stimulálását követően. A jobb összehasonlíthatóság érdekében az nRT-IPSC-k (szürke) és az APT-IPSCk (fekete) az első csúcs amplitúdójához lettek normalizálva, majd egymásra fektetve (relatív). nRT: thalamicus reticularis nucleus, APT: anterior pretectum (Wanaverbecq és mtsai 2008).
51
Az in vitro elektrofiziológiai és hisztológiai eredmények bizonyítják, hogy az APTből érkező gátlás erős befolyással bír a magasabbrendű thalamus sejtjein. Nem tudjuk azonban, hogy az APT sejtek milyen tüzelési mintázattal jellemezhetőek in vivo kísérletekben, és hogy működésük hogyan viszonyul az agykérgi aktivitásához. Az APT sejtek morfológiai adatai sem állnak a rendelkezésünkre.
52
CÉLKITŰZÉSEK
Az irodalmi áttekintésben leírtak alapján elmondható, hogy driver bemenetük és hálózati összeköttetéseik alapján a thalamust két eltérő típusú, funkcionálisan különböző thalamocorticalis magcsoportra oszthatjuk. Az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus magok relésejtjeinek elektrofiziológiai tulajdonságaiban tapasztalható eltérésekről azonban csak kevés adat áll rendelkezésünkre. Tüzelési tulajdonságaikat még nem vetették alá részletes analízisnek, valamint az sem ismert, hogy tüzelésük szinkronitása az egyes LFP frekvenciákhoz hogyan viszonyul. Az eltérő serkentő összeköttetések mellett a magasabbrendű thalamicus magok gátló bemeneteik tekintetében is jelentősen eltérnek az elsőrendű thalamicus magoktól, hiszen pályajelöléses- és elektrofiziológiai kísérletek igazolták, hogy az nRT-ból érkező gátlás mellett a magasabbrendű magok egy nagyon erős és rájuk szelektíven érkező gátlást
is
kapnak
extrathalamicus
területekről.
A
szenzoros
területekre
az
extrareticularis gátlás a ZI és az APT területéről érkezik. Nem volt ismert, hogy a ZI és az APT milyen elektrofiziológiai sajátságokkal rendelkezik, milyen tüzeléssel jellemezhető sejteket tartalmaz, továbbá nem ismert, hogy az egyes sejtek tüzelése milyen mértékű szinkronitást mutat az agykérgi aktivitással, és hogy ez a szelektív gátlórendszer miképp képes a thalamocorticalis rendszer befolyásolása útján a kérgi működésre hatást gyakorolni. A fentiek alapján kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. In vivo egysejt-elvezetéses elektrofiziológiai kísérletekben altatott patkányon megvizsgáltuk, hogy különbözik-e az elsőrendű- és a magasabbrendű thalamicus magok relésejtjeinek tüzelési mintázata. Vizsgáltuk az átlagos tüzelési frekvenciát, a burstök előfordulásának gyakoriságát, a burstiness tulajdonságot (az összes akciós potenciál hány százaléka alkotja a burstöket). A burstök jellemzéséhez az intraburst frekvenciát, a burst hosszát, és a burstöt alkotó akciós potenciálok számát határoztuk meg.
53
2. Megvizsgáltuk, hogy milyen kapcsolatban van az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus relésejtek tüzelése a kérgi LFP lassú hullámú aktivitásával és béta aktivitásával. 3. Megvizsgáltuk a ZI és az APT sejtek tüzelési mintázatát in vivo altatott patkányon végzett egysejt-elvezetéses elektrofiziológiai kísérletekben, valamint vizsgáltuk a sejtek tüzelésének fáziskapcsoltságát a kérgi lassú hullámú agykérgi aktivitáshoz. 4. Az extrareticularis pálya kémiai stimulálása útján vizsgáltuk, hogy milyen hatással lehet ennek az igen erős gátló pályának a gátlása a magasabbrendű thalamicus magok relésejtjeinek tüzelési aktivitására és kapcsoltságára az agykérgi aktivitással.
54
MÓDSZEREK
A kísérleteket felnőtt, hím, Wistar patkányokon (> 1 hónapos, 300-400g) végeztük, és mindent elkövettünk, hogy csökkentsük a kísérleti állatokat érő stresszt a beavatkozások
során,
valamint
törekedtünk
a
felhasznált
állatok
számának
minimalizálására. Minden kísérletet az Európai Unió előírásai szerint (86/609/EEC, engedélszám: 2300/003), a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet etikai bizottsága és a francia Állatkísérletek Regionális Etikai Bizottsága (Strasbourg, Franciaország (F.o.)) által elfogadott módon végeztünk.
In vivo elektrofiziológia
Helyi, kérgi mezőpotenciálok regisztrálása
Uretán anaesthesia: A kísérletekben uretán (0,76 ml/100g, 20%-os oldat fiziológiás sóoldatban oldva) altatás alatt kérgi mezőpotenciálokat (local field potential, LFP) vezettünk el, bipoláris mélyelektróda (felszíni és 1,5 mm mély, a kéreg V. rétegéből), illetve monopoláris wolfram mélyelektróda (1,5 mm, V. réteg) (in vitro impedancia 0,81,2 MΩ; Bowdoinham, ME) segítségével az S1 kéregből. A mélyelektródán a kérgi LFP mellett soksejt-aktivitást is regisztráltunk. Referencia elektródként egy rozsdamentes acélcsavart ültettünk be a cerebellum fölé. Az elvezetett jelet erősítés (1000-szeres) és szűrés (0,1 Hz-5 kHz) (BioAmp, Supertech, Pécs, HU) után 16.6 kHzel mintavételeztük (micro 1401 mkII; Cambridge Electronics Design, Cambridge, UK). A kérgi soksejt-aktivitást a 800 Hz és 5 kHz közötti jel 3,5 szórást (SD) meghaladó értékeiként detektáltuk. Ketamin/xilazin altatás: A kísérletekben ketamin (75 mg/kg) és xilazin (5 mg/kg) keverékét alkalmaztuk és LFP-t vezettünk el felszíni csavar makroelektróda segítségével az S1 kéregből. Referencia elektródként egy rozsdamentes acélcsavart ültettünk be a cerebellum fölé. Az elvezetett jelet erősítés (1000-szeres) és szűrés (0,1
55
Hz-5 kHz) (BioAmp, Supertech, Pécs, HU) után 16.6 kHz-el mintavételeztük (micro 1401 mkII; Cambridge Electronics Design, Cambridge, UK). Neuroleptanalgézia: A műtét során mély általános altatást alkalmaztunk (40 mg/kg pentobarbital, i.p. (Sanofi, Libourne, France) és 50 mg/kg ketamin i.m (Merial, Lyon, F.o.)). Tracheotómia és a pénisz véna katéterezését követően D-tubokurarin-klorid (0.4 mg, Sigma-Aldrich, sant-Quentin Fallavier, F.o.), fentanil (1 μg, Janssen, BoulogneBillancourt, F.o.), haldol (100 μg, Janssen) és szőlőcukor (25 mg) oldatának vénás adagolását kezdtük meg 0,5 ml/óra sebességgel. Az EKG-t folyamatosan regisztráltuk. A patkányokat mesterségesen, géppel lélegeztettük. Az LFP-t bilaterálisan regisztráltuk az S1 kéregből makroelektródák segítségével. A referencia elektróda a nyakszirti lebeny fölött volt. Az LFP-t 0,1 Hz-1200 Hz között szűrtük, 100-szorosáre erősítettük (Cyber-Amp 380; Molecular Devices). A jelet 25 kHz-en digitalizáltuk.
In vivo 24 csatornás elvezetés rétegelektróda segítségével
Kísérleteink során 24 csatornás rétegelektródát használtunk soksejt aktivitás elvezetésére és farmakonok beadására. A 24 csatornás elektródán 100 μm-ként helyezkedtek el az elvezetési pontok, melyek átmérője 25 μm, a hegy átmérője pedig 350 μm volt. Az elektróda belsejébe vezetett 50 μm átmérőjű belső cső farmakonok beadását tette lehetővé. A farmakon beadási pont a 9. és a 10. elvezetési pont közé esett (32. ábra). A drogadagolás (2 μmol-os bicuculline oldat, Sigma-Aldrich, Budapest, HU) egy 5 μl-es Hamilton fecskendő (Hamilton Company, Reno, NV) és egy 250 μm-es Tygon cső segítségével történt (Sanit-Gobain, Akron, OH). A rendszert drogadagolás előtt gondosan többször átöblítettük, hogy kimossuk a gyakran keletkező buborékokat. A soksejt-aktivitást 200 Hz és 5 kHz között szűrtük, a mintavételi frekvencia 20 kHz volt
(LabView,
National
Instruments,
merevlemezen tároltuk az analízishez.
56
Austin,
TX).
A
regisztrált
adatokat
elvez etési hely * beadási * helyek
32. ábra: 24 csatornás elektróda képe A 24 csatornás elektródán 100 μm-ként helyezkedtek el az elvezetési pontok, melyek átmérője 25 μm, a hegy átmérője pedig 350 μm volt. Az elektróda belsejébe vezetett 50 μm-es belső cső volt alkalmas drog beadására. A drog beadási pont a 9. és a 10. elvezetési pont közé esett.
In vivo juxtacelluláris egysejt-elvezetés és jelölés
In vivo egysejt-aktivitást vezettünk el a ventrális poszteriolaterális-, a ventrális poszteriomediális magokból, vagyis a ventrobazális thalamicus magból, a poszterior thalamicus magból illetve a zona incerta (ZI) és az anterior pretectum (APT) területéről üveg mikroelektródák (in vivo impedancia 15-60Ω) segítségével, melyeket 1,5 mm külső átmérőjű, 0,86 mm belső átmérőjű boroszilikát üvegkapillárisokból húztunk, majd 0,5 M NaCl és 2 %-os neurobiotin oldatával töltöttünk meg. Az elektródákat piezoelektromos mozgató segítségével juttattuk a mély agyrégiókba, így lehetőségünk nyílt az elektródák akár nanométerespontosságú léptetésére is. Az elvezetett sejt akciós potenciáljait erősítést (100-szoros) és szűrést (0,1 Hz – 5 kHz ill. 100 Hz - 5kHz) követően 16.6 kHz-el mintavételeztük a további jelfeldolgozás céljára. A regisztrált sejtek elvezetése Pinault (Pinault 1996) által leírt juxtacelluláris technika segítségével történt. Az elvezetett sejtnek egyre növekvő erősségű négyszögjel áramimpulzust adtunk, és az áramerősséget a neuronális tüzelés modulációjáig növeltük. A tüzelés modulációja 2 nA-15 nA közé esiő áraminjekcióknál következett be (33. ábra). Ha a
57
sejt a négyszögjelek alatt tüzelt, akkor az injektált áram hatására az üvegpipettában lévő neurobiotin a sejtbe jutott, lehetőséget teremtve a sejt pontos elhelyezkedésének meghatározására. Így a perfúziót és a metszést követően hisztológiai eljárásokkal megadható a sejt pontos lokalizációja.
33. ábra: A juxtacelluláris elvezetés-jelölés technika A jelölőanyagot 200 ms-os on-off áramadásokkal jutattjuk be az idegsejtbe. Az áramadás alatt a sejt ritmikusan, az „áramadás ütemére” tüzel.
Adatanalízis
Burst-detekció és burst-analízis
A regisztrált egysejtelvezetések burst-analízise az interspike intervallumok egydimenziós Ward-féle klaszteranalízisén alapult (Hangya és mtsai 2008). Feltételeztük, hogy a legrövidebb ISI-t tartalmazó klaszter feleltethető meg az intraburst intervallumoknak. A klaszterezést iteratív módon végeztük, a klaszterek számát kettőtől az elméleti maximumig növeltük. A legkisebb burstön belüli frekvenciát a klaszterek számának függvényében ábrázoltuk (34. ábra).
58
34.ábra: A minimális intraburst frekvencia a klaszterszám függvényében A kiválasztott „ugrást” pirossal jelöltük. Ebben az esetben az 14. clustert létrehozo klaszterezést tekintettük megfelelőnek. A burstön belüli frekvenciák meghatározásához nem egy konkrét értéket választottunk a függvényen, hanem meghatároztuk azt a frekvenciát, amit már biztosan nem tekintettünk burstön belüli frekvencia értéknek (pl. thalamocorticalis relésejtek esetében kb. 80 Hz). Ezután a legnagyobb olyan ugrást választottuk függvényen, amely már nagyobb volt az általunk meghatározott határértéknél (pl. thalamocorticalis relésejt esetén > 80 Hz) (34. ábra), majd a legnagyobb ugrást követő klaszerértéket választottuk ki. Az ennek megfelelő klaszterezésben a legkisebb interspike intervallumot tartalmazó klaszter csak az intraburst intervallumokat tartalmazta. A klaszteranalízissel kiválasztott burstöket a Matlab 7.5-ben írt program kiemelte, így lehetővé tette a kiválasztott burstök ellenőrzését és lehetőséget adott a klaszteranalízis módosítására. Néhány esetben a burstök egyedi ellenőrzése alapján valóban szükséges volt módosítani a legkisebb interspike intervallum függvényen általunk kiválasztott értéken.
35.ábra: A klaszteranalízis során nyert adatok megjelenítése A klaszteranalízis során elkülönített burstöket a szoftver átszínezte, így lehetőséget biztosított a kapott eredmények utólagos ellenőrzésére. Az ábrán a burstben lévő akciós
59
potenciálok pirossal, a burstön kívüli akciós potenciálok kékkel jelentek meg (Ward és Werner 1963).
Fázisanalízis
Az akciós potenciálok lassú hullámú LFP aktivitáshoz való (< 4 Hz) és béta akvtivitáshoz való (10 Hz – 80 Hz) fáziskapcsoltságát is meghatároztuk. A preferált szöget az adott akciós potenciál elhelyezkedése adta meg az LFP Hilberttranszformációjával kapott jelen (Gabor 1946, Hurtado és mtsai 2004). Az LFP-t először 5 Hz-nél szűrtük egy aluláteresztő szűrőt használva. A 250 ms-nál rövidebb ciklusokat, valamint középérték + 2 SD-nél alacsonyabb amplitúdójú ciklusokat kizártuk az analízisből. A burstöket – a burstön kívüli akciós potenciálokhoz hasonlóan – egyedi eseményeknek tekintettük, és a burst első akciós potenciáljával vettük figyelembe. Az átlagos irányt az átlagos szöggel, a szórást az átlagos vektor hosszal jellemeztük (0: nagy szórás; 1: kis szórás). Az átlagolt fázishisztogramokat az egyedi eloszlásokból random kiválasztott 100 elemből számoltuk. 100 elemnél kevesebb esemény esetén nem számoltunk fázisértékeket. Az akciós potenciálok béta frekvenciás LFP aktivitásához (10 Hz - 20 Hz) való fáziskapcsoltságát hasonló módon határoztuk meg.
Autokorreláció, keresztkorreláció – MUA index, STA index
Az akciós potenciálokat MATLAB szoftver (MathWorks, Natick, MA) segítségével detektáltuk és analizáltuk. A frekvenciaspektrumokat Welch módszerével közelítettük , (Welch 1967) 2.44 Hz felbontásban. A zona incerta (ZI) és thalamocorticalis (TC) sejtek kérgi modulációjának erősségét kétfajta mérőszámmal határoztuk meg. Az akciós potenciál által időzített helyi kérgi mezőpotenciál átlagot (spike triggered average, STA) számoltunk a ZI és TC sejtek esetén. Az egyik mérőszám a normalizált STA 0 ms-beli csúcsának alapvonaltól való távolsága (STA index) volt. Meghatároztuk a ZI- és TC sejtek és a kérgi soksejtaktivitás közti keresztkorrelogramot (MUA-CCG). A második mérőszám e normalizált keresztkorrelogram standard deviációja volt
60
(MUA-index). Az auto- és keresztkorrelációkat 10 ms időablakokban számoltuk. E mérőszámok relevanciáját az adja, hogy az STA és a MUA-CCG 0 ms-beli értéke a kéreg és a ZI, illetve TC sejt szinkronizációjától függ.
Az egysejtaktivitás és a kérgi LFP kapcsolata 5-9 Hz-es oszcillációk során
A wavelet analízis során az LFP-t alulmintavételeztük 25 kHz-ről 250 Hz-re és a diszkriminált akciós potenciálokat folyamatos jellé konvertáltuk, majd alkalmaztuk a wavelet-transzformációt (Torrence és Compo 1998). Az 5-9 Hz-es oszcillációk kiválasztására a megfelelő frekvencia sávba eső wavelet amplitúdó értékek összegét vettük az LFP wavelet 5-9 Hz-es frekvenciasávjában. Az összegzett wavelet amplitúdóérték középértéke +2 SD-t választottuk a küszöbértéknek. A fenti eljárást az egysejt-aktivitás wavelet felbontására, valamint a két jel cross-wavelet spektrumára is elvégeztük (Borhegyi és mtsai 2004). Annak érdekében, hogy képet kaphassunk az 5-9 Hz-es moduláció mértékről egy adott időpontban, az 5-9 Hz-es frekvenciasávba eső wavelet amplitúdó értékek összegét elosztottuk az összes amplitúdóérték összegével. Az 5-9 Hz-es és nem 5-9 Hz-es szakaszok autokorrelogramjának spektrumát a Welch módszerrel közelítettük (Welch 1967). Annak érdekében, hogy a sejtszintű modulációkat meghatározhassuk a ZI és TC sejtek esetén, az LFP 5-9 Hz-es és nem 5-9 Hz-es szakaszokat Mann-Whitney-U teszttel hasonlítottuk össze mind relatív, mind az abszolút 5-9 Hz-es amplitúdó értékek esetén. Kontrollként gyors oszcillációkkal jellemezhető LFP szakszokat használtunk.
61
Hisztológia
Perfúzió Az elektrofiziológiai kísérletek elvégzése után az állatokat perfundáltuk (fiziológiás sóoldatos átmosás után, 4% paraformaldehid, 0,05 % glutáraldehid, 15 % pikrinsav oldatával), majd az agy kiemelése után 50 μm vastag koronális metszeteket készítettünk Vibrotome segítségével. A metszeteken 2-es típusú vezikuláris glutamát transzporter (vGLUT2; 1:3000, Synaptic Systems; Cat. No. 135 102) immunfestést végeztünk. Normál ABC protokoll után a vGLUT2 megjelenítéséhez DABNi-t használtunk. Juxtacellulárisan jelölt sejtek esetén az 50 μm-es koronális metszeteket kettős fluoreszcens immunfestésnek vetettük alá, hogy megjelenítsük a neurobiotinnal töltött sejtet, és kimutassuk annak lehetséges PV-tartalmát., majd a neurobiotint DABNi kromogén segítségével is előhívtuk végül, majd ozmiumos kezelés és dehidrálás után Durcupan-ba
ágyaztuk
előkészítve
a
további
fény-és
elektronmikroszkópos
vizsgálatokra.
A jelölt sejtek háromdimenziós rekonstrukciója
A jelölt sejtek dendritfáját camera lucida és Neurolucida 5.2 (MBF Bioscience, Magdeburg,
Németország)
program
segítségével
rekonstruáltuk.
A
dendritfa
analíziséhez az alábbi zsugorodási korrekciókat használtuk: Durcupan beágyazásnál: xy tengely, 1,1; z-tengely, 2,2; zselatinos beágyazásnál: x-y tengely, 1,1; z-tengely, 5. A program segítségével meghatároztuk a teljes dendritfa, az egyes dendritek, az egyes dendritszegmensek hosszát és a dendrogramot. Ezen kívül a 3D analízis lehetőséget biztosított a kirajzolt sejtek minden irányban lévő kiteredésének vizsgálatára.
62
EREDMÉNYEK
Az elsőrendű- és a magasabbrendű thalamicus magok elektrofiziológiai tulajdonságainak jellemzése
Régóta ismert, hogy a thalamicus relésejtek két különböző, burst, illetve tonikus módban képesek tüzelni (Jahnsen és Llinas 1984a), és ez a tulajdonság, valamint a burstök struktúrája nagymértékű homogenitást mutat az egyes thalamicus magok és az egyes vizsgált emlősfajok között (Llinas és Steriade 2006). Néhány nemrég megjelent tanulmány arra utal azonban, hogy az elsőrendű és a magasabbrendű thalamicus magok elektrofiziológiai tulajdonságai különbözhetnek (Ramcharan és mtsai 2005, Landisman és Connors 2007). Ezért kísérleteinkben célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a különböző elsőrendű-, illetve magasabbrendű magok tüzelési mintázatát altatott patkányban in vivo. Kísérleteinkben 38 relésejtet vezettünk el ketamin/xylazin altatásban lévő Wistar felnőtt patkányokon juxtacelluláris elvezetési módban (Pinault 1996). Az elvezetést követően a sejteket a juxtacelluláris jelölés technika segítségével megjelöltük, így hisztológiai festést követően azonosíthattuk az elvezetett idegsejteket. A pontos lokalizációt a Paxinos atlasz (Paxinos és Watson 1998) segítségével végeztük, valamint vGlut2 immunfestést végeztünk, amely a thalamusba érkező serkentő óriásterminálisok szelektív markere (lásd Bevezetés fejezet), és festődése segítséget nyújt a maghatárok meghatározásában. Egy állatban több nyomvonalon is vezettünk el és jelöltünk meg sejteket, lehetőség szerint egymástól távoli elvezetési pontokon. Néhány esetben lehetőségünk nyílt az elvezetett, de sikertelenül megjelölt sejtek lokalizációjára is, az azonos nyomvonalban elvezetett és megjelölt sejtek elhelyezkedése alapján. Kísérleteinkben az elsőrendű szomatoszenzoros ventrobazális komplexben (VB): a ventrális poszteriomediális thalamicus magban (VPM) és a ventrális poszteriomediális thalamicus magban (VPL), valamint a magasabbrendű poszterior thalamicus magban (Po) végeztünk egysejt-elvezetést. Mivel a Po és a VPM határán lévő jelölt sejtek gyakran átnyújtották dendritjeiket a szomszédos régióba, így úgy határoztunk, hogy kijelölünk egy kb. 300 μm-es
63
határzónát, és az itt található sejteket külön csoportként kezeltük, és a továbbiakban PoVPM csoportnak hívtuk (36. ábra).
Po
VPM 100 um
36. ábra: vGlut2 festés a PoVPM határterületről Egy koronális metszeten a PoVPM határterület látható két jelölt sejttel. Látható, hogy az egyik sejt sejtteste még inkább a VPM-ben helyezkedik el, míg a dendritfa jelentős része inkább a Po-ban van. Mérőléc: 100 μm. Po: poszterior thalamicus mag; VPM ventrális poszteromediális thalamicus mag. Összességében tehát három csoportot különítettünk el, 14 sejtet vezettünk el a Po, 17-t VB a, 8-t a PoVPM területéről (37. ábra). 37. ábra: A juxtacellulárisan elvezetett sejtek elhelyezkedése a thalamusban LDMR:
laterodorzális
mediorosztrális
rész;
mag LDVL:
laterodorzális mag ventrolaterális rész; LDDM: laterodorzális mag dorzomediális
64
rész;
LPLR:
lateroposzterior mag laterorosztrális rész; LPMR: laterodorzális mag mediorosztrális rész; CL: centrolaterális mag; MDL: mediodorzális mag laterális része; MDC: mediodorzális mag kaudálisis része; VPM: ventrális poszteromediális mag; VPL: ventrális poszterolaterális mag; VM: ventromediális mag; VL: ventrolaterálsi mag; PC: paracentrális thalamicus mag; Rt: thalamicus reticularis mag;DLG: oldalsó térdestest; VLG: ventrális térdestest. Mérőléc: 1mm.
A Po, VB és PoVPM sejtek tüzelési sajátságainak jellemzése
Ismert, hogy a burst mód fontos szerepet tölt be a thalamocorticalis információátvitelben. Nemrégiben igazolták, hogy az egyes burstökben lévő későbbi akciós potenciálok is képesek posztszinaptikus válasz kiváltására, ha a megelőző akciós potenciálok sikertelenek voltak, így a burstön belüli későbbi akciós potenciálok is képesek befolyásolni a kérgi célterület sejtjeinek működését (Swadlow és Gusev 2001). Ketamin/xilazin altatásban az elvezetett relésejtek nagyrészt burst módban tüzeltek, ezt azonban időközönként tonikus periódusok szakították meg. Annak érdekében, hogy különbséget tegyünk a különböző magok tüzelési sajátságai között, egy, az interspike intervallumok
(ISI-k)
egydimenziós,
hierarchikus
klaszteranalízisén
alapuló
matematikai analízist alkalmaztunk. A legkisebb ISI-ket tartalmazó klasztert tekintettük burstöknek. A burstöket egy Matlab 7.5 szoftver segítségével írt programmal analízáltuk, majd az analízis után ellenőriztük azokat (lásd Módszerek fejezet). Az analízis során vizsgáltuk a tüzelési sajátságokat jellemző paramétereket számoltunk, mint a burst események frekvenciáját, az átlagos tüzelési frekvenciát, valamint egy burstiness-nek nevezett paramétert, amely a burstökben résztvevő akciós potenciálok arányát jelenti az összes akciós potenciálhoz képest. Meghatároztuk a burst tulajdonságokat is, mint az intraburst frekvencia, az intraburst tüskeszám és a burst hossz (38. ábra) (lásd Módszerek fejezet).
65
38.
ábra:
A
számolt
burst-tulajdonságok
ábrázolása
egy
VPM
sejt
kisüléssorozatán Az ábra az analízis során számolt burst-paramétereket ábrázolja. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a VB (medián: 423,16 Hz) és a PoVPM határsejtek (418,72 Hz) szignifikánsan magasabb intraburst frekvenciával tüzeltek, mint a Po sejtek (341,68 Hz) . Az intraburst tüskeszám a VB (3,69) és PoVPM (3,77) sejtek esetén szintén szignifikánsan magasabbnak bizonyult a Po sejtekénél (2,67). Érdekes módon a PoVPM sejtek átlagos tüzelési frekvenciája (6,24 Hz) és a burstök átlagos gyakorisága (1,49 Hz) is szignifikánsan magasabb volt a Po sejtekénél (tüzelési frekvencia: 3,88 Hz, burst frekvencia: (1,22) és VB (tüzelési frekvencia: 5,82 Hz, burst frekvencia: 1,44) sejtekénél (38. ábra, 39. ábra, 1.táblázat).
66
39. ábra: A burst-tulajdonságok Po, VB és PoVPM sejtek esetén Látható, hogy a Po sejtek intraburst frekvenciája és intraburst tüskeszáma szignifikánsan különbözik a VB és PoVPM sejtekétől, míg a bursthossz nem mutat szignifikáns eltérést (*). Így megállapítható, hogy a VB és PoVPM sejtek burstön belüli magasabb frekvenciával és a burstön belül több akciós potenciállal tüzelnek.
67
40. ábra: A tüzelési tulajdonságok Po, VB és PoVPM sejtek esetén. Látható, hogy az átlagos tüzelési frekvencia, a burstök gyakorisága és a burstiness tekintetében kizárólag a PoVPM sejtek magas burstfrekvenciájában tapasztalható szignifikáns eltérés Po sejtekéhez képest (*).
68
1. táblázat: A Po, VB és PoVPM sejtek burst-tulajdonságai Intraburst
Intraburst
Burst
Tüzelési
Burst
Burstiness
frekvencia
tüskeszám
hossz
frekvencia
frekvencia
(Hz)
(db)
(ms)
(Hz)
(Hz)
medián
medián
medián
medián
medián
medián
Po
341,68*
2,67*
5,86
3,88
1,22
0,934
VB
423,16
3,69
6,21
5,82
1,44
0,960
PoVPM
418,72
3,77
7,00
6,24
1,49
0,941
* p<0,05.
A Po, VB és PoVPM sejtek interspike intervallum hosszainak (ISI) válzotása a burstön belüli akciós potenciálok függvényében
A burst-tulajdonságok jobb összehasonlítása érdekében az egyes sejttípusok esetén ábrázoltuk a ISI-k hosszát a burstben elfoglalt helyük függvényében (41. ábra). Megállapiíthatjuk hogy az ISI-k dinamikája nem mutatott szignifikáns különbséget az egyes sejttípusok között.
69
41. ábra: Az ISI változása a burstön belüli akciós potenciálok függvényében Po, VB és Po VPM sejtek esetén Az ábrán látható, hogy az egyes sejttípusok a burstök dinamikájában nem mutattak szignifikáns eltérést. Megállapíthatjuk tehát, hogy az elsősorban a sejt belső (intrinsic) tulajdonságai által meghatározott burst-jellegzetességekben különböznek a Po és VB sejtek. A határsejtek tulajdonságai az elsőrendű magvakéival egyeznek meg.
70
A Po, VB, és PoVPM sejtek fázisviszonyainak jellemzése a lassú hullámú kérgi aktivitás Up state-jeihez képest
Az agykéreg és a thalamus kapcsolatának jellemzésére a thalamicus egysejtelvezetéssel egyidőben agykérgi LFP-t vezettünk el a primér szomatoszenzoros agykéregből, így lehetőségünk nyílt annak vizsgálatára, hogy a különböző thalamicus magvakban elhelyezkedő relésejtek tüzelése a kérgi lassú hullámú aktivitás Up statejének melyik fázisát preferálja. A relésejtek tonikus tüzelés alatti fázisviszonyainak analízise nem okoz elméleti problémát, azonban a burst aktivitás fáziskapcsoltságának vizsgálatára több módszer is kínálkozik. A matematikai analízishez azt a módszert választottuk, miszerint burst aktivitás esetén a burst fáziskapcsoltságot kizárólag a burstben szereplő első akciós potenciál fázisával jellemeztük, így a statisztikai analízishez a burstök fázisának számolásakor a burstben szereplő első akciós potenciált vettük figyelembe (42. ábra) (lásd Módszerek fejezet). Így elkerültük a fázisszög meghatározásának súlyozását a burstben lévő akcióspotenciálok számával.
42. ábra: A fázispreferencia számolásának elve Az LFP-t 5Hz-es aluláteresztő szűrővel szűrtük, és ehhez viszonyítjuk az akciós potenciálok fázisát. Fázispreferenciának
a
preferált
fázis
fáziskonzisztenciának a szórást tekintjük.
71
szöget,
43.
ábra:
A
lassú
hullámú
oszcillációkhoz
viszonyított fázispreferencia és fáziskonzisztencia az egyes Po, VB és PoVPM sejtek esetén Az egyes fázisdiagramok az adott sejtcsoport összes sejtjét egyesével ábrázolják. Egy vektor egy sejtnek, a vektor által bezárt szög a preferált fázisnak, a vektor hossza pedig a fáziskonzisztenciának felel meg. A 0° az Up state csúcsát jelenti. Látható, hogy a Po és PoVPM sejtek az Up state felszálló szárán, míg a VB sejtek inkább az Up state csúcsán tüzelnek. A fáziskonzisztencia (vektorhossz) értékek változóak. Figyeljük meg, hogy a fáziskonzisztencia minden csoportban igen variábilis. Tehát a Po sejtek esetén – melyek agykérgi driver bemenetet kapnak – sem feltétlenül tapasztalható erős fáziskapcsolatság a kérgi lassú hullámú aktivitáshoz.
72
44. ábra: Egy-egy sejtcsoport lassú hullámú
aktivitáshoz
viszonyított
fázishisztogramjai a Po, VB és PoVPM sejtek esetén Az
egyes
sejtcsoportok
átlagolt
fázishisztogramjai mutatják, hogy a Po és PoVPM
sejtek
fáziskapcsoltsága
szignifikánsan eltér a VB sejtekétől. Figyeljük meg a magasabb értékeket a Po és
PoVPM
határsejteknél
a
negatív
szögértékekkel jellemzett fázisban (Up state felszálló szára). Az átlagos fázisszög és átlagos vektorhossz értékeket a 2. táblázat tartalmazza.
73
45. ábra: A lassú hullámú oszcillációkhoz átlagolt
viszonyított
fázispreferencia
és
fáziskonzisztencia a Po, VB és PoVPM sejtek esetén Az összegzett ábrán az egy adott vektor által bezárt szög az
adott
sejtcsoport
átlagosan mutatja
preferált az
által szöget
agykérgi
lassú
hullámú aktivitás csúcsához képest. Az Up state csúcsát a 0° jelenti. A vektor hossza a fáziskonzisztencia mértékét fejezi ki. Po piros; VB kék; PoVPM zöld. Az átlagolt fázishisztogramok alapján megállapíthatjuk, hogy a VB sejtek által preferált fázis 13,074° volt, míg a Po sejtek a -35,71° fázist preferálták. Tehát míg a VB sejtek a kérgi lassúhullámú aktivitás Up state-jeinek csúcsa körül, addig a Po sejtek inkább az Up state-ek felszálló ágán tüzeltek. A PoVPM sejtek fázispreferenciája (44,67°) a Po sejtekéhez volt hasonló, azonban fáziskonzisztenciájuk populációs szinten valamennyivel kisebb volt. (45. ábra, 2. táblázat) 2. táblázat: Fázispreferencia és fáziskonzisztencia a lassú hullámú oszcillációkhoz képest Po, VB és PoVPM sejtek esetén A táblázat a 45. ábra adatait tartalmazza. A Po, VB és PoVPM csoportok p < 0.001 szignifikancia szinten páronként eltérnek egymástól. Átlagos szög
Átlagos vektor hossz
Po
-35,71°
0,482
VB
13,074°
0,418
PoVPM
-44,67°
0,344
74
A fázis tulajdonságok és az intraburst tüskeszám kapcsolata
A következőkben megvizsgáltuk, hogy az elsőrendű-, illetve a magasabbrendű thalamicus magok fázispreferenciája miképp változik a burstön belüli tüskeszámok növekedésével. Eredményeink azt mutatják, hogy egy adott Po sejtnél a több akciós potenciált tartalmazó burst az Up state szignifikánsan korábbi fázisában következik be. Ez átlagosan 18,08° fáziselőzést jelent a 3 vs. 2 tüskét tartalmazó burstök között, 8,27°-ot a 4 vs.3 és 5,23°-ot az 5 vs. 4 akciós potenciált tartalmazó burstök között. A megfelelő értékek a VB-re -3,28°; -2,24° és -10,78°. A 6 akciós potenciált tartalmazó burstök átlagosan 8,85°-kal tüzelnek korábban az 5 akciós potenciált tartalmazó burstökhöz képest, míg a 7 a akciós potenciált tartalmazó burstök átlagosan 29,49°-kal előzik meg 6 akciós potenciált tartalmazó burstöket a lassú hullámú oszcillációk fázisához viszonyítva. A PoVPM határsejtekre ugyanezek az értékek -19,92°-nak, -22,07°-nak,14,21°-nak, -14,87°-nak és -14,87°-nak adódnak.
75
46. ábra: Egyre több akciós potenciált tartalmazó burstok egymáshoz viszonyított fázispreferenciája Az ábrán az egyre nagyobb tüskeszámmal jellemezhető burstök fázispreferenciája látható. Minden ábra esetén az első oszlop a 3 tüskét tartalmazó burst átlag fázis és a 2 tüskét tartalmazó burst átlag fázis különbsége, ezt követi a 4 tüskét tartalmazó burst átlagos fázis és a 3 tüskét tartalmazó burst átlagos fázis különbsége, stb. Minden pont egy sejt átlagolt értékére vonatkozik. Az ábrán jól látszik, hogy a Po és PoVPM sejtek a burstön belüli tüskeszám növekedésével egyre inkább az Up state-ek felszálló szárán tüzelnek (negatív különbség érték), míg a VB sejtek a burstön belüli tüskeszám
76
növekedésével nem változtatják a fázis preferenciájukat szignifikánsan. Az ábra az eredményeket az 5 tüske/burst – 4 tüske/burst adatokig mutatja. A magasabb burstön belüli akciós potenciállal jellemezhető burstökre jellemző eredményeket a kis elemszám miatt nem mutatjuk. Eredményeink alapján elmondható, hogy a Po és PoVPM sejtek sejtek a burstön belüli tüskeszám növelésével egyre inkább az Up state-ek kezdeti, felszálló szárán tüzelnek, míg a VB fázistulajdonságai az intraburst tüskeszám növekedésével nem változtak szignifikánsan.
77
A Po, VB, és PoVPM sejtek fázisviszonyainak jellemzése az agykérgi béta aktivitáshoz képest
A lassú hullámú oszcillációk során elvezetéseinkben az LFP aktív fázisában béta frekvenciás aktivitás is megfigyelhető volt. Ezért a következőkben megvizsgáltuk az egyes sejtek fázis-tulajdonságait a kérgi béta aktivitáshoz viszonyítva. 47. ábra: A béta oszcillációkhoz viszonyított átlagolt fázispreferencia és fáziskonzisztencia az egyes Po, VB és PoVPM sejtek esetén Az egyes fázisdiagramok az adott sejtcsoport összes sejtjét egyesével ábrázolják. Egy vektor egy sejtnek, a vektor által bezárt szög a preferált fázisnak, a vektor hossza pedig a fáziskonzisztenciának felel meg. A 0° a béta hullám pozitív csúcsát jelenti, a 180° a negatív csúcs (trough) jelenti. Mind a Po, mind a VB és a PoVPM határsejtek a béta hullámok negatív csúcshoz közel tüzeltek. A fáziskonzisztencia nem mutatott szignifikáns eltérést.
78
48.
ábra
Egy-egy
sejtcsoport
aktivitáshoz
béta
viszonyított
fázishisztogramjainak középértéke a Po, VB és PoVPM sejtek esetén Az
egyes
sejtcsoportok
fázishisztogramjai
sem
átlagolt mutatnak
szignifikáns különbséget, és jól látszik, hogy a sejtek a béta hullámok negatív csúcsot preferálják. Az átlagos fázisszög és átlagos vektorhossz értékeket a 3. táblázat tartalmazza.
79
49. ábra: A lassú hullámú oszcillációkhoz átlagolt
viszonyított
fázispreferencia
és
fáziskonzisztencia a Po, VB és PoVPM sejtek esetén
Átlagos szög
Átlagos vektor hossz
Po
126,08°
0,198
VB
137,94°
0,128
PoVPM
118,14°
0,204
3. táblázat: A Po, VB és PoVPM sejtek fáziskpcsoltsága és fáziskonzisztenciája a béta oszvillációkhoz képest Minden
sejttípus
a
béta
oszcillációk
negatív
csúcsa
körül,
hasonló
fáziskonzisztenciával tüzelt. Eredményeink alapján elmondható, hogy a Po, VB és PoVPM sejtek fáziskapcsoltságában a kérgi béta aktivitáshoz képest nem mutatható ki szignifikáns különbség.
80
A ZI sejtek elektrofiziológiai tulajdonságainak jellemzése
A kísérletek során előforduló LFP állapotok jellemzése
Uretán altatásban az altatás mértéke spontán változást mutatott a kísérletek alatt. Felszínes alvás esetén az LFP-t alacsony amplitúdójú, gyors oszcillációk jellemezték a béta és gamma sávban. Ebben az állapotban az alacsony amplitúdójú gamma oszcillációkat kivéve az agykéreg nem mutatott jelentős szinkronizált aktivitást. Mély alvásban az LFP nagy amplitúdójú oszcillációt mutatott a delta tartományban (1-4 Hz) (50. ábra).
A ZI sejtek tüzelési mintázata uretán altatásban – az egysejt-aktivitás és a kérgi lassú hullámú oszcillációk kapcsolata
Harmincöt ZI sejtből vezettünk el juxtacelluláris módban, majd jelöltünk a juxtacelluláris jelölési technika segítségével (Pinault, 1996). 21 sejt esetében egyértelműen meghatározható volt a megjelölt sejt és az elvezetés kapcsolata. A maradék 14 esetben az elvezetett sejt pozícióját az ugyanabból az állatból elvezetett és megjelölt sejtek koordinátái alapján határoztuk meg. 32 sejtből 21 a ZI dorzális részén, 7 a ventrális részen, 3 a rosztrális szektorban, míg 1 a kaudális szektorban helyezkedett el. Három sejt esetében nem tudtuk meghatározni, hogy azok a ZI mely szektorába estek. A ZI sejtek tüzelési frekvenciája széles sávban, 0,08 Hz és 41,67 Hz között változott (középérték ± SD: 10,58 Hz ± 11,07 Hz; 45. ábra). A gyors oszcillációkkal jellemezhető LFP alatt a sejtek jellemzően tonikus tüzelést mutattak vagy irregulárisan tüzeltek. Időnként előfordultak 70 Hz körüli magas frekvenciás tranziensek, azonban csak igen ritkán, amit a unit autokorrelogram jól mutat (nincs központi csúcs rövid latenciával). A tüzelési mintázat nem mutatott összefüggést az agykérgi LFP-vel vagy az agykérgi soksejt-aktivitással (MUA-val).
81
Húsz ZI sejtet vizsgáltunk szinkronizált LFP alatt. Az LFP autokorrelogramokat és a kérgi MUA autokorelogramokat használtuk, hogy stabil és összehasonlítható LFP szakaszokat válasszunk ki. Az agykérgi lassú hullámú aktivitás megjelenésével a ZI sejtek többsége ritmikus egyszeres akciós potenciálokkal vagy azok csoportjaival kezdett tüzelni (50A ábra), amely fáziskapcsoltságot mutatott a kérgi lassú hullámú aktivitással. A moduláció mértéke sejtenként változott. Az akciós potenciálok tüzelési frekvenciája sosem haladta meg az 50 Hz-et. E tulajdonság egyértelműen különbözik a thalamocorticalis relésejtekétől, mivel azok hasonló körülmények között magas frekvenciás burst módban (300-500 Hz) tüzelnek. Azok a ZI sejtek, amelyek aktivitása változott az agykérgi lassú hullámok megjelenésével, a kérgi Up state-ek alatt tüzeltek. A tüzelési frekvencia nem csökkent jelentős mértékben a lassú hullámú oszcillációk alatt a gyors gamma frekvenciás oszcillációkhoz képest (3,88 Hz ± 2,79 Hz vs. 6,33 ± 4,79 Hz). Annak érdekében, hogy meghatározzuk a ZI sejtek tüzelésének időzítését a kérgi lassú hullámú aktivitáshoz viszonyítva, keresztkorrelációt végeztünk a ZI sejtek egysejt aktivitása és a kérgi soksejt-aktivitás között. Az átlagos csúcs a keresztkorrelogramban 1,09 ms-nál adódott kis varianciával (±1,76 ms), amely erős kapcsoltságot feltételez a ZI sejtek tüzelése és az agykérgi MUA, valamit az agykérgi lassú hullámú oszcillációk között (50. ábra). Négy ZI sejt esetében a tonikus tüzelés nem változott a kérgi lassú hullámok megjelenésével, vagyis ezen sejtek tüzelése tonikus maradt (50. ábra).
82
50. ábra: A ZI sejtek tüzelési mintázata uretán altatásban Az A) ábra egy reprezentatív fázikus ZI sejt, a B) egy tonikus ZI sejt tüzelését mutatja lassú hullámú LFP aktivitás (A2, B2) és gyors oszcillációk alatt (A1, B1). Aa, Ba) LFP autokorrelogram; Ab,Bb) Az LFP-k teljesítmény spektruma (power spektrum); Ac,Bc) STA; Ad,Bd) A kérgi soksejt-aktivitás és a ZI egysejt-aktivitás keresztkorrelogramja. A fekete vonalak a lassú hullámú LFP, a szürke vonalak a gyors oszcillációk alatti adatokat jelzik. A1 és B1 esetében mind a fázikus, mind a tonikus ZI sejt egyszeres akciós potenciálok irreguláris sorozatával tüzel, amely független az agykérgi aktivitástól, míg a lassú hullámú LFP alatt a fázikus sejt tüzelése az agykérgi Up stateekhez kapcsoltan, a lassú hullámok negatív csúcsával megegyező időben történik. A tonikus sejt tüzelését a lassú hullámú kérgi aktivitás megjelenése nem befolyásolta. UNIT: egysejt-aktivitás; MUA: soksejt-aktivitás, LFP: agykérgi mezőpotenciálok.
83
Erősen modulálható, fázikus és nem modulálható, tonikus sejtek akár egymáshoz nagyon közel, ugyanabban a nyomvonalban (track) is megtalálhatóak voltak. A tonikus sejtek tüzelési frekvenciája szignifikánsan magasabb volt felszínes altatásban, a gyors oszcillációkat tartalmazó LFP alatt, mint a fázikus
sejtek
tüzelési
frekvenciája
(rendre 19,8 ± 8,81 Hz vs. 6,33 ± 4,79 Hz, p < 0.0001, Kétmintás t-próba), és a lassú hullámok megjelenésének hatására kisebb mértékű frekvencia csökkenéssel reagáltak, mint a fázikus sejtek (rendre 16,9 % vs 75,8 %) (51. ábra). 51.
ábra:
A
ZI
sejtek
tüzelési
frekvenciájának változása az LFP-vel A tüzelési frekvencia változása tonikus (szaggatott vonal) és fázikus (egyenes vonal) ZI sejtek esetén a lassú hullámú LFP és a gyors oszcillációk között. Egy vonal egy sejtet jelöl. A tonikus sejtek magasabb
frekvenciával
és
kevésbé
modulálható módon tüzeltek.
A különböző szektorokban elvezetett ZI sejtek tüzelési mintázatának összehasonlítása
Az általunk elvezetett sejtek esetén a ZI két szektorából, a ventrális-, illetve dorzális szektorból elvezetett sejtek aktivitása nem mutatott jelentős különbséget. Mindkét szektor hasonló heterogenitást mutatott. Mind a fázikus sejtek, melyek modulációt mutattak tüzelési frekvenciájukban a kérgi lassú hullámú aktivitás megjelenésére, mind a tonikus sejtek, melyeket nem modulált a kérgi lassú hullámú oszcilláció, megtalálhatóak voltak mind a dZI, mind a vZI területén.
84
A vZI neuronok tüzelési frekvenciája 0,08 Hz és 41,67 Hz közé esett agykérgi gyors oszcillációk alatt, míg 0,19 Hz és 14,53 Hz közé a lassú hullámú kérgi oszcillációk során. Ugyanez a dZI sejtek esetén 0,3 Hz - 18,4 Hz-nek és 3,1 Hz - 16,4 Hz-nek adódott. A 3 rosztrális és 1 kaudális ZI sejt a fázikus sejtekhez hasonló aktivitást mutatott.
ZI és TC sejtek tüzelési mintázatának összehasonlítása szinkronizált kérgi oszcillációk alatt Huszonegy TC sejtet vezettünk el, melyek a dorzális thalamus különböző magjaiban helyezkedtek el, úgy mint a VPM, a Po, ethmoidális mag, nucleus suprageniculatus limitans. A relésejtek tonikus tüzelést mutattak a gyors oszillációkkal jellemezhető, deszinkron LFP szakaszok alatt, és nem mutattak fáziskapcsoltságot a kérgi aktivitással. A sejtek tüzelési frekvenciája 4,29 Hz és 16,72 Hz között változott (középérték ± SD; 11,51 Hz ± 4.92 Hz) (52. ábra). Az elvezetett sejtek a kérgi lassú hullámú aktivitás megjelenésekor, a szinkronizált LFP szakaszok alatt burst módban kezdtek tüzelni. A TC sejtek tüzelésének fáziskapcsoltsága a kérgi lassúhullámú LFP-hez közepes mértékű volt, ami jól látható a közepes méretű STA amplitúdón és a zajos kérgi soksejt-aktivitás-TC egysejt-aktivitás keresztkorrelogramon (52. ábra, Ac, Ad). A kérgi lassú hullámok alatt a TC sejtek tüzelési frekvenciája 1,41 Hz ± 4,92 Hz értékre csökkent.
85
52. ábra: A thalamocorticalis relésejtek tüzelési mintázata és kapcsolata a kérgi LFPvel A1) A gyors oszillációkkal jellemezhető, deszinkron LFP szakaszok alatt a TC relésejt tonikus módban, egyszeres akciós potenciálok irreguláris sorozatával tüzelt. A2) Szinkronizált lassú oszcillációk alatt a relésejt burst módba váltott; a gyors kisüléssorozatok az LFP mély, negatív csúcsával esnek egybe. Aa) Szinkronizált állapotban (fekete) az autokorrelogram középső csúcsa a burstökre utal. Ab) Az LFP teljesítmény spektruma (power spektrum) szinkronizált és deszinkronizált állapotban. Ac) Lassú hullámú LFP aktivitás során a TC sejt tüzelése közepes mértékben volt szinkronizált az agykérgi aktivitással, amit az STA közepes amplitúdójú csúcsa mutat. Ad) Agykérgi soksejt-aktivitás és TC egysejt-aktivitás keresztkorrelogram. UNIT: egysejt-aktivitás; MUA: soksejt-aktivitás, LFP: agykérgi mezőpotenciálok. Ebben a kísérletben a szinkronizáció mértékét a kérgi aktivitással a ZI- és a TC sejtek esetén az STA indexet és a MUA indexet (lásd Módszerek fejezet). Az STA indexet ábrázoltuk a MUA index függvényében. Mivel mind a két mérőszám a helyi egysejt-aktivitás és a kérgi soksejt-aktivitás függvénye, ezért a két index korrelációt mutat. A szinkronizáció mértékét egy adott sejthez tartozó pont távolsága fejezi ki a 0 ponttól. A 0 ponttól távol eső pontok a szinkronizáció magas, míg a közel esők a szinkronizáció alacsony mértékére utalnak. Négy tonikus ZI sejt (a ZI sejtek 20 %-a) szinkronitása adódott a legkisebb értéknek. A 16 fázikus ZI sejtből 11 (A ZI sejtek 55 %-a) a TC sejtekkel megegyező szintű szinkronizációval volt jellemezhető, míg a maradék 5 fázikus ZI sejt (25 %) a TC sejtekét magasan meghaladó szinkronitást mutatott. Eredményeink alapján elmondható, hogy a fázikus ZI sejtek nagy része hasonló vagy magasabb szinkronizációt mutatott a kérgi lassú hullámú aktivitással, mint a TC relésejtek. A legkisebb mértékű kapcsoltságot a kérgi lassú hullámú aktivitáshoz a tonikus ZI sejtek tüzelése mutatta (53. ábra).
86
53. ábra: A ZI sejtek tüzelése jobban szinkronizált a lassú hullámú oszcillációkkal, mint a TC sejteké Az akciós potenciál által időzített mezőpotenciál átlag amplitúdó, STA amplitúdó (spike triggered STA average amplitude) (STA index) a kérgi soksejt-aktivitás és az egysejtaktivitás keresztkorrelogram átlagos amplitúdójának (MUA index) függvényében ábrázolva (lásd Módszerek fejezet). Mindkét paraméter az egysejt-aktivitás és az agykérgi aktivitás függvénye,és e két érték erősen függ egymástól. A fázikus ZI sejtek (teli körök) hasonló vagy magasabb STA és MUA értékeket vesznek fel, mit a TC sejtek (háromszögek). A tonikus ZI sejtek értékei a legalacsonyabbak (üres körök).
ZI sejtek tüzelési aktivitása neuroleptanalgéziában – az egysejt-aktivitás és a kérgi 5-9 Hz-es oszcillációk kapcsolata
ZI sejtek aktivitását és a rájuk érkező kérgi befolyás hatását 5-9 Hz-es oszcillációkkal jellemezhető agykérgi aktivitás során is vizsgáltuk (lásd Bevezetés fejezet). Az 5-9 Hz-es aktivitás viszonylag rövid időtartamú (0,5-2 s) és kisebb mértékű szinkronizációval jellemezhető, mint a lassú hullámú oszcilláció, ezért ez gyengébb ritmikus kérgi aktivitásának tekinthető. Neuroleptanalgézia (lásd Módszerek fejezet) alatt az 5-9 Hz-es kérgi oszcilláció váltakozik a gyors kérgi oszcillációkkal.
87
Tizenkilenc ZI sejtet vezettünk el neuroleptanalgéziában, amelyből 15 esetben elegendő adatot gyűjtöttünk az analízishez. Két állatban (4 sejt) az 5-9 Hz-nél lassabb oszcillációk domináltak. Ilyen alkalmakkor a ZI sejtek a kérgi lassú hullámokhoz fáziskapcsoltan tüzeltek, akárcsak az uretános altatás esetében. A maradék 11 közül 3 sejt lassan tüzelt (3,95 Hz-es átlagos tüzelést mutatott 5-9 Hz-es oszcillációk alatt és 4,16 Hz-es átlagos tüzeléssel volt jellemezhető a nem 5-9 Hz-es szakaszok alatt); míg 8 sejt gyors tonikus tüzelést mutatott (átlagosan 32,8 Hz-zel tüzelt az 5-9 Hz-es oszcillációk alatt és 34,8 Hz-es tüzelést produkált a nem 5-9 Hz-es oszcillációk alatt). Ezt a 8 sejtet használtuk wavelet analízishez, míg ISI eloszlást 10 sejt esetében számoltuk (8 gyors és 2 lassú sejt esetében), mivel a lassú sejtek is elégséges számú intervallummal rendelkeztek (n>100) a statisztikai összehasonlításhoz.
54. ábra: ZI sejtek tüzelése neuroleptanalgéziában A) Két egyidejűleg, a bal, illetve jobb agyféltekéből elvezetett ZI sejt és a jobb oldali S1 LFP. Jól látható, hogy míg a bal oldali ZI sejt az Up state-ek alatt, addig a jobb oldali a Down state-ek mélységi negatív csúcsa körül tüzel. Aa) A bal oldali sejt STA-ja, Ab)a jobb oldali unit STA-ja. Mindkét sejt aktivitása modulált a lassú hullámú LFP aktivitással, de a két sejt a kérgi lassú hullámok ellentétes fázisában tüzel. B) Egy másik ZI sejt tonikus módban tüzel az alacsony ampitúdójú gyors oszcillációk alatt (A gyors oszcilláció feltehetően hippocampalis eredetű théta oszcilláció, mivel ebben ezen elvezetés esetén a felszíni LFP elektróda a parietális kéreg felett volt elhelyezve). Az
88
STA (Ba) gyenge modulációt mutat, míg az autokorrelogram (Bb) a tonikus tüzelést tükrözi. LFP: helyi kérgi mezőpotenciál aktivitás, unit: egysejt-aktivitás. Három paramétert vizsgáltunk annak érdekében, hogy felfedjük a különbségeket a ZI sejtek tüzelési mintázatában az 5-9 Hz-es oszcillációk és a nem 5-9 Hz-es oszcillációk alatt, 1) összehasonlítottuk az ISI-k eloszlását, 2) az egysejt autokorrelogramokat,
3)
valamint
az
egysejt-elvezetés
5-9
Hz-es
sávjában
meghatároztuk a spektrális teljesítmény-sűrűséget (power density). Az 5-9 Hz-es szakaszok megjelenésekor a legtöbb ZI sejt megváltoztatta a tüzelését. Mind a 8 gyors sejt esetén megváltozott az átlagos tüzelési frekvencia; 5 sejt csökkentette tüzelési frekvenciáját 19,76 %-kal (tartomány: 9,65-23,8%; szupresszált csoport), 3 növelte a tüzelési frekvenciáját 14,84 %-kal (tartomány: 11,01-23,37 %; aktivált csoport). A 8 közül 6 esetben az ISI-k eloszlása szignifikánsan különböző volt (p < 0,05, Mann-Whitney U-teszt) az 5-9 Hz-es és a nem 5-9 Hz-es oszcillációk során. Az 5-9 Hz-es LFP epizódók alatt a 100-200 ms hosszú interspike intervallumok jelentek meg a magas frekvenciás tranziensek aránya is megnövekedett (55. ábra). Minden ZI sejt mutatott tranzienseket (900 Hz-ig), mely aktivitás mind az 5-9 Hz-es, mind a nem 5-9 Hz-es LFP szakaszok alatt jelentkezett, azonban különböző arányban (52. ábra). Az LFP 5-9 Hz-es aktivitása együtt járt e tranziens komponensek szignifikáns megváltozásával. A szupresszált csoportban 3 sejt esetében aktivitásuk csökkenést, míg a szupresszált csoportból 1 esetben, az aktivált csoportból pedig 3 esetben növekedést mutatott az 5-9 Hz-es kérgi oszcillációk alatt. Megjegyzendő, hogy a magas frekvenciás események időnként szinkronitást mutattak az 5-9 Hz-es kérgi oszcillációkkal, azonban pontos fáziskapcsoltság nem volt kimutatható. A maradék 2 lassú, tonikus sejt esetében a tüzelési frekvencia változása nem volt kimutatható, azonban az egyikük esetében az interspike intervallum eloszlás szignifikáns változást mutatott. A ZI sejtek tüzelésének ritmicitásának vizsgálata az autokorrelogramok spektrumának analízisével történt. A vizsgált 10 sejtből csak 1 sejt mutatott fázikus, szinkron tüzelést az 5-9 Hz-es kérgi oszcillációkkal. Annak érdekében, hogy alaposabban megvizsgáljuk a ZI sejtek tüzelésének 5-9 Hz-es komponensét a ZI egysejt-aktivitásra
wavelet
analízisén
alapuló
89
idő-frekvencia
dekompozíciót
alkalmaztunk. A teljesítmény-sűrűség az 5-9 Hz-es sávban szignifikáns növekedést mutatott az 5-9 Hz-es szakaszok alatt a nem 5-9 Hz-es szakaszokhoz képest mind a 8 vizsgált gyors ZI sejt esetében. A növekedés mértéke sejtről sejtre változott (7-97 %, középérték 27,1 %).
55. ábra: A ZI sejtek tüzelési mintázata 5-9 Hz-es oszcillációk alatt A, B) Két egyidejűleg elvezetett ZI sejt a bal (A), illetve jobb (B) agyféltekéből 5-9 Hzes LFP oszcillációk alatt. A1, B1) Szűrt LFP (felüláteresztő szűrő, > 0,5 Hz. A2, B2)az Egysejt- aktivitás. A3, B3) Az LFP (fekete) és az egysejt-aktivitás (szürke) spektrális amplitúdója. A4, B4) Kétmásodperces intervallumok a A1-B2 ábrákból (felül LFP, alul egysejt-aktivitás). Az 5-9 Hz-es szakaszokat rendre vastag vonallal, a nem 5-9 Hz-es szakaszokat dupla vonallal ábrázoltuk. A bal oldali ZI sejt (A) esetén az 5-9 Hz-es LFP szakaszok alatt a sejt spektrális amplitúdója is megnőtt az 5-9 Hz-es sávban (A3), a jobb oldali ZI sejt (B) azonban ugyanezen 5-9 Hz-es LFP szakaszok alatt nem mutatott 5-9 Hz-es modulációt (B3), bár tüzelési frekvenciája csökkent. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy kérgi a 5-9 Hz-es oszcillációk erős befolyással voltak az elvezetett ZI sejtekre, a tüzelési frekvencia változása és a tüzelési
90
aktivitás 5-9 Hz-es modulációja megfigyelhető volt a sejtek többségénel, míg fáziskapcsolt tüzelést csak a sejtek nagyon kis része mutatott.
A ZI sejtek morfológiai tulajdonságainak jellemzése
12 ZI sejt (dZI, n=6; vZI, n=3; cZI, n=3) dendritfáját rajzoltuk ki Neurolucida szoftver segítségével. A ZI sejtek fuziform vagy ovális sejttesttel jellemezhetőek, melyekből 3-5 vastag elsőrendű dendritág indul el. A legtöbb dendritet ritkásan tüskék borították. A dendrittüskék viszonylag hosszú nyaki résszel és megduzzadt feji résszel rendelkeztek. A teljes dendrit hossz 9 ZI sejt esetében 4800 μm és 7200 μm közé esett, azonban két vZI és egy cZI sejt csak 2644 μm-es, 2888 μm-es és 2707 μm-es dendritfával rendelkezett, a tökéletes jelölés ellenére. Lehetséges, hogy ezen egyszerűbb morfológiával rendelkező sejtek egy eltérő sejttípust alkotnak. A ZI sejtekre általánosan jellemző volt, hogy dendritágaik csak néhány helyen ágaztak el. Az elsőrendű dendritek 41,3 %-ának 2 vagy kevesebb elágazási pontja volt. A dendritszegmensek az elágazási pontok között akár a többszáz μm-et is elérhették (1,3 μm - 1075,3 μm, középérték: 95,76 μm). A 200 μm-nél hosszabb szegmensek aránya a dendritek összhosszának 71,9 %-nak adódott. Összehasonlításul: ugyanez az érték egy három dimenzióban rekonstruált VPM sejt esetén 5,1 %-nak adódótt. Az átlag hossz és a hossztartomány az első-, másod-, harmad- és negyedrendű dendritszakaszok esetén a következő volt: 134,5 μm (2,3 μm - 768,1 μm); 186,1 μm (1,3 μm - 1075,1 μm); 145,3 μm (1,9 μm - 642,8 μm) és 119 μm (2,8 μm - 957 μm). Eszerint mind az első-, mind a másod-, mind a harmad- és a negyedrendű dendritek esetében is előfordulhatnak nagyon hosszú dendritszakaszok. A ZI sejtek mediolaterális irányban kiterjedt dendritfával jellemezhetőek. Az átlagos fesztávolság 960,4 μm-nek adódott (tartomány: 523,3 μm - 1318,2 μm). A ZI sejtek dendritarborizációjának háromdimenziós vizsgálata során kiderült, hogy a ZI sejtek polarizált morfológiával jellemezhetőek. A legtöbb ZI sejt dendritfája egy 200300 μm-es lamellában helyezkedik el. Az átlagos arányszám a dendrit fesztávolság hossztengelye mentén és az erre merőleges rövidtengely mentén 4.0-nak adódott (tartomány: 1,9- 7,3 ), ami szerint a ZI sejtek átlagosan 4x hosszabb hossztengellyel rendelkeznek, általában a mediolaterális irányban. A dZI és cZI sejtek esetében a
91
lamella orientációja csaknem koronális volt, néha a laterális részen kissé döntött kaudális irányban, vagy rosztrálisan a dorzális részen. A dZI és cZI sejtek dorzoventrális kiterjedése összemérhető vagy nagyobb volt az anterio-poszterior kiterjedésükkel. A ventrálisan elhelyezkedő dZI sejtek dendritjei gyakran árnyúltak a vZI-be, míg a vZI sejtek dorzális nyúlványai sosem lépték át a dZI-vZI határt. A vZI sejtek legrövidebb tengelye a dorzo-ventrális irányba esett. 56.
ábra: Egy juxtacellulárisan elvezetett és neurobiotinnal megjelölt dZI sejt dendritfájának 3D rekonstrukciós képe A) Fénymikroszkópos koronális metszet, amely a megjelölt sejt sejttestjét tartalmazza. Mediolaterális irányban a sejt csaknem az egész ZI-t kitölti. B) A jelölt sejt tüzelési mintázata (alul) és a kérgi LFP aktivitás (felül).C) A kirajzolt sejt dendrogramja. A sejt koronális (D), szaggitális (E) és dorzális (F) nézete. A sejt kiterjedése a mediolaterális irányban a legnagyobb (G). Mérőléc: A: 0.5 mm; D-F: 300 μm.
92
A fenti morfológiai adatok kizárólag a fázikus ZI sejtek vizsgálatai során keletkeztek, mivel megfelelően megjelölt tonikus ZI sejt nem állt rendelkezésünkre. Néhány tonikus sejt szómáját és proximális dendritágait nyomon követtük, és ezek nem különböztek fázikus társaikétól.
93
Az APT sejtek elektrofiziológiai tulajdonságainak jellemzése
Az APT sejtek tüzelési mintázata és a tüzelés fáziskapcsoltsága a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz
Az APT sejtek tüzelési mintázatát in vivo uretán altatott patkányokon vizsgáltuk juxtacelluláris
egysejt-elvezetéses
technikával.
Ezzel
egyidőben
a
primér
szomatoszenzoros kéregből LFP-t vezettünk el (lásd Módszerek fejezet). Az LFP-n a lassú, nagy amplitúdójú, alacsony frekvenciás oszcillációk domináltak. A REMalváshoz hasonló deszinkronizált LFP-t időszakosan farokcsípéssel váltottuk ki. A sejtek tüzelési mintázat alapján három, élesen elkülönülő csoportot alkottak. A kategóriák között jelentős különbséget tapasztaltunk a sejtek tüzelési aktivitásában az LFP-vel való fáziskapcsoltságuk és a deszinkronizált EEG alatti tüzelési aktivitásuk vonatkozásában. A 25 elvezetett sejtből 21-et a fenti kritériumok alapján három csoportba soroltunk. Megkülönböztettünk 1) gyors burstökkel jellemezhető (fast bursting), 2) kizárólag tonikus tüzelést mutató (tonic), valamint 3) lassú ritmikus aktivitást mutató sejteket (slow rhythmic). A gyors burstökkel jellemezhető sejtek (n=6) magas frekvenciás burstöket mutattak lassú hullámú kérgi oszcillációk alatt, melyeket időnként irreguláris akciós potenciálok tarkítottak. Minden regisztrált sejt esetében a burstök intraburst frekvenciája meghaladta a 350 Hz-et (egészen 600 Hz-ig). Spontán vagy farokcsípés indukálta LFP deszinkronizáció esetén a burstök száma csökkent, és a tüzelés egyszeres akciós potenciálok tonikus sorozatává vált. A sejtek tüzelése és a kérgi LFP között korreláció ekkor nem volt megfigyelhető (57. ábra). A tonikus sejtek (n=8) monoton, majdnem óramű pontosságú tüzelést mutattak a lassú hullámú kérgi aktivitás során, 13 Hz és 23 Hz közötti tüzelési frekvenciával az agykérgi LFP-től teljesen függetlenül. A kérgi deszinkronizáció kb. 10%-kal növelte a tüzelési aktivitást a tüzelési mintázat változtatása nélkül. A lassú ritmikus sejtekre 1-7 Hz-es tüzelés volt jellemző, az akciós potenciálok egyszeres tüskék, páros akciós potenciálok (doublet), illetve alacsony frekvenciás burstök formájában jelentkeztek. Burstök esetében az intraburst frekvencia ritkán
94
haladta meg a 100 Hz-et, a legkiemelkedőbb érték 170 Hz-nek adódott. A sejtek tüzelése a kérgi Up state-ek felszálló szárához volt kapcsolt. Kérgi aktiváció hatására a ritmikus aktivitás irreguláris tüzeléssé változott (57. ábra), bizonyos sejteknél a tüzelési frekvencia emelkedett, másoknál csökkent.
95
57. ábra: Három különböző tüzelési mintázattal jellemezhető idegsejtcsoport az APTben uretán altatás alatt. A) A gyors burstökkel jellemezhető sejtek csoportja (fast bursting cells) lassú hullámú LFP aktivitás alatt, A1) valamint a gyors oszcillációkkal jellemezhető, deszinkronizált LFP szakaszok alatt. Az autokorrelogramok (auto) központi csúcsának megléte, illetve hiánya, valamint az STA-k is jól mutatják e sejtek burst tulajdonságait. B) Tonikus aktivitással jellemezhető sejtek (tonic cells) csoportja lassú hullámú LFP alatt, valamint B1) deszinkron LFP alatt. A lapos autokorrelogramok és STA-k a burstök hiányáról árulkodnak. C) A lassú ritmikus aktivitással jellemezhető sejtek (slow rhythmic cells) csoportja lassú hullámú LFP, majd C1) agykérgi aktiváció során. Az autokorrelogram és az STA jól tükrözik a ritmicitást a lassú hullámú LFP alatt, majd a gyors oszcillációkkal jellemezhető LFP alatt a ritmikus aktivitás lassú, irreguláris tüzelésbe csap át, amely – az autokorrelogramon és az STA-n jól látható módon – nem korrelál a deszinkron LFPvel. LFP: agykérgi helyi kérgi mezőpotenciál; UNIT: egysejt-aktivitás; STA: spike triggered average; AUTO: autokorrelogram; S1: primér szomatoszenzoros kéreg.
Az APT sejtek morfológiai sajátságainak jellemzése
Az elvezetett APT sejtek némelyikén fény és elektronmikroszkópos vizsgálatokat végeztünk,
hogy
meghatározhassuk
pontos
elhelyezkedésüket,
neurokémiai
sajátosságaikat és morfológiai tulajdonságaikat. A sejtek APT-n belüli elhelyezkedését a 58. ábra mutatja. Mindhárom idegsejt-típus fuziform vagy szabálytalan alakú sejttesttel rendelkezett, amelyből 4-5 dendritág és sűrű axonhálózat eredt. A gyors burstökkel
jellemezhető
neuronok
dendritágain
csaknem
kétszer
annyi
dendritelágazódás volt megtalálható, mint a tonikus vagy lassú ritmikus sejtek esetében. Ráadásul a gyors burstökkel jellemzhető sejtek disztális dendritjeit jellegzetes tüskeszerű struktúrák borították. A tonikus és lassú ritmikus sejtek dendritfáján csak kis számban találtunk dendrittüskéket. Mivel az APT gazdag PV-tartalmú idegsejtekben, és a PV a GABAerg jellegre utal, megvizsgáltuk,
hogy
a
fiziológiai
tulajdonságuk
alapján
elkülönült
három
idegsejtcsoport mutat-e különbséget PV tartalomban is. Az immuncitokémiai
96
vizsgálatok kimutatták, hogy minden gyors burstökkel jellemezhető sejt erősen PVpozitívnak mutatkozott (n=3), míg a tonikus sejtek (n=4) gyengén, a lassú ritmikus sejtek (n=2) pedig egyáltalán nem mutattak PV immunreaktivitást (59. ábra). Eredményeink alapján a kapott elektrofiziológiai és morfológiai tulajdonságok megfeleltethetőek
egymásnak,
mely
egyértelműen
bizonyítja
a
csoportosítás
létjogosultságát. Két gyors burstökkel jellemezhető sejt esetében egészen a thalamusig tudtuk követni a felszálló axonkollaterálisokat. Az egyik esetben a jelölt terminálisok egy csoportja (70-80 db) a poszterior magban volt megtalálható. Ezen terminálisok elektronmikroszkópos analízise során kiderült, hogy a terminálisok többszörös szimmetrikus szinapszisokat képeztek thalamocorticalis relésejtek proximális vastag dendritjeivel (n=8). Hét ezek közül az anterográd pályakövetéssel jelölt terminálisokkal megegyező ultrastrukturális sajátságokat mutatott (lásd Bevezetés fejezet). Ezek a morfológiai megfigyelések igazolják, hogy monoszinaptikus gátló kapcsolat létezik az APT és a thalamus között. A
gyors
burstökkel
jellemezhető
sejtek
helyi
axonkollaterálisai
szintén
szimmetrikus szinapszisokat létesítettek más APT sejtek szómáján, illetve proximális dendritjein (n=12), de ezek a terminálisok kisebbek voltak, és nem voltak puncta adhearentiával (PA) jellemezhetőek. A tonikus sejtek axonkollaterálisait megtaláltuk a posterior triangularis thalamicus magban (n=9 terminális), a zona incertában (n=3), a ventrális laterális térdestestben (vdLGN) (n=5); ezen kívül lokális axonkollaterálisok hálózata is megfigyelhető volt az APT-ben (n=3). Mind a 20 lokális axonterminális egyszerű szimmetrikus szinapszisokat létesített a posztszinaptikus partnerrel, PA nem volt megfigyelhető (58. ábra, 59. ábra).
97
58. ábra: A juxtacellulárisan jelölt sejtek elhelyezkedése az APT-ben A sejtek dendritfáját feketével ábrázoltuk, minden szóma körül egy meghatározott színű körrel, amely a sejt típusát reprezentálja. Az axonokat – amennyiben az axonjelölés sikeres volt – szintén színazonosan jelöltük. A gyors burstökkel jellemezhető sejteket pirossal, a tonikusakat kékkel, a lassú ritmikusakat pedig zölddel jelöltük. Megjegyzendő, hogy a dendritfa átlagban egy 300 μm sugarú körön belül helyezkedett el, és hogy minden sejttípus esetében megfigyelhető volt lokálisan sűrűn elágazó axonfa. OPT: olivaris pretectalis mag, PLi: poszterior limitans thalamicus mag.
98
59. ábra: A három, elektrofiziológiai módszerrel azonosított sejttípus morfológiai tulajdonságai A) A fluoreszcens felvételen a gyors burstökkel jellemezhető, neurobiotinnal jelölt sejt (zöld) látható. A neurobiotint egy zölden fluoreszkáló jelölőanyaggal festettük. A sejttest PV-immunreaktívnak (piros) bizonyult. Az átfedő metszeteken (overlay) jól látható, hogy neurobiotinnal jelölt sejt PV-pozitív. A1) Az „A” sejt szómája, dendritfája
99
és helyi axonarborizációja (piros). A szatelita ábrán (inset) jól látszanak a filopódium szerű dendrittüskék, melyek a disztális dendriteken csoportosulnak. A2) A jelölt sejt lokális axonjának egy axonterminálisa, amely két szimmetrikus szinapszist létesít egy jelöletlen APT dendrittel. A3) A jelölt sejt négy felszálló axonága éri el a thalamust, és a Po területén jelölt axonterminálisokat képez. A leszálló axonkollaterálisok a colliculus superiorba futnak. (kettős nyíl). (Az ábrát a Paxinos és Watson atlasz paraszaggitális metszési síkjai alapján rajzoltuk.) A4) Az elektronmikroszkópos felvétel azt mutatja, hogy a jelölt terminálisok szimmetrikus szinapszisokat (nyilak) létesítenek a thalamocorticalis relésejtek proximális dendritágain. A nyílhegyek a gliaborítást, a kettős nyílhegy a PA-t mutatják. B) A neurobiotinnal megjelölt tonikus sejt (zöld) halványan PV-pozitív (piros). Összehasonlításképpen a csillag egy erősen PV-pozitív sejtet mutat. B1) A koronális metszeten a jelölt sejt sejtteste és dendritfája feketével, míg axonarborizációja pirossal ábrázolva látható. A neuron csak részlegesen jelölődött, így csak a fő axonág rajzolódott ki, amely a posterior triangularis magba (PoT), a dZI-be és a vdLGN-be érkezik. B2) Az elektronmikroszkópos képen szimmetrikus szinapszisokat láthatunk a célsejtek proximális dendritjein. b3 egy neurobiotinnal jelölt axonterminálist mutat, amely szimmetrikus szinapszist (nyíl) létesít egy ZI sejt proximális dendritjén. Ugyanez látható nagyobb nagyításban a szatelita ábrán. C) A lassú ritmikus tüzeléssel jellemezhető sejtek PV-negatívak voltak. A neurobiotin-jelölt, PV-negatív sejttest látható a képen. A fehér nyilak a neurobiotinjelölt sejtre mutatnak. C1 és C2 két kirajzolt lassú ritmikus sejtet mutat, a szómákat és a dendritfát feketével, az axont pirossal ábrázolva.
Az APT-thalamicus pálya kémiai stimulálása in vivo
A következő kísérletünkben arra kerestük a választ, hogy mi történik akkor, ha az APT lokális GABAerg kapcsolatainak gátlása révén erősítjük a pretecto-thalamicus pályáról érkező gátlás mértékét a magasabbrendű thalamus sejtjein. Ezért az APT-be GABAA antagonistát, bicucullint injektáltunk, hogy kémiai stimulálás révén serkentsük az extrareticularis gátlás erősségét, majd vizsgáltuk, hogy az egyes sejtek LFP-hez viszonyított tüzelése hogyan változott lassú hullámú LFP-hez képest. Kísérleteink során
100
azt vártuk, hogy a magasabbrendű Po sejtek fáziskapcsoltága változni fog az APT kémiai stimulációjának hatására, míg az elsőrendű VB sejtek a kontrollhoz hasonló mintázattal tüzelnek. A 60. ábra két reprezentatív Po és VB sejt eredményeit mutatja.
60. ábra: Egy Po és agy VB sejt fáziskapcsoltsága kontroll körülmények között és az APT kémiai stimulálása után. Látható, hogy a kontroll körülmények között az Up state csúcsa körül tüzelő sejt a pretecto-thalamicus pálya stimulálásának hatására az Up state felszálló ágán kezd tüzelni. A VB sejt fázisa a kezelés hatására változatlan marad. Várakozásainkkal ellentétben, azonban nem minden Po sejt mutatott fáziseltolódást a kontroll kísérlethez képest (7 Po sejtből 3 mutatott és 4 nem mutatott fázis eltolódást), és volt néhány VB sejt, amely meglepetésszerűen a Po sejtekéhez hasonló mértékű fáziseltolódást mutatott (6 VB sejtből 2 VB sejt a Po-hoz hasonló fáziseltolódást, míg 4 nem mutatott változást a fáziskapcsoltságban). A várttól eltérő eredmények új kérdéseket vetnek fel, így további kísérleteket igényelnek, melyek új irányt nyithatnak az extrareticularis rendszer működésének megértésében.
101
MEGBESZÉLÉS
Dolgozatomban a szomatoszenzoros rendszer példáján megmutattam, hogy az elsőrendű- és a magasabbrendű thalamicus magok eltérő tüzelési mintázattal rendelkeznek,
az
elsőrendű
thalamicus
magok
burstjei
magasabb
intraburst
tüskeszámmal és magasabb intraburst frekvenciával rendelkeznek. Ezen kívül az elsőrendű és a magasabbrendű magok különböznek a kérgi aktivitáshoz való viszonyukban,
mely
eltérés
oka
egyrészt
a
kétféle
mag
eltérő
serkentő
összeköttetéseiben, másrészt a kutatócsoportunk által leírt, a magasabbrendű thalamusra érkező szelektív extrareticularis gátlás meglétében keresendő. A főként szenzoros thalamocorticalis rendszereket érintő két extrareticularis mag, a zona incerta (ZI) és az anterior pretectum (APT) sejtjeinek in vivo elektrofiziológiai vizsgálata során fény derült arra, hogy ezen extrareticularis gátlómagvak sejtjeinek tüzelési mintázata a magokon belül heterogenitást mutat. A ZI-ben két különböző tüzeléssel jellemezhető csoportot írtunk le. A fázikus sejtek tüzelése kapcsoltságot mutatott a kérgi lassú hullámú aktivitással és az 5-9 Hz-es oszcillációkkal. A lassú hullámú oszcillációkhoz való kapcsoltság mértéke egyenlő volt, vagy akár meg is haladta a thalamocorticalis relésejtek kapcsoltságának mértékét. Ennek egyik oka a ZI sejtek dendritfájának speciális morfológiája lehet. A dendritfa mediolaterális hosszanti kiterjedése és a dendriteken található kevés elágazás lehetővé teszi, hogy a párhuzamosan futó cortico-incertális rostok számos szinapszist létesítsenek rajta. Így különböző kérgi területekről egyszerre érkezhet információ az adott ZI sejtre, ráadásul óriás cortico-incertális terminálisok által, melyek általában a ZI dendritek proximális részére vagy dendrittüskékre érkeznek. Ez teheti lehetővé a kérgi szinkronitás akár a relésejtekét is meghaladó mértékét. Az APT-n belül három jól elkülönülő sejtcsoportot tudtunk megkülönböztetni elektrofiziológai és immunhisztokémiai tulajdonságaik alapján. A gyors tüzeléssel jellemezhető sejtek, melyek magas frekvenciás burstöket produkáltak, és viszonylag magas kapcsoltságot mutattak a kérgi lassú hullámú aktivitáshoz, erős gátlást képesek kifejteni a magasabbrendű thalamus célsejtjeire. A lassú ritmikus tüzeléssel jellemezhető sejtek a kérgi információ átadásában, a tonikus sejtek a szinkronitás kialakításában játszhatnak fontos szerepet.
102
Végül a pretecto-thalamicus pálya kémiai stimulálása útján képesek voltunk a magasabbrendű
relésejtek
fáziskapcsoltságának
megváltoztatására,
így
valószínűsíthető, hogy az elsőrendű- és magasabbrendű magok eltérő fázisviszonyainak kialakításában nemcsak az eltérő serkentő bementek, hanem a magasabbrendű magokra érkező szelektív extrareticuláris gátlás is fontos szerepet játszik.
Az elsőrendű- és a magasabbrendű thalamicus magok eltérő tüzelési mintázata és fáziskapcsoltsága a lassú hullámú kérgi oszcillációkhoz
A burst tüzelési mód, mint az információátvitel egyik formája
Az emlős thalamus sejtjei alkotják azt az átkapcsolóállomást, ahol a perifériáról érkező információk továbbítódnak az agykéreg felé. A thalamocorticalis sejtek kétféle módban képesek működni, így szabályozva az információáramlás menetét (Sherman és Koch 1986, Steriade és Llinas 1988, McCormick és Feeser 1990). Ébrenlét alatt a sejtek hűségesen továbbítják a rájuk érkező jelet (relay mód), míg szendergés, alvás, illetve altatás alatt a tüzelés burst módba vált. A régebbi felfogás, miszerint a thalamocorticalis relésejtek burst tüzelési módban „szétkapcsolnak” az agykéregtől, vagyis nem közvetítenek információt, mára már megdőlni látszik, és úgy tűnik, a burst mód egy másféle típusú információátvitelt eredményez. Ugyanis megfigyelték, hogy a burst tüzelési mód teljesen éber állapotban is kimutatható (Guido és Weyand 1995, Ramcharan és mtsai 2000b, Ramcharan és mtsai 2000a). Eszerint a thalamocorticalis relésejtek a perifériáról érkező jeleket csak részben és szelektíven zárják ki (Mukherjee és Kaplan 1995). Ezen tulajdonságok miatt manapság egyre inkább az a nézet látszik előtérbe kerülni, hogy a thalamicus burst mód „figyelmi hívószóként” (attentional searchlight) vagy „ébresztési hívószóként” (wake-up call) funkcionál, melynek akkor van jelentősége, ha egy új, potenciálisan érdekes vagy akár egy veszélyt kódoló információ továbbítódik az agykéreg felé.
103
Az első és magasabbrendű thalamicus magok eltérő tüzelési sajátságai
Az utóbbi időben készült tanulmányok igazolják, hogy az elsőrendű- és a magasabbrendű thalamicus magok burst-tulajdonságai különböznek. Éber majomban elvezetett sejteken kimutatták, hogy a magasabbrendű thalamicus magok szignifikánsan magasabb burst-frekvenciával tüzeltek, mint az elsőrendű magok (Ramcharan és mtsai 2005). Szeleten végzett intracelluláris whole-cell patch clamp elvezetésekkel bizonyították, hogy az elsőrendű magok szignifikánsan magasabb intraburst frekvenciával és magasabb számú intraburst tüskeszámmal tüzeltek, mint a magasabbrendű magok (Landisman és Connors 2007). Kísérleti adatok bizonyítják azt is, hogy a burstökben lévő akciós potenciálok száma fontos lehet abban az esetben, ha egy burst első, illetve első néhány akciós potenciálja nem képes a kérgi célterület sejtjének aktiválására. Ebben az esetben a burstön belüli későbbi akciós potenciálok is viszonylag nagy hatékonysággal képesek válasz kiváltására a posztszinaptikus sejten (Swadlow és Gusev 2001). In vivo kísérletünkben egy új, általunk kidolgozott burst-detekciós adatanalízis segítségével igazoltuk, hogy az elsőrendű szomatoszenzoros mag, a VB sejtjei szignifikánsan magasabb intraburst frekvenciával és szignifikánsan magasabb intraburst tüskeszámmal tüzeltek, mint a magasabbrendű szomatoszenzoros mag, a Po sejtjei. Burstök előfordulási gyakorisága tekintetében nem kaptunk szignifikáns különbséget a VB és a Po tüzelése között, ami feltehetően a mély altatás miatt a burstök eleve magas (90 %-ot meghaladó) arányának köszönhető. Érdekes módon azonban a VB és a Po közötti határzóna sejtjeinek tüzelése különbözött mind a Po, mind a VB sejtjeinek tüzelésétől. A PoVPM határsejtek intraburst tüskeszáma és burstön belüli frekvenciája a VB sejtekére hasonlított, ami azt igazolja, hogy ezek a sejtek belső (intrinsic) tulajdonságaik tekintetében a VB sejtekkel mutatnak hasonlóságot. Fáziskapcsoltság tekintetében azonban tüzelésük inkább a Po sejtek tüzelésére hasonlított, ami az agykéreg V. rétegéből érkező szinaptikus bemenetek fontosságára utal. Ez megerősíti, hogy a határzónában az agykéreg V. rétegéből nagy mennyiségben érkeznek óriás, serkentő terminálisok (Liao és mtsai 2008).
104
Feltételezésünk szerint mind a burst tulajdonságok, mind a fáziskapcsoltság függ a sejt intrinsic tulajdonságaitól, azonban különböző mértékben. Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy a burst tulajdonságok létrehozásához mennyire járulnak hozzá a sejt intrinsic tulajdonságai, összehasonlítottuk eredményeinket Landisman és Connors tanulmányával (4.táblázat). 4.táblázat: In vivo eredményeink és az in vitro irodalmi adatok összevetése Saját eredményeink: Intraburst frekvencia
Intraburst tüskeszám
(Hz) medián
medián
Po
341,68*
2,67
VB
423,16
3,69
* p<0,05 In vitro whole-cell patch clamp elvezetés (Landisman és Connors 2007): Intraburst frekvencia
Intraburst tüskeszám
(Hz) középérték ± SD középérték ± SD Po
231,7 ± 68,4*
4,4 ± 1,8
VPM
348,5 ± 81,3
5,3 ± 1,4
* p<0,05 Elmondhatjuk tehát, hogy mind in vitro, mind in vivo kísérletben a burstön belüli akciós potenciálok száma és a burstön belüli frekvencia magasabb értéket adott a a VB sejtjein, mint a Po esetén. Az in vitro és in vivo adatok közti különbség a hálózati tulajdonságok különbözőségéből eredhet, hiszen szeletpreparátum esetén a működő cortico-thalamicus bemenetek hiányoznak.
105
Az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus magok eltérő fáziskapcsoltsága a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz
A kérgi oszcillációk kialakulásában fontos szerepet tölt be a thalamocorticalis rendszer. Mély alvás, illetve altatás alatt a delta- és a lassú hullámú oszcillációk dominálnak a kérgi mezőpotenciálokban (Metherate és Ashe 1993b, Steriade és mtsai 1993). A lassú hullámú aktivitás, mely az agykéreg és a thalamus szinkron működésének eredménye (Leresche és mtsai 1991), egy aktív fázis és egy mélységi negatív fázis ismétlődésével jön létre (Shu és mtsai 2003). Az aktiv fázis, vagyis az Up state alatt létrejövő időleges aktivitás az ébrenléthez hasonlítható állapot (Moruzzi és Magoun 1949), míg a Down state egy inaktív állapotnak tekinthető. Kísérletünkben meghatároztuk, hogy az elsőrendű-, illetve a magasabbrendű thalamus magvai milyen kapcsolatot mutatnak a kérgi lassú hullámú oszcilláció Up state-jének fázisával. Eredményeink alapján elmondható, hogy a magasabbrendű Po sejtek az Up state felszálló szárán, míg az elsőrendű VB sejtek inkább az Up statek csúcsa körül tüzeltek. A PoVPM határsejtek szintén az Up state-ek korai fázisában voltak aktívak. Néhány újabb kísérleti adat arra utal, hogy a kérgi Up state-eket a neocortex mélyebb rétegei, elsősorban az V. rétegi sejtek aktivitása iniciálja (Berger 2008, Timofeev 2008). Mivel az V. rétegi bemenet hiányzik az elsőrendű magoknál, így elképzelhető, hogy az V. rétegi corticothalamicus sejtek korai aktivitása képes a magasabbrendű magok korai tüzelését beindítani. A PoVPM sejtek korai tüzelését az előbbiekben említett eredmény látszik alátámasztani, miszerint az V. rétegi corticothalamicus terminálisok eloszlása ezen a területen nagy sűrűséget mutat (Liao és mtsai 2008). A határsejtek tüzelési tulajdonságaik alapján egy érdekes átmenetet képeznek – burst-tulajdonságaik tekintetében a VB-re, míg lassú hullámú oszcillációhoz történő kapcsoltságukban a Po sejtjeihez hasonlítanak – ami alátámasztani látszik azt, hogy a burst-tulajdonságokat inkább a sejt intrinsic, míg a fázis-tulajdonságokat inkább a sejt bemeneti sajátságai határozzák meg.
106
Az extrareticularis gátlórendszer magjainak jellemzése tüzelési mintázat és kérgi lassú oszcillációkhoz történő fáziskapcsoltság tekintetében
Kutatócsoportunk kimutatta, hogy a magasabbrendű thalamus magvai a reticularis gátlás mellett egy rájuk szelektíven érkező, igen erős extrareticularis gátlást is kapnak. A szenzoros magasabbrendű thalamicus magokat a ZI és az APT idegzi be szelektíven (Bartho és mtsai 2002, Bokor és mtsai 2005). Doktori munkám során e két extrareticularis gátlómag sejteinek tüzelési mintázatát és lassú hullámú kérgi oszcillációkkal való kapcsoltságát vizsgáltam in vivo egysejtelvezetéses elektrofiziológiai kísérletekben. Mindkét mag sejtjei heterogenitást mutattak tüzelési tulajdonságaik tekintetében, és mindkét extrareticularis magban megkülönböztethetőek voltak a lassú hullámú oszcillációkkal szinkron aktivitással jellemezhető és a lassú hullámok ritmusát figyelmen kívül hagyó sejtcsoportok.
A ZI sejtjeinek elektrofiziológiai és morfológiai jellemzése
A ZI sejtjeinek tüzelési mintázata az APT-hez hasonlóan heterogenitást mutatott, megkülönböztettünk fázikus tüzeléssel jellemezhető és tonikus aktivitású sejtcsoportot. A sejtek a ZI szektorain belül kevert eloszlást mutattak. A fázikus sejtek tüzelése a gyors kérgi oszcillációk alatt, vagyis deszinkron LFP esetén nem mutatott fáziskapcsoltságot, a sejtek tonikusan tüzeltek, míg a lassú hullámok megjelenésével a tüzelés a kérgi aktivitással szinkronná vált. A sejtek nem produkáltak
nagy
kisüléssorozatokban
frekvenciás tüzeltek.
burstöket,
hanem
Összehasonlítva
a
szinkron
kis
szinkronitás
frekvenciás mértékét
a
thalamocorticalis relésejtekkel azt tapasztaltuk, hogy a fázikus ZI sejtek szinkronitása egyenlő volt, vagy akár meg is haladta a thalamocorticalis relésejtekre jellemző értéket. Ennek feltételezhetően egyik oka a ZI sejtek dendritfájának morfológiájában keresendő, hiszen e sejtek dendritjeinek mediolaterális kiterjedése akkora, hogy az egyes sejtek gyakran a ZI teljes mediolaterális kiterjedésén átnyúlnak. Ezen felül a cortico-incertális terminálisok, melyek jelentős bementet képeznek a ZI sejtjein, óriás serkentő axonterminálisokkal szinaptizálnak leggyakrabban a ZI sejtek dendritjeinek proximális
107
részén. A kérgi befolyás mértékét még jobban elősegíti az, hogy a cortico-incertális axonok a mediolaterális dendritekkel párhuzamosak futnak (Mitrofanis és Mikuletic 1999), azokkal gyakran szinaptizálnak, így a kéregből a bemenetet topografikus elrendeződésben, az egyes kérgi moduloknak megfelelően érkezhet a ZI sejtekre. Így a ZI sejtek képesek lehetnek integrálni a különböző kérgi szegmensek aktivitását.
61. ábra: Az cortico-incertális pálya fény- és elektronmikroszkópos képe A) Camera lucida rajz az anterográdan jelölt rostokról (50 μm-es koronális metszet). A terminálisokkal rendelkező axonkollaterálisok párhuzamosan futnak a metszet síkjával néhány száz mikrométeren keresztül. A nyilak a terminálisokat mutatják, melyek általában kis csoportokban helyezkednek el. A szagatott vonal a dZI-vZI határt mutatja. A szürkén jelölt terület a B ábrán látható nagyobb nagyításban. B) A boutonok gyakran szinaptizáltak tüskenyakon. C és D a B kép bekeretezett területéről készült elektronmikroszkópos kép. C) Két jelölt axonterminális b1 és b2 ugyanarra a posztszinaptikus ZI sejtre szinaptizál (d). A szatelita ábra kis nagyítású kép a két boutonról, a csillag egy kapillárist mutat. D) A b2 terminális két felszabadulási hellyel
108
létesít aszimetrikus szinapszist a posztszinaptikus partnerrel (nyílhegy). E) Nagy nagyítású elektronmikroszkópos felvétel egy másik cortico-incertális terminálisról, hosszú aktív zónával és többszörös felszabadulási hellyel. Mérőléc: A) 100 μm, B) 50 μm, C) 2 μm, 10 μm (szatelita), D,E) 1 μm. (Bartho és mtsai 2002). Összehasonlítva a ZI sejtek dendritfájának morfológiáját a thalamocorticalis relésejtek morfológiájával elmondható, hogy a ZI sejtek dendritfája kevés elágazást, így viszonylag hosszú (többszáz mikrométer) elágazásmentes dendritszakaszokat tartalmaz, szemben
a
relésejtek gyakran
elágazó, rövid
dendritszakaszokat
tartalmazó
dendritfájával. Ez a dendritfa viszonylag kisebb kérgi területekről érkező bemenetet enged meg, és valószínűsíthető, hogy a relésejtek vékony disztális dendritjeire érkező bemenetek amplitúdója nagyobb mértékben csökken a számos elágazás miatt (Emri és mtsai 2003), mint a ZI sejtek vastag disztális dendritjeire ékező EPSP-k, melyek kevés dendritelágazás útján jutnak el a szómáig.
A ZI különböző sejttípusainak lehetséges funkciója
Anterográd pályajelöléses kísérletekből ismert, hogy a ZI az APT-hez hasonló óriás GABAerg terminálisokkal létesít kapcsolatot a posztszinaptikus magasabbrendű relésejtekkel (Bartho és mtsai 2002). A hasonlóság nagymértékű, hiszen a ZIthalamicus terminális is többszörös szinapszist létesít sok aktív zónával, általában a célsejtek proximális dendritjein. A thalamusban a ZI-ből eredő incerto-thalamicus terminálisok gyakran a primer afferensek, vagy a kérgi V. rétegi terminálisok mellett voltak megtalálhatóak. A terminálisok
közelsége
lehetővé
teheti,
hogy
az
óriás
gátló
terminálisok
megakadályozzák a serkentő terminálisok serkentő hatását a magasabbrendű relésejteken (61. ábra). Az incerto-thalamicus szinapszisok proximális lokalizációja még jobban biztosítja azt, hogy a gátlás csak minimális mértékben gyengüljön a szóma eléréséig, így ez a gátlás a magasabbrendű thalamicus relésejtek, és rajtuk keresztül az általuk nagy mértékben beidegzett kérgi területek működését is befolyásolja (Jones 1998, 2001).
109
A gátló pálya erősségének vizsgálatára kutatócsoportunk kollaborációban végzett kísérleteket. A kísérletek során a ZI lézióját megelőzően és azt követően is vizsgálták a magasabbrendű thalamicus Po sejtjeinek tüzelési aktivitását juxtacelluláris és intracelluláris elvezetés során. Ezen kívül vizsgálták a bajusz-stimulációra adott válasz erősségét, illetve latenciáját. A juxtacelluláris elvezetésből származó eredmények arra utalnak, hogy ZI-lézió után a Po sejtek tüzelése szignifikáns mértékben felgyorsult. Intracelluláris mérésekben a lézió előtt az IPSP-k domináltak, míg lézió után EPSP-k jelentek meg, melyek a kéreg inaktivációját követően is fennmaradtak, ami az EPSP perifériás eredetére utal. A bajusz-ingerlésre adott válasz erőssége megnőtt, latenciája pedig szignifikánsan lerövidült (Lavallee és mtsai 2005). Más kísérletben is bizonyították, hogy a magasabbrendű szomatoszenzoros magban a ZI-ból érkező gátlás elfojtását követően a bajusz-stimuláció kiváltotta válasz latenciája szignifikánsan lecsökkent és amplitúdója szignifikánsan megnőtt (Trageser és Keller 2004). Ezen eredmények alapján elmondható, hogy az incerto-thalamicus gátló rostok előrecstoló gátlás útján (feed forward inhibition) képesek lecsökkenteni a magasabbrendű thalamus sejtjeinek spontán tüzelési aktivitását, csökkentve ezzel a szenzoros jelátvitelt az agykéreg corticothalamicus sejtjei felé. A magasabbrendű szomatoszenzoros Po magban a bajuszokból érkező szenzoros információ hű továbbítása csak a ZI lézióját követően következhet be. Ezek alapján megállapítható, hogy a ZI jelentős gátlást fejt ki a magasabbrendű thalamus sejtjein, így a ZI sejtek a kéreghez kapcsolt aktivitásuk révén valószinűleg hatékonyan befolyásolhatják a thalamocorticalis relésejtek fázispreferenciáját.
Az APT sejtjeinek elektrofiziológiai és morfológai jellemzése
Az APT sejtek tüzelési aktivitása nagy mértékű heterogenitást mutatott, tüzelési aktivitás és PV-tartalom tekintetében három jól elkülönülő sejcsoportot tudtunk megkülönböztetni az APT-ben. Az egyes sejtcsoportok az APT-n belül keverten helyezkedtek el. Megkülönböztettünk gyors burstökkel jellemezhető sejteket, melyek magas (300600 Hz-es) frekvenciás burstökkel tüzeltek a lassú hullámú alvás alatt. A burstök időzítése erős kapcsoltságot mutatott a kérgi aktivitással. Elkülönítettünk tonikus
110
sejteket, melyek a kéregtől függetlenül tüzeltek, és lassú ritmikus tüzeléssel jellemezhető sejteket, melyek még a gyors burstökkel jellemezhető sejtek tüzelésénél is magasabb szinkronitást mutattak a kérgi aktivitással. A gyors bustökkel jellemezhető sejtek
axonterminálisait
juxtacelluláris
elvezetés
és
jelölés
után
vizsgálva
megállapítottuk, hogy azok minden esetben óriás gátló terminálissal létesítettek kapcsolatot a magasabbrendű thalamus célsejtjein. A gyors burstökkel jellemezhető APT sejtek dendritfáján egyedi felépítésű dendrittüskék voltak a jellemzőek, hosszú nyaki majd azt követő feji régióval, míg mindhárom típusú APT sejtre elágazó axonhálózat és a lokális axonkollaterálisok nagy száma volt a jellemző.
Az APT különböző sejttípusainak lehetséges funkciója
Anterográd
pályajelöléses
kísérletekből
ismert,
hogy
az
APT-thalamicus
óriásterminálisok szimmetrikus, gátló, GABAerg szinapszisokat hoznak létre a magasabbrendű thalamus célsejtjein. A terminálisok ultrastruktúrájának vizsgálata során kiderült, hogy a terminális felépítése jellegzetes: egy terminális többszörös szinapszissal és több aktív zónával csatlakozik a magasabbrendű relésejt általában proximális dendritjéhez (Bokor és mtsai 2005, Wanaverbecq és mtsai 2008). Annak igazolásaként, hogy a pretecto-thalamicus pálya igen erős gátlást képes kifejteni a magasabbrendű thalamus sejtjein, pretecto-thalamicus pályát tartalmazó szeleteken végeztek vizsgálatokat svájci kollaborátoraink. A kísérletben APT stimulálást végezték, és igazolták, hogy e gátló pálya stimulációja visszacsapó kisüléssorozatokat (rebound burst) képes kiváltani a magasabbrendű thalamus sejtjein. Ha
a
gyors
burstökkel
jellemezhető
APT
sejtek
aktivitásával
megegyező
tüzelésmintázattal stimuláltak, akkor a célsejtben visszacsapó kisüléssorozatokból álló az aktivitásmintázat volt megfigyelhető (Bokor és mtsai 2005). Ez arra utal, hogy megfelelő membránpotenciál-érték esetén az APT-ből érkező bemeneti gátló jel egy burst sorozat aktivitásban viszi át az információt a magasabbrendű thalamocorticalis relésejtre.
111
62. ábra Rebound burstök a Poban A)
Az
APT-thalamicus
pálya
stimulálása in vitro rebound burstöket vált ki a Po-ban. B) Fast bursting sejt tüzelési aktivitásával történő stimuláció szintén rebound burstöket generál a Po-ban (Bokor és mtsai 2005). Ugyanez
a
szeletpreparátum
lehetőséget biztosított arra, hogy a pretecto-thalamicus és a reticulo-thalamicus pályát felváltva stimuláljuk ugyanazon magasabbrendű (Po) relésejtből történő elvezetés esetén. Magas frekvenciás (50 Hz) stimuláció hatására az nRT-thalamicus terminális esetén a multipulzus depresszió mértéke nagynak bizonyult és a gátló áram fázikus komponensének csökkenése volt megfigyelhető, vagyis az nRT-thalamicus terminális már nem tudta átvinni a gátló információt azonos hatékonysággal; míg az APT-thalamicus terminális továbbra is hűen tudta továbbítani a gyors, gátló impulzusokat; multipulzus depresszió kisebb mértékben volt megfigyelhető, a gátló áram fázikus komponense kevésbé csökkent a perzisztens komponens növekedése mellett (Wanaverbecq és mtsai 2008). Ezek alapján elmondható, hogy a gyors burstökkel jellemezhető sejtek erős gátlást képesek kifejteni a magasabbrendű thalamus sejtjein, és a gátlás hatékonységa nem csökken magas bemeneti frekvencia esetén sem. A tonikus sejtek óraműpontosságú tüzelését a kérgi lassú hullámok megjelenése sem tudta megváltoztatni, így azt gondoljuk, hogy ezen sejtek legfontosabb szerepe a magasabbrendű magok szinkronizációjában rejlik. A lassú ritmikus sejtek nagyfokú szinkron tüzelése a kérgi lassú hullámokkal arra utalhat, hogy ezen sejtek a kérgi információkat továbbítják az APT-be, hiszen az is ismert, hogy az APT igen erős kérgi bemenettel rendelkezik (Foster és mtsai 1989, Cadusseau és Roger 1991).
112
Az extrareticularis gátlórendszer kémiai stimulálása
Annak érdekében, hogy igazoljuk a már in vitro kísérletekben igazolt pretectothalamicus pálya erős gátló hatását, az APT kémiai stimulációját végeztük. Az APT-be injektált GABAA antagonista, bicuculline a lokális kollaterálisok szelektív gátlásával az pretecto-thalamicus pályát serkenti. E felerősített gátlás, így feltételezésünk szerint képes lehet a magasabbrendű thalamus sejtjeinek kérgi oszcillációkhoz történő fáziskapcsoltságát megváltoztatni. Eredményeink azt mutatják azonban, hogy a pretecto-thalamicus pálya gátlásának erősítése nem minden esetben okoz fáziseltolódst a magasabbrendű thalamus sejtjein. Ennek több oka is lehet: 1) Méréseink alapján elmondható, hogy a bicuculline beadást követően nem az APT egésze stimulálódik. Pályajelöléses kísérleteinkből tudjuk, hogy az APT terminálisok kis csoportokban végződnek a Po-ban, valamint lehetséges, hogy az APT nem minden Po sejtre vetít, így elképzelhető, hogy ezért nem kaptunk minden esetben APT indukálta hatást. 2) Az APT lassú ritmikus sejtjeinek morfológiai analízise nem igazolta e sejtek egyértelműen GABAerg jellegét, így lehet, hogy ezek a sejtek serkentőek, így ellentétesen hatnak a Po-ra. Kutatócsoportunk retrográd- és anterográd pályajelöléses kísérletei igazolnak egy kismértékű serkentő komponenst a pretecto-thalamicus pályában (Bokor és mtsai 2005, Giber és mtsai 2008). 3) Kutatócsoportunk leírta, hogy az APT mind gatló, mind serkentő pályát küld a ZI-be, a ZI pedig vetít a Po-ba. Ez az indirekt útvonal szintén befolyásolhatja eredményeinket. 4) Nem zárható ki olyan leszálló APT-ből érkező pályák szerepe, melyek olyan agytörzsi központokat innerválnak, amelyek mind a Po-ba, mind a VB-be vetítenek. 5) Ezen kívül nem zárható ki a kérgi leszálló pályák szerepe. Elképzelhető, hogy kérgi bemenet hatása az APT és a Po területén altatásban, a lassú oszcillációk alatt olyan erős, hogy ezt a pretecto-thalamicus pálya stimulálása nem képes megváltoztatni. 6) Végül nem zárható ki az nRT lehetséges szerepe sem.
113
Az extrareticularis gátlórendszer és a reticularis gátlórendszer
Az itt bemutatott és korábbi eredményink alapján elmondható, hogy a jól ismert thalamocorticalis kör mellett – melyben a gátló funkciókért elsősorban a thalamicus reticularis mag felelős – a magasabbrendű magok esetén egy párhuzamos gátlórendszerről is beszélhetünk. Az APT és a ZI gátló bemenetet küld azokba a thalamicus magokba, melyek serkentő, driver bemenetet kapnak az agykéreg V. rétegétől. Ugyanakkor a ZI és az APT is rendelkezik erős V. rétegi kérgi befolyással, így a már jól ismert thalamocorticalis hurok mellett, melyet a VI. rétegi bemenet és az nRT bemenet alkot, beszélhetünk egy párhuzamos, V. réteg – APT / ZI hurokról. A látszólagos hasonlóság ellenére számos különbség mutatkozik a két rendszerben. 1) Az APT és a ZI az nRT-val ellentétben nem kap bemenetet a thalamustól, így az extrareticularis gátlórendszer külső szabályozóként vehet részt a szabályozásban. 2) A ZI és az APT a nRT-val ellentétben kiterjedt kapcsolatrendszerrel rendelkezik, így részt vehet a thalamocorticalis és az agytörzsi oszcillációk összehangolásában. 3) A APT-thalamicus és ZI-thalamicus szinapszisok többszörös szinapszist létesítenek, többszörös aktív zónával, ellentétben az egyszeres nRT-thalamicus szinapszisokkal. 4) A pretecto-thalamicus szinapszis multipulzus depressziója kisebb mértékű csökkenést mutat magas frekvenciás stimulálásra, mint az nRT-thalamicus szinapszis. 5) A nRT-n belüli vitatott lokális kolaterális-rendszerrel ellentétben az APT és a ZI kiterjedt lokális kollaterális-hálózattal rendelkezik (Power és Mitrofanis 1999b), ami alkalmassá teszi a magon belüli szinkron aktivitás fenntartására. 6) A helyzetet bonyolítja, hogy az APT és a ZI reciprok kapcsolatban áll egymással, mely kapcsolat csak részben GABAerg (Giber és mtsai 2008).
114
63.ábra: Az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus magok serkentő- és gátló kapcsolatrendszerének összefoglalása A serkentő kapcsolatokat szürkével, a gátlókat feketével jelöltük.
115
KÖVETKEZTETÉSEK
A magasabbrendű thalamicus magok relésejtjeinek burst tüzelésében tapasztalható eltérés valószínűleg a sejtek saját (intrinsic) tulajdonsága, míg a kéreghez való szinkronitás-különbség a kérgi bemenetek különbözőségéből eredhet. Ezt az V. rétegi kérgi bemenetek erős volta mellett az is alátámasztani látszik, hogy a PoVPM határsejtek, melyekhez nagy mértékben érkezik az V. rétegi kérgi befolyás bursttulajdonságaikban a VB-re, míg fázis tulajdonságaikban a Po-ra hasonlítottak. A fázispreferenciában adódó különbség a két thalamicus magcsoport között részben az eltérő serkentő kapcsolatrendszerből, részben a magasabbrendű magokra szelektíven érkező extrareticularis gátlásból ered. Az extrareticularis gátlópálya lehetőséget nyújt a magasabbrendű thalamus magjainak szelektív előrecsatoló gátlására (feed-forward inhibition). Jelen doktori értekezés az első összefoglaló munka az extrareticularis gátlórendszer sejtjeinek elektrofiziológiai jellemzésére.
116
ÖSSZEFOGLALÁS
A thalamus az agy egyik legfontosabb kéregalatti jelszűrő és jeltovábbító átkapcsoló struktúrája. A thalamus kapcsolatrendszere, így funkciója alapján két eltérő típusú magcsoportra osztható. Megkülönböztethetünk elsőrendű magokat, melyek feladata információszűrés és jeltovábbítás az agykéreg felé, és megkülönböztetünk magasabbrendű magokat, melyek komplexebb, integratív folyamatokban játszhatnak fontos szerepet. Kutatócsoportunk bebízonyította, hogy ezen magcsoportok nem csak a már régebben leírt serkentő kapcsolatrendszerükben különböznek, hanem eltérő gátlórendszerrel is rendelkeznek. Mindkét magcsoportra érkezik reticularis gátlás, azonban a magasabbrendű magokra egy szelektív, a thalamicus reticularis magtól különböző, azon kívül eső, ún. extrareticularis gátlás is érkezik. Doktori munkám során a két eltérő típusú magcsoport relésejtjeinek tüzelési mintázatát és a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz való fáziskapcsoltságát vizsgáltam in vivo elektrofiziológiai módszerek segítségével altatott patkányokon, majd két extrareticularis mag, az anterior pretectum (APT) és a zona inccerta (ZI) sejtjeinek tüzelési tulajdonságait és a lassú hullámú kérgi aktivitáshoz való fáziskapcsoltságát vizsgáltam, majd a pretecto-thalamicus pálya kémia stimulálásának hatását vizsgáltam a magasabbrendű thalamicus magok tüzelési tulajdonságaira. Eredményeink alapján az elsőrendű- és magasabbrendű thalamicus magok tüzelési tulajdonságai és lassú hullámú aktivitáshoz való fáziskapcsoltságuk különbözik. Az APT-ben elkülönülő három sejtcsoport közül a gyors burstökkel jellemezhető csoport erős gátlást fejthet ki a magasabbrendű thalamus célsejtjein. A ZI-ben leírt két elkülönülő csoport közül a fázikus sejtek többsége a relésejtekkel megegyező vagy azokat meghaladó szinkronitást mutatott a kérgi lassú hullámú oszcillációkkal. Az APT kémiai stimulálása megváltoztatta a magasabbrendű relésejtek fázisviszonyait és tüzelési aktivitását. A fázispreferenciában adódó különbség a két thalamicus magcsoport között részben az eltérő serkentő kapcsolatrendszerből (V. rétegi bemenet), részben a magasabbrendű magokra szelektíven érkező extrareticularis gátlásból ered. A kéregnek e két eltérő thalamocorticalis rendszerből érkező információt kell összehangolnia.
117
SUMMARY
The thalamus is one of the most prominent subcortical structures that relays and transmits information to the cortex. Thalamic nuclei can be diveded into two separate types according to their function. First order nuclei are responsible for the information filtering and signal transmission towards the cortex, whereas higher order thalamic nuclei might play a role in more complex, integrative functions. Recently it was shown by our laboratory that the latter relays differ not only in their excitatory network properties described previously, but they also possess a different inhibitory system. Both groups of nuclei receive reticular inhibition, but there are other sources of inhibitory inputs arriving selectively to higher order thalamic nuclei which originate outside of the thalamic reticular nucleus, hence their name: extrareticular inhibitory sytem. In my thesis, I focused first on the difference of the firing properties and the phase properties of the cortical slow oscillations of the first order and higher order relays by applying in vivo electrophysiological methods on anaesthetized rats. Then I started to examine two nuclei of the extrareticular inhibitory system. First, I examined the firing properties and the phase characteristic of the anterior pretectum (APT) and zona incerta (ZI), then I examined the effect of the chemical stimulation of the pretectothalamic pathway on the firing properties of higher order thalamic nuclei. Our results show that first order and higher order thalamic relays differ in their firing characteristics and their phase properties to slow oscillations. From the three cell types we distinguished in the APT, the group of fast bursting cells was capable of transmitting a very strong inhibition to the higher order target cells. From the two groups of ZI cells, the majority of the modulated ones showed as high or even higher synchrony to the cortical slow wave oscillations as relay cells. Chemical stimulation of the APT changed the firing and phase properties of higher order relay cells. The difference in the phase properties between these two types of thalamic nuclei might partly arise from the difference in their excitatory network properties (V. layer input), or partly from the extrareticular inhibition arriving selectively onto higher order nuclei. The neocortex has to deal with these two types of information coming from the two different thalamocortical systems.
118
IRODALOMJEGYZÉK
Alexander GM, Carden WB, Mu J, Kurukulasuriya NC, McCool BA, Nordskog BK, Friedman DP, Daunais JB, Grant KA, Godwin DW (2006) The native T-type calcium current in relay neurons of the primate thalamus. Neuroscience 141:453-461. Andersen P, Eccles JC, Sears TA (1964) The Ventro-Basal Complex of the Thalamus: Types of Cells, Their Responses and Their Functional Organization. J Physiol 174:370-399. Avanzini G, de Curtis M, Panzica F, Spreafico R (1989) Intrinsic properties of nucleus reticularis thalami neurones of the rat studied in vitro. J Physiol 416:111-122. Bal T, McCormick DA (1993) Mechanisms of oscillatory activity in guinea-pig nucleus reticularis thalami in vitro: a mammalian pacemaker. J Physiol 468:669-691. Bal T, von Krosigk M, McCormick DA (1995a) Synaptic and membrane mechanisms underlying synchronized oscillations in the ferret lateral geniculate nucleus in vitro. J Physiol 483 ( Pt 3):641-663. Bal T, von Krosigk M, McCormick DA (1995b) Role of the ferret perigeniculate nucleus in the generation of synchronized oscillations in vitro. J Physiol 483 ( Pt 3):665-685. Bando T, Zambelli A, Spencer WA (1980) Rebound excitation and the rhythmic activity of the ventrobasal complex of the thalamus. Brain Res 192:29-38. Bartho P, Freund TF, Acsady L (2002) Selective GABAergic innervation of thalamic nuclei from zona incerta. Eur J Neurosci 16:999-1014. Bartlett EL, Stark JM, Guillery RW, Smith PH (2000) Comparison of the fine structure of cortical and collicular terminals in the rat medial geniculate body. Neuroscience 100:811-828. Berger (2008) Dendritic activity in layer 5 pyramidal cells in the somatosensory cortex in vitro during upstates. In: 6th FENS Forum Of European Neuroscience. Geneva. Bezdudnaya T, Cano M, Bereshpolova Y, Stoelzel CR, Alonso JM, Swadlow HA (2006) Thalamic burst mode and inattention in the awake LGNd. Neuron 49:421-432.
119
Bloomfield SA, Hamos JE, Sherman SM (1987) Passive cable properties and morphological correlates of neurones in the lateral geniculate nucleus of the cat. J Physiol 383:653-692. Bokor H, Frere SG, Eyre MD, Slezia A, Ulbert I, Luthi A, Acsady L (2005) Selective GABAergic control of higher-order thalamic relays. Neuron 45:929-940. Borhegyi Z, Varga V, Szilagyi N, Fabo D, Freund TF (2004) Phase segregation of medial septal GABAergic neurons during hippocampal theta activity. J Neurosci 24:8470-8479. Bourassa J, Deschenes M (1995) Corticothalamic projections from the primary visual cortex in rats: a single fiber study using biocytin as an anterograde tracer. Neuroscience 66:253-263. Bourassa J, Pinault D, Deschenes M (1995) Corticothalamic projections from the cortical barrel field to the somatosensory thalamus in rats: a single-fibre study using biocytin as an anterograde tracer. Eur J Neurosci 7:19-30. Broman J (1994) Neurotransmitters in subcortical somatosensory pathways. Anat Embryol (Berl) 189:181-214. Brunton J, Charpak S (1997) Heterogeneity of cell firing properties and opioid sensitivity in the thalamic reticular nucleus. Neuroscience 78:303-307. Cadusseau J, Roger M (1991) Cortical and subcortical connections of the pars compacta of the anterior pretectal nucleus in the rat. Neurosci Res 12:83-100. Cajal SRY (1995) Histology of the Nervous System. Oxford: Oxford University Press. Castro-Alamancos MA (2002) Properties of primary sensory (lemniscal) synapses in the ventrobasal thalamus and the relay of high-frequency sensory inputs. J Neurophysiol 87:946-953. Castro-Alamancos MA (2004) Dynamics of sensory thalamocortical synaptic networks during information processing states. Prog Neurobiol 74:213-247. Castro-Alamancos MA, Connors BW (1997) Thalamocortical synapses. Progress in Neurobiology 51:581-606. Castro-Alamancos MA, Calcagnotto ME (1999) Presynaptic long-term potentiation in corticothalamic synapses. J Neurosci 19:9090-9097.
120
Condo GJ, Wilson PD (1990) Morphological organization of thalamocortical relay cells in the dorsal lateral geniculate nucleus of the North American opossum. J Comp Neurol 292:303-319. Contreras D, Curro Dossi R, Steriade M (1992) Bursting and tonic discharges in two classes of reticular thalamic neurons. J Neurophysiol 68:973-977. Contreras D, Curro Dossi R, Steriade M (1993) Electrophysiological properties of cat reticular thalamic neurones in vivo. J Physiol 470:273-294. Contreras D, Destexhe A, Sejnowski TJ, Steriade M (1996) Control of spatiotemporal coherence of a thalamic oscillation by corticothalamic feedback. Science 274:771-774. Coulter DA, Huguenard JR, Prince DA (1989) Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. J Physiol 414:587-604. Cowan RL, Wilson CJ (1994) Spontaneous firing patterns and axonal projections of single corticostriatal neurons in the rat medial agranular cortex. J Neurophysiol 71:17-32. Crabtree JW (1996) Organization in the somatosensory sector of the cat's thalamic reticular nucleus. J Comp Neurol 366:207-222. Crabtree JW (1999) Intrathalamic sensory connections mediated by the thalamic reticular nucleus. Cell Mol Life Sci 56:683-700. Crunelli V, Leresche N, Parnavelas JG (1987a) Membrane properties of morphologically identified X and Y cells in the lateral geniculate nucleus of the cat in vitro. The Journal of physiology 390:243-256. Crunelli V, Lightowler S, Pollard CE (1989) A T-type Ca2+ current underlies lowthreshold Ca2+ potentials in cells of the cat and rat lateral geniculate nucleus. J Physiol 413:543-561. Crunelli V, Kelly JS, Leresche N, Pirchio M (1987b) The ventral and dorsal lateral geniculate nucleus of the rat: intracellular recordings in vitro. J Physiol 384:587601. Denning KS, Reinagel P (2005) Visual control of burst priming in the anesthetized lateral geniculate nucleus. J Neurosci 25:3531-3538.
121
Deschenes M, Bourassa J, Pinault D (1994) Corticothalamic projections from layer V cells in rat are collaterals of long-range corticofugal axons. Brain Res 664:215219. Deschenes M, Paradis M, Roy JP, Steriade M (1984) Electrophysiology of neurons of lateral thalamic nuclei in cat: resting properties and burst discharges. J Neurophysiol 51:1196-1219. Destexhe A, Neubig M, Ulrich D, Huguenard J (1998) Dendritic low-threshold calcium currents in thalamic relay cells. The Journal of neuroscience 18:3574-3588. Domich L, Oakson G, Steriade M (1986) Thalamic burst patterns in the naturally sleeping cat: a comparison between cortically projecting and reticularis neurones. J Physiol 379:429-449. Emri Z, Antal K, Crunelli V (2003) The impact of corticothalamic feedback on the output dynamics of a thalamocortical neurone model: the role of synapse location and metabotropic glutamate receptors. Neuroscience 117:229-239. Fanselow EE, Sameshima K, Baccala LA, Nicolelis MA (2001) Thalamic bursting in rats during different awake behavioral states. Proc Natl Acad Sci U S A 98:15330-15335. Ferster D, LeVay S (1978) The axonal arborizations of lateral geniculate neurons in the striate cortex of the cat. J Comp Neurol 182:923-944. Forel A (1877) Untersuchungen über die haubenregion und ihre oberen verknüpfungen im gehirne des menschen und einiger saügethiere, mit beitragen zu den methoden der gehirnuntersuchung. Arch Psychiat Nervenkr:393–495. Foster GA, Sizer AR, Rees H, Roberts MH (1989) Afferent projections to the rostral anterior pretectal nucleus of the rat: a possible role in the processing of noxious stimuli. Neuroscience 29:685-694. Fremeau RT, Jr., Voglmaier S, Seal RP, Edwards RH (2004a) VGLUTs define subsets of excitatory neurons and suggest novel roles for glutamate. Trends Neurosci 27:98-103. Fremeau RT, Jr., Kam K, Qureshi T, Johnson J, Copenhagen DR, Storm-Mathisen J, Chaudhry FA, Nicoll RA, Edwards RH (2004b) Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science 304:18151819.
122
Fremeau RT, Jr., Troyer MD, Pahner I, Nygaard GO, Tran CH, Reimer RJ, Bellocchio EE, Fortin D, Storm-Mathisen J, Edwards RH (2001) The expression of vesicular glutamate transporters defines two classes of excitatory synapse. Neuron 31:247-260. Friedlander MJ, Lin CS, Stanford LR, Sherman SM (1981) Morphology of functionally identified neurons in lateral geniculate nucleus of the cat. J Neurophysiol 46:80129. Fujiyama F, Furuta T, Kaneko T (2001) Immunocytochemical localization of candidates for vesicular glutamate transporters in the rat cerebral cortex. J Comp Neurol 435:379-387. Fukuda Y, Sumitomo I, Sugitani M, Iwama K (1979) Receptive-field properties of cells in the dorsal part of the albino rat's lateral geniculate nucleus. Jpn J Physiol 29:283-307. Gabor D (1946) Theory of communication. J Inst Electr Eng 93:429-457. Giber K, Slezia A, Bokor H, Bodor AL, Ludanyi A, Katona I, Acsady L (2008) Heterogeneous output pathways link the anterior pretectal nucleus with the zona incerta and the thalamus in rat. The Journal of comparative neurology 506:122140. Golshani P, Liu XB, Jones EG (2001) Differences in quantal amplitude reflect GluR4subunit number at corticothalamic synapses on two populations of thalamic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 98:4172-4177. Grofova I, Rinvik E (1974) Cortical and pallidal projections to the nucleus ventralis lateralis thalami. Electron microscopical studies in the cat. Anat Embryol (Berl) 146:113-132. Groh A, de Kock C, Wimmer V, Sakmann B, Kuner T (2008) Driver or coincidence detector: modal switch of a corticothalamic giant synapse controlled by spontaneous activity and short-term depression. J Neurosci:In press. Guido W, Weyand T (1995) Burst responses in thalamic relay cells of the awake behaving cat. J Neurophysiol 74:1782-1786. Guillery RW, Feig SL, Lozsadi DA (1998) Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends Neurosci 21:28-32.
123
Guillery RW, Feig SL, Van Lieshout DP (2001) Connections of higher order visual relays in the thalamus: a study of corticothalamic pathways in cats. J Comp Neurol 438:66-85. Hangya B, Slézia A, Bokor H, Ulbert I, Varga V, L. Acsády L. (2008) Burst identification in thalamocortical neurons by the means of hierarchical cluster analysis. In: 6th FENS Forum of European Neuroscience. Geneva, Switzerland. Harpring JE, Pearson JC, Norris JR, Mann BL (1985) Subclassification of neurons in the ventrobasal complex of the dog: quantitative Golgi study using principal components analysis. J Comp Neurol 242:230-246. Harris RM (1986) Morphology of physiologically identified thalamocortical relay neurons in the rat ventrobasal thalamus. J Comp Neurol 251:491-505. Havton LA, Ohara PT (1994) The brain of Karen Ann Quinlan. N Engl J Med 331:1378; author reply 1379-1380. Hazlett JC, Dutta CR, Fox CA (1976) The neurons in the centromedian-parafascicular complex of the monkey (Macaca mulatta): a Golgi study. J Comp Neurol 168:41-73. Heise CE, Mitrofanis J (2004) Evidence for a glutamatergic projection from the zona incerta to the basal ganglia of rats. J Comp Neurol 468:482-495. Herzog E, Bellenchi GC, Gras C, Bernard V, Ravassard P, Bedet C, Gasnier B, Giros B, El Mestikawy S (2001) The existence of a second vesicular glutamate transporter specifies subpopulations of glutamatergic neurons. J Neurosci 21:RC181. Hirsch JC, Fourment A, Marc ME (1983) Sleep-related variations of membrane potential in the lateral geniculate body relay neurons of the cat. Brain Res 259:308-312. Hoogland PV, Wouterlood FG, Welker E, Van der Loos H (1991) Ultrastructure of giant and small thalamic terminals of cortical origin: a study of the projections from the barrel cortex in mice using Phaseolus vulgaris leuco-agglutinin (PHAL). Exp Brain Res 87:159-172. Houser CR, Vaughn JE, Barber RP, Roberts E (1980) GABA neurons are the major cell type of the nucleus reticularis thalami. Brain Res 200:341-354.
124
Huguenard JR (1996) Low-threshold calcium currents in central nervous system neurons. Annu Rev Physiol 58:329-348. Huguenard JR, Prince DA (1991) Slow inactivation of a TEA-sensitive K current in acutely isolated rat thalamic relay neurons. J Neurophysiol 66:1316-1328. Huguenard JR, McCormick DA (1992) Simulation of the currents involved in rhythmic oscillations in thalamic relay neurons. J Neurophysiol 68:1373-1383. Huguenard JR, Prince DA (1992) A novel T-type current underlies prolonged Ca(2+)dependent burst firing in GABAergic neurons of rat thalamic reticular nucleus. J Neurosci 12:3804-3817. Huguenard JR, Prince DA (1994) Intrathalamic rhythmicity studied in vitro: nominal Tcurrent modulation causes robust antioscillatory effects. J Neurosci 14:54855502. Huguenard JR, Coulter DA, Prince DA (1991) A fast transient potassium current in thalamic relay neurons: kinetics of activation and inactivation. J Neurophysiol 66:1304-1315. Hurtado JM, Rubchinsky LL, Sigvardt KA (2004) Statistical method for detection of phase-locking episodes in neural oscillations. J Neurophysiol 91:1883-1898. Jacobsen RB, Ulrich D, Huguenard JR (2001) GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. J Neurophysiol 86:1365-1375. Jahnsen H, Llinas R (1984a) Electrophysiological properties of guinea-pig thalamic neurones: an in vitro study. J Physiol 349:205-226. Jahnsen H, Llinas R (1984b) Ionic basis for the electro-responsiveness and oscillatory properties of guinea-pig thalamic neurones in vitro. J Physiol 349:227-247. Jones E (1985) The Thalamus. New York: Plenum Press. Jones EG (1998) Viewpoint: the core and matrix of thalamic organization. Neuroscience 85:331-345. Jones EG (2001) The thalamic matrix and thalamocortical synchrony. Trends Neurosci 24:595-601. Kaneko T, Mizuno N (1988) Immunohistochemical study of glutaminase-containing neurons in the cerebral cortex and thalamus of the rat. J Comp Neurol 267:590602.
125
Kaneko T, Fujiyama F, Hioki H (2002) Immunohistochemical localization of candidates for vesicular glutamate transporters in the rat brain. J Comp Neurol 444:39-62. Killackey HP, Sherman SM (2003) Corticothalamic projections from the rat primary somatosensory cortex. J Neurosci 23:7381-7384. Kimura A, Grigor'yan R, Asanuma H (1999) Long-term increases in neuronal activity in the motor cortex evoked by simultaneous stimulation of the thalamus and somatosensory cortex in cats. Neurosci Behav Physiol 29:475-481. Kinney HC, Korein J, Panigrahy A, Dikkes P, Goode R (1994) Neuropathological findings in the brain of Karen Ann Quinlan. The role of the thalamus in the persistent vegetative state. N Engl J Med 330:1469-1475. Kiss A, Tombol T (1972) Golgi analysis and degeneration studies of the nucleus ventralis lateralis and ventralis medialis in the cat thalamus. Brain Res 47:303315. Kolmac C, Mitrofanis J (1998) Distribution of various neurochemicals within the zona incerta: an immunocytochemical and histochemical study. Anat Embryol (Berl) 199:265-280. Kolmac CI, Power BD, Mitrofanis J (1998) Patterns of connections between zona incerta and brainstem in rats. J Comp Neurol 396:544-555. Kölliker VA (1896) Handbuch der Gewebelehre des Menschen. Nervensystemen des Menschen und der Thiere, 6 Edition. Leipzig: Engelmann. Kraushaar U, Jonas P (2000) Efficacy and stability of quantal GABA release at a hippocampal interneuron-principal neuron synapse. The Journal of Neuroscience 20:5594-5607. Kultas-Ilinsky K, Ilinsky I, Warton S, Smith KR (1983) Fine structure of nigral and pallidal afferents in the thalamus: an EM autoradiography study in the cat. J Comp Neurol 216:390-405. Kultas-Ilinsky K, Reising L, Yi H, Ilinsky IA (1997) Pallidal afferent territory of the Macaca mulatta thalamus: neuronal and synaptic organization of the VAdc. The Journal of comparative neurology 386:573-600. Kuroda M, Price JL (1991) Synaptic organization of projections from basal forebrain structures to the mediodorsal thalamic nucleus of the rat. J Comp Neurol 303:513-533.
126
Landisman CE, Connors BW (2007) VPM and PoM nuclei of the rat somatosensory thalamus: intrinsic neuronal properties and corticothalamic feedback. Cereb Cortex 17:2853-2865. Landisman CE, Long MA, Beierlein M, Deans MR, Paul DL, Connors BW (2002) Electrical synapses in the thalamic reticular nucleus. J Neurosci 22:1002-1009. Landry M, Bouali-Benazzouz R, El Mestikawy S, Ravassard P, Nagy F (2004) Expression of vesicular glutamate transporters in rat lumbar spinal cord, with a note on dorsal root ganglia. J Comp Neurol 468:380-394. Lavallee P, Urbain N, Dufresne C, Bokor H, Acsady L, Deschenes M (2005) Feedforward inhibitory control of sensory information in higher-order thalamic nuclei. J Neurosci 25:7489-7498. Lee SH, Govindaiah G, Cox CL (2007) Heterogeneity of firing properties among rat thalamic reticular nucleus neurons. J Physiol 582:195-208. Leresche N, Lightowler S, Soltesz I, Jassik-Gerschenfeld D, Crunelli V (1991) Lowfrequency oscillatory activities intrinsic to rat and cat thalamocortical cells. J Physiol 441:155-174. Lesica NA, Stanley GB (2004) Encoding of natural scene movies by tonic and burst spikes in the lateral geniculate nucleus. J Neurosci 24:10731-10740. Li J, Bickford ME, Guido W (2003) Distinct firing properties of higher order thalamic relay neurons. J Neurophysiol 12:12. Liao CC, Lai WS, Yen CT (2008) Preferential distribution of large corticothalamic terminals in the boundary region of the ventroposterior nucleus in the mice. In: Neuroscience 2008, 38th Annual Meeting of the Society For Neuroscience. Washington DC. Lin CS, Nicolelis MA, Schneider JS, Chapin JK (1990) A major direct GABAergic pathway from zona incerta to neocortex. Science 248:1553-1556. Lindstrom S, Wrobel A (1990) Private inhibitory systems for the X and Y pathways in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat. J Physiol 429:259-280. Llinas R, Jahnsen H (1982) Electrophysiology of mammalian thalamic neurones in vitro. Nature 297:406-408. Llinas RR (1988) The intrinsic electrophysiological properties of mammalian neurons: insights into central nervous system function. Science 242:1654-1664.
127
Llinas RR, Steriade M (2006) Bursting of thalamic neurons and states of vigilance. J Neurophysiol 95:3297-3308. Lubke J (1993) Morphology of neurons in the thalamic reticular nucleus (TRN) of mammals as revealed by intracellular injections into fixed brain slices. J Comp Neurol 329:458-471. May PJ, Sun W, Hall WC (1997) Reciprocal connections between the zona incerta and the pretectum and superior colliculus of the cat. Neuroscience 77:1091-1114. McAllister JP, Wells J (1981) The structural organization of the ventral posterolateral nucleus in the rat. J Comp Neurol 197:271-301. McCormick DA, Feeser HR (1990) Functional implications of burst firing and single spike activity in lateral geniculate relay neurons. Neuroscience 39:103-113. McCormick DA, Huguenard JR (1992) A model of the electrophysiological properties of thalamocortical relay neurons. J Neurophysiol 68:1384-1400. Metherate R, Ashe JH (1993a) Ionic flux contributions to neocortical slow waves and nucleus basalis-mediated activation: whole-cell recordings in vivo. J Neurosci 13:5312-5323. Metherate R, Ashe JH (1993b) Nucleus basalis stimulation facilitates thalamocortical synaptic transmission in the rat auditory cortex. Synapse 14:132-143. Mitrofanis J (2005) Some certainty for the "zone of uncertainty"? Exploring the function of the zona incerta. Neuroscience 130:1-15. Mitrofanis J, Mikuletic L (1999) Organisation of the cortical projection to the zona incerta of the thalamus. J Comp Neurol 412:173-185. Mitrofanis J, deFonseka R (2001) Organisation of connections between the zona incerta and the interposed nucleus. Anat Embryol (Berl) 204:153-159. Morest DK (1964) The Neuronal Architecture of the Medial Geniculate Body of the Cat. J Anat 98:611-630. Morest DK (1965) The Laminar Structure of the Medial Geniculate Body of the Cat. J Anat 99:143-160. Moruzzi G, Magoun HW (1949) Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1:455-473.
128
Mukherjee P, Kaplan E (1995) Dynamics of neurons in the cat lateral geniculate nucleus: in vivo electrophysiology and computational modeling. J Neurophysiol 74:1222-1243. Mulle C, Madariaga A, Deschenes M (1986) Morphology and electrophysiological properties of reticularis thalami neurons in cat: in vivo study of a thalamic pacemaker. J Neurosci 6:2134-2145. Nicolelis MA, Chapin JK, Lin RC (1992) Somatotopic maps within the zona incerta relay parallel GABAergic somatosensory pathways to the neocortex, superior colliculus, and brainstem. Brain Res 577:134-141. Nicolelis MA, Chapin JK, Lin RC (1995) Development of direct GABAergic projections from the zona incerta to the somatosensory cortex of the rat. Neuroscience 65:609-631. Ohara PT, Havton LA (1994a) Preserved features of thalamocortical projection neuron dendritic architecture in the somatosensory thalamus of the rat, cat and macaque. Brain Res 648:259-264. Ohara PT, Havton LA (1994b) Dendritic architecture of rat somatosensory thalamocortical projection neurons. J Comp Neurol 341:159-171. Ojima H (1994) Terminal morphology and distribution of corticothalamic fibers originating from layers 5 and 6 of cat primary auditory cortex. Cereb Cortex 4:646-663. Pape HC (1994) Specific bradycardic agents block the hyperpolarization-activated cation current in central neurons. Neuroscience 59:363-373. Paxinos G, Watson C (1998) The rat brain in stereotaxic coordinates, Fourth Edition Edition. London: Academic Press. Pearson JC, Haines DE (1980) Somatosensory thalamus of a prosimian primate (Galago senegalensis). I. Configuration of nuclei and termination of spinothalamic fibers. J Comp Neurol 190:533-558. Pearson JC, Norris JR, Phelps CH (1984) The cytoarchitecture and some efferent projections of the centromedian-parafascicular complex in the lesser bushbaby (Galago senegalensis). J Comp Neurol 225:554-569. Perez-Reyes E (2003) Molecular physiology of low-voltage-activated t-type calcium channels. Physiol Rev 83:117-161.
129
Peschanski M, Ralston HJ, Roudier F (1983) Reticularis thalami afferents to the ventrobasal complex of the rat thalamus: an electron microscope study. Brain Res 270:325-329. Pinault D (1996) A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J Neurosci Methods 65:113-136. Pinault D (2004) The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Res Brain Res Rev 46:1-31. Pinault D, Bourassa J, Deschenes M (1995) The axonal arborization of single thalamic reticular neurons in the somatosensory thalamus of the rat. Eur J Neurosci 7:3140. Pinault D, Vergnes M, Marescaux C (2001) Medium-voltage 5-9-Hz oscillations give rise to spike-and-wave discharges in a genetic model of absence epilepsy: in vivo dual extracellular recording of thalamic relay and reticular neurons. Neuroscience 105:181-201. Pinault D, Slezia A, Acsady L (2006) Corticothalamic 5-9 Hz oscillations are more proepileptogenic than sleep spindles in rats. The Journal of physiology 574:209227. Power BD, Mitrofanis J (1999a) Specificity of projection among cells of the zona incerta. J Neurocytol 28:481-493. Power BD, Mitrofanis J (1999b) Evidence for extensive inter-connections within the zona incerta in rats. Neurosci Lett 267:9-12. Price JL, Slotnick BM (1983) Dual olfactory representation in the rat thalamus: an anatomical and electrophysiological study. J Comp Neurol 215:63-77. Puelles L, Rubenstein JL (2003) Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends Neurosci 26:469-476. Ramcharan EJ, Gnadt JW, Sherman SM (2000a) Burst and tonic firing in thalamic cells of unanesthetized, behaving monkeys. Vis Neurosci 17:55-62. Ramcharan EJ, Gnadt JW, Sherman SM (2005) Higher-order thalamic relays burst more than first-order relays. Proc Natl Acad Sci U S A 102:12236-12241.
130
Ramcharan EJ, Cox CL, Zhan XJ, Sherman SM, Gnadt JW (2000b) Cellular mechanisms underlying activity patterns in the monkey thalamus during visual behavior. J Neurophysiol 84:1982-1987. Reichova I, Sherman SM (2004) Somatosensory corticothalamic projections: distinguishing drivers from modulators. J Neurophysiol 92:2185-2197. Reinagel P (2007) The inner life of bursts. Neuron 55:339-341. Ricardo JA (1981) Efferent connections of the subthalamic region in the rat. II. The zona incerta. Brain Res 214:43-60. Rockland KS (1996) Two types of corticopulvinar terminations: round (type 2) and elongate (type 1). J Comp Neurol 368:57-87. Roger M, Cadusseau J (1985) Afferents to the zona incerta in the rat: a combined retrograde and anterograde study. J Comp Neurol 241:480-492. Romanowski CA, Mitchell IJ, Crossman AR (1985) The organisation of the efferent projections of the zona incerta. J Anat 143:75-95. Rouiller EM, Welker E (2000) A comparative analysis of the morphology of corticothalamic projections in mammals. Brain Res Bull 53:727-741. Roy JP, Clercq M, Steriade M, Deschenes M (1984) Electrophysiology of neurons of lateral thalamic nuclei in cat: mechanisms of long-lasting hyperpolarizations. J Neurophysiol 51:1220-1235. Sanchez-Vives MV, McCormick DA (2000) Cellular and network mechanisms of rhythmic recurrent activity in neocortex. Nat Neurosci 3:1027-1034. Sawyer SF, Young SJ, Groves PM (1989) Quantitative Golgi study of anatomically identified subdivisions of motor thalamus in the rat. J Comp Neurol 286:1-27. Scheibel ME, Scheibel AB (1966a) The organization of the ventral anterior nucleus of the thalamus. A Golgi study. Brain Res 1:250-268. Scheibel ME, Scheibel AB (1966b) The organization of the nucleus reticularis thalami: a Golgi study. Brain Res 1:43-62. Shammah-Lagnado SJ, Negrao N, Ricardo JA (1985) Afferent connections of the zona incerta: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience 15:109-134. Sherman S, Guillery R (2006) Exploring the Thalamus and Its Role in Cortical Function: Academic Press.
131
Sherman SM (2001) Tonic and burst firing: dual modes of thalamocortical relay. Trends Neurosci 24:122-126. Sherman SM, Koch C (1986) The control of retinogeniculate transmission in the mammalian lateral geniculate nucleus. Exp Brain Res 63:1-20. Sherman SM, Guillery RW (1996) Functional organization of thalamocortical relays. J Neurophysiol 76:1367-1395. Shosaku A, Kayama Y, Sumitomo I (1984) Somatotopic organization in the rat thalamic reticular nucleus. Brain Res 311:57-63. Shu Y, Hasenstaub A, McCormick DA (2003) Turning on and off recurrent balanced cortical activity. Nature 423:288-293. Somogyi G, Tombol T, Hajdu F (1973) Some golgi observations in the nucleus anterior ventralis and anterior medialis thalami of the cat. Z Anat Entwicklungsgesch 139:247-258. Spreafico R, Battaglia G, Frassoni C (1991) The reticular thalamic nucleus (RTN) of the rat: cytoarchitectural, Golgi, immunocytochemical, and horseradish peroxidase study. J Comp Neurol 304:478-490. Spreafico R, de Curtis M, Frassoni C, Avanzini G (1988) Electrophysiological characteristics of morphologically identified reticular thalamic neurons from rat slices. Neuroscience 27:629-638. Stanford LR, Friedlander MJ, Sherman SM (1983) Morphological and physiological properties of geniculate W-cells of the cat: a comparison with X- and Y-cells. J Neurophysiol 50:582-608. Stehberg J, Acuna-Goycolea C, Ceric F, Torrealba F (2001) The visceral sector of the thalamic reticular nucleus in the rat. Neuroscience 106:745-755. Steriade M (1996) Arousal: revisiting the reticular activating system. Science 272:225226. Steriade M, Llinas RR (1988) The functional states of the thalamus and the associated neuronal interplay. Physiol Rev 68:649-742. Steriade M, Timofeev I (2003) Neuronal plasticity in thalamocortical networks during sleep and waking oscillations. Neuron 37:563-576. Steriade M, Domich L, Oakson G (1986) Reticularis thalami neurons revisited: activity changes during shifts in states of vigilance. J Neurosci 6:68-81.
132
Steriade M, McCormick DA, Sejnowski TJ (1993) Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science 262:679-685. Steriade M, Deschenes M, Domich L, Mulle C (1985) Abolition of spindle oscillations in thalamic neurons disconnected from nucleus reticularis thalami. J Neurophysiol 54:1473-1497. Swadlow HA, Gusev AG (2001) The impact of 'bursting' thalamic impulses at a neocortical synapse. Nat Neurosci 4:402-408. Szentagothai J, Hamori J, Tombol T (1966) Degeneration and electron microscope analysis of the synaptic glomeruli in the lateral geniculate body. Exp Brain Res 2:283-301. Talley EM, Cribbs LL, Lee JH, Daud A, Perez-Reyes E, Bayliss DA (1999) Differential distribution of three members of a gene family encoding low voltage-activated (T-type) calcium channels. J Neurosci 19:1895-1911. Telgkamp P, Padgett DE, Ledoux VA, Woolley CS, Raman IM (2004) Maintenance of high-frequency transmission at purkinje to cerebellar nuclear synapses by spillover from boutons with multiple release sites. Neuron 41:113-126. Terenzi MG, Zagon A, Roberts MH (1995) Efferent connections from the anterior pretectal nucleus to the diencephalon and mesencephalon in the rat. Brain Res 701:183-191. Terenzi MG, Rees H, Morgan SJ, Foster GA, Roberts MH (1991) The antinociception evoked by anterior pretectal nucleus stimulation is partially dependent upon ventrolateral medullary neurones. Pain 47:231-239. Theyel BB, Llano DA, Sherman SM (2008) The cortico-thalamo-cortical relay: a potent circuit for intercortical information flow. In: Neuroscience 2008, 38th Annual Meeting of the Society For Neuroscience. Washington DC. Timofeev (2008) Spontaneous activity in the thalamocortical network during sleep and wakefulness. In: 6th FENS Forum Of European Neuroscience. Geneva. Todorovic SM, Lingle CJ (1998) Pharmacological properties of T-type Ca2+ current in adult rat sensory neurons: effects of anticonvulsant and anesthetic agents. J Neurophysiol 79:240-252. Tombol T (1967) Short neurons and their synaptic relations in the specific thalamic nuclei. Brain Res 3:307-326.
133
Tombol T (1969) Two types of short axon (Golgi 2nd) interneurons in the specific thalamic nuclei. Acta Morphol Acad Sci Hung 17:285-297. Tombol T, Bentivoglio M, Macchi G (1990) Neuronal cell types in the thalamic intralaminar central lateral nucleus of the cat. Exp Brain Res 81:491-499. Torrence C, Compo G (1998) A Practical Guide to Wavelet Analysis. Bulletin of the American Meteorological Society. Trageser JC, Keller A (2004) Reducing the uncertainty: gating of peripheral inputs by zona incerta. J Neurosci 24:8911-8915. Tseng GF, Royce GJ (1986) A Golgi and ultrastructural analysis of the centromedian nucleus of the cat. J Comp Neurol 245:359-378. Varela C, Sherman SM (2007) Differences in response to muscarinic activation between first and higher order thalamic relays. Journal of Neurophysiology 98:35383547. Varela C, Sherman SM (2008) Differences in Response to Serotonergic Activation between First and Higher Order Thalamic Nuclei. Cereb Cortex. Varoqui H, Schafer MK, Zhu H, Weihe E, Erickson JD (2002) Identification of the differentiation-associated Na+/PI transporter as a novel vesicular glutamate transporter expressed in a distinct set of glutamatergic synapses. J Neurosci 22:142-155. Veinante P, Deschenes M (1999) Single- and multi-whisker channels in the ascending projections from the principal trigeminal nucleus in the rat. J Neurosci 19:50855095. Veinante P, Jacquin MF, Deschenes M (2000a) Thalamic projections from the whiskersensitive regions of the spinal trigeminal complex in the rat. J Comp Neurol 420:233-243. Veinante P, Lavallee P, Deschenes M (2000b) Corticothalamic projections from layer 5 of the vibrissal barrel cortex in the rat. J Comp Neurol 424:197-204. Villarreal CF, Prado WA (2007) Modulation of persistent nociceptive inputs in the anterior pretectal nucleus of the rat. Pain 132:42-52. von Krosigk M, Bal T, McCormick DA (1993) Cellular mechanisms of a synchronized oscillation in the thalamus. Science 261:361-364.
134
von Krosigk M, Monckton JE, Reiner PB, McCormick DA (1999) Dynamic properties of corticothalamic excitatory postsynaptic potentials and thalamic reticular inhibitory postsynaptic potentials in thalamocortical neurons of the guinea-pig dorsal lateral geniculate nucleus. Neuroscience 91:7-20. Wanaverbecq N, Bodor AL, Bokor H, Slezia A, Luthi A, Acsady L (2008) Contrasting the functional properties of GABAergic axon terminals with single and multiple synapses in the thalamus. J Neurosci 28:11848-11861. Wang X, Wei Y, Vaingankar V, Wang Q, Koepsell K, Sommer FT, Hirsch JA (2007) Feedforward excitation and inhibition evoke dual modes of firing in the cat's visual thalamus during naturalistic viewing. Neuron 55:465-478. Ward RF, Werner SL (1963) Analysis of Variance of the Composition of a Migmatite. Science 140:978-979. Watanabe K, Kawana E (1982) The cells of origin of the incertofugal projections to the tectum, thalamus, tegmentum and spinal cord in the rat: a study using the autoradiographic and horseradish peroxidase methods. Neuroscience 7:23892406. Welch PD (1967) The Use of Fast Fourier Transform for the Estimation of Power Spectra: A Method Based on Time Averaging Over Short, Modified Periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics 15:70-73. Yen CT, Conley M, Jones EG (1985a) Morphological and functional types of neurons in cat ventral posterior thalamic nucleus. J Neurosci 5:1316-1338. Yen CT, Conley M, Hendry SH, Jones EG (1985b) The morphology of physiologically identified GABAergic neurons in the somatic sensory part of the thalamic reticular nucleus in the cat. J Neurosci 5:2254-2268. Zagon A, Terenzi MG, Roberts MH (1995) Direct projections from the anterior pretectal nucleus to the ventral medulla oblongata in rats. Neuroscience 65:253272. Zhou J, Nannapaneni N, Shore S (2007) Vessicular glutamate transporters 1 and 2 are differentially associated with auditory nerve and spinal trigeminal inputs to the cochlear nucleus. J Comp Neurol 500:777-787.
135
SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA
Az értekezés témáját adó saját közlemények:
Slézia A*, Hangya B*, Bokor H, Ulbert I, Barthó P., Acsády L. Heterogenous firing pattern in different relay nuclei: burst properties and phase relationship to cortical activity. (előkészületben) Barthó P*, Slézia A*, Varga V, Bokor H, Pinault D, Buzsáki G, Acsády L. Cortical control of zona incerta. J Neurosci. 2007 Feb 14;27(7):1670-81. Bokor H, Frére SG, Eyre MD, Slézia A, Ulbert I, Lüthi A, Acsády L. Selective GABAergic control of higher-order thalamic relays. Neuron 2005 March 24, 45:929-940. Az értekezés témájától független közlemények:
Slézia A., Kékesi AK, Szikra T, Papp AM, Nagy K, Szente M, Maglóczky Zs, Freund TF, Juhász G. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiol Dis 2004 Aug 1, 16 (3): 490-499. Pinault D, Slézia A, Acsády L. Corticothalamic 5-9 Hz oscillations are more pro-epileptogenic than sleep spindles in rats. JPhys 2006 Jul 1, 574:209-227.
136
Giber K, Slézia A, Bokor H, Bodor AL, Ludányi A, Katona I, Acsády L. Heterogeneous output pathways link the anterior pretectal nucleus with the zona incerta and the thalamus in rat. JCN 2008 Jan 1, 506:122-140. Wanaverbecq N, Bodor AL, Bokor H, Slézia A, Lüthi A, Acsády L. Contrasting the functional properties of GABAergic axon terminals with single and multiple synapses in the thalamus. J Neurosci 2008 Nov 12, 28:11848-11861.
137
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Acsády Lászlónak, hogy lehetővé tette és segítette munkámat és doktori értekezésem elkészítését. Köszönetet mondok kollegáimnak: Dr. Barthó Péternek, Dr. Bokor Hajnalkának, Hangya Balázsnak, Dr. Ulbert Istvánnak, Giber Kristófnak, Dr. Varga Viktornak, Bodor Ágnesnek a szakmai segítségért és a lelkes együttműködésért. Köszönet a Thalamus Kutatócsoport és Celluláris Hálózat Neurobiológiai Kutatócsoport többi tagjának a mindennapi segítségért és azért, hogy egy szakmai fejődést is lehetővé tevő baráti légkört teremtettek meg a KOKI-ban. Köszönetet mondok Dr. Dider Pinaultnak, akinek laboratóriumában ösztöndíjasként 11 hónapot töltöttem. Köszönöm Kaszás Attilának a szeretetteljes emberi és szakmai segítséget, melyet dolgozatom megírása során nyújtott. Köszönöm szüleimnek, akik mindig támogattak, és minden lehetőséget megadtak, hogy tanulmányaimat és kutatómunkámat végezhessem. Köszönöm barátaimnak, akiknek legtöbbje nemcsak baráti, de szakmai segítséget is nyújtott doktori munkám során.
138
