A szöveti regeneráció experimentális vizsgálata A szájnyálkahártya- és csontszövet -regeneráció vizsgálata állatmodell rendszerekben

A szöveti regeneráció experimentális vizsgálata A szájnyálkahártya- és csontszövet -regeneráció vizsgálata állatmodell rendszerekben

Doktori értekezés

Dr. Blazsek József Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Fogorvostudományi Kutatások

Orálbiológiai Tanszék Témavezető: Dr. Varga Gábor egyetemi tanár, MTA doktor Hivatalos bírálók: Dr. Nemeskéri Ágnes egyetemi docens, Ph.D. Dr. Tímár József egyetemi tanár, MTA doktor Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Barabás József egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Orosz Mihály egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Nagy Gábor egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Kelentey Barna egyet. adjunktus, Ph.D.

Budapest 2008

TARTALOMJEGYZÉK

oldal

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

7

1.) BEVEZETÉS

12

2.) CÉLKITŰZÉSEK

18

2-A. A szájnyálkahártya regenerációs faktor kompenzációjának

18

modellezése a nagynyálmirigyek részleges- és teljes eltávolításával (abláció) 2-A.1. A gl. parotis kompenzációs lehetősége – részleges ablációban

18

2-A.2. Nagynyálmirigyek teljes eltávolítása – „total ablació”

20

2-B. Csontszövetre irányuló vizsgálatok és az adekvát modell keresése,

22

csontregeneráció és implantátum-beépülés modellezése, modifikálása 2-B.1. Új szempontok az experimentális csontkutatásoknál

22

2-B.2. Új vizsgálati modell kialakítása farokcsigolyában

23

2-B.2.1. A csontszövet és a csontvelő biológiája

24

2-B.2.2. Új vizsgálati modell kidolgozása csontregeneráció- és implantátum

27

beépülés vizsgálatára szivacsos csontszövetben 2-B.2.3. Titán implantátumok szervülési erejének mérése és a regenerációs

29

új-csontszövet mikromorfometriai elemzése 3.) MÓDSZEREK 3-A. A nagynyálmirigyek részleges- és teljes eltávolítása (abláció)

33 33

3-A.1. Általános protokollok

33

3-A.1.1. Kísérleti állatok

33

3-A.1.2. Nyálmirigy szöveti minta

33

3-A.1.3. Nyálgyűjtés

33

a.) Részleges ablációban és paralell kontroll állatokban

33

b.) Teljes ablációban és a paralell kontroll állatokban

33 34

3-A.1.4. Biokémiai vizsgálatok a.) Fehérje tartalom meghatározás

34

b.) Amiláz enzimaktivitás mérés

34

c.) Fotométeres mérések

34

d.) EGF tartalom mérése

34

3-A.1.5. Statisztikai számítási módszerek

35

2

3-A.2. A részleges nyálmirigyabláció kísérleti modell

35

3-A.2.1. Kísérleti állatok és műtéti technika

35

3-A.2.2. Kezelési protokoll

35

3-A.3. A teljes nyálmirigyabláció – kisnyálmirigyek kísérleti modellezése:

36

„Kisnyálmirigy experimentális vizsgálat” 3-A.3.1. Műtéti technika

36

3-A.3.2. Teljes ablációs állatok kezelési protokollja

37

a.) Akut vizsgálat

37

b.) Krónikus vizsgálat (7, 14, 21 nap)

37

c.) A kisnyálmirigy szekréció stimulálása és gátlása

37

3-B .1. A szivacsos csontok szöveti alapszerkezetének in situ vizsgálata

38

3-B.1.1. Kisérleti állatok

38

3-B.1.2. Micro-angiográfia és kombinált festési eljárások

38

3-B.1.3. Csont és porc szimultán festése

39

3-B.1.4. Hisztologiai vizsgálatok

39

a.) A femur és a csigolyák sebészi kipreparálása

39

b.) A csont és csontvelő szövettani vizsgálata

40

c). A metszetek rutin vizsgálata vagy háttérfestése

41

d.) A Ca kimutatása

42

e.) Tartarát rezisztens, specifikus savas foszfatáz enzim kimutatása

42

osteoclastokban f.) Lúgos foszfatáz enzim kimutatása osteoblastokban 3-B.1.5. Sejt-tenyészetek

42 42

a.) Hematopoietikus őssejtek (HSC) és progenitor sejtek kvantitatív

42

meghatározása b.) Hematopoietikus őssejtek analízise és izolálása

43

3-B.2. Csontregeneráció, osseointegráció experimentális modell „OSSI.modell” 44 Titán Implantátum osseointegráció vizsgálati módszere patkány farokcsigolyán

Szabadalmi szám: P0800345

3-B.2.1. Kísérleti állatok

44

3-B.2.2. Titán implantátum

44

3-B.2.3. Új Műtéti technika

44

3

3-B.2.4. Mikro komputer tomográfia (microCT)

46

a.) Rtg analízis, minták szkennelése

46

b.) MikroCT rekonstrukció és 2D analízis

47

3-B.2.5. Biomechanikai vizsgálat –kimozdulási maximum erő mérése

48

3-B.2.6. Szövettani mikrostruktúra vizsgálat

49

3-B.2.7. Vizsgálati protokoll: az újonnan képződő csontszövet fejlődési

50

szakaszainak vizsgálatára 3-B.3. Szisztémás, krónikus biszfoszfonát kezelés hatása a csontregenerációra és implantátum osseointegrációra

51

3-B.3.1. Kísérleti állatok

51

3-B.3.2. Kezelési protokoll – amin-biszfoszfonát (Zometa) krónikus kezelés

52

3-B.3.3. Mikro komputer tomográfia - mikroCT Rekonstrukció 2D és 3D analízis 52 a.) Minta előkészítés

52

b.) Minta szkennelés és rekonstrukció

52

3-B.3.4. Az implantátumok biomechanikai rögzülési értékeinek meghatározása 54 3-B.3.5. Hisztológiai vizsgálat

54

3-B.3.6. Statisztikai értékelés és ábrázolás

54

4.) EREDMÉNYEK

55

4-A.1. Az EGF kompenzációs termelésének vizsgálata a szubmandibuláris és

55

szublinguális nyálmirigyek ablációját követően (részleges abláció) 4-A.2. Az EGF-el szabályozott orális epithelsejt-regeneráció lehetősége a

60

nagynyálmirigyek teljes ablációjában 4-A.2.1. Akut vizsgálatok

60

a.) Kimosási értékek – alapszekréció

60

b.) Szekréció stimulálás és gátlás

60

4-A.2.2. Krónikus vizsgálatok

63

a.) Testsúly, táp- és vízfogyasztás

63

b.) A szájüregi nyálkahártya felület nyugalmi kimosási értékei

64

c.) A szájnyálkahártya felület kimosási értékei stimulációt követően

65

4-B.1. Alapadatok és ismeretek a csont-kompartmentekről

68

4-B.1.1. A csont és csontvelő szövetek ontogenetikai fejlődése

68

4

4-B.1.2. Az állcsont, a combcsont és a farokcsont összehasonlító szöveti szerkezete rágcsálókban

69

a.) Jellemző sejttípusok a különböző eredetű szivacsos csontban

69

b.) Érhálózati különbségek az eltérő helyen lévő szivacsos csontokban

69

c.) Hisztológiai külömbségek a caudalis és sacralis csigolya szivacsos

70

csontjában 4-B.1.2. A csontvelő sejtek összehasonlító kvantitatív elemzése

71

4-B.1.3. Hematopoietikus őssejtek és „fészek-képzö” (niche) sejtek funkcionális 71 analízise a.) FACS vizsgálatokkal kimutatható különbségek

71

b.) Kimutatható funkcionális különbségek sejttenyészeten

73

c.) Az őssejtek környezete (niche) változó az eltérő szivacsos csontokban 73 4-B.2. Csontosodási kinetika - Titán implantátum osseointegrációja az idő

75

függvényében 4-B.2.1. Biofizikai vizsgálat -rögzülési erők

75

4-B.3. A biszfoszfonát - Zometa® kezelés általános és csontszöveti hatása

76

4-B.3.1. A krónikus biszfoszfonát kezelés általános hatása

76

4-B.3.2. A krónikus biszfoszfonát kezelés hatása az osseointegráció

77

biomechanikai erejére – Ti-implantátum rögzülésére 4-B.3.3. Farokcsigolya szivacsos csont szöveti struktúrája a krónikus

78

biszfoszfonát kezelést követően 4-B.3.4. -mikroCT morfometriai változások krónikus biszfoszfonát kezelés

79

következtében a.) Rekonstruált digitális kép

79

b.) A kvantitatív morfometriai analízis eredményei

80

5.) MEGBESZÉLÉS

86

5-A.1. EGF termelés szubtotális nagy-nyálmirigy eltávolítás

86

(részleges abláció) után 5-A.2. A kisnyálmirigy experimentális modell (teljes abláció). Nyál és EGF-

87

termelés nagynyálmirigyek nélkül 5-B.1. A csont-fejlődési és csontregenerációs vizsgálatok számára optimális „monokróm” csontszövet feltárása

5

88

5-B.2. Az új osseointegrációs („OSSI”) modell

89

5-B.3. Amino-biszfoszfonát krónikus experimentális alkalmazása

89

6.) KÖVETKEZTETÉSEK

92

6-A.1. Kompenzációs EGF termelődés lehetősége a gl. parotisban

92

6-A.2. A kisnyálmirigyek EGF termelése

93

6-B.1. Alapfelismerés: a Hox kod és a hematopoietikus őssejtek

93

biológiája összekapcsolt 6-B.1.2. Perspektívák

94

6-B.2. Az „OSSI”-modell széleskörű alkalmazhatósága

95

6-B.3. A biszfoszfonátok terápiás lehetősége a csontregenerációs folyamatokban 95 7.) ÖSSZEFOGLALÁS

97

8.) APPENDIX

100

8-1. Az osteoblastok és osteoklastok szerepe a hematopoiézisben

100

8-2. Rövid összefoglalás az implantológiai alapfogalmakról

100

a.) Implantátum

101

b.) Osseointegráció

101

c.) Osseointegráció vagy Biointegráció

102

d.) Osseointegrált implantátum

102

8-3. Biszfoszfonát hatás a csontregenerációra

102

8-3.1. A biszfoszfonátok

102

8-3.2. A biszfoszfonátok csontszöveti hatásai

105

8-3.3. A biszfoszfonátok csontresorpció-gátlás mechanizmusa

107

8-3.4. A biszfoszfonátok kalcifikációra kifejtett hatása

108

8-3.5. A biszfoszfonátok klinikai alkalmazása

109

8-3.6. A biszfoszfonát mellékhatások

110

9.) IRODALOMJEGYZÉK

113

10.) PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

131

11.) KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

136

6

RÖVIDÍTÉSEK (AB) abláció, ablatio : A valamely szerv eltávolítása, itt nagynyálmirigyek részleges, vagy teljes eltávolítása (részleges abláció, teljes v. totál abláció (EGF) Epidermal Growth Factor : Epidermális Növekedési Faktor (HSC) Hamatopoietic Stem Cells : Hematológiai irányba differenciálódott őssejtek (FACS) Fluorescent Activating Cell Sorter : Sejtfelszíni membrán alapján fluorescens jelölésen alapuló sejt szortírozás, számlálás („niche”) Fészek : Az egyes differenciálódó sejtvonalak közös sejtes környezete, mely a fejlődés strukturális, molekuláris regulációjában is szerepet játszik (Hox kód) Hox gene clusters : Az egyes végtagok pozícióját a gerincesek testének hosszanti felosztásában kulcsszerepet játszó homeobox (hox) gének kombinációja határozza meg (mCT) micro Computer Tomograph : Komputer által vezérelt rtg felvételezési technika, mely fókuszált „szeletfelvételek”, rétegei alapján szoftveres két- és háromdimenziós képeket állít elő, kisméretű objektumokon, nagyfelbontással (Zometa) acidum zoledronicum anhydricum : A zoledron sav, az amino-biszfoszfonátok egyik kereskedelemben forgalmazott gyógyszer tagja, a Novartis (Basel, Switzerland) gyógyszergyár fejlesztése ATC M05B A08 (NGF) Nerve Growth Factor : Idegsejt növekedést serkentő faktor, TGF-béta szupercsaládhoz tartozó növekedési faktor (BMPs) Bone Morphogenetic Proteins : Csontszövet fejlődését serkentő fehérjék a TGF-béta szupercsaládhoz tartozó növekedési faktor

7

(TGF) Transforming Growth Factor : Növekedési faktor szupercsalád alcsoportjai a TGF-alfa és TGF-béta (osseointegráció) : Direkt, átkötő anyag nélküli rögzülés a csonthoz, implantátumnál csont-fém kapcsolódás, vagy biokerámia-csont kapcsolódás stb. (GI) gasztrointesztinális traktus : A gyomor-bél rendszer teljes egésze, a cardiától, az anális nyílásig (

125

I-EGF) Jód 125-EGF: Jód 125-ös izotópjával jelzett EGF, béta-sugárzó

(PCR) Poli Chain Reaction : Nukleinsav polimeráz láncreakcióra épülő genetikai lánc tipizálás (RT-PCR) reverz transzkriptáz PCR : Ribonuklein savból (RNS) visszkódoló enzim (reverz-transzkriptáz) felhasználásával készült DNS lánc-sokszorozás (RNS), (mRNS) ribo nuklein sav, messenger ribo nukleinsav: Fehérje kódoló genetikai molekulák (DNS) Dezoxiribonuklein Sav (cDNS) Complementary DNA: RNS-ről reverz transzkriptáz enzimmel átírt DNS- másolat, jól tárolható stabil kódforma. (ABG) Anterior Buccal Gland : A szájnyálkahártya szájnyílás körüli kisnyálmirigyek (RRA) „Radio-Receptor Assay”: Sugárzó izotóp atommal jelzett receptor ligand, mellyel kvalitatív jelölhetőek a membrán-receptorok és kvantitatíve mérhető a mennyiségük. (Cit.) Citric Acid, Citromsav: Citromsav 0,2 %-os oldata, a kísérleti állatok folyadék forrása (LATI) Labor Állat Tenyésztő Intézet (Gödöllő, Hungary) (U) „Unit”, Nemzetközi Egység: Leggyakrabban biokémiai standardizálási módszer jele, Itt Enzim-aktivitás mérési összehasonlítására egységesített eljárás mérőegysége. Amiláz esetén 1U= 1g keményítőt, 1 perc alatt, 37C-on, pH 7,4-es közegben átalakító enzimaktivitás

8

(Huplastb-mp) „humán placentális syncitiotrofoblaszt-membrán preparátum”: Emberi –placenta membrán-preparátum, mely a synciciotrofoblaszt-membrán nagyszámú EGF-receptor tartalma miatt, kiváló nem fajspecifikus EGF-kötő médium. (g) gravitációs gyorsulási konstans érték: Centrifugális szedimentációs erő (f) meghatározásához, kiszámításához használandó állandó, g=9,81 m/sec2 f = ω2 x r / g ahol ω –forgásszög r – a sugár , g - a gravitációs konstans (MSC) „Mesenchymal Stem Cell”: Mezenhimális irányban struktúrált őssejt, melyek differenciálódni képesek osteoblastokká, chondroblastokká, a véredényt képző endotheliummá, kötőszövet stróma képző fibroblastokká, zsírsejtekké valamint még egyéb kötőszövet formáló sejtté. (HSC) „hemotopoietic stem cells”: Vérképzési sejtvonalak őssejtje, pluripotensek, nagy önfenntartó osztódási képességgel rendelkeznek és ugyanakkor képesek az összes hemato lymphopoetikus sejtvonal képzésére (PBS) „Phosphate Buffer Saline”: Foszfát puffer oldat (AZF) „acid-zinc-formaldehyd”: Szövettani fixáló oldat: jégecet, cink-klorid és formalin komponensekből áll (TRAP) „tartarát rezisztens acid-phosphatase”: Tartarát kezeléssel szemben ellenálló savi-foszfatáz, mely az osteoclastokban magas szinten megtalálható, jelzésükre alkalmazható citokémiai reakció. (LDA) “limiting dilution analysis”: vég-kihigítási-analizis, sejttenyészetek életképességének meghatározására. (MS-5) „feeder-layer cells”: Standard jól osztódó monolayert alkotó multipasszált tumorsejtvonal. Hordozó konfluens sejtréteg a tenyészetek edénnyel érintkező rétege, melyre ültethetők a különféle tenyésztendő célsejtek, melyek egymaguk nem képesek letapadni és fejlődni a tenyészedényekben. (CFU) “Colony Forming Unit”:

9

Különféle elkötelezett (pl.:vér-alakoselem) sejtvonalakat képző egységek (HPC) „High Proliferative Capacity”: Magas proliferatív képességű sejtcsoportok pl: HPC-CFU („buffy coat”): szabadon szuszpendálható sejteket jelent a csontvelői parenchyma rétegből. („szabadúszó őssejtek?”) (Haematon) : vérképzési strukturális alapegység, belőle minden vérképző elem nagy mennyiségben képződhet, miközben struktúráját megtarja. (NK) : „neutral killer cell” Alapvető egyedi gén-kód ellenőrző sejtes ölő egységünk. NK1.1- antitestel kimutatható. (T-LC) T-lymphocyta cell: CD4 felszíni antitestel jelölhető (H33342) „haemopoietic standard AG”: A hematologiai stem sejtek felszíni markere (HA) „hydroxyapatit” Keményszöveti kristály alkotó struktúrája („OSSImodell”) „OsseoIntegration modell” Saját szabadalmi eljárásban védett csontregenerációs szisztéma (ROI) „Region of Interest” A speciálisan megadott vizsgálandó területek alapja a mikromorfometriai elemzéseknél (TV) „Tissue Volume”: A mikromorfometriai elemzés teljes térfogata, teljes szöveti térfogat. (N) „newton”: az erő mértékegysége (ATP) „Adenozin Trifoszfát”: 3 foszfát makroerg kötést tartalmazó molekula (FPPS) „farnezil difoszfát-szintáz” enzim: a mevalonát útvonalon a farnezylpyrofoszfát és geranylgeranylpyrofoszfát képződését iniciálja. Gátlása apoptózist indukál.

10

(BRC-U) „Bone Remodelling Compartment-Unit”: A csont egyensúlyát biztosító lebontó (osteoclast) és felépítő (osteoblast) elemeket tartalmazó egység. (Tb.Sp.) „Trabecular separation”: Trabekulák közti tér, a csontszövet „szivacsossága” légtartalma (Tb.Dm) „Trabecular diameter”: Trabekula átmérő, a gyakorlatban a trabekulák sugara, tehát ½ átmérő (Tb.N) „Trabecular number”: Trabekula szám egységnyi csontra vonatkoztatva (1/mm) (BV/TV) „Percent bone volume”: A csont %-os térfogata (BM) „Bone Marrow”: csontvelő, allogén csontvelő (MMP) „Metalloprotease”: a szöveti MP-3, TNF-alfa gátlása, apoptózis indukálása (TNF-alfa) Tumor Necrosis Factor”: Tumor sejt nekrotizáló faktor (ONJ) „Oral Necrosis of Jaw”: Szájüregi állcsont-nekrózis, biszfoszfonát kezelés mellékhatásaként megjelenő kórkép

11

1) BEVEZETÉS A szövetek homeosztatikus működése. A szájüreg fiziológiai integritását és patofiziológiai elváltozásait a folytonos funkcionális (biológiai, mikrobiológiai, kémiai, fizikai) hatásokból származó mikro-sérülések és a szöveti funkciót fenntartó és védő mechanizmusok egyensúlya határozza meg. Az alapvető szájüregi funkciók (nyálképzés, rágás, előemésztés, nyelés, védelmi-folyamatok, érzékelési információk) minőségét egyrészt az alkotó szövetek integritása, másrészt önmegújulási, regenerációs képessége biztosítja. Biológiai értelemben a szövetek képzését és önmegújuló képességét az embrionális korban megjelenő, specializált őssejtek biztosítják, melyek egyrészt önfenntartó, asszimetrikus osztódásra, másrészt terminális differenciálódásra képesek. A gyorsan

megújuló

szövetek

meglepően

nagymennyiségű

sejtet

termelnek.

Kiszámították, hogy az emberi élet során, hozzávetőlegesen, az emésztőcsatorna 7600 kg, a csontvelő 5600 kg, míg a bőr 80kg szövetet termel [1]. Egy másik csoportot képeznek az expandáló szövetek, mint például a máj, számos mirigyszövet, a nyálkahártya és a csontszövet. Itt a sejtek nem osztódnak folyamatosan, de bármelyik sejt képes osztódási ciklusba lépni és kiegészíteni a hiányzó szöveti struktúrát. A programozott sejthalál (apoptózis), döntően, a differenciált sejtekre jellemző fiziológiai folyamat. A keratinizált, elhalt epidermisz sejtek védelmi borítékot képeznek szervezetünk számára, míg például a neutrophil granulocyták 8 órával keringésbe jutásuk után dezintegrálódnak, hogy új aktív sejtek léphessenek helyükre, így folytonos védelmet biztosítanak a mikrobiális támadásokkal szemben. A folyamatos kisebb és az időnként súlyosabb szövetpusztulások helyreállítása az élet alapvető feltétele. Napjainkban az orvostudomány egy új forradalmi korszakát éli, melynek alapvető eleme a szövetek regenerációja. A kutatásoknak új lendületet adott egyrészt az a régebbi keletű felismerés, hogy az alacsonyabb rendű gerincesek bámulatos szervregenerációra képesek, másfelől az a tény, hogy az emberi szervezet számos szövetében jelentős mennyiségű, izolálható őssejtet lehet találni. Az élet egyik principiuma a szervezetek védelmi képessége. A testfelszín védelmi rendszerének kiemelt tényezője a nyálkahártya kompakt záró rétege, Az orális funkciók során, ezen a záró rétegen, akár százas nagyságrendben is keletkeznek mikrosérülések és gyakoriak a kiterjedt patológiás nyálkahártya-eróziók is. A szervezet felé irányuló

12

káros (mikrobiális, antigenikus, toxikus, stb.) inváziós támadás kivédésének esélyét a seb-kapu mielőbbi záródása alapvetően növeli. Az epithel sejtréteg gyors záródása azon mikrosérülések esetén ahol kapilláris sérülés-vérzés nincs, kiemelt életfontosságú, hiszen nem számíthatunk a vér sejtes elemek, a véralvadék záró barrierjére, gátjára. Nem lehet tehát kellően kihangsúlyozni a nyál komponensei közül az Epidermális Növekedési Faktor (EGF) domináns hatását, mely az epitheliális sejtek proliferációját és differenciációját biztositja. Az EGF-hatásra Stanley Cohen figyelt fel, a Rita LeviMontalcini

–vel

1953-59

között,

Washingtonban

végzett

idegsejt-növekedési

vizsgálatok során. A tumoros idegszövetből nyert, idegsejt növekedési faktort (NGF) tartalmazó (crude) kivonatot tovább tisztítva 1962-ben, már a Nashville–i Vanderbilt Egyetem kutatócsoportjában izolálta az EGF-et. Kimutatta, hogy az epithelsejt növekedési faktort egér submandibuláris nyálmirigye nagymennyiségben termeli [2, 3, 4]. Az EGF kötő-receptorát is megtalálta a sejtfelszíni membránon és leírta a sejtbejutási mechanizmusát [5]. A Cohen és Levi-Montalcini növekedés-szabályozás kutatásban elért eredményeiért 1986-ban orvosi Nobel-díjat kapott [6]. Az EGF termelés experimentális modellkísérleteit és a humán nyál EGF tartalmának vizsgálatait laboratóriumunkban a 90-es években indítottuk. Az EGF szájüregi jelenlétének jellemzésével részleges és teljes ablációt követően két közleményünkben számoltunk be [55, 7]. Ezen korai adatainkat azóta sem cáfolta irodalmi adat, megerősítése mellett szól, hogy humán patológiás kisnyálmirigyekben kimutatták az EGF és receptorának termelődését [8]. Míg a szinte folyamatos rágást produkáló rágcsálókban az EGF termelésének döntő forrása a szubmandibuláris nyálmirigy, addig emberben főleg rágáskor, a mikrosérülések keletkezése idején, a parotis nyál szekrétumában mutatható ki nagy mennyiségű EGF. Ez a praktikus eltérés számos kérdést vet fel: a) vajon a fő termelési helyeken kívül van-e EGF termelés, b) lesz-e nyálban EGF ha a fő képzőhelyéül szolgáló nyálmirigyet elveszítjük, c) lehet-e a nagy nyálmirigyek nélkül EGF-re számítani a szájnyálkahártya regenerációban? Munkáim első periódusában olyan vizsgálatokat végeztem, és egy olyan új sajátfejlesztésű kísérleti módszert fejlesztettem ki, mely az előbbi kérdésekre keres választ és ad vizsgálati lehetőséget. Ezen témaköröket a dolgozatban „A” betűs sorszámokkal jelöltem.

13

A civilizációs életmód és környezet szöveti regenerációt romboló hatásai. Az egyre általánosabbá váló civilizációs kedvezőtlen táplálkozási hatások, a dohányzás, fokozódó kemikália-terhelés, alkoholfogyasztás, és egyéb terhelő tényezők a szájüreg területén népbetegség szintre fokozzák a kemény- és lágyszöveti destrukciókat. Annak ellenére, hogy a dentális keményszövetek szuvas lézióit a kariológia hatalmas technológiai fejlődés nyomán egyre jobb eredménnyel restaurálja, a folyamat megállíthatatlan: a végén ott áll a fog elvesztése. A szájnyálkahártya gyors regenerációja központi szereppel bír az egész orális régió szöveteinek működésében. Sőt a szájnyálkahártya sérülések, gyulladások, a szervezet fertőzési kapui, fogágy-betegségek révén, nagymértékű csontszövet veszteséget idéznek elő, végül fogak eltávolítását indikálják de ezen túl súlyos - egész szervezetet veszélyeztető állapotokat is kiválthatnak. Foghiányok esetén

bizonyos esetekben a normális funkcionális állapot

rehabilitációjához a klasszikus protetikai megoldásokat nem alkalmazhatjuk. A kellő helyzetű és stabilitású rágó funkciót ellátó fogcsoportok illetve pillérfogak hiánya, kényszerítőleg gyors fejlődésnek indította mind a dentális implantációs technikákat mind a destruált csontos fogágy restaurációt. Az implantátumok eredményességének alapja - a kellő statikai és csontbiológiai helyzet esetén is - az implantátum osseointegrációja (oi). Normális esetben is ez a folyamat lassú (6-10 hónap) a betegek számára elviselhetetlen, kellemetlen. A legjobb eredményeket mutató kétfázisú implantációs technika esetén a csökkentett terhelés miatt erre az időszakra a fogazati státusz gyakran táplálkozási nehézségeket okoz, melynek gyakran a szervezet egészére is negatív hatása van. Az anyagcsere megbomlása (eszenciális aminosavak, vitaminok, ásványi anyagok, nyomelemek hiánya) révén egyrészt a csontképzés folyamatára is visszahat, másrészt védekezési, regenerációs, immunológiai-problémákat is kiválthat. Az utóbbi évtizedekben nagy fejlődésnek indult a bio-membránok alkalmazása az irányított

csont

rekonstrukciós

eljárásokban.

Mind

az

implantátumok

osseointegrációjánál mind a fogágy restauráció irányított csontújraképzésénél központi kérdés a csontregeneráció és annak szabályozása. A képződő csont minősége (szerkezete, mineralizáltsága, terhelhetősége) és a kialakulásához szükséges idő, számos tényező, mint például az egyes növekedési faktorok, citokinek,

14

csontképzési proteinek, ionok lokális – esetenként szisztémás - aktivitásától vagy gátlásától függ. A csont kutatás korszerű alapjait, a száz évvel ezelőtt tevékenykedő. W.B. Coley [9] megfigyeléseitől számíthatjuk. A csontképzés szabályozás a keményszövet formálás több fázisból álló folyamata szerint, különböző időbeni és térbeni orientációjú sokkomponensű folyamat. Ebben döntő szerepet játszanak, a csontformáló fehérjék (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) melyek a differenciálódási növekedési faktor család tagjai (Transforming Growth Factor pl.: TGF-α, TGF-β). A BMP-ek létezésének első bizonyítékai sebészi esetekből származnak. Hólyagműtéteknél csontképződést figyeltek meg fasciában [10], főleg azokban az esetekben, ahol széles összeköttetést biztosító hidat képeztek, a kötőszöveti, és az „osteoinduktív” szövetfelszínek között. [11, 12] ektópiás helyen csontképzést tudott indukálni demineralizált csont illetve húgyúti epithelium kötőszöveti környezetbe ültetésével. A 70-es években Selye János mutatott rá, hogy különféle geometriai formák és a különböző mértékű nyomásviszonyok csontképzést indukálhatnak [13, 14]. Az utóbbi évtizedekben hatványozottan felgyorsult a csontképzésre vonatkozó kutatások száma [15]. A csontfelépülés sejtműködési rendszerében fontos reguláló faktorokról kapott információink döntően in vitro tenyészetek eredménye, a humán klinikumra is adaptálható in vivo experimentális kísérletek, értékelések hiányosak. A szervezet keményszöveteinek sérülés illetve destrukció következtében kialakuló hiányait, immuntoleráns idegen anyagok felhasználásával már egy évszázada pótolják. A sikeres funkcionális rehabilitáció legfontosabb tényezői a kilökődési immuntolerancia és a biológiai használati érték. Ezen utóbbi faktor alapja a csontregeneráció, mely kedvező esetben az idegen anyag és csont közötti szoros kapcsolatot, „szervülést” létrehozva biztosítja a megfelelő rögzülést. Az „osseointegráció” mint kifejezés, ezt a biológiai regenerációs folyamatot jelenti. A regenerációs faktorok egyre szélesebb körű kutatási eredményei új dimenziót nyújthat a hosszadalmas biológiai folyamat befolyásolására [16]. A dentális implantátumok speciális helyzetben - a szájüregben – kell, hogy működjenek. Az anyagcsere, fajfenntartás, kommunikáció során gyorsan változó

15

mikroflóra veszélyes inváziós hátteret jelent az orális régióban. A szervezet talán legnehezebb védekezési szituációja az egységében rugalmas lágyszöveti védő rétegeken a csontból a felszíni külvilág felé áttörő fogak körüli rés lezárása. A periodontális ligamentum és a gingiva marginális tapadása a fogak felszínéhez igen erős. Ha sérül a barrier, a fedő epithel sejtréteg növekedési faktorának (EGF) stimulációja hatására gyors burjánzással zárja a keletkezett rést. Ez legtöbb esetben azonban a zárási vonal apikális irányú eltolódásával, „tasakképződéssel” jár. Ez a mechanizmus - a felszíni sérülések

„gyors-zárás”

védekezési

szisztémája

–

a

dentális

implantátum

osseointegrációját hiusíthatja meg, a csontra felkúszó azt az implantátum felszíni kapcsolódási pontjaitól elválasztó epithelsejtréteg kialakításával. A klinikumban ezért többféle módszert is alkalmaznak ennek az epithel, destabilizáló réteg kialakulásának megakadályozására. A leginkább eredményes „kétfázisos módszernél” a sebészi feltárással csontba ültetett „gyökérműveket” a csontosodási időszakra – ami fél-, egy év is lehet - priméren nyálkahártyával fedve mintegy „elrejtik” a felszíni gyors regenerációjú epithelsejt réteg elől. Biztató eredményeket adnak az egyfázisos technikák során kifejlesztett „membrános”, vagy speciális geometriai lezárási módszerek, illetve biológiai hatású regenerációt modifikáló-gátló molekulák alkalmazásai is. Valamennyi eljárásban egységes, hogy az implantátum körüli csontosodási regenerációnak nagyobb esélyt kell adni, mint a mélybe burjánzó epithelsejt-regenerációnak. Új kísérleti modellek szükségessége és az irodalmi háttere Nemzetközi tendenciákat is figyelve egyre inkább kialakult az igény, egy olcsó, könnyen

kivitelezhető

experimentális

csontregeneráció-vizsgáló

módszer

kifejlesztésére. Alapvetően a módszernek kritériuma, hogy egységes rendszerben lehessen vizsgálni magát a csontképződést, a csontképződésre in situ és/vagy szisztémásan

ható

faktorok,

gyógyszerek

hatásait

valamint

implantátum

anyagösszetétel, felszíni struktúra variánsait. Világszerte -így laboratóriumunkban is- rutin kísérleti állat a fehérpatkány. A patkányok anatómiai sajátosságai, a kis méretek miatt, orális régió tekintetében azonban nem adnak jó lehetőségeket a csontosodási folyamatok nagyszámú, rutin ellenőrzésére. A fajon belüli módszertani lehetőségek keresése közben jutottunk el a patkány farokcsigolya illetve a fogágyat alkotó csont morfológiai szerkezet hasonlóság alapján a

16

farokcsigolyacsont csontállományának felhasználáshoz a csontregeneráció illetve az osseointegrációs vizsgálatokban. Az utóbbi évtizedben a keményszöveti regenerációra fordítottam figyelmet, és fejlesztettem

ki

patkány-farokcsigolyán

egy

új

„Csontszöveti-regeneráció

/osseointegráció vizsgálati modell”-t. A kérdéskört dolgozatomban „B” betűs sorszámokkal jelöltem. A módszer széles körű elemzési lehetőségeket biztosít az experimentális csontszövet fejlődéstani, őssejt és regenerációs, implantátum osseointegrációs kutatásoknak. A mérési eredmények alapján kiválasztható a leginkább optimális csontszerkezet, implantátum-felület, biológia faktor illetve ion milliő, amely az osseointegrációt szabályozó alaptényezőket kedvező irányba módosítja. Az

utóbbi

évek

során

számos

közlemény

számolt

be

súlyos

szájüregi

csontproblémákról, mely hátterében biszfoszfonát therápia mellékhatását tételezik fel. [132, 172]. Csontbetegségekben – főképp a lebontással, csontmetasztázisokkal összefüggő kórképeknél - a klinikum Világ szerte nagyszámban alkalmaz biszfoszfonát készítményeket, a csontszöveti steady state rendszerben, az osteoclastok működésének csökkentésére.

Miután

a

csontregeneráció

és

osseointegráció

csontszöveti

remodellingen keresztül történik, adódik a kérdés: az oszteoklasztokra ható biszfoszfonát kezelés hogy befolyásolja az erre a területre kidolgozott kísérleti modellünkben az osseointegrációt. Őszintén megvallva, a számos aggasztó mellékhatás esetet bemutató tanulmány alapján azt vártuk, hogy jelentősen romlik az implantátum rögzülés, kvázi ki fognak potyogni a stiftek, miközben lebomlik, szétesik a farokcsigolya………. Dolgozatomban a lágy és keményszövetek regenerációjával foglalkozó munkáimból olyan „csokrot” állítottam össze melyben döntően az orális indíttatás adta a motivációt kísérleteimben, de mégis bizonyos mértékben álltalános megállapításokhoz jutottunk. Meg kell jegyeznem, hogy a jelenlegi szerkesztés külön kérésre, a Doktori Iskola követelményéhez igazítva, nem mondható könnyen átláthatónak, amiért elnézést kérek az olvasótól.

17

2) CÉLKITŰZÉSEK 2-A. – A szájnyálkahártya regenerációs faktor kompenzációjának modellezése a nagynyálmirigyek részleges- és teljes eltávolításával (abláció) 2-A.1. A gl. parotis kompenzációs lehetősége – részleges ablációban. A szájnyálkahártya és a gasztrointesztinális traktus (GI) integritásában a nyál epidermális növekedési faktor (EGF) szerepéről kísérleti állatokban mind normál mind kóros viszonyok között számos adatunk van. A tápcsatorna normál működésének fenntartásához elengedhetetlen a folyamatos megújulás biztosítása, a sejtproliferáció és differenciálódás szabályzó rendszerének megfelelő funkcionális állapota [184, 185, 186, 187]. Kiterjedt kutatások eredményei alapján az epidermális növekedési faktor (EGF), mint trófikus tényező kulcsfontosságú szerepet játszik a bélcsatorna egészséges működésének fenntartásában [17, 18, 19]. Az EGF a tápcsatorna egyes szerveiben, ezek közül is legnagyobb mennyiségben, a nyálmirigyekben termelődik, s nagy mennyiségben kerül a bélcsatornába. Számos bizonyíték van arra, hogy a luminális EGF szerepet játszik a tápcsatorna felső szakasza működésének szabályozásában. Erre utal, hogy igen magas a peptid koncentrációja, stabilitása a tápcsatorna lumenében, valamint a peptid luminális szintjét idegi és hormonális tényezők - duplán biztosítottan – szabályozzák. Ezt a szerepet erősíti, hogy stimuláció során az EGF szekréció elsősorban a lumen felé irányul, és legfőképpen, hogy a luminális EGF bizonyíthatóan jelentős biológiai aktivitással rendelkezik [20, 26, 188, 189]. Az EGF-et nemcsak egerek nyálmirigye termeli igen nagy mennyiségben [21,] de magas koncentrációban patkány [22] és ember [23, 24, 25] nyálában is kimutatható. Egérben és patkányban az EGF termelés fő forrása a submandibuláris nyálmirigy [27, 28] míg emberben elsősorban a parotis [24, 29]. Bár a nyálmirigyekétől kisebb mennyiségben, de EGF-immunoreaktív sejteket a gasztrointesztinális traktus alsóbb régióiban is találtak, így a gyomorban [23], a Brunner mirigyekben [23, 27] a vékonybél Paneth sejtjeiben [30] és a pancreasban [31]. Emellett más szervekben is kimutattak EGF termelő sejteket. Megfigyelték, hogy a máj kiválasztja és az epében üríti az intravénásan adott

125

I-EGF jelentős részét patkányban [32, 33]. Figyelemre méltó, hogy

a nyál EGF koncentrációja 2-3 nagyságrenddel magasabb, mint a plazmáé [21, 34, 35]. Ugyanakkor emberi epe EGF koncentrációja háromszor akkora, mint a plazma, és 3-10szer nagyobb, mint a pancreasnedv EGF szintje [31, 36 ]. Egérben a nyál koncentrációja

18

közel 1 µg/ml, ami legalább 250-szerese a biológiai aktivitást mutató szintnek. Patkányban és emberben ezek az értékek kisebbek (2.7-4.0 ng/ml), de az EGF koncentráció szimpatikus stresszt modellező adrenalin infúzió során 400 ng/ml-re növekszik meg [34]. Emberben biológiai aktivitást mutató koncentrációk mutathatók ki a duodenumnedvben (21 ng/ml), a pancreasnedvben (2.3-8.0 ng/ml) és az epében is (0.3-5.0 ng/ml) [23, 31, 45]. A pancreasnedv EGF szintje szekretin stimulációt követően 100 ng/ml fölé emelkedik [23]. A nyálmirigyek EGF szekréciója a lumen felé irányul, amint azt mutatják azok a vizsgálatok, melyek szerint adrenerg agonisták a nyál EGF koncentrációját néhány százszorosára növelik, miközben a plazma EGF szintje nem változik [22]. Az EGF diurnalis termelődésére utaló adatokat is közöltek [190]. A gasztrointesztinális traktusban elváltozást kiváltó patológiás eseteknél (alkohol, dohányzás), károsodás függő EGF termelődésről számoltak be [191], mely utalhat bizonyos szöveti faktorok szerepére az EGF termelés szabályozási rendszerében Ha patkányban eltávolítjuk a submandibuláris nyálmirigyet – mely rágcsálókban az EGF termelési és tárolási hely – a gl. Parotisban funkcionális hipertrófiás-hiperpláziás kompenzáció jön létre [37], megemelkedik a H+-ion reflux az intestinális nyálkahártyán [38], és nő a fekélyképződés [39]. A gl. Submandibuláris irtott (ablatio) egereknél ivóvízben adagolt EGF (1 µg/ml ) helyreállítja a sebgyógyulás normális ütemét [39]. Intraperitoneális EGF kezelés (10 µg/kg,i.p. napi 2x - 3 napig) növeli a nyál amiláz aktivitását, miközben paralel csökken az amiláz tartalom gl. Parotisban. RNA reverz transzkriptáz PCR-el elemezve a mirigyszövetet cDNS 576bp amiláz-derivátum produktummal, az EGF kezelt állatokban 18-szorosra fokozódott az amiláz mRNS szint a kontrollhoz képest. [40]. Nincsenek pontos adataink, mely sejttípusok termelik a nyál EGF-et. Eddig patkány gl. Submandibulárisban a granuláris konvolúciós tubulusok sejtjeiben (GCT cells) mutattak ki EGF termelés, ahol nagyon gazdag az adrenerg beidegzés [41, 61]. Egérben és patkányban noradrenalin adással emelni lehet mind a nyál, mind a plasma EGF koncentrációját [42, 43, 44] mely hatás alfa-adrenerg receptoron mediálódik [22]. Korábbi vizsgálataink és irodalmi adatok is alátámasztják, hogy fokozott funkcionális terhelésre pl.: gusztatórikus ingerlésre, vagy a paralell nyálmirigypárok eltávolítása (sialoadenectomia,

ablatio)

után,

a

megmaradt

mirigyek

funkcionális

aktivitásfokozódással (hypertrófia és hyperplázia), bizonyos kompenzálásra képesek a

19

mirigyfunkció, vagyis a nyálelválsztás terén. [37, 46, 47]. Nem ismert, hogy ez a mirigykompenzáció létre jön-e az EGF produkció terén is, de lehetőségét nem zárhatjuk ki az epithel sejtekre kifejtett hatás alapján. Ennek humán viszonylatban is számos esetben lehet jelentősége. A különböző okból (tumor, baleset, fertőzés) kieső nyálmirigytermelés esetén van-e esély az EGF kompenzációra, mely a napi több száz szájnyálkahártya mikrosérülés regenerációját - fertőzési kapuként tekintve életfontosságú lehet. Kísérleteink első részében erre a kérdésre kerestünk választ, az állatok gl. Submandibuláris-sublingualis

eltávolítása

(ablatio)

után

kialakuló

gl.

Parotis

kompenzációs megnagyobbodása vonatkoztatható-e az EGF termelés és szekréció kompenzációjára is. 2-A.2. Nagynyálmirigyek teljes eltávolítása – „total ablació”. Az előzőek gondolatmenetét követve adódik a kérdés, van-e lehetőség facilitált, vagyis növekedési faktorral (EGF) szabályozott nyálkahártya regenerációra valamennyi nagynyálmirigy

kiesésekor?

kisnyálmirigyek

képesek-e

A

nyálkahártyában

kompenzációra?

szétszórva

Egyáltalán

van-e

elhelyezkedő túlélési

esély

nagynyálmirigyek nélkül, a totál ablációt követően? Ezekre a kérdésekre – természetes körülmények között - experimentális modellkísérlet keretei között lehet választ keresni. A kisnyálmirigyek experimentális vizsgálata a kísérleti munkákban általánosan alkalmazott kistestű rágcsálókban - mint pl. egér, patkány, hörcsög - számos főként technikai problémával jár. Előfordult kezdetben olyan vélemény is, amely rágcsálók esetén a kisnyálmirigyek létezését is megkérdőjelezte. 1972-ben Robert S. Redman anatómiai és histológiai vizsgálatokkal igazolt patkányban az bucca anteriális területén kis nyálmirigyeket (Anterior Buccal Gland = ABG). Nyálszekrétum glycoproteinjeibe 1984-ben jelzett

35

S beépülés vizsgálattal buccalis és palatinalis mirigyeket mutatott ki

D.R.J. Green [48]. A Redman laborban Suzanne Nicholas írta le mucous felépítésű buccalis mirigyek ultrastruktúráját 1985-ben [49]. Az ABG beidegzését 1994-ben J. Törnwall írta le [50]. Eredményeik a nagy nyálmirigyekre jellemző kettős beidegzésű trigeminális -parasympathicus- dominanciára utalnak. A humán kisnyálmirigy szekrétum kémia komponenseire vannak korai adatok [192]. A szekréció szabályozási

20

viszonyainak vizsgálatára kifejlesztett korszerű módszerekkel – egy-egy mirigyre, vagy lokalizált területre határolva – újabb adatokkal bővültek ismereteink az ezredfordulón [193, 194, 195]. Patkányok esetében, ahol a nyugalmi nyálmennyiség elenyésző, igen változatos ingerlési technikákkal (elektromos idegingerléstől a különböző receptor agonistákig) csak stimulált nyálat gyűjthetünk biztonsággal. A nagynyálmirigyek vizsgálatánál gondos kivitelezés mellett nyerhetünk izolált nyálmintát, akár az orális kivezetés kanülálásával, akár sebészi ductus feltárás mellett direkt kivezetéssel. A szájüregben több helyen elszórtan elhelyezkedő kisnyálmirigyek természetéből adódóan e módszerek nem alkalmazhatók. A nagynyálmirigyek funkcionális intaktságának megtartása mellett a stimulálással nyert kisnyálmirigy szekrétum izolált gyűjtése – teljes elkülönítése – rágcsálóknál gyakorlatilag kivitelezhetetlen. - Ezen technikai problémák mellett, izolált mirigyek vizsgálatával nem nyerhetnénk a teljes szájüregre vonatkozó adatokat, a kisnyálmirigy rendszer szekréciója tekintetében. - Humán viszonylatban a nagynyálmirigyek vírusinfekció, tumor, sérülés, nyálkövesség következtében viszonylag gyakran esnek ki a funkcionális nyáltermelésből. Kevés adatunk van a kisnyálmirigyek kompenzációs lehetőségéről. A feltételek szabadabb megválasztásával, befolyásolásával egy experimentális állatmodell sok új adathoz juttathat bennünket. - A nyálmirigyeknek a nyáltermelésen túlmenően egyéb, a szervezet égészére is kiható funkciói is vannak, mint például a growth faktorok, szabályozó peptidek termelése. Kérdéses, hogy a nagynyálmirigyek eltávolítása befolyásolja-e az egyed túlélését? Laboratóriumunkban egy olyan kísérleti módszert dolgoztunk ki, melyben a nagynyálmirigyek voluminózus szekréciója nem keveredhet a szájüregi nyálkahártyára közvetlen szekretáló nyálkahártya mirigyek, döntően kisnyálmirigyek produktumával. Modellünkben ez a feltétel úgy valósul meg maradéktalanul, hogy valamennyi nagynyálmirigy kivezetőcsövének lekötése után az összes nagynyálmirigyet teljes egészében eltávolítjuk. Kísérleti metodikáink sorában ezt az eljárást „totál abláció”-nak nevezzük. Természetesen ebben az esetben is figyelembe kell venni, hogy a szájüregben a kisnyálmirigyek szekrétuma mellett, a szájüregi nyálfilmbe kerülhetnek széteső sejtek anyagai, a gingivális sulcus váladék, vagy mikrosérüléseken át intersticiális folyadék illetve vér. A nagynyálmirigyek részleges eltávolítását követően krónikus, míg a totál

21

ablációja után akut és krónikus kísérleteket végeztünk a fent említett kérdéskörök tisztázására.. 2-B. - Csontszövetre irányuló vizsgálatok és az adekvát modell keresése, csontregeneráció és implantátum-beépülés modellezése, modifikálása 2-B.1. Új szempontok az experimentális csontkutatásoknál Gyakorlati és tradicionális szempontok miatt a csontkutatásokban – így az implantológiában is – a nagyobb volumenű kompaktával és spongiózával rendelkező combcsont, csípőcsont, koponyacsont szöveteit alkalmazzák tradícionálisan. Ezen anatómiai területeken a csont szoros egységben működik az életfontosságú hematopoetikus szövettel. Miután az előzőekben bemutatott számos kapcsolódási ponton összefüggő rendszerről van szó a csontszövet remodelling funkciója is összekapcsolódik a vérképzéssel. A humán dentális implantológiában az eredeti célterületek - a hiányos vagy gyér hematopoetikus aktivitású állkapocs csontok – experimentális

céllal

nehezen

hozzáférhetőek.

Az

experimentális

kísérleti

vizsgálatoknál leggyakrabban alkalmazott rágcsálóknál – egér, patkány – ráadásul a moláris területekre korlátozódó csekély csonttérfogatnál komoly technikai bravúrok szükségesek, így implantációs alapkísérletekhez nem praktikusak. A nagyobb testű emlősállatokon végzett kísérletek morális és gazdasági szempontok miatt korlátozottak. Az említett meggondolások és csontváz strukturális szerkezetének vizsgálata alapján a patkányok farokcsigolya (caudális vertebrák) csontállományát választottuk a szivacsos csont regenerációjának kísérleti modellezéséhez. Az irodalomban kevés adat található a felnőtt rágcsálók farokcsontjára vonatkozóan, amit részben az magyaráz, hogy az evolució során, primátákban, degenerálódik, involúción megy át és így elveszti jelentőségét a terápiára irányított kutatások szempontjából. A farokcsigolya, a csontvelő-szövet kísérletes vizsgálata területén is teljesen elhanyagolt, és nem találtunk adatot erre vonatkozóan. Ismeretes, hogy rágcsálókban a csontvelő-kutatás modell szerve az egér femur, tibia és a calvaria. A többi szivacsos csontban folyó vérsejtképzésről nem állnak rendelkezésre pontos, a mai methodológai szintnek megfelelő adatok. Az implantológiai kutatások is többnyire az előbbi csontokban folynak – különböző speciesekben. Az állcsontokba helyezett implantátumok környezetében klinikai és tankönyvi adatok szerint a csontállomány nem mutat

22

számottevő vérképzésre utaló szerkezetet. Felvetődik a kérdés, mennyire lehet egzakt válaszokat kapni kizárólag a csontszerkezetet érintő, vagy a dentális implantátumok osseointegrációjáról, azokban a kísérleti eljárásokban melyeket olyan csontban végeznek, ahol a csontszövet és hematopoetikus szövet szerves egységet képez? Lehet, hogy megkérdőjelezhetők ezen területeken végzett kísérletekből kapott, egyszerű szivacsos csontra vonatkozó regenerációs, implantátum osseointegrációs eredmények? Először tehát olyan csontszövetet kerestünk, amelynek hematopoetikus szerepe csekély vagy nincs, így jó eséllyel eqvivalens a csontvelőben szegényes vagy hiányos csontokkal (pl. állcsontokkal). Összehasonlító vizsgálatokat végeztünk először egereken, hogy megfelelő alap-adatokat nyerjünk a titán implantátumokkal végzendő munkáinkhoz, ami lehetővé tette egy viszonylag széles spektrumú analízis kivitelezését. Majd ezen ismeretek alapján kidolgoztuk a vizsgálati metodikát patkány farokcsigolyákra. Módszerünk két újdonságot is magába foglal: 1.) patkány farokcsigolyát alkalmaz a szivacsos csont vizsgálatokhoz, valamint 2.) az implantátum körül művi-csontkazetta üreget alkalmaz az újcsontképződés, valamint lokális modifikáló eljárások vizsgálatára. Ez a módszer lehetővé teszi bio-materiális anyagok és/vagy különféle sejtpopulációk tesztelését és mérését a csontregeneráció és újcsontképződésosseointegráció folyamatában, melyet kvantitatív rögzítési erőkkel és mikromorfológiai mérőszámokkal

jellemezhetünk.

A

módszer

alkalmazásának

bemutatására

a

csontregeneráció-osseointegráció időbeli folyamatát és a krónikus, szisztémásan alkalmazott Zometa kezelést, mint a modifikált újcsontképzést választottam. 2-B.2. Új vizsgálati modell kialakítása farokcsigolyában Az experimentális vizsgálatok egyik fő sarokpontja, hogy az általuk megválaszolt kérdések, milyen mértékben adaptálhatók humán viszonyokra. Sokszor alapvető megegyezésekre, így a nyilvánvaló alkalmazhatóságra, sem látunk törekvést. Vannak szöveteink, melyek nem monoton szerkezetűek és nem egy funkcióval rendelkeznek, szoros együttműködésben sőt egy lokalizációban vannak egyéb szövetekkel – de szervezetünkben ezen viszonyok topológiai variációival is számolnunk kell. Ilyen a csont, amely a hematopoietikus csontvelőszövettel és az energia raktározó zsírszövettel van szoros kapcsolatban. A nélkül, hogy ne ismernénk annak a szövet

23

kompartmentnek az aktuális feladatkörét, steady state állapotának regulációs mechanizmusait amelyen a kísérleteinket végezzük nem számíthatunk egyértelmű sikerre. Élünk a gyanúval, hogy sok alapkérdéseket feltevő implantációs kísérlet megállapítása kérdőjelezhető meg csontregeneráció tekintetében. A bevezetőben kifejtettek értelmében számos olyan helyzet állhat elő a humán klinikumban, amikor olyan csontkompartmentbe kerül implantátum, vagy csontpótló anyag, ahol az aktuális csontszövet nem, vagy csak jelzés szinten tartalmaz vérképző szöveti elemeket. Feltehető, hogy ezekben az esetekben a csontszöveti reakciók - mint a regeneráció, osseointegráció – különböznek a vérképző szövettel együtt funkcionáló csont kompartmentekhez képest. E kérdéskör mentén kezdtük elemezni az egyes csontkompartmentek és a vérképzés viszonyát – fenntartva azt célt, hogy megfelelő csontszövetet találjunk, a „tiszta” csont-reakciók vizsgálatára mely alkalmas a vérképzési

funkciók

nélküli

csontregeneráció,

osseointegráció

experimentális

kutatására. 2-B.2.1. A csontszövet és a csontvelő biológiája

A csont- és a vérképző csontvelő-

szövet szerves, elválaszthatatlan, funkcionálisan egymásra utalt egységet képez a gerincesek szervezetében. Ezt Vera Dantchakof fogalmazta meg legszebben az elmúlt század elején, miszerint a csont és csontvelő, „mint a termőföld a magvakat, fenntartja a vérsejtek termelését”. A kölcsönhatás a másik irányban is alapvető, ugyanis a hematopoietikus

őssejtekből

differenciálódnak

az

osteoclastok

melyek

a

csontátépítéshez és a Ca++ mobilizációhoz nélkülözhetetlenek. Felnőtt szervezetben, a csontvelő parenchyma állománya foglalja magába a mesenchymális őssejteket (MSC), melyek differenciálódni képesek osteoblastokká, chondroblastokká, a véredényt képző endotheliummá és zsírsejtekké. Ezenfelül a mesenchymális őssejtek izom és in-sejtekké is

képesek

differenciálódni

és

extrém

körülmények

között

talán

képesek

differenciálódni más, specializált sejtté is. Az ontogenetikai fejlődés során a hematopoietikus szövet jelenik meg először, mint funkcionális szövet, primitív formában, ami biztosítja a gyorsan növekvő sejtek oxigén ellátását és a macrophágok révén, biztosítja a szöveti átrendeződéshez szükséges hydrolitikus enzimeket. Magasabb rendű gerincesekben a vérképző sejtek autonóm módon jelennek meg legelőször az extra-embrionális szikzacskó mezodermából, [62, 63] majd a splachnopleurális mezodermából, ami hemangiogenikus csomókba

24

szerveződik a dorzális aorta ventrális területein [62, 64, 65, 66, 67, 68, 69]. Innen, az aortából származnak a végleges, a felnőtt szervezetre jellemző hematopoietikus őssejtek (hemotopoietic stem cells, HSC) melyek nagy önfenntartó osztódási képességgel rendelkeznek és ugyanakkor képesek az összes hemato-lymphopoetikus sejtvonal irányába differenciálódni. Az aorta vérszigetekből a keringésen keresztül jutnak a kezdeti máj primordiumba, melyet nagymértékben feltöltenek, egérnél az egyedfejlődés 12-ik napja körül [70]. Az embrionális máj tekinthető az első igazi vérsejtképző szervnek ahol a őssejtek frenetikus gyorsasággal szaporodnak, érdekes módon a hepatoblasztokkal párhuzamosan egy kiméra szervet képezve, egész a születés körüli fejlődési stádiumig [71]. Eddig az ontogenetikai korig a HSC populáció függetlenül fejlődik a későbbi csontképző szervkezdeményektől 10. ábra.

10.ábra: Az embrionális vérképző rendszer és a csontrendszer fejlődésének összekapcsolódása: szikzacskó-máj-lép----csontvelő.

25

Embryonális leoszlás Mesoderma Mesenchyma Hemangioblast MSC Angioblast Osteoblas

HSC

proT

Stellat sejt

Com MP

T-

proB

B-

proN

N

proD

ComL

CSONT

Endothelium

Centrális véna

46. GMP ME

DC Granulocytá Monocyta MacrophageErythroid

Eosi no Neu tro M Bas

RB Pla

Pro-Osteoclast Megakaryocyt Macrophag Res Csontvelő önreprodukáló Közös Tranzit progenitorok Terminalális kiáramlás SC Differenciálódás Asszimetrikus sejtoszlás Amplifikáló sejtvonalak Homing Expanzió Expanzió segregációja Önmegújuló Ö Osteoclast

11.Ábra: A csont remodelling elemek és a hematopoietikus stem sejtek eredete, önfenntartása és terminális differenciálódása

A végleges vérképző szövet, a csontvelő fejlődése, intim kapcsolatban áll és szorosan

kapcsolt

a

csontváz

fejlődésével.

Egyrészt,

a

csontmodell

végső

megformálásában, főleg a hosszú és szivacsos csontok esetén, a keringésből származó hematopoietikus „előfutárok” játszanak döntő szerepet. Ezek a sejtek a májból és lépből származnak, oszteo,- és chondroclastokká differenciálódnak és a kezdeti üregképzésben, a központi és a lakunás részek hisztolizisében vesznek részt. A csontvelő fejlődésében kritikus esemény a központi csont shaft, a diaphysis, hisztolízise, átformálása [72] a hematopoietikus őssejtek bevándorlása előtt, ami csak ezután, a csontfejlődés, az endochondrális ossifikáció végső szakaszában kezdődik [73]. Alapvető, mind a mai napig vitatott és kutatott biológiai kérdés, hogy mi szabja meg a szövetek domináns, karakterisztikus szöveti szerkezetét, funkcionális mibenlétét. A gyorsan osztódó és differenciálódó szövetekben, ahol az őssejtek biztosítják a szövetek sejt-tömegprodukcióját, két terminológiát vezettek be az irodalomban. Wolf és Trentin [74] nyomán a „szöveti mikrokörnyezet, vagy microenvironment”, míg Schofield [75] elmélete szerint egy hypotetikus „őssejt fészek, vagy niche” felelős az

26

őssejt biológiai és fiziológiai szabályozásáért. Manchesterben, LG Lajtha professzor csoportja, a Paterson Laboratóriumban, az 1970-es évek közepétől több éven keresztül dolgozott a „niche” topológiai meghatározásán. Frakcionált csontvelő elutrálást alkalmazva az egér femurban arra a következtetésre jutottak, hogy az őssejtek nagyobb gyakorisággal fordulnak elő az endoszteumhoz közeledve [76]. A „niche”-t azonban sem detektálni, sem izolálni sem cytológiailag meghatározni nem sikerült nekik. Néhány éve a „niche” modell új fellendülésen ment át és számos szöveti rendszerben, kizárólag szilárd szövetek esetén, sikerült azonosítani az őssejteket dajkáló, „niche”-t formáló sejteket. A csontvelő szövetre vonatkozó jelenlegi adatok azt sugallják, hogy az őssejtek célzott, az endoszteum felé való vándorlását a Ca-érzékelő receptorok irányítják [77] míg mások szerint a szöveti oxigén gradiens (hypoxia felé) vagy az SDF1/CXCR4komplex játszaná ezt a szerepet. Másrészt az adatok azt sugallják, hogy az őssejtek nyugalmi állapotát az endosteumot bélelő osteoblasztok biztositják, BMP-R függő delta-like faktoron és a „notch”-receptoron keresztül [78], vagy osteopontinon keresztül [79], vagy a Tie2/Angiopoietin-1 szignál mechanizmuson keresztül [80].

Homeostázis Csont Osteoblast

1α,25D3 ösztrogen

Csont

Modulációk

HS G

RANK-L

Osteoclas 2+

Ca SDF-1O2

Jagged1 Notch

PTH/PTHrP Calvi, PTHrP-R Knock In

2003

Zhang, 2003 Arai, 2004

+ +

BMP BMP-RIA Knock Out

Β-Catenin Sinus H +S N-cadherin endothel

Ang Ti e2 HS

Ca-SR

HS CXCR

HS HS G HS

EC

G

C

MK Rafii, 2004

12.Ábra: A csont kompartment és a hematopoietikus őssejt-niche kapcsolat és szabályzása a jelenlegi modellek alapján (I.B. utàn)

27

Ezeket az adatokat sokan úgy interpretálják, hogy az endosteális osteoblasztok önmagukban képzik a hematopoietikus őssejtek számára a „niche”-t [81, 82]. Más munkák azt valószínűsítik, hogy a HSC „niche”-t a vasculáris endothel sejtek képzik [83, 199]. Ezeket az adatokat, amelyek önmagukban érdekes, új információkat hoztak a felszínre a 12. ábrán foglaltuk össze. 2-B.2.2. Új vizsgálati modell kidolgozása csontregeneráció- és implantátum beépülés vizsgálatára szivacsos csontszövetben Cél: ƒ

Információt tudjunk adni implantátum erőviszonyainak tervezéséhez a klinikum számára, melyből a szokványos vizsgálati paraméterek (rtg analízis, CT, implantátumfelület), meghatározásával a funkcionális erőviszonyokra lehessen következtetni

ƒ

Az előzőek értelmében a mikromorfometriai rtg analízis (mikroCT) során nyert mikromorfológiai adatok (pl. aktuális egységnyi mintaszövet csonttérfogata, csontfelület, trabekulaszám, átlagos trabekulaátmérő, porozitás, abszorpció) és az implantátumot rögzítő tangenciális erők közötti összefüggés meghatározása.

Kutatási hipotézis: 1. Patkány farokcsigolya kortikális réteggel borított spongiózája – melynek térfogata közel 1 cm3 – előzetes vizsgálataink alapján alkalmas csontszövetben történő fiziológiás és pathológiás biológiai folyamatok, valamint a regulációs tényezők, így a csontregeneráció és degeneráció, implantátum osseointegráció vizsgálatára, elemzésére. 2. A csontregeneráció ideje és minősége változtatható lokálisan alkalmazott és szisztémásan adott biológiai faktorokkal (BMP, EGF), kristályképző kémiai anyagokkal (pl. hydroxyapatit HA ) és drogokkal, amely hatások vizsgálhatók új kísérleti rendszerünkben az implantátum körüli művi csontkezetta

alkalmazásával

patkánymodellen.

28

(„OSSImodell”)

in

vivo

kísérleti

Kérdés: 1. Milyen összefüggést mutat a csontregeneráció morfológiája az osseointegráció kvantitatív biomechanikai mértékével 2. A csontremodellinget szisztémás gyógyszeres kezeléssel befolyásolva, kimutathatóak-e kvantitatív csontregenerációs változások modellünkben az implantátum osseointegráció biomechanikai és mikromorfológiai paramétereiben Az

előzőek

során

vázolt

problémakörök

vizsgálatára

építettük

fel

az

osseointegrációs experimentális sorozatunkat. 2-B.2.3. Titán implantátumok szervülési erejének mérése és a regenerációs újcsontszövet

mikromorfometriai

elemzése.

A

gerinces-váz

integritásának

és

funkcionális stabilitásának alapja a krisztalizált csontszövet osteoblastok és osteoclastok működésén alapuló folyamatos felépülése és bontása. [92, 93].

A csont homeosztázis

steady-state állapot szabályozása több szinten történik. A mechanikai hatások indukcióját, centrális és lokális endokrin kontrolll viszi át a csontszövet és a csontvelő sejtek között kialakuló “cross-talking”-al [ 94, 95]. Az utóbbi időben közöltek szerint szoros kapcsolat áll fenn a csont és vaszkuláris szövet között, egy speciális microkörnyezetet képezve, melyet “bone remodelling compartment”-nek (BRC) neveznek. [96, 97], melynek kulcsszerepe van a csontátépülésben (bone remodelling) és a törés regenerációban. A BRC-t körülveszi egy, csontfelszíni sejtréteg. A csontvelő lakunás zárt részeit borító sejtekből kinyerhetők oszteotropikus citokinek, növekedési faktorok (osteoprotegerin, RANKL) melyeknek lokális szabályozó funkciója van. Egyes szerzett csontbetegségek

keletkezhetnek

a

csontvelőhöz

kapcsolódó

osteoblastok,

hematopoetikus stem sejtekből származó osteoclastok, az ér-endothel sejtek és a BRC egységet borító sejtek (bone linig cells) közötti egyensúly zavarból [98, 99]. A BRC – nek van olyan területe ahol a sejtek közvetlen kapcsolódnak a csupasz (denudált) csonttal és a csontmátrixal és feltehető hogy ezt az „ablakot” mint alapterületet foglalják el a csont-specifikus rák sejt metasztázisok. A metasztatikus sejtek – nevezetesen az emlő, a prosztata rák sejtjei és a myeloma multiplex sejtek képesek az osteoclastok

29

képződését és funkcióját serkenteni parathyroid hormone-related protein (PTHrP) kapacitásukkal [100]. Ennek alapján csökkenthető a BRC területek metasztatikus esendősége anti-rezorptív hatású

anyagokkal

–

mint

pl.

a

biszfoszfonatokkal.

Számos

vizsgálat

a

csontmetasztázisok gyakoriságában szignifikáns csökkenést mutat ki biszfoszfonátkezelésre [101, 102, 103]. A csontszövetben – annak ellenére, hogy robosztus, masszív szövet – igen gyakran kóros elváltozások alakulnak ki, a rákos elfajulásokon kívül is. Így a csontszövetben állandó jelleggel problémát okoznak az endocrin szabályozási zavarok, mikrobiológiai infekciók, gyulladásos reakciók, rtg-besugárzás vagy más terápiás eljárások mellékhatásai, de magában az öregedéssel együtt járó csökkent regeneráció is. A mechanikai trauma valamennyi zavar progresszióját erősíti és gyakori probléma a humán

egészségügyben.

A

csontbetegségek

kezelésénél

manapság

jelentős

előrelépéseket értek el. A kutatásokban új terület a szerves vázanyagok, csontképzési faktorok összekapcsolása a génterápiával [104] és a lokális őssejt képzéssel [105, 106], amely összességében új utakat nyit a csontregeneráció optimális kezelési eljárásaiban. Az egyre speciálisabb, kifinomultabb fém implantátumok alkalmazása új lehetőségeket teremt a csontbetegségek terápiájában, nem utolsósorban a fogazati rehabilitációban – bár módszertanilag e terület még korántsem megoldott. Az elmúlt 25-30 évben a dentoalveoláris régióban alkalmazott endosseális implantáció olyan fejlődésen ment keresztül, hogy kijelenthetjük az elvesztett fogak nagy biztonsággal rekonstruálhatók dentális implantátumok alkalmazásával. A útkezdő- kereső próbálkozások a 60-as években, sok esetben kudarccal értek véget. Az implantátum körül kialakuló „kapszuláris” réteg, mely kötőszövetes fibrotikus – vagy csonttal kombinált fibrotikus szerkezetet

mutatott,

csökkent

értékű

rögzülést

eredményezett

[200].

Még

kedvezőtlenebb helyzetet és az implantátum „elvesztését” jelentheti, ha a nyálkahártya epithelsejt rétege - gyors regenerációval - mintegy izolálja a csontot és az implantátum felületét, amely végül kilökődik. Az első komoly sikerekről Bränemark számolt be, ahol az implantátum felület - csontfelület direkt kontaktusa fejlődött ki. [107]. Ő nevezte el ezt a típusú implantátum-csont kapcsolatot „osseointegráció”-nak mely ideális rögzülést eredményez [108]. Az implantátum stabilitását az a versenyfutás dönti el, amely az implantátum felé haladó csont-regeneráció illetve az implantátum körüli nyálkahártya

30

epithelsej-regeneratív burjánzás között zajlik. Jó eséllyel rehabilitálhatunk, ha a csontregeneráció győz, a csontszövet kapcsolódik az implantátumra. Az implantátum anyaga, felülete és alakja befolyással van a csontregenerációra [201]. Alapban az epithel burjánzás a nyerő, mivel sokkal gyorsabb a regenerációja, melyet növekedési faktora, a nyálban nagy koncentrációban jelenlévő - EGF gyorsít fel. Ebben a versenyben fontos tényező az idő, mely a szöveti reakciókon kívül a páciens számára is alapvető kérdés. A csontszövet

regenerálódását

befolyásoló

tényezők

vizsgálata

-

kapcsolva

a

vérsejtképzéshez – közel fél évszázadra tehető. Mérföldkő ebben a munkában a csontból kivont fehérjék azon csoportjának izolálása melyek ektópiás helyre adva, képesek ott új csont, vagy új porcképzést indukálni. [12]. Urist nevezte el ezt a fehérje-csoportot: “Bone Morphogenic Protein (BMP)” –nek. A különféle technikákkal mára 14-féle BMP-t izoláltak humán csontból [109, 110, 111, 112, 113]. Az eddigiek közül a rhBMP-2 a legerősebb hatású [114, 115, 116, 117, 118, 119]. Thorarinn és munkatársainak

sikerült

indukálni

rhBMP-2

–vel

az

implantátum

körüli

csontregenerációt és osseointegrációt létrehozni [120]. A szervezet szövetarányainak aktuális egyensúlyát számos regulációs faktor irányítja. A BMP faktorok molekuláris szerkezetével azonos, vagy hasonló regulátorok működnek a csontkörüli szövetekben. A Transforming Growth Factor (TGF) család tagjai a kötőszövet és bőr regenerálódásában játszanak szerepet, közvetlen hatásuk a csontképzésre nem mutatható ki [113]. Viszont kombinációban a BMP-vel a TGF-ß2 oszteogenikus aktivitást indukál [121]. Mint korábbi fejezetünkben részletesen taglaltuk, a csont- és vérképzés szoros kapcsolatban vannak egymással. Burchardt és Friedlander mintegy húsz éve csont-transzplantációs és a csont klinikai alkalmazásának alapkutatásaiban az osteogenikus markerek viszonyítási alapjául, “gold standard”-nek adta meg, az autogen csontvelős csontot (Autogenous particulate marrow APM) és a szivacsos csontot (cancellous bone (CB) [122, 123]. Boyne majmokon végzett 6 hetes időtartamú osseointegrációs vizsgálatában csontregenerációs induktornak az implantátum mellett BMP-t, TFG-B -t, és autogén csontot alkalmazott. Vizsgálati eredménye alátámasztja, hogy az alveoláris csont adequate inductor anyagra, a csontregeneráció gyorsul, vagyis az osseointegráció ideje csökkenthető [118]. Bonyolult és sokáig tartó konszolidációs folyamat a természetes biológiai struktúra – jelen esetben a szivacsos csont – felülete és a fém kapcsolódása, amely alapvetően különbözik a sejt-sejt kapcsolódás, vagy a kötőszövet-sejt

31

kapcsolódás mechanizmusától [108, 124, 125]. A biológiai szövetépítésben jelentősek a „biológiai ragasztók” a felületi kapcsolódások megerősítésében, mint például a kondroitin szulfát, amely igen erős biomateriális egységben tartja a porcszövetet [126]. A

csont

és

fém

kapcsolat

esetében

alapvető

sejtes

közreműködést

az

osteoblast/osteoclast aktivitás szöveti homeosztázisa jelenti, a sérült csont direkt átépítésével egy szilárd új szivacsos, vagy tömör csont képzésével. Az idősödő népességet jelentős mértékben érintő oszteoporózis betegség kezelésében alkalmazott biszfoszfonátok az osteoclastok képződését és aktivitását egyaránt gátolják [116, 127, 128, 129, 130]. Mellékhatásuk viszont lényeges korlátot jelent alkalmazásuknál, főként ezen idősebb betegek esetén [131, 132, 133]. A különböző molekula típusok között a heterociklikus imidazol biszfoszfonát (Zometa® ) megjelenése alacsonyabb toxicitást jelenthet, mivel alacsonyabb dózisban hatásos, szemben a többi biszfoszfonáttal. Ráadásul újabb adatok bizonyítják, hogy képes fokozni in vitro sejtvonalakon az osteoblastok proliferációját, és terminális differenciálódását [134, 135, 136]. Ezen túl rövid periódusú Zometa kezeléssel fokozni lehet a csont ásványi anyag denzitását és allogén stem-sejt transzplantáció után a csontvelő progenitor fibroblasztok számát [82] Ezen adatok felvetik a kérdést, hogyan befolyásolja a krónikus Zometa-kezelés az osseointegráció folyamatát és a regeneráció folytán újraképződő csont szerkezetét? Az utóbbi években egyre több szöveti regulator és bioaktív anyag vizsgálatáról, hatásmechanizmusáról számolnak be in vitro sejtélettani kutatás eredményei alapján. Az izolált körülmények között nyert adatok adaptálása in vivo dimenzióba, számos experimentális állatmodell igényét veti fel.

32

3) MÓDSZEREK 3-A. A nagynyálmirigyek részleges- és teljes eltávolítása (abláció) 3-A.1. Általános protokollok 3-A.1.1. Kísérleti állatok. Kísérleteinkben ad libitum táp és folyadékadás mellett fordított fénycikluson tartott 260-310g testsúlyú Wistar Crl.(Wi)Br patkányokkal dolgoztunk. A műtéteket és a szekréciós vizsgálatokat nátrium-pentobarbital (40 mg/kg i.p., Nembutal, Serva 30225) altatásban végeztük. 3-A.1.2. Nyálmirigy szöveti minta. Az állatokból medián sagitális metszésen át kipreparáltuk a nyálmirigyeket, a zsír- és kötőszövet lehető legnagyobb mellőzésével. Az ér és kivezető cső köteget tompa feltárással kipreparáltuk, a mirigy hilusoknál lekötöttük és a mirigyeket levágtuk. A mirigysúlyukat lemértük, a szöveteket 0 C°-on 20 mM pH 7,4-es foszfát pufferben ollóval aprítottuk, majd blendor-rendszerű késes készülékkel, jeges vízfürdőben homogenizáltuk (3x5perc,). 3-A.1.3. Nyálgyűjtés a.) Részleges ablációban és paralell kontroll állatokban. Altatott állapotban, kis medián nyaki metszésből trachea-kanült helyeztünk be – az átjárható légutak biztosítására - melyet kettős ligatúrával rögzítettünk. A szájüregbe illetve a gl. parotis kivezetőcsőre helyezett műanyag kanüllel Eppendorf centrifugacsőbe vezettük a kevertilletve a parotisnyálat, 15’-es frakciókban, pilocarpin-HCl ip. stimulációt alkalmazva. b.) Teljes ablációban és a paralell kontroll állatokban. A kisnyálmirigyek szekréciós vizsgálatára általunk kifejlesztett új nyálgyűjtési módszer: „a frakcionált szájüreg öblögetéses kimosás”. Akut kísérleteinknél folyamatos altatásban, a nagynyálmirigyek eltávolítását követően trachea kanült helyeztünk be. A posztoperációs nyugalmi fázis (45 perc) után, - míg a krónikus vizsgálatainkban a periódusok végén a kísérleti napon, a szokásos táplálkozási protokollnak megfelelően előzetes 16 óra éheztetés utáni altatásban - gyűjtöttünk nyálmintát a teljesen intakt, sérülésmentes nyálkahártyával rendelkező szájüregből. A szekréciós vizsgálatoknál 5-perces intervallumokkal frakcionált kimosási gyűjtést alkalmaztunk. A nyálgyűjtést Eppendorf centrifuga csövekbe előzetesen 250-250µl kiadagolt,

szobahőmérsékletű,

naturálisvízzel

(topwater)

történő

öblögetéssel

valósítottuk meg, automata pipettát használva. A levett mintákat jégdarába helyezve hűtöttük. Állatonként összességében 150 perces vizsgálati periódus alatt így harminc db

33

5-perces frakciót kaptunk. Ebből az első 10 frakció. a kimosási nyugalmi fázis, majd következő 20 frakció a stimulációra adott válsz, a stimulált szekréciós fázis. E stimulációs ingerre adott 100-perces szekréció összesített értékeit elemeztük. Az álműtött, kontroll csoport intakt állataiból, a 100-perces szummált nyugalmi valamint a stimulált kevert nyál output-ot - trachea kanül behelyezését követő 45 perc poszt traumás szünet után- 15 ml-es Cornig centrifugacsőbe gyűjtöttük. A volumenérték leolvasása után ezeknél a kevertnyál szekrétumoknál elvégeztük a frakcionált gyűjtési volumenre adaptáló naturálvizes hígítást (20x250 µl), vagyis a nyert szekrétumhoz adtunk 5 ml naturálvizet. A biokémiai vizsgálatokhoz a mintákat -2o°C -on tároltuk. 3-A.1.4. Biokémiai vizsgálatok a.) Fehérje tartalom meghatározás. A fehérje koncentrációt Bradford-féle módszerrel savas közegben Coomassie Brillant-Blue G-250 festék fehérjékkel adott, koncentráció függő kékszín- intenzitás változása alapján, fotométerrel 49o nm-en mértük [51], Bio-Rad Protein Micro Assay- kitt felhasználásával A koncentrációkat bovin serum albumin standard alkalmazásával, 2-20 µg/ml tartományban mértük automata fotométeren, 1o ill. esetenként 1oox -os mintahígításokból b.) Amiláz enzimaktivitás mérés. Az amiláz aktivitást keményítő bontása alapján végeztük [52]. Egy nemzetközi egység enzimaktivitás (U) megfelel 1mg keményítő hidrolizálással 37°C-on, egy perc alatt. Standardizálásra 1 ml nyál 1 mg fehérje tartalmára számítva. Az enzimaktivitás meghatározását Phadebas (Pharmacia, Sweden) tabletta teszt, fotométeres módszerrel végeztük, 560 nm-en mérve at extinkciókat, 1o és 1oox-os hígításokból. Az értékeket U/L koncentrációban ill. a százperces szummációs kidobási értéknél U nemzetközi egységben adtuk meg. c.) Fotométeres mérések. Mind a fehérje mind az amiláz mérésnél micro-plate rendszerre adaptálva dolgoztunk és a koncentrációk meghatározásához az extinkciókat Bio-Rad micro-plate reader (Modell: 3550) fotométer automatán mértük és egyedi PCszoftverrel számítottuk ki az értékeket d.)

EGF

tartalom

mérése.

Mind

a

nyálmintákból,

mind

a

mirigyhomogenizátum felülúszókból „Radio-Receptor Assay” (RRA) módszerrel, human

placentális

syncitiotrofoblaszt-membrán

preparátumot

(Huplastb-mp)

alkalmazva mértük az EGF-koncentrációt [53]. A vizsgálandó 100 µl mintához adtunk 100 µl Humán placenta-membránpreparátum –ot és 100 µl izotóppal jelzett humán [

34

I125]-EGF -et (100 µl/50,000 cpm). Egy éjszaka, szobahőmérsékleten történő inkubáció után 1000µl 5% polyethylenglycol precipitálás fokozás után, a mintákat centrifugáltuk 10 percig, 1500xg értékkel. A felülúszót eldobásra leszívtuk, a csapadékot mértük. A membránhoz kötött jelzett EGF beütésszámot gamma-counterrel mértük, és a minta EGF koncentrációját a leszorításos egyensúly alapján standard koncentrációgörbe alapján számítottuk. A metodikában alkalmazott membrán EGF-receptora speciesfüggetlen EGF-kötő kapacitású [54]. 3-A.1.5. Statisztikai számítási módszerek. A vizsgálati csoportok adatainak átlagát számítottuk, megadva az átlagtól való standard ± eltérést (SD, SEM). Dunnet-test, vagy Student t-próba alkalmazásával készítettük el a variancia-analízist az értékek normál Gauss eloszlása alapján. Az adatokat Microsoft Excel 5.o adatkezelő szoftwerrel dolgoztuk fel, a statisztikai protokolok felhasználásával. Szignifikancia szintet p <0,05 – nél határoztuk meg. 3-A.2. A részleges nyálmirigyabláció kísérleti modell 3-A.2.1. Kísérleti állatok és műtéti technika. 24 db 250-300 g testsúlyú nőstény Wistar patkányból, enyhe Nembutal (30 mg/kg ip.) narkózisban, intraperitoneálisan (ip.) adott pilocarpin 2,5 mg/kg stimulálással 15 perces időintervallumban nyálat gyüjtöttünk, Eppendorf csövekbe. Ez után 12 állatnál nyaki medián sagitális metszésből, tompa szövetszétválasztással feltártuk a régiót. Kifejtettük mindkétoldali gl. submandibularis és a szorosan hozzáfekvő gl. sublingualis nyálmirigyeket. Az egykötegben futó kivezető csövet és ereket ligatúrával lekötöttük, majd a köteget átvágva eltávolítottuk a mirigyeket (részleges ablació). 3-A.2.2. Kezelési protokoll. Mind a műtött, mind az álműtött intakt állatokat két csoportra osztottuk: melyekben itatásra ad libitum tiszta csapvizet illetve, 0,5%-os citromsavas csapvizet adtunk, fokozott gusztatórikus ingernek. A kísérleti csoportjaink így a következők voltak: „kontroll” (Kont. = intakt álműtött, csapvíz itatással), „ablációs” ( AB = nyálmirigy eltávolított, csapvíz itatással), „citromsavas” (Cit. = intakt álműtött, 0,5% citromsavitatással), „ablációs és citromsavas” (AB+Cit. = nyálmirigy eltávolított, 0,5% citromsavitatással). Az egy hetes kezelési periódus alatt az állatok ad libitum standard patkánytápot (LATI Kft.) kaptak. A klimatizált állatházban, fordított fényciklussal az állatok diurnális ritmusát kontrolláltuk. A kísérlet előtt 12-16 órával a

35

tápot megvontuk. A kísérleti napon Nembutal narkózisban minden második állatból pilocarpin stimulálással 15-perces nyálmintát vettünk. Az artéria abdominálison történő elvéreztetés után valamennyi állatból kipreparáltuk a nyálmirigyeket, súlyukat lemértük.. A mirigysúlyok lemérése után a szöveteket 0 C°-on 20 mM foszfát pufferben (pH 7,4) blendorral homogenizáltuk. 0. nap – kísérlet indítás

7. nap

4) Nyálgyüjtés - Feldolgozás

1) Nyálgyüjtés: 24 db patkány

Gl Parotis

Nemanbutal narkózis (30 mg/kg) Stimulus: pilocarpin 2,5 mg/kg ts ip.

Gl. Submand Gl. Subl.

0. nap 15 perces nyálminta

Kezelés: 7 nap Citromsav itatás

Analizis: 7. Nap 15 perces nyálminta

Nyálmintából Mirigyből -Fehérje -Amiláz -EGF

3) Csoprtok: 2) Részleges Abláció -gl.submandibuláris -gl. Sublingualis műtéti eltávolítása

1. Kontrolll 6 db 2. Ablació (AB) 6 db 3. Citromsav (Cit.) 6 db 4. AB + Cit. 6db

1. Ábra: A RÉSZLEGES ABLÁCIÓ MODELL protokollja: nyálminta vétel, a gl. Submandibularis és gl. Sublingualis eltávolítása, kezelési periódus, mintavételek és analízisek

3-A.3. A teljes nyálmirigyabláció – kisnyálmirigyek kísérleti modellezése: „Kisnyálmirigy experimentális vizsgálat” 3-A.3.1 Műtéti technika. Median sagitalis nyaki bőrmetszésből feltártuk a nagynyálmirigyek régióját. Óvatos, tompa szövetszétválasztás mellett a mirigyeket a kötőszöveti rögzítésükből felszabadítottuk, a mirigy hílusánál a kivezetőcső-ér komplexust lekötöttük, majd a mirigyeket levágtuk. Ily módon először a baloldali ezt követően

a

jobboldali

parotist,

majd

ugyancsak

a

bal

és

jobboldali

submandibuláris/sublingualis nyálmirigyeket távolítottuk el. Krónikus kísérleteinknél a sebet tovafutó varrattal zártuk, mely pár nap alatt per primam zárult. Az állatokat, ez esetben ébredésig testhő-kontroll alatt tartottuk, majd ébredés

36

után randomizált módon három csoportba osztva visszahelyeztük eredeti állatházi környezetükbe. 3-A.3.2. Teljes ablációs állatok kezelési protokollja a.) Akut vizsgálat. Akut kísérleteinknél a nyálmirigyek eltávolítása után - és a krónikus kísérletek szekréciós vizsgálatánál is- poliethylen gégekanült helyeztünk be, az átjárható légutak biztosítására. A műtét után testhőmérsékleti kontroll mellett, 45 perc posztoperációs stabilizálódási szünetet iktattunk be, a műtéti stressz rendeződésére, majd a folyamatos anaesthesia fenntartása mellett indítottuk el a szájüregi mintavételezést. b.) Krónikus vizsgálat (7, 14, 21 nap). Az állatokat a vizsgálati időnek megfelelően 7, 14 és 90 napig ad libitum táp és folyadékfelvételen tartottuk Az intézetünkben, korábbi ablációs-hipertrófiás kísérletek eredményei alapján választottuk a 7 és 14 napos vizsgálati periódust. Korábbi tapasztalatok és irodalmi adatok hiányában felmerült a túlélés kérdése a nagy-nyálmirigyek teljes funkciókiesése következtében. Ennek megválaszolására a túlélési lehetőséget vizsgálva, 2 állatot további (90 nap) megfigyelés alatt tartottunk. Az állatok állapota (folyadék és tápfelvétel, fizikális állapot) a totál ablációt követően 90 nap elteltével sem mutatott eltérést a kontroll állatoktól. c.) A kisnyálmirigy szekréció stimulálása és gátlása. A szájüregben lévő reziduális nyálfilmet az első 10 frakcióba kimostuk (50. perc), majd ez után alkalmaztuk szisztémásan intraperitoneális (ip.) Pilocarpin injekcióval a szekréciós ingerlést. Ha az inger antagonistájának hatását vizsgáltuk, akkor az antagonistát előzetesen az 5. frakció idején (25. perc) adtuk be szintén ip. injekcióban. Szekréciós ingerként 1 mg/kg pilocarpint (Pilocarpine-HCl, Serva) alkalmaztunk, antagonista vizsgálat esetén a ßreceptor gátló propranololt (Inderal inj.ZENECA UK), 2 mg/kg dózisban ip. adtuk az 5. frakció végén (25. perc).

37

– KRÓNIKUS kísérletek befejezése 7. nap, 14 nap és 90 nap

0. nap – AKUT kísérlet indítás

4) Nyálgyüjtés - Feldolgozás

1) Nyálgyüjtés: Kontrolll alap értékek felvétele Nemanbutal narkózis (30 mg/kg) Stimulus: pilocarpin 2,5 mg/kg ts ip. Szájüreg kimosási módszer

30x 5’-es frakció Kezelés: ad libitum táp és csapvíz 7, 14 és 90 nap

0. nap AKUT 150 perces nyálminta 30x 5’-es frakció 250-250µl naturvíz

2) Teljes Abláció -gl.Parotis -gl Submandibuláris -gl. Sublingualis műtéti eltávolítása

Analizis: 7. Nap 15 perces nyálminta

3) Csoprtok: n4

1. Kontrolll és Akut Totál Abláció (TAB)

5’-es kimosott frakcionált Nyálmintákből -Fehérje -Amiláz -EGF

2. Krónikus TAB - 7 nap n3 3. Krónikus TAB - 14 nap n4 4. Krónikus TAB 90 nap n2

2. Ábra: A TOTÁL ABLÁCIÓ – KISNYÁLMIRIGY EXPERIMENTÁLIS MODELL protokollja: nyálminta vétel intakt állatból, a gl. Parotis, gl. Submandibularis és gl. Sublingualis eltávolítása, vizsgálati periódus utáni nyálmintavételek és analízisek

3-B .1. A szivacsos csontok szöveti alapszerkezetének in situ vizsgálata 3-B.1.1. Kisérleti állatok. Laboratóriumi C57BL/6 típusú egereket (IFFA CREDO, L’Arbresle, France) alkalmaztunk melyeket 12 órás világos-sötét fénycikluson tartottuk, ad libitum folyadék és tápfelvételen. Az összehasonlító anatómiai és szövettani vizsgálatokhoz az egereket avertin anestézia alatt intracardiális perfúzióval (100 mL Ca, Mg-free PBS/20IU heparin/mL) véreztettük ki az in situ fixálás során. Etikai engedélyi szám NO:1799/003/2004. 3-B.1.2. Micro-angiográfia és kombinált festési eljárások. A csont és csontvelő parenchyma alapvető szerkezetének vizsgálatára kidolgoztunk egy új módszert, amely láthatóvá teszi három dimenzióban a véredény rendszert, a zsírsejteket és a megakaryocytákat. Az egereket avertine anestézia alatt perfundáltuk szíven keresztül Ca-, Mg-mentes phosphate pufferrel (100ml totál térfogat; 115cm magasság). A perfuziót 1%-os alginate-blue poliszacharid komplexszel folytattuk (Sigma, Low density alginate és Berlin kék komplex) amely rendkívül jól irrigál a szövetekbe és alacsony diffúziója révén, élénken színezi az egész érrendszert. A szerveket és

38

szöveteket kipreparáltuk és 4%-os paraformaldehydben fixáltuk 24 órán keresztül, majd mostuk Ca-tartalmú PBS-ben. A vizsgálandó csontokat, ebben az esetben a comb, az alsóállcsont, valamint a farokcsigolya csontokat, kipreparáltuk, majd hosszanti irányban felnyitottuk sztereomikroszkóp alatt. Az eljárást a zsírsejtek és acelluláris zsírcseppek festésével folytattuk előzetesen elkészített Oil-red oldatban (0.5g Oil-red-et oldva 100ml iso-propyl alkoholban, majd ezt 60%-ra hígítjuk desztillált vízzel és a reagenst szűrjük festés előtt). A megakaryocytákra specifikus acethyl-cholinészteráz szimultán kimutatását alkalmaztuk a teljes csontvelő parenchyma értékelésére. Ennek alkalmazása esetén a micro-angiográfia után közvetlenül, - paraformaldehyd fixálás nélkül folytattuk a reakciót. A felnyitott hosszú csontokat óvatosan a szubsztrát oldatba vittük, amelynek összetétele: 30 mg acethylcholine-jodide 45 ml 0.1M-os NaH2PO4.6H2O (pH 6.0), 3.0 ml 0.1 M Na-citráte (pH 6.0), 6.0 ml 30 mM CuSO4 és 6.0 ml 5 mM K3Fe(CN)6. A sötétbarna reakciótermék kb. 20 perc után értékelhető, és a megakaryocytákat mutatja. Ezután a mintákat fixáltuk PAF-ban, mostuk PBS-ben és vagy közvetlenül analizáltuk, vagy a zsírsejtek Oil-red-es festése után fotografáltuk 3-B.1.3.

Csont és porc szimultán festése. A lágyrészekből kifejtett, megtisztított

csontvázat fixáltuk (6% formaldehid), és dehidráltuk 50, 70 és 100%-os etanolban (5-5 óra), majd acetonban (3x1óra). Alizarin vörös/Alcian kék festést alkalmaztunk standard festék-oldat alkalmazásával (5 térfogatnyi 0,3% alcian blue 70% alkoholban, 5 térfogatnyi 0,1% alizarin red 96% etanolban, 5 térfogatnyi cc. ecetsav és 85 térfogatnyi 70% etanol) egy éjjelen 37°C-on. A csont alapszínének (background) eltávolítására többszöri cserélgetéssel az 1% KOH és 20% glycerin vizes közegében [84, 85]. A natív vagy festett csontváz-preparátumot foto-dokumentáltuk sötét-hátteres megvilágítással, Zeiss STEMI SV8 sztereomikroszkóp-CCD kamera (Sony) egységgel. A reprezentatív területeket digitálisan kezeltük (Photoshop) és tároltuk 3-B.1.4. Hisztologiai vizsgálatok. a.) A femur és a csigolyák sebészi kipreparálása. A lágyrészeket eltávolítottuk, a tisztított csontok fixálása egy éjjelen át történt szobahőn, acetic acidzinc formalin (AZF) fixálóban (1,25 g cink-klorid, 15 ml cc formaldehid, 0,75 ml jégecetsav és desztillált víz (dv.) 100 ml-re kiegészítve). Ezt követően 3x30 perc dv-es mosás után a mintákat dekalcináltuk, Gooding és Stewart ultragyors 4 órás módszerével (5% formaldehid és 10% hangyasav vizes oldata). A mintákat mostuk dv-ben 3x30

39

percet majd sucrose-gelatin impregnálás és isopentan-nal -80°C -ra fagyasztás után metszettük. A fagyasztás alatt készített 5-10 µm-es metszeteket poly-lysin-el bevont tárgylemezre vittük majd különböző festési eljárásokat végeztünk a sejtek identifikálására [84]. Az osteoblast kimutatására a magas alkalikusfoszfatáz tartalom, az osteoclast kimutatatására a tartarát rezisztens savifoszfatáz (TRAP) aktivitásokon alapuló standard detektációs kittet használtunk (Sigma, USA)..

13. Ábra: Csontvelő szövetek preparálása topológiai, citológiai és kvantitatív sejt vizsgálatokhoz b.) A csont és csontvelő szövettani vizsgálata. Egy kombinált fixálási eljárást alkalmaztunk melyet a Hammersmith Hospital-ban dolgoztak ki, humán csontvelő diagnosztikai analízisére [84]. A módszer lehetővé teszi a szöveti struktúra, a fehérjék antigén-jellegének és a nukleinsavak integritásának megőrzését. Az AZF fixative összetétele: 12.5 g zink chloride, 150 ml koncentrált formaldehyde, 7.5 ml jégecetsav 1000 ml-re kiegészítve desztillált vízzel. A mintákat 20-24 órán át, fixáltuk, majd

40

mostuk desztillált vízben (30 perc) miután a csontokat dekalcifikáltuk Gooding és Stewart szerint 10% hangyasavat tartalmazó 5 %-os formaldehydben 1-2 órán keresztül [86]. Mosás után a szöveteket vagy parafinba ágyaztuk, vagy sucrose-gelatinban impregnáltuk és izopentánban lefagyasztva - 80°C-on tároltuk metszésig. 5-15 µm-es metszeteket standard eljárás szerint készítettük és SuperFrost tárgylemezre vittük fel. Közvetlenül, vagy deparafinálás után festettünk a következő eljárásokkal: c). A metszetek rutin vizsgálata vagy háttérfestése. A metszeteket MayGrünwald Giemsa, vagy hematoxilin-eosinnal festettük Tartarát rezistens savas foszfatáz kimutatás

A

D Distalis femur

Gerinc vertebrák monoton festési patternt mutatnak C7- T13 -

Utolsó sacralis csigolya

Első csudális csigolya

Hiányos parenchyma jellemzi a caudalis Vertebrák csontvelő állományát

L6- S4 – C25

utolsó sacrális elso caudális vertebra

thor

sacr

caud

capill

C

B

Oil-red festés jelzi a zsírcseppek dominanciáját (vörös) és a véredényeket (alginát-kék) az apláziás caudális vertebrában

Natív vertebra preparátumok mutatják a vörös csontvelo eltéro jelenlétét

14. Ábra: A szkeleton-gerinc a farok vertebrák és más szivacsos csontszövet kompartmentek összehasonlító hisztológiája, natív vitrifikáló eljárás és szövettani festéssel. Az axiális vertebrák azonos csont (Alizarin-red) és porc-szövetet (Alcian-blue) de eltérő csontvelő szövetet tartalmaznak.(A) Natív készítményeken látható egy szegmentált különbség: a felső szegmensek csigolyáin vörös színben tűnik át, a jelentős mennyiségű csontvelő, míg a hemetopoietikus elemekben apláziás caudalis vertebrák halvány színűek (B). Oil-red festéssel a caudális csigolyákban nagymennyiségű zsírcsepp látható (vörös) és érhálózat (kék). Kis nagyításon enzimhisztológiával a farok csigolyákban TRAP pozitív osteoclastok láthatók

jelentős

számban,

szemben

a

szivacsos

parenchimájával (D).

41

femur

csontvelő-gazdag

hematopoietikus

A

B

15. Ábra: Giemsa-festett csontvelő preparátumok caudális vertebrából és femurból. A Caudális vertebra sejtszegény hiányos parenchyma állománnyal és tág szövetközti terekkel rendelkezik. (A). A femorális csontvelő bőséges és teljes hemato-lymphopoietikus sejtállománnya mozaikszerűen szorosan kitölti a csontvelőt. B). Mely egyértelművé teszi a makroszkóposan is látható eltéréseket.

d.) A Ca kimutatása. A von Kossa [87] eljárást alkalmaztuk. A fixált metszeteket vagy sejt-tenyészeteket 1%-os ezüst-nitrátban inkubáltuk UV-besugárzás alatt 45 percig, mostuk, majd a fölösleges reagenst 3%-os Na-thioszulfáttal kötöttük le és a preparátumokat desztilláltvízben öblítettük. A sötétbarna-feketés reakciótermék a Ca helyére precipitált ezüst. e.) Tartarát rezisztens, specifikus savas foszfatáz enzim kimutatása osteoclastokban. Az enzimreakciót savas foszfatáz Sigma-kittel végeztük leirás szerint (Sigma; protokoll # 387). 50 ml reakció térfogathoz 1ml 0.335 mol/l (pH4.9) Na-tartarát oldatot adtunk. f.) Lúgos foszfatáz enzim kimutatása osteoblastokban. A preparátumokat 0.2M TrisHCl (pH8.3) pufferben inkubáltuk 10-15 percig, majd a Vector Lab.Ltd lúgos foszfatáz kittjével folytattuk a reakciót. 20-30 perc után a kék reakciótermék mutatja a lúgos foszfatáz pozitív sejteket. 3-B.1.5. Sejt-tenyészetek a.) Hematopoietikus őssejtek (HSC) és progenitor sejtek kvantitatív meghatározása.

42

A HSC populáciot in vitro rendszerben mértük a vég-kihigítási-analizis (“limiting dilution analysis, LDA)”) elvén [88]. Röviden: a vizsgálatokhoz a következő összetételű tápoldatot használtuk: IMDM medium (GIBCO), 12.5v/v% SVF (HyClone), 12.5v/v% horse serum (Sigma), 0.5mM acid folic, 10 mM myo-inositol, 50 µM acid ascorbic, 10-4 M beta-mercaptoethanol, 10-6M hydrocortison hemisuccinát és penicillin/streptomycin antibiotikum keverék Sigma). Az MS-5 sejtekből trypszines passzálást követöen konfluens tenyészeteket készítettünk 96-üregű, lapos aljú tenyész-rendszerben (Falcon, 96-well microplate) majd a sejteket 2000 rad-al besugároztuk. A vizsgálandó sejtszuszpenzióból sorozat-hígítást készítettünk, általában 270-90-30 és 10x103 sejt per ml koncentrációban és minden hígításból 100 µl aliquotot pipettáztunk a már előre készített „feeder-layer” MS-5 sejtekre, 24 parallel mikroplate-helyre. A kultúrákat hetente analizáltuk fázis-kontraszt mikroszkóp alatt és értékeltük a “cobblestone area forming cell (CAFC)” –nek nevezett sejt klónokat mindegyik mikro-edényben. Ezután az elhasznált tápfolyadék felét frissel újítottuk fel, majd a tenyészeteket tovább inkubáltuk. A HSC frekvenciáját, az eredeti vizsgálandó szuszpenzióban, az eredmények fél-logaritmusos ábrázolása révén határoztuk meg. Ehhez ábrázoltuk az abcisszán a bevitt sejtszámot, és az ordinátán a negatív mikrotenyészetek %-át logaritmikusan. Az 1 HSC/ X bevitt sejt értéket ott kapjuk meg ahol a lineáris korrelációs görbe metszi a -37% értéket. Irodalmi adatok szerint a tenyészetek 14-ik napján nyert érték a myeloid “Colony Forming Unit”-nak felel meg (GM-CFU, MCFU, G-CFU és High Proliferative Capacity (HPC)-CFU), mig a tenyészetek 35-ik napján nyert érték a hematopoietikus őssejteknek számára utal [88, 89]. b.)

Hematopoietikus

őssejtek

analízise

és

izolálása.

Az

őssejteket

“Fluorescent Activating Cell Sorter”-el válogattuk és számoltuk. Összehasonlító vizsgálathoz a szivacsos csontban (farokcsigolya) és femurban lévő csontvelő szövetet három frakcióban nyertük ki micro-disszekció során (13.ábra). A szabadon szuszpendálható sejteket (buffy coat), a noduláris hematon [15. Blazsek I. 2000] frakciót és az endoszteumhoz szorosan szervült sejteket külön analizáltuk. Először enzimatikusan (0.1% Collagenase-I, II, III és 0.1 U hyaluronidase, 37°C, 60 perc) emésztve, egysejtű szuszpenzióvá disszociáltuk a szöveteket, az enzimeket mosással eltávolítottuk (2xPBS, 4°C) majd Bürker kamrában meghatároztuk a kinyert sejtszámot. A sejtfrakciókat 106 sejt/ml koncentrációban szuszpendáltuk Ca, Mg-mentes

43

PBS/2%FCS-ban,

majd

hozzáadtuk

a

Hoechst-33342

fluorokrómot

5µg/ml

koncentrációban és 90 percig 37°C-on inkubáltuk. Ezután a szuszpenziókat 4°C-ra hűtöttük, centrifugáltuk, a sejteket 800 µl térfogatban szuszpendáltuk és 4 aliquotra osztottuk. A 200µl-es szuszpenziókhoz

hozzáadtuk a fluorokrómmal jelzett

ellenanyagokat 1:50-es hígításban (FITC anti c-kit, PE ant-Sca-1; Becton-Dickinson) egyedül, vagy együttesen.- 30 percig inkubáltuk, majd a szuszpenziókat mostuk 4°C-on, és azonnal analizáltuk FACS-on (FacsStar Vantage Option Digital, Becton Dickinson) 3-B.2. Csontregeneráció, osseointegráció experimentális modell „OSSI.modell” Titán Implantátum osseointegráció vizsgálati módszere patkány farokcsigolyán Szabadalmi szám: P0800345 3-B.2.1. Kísérleti állatok. Kísérleteinket laboratóriumi rágcsálókon végeztük. A Charles River vonalú 250-370 g testsúlyú Crl(Wi)Br Wistar nöstény patkányokat a Semmelweis Egyetem NET központi, légkondicionált állatházában tartottuk, fordított fényciklusban ad libitum folyadék és tápfelvételen (LATI standard patkánytáp). A kísérleti anaestéziát intraperitoneális (ip.) injekcióban nátrium pentobarbitallal (Nembutal 40mg/tskg) végeztük. Az állatokat az artéria abominalis átvágásával véreztettük ki. A kísérletek rendelkeznek etikai engedélyi számmal: NO 46/1999. 3-B.2.2 Titán implantátum – adaptált mini dentálimplantátum Az osseointegráció fizikális mérésére szolgáló speciális mini-implantátumot a Full-tech Kft. állítja elő - mely 1,0 Ømm mag átmérőjű csavarmenetes homokfúvással kezeltfelületű Titán-stift, lapított fejének átmérője 2,5 mm, centrális 1,0 Ømm lukkal (21A.ábra). A csigolya centrális előfuratába nyomjuk, amelyet az első harmadán a csontszövet lazán rögzíti. A behelyezés mélységi standardját, a stift fején kialakított furat adja, mely minden esetben egy síkba kerül a porcfelszínnel (21B.ábra) 3-B.2.3. Új Műtéti technika. Titán implantátum, biológiai minták beültetésére. (22.ábra) A patkányfarok bőrét felületi vizes lemosással és 0,6% o-fenil-fenol, alkohol, tenzid tartalmú sebészi bőrdezinficiáló (Clarasept-derm-Uniclean Kft. Budapest) oldatos áztatással fertőtlenítettük (30 perc). A faroktőnél kettős ligatúrával felfüggesztettük a keringést a műtét idejére. Steril eszközökkel és környezetben a 4/5 farki csigolya ízesülésétől disztálisan 5-6 mm-re körbemetszettük a bőrt, majd az ízületnél disekáltuk a csigolyákat. A szabaddá váló csigolya disztális, porcszövettel borított ízfelszínét

44

centrálisan tengelyirányban egy 1,0 mm átmérőjű fúróval 8mm mélységig előfúrtuk. Ezt a lukat második fázisban 2,0 mm átmérőjű fúróval 5 mm mélységig tágítottuk, kialakítva egy 5 mm mély 2 mm Ø „művi csontosodási kazettát”. Ez az üreg (művi csontkazetta) a csontosodási folyamat (regeneráció) nyomon követésére ad lehetőséget, továbbá in situ behelyezhető a csontosodási folyamat 1)–biomechanikai ellenőrzésére implantátum, a csontosodási folyamat regulálására kiválasztott 2)–modifikáló kémiai anyag, vagy 3)-biológiai aktív minta pl.: szövetpreparátum, tumorsejt, őssejt. Az implantátum és/vagy vizsgálati preparátumok behelyezése után a farok bőrének atraumatikus suturájával zárjuk a sebet. A varrat után a bőrfelületet bőrfertőtlenítővel fújjuk be, és egy vékony fedőhártyával bevonva izoláljuk (Plastubol). Az állatokat ébredésig testhőmérsékleten tartjuk. A kísérleti periódus első két hetét az állatok egyedi ketrecekben töltik, fokozott higiénia biztosításával. A farok sebgyógyulása után a szocializációs igények helyreállítására visszahelyezzük állatainkat közös csoportjukba.

A

B

a:1mm

1 mm

3,5mm

h=3,5mm

2 mm

5mm b:2mm

L=7,0mm df=0,8mm d=1,2m m l=5,0mm

Df=2mm

21. Ábra: Az üregformáló eszközök: 1mm Ø fúró és 2 mm Ø fúró, mélység korlátozóval (A). A csigolya preparálás sematikus ábrája (B).

45

1.

2.

3.

4.

5.

6

7

8

9

22. Ábra : A műtéti technika lépései: 1-patkányfarok fertőtlenítés, 2-a farok keringésének lekötése, 3bőrmetszés steril körülmények között, 4-csigoly diszekció, 5-centrális furatok elkészítése 1- majd 2 mm Ø csigafúróval, 6-a vizsgálandó anyagok elhelyezése a csontkazettába, 7- a titánstif centrális behelyezése, 8- sutura és dezinfiziáló védelem felhelyezése, 9- első két hét egyedi hospitalizáció.

3-B.2.4. Mikro komputer tomográfia (microCT). a.) Rtg analízis, minták szkennelése. A módszer lehetőséget ad, hogy Implantátum-stiftek beültetését követő különböző időpontokban a csontállományban kialakított csontkazetta csontosodási stádiumát, a regenerálódás mineralizálódási folyamatát mikroCT-vel in situ nyomonkövessük. A teljes állatot befogadó mCT készülékek lehetőséget adnak önkontrollos csontregenerációs időgörbék felvételére. Jelenleg rendelkezésünkre álló berendezés csak kisebb preparátumok vizsgálatára alkalmas („Skyscan 1172”, X-RAY Microtomograph, Belgium). A készülékben 8 µm pontméreten mikrofókuszálható röntgen sugárforrás van melynek 17,7 µm felbontása van. A kép rekonstrukció con-beam algoritmus szerint történt. - Az rtg sugár homogenitásának javítására és „lágyítására” 0,5 mm vastagságú alumínium filtert alkalmaztunk.

46

- A fém implantátumokat tartalmazó patkányfarok szekcionált mintákat teljes fordulattal 360°-on, míg a stiftek kiszakítása után a fémmentes csontszövetet 180°-on szkenneltük, 0,7 fokonkénti lépés-intervallumokkal. A fémfelszín/csont határán generálódott zajt fizikai és szoftveres módszerrel elimináltuk. - A rekonstruált szeletekből 2D szövetszerkezeti képet állíthatunk elő, mérésekhez és vizuális bemutatáshoz. (23, 24. ábra)

A

B

23. Ábra: Az implantátum behelyezés után 3 héttel már helyenként látható az újonnan képződő csontlamella rendszer, de még jól kivehető a csontosodási kazetta határa, és igen intenzíven látható a körülötte lévő eredeti trabekuláris állomány, illetve a centrálisan elhelyezkedő implantátum A) horizontális metszet, B) medián saggitális metszet. A sárga körök reprezentálják a kazetta határait jelentő ROI-t (Region Of Interest)

b.) MikroCT rekonstrukció és 2D analízis. A minták adathalmazát rekonstrukciós programmal 2D és 3D struktúrává alakítottuk. Az elemzésnél kijelöltük a csontkazetta és az implantátum közötti csont-hengert. A mintákon behatároltuk a csontkazettának megfelelő külső és belső (az implantátum helyének széle) körvonalát, ez egy gyűrű alap, majd megadtuk ezen alaphoz tartozó vizsgálandó henger magasság értékét. Elemzéseinknél ezt 1,5 mm-ben határoztuk meg, amely 86 rtg szeletet foglal magában (ROIx1,5mm). Az így behatárolt egységes térfogatba (TV: 2,694 mm3) eső szövetet elemeztük a morfometriai szoftverrel. Az elemzéseket valamennyi minta esetén két külön csigolya azonos területén végeztük. Az alsó preparált csigolya (C5) elemzésével információt kapunk az újonnan regenerálódó csontszövet paramétereiről ezeket „Új csont” adatok néven kezeljük (New Bone).

47

A

C

B

24.Ábra: Patkányfarok vertebra 3D-s rekonstruált képe, egy – tetszőlegesen – adott síkban történt metszéssel (A). Titán implantátum stift kihúzása után keresztmetszeten (B), illetve hosszmetszeten (C) láthatjuk a csigolya finomszerkezetét. Jól látható a csigolya kompat csontállománya és a centrális stift helye közötti trabekuláris állomány a 10. hetes regenerációban.

Az alsó preparált csigolya feletti csigolyán (C4) az alsóval megegyezően kijelölt (ROIx1,5mm) térfogatnak csontszövet morfometriai értékeit, mint belső-referencia kontroll (Reference Bone) adatokat kezeltük (33. Ábra). Az így elvégzett mérések kísérleti rendszerünkben két csoportot jelentenek: „A”=Referencia csont kontroll, „B” =Referencia csont. Ezen alakzatok csont-stuktúráját vetettük szoftveres analízis alá, melynek eredményeit az 3-4. táblázatban foglaltuk össze. Az adatokkal standard statisztikai elemzéseket végeztünk. Megjegyzés: A konkrét elemzéseket és adatokat a biszfoszfonát kezelést leíró fejezetben mutatjuk be. 3-B.2.5.

Biomechanikai vizsgálat –kimozdulási maximum erő mérése. A

csontosodási regenerációs folyamat különböző stádiumaiban altatott állatokon a bőr feltárása után a Ti-stiftek kiszakítási maximum erejének (Newton) mérésével (Tenzi gyártmányú TE 18.1 típusú speciális készülékkel (elektronikus nyúlásbélyeggel működő

48

max-erőmérő) meghatározzuk a osseointegrációra jellemző rögzülési erő adatokat, melyek iránya a dentális implantátumok terhelésével megegyezik (25.ábra) A mérés menete: 1. A csavar disztális végén lévő lyukon átfűzött acél szállal csatlakozunk egy külön erre a célra kifejlesztett digitális végpont-erőmérő műszerre. 2.

A csigolya test rögzítése és a műszer 0 –értékre állítása után csavarmenet előtolással, egyenletes húzóerő fokozással a csavart kimozdítjuk.

A műszeren kijelzett maximum érték a rögzülési erővel azonos Newton (N) értéket adja. 3-B.2.6.

Szövettani mikrostruktúra vizsgálat. Metszet készítés: fixálás: formalin

(10%); dekalcinálás: TBD-2 (formic acid, sodium citrat) 2 hét alatt; víztelenítés felszálló alkoholsoron; paraffin beágyazás; metszés: Reichert-Jung microtom; felvitel: superfrost lemezre; festés: Hematoxilin-Eozin, illetve a

Hisztologiai

vizsgálatok” fejezetben leírt eljárásokat alkalmaztuk A szövettani feldolgozás során, vizsgáljuk a kontroll és a bioregulátor anyagok hatására képződött csont morfológiáját, az implantátumok kiszakítása után, Nikon fénymikroszkóppal, Sony digitális fotoadaptor archiválással. Csoportonként 3-3 állat mintáit dolgoztunk fel (26.ábra).

Maximum erőmérő extrakciós egység Extrakciós rés és befogó egység Szekcionált patkányfarokcsigolyák

25. Ábra: Maximum-erőmérő készülék, speciális fejlesztés, a mini-implantátumok kimozdítási erejének mérésére (TENZI Kft. Hungary)

49

C

C B 2 mm

D 1 mm

E

A F 26.Ábra: Szövettani metszet kisnagyítású képe 3 és 6 hetes regenerálódási fázisban (HE festés), a Titán stift kihúzása után. A fekete pontsor az üreg határain halad. A centrális üreg „proximális” része (A) a stift körüli rögzítő centrális furat, a (B) üreg a csontosodási kazetta. Az újonnan képződött csont („New Bone”) a piros és fekete pontsor között látható (C), mely az implantátum kimozdítás és a metszet készítése közben kimozdult. Nagyobb nagyításban látható az új csont (D), a mesenchimalis kötőszöveti térhálózat kialakulása (E) és a széli területeken az eredeti csont

3-B.2.7.

Vizsgálati

protokoll:

szakaszainak vizsgálatára. A

az

újonnan

csontátépülés,

képződő

csontszövet

remodelling,

fejlődési

regeneráció

igen

hosszadalmas folyamat. Csonttörésnél 6-8 hét [140] a csont teljes átépülése 18 hetet vesz igénybe. Implantátum integráció, teljes mineralizációval 18-54 hét [141]. Mégis számos experimentális vizsgálat, néhány hetes (2- 4 hetes) periódust vizsgál, és alkot véleményt. Ezért fontosnak tartjuk, hogy a kísérleti rendszerünk alapadatait a fiziológiás csontregeneráció széles intervallumában meghatározzuk. A vizsgálati mérőpontokat a regeneráció 1-, 2-, 3-, 6-, 12-, 18-hetes időpontjára terveztük. A módszereknél ismertetett műtéttechnikai eljárással behelyeztük az implantátumokat majd ezután az állatok, a farokbőr teljes gyógyulásáig (14 nap) dezinficiált egyedi ketrecekbe kerültek. A fokozott szocializáltságot igénylő kísérleti patkányainkat ezt követően visszahelyeztük a közös ketreceikbe, a csoportoknak megfelelően. Innen a vizsgálati nap előtt átszállítottuk a kísérleti laboratóriumba, ahol nembutal narkózis alatt, elvéreztetés után végeztük el a méréseket, dolgoztuk fel a szekcionált csigolyákat.

50

A 27. ábrán szemléltetjük a szöveti reakciók makroszkópos képét, a farokbőr leválasztó feltárás után.

27. Ábra: A 18 hetes regeneráció után látható a tökéletesen lobmentes kötőszöveti burok és az alatta áttünő csontosodási kazetta „pereme”. Az implantátum feje körül jól látható körkörös rosthálózat.

A célkitúzések ide vonatkozó kérdéseinek vizsgálatára az előzőekben ismertetett új in vivo művi csontkazettás experimentális implantációs modellünket alkalmaztuk, mely a szisztémás kezeléseket is lehetővé tesz az osseointegrációs folyamat befolyásolására. Vizsgálataink magába foglalják (1) érdesített felszínű titán-csavar implantációját [137] patkány farokcsigolyába, (2) meghatározott idejű szisztémás gyógyszeres kezelést, (3) az implantátum rögzülésének kvantitatív biomechanikai mérését, úgymint a fixáció/kimozdítás erő (Newton=N) meghatározását, (4) az implantátum

körüli

művi

csontüreg-kazettában

az

újcsontképződés

mikromorfológiájának elemzését mikro-ComputerTomograph alkalmazásával. 3-B.3. Szisztémás, krónikus biszfoszfonát kezelés hatása a csontregenerációra és implantátum osseointegrációra [203] 3-B.3.1. Kísérleti állatok. Ebben a kísérletben a korábbiakban leírt osseointegrációs experimentális implantációs modellünket alkalmaztuk. 20 db 260-330 g testsúlyú Crl(Wi)Br Wistar nöstény patkányt implantáltunk. 10 állat 1ml fiziológiás sóoldatot a másik 10 állat 0,06 mg/100gts intraperitoneális.Zometa kezelést kapott, patkányra adaptált protokoll szerint. Az állatok a Semmelweis Egyetem NET központi, légkondícionált állatházában tartottuk, fordított fényciklusban ad libitum folyadék és

51

tápfelvételen (LATI standard patkánytáp). A kísérleti anestéziát intraperitoneális (ip.) injekcióban sodium pentobarbitallal (Nembutal 40 mg/tskg) végeztük. 3-B.3.2. Kezelési protokoll. Krónikus kezelés amino-biszfoszfonáttal: Zometával (zolendronic acid, zolendronate - Zometa®, Novartis, Basel, Switzerland). A Zometa® dózisát, a gyógyszerhez mellékelt gyári ismertető alapján állítottuk be, valamint figyelembe vettük az ide vonatkozó humán irodalmat is [171]. A patkányra megadott, nagyobb, mint 1 mg/kg letális single-dózis alapján döntöttük el az alkalmazott kezelést, ennek 60%-ában vagyis 0,6 mg/kg/alkalom dózisban alkalmaztuk, fiziológiás oldatban hígítva. A humán intravénás beadási protokollt, a patkányoknál általában alkalmazott intraperitoneális injektálásra váltottuk. A hígítást úgy állítottuk be, hogy az állatok legalább 0,5-1 ml oldatban kapják a dózist. Ehhez 1 mg/ml-es stockoldatot készítettünk és fiziológiás sóoldattal higítottunk munkaoldatot, amelynek 250 µl-e tartalmazta a 0,06 mg/100 gts dózist. A kontrollok 1 ml fiziológiás sóoldatot kaptak. A 10 db kontroll és 10 db Zometával kezelt állatok kezelése 2-hetes periódusokban történt 3 alkalommal, úgy hogy az első kezelést a műtét napján adtuk (kezelés a 0. 14. és 28. napon). Az implantátum beültetés után a kezelés 6. hetén dolgoztuk fel az állatokat. A korábbiakban anyag és módszereinkben részletesen leírt protokollokat végeztük el a kísérleti csoportokban : 3-B.3.3. Mikro komputer tomográfia - mikroCT Rekonstrukció 2D és 3D analízis a.) Minta előkészítés. A hathetes kísérleti periódus végén az állatok farokcsonkját (C2-5) pentobarbitál narkózisban szekcionáltuk. b.) Minta szkennelés és rekonstrukció. Az elemzéseket valamennyi minta esetén két egymást követő külön csigolya azonos területén végeztük. Az alsó preparált csigolya (C5) disztális végének elemzésével információt kapunk az újonnan regenerálódó csontszövet paramétereiről ezeket „Új csont” (New Bone) adatok név alatt tárgyaljuk. Az alsó preparált csigolya feletti csigolya (C4) disztális részén az alsóval teljesen megegyezően kijelölt térfogatnak csontszöveti morfometriai értékeit, mint belső-„referencia kontroll” (Reference Bone) adatokat kezeltük (33A-B ábra). Az így elvégzett mérések e konkrét kísérleti rendszerünkben négy csoportot jelentenek: „A”=Referencia csont

kontroll, „B” =Referencia csont Zometa kezelt

mintákat,

valamint „C” =Új csont kontroll és „D” =Új csont Zometa kezelt mintákat. Ezen területek csont-stuktúráját vetettük szoftveres analízis alá.

52

C3-as vertebra referencia csont

A,B

(önkontroll) A) placebo kezelt vagy B) Zometa kezelt

C4-es vertebra „Új csont

C,D

a csontosodási kazettából Implantátum kihúzás utáni vizsgálatban C) placebo kezelt vagy D) Zometa kezelt

A 33. Ábra 3D –értelmezője. Az A-B és C-D csontstruktúrákra illesztjük a gyűrű alapú ROIx1,5 mm vizsgálati egység-térfogatot. Patkány farok vertebra C3-4.

Patkány farok vertebra C3-4.

B

A 2 mm 1,5 mm 1,2 mm

C

Referencia Bone Minta

Az kihúzott implantátum helyének szimulátuma

2 mm

D

New Bone Minta

ROI x 1,5 mm Vizsgált összvolumen (TV)

1,5 mm 1,2 mm Placebo kezelt Kontroll

Az kihúzott implantátum helye

Zometa kezelt

33. Ábra: A csigolyák microCT morfometriai elemzésének sematikus ábrája. A referencia csont viszonylata C3-as csigolyán: A)- Referencia kontroll placébó kezelt és B)- Referencia kontroll Zometa kezelt minták. A Titán stifttel implantált C4-es csigolyán: C) Placébó kezelt új csontszövet az

53

implantátum körüli üregben és D) Zometával kezel új csontszövet az implantátum körüli üregben. Az elemzett standard térfogat-egység mérete (TV=2,694 mm3 ) a csontosodási üreg határait magába foglalt harántmetszeten manuálisan kijelölt alapterület (ROI =Region Of Interest) x 1,5mm magasságú henger, mely üreg szabad hely az újonnan képződő csontszövet számára (vastag fekete téglalappal jelölve szemléltetjük). A centrális fehér zóna az implantátumnak megfelelő terület. A C-D mintákon tényszerűen az implantátum vagy a kihúzás után a helye, illetve az A-B mintákon szimulálva, a mérési térfogaton kívüli terület

3-B.3.4. Az implantátumok biomechanikai rögzülési értékeinek meghatározása. A stiftek rögzülését a kimozdulási maximum erő mérésével határoztuk meg a mCT –es szkennelést követően, a vizsgálati protokoll szerinti feltárásból – külön gondot fordítva az implantátum feji végének kibontására. A mérő eszköz acél-szálának befűzése egyik esetben sem okozott gondot, a nagyrészt kötőszövetes benövéseket szike, olló és injekciós

tű

segítségével

távolítottuk

el

(34.ábra).

A

stiftek

rögzülését

a

kimozdításukhoz szükséges maximális erő meghatározásával kvantitatív mértük. A mérési protokollt a módszereknél adjuk meg. A készülék a 25. ábrán látható. 3-B.3.5. Hisztológiai vizsgálat. A patkány csigolyákat 6% formalinban fixáltuk 2 napon át +4°C-on, majd dekalcináltuk 18% Na-EDTA (pH7,4) oldatban 56°C-on egy héten át. A paraffinba ágyazott mintákat metszettük. A deparaffinált metszeteket rutin haematoxilin-eosin festékkel perjódsavas-Schiff (PAS), illetve ezüst-nitrát reagenssel festettük. Leica DMLB1005 fénymikroszkóp-CCD JVC kamera egységen a reprezentatív területeket fotóztuk és digitalizálva archiváltuk. 3-B.3.6. Statisztikai értékelés és ábrázolás. Kísérleteinkben a jellemző változásokat a vizsgált paraméterek számadatainak átlagértékeivel és ± szórás értékeivel jellemeztük (S.D.). Az adatok elemzésénél, a vizsgálat jellegéhez viszonyított nagy csoport elemszám (n=10-10) biztosította a szükséges Gauss eloszlást. A morfometriai analízisnél kettős (belső-külső) kontrollt alkalmaztunk. A csoportok közötti szignifikancia analízist ANOVA (Student-t) teszttel számítottuk. A számításokhoz InStat programcsomagot használtunk (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA.). Az adatok alapján Microsoft Office Exel 2003 grafikai programmal készítettük a grafikus ábrákat. A digitális képeket Photoshop programmal jelenítettük meg

54

4) EREDMÉNYEK 4-A.1. Az EGF kompenzációs termelésének vizsgálata a szubmandibuláris és szublinguális nyálmirigyek ablációját követően (részleges abláció) [55] Adaptációs változások vizsgálata a nyál EGF szekréciójában és tárolásában. Ezekben a kísérletekben vizsgáltuk a teljes nyál és a nyálmirigyek EGF, fehérje szintjét patkányban, kétoldali submandibularis és sublimgualis mirigy ablációban, citromsav gisztatórikus ingerlésnél és a két eljárás kombinációjánál, a kontroll állapottól való eltérését. A nyálmirigy funkcionális stimulálásához ip. pilocarpin-t alkalmaztunk. A pilocarpin kettős hatással rendelkezik: elsődleges cholinerg és másodlagosan szimpatikus aktivitása révén optimális a nyálszekréció kiváltásához [56]. 1.Táblázat: Kísérleti állatok testsúlya a kezdeti napon (0 day) és 7 nap abláció (AB), 0,5%-os citromsavas ivóvíz itatás (Cit.) és a kettő együttes kezelés (AB+Cit.) után illetve a Kontrolll csoportnál. Átlagértékek ± S.E.M., * p<0.05, ** p<0,01, NS p>0,05

Kontroll

Abláció

0. nap

7. nap

(g)

271.8

SEM±

9.2

Citrom-sav

AB + Cit

0. nap

7. nap

0. nap

7. nap

0. nap

7. nap

277.8

261.8

268.0

272.0

280.0

272.7

270.8

9.9

10.7

9.9

4.7

5.9

10.8

15.5

testsúly:

P

NS

NS

NS

NS

A kondíciók egyhetes fennállása az állatok testtömegében nem okozott eltérést. (1. táblázat). A parotis mirigysúlyok az AB-csoportban 10%-al, a Cit.-csoportban 30%-al míg a kombinált csoportban 90%-al növekedtek. A submandibuláris mirigysúly egy hét citromsavas ivóvízitatásra nem változott (2. táblázat). A gl. Submandibularisban a fehérje koncentráció az egyhetes citromsavas itatásra nem mutatott változást (3a Ábra).

55

2.Táblázat: A gl. Submandibuláris és gl. Parotis mirigyek súlya a kísérleti csoportokban éhező és 2,5 mg/kg ip. Pilocarpine injekció adás után 15 percig történő szekréciós fázis után Átlagértékek ± S.E.M., * p<0.05; ** p<0,01; NS p> 0,05

0. nap Stim

Kontroll

Abláció

Citrom sav

AB + Cit

(7. nap)

(7. nap)

(7. nap)

(7. nap)

Éhező

Éhező Stimulált

Éhező Stimulált

Éhező Stimulált

Stimulált

Gl. Submandibuláris

mirigy súly

371.3

SEM±

11.8

407.3 383.3 31.5

10.1

-

-

-

-

402.0 384.7 11.2

p

17.4

-

-

-

-

NS

Gl. Parotis

mirigy súly

-

325.7

305.0

SEM±

-

16.2

7.4

p

384.0 332.0

viszonyítási

410.7 374.3

658.3 518.3

16.6

58.6

37.2

7.2

63.6

70.5

*

NS

**

**

**

**

értékek

A fehérje tartalom változásai a gl. Parotisban különböző trend jellegűek de nem szignifikáns különbségek: éhező állapotban az AB csoportban 25% csökkenést, a Cit. csoportban 12%-os emelkedést kaptunk, a kombinált (AB+Cit) csoportban 20%-os csökkenést mértünk (3b. ábra).

56

3a

gl. Subm. szöveti fehérje nyugalomban gl. Subm. szöveti fehérje 15'-stimuláció után

NS

NS

fehérje m g / g m irigyszövet

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0. nap

Kontroll 7.nap

Citromsav 7.nap

gl. Parot. Szöveti fehérje nyugalomban

3b

NS 12%<

gl. Parot. szöveti fehérje 15'-stimuláció után

NS 25%> NS

fe h é rje m g / g m irig yszö ve t

160

NS

NS 20%>

140 120 100 80 60 40 20 0

kontroll

AB

Citromsav

AB+Cit.

3a-b.Ábra: A nyálmirigyek szöveti fehérjetartalma a kísérlet kezdetén és 7 nap 0,5%-os citromsavas ivóvíz kezelés után a) a gl. Submandibularisban, és b) a részleges AB után a gl. Parotisban. Éhezés (üres oszlop) illetve 2,5 mg/kg ip. Pilocarpine injekció után (tele oszlop). Átlagértékek ± S.E.M., NS (nem szignifikáns)

A gl. Parotis szöveti EGF koncentrációja mind a három kezelt csoportban 90-95%-ra csökkent a kontrollhoz képest és az abláció melletti gusztatórikus stimulus a szövetből további ürítést indukált (4b Ábra). Viszont nem csökkent, sőt ellentettje 40%-os EGF fokozódás volt mérhető a Submandibularis mirigyben 7 nap gusztatórikus inger nyomán (4a. Ábra). Mind a parotis, mind a submandibularis mirigyekben pilocarpin szekréciós stimulálás után csökent a EGF koncentráció (4a-b. Ábra).

57

4a

gl. Subm. szöveti EGF nyugalomban gl. Subm. szöveti EGF 15'-stimuláció után 900

*

E G F u g / g m irig y s z ö v e t

800

NS

NS

700 600 500 400 300 200 100 0

0. nap

Kontroll 7.nap

4b

Citromsav 7.nap

gl. Parot. szöveti EGF nyugalomban 5000

*

gl. Parot. szöveti EGF 15'-stimuláció után

4500

E G F n g / g m irig y s z ö v e t

4000 3500

*

3000

NS

2500

*

2000 1500 1000 500 0

kontroll

AB

Citromsav

AB+Cit.

4a-b. Ábra: A nyálmirigyek szöveti EGF tartalma a kísérlet kezdetén a részleges AB és citromsav kezelés után a 7. napon, a) gl. submandibularisban illetve b) a gl. Parotis szövetben 7 nap 0,5%-os citromsavas ivóvíz itatás (Cit.) abláció (AB), és a kettő együttes kezelés (AB+Cit.) után és a kontroll értékek (Kont.). Éhezés utáni állapotban (üres oszlopok) és 2,5 mg/kg ip. pilokarpin stimulációt követő 15’ szekréció után a szövetben maradó EGF-tartalom (sötét oszlop). Átlagértékek ± S.E.M., ** p<0.01

58

Nagymértékű fehérje koncentráció emelkedést mértünk a pilocarpin stimulusra szekretált nyálmintákban mindhárom kezelt csoportban. AB esetén: +240%, Cit. itatásnál: +80%, AB+Cit kombinációban: +350%. Ezzel párhuzamosan a nyál fehérjetartalom változásai a kontroll csoportban nem haladták meg a ±10%-ot (5a. ábra). A nyálminták EGF koncentrációja az AB csoportban 10%-al csökkent, szemben a másik két csoport mintáinak szignifikáns emelkedésével (5b. Ábra). A nyál fehérjéhez viszonyított EGF tartalma (EGF/protein hányados) valamennyi kezelési csoportnál a 7 napos periódus után csökkent: AB -80%, Cit. -40%, AB+Cit. -40% (5c. Ábra).

5a

Nyál fehérje 0. nap Nyál fehérje 7. nap

NS

** fe h é rje m g / m l k e v e rtn y á l

*

**

4,5

*

4 3,5

**

3 2,5 2

NS

1,5 1 0,5 0

kontroll

AB

Citromsav

5b

AB+Cit.

Nyál EGF a 0. nap Nyál EGF a 7. nap

NS 40 35

NS

NS

NS

* *

AB

Citromsav

AB+Cit.

EGF ng / ml nyál

30 25 20 15 10 5 0

kontroll

59

5c

Nyál EGF/ feh. arány 0. nap Nyál EGF / feh. arány 7. nap

nyál EGF ng / mg protein

25

NS

**

20

**

NS

15

10

5

0

kontroll

AB

Citromsav

AB+Cit.

5a-c. Ábra: Fehérje (5a) és EGF (5b) koncentráció és az EGF / Fehérje hányados (5c) a 2,5 mg/kg ip. Pilocarpine injekció után a 15 percig gyűjtött kevert nyálban a kezdeti napon (sárga oszlop) és a kísérleti csoportokban (barna oszlop) 7 nap abláció (AB), 0,5%-os citromsavas ivóvíz itatás (Cit.) és a kettő együttes kezelés (AB+Cit.) után illetve a kontroll csoport mintáiban (Cont.). Átlagértékek ± S.E.M., * p<0.05, ** p<0,001

4-A.2. Az EGF-el szabályozott orális epithelsejt-regeneráció lehetősége a nagynyálmirigyek teljes ablációjában ( kisnyálmirigy experimentális modell) [7] 4-A.2.1. Akut vizsgálatok a.) Kimosási értékek – alapszekréció. A nagynyálmirigyek eltávolítása után a poszttraumás 45 perces nyugalmi periódus után indítottuk a mintavételt (nyálgyűjtést), a szájüreg frakcionált öblögetését. A kimosási értékek az 5-6. frakcióban stabilizálódnak. Protein koncentrációban a kiindulási 400-500 µg/ml ötödére 100 µg/ml-re , amiláz esetén 30-40ezer U/L századára 3oo-5oo U/L értékre esik le. A 1oo perc időtartam alatti kiválasztásnál összesen ez kb.3oo µg-nyi proteint jelent, mely szummálva kb. 5o U egység amiláz össz-enzimaktivitással rendelkezik. (6b-c.ábra) b.) Szekréció stimulálás és gátlás. Első lépésben intakt állatok és a teljes abláción átesett állatok szájüregi mosófolyadékát elemeztük, a totál ablációs nyálvizsgálatnak megfelelő protokoll szerint, pilocarpin stimulációra adott szekréció 100 perces intervallumra eső mintái alapján. Az adatok a 6a ábrán láthatók. Összevetve intakt kontroll állatok 100-perces

szekréciós értékeivel (100%) a stimulált fehérje

tartalom kb.14%-át míg az amiláz érték csupán kb.1-2%-át teszik ki az abláció után.

60

fehérje µg / 100 perces szekréció & amiláz U / 100 perces szekréció

10000

7673 ±

intact control acute ablation

intakt kontroll állat

8000

akut teljes abláció

6000 kb. 14%

4000

2117 ± 938 1096 ± 51

2000

kb. 1-2% 25,8 ± 5,3

n=4

0 protein output(µg)

amylase output(U)

Fehérje tartalom

6a

Amiláz tartalom

600

acute cleaning akut kimosási görbe

fehérje µg/ml

500

akut pilo. acute pilo.stimulálás stimulation acute propranolol pilo. β-blokk + pilo.&stimulálás akut

400

100 perc szekréciós fázis

300

propranolol β-blokkoló pilocarpin

200

100

0 1

3

5

7

9

11

6b

13

15

17

19

21

23

25

27

29

5'-es frakciók

Am iláz (U /L)

60000 50000

acute clearing akut kimosási görbe acute akut pilo.stimulation pilo. stimulálás

40000

propranolol pilo.stimulálás β-blokk + & pilo.

30000

100perc szekréciós fázis

propranolol β-blokkolás pilocarpin stimulálás

20000 10000 0 1

6c

3

5

7

9

11

13

15

17

5'-es frakciók

61

19

21

23

25

27

29

F e h é r je ( µ g / 1 0 0 p e r c k iv á la s z t á s )

1400

35

fehérje * A m ilá z ( U / 1 0 0 p e r c e s k iv á la s z t á s )

1200 1000 800 600 400 200

6d

n=3

0

kimosási acut cleaning alapérték

n=3 Pilocarpin acut pilo. stimulation stimuláció

n=3

amiláz *

30

25

20

15

10

5 n=3

0

β-blokkolás propranolol & pilo. + Pilo. stimulálás

n=3

acute cleaning kimosási

acute pilo.stimulation Pilocarpin

alapérték

stimuláció

n=3 propranolol & pilo. β-blokkolás + Pilo. stimulálás

6a-d. Ábra: Az intakt kontroll állatok és a teljes nagynyálmirigy ablációt követő szájüregi fehérje és amiláz tartalom összehasonlítása a 100 perces szekréciós fázisban (6a). A szájüregi mosófolyadékfrakciókban mérhető fehérje (6b), amiláz (6c) koncentrációk, nyugalmi állapotban és pilocarpin ingerlést alkalmazva önmagában valamint β-blokkoló adását követően, 45’ poszttraumás nyugalmi intervallum után akutan a nagy-nyálmirigyek eltávolítása napján. A 6d ábra a 100perces összesített szekréciós fázisok értékeit mutatja be.

- A sorban egymást követő első 10 frakció (50 perc) a „rest” vagyis maradék nyálfilm kimosási intervallum - ez után 10 mg/kg pilocarpin-HCl stimulációra adott 1oo-perces intervalumban a szekretált nyál frakciói (20db) döntően a kisnyálmirigyek szekrétumát tartalmazzák. Ez esetben – stimuláció utáni 100 percben - az összes protein tartalom, az alapérték mintegy 3-szorosára 1000 µg-ra, az amiláz tartalom 10-szeresére 500 U-re fokozódik. (6b-c ábra) -Az állatok egy csoportjában az 5. frakció végén a 25. percben – vagyis a stimulálás előtt 25-perccel - adott ß1+ß2-receptor gátló propranolol előkezelés a 10. frakciót követő pilocarpin stimulusra adott szekréciós választ mintegy felére csökkentette. Protein esetén szignifikánsan az adott 100-perc alatt a kb. 1000 µg kimosható mennyiség 500 µg-ra, míg a kb. 500 U amiláz enzim mennyiség p<0,05 szignifikanciával 235 U-re csökkent. (6b-c. ábra)

62

4-A.2.2. Krónikus vizsgálatok a.) Testsúly, táp- és vízfogyasztás- A nagy-nyálmirigyek hiányában az állatok táplálkozása és vízivási gyakorlata megváltozik. A táplálkozás közbeni itatóhoz járás, vagyis a vízivási gyakoriság intenzívvé válik Krónikus kísérletünk esetén a nagynyálmirigy irtott állatok testsúlyegységre jutó vízfogyasztása az első két hétben 70%-al, majd a harmadik héten 53%-al volt magasabb a kontrolloknál (7c.ábra). A tápanyagfogyasztás testsúlyra számított értéke az első héten 10%-al, a másodikon 18%al, a harmadikon 44%-al haladta meg a kontroll mennyiséget (7b.ábra). Az elhullott tápanyag mennyisége fokozódott. A testsúlygyarapodás a nagyobb tápfogyasztás ellenére az első héten 6%-al, a másodikon 13%-al, a harmadikon 16%-al marad el a kontrollok értékeitől, mely nem jelent szignifikáns csökkenést (7a.ábra). A túlélési lehetőség vizsgálatára prolongált két állatunknál három hónap elteltével sem maradt el a testsúly lényeges mértékben a fajra jellemző értékektől.

NS

350

NS

300 te s ts ú ly ( g )

NS

abláció

250 200 150 100 50 0 0. nap

7a

7. nap chr

14. nap chr kísérleti napok

63

kontroll

21. nap chr

NS

g tá p /h é t/1 0 0 g ts

100

kontroll

NS NS NS

80

abláció

60 40 20 0 7. nap chr

7b

h e ti v iz fo g y s z tá s ( m l/1 0 0 g ts )

160 140

14. nap chr 21. nap chr kísérleti napok kontroll

NS

**

NS

**

abláció **

120 100 80 60 40 20 0 7. nap chr

7c

14. nap chr

21. nap chr

kísérleti napok

7a-c. Ábra: A kísérleti állatok testsúlya (a), valamint testsúly egységre számítva a heti táp (b)- és vízfogyasztása (c), a nagy-nyálmirigyek teljes ablációját követő három héten

b.) A szájüregi nyálkahártya felület nyugalmi kimosási értékei. A 7. és a 14. napos krónikus kísérleteknél az első pár frakcióban megjelenő produktumok (protein, amiláz) kimosási értékei alacsonyabb koncentráció szintről indulnak és már az első 3-4.

64

frakcióval kimosódnak és a bazál szinten stabilizálódnak. A protein kimosás a feléről 200-250 µg/ml-ről, az amiláz esetén a huszadáról 1300-2000 U/L -ről indul. - Az ablációt követően három hónappal az állatoknál a protein kimosás az akut érték szintjéről indul de még a 10. frakciónál sem csökken a 100 µg/ml bazális koncentráció érték alá. (8a. ábra) A tartós (3 hónap) fokozott funkció növeli a nyálka film amiláz tartalmát is. Az első 10 frakció értéke 5-6 szorosra a 7, ill. 14 napos értéknek, bár ez még mindig alatta marad az akut műtét utáni kimosás 1-10. frakció értékeinek. A teljes 100 perces periódusban stimulálás nélkül az amiláz aktivitás, a protein tartalomhoz hasonlóan, az 1 és 2 hetes csoporthoz viszonyítva végig magasabb bazális szinten stabilizálódik (8b. ábra). c.) A szájnyálkahártya felület kimosási értékei stimulációt követően Stimulálásra adott 100 perces összesített szekréció. -

Pilocarpin

stimuláció

hatására

1oo-perces

intervallumban

kiürített

fehérje

mennyiségek a 7 és 14 napos csoportban az akut kontroll értékek alatt maradnak (8oo9oo µg). A 100-perces amiláz szekréció sem éri el a kontroll szintet a 7 és 14 napos csoportban.. - Három hónappal a mirigyeltávolítást követően viszont az állatok fehérje és amiláz termelésében mérhető javulást mértünk (8a-c ábra).

600

akut kimosás 7nap-chr 14nap-chr 90nap-chr akut pilo.stimuláció

fehérje µg/ml

500

pilocarpin

400 300

100perc szekréciós fázis

200 100 0 1

8a

3

5

7

9

11

13

15

17

5'-es frakciók

65

19

21

23

25

27

29

50000 amiláz U/L

45000

akut kimosás akut pilo.stimuláció 7nap-chr 14nap-chr 90nap-chr

40000 35000 30000

100perc szekréciós fázis

25000

pilocarpin

20000 15000 10000 5000 0 5'

8b

25'

45'

65'

85'*

105'

125'

145'

5'-es szekréciós intervallumok

Fehérje µg / 100 perc szekréció

^

Amiláz U / 100 perc szekréció

1400

73,4

60 NS

1200

^*

NS

50

1313

1000

40

800

30

600

^*

680

400

^

20

30,9

10

200 n= 3

n= 3

n= 4

n= 4

n= 2

0

8c akut kimosás

akut pilo.inger

7nap-chr

14nap-chr

n= 3

0 akut kimosás

90nap-chr

n= 3

akut pilo.stimuláció

n= 4

7nap-chr

n4

14nap-chr

n= 2

90nap-chr

8a-c. Ábra: A főként kisnyálmirigyek szekréciós tulajdonságait szemléltetik a fehérje (8a) és amiláz (8b) szekréciós folyamat görbék, a nagynyálmirigyek teljes ablációját követő különböző időpontokban. A fehérje és amiláz tartalom nyugalmi szekréciót jelentő stimuláció mentes kimosás, valamint a stimulált szekréciós fázis értékeinek statisztikai-átlag viszonyait a 8c ábra foglalja össze a100 perces szekréciós fázisok értékeit ábrázolva

-

A frakciók EGF elemzéséhez szükséges nagyobb volument úgy tudtuk

biztosítani, hogy az egymást követő 3-3 frakciót összesítettük, vagyis „átlagoltuk” értékeiket. Az így összeállt 10 szummált frakció EGF tartalmát határoztuk meg. Az abláció utáni akut kísérletben a frakciósorozat első mintáinak csökkenő tendenciáját látjuk, mely a nyálkahártyán lévő residuális kevert nyál kimosását jelenti. A pilocarpine stimulálást követően az összevont-frakciók EGF tartalma fokozódó-csökkenő csúcsgörbét írnak le, hasonló módon, mint a fehérje és amiláz mérésekben (9a. ábra).

66

A nem nagynyálmirigyek termelte – nagy valószínűséggel – a kisnyálmirigyek területéről szájüregbe kerülő EGF szekréció detektálása a Pilokarpin kettős hatású szekretagog alkalmazásával azt jelzik, hogy az EGF szintézis jelen van a száj nyálkahártyán, a totál abláció ellenére. Az akut vizsgálatokban - a műtét utáni 2 órás nyuglmi fázist követően - a pilocarpinstimulációra a 100 perces intervallumban gyűjtött szekrétum EGF tartalma 2,33 ng. A totál ablációs műtétet követő 7. napon ez az érték 2,267 ng, a 14. napon 2,633ng a mért EGF érték, tehát nem mutat lényeges eltérést.

2,5

chr-7d 1x pilo

EGF ng/ml

2

chr-14d 1x pilo

1,5

acut 1x pilo

1 0,5 acut 1x pilo

0 1

9a

2

3

4

5

6

15'-es frakciók

67

7

8

chr-7d 1x pilo 9

10

11

Akut AB

EGF ng/ml 100 perc szekrétum

chr-7nap AB

5

chr-14nap AB

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5

n=3

0

n=3

n=3

-0,5

Akut AB

9b

chr-7nap AB

chr-14nap AB

csoportok

9a-b.Ábra: A kisnyálmirigyek EGF szekréciós tulajdonságai az idő függvényében (9a) a nagynyálmirigyek teljes ablációját követő különböző időpontokban. Az a 50. percben (összesített 3-3 frakciók esetén 3 és 4 közé eső időben) adott 2,5 mg/kg ip. Pilocarpine injekció után látható a fokozódócsökkenő szekréciós válasz. A stimulált 100 perces szekréciós fázis statisztikai átlagainak viszonyát a 9b ábra foglalja össze. Átlagértékek ± SD, NS: p> 0,05

4-B.1. Alapadatok és ismeretek a csont-kompartmentekről. 4-B.1.1. A csont és csontvelő szövetek ontogenetikai fejlődése. Az elsődleges csontosodás egérben, hasonlóan a patkányhoz, az embryonális kor 16-ik napja körül kezdődik, mind az axiális, mind az appendikuláris csontokon. Perinatális és korai postnatális korban jól megfigyelhető a jelentős aszinkrónia, különböző anatómiai területeket összehasonlítva. Például a femur-ban (10.ábra), a születés utáni 14-ik napon a diafízisben már kialakul a végleges szivacsos csontállomány teljes csontvelő sejtállománnyal, ugyanakkor az epifízis még porcos állapotban van jelen. Mivel a csont és csontvelő fejlődése szorosan egymásra utalt, ez azt is jelenti, hogy a csontvelő szövet fejlődése is jelentősen eltérö a különböző funkciójú anatómiai lokalizációkban. Az viszont mind a mai napig nem tisztázott, hogy a szivacsos csontállomány szükségszerűen tartalmaz-e minden esetben teljes értékű csontvelőt!? [204]

68

Ezt a kérdést, aminek számos elméleti és gyakorlati következménye lehet, előkísérleteink során tett megfigyelésünk is felvetette. Felnőtt patkányok és egerek teljes axiális és appendikuláris csontvázát kipreparálva megfigyeltük, hogy a szivacsos csontok vagy élénk piros, vagy halvány színezetűek. Például az első és hátsó végtagok végződésein (kéz és lábfej; autopod) az ujjperecek közül a középső phalange erősen vörös míg a közelebbi és távolabbi csontok színtelenek. Hasonlóan, és meglepő módon, a farokcsigolyák teljes sorozata színtelen a megelőző vörös színű sacrális csigolyákkal összehasonlítva. Ez a szöveti különbség rendkívül domináns és makroszkóposan is megfigyelhető (14.ábra). Viszont nem ad feleletet arra, hogy miből adódik, a vérrendszer denzitásának különbözőségéből, vagy a csontvelő sejtek, speciálisan a vörösvérsejtek mennyiségének különbözőségéből!?

Az előbbi kérdésre többirányú,

célzott alapkísérlet eredménye adott választ 4-B.1.2. Az állcsont, a combcsont és a farokcsont összehasonlító szöveti szerkezete rágcsálókban a.) Jellemző sejttípusok a különböző eredetű szivacsos csontban. Először qualitatív cytológiai analízist végeztünk, a különböző területek csontvelő-mintáiból. A sejtszuszpenziókból cytospin preparátumokat készítettünk és Giemsa festés után analizáltuk a jellemző csontvelő sejt-típusok jelenlétét. Meglepő és rendkívül lényeges kvalitatív különbséget ismertünk fel a femur és a farokcsigolya “csontvelő” állománya között. Míg a femurban megfigyelhető a teljes hemato-lymphopoietikus sejtállomány (15B.ábra a farokcsigolya parenchymája rendkívül szegény, monoton képet mutat (15A.ábra). Ez utóbbi populáció főleg kisméretű, kerek sejtekből áll. Ugyanakkor a megakariocyták, erythroid szigetek és a jellegzetes hematon komplexek teljesen hiányoznak. A központi, centrális üreget nagymennyiségű LDL (low density lipid) cseppecskék töltik ki, melyek a csont hosszanti kettévágása és felnyitása után a tápfolyadék felszínére flotálódnak. A parenchymához kötött zsírcseppeket oil-red festéssel tettük láthatóvá (14.ábra). b.) Érhálózati különbségek az eltérő helyen lévő szivacsos csontokban. Egy másik kísérleti vizsgálat során az érrendszert analizáltuk. Egy újonnan kidolgozott micro-angiográfiás (alginate-kék festékszuszpenzió) módszerrel követtük az érrendszer irrigációját a csontvelőben. A módszerrel a femur érhálózata nagyon lassan tölthető fel. A femur kibontott csontvelő szövetből izolált hematon egységeken megfigyelhető a végkapillárisok jelenléte, míg a hematonok szőlőfürthöz hasonlón rendeződnek el a

69

kapillárisok végein. Acethyl-cholinesterase reakcióval a hematon egységekben differenciálódott megakariocytákat mutattunk ki. Ez a konfiguráció jól magyarázza a csontvelő szövet lassú perfuzálhatóságát. Ezzel szemben az ujjpercek, az állcsont és a farokcsigolya “csontvelő” állománya gyorsan feltölthető az alginát-kék komplexszel. A vérerek jelenlétét mutatja kék, és a zsírcseppeket, piros megjelenésben az 14.ábra, ami igazolja, hogy a farokcsigolyák szivacsos állományát nem a vérképző csontvelő szövet, hanem az ezt behelyettesítő, érhálózatban dús zsírszövet tölti ki, mely nagymértékű hasonlóságot mutat az állcsont szivacsos kompartmenjével. c.) Hisztológiai külömbségek a caudalis és sacralis csigolya szivacsos csontjában. Hisztológiai metszeteken vizsgáltuk az utolsó sacrális és ez első caudális csigolyák szerkezetét. A metszeteken tartarát rezisztens savas foszfatáz (TRAP) pozitív osteoclastok láthatók az endosteum kontúr vonalán. A korábbi megfigyeléssel egyezően a caudális szivacsoscsontnak rendkívül szegényes a sejtes állománya és a parenchymát többségében zsírcseppek töltik ki (14.ábra).

mandible-ant mandible-post

A

Haematon / csontkompartment

calvaria fro-par calvaria occip

10

B

cervical v

3

thoracic v lumbar v sacral v caudal v

10

2

peninian botulum sternum rib clavicule

10

1

stylopode zygopode-fibula zygopode-tibia tarsal

10

metatarsal

0

10

phalanx

1

10

2

10

3

10

4

10

5

TNCx103 / csontkompartment

16.Ábra: Az egyedi csont-egységek vérsejt termelő képessége szoros, számszerű, pozitív korrelációban áll a hematon egységek számával (A), Látható, hogy a mandibula elülső (■) alveolaris területe

70

nagymértékű hasonlóságot mutat a caudalis vertebra

(◊) hematopoietikus aktivitását meghatározó

hematonok számával. A mandibula ramusban (▲) is csak csekély a vérképzés, szemben az alsó végtagi csontkompartmentekkel (●), illetve a sacralis vertebrák (∇) csont állományával, ahol jelentős mértékű vérképzési egység található. Az önreprodukciós képességre irányuló tenyésztési sejtszámadatok (B) mutatják, hogy farokcsigolyákból nyert sejtek (-○-) egy 7-10 napos periódus után lecsengenek, míg az alsó végtag (femur, -●-) folyamatos populáció gyarapodásra képes.

4-B.1.2.

A csontvelő sejtek összehasonlító kvantitatív elemzése. Először

mikrodisszekcióval,

a

módszer

fejezetben

részletezett

technikával

(17.Ábra),

kibontottuk a legtipikusabb csöves csontokat, külön-külön, steril körülmények között, tápfolyadék alatt. A könnyen szuszpendálható sejteket pipettázással gyűjtöttük, a csontfelszínhez tapadt csontvelő szövetet pedig collagenase keverékkel emésztettük le. A két frakciót egyesítettük és tápfolyadékban mostuk. A vörösvértestek lízise után meghatároztuk az összes magvas sejtszámot. Az adatok világosan mutatják a szignifikáns kvantitatív különbséget a femur csontvelő, a testet alkotó axiális vertebrák és a farokcsigolyák sejtes állománya között (16 A ábra). Figyelemre méltó, három nagyságrenddel kisebb mennyiségű csontvelő állományt találtunk a legnagyobb caudális vertebrákban, a közvetlen megelőző sacralis vertebrákhoz képest. Az is kitűnik, hogy az állcsontok sejt-populációban a caudális vertebrákhoz hasonló mintázatot mutatnak, míg a femurtól lényegesen eltérnek! 4-B.1.3. Hematopoietikus őssejtek és „fészek-képzö” (niche) sejtek funkcionális analízise A fentebbi adatok egyértelműen arra mutatnak, hogy a caudális vertebrákban nem folyik vérsejt-képzés, vagy ha igen csak nagyon lecsökkent mértékben. A megakariocyták és erythroblastok, valamint a hematon egységek hiánya arra utal, hogy mind az őssejtek, mind az őssejt fészkeket (niche) alkotó sztroma sejtek gátoltak. Ennek eldöntésére két methodikai megközelítéssel kerestük a választ. a.) FACS vizsgálatokkal kimutatható különbségek. (Fluorescent Activating Cell Sorter). Először az őssejtek jelenlétét és fiziológiai állapotát analizáltuk FACS-on. Az irodalmi adatok egyértelműen állítják, hogy az őssejtek „ujjlenyomatára” két membrán fehérje, a Sca-1 (Stem Cell Antigén) és az őssejt növekedési faktorának (Stem Cell Factor, SC) receptora a c-kit protoonkogén produktum jellemző. Ezen túlmenően a multidrog rezisztenciáért felelős membránfehérje, amely proton pumpaként működik

71

(Mdr) jellemzi a nyugalmi (G0) állapotban lévő őssejteket. Az előző két fehérjét fluorokrómmal jelzett monoklonális IgG-vel jelöltük. Az Mdr-re pozitív sejteket azon az alapon szelektáltuk, hogy ezek kipumpálják a Hoechst33342 DNS-hez kötődő fluorokrómot, melyet két hullámhosszon detektálhatunk. A negatív vagy enyhén festett sejtek egy folyamatos kohortot képeznek koordináta rendszeren ábrázolva, melyek csőr alakban válnak ki a tömeget alkotó pozitív sejtek közül és futnak a 0 értékek felé. (19.ábra) Az összehasonlító vizsgálatokhoz a femur csontvelő állományát és a farokcsigolyák szivacsos

állományát

preparáltuk

mikrodisszekcióval.

Ezt

követően

teljesen

disszociáltuk a parenchymát és az endosteumot bélelő sejteket, jelöltük Hoechst 33342al majd a két említett immunoglobinnal. A FACS analízist és a sejtek izolálását az összes magvas sejtre vonatkozóan és a Sca-1+/c-kit+ kettősen pozitív jelzésű sejtekre vonatkozóan végeztük. Az 19. ábra mutatja, hogy a farokcsigolyák tartalmaznak hematopoietikus őssejteket, melyek profilja nyugalmi állapotban lévő sejtekre jellemző. Jelenlétük ellenére mennyiségük messze elmarad a femurban található őssejtekhez képest. Az őssejtek egy szegmensre vonatkozó száma a farokcsigolyában kb. 2000-szer alacsonyabb, mint a femurban. (17. ábra)

A

Hematon

Buffy coat

Endosteum

C

B

1 femur

Buff Coa

Hemato

Endosteum

28x1 6

5.5x16

2.6x16 2.74=7124 1.09=135 0.08=5

TNC S 0.34%=7480 SpScaKi 12.91=965 SpScaKitCD1 0.14=10 0 To-HSCin 10 SP

0.39=21450 17.77=3802 2.56=54 54

57

17 Ábra: FACS analízis bizonyítja, hogy a nyugvó hematopoietikus őssejtek 80%-a hematon egységekből izolálható

72

b.)

Kimutatható

hematopoietikus

őssejtek

funkcionális jelenlétét

és

különbségek gyakoriságát

sejttenyészeten.

funkcionális

teszttel

A is

meghatároztuk. A femurból és caudális vertebrákból preparált sejtszuszpenziókat tenyésztettük MS-5 feeder sejteken és meghatároztuk a tipikus „cobbleston areát képző” sejtklónok gyakoriságát. Az 16B. ábra mutatja a vizsgálat eredményét, amely szerint a farokcsigolyákban is jelen vannak a primitív hematopoietikus őssejtek. Jelentős gyakoriságukat az magyarázza, hogy itt hiányzik a nagy mennyiségű differenciálódó és már differenciált sejttömeg. Az is jellemző, hogy az egy szegmensre számolt őssejtek abszolút száma csekély. Míg egy femurban kb. 9000 őssejtet találtunk, és egy sacrális vertebrában kb. 1500-at, addig egy caudális vertebrában csak 25-30-at (Táblázat-17). Ezek a funkcionális adatok megerősítik a FACS-al nyert analitikai eredményeinket. c.) Az őssejtek környezete (niche) változó az eltérő szivacsos csontokban. A következő kísérleti megközelítés arra irányult, hogy az őssejteket fenntartó, niche-t alkotó sejtek jelenlétét, vagy hiányát igazoljuk. Erre a célra a hematonok jelenlétének meghatározása látszott a legalkalmasabb módszernek, mivel a hematonok kompakt és izolálható sejtaggregátumok melyek számát nagy pontossággal meg lehet becsülni. Példaként mutatjuk a felnőtt egér calvaria vékony csontvelő állományát, ahol a hematon egységszerkezet könnyen felismerhető (20.ábra). Amint azt a 16A-ábra mutatja az axiális vertebrákban lévő magvas sejtek száma körülbelül azonos a cervicális és sacrális vertebrákban, míg a sejtek száma dramatikusan leesik az utolsó sacrális csigolyától a rákövetkező első caudális csigolyáig. Megfigyeléseink szerint hasonló, számszerű különbség áll fenn ezekben a szivacsos csontállományt tartalmazó szövetekben a structurált hematonok mennyiségében is.

73

HSC sejtszám / teljes femur

350

SP+/SSKT-Go NonSP/SSKT-CC

300 250 200 150 100 50 0

„Buffy coat”

„Haematon”

Endosteum

BM

18- Ábra: Aktív (SP+) és nyugvó (NonSP) hematopoietikus stem sejtek (HSC) kvantitatív elhelyezkedése femurban

CD19

NK1.1

CD4

B-LC

NK

T-LC

Myeloid CD11B H33342

c-kit

Side Population Sca-1

H33342

19. Ábra: A caudális vertebrák apláziás, hematopoietikus őssejtekben és csontvelőben szegény parenchymát tartalmaznak

74

H H

H H

H

H

20. Ábra: Jól látható a Hematon csoportok tagozódása, a különböző egér csontvelő preparátumokban 4-B.2. Csontosodási kinetika - Titán implantátum osseointegrációja az idő függvényében 4-B.2.1. Biofizikai vizsgálat -rögzülési erők (Newton). A 28. ábrán ábrázoltuk a csontregeneráció 1 - 18 hetes intervallumaiban a titánstiftek rögzülési értékeit patkány farokcsigolyában. Az 1 és 2 hetes csoportoknál nem tapasztalható számottevő rögzülés: 1. hét:1,6 N (±0,8), 2. hét: 2,2 N (±2,8). A mért értékek jellemzőek a csontregeneráció első exudatív, proliferációs szakára, mikor még csak különálló sejtcsoportokkal lehet számolni. A következő periódusban: 3. hét: 9,0 N (±8,5), 5. hét: 20,8 N (±7,9), a retikuláris csontszövet (rostos szövet) megjelenésére utalva fokozódó rögzülés mutatható ki. A csontosodás további időszakában már kifejezettebb rögzülési erő mérhető: 6. hét: 30,0 N (±5,9), 12. hét: 50 N (±19,9). Ekkor már számottevő pozitív felépítő remodellinggel a lemezes csontosodás is kialakul és fokozódik a rögzülés. Vizsgálatunk utolsó szakaszára jelentőssé válik a rögzülés: 18. hét:107,9 N (±22,7) ami már belenyúlik a mineralizálódás befejező szakába, bár még a maximumot nem éri el.

75

140

Newton (N)

120

rögzülési erő (Newton)

100 80 60 40 20

n= 9

0 -20

1. nap

7. nap 14. nap 21. nap 35. nap 42. nap 84. nap

126. nap

28. Ábra: Osszeointegráció mértéke Titánimplantátum rögzülési erő mérés alapján patkány farokcsigolyában, a mérési pontokban ± SD jelöléssel.

4-B.3. A biszfoszfonát - Zometa® kezelés általános és csontszöveti hatása 4-B.3.1. A krónikus biszfoszfonát kezelés általános hatása. Patkánykísérletekben (még nem publikált saját adat) és a klinikai közlemények adatai [174] alapján a csontsérülések regenerálódási folyamatában az osteogenesis mértéke a 6-12 hét közötti időben már jól kimutatható mértékű. Ennek ismeretében és a vizsgálati modellünkben alkalmazott Titán-stift rögzülési időgörbéje (28.ábra) alapján állítottuk be kísérletünk 6 hetes időtartamát. E krónikus kísérletünkben 3 alkalommal 2-hetente alkalmazott intraperitoneális Zometa® a fejlődésben lévő patkányok testsúlyában nem idézett elő változást. Átlagosan az állatok testsúlya hetente 4g-ot gyarapodott. A kontrollhoz viszonyítva a Zometa-val kezelt állatoknál nem mérhető szignifikáns testsúlyváltozás (35. ábra). A 0. napon a kontroll állatok testsúlya 288,6±29,3 g, valamint a Zometa® kezelt csoport állatainak testsúlya 292,7±21,6 g, közöttük nincs jelentős eltérés (p>0,72 NS). A 6. hét után mutatott testsúlyváltozások a kontroll 312,8±33,7 g, illetve Zometa kezelt csoportban 307,2±2,.0 g, nem szignifikáns mértékűek (p>0,66, NS). A szisztémásan - ip. injekcióval - szervezetbe vitt zolendronic acid nem váltott ki sem infekciót, sem szisztémás gyulladásokat. Fontos, hogy a sebészi beavatkozás helyén, egyetlen esetben sem lehetett gyulladásra utaló jeleket látni, vagy a sok esetben klinikai megfigyelésekben tapasztalt, mellékhatásként értékelt oszteonekrózist sem (34. ábra)!

76

400 350

Test súly (g)

NS

300 250 Control

200

Zometa

150 100 50 0 Start értékek

6. hét

35. Ábra: A kísérleti állatok testsúly viszonyai a kísérlet kezdeti napján és a 6 hét kísérleti periódus végén. Az állatok a szokásos kb. heti 4 g gyarapodással fejlődtek. A Zometával kezelt csoport néhány százalékos lemaradása nem szignifikáns.

4-B.3.2. A krónikus biszfoszfonát kezelés hatása az osseointegráció biomechanikai erejére – Ti-implantátum rögzülésére. A 6 hetes kezelési periódus kezdetén a titanimplantátumokat behelyeztük a csigolyákba a művi csontosodási kazetta tengelyébe, (ahogy az anyag és módszer fejezetben részletesen leírtuk. Az eljárás sémáját a 21-22. ábrán láthatjuk) A 36. ábrán ábrázolom az implantátumok tangenciális kimozdításához szükséges erőket Newtonban (N). A 6 hetes kísérlet végén a kontroll és a Zometával® kezelt csoportok esetén jól látható a külömbség. Az adatok a csontregeneráció (osseointegráció) mértékére utalnak, az implantátumok stabilitásának arányában. A mért kimozdítási erő értékek a kontroll állatokban tipikusan a normál, zavartalan csontregeneráció rögzítettségi tartományába esnek. A Zometával® kezelt állatok esetén az átlagérték magasabb (44,2±14,4 N), szemben a kontrollal (32,4±9,4 N). A kezelt csoport fokozott rögzülése 35%-al haladja meg a kontroll értéket, amely a statisztikai elemzés alapján a szignifikancia határ közelében van (p<0,06).

77

Tangencionalis rögzülési erő (Newton)

7 6

NS 38% fokozódás

5 4 3 2 1 0

n=10 Zometa®

Kontroll

36. Ábra: Zometa kezelés mellett a Titán implantátumok rögzülési értéke 38% -al haladta meg a kontroll adatokat, amely biomechanikailag jelentős, de statisztikailag a szignifikancia határ felett van.(Extrakciós erők: Kontroll:32,4 ±9,38 N; Zometa: 44,22 ±15,38 N; p< 0,06)

4-B.3.3.

Farokcsigolya szivacsos csont szöveti struktúrája a krónikus

biszfoszfonát kezelést követően. Az amino-biszfoszfonát 6 hetes kezelési periódus végén - az implantátumok kiszakítása után - a farokcsigolya morfológiai képében, a csontosodási kazettában, a subepifizeális területeken nem látható lényeges különbség az osteoid trabekuláris szerkezetben. Nyomokban sem látható oszteonekrózisra utaló szekvesztráció. Viszont markáns jelei vannak az intenzívebb csontképzésnek a trabekulák mérete és denzitása nagyobb a kezelt állatokban, mint a kontrollban (37A, 37B ábra). Az új csont nem kalcifikálódott, PAS pozitív területeiben nincs változás, ami arra utal, hogy fokozottabb a trabekulák kalcifikációs folyamata a kezelt állatokban. Megerősíti az előbbieket az ezüst-impregnációs eljárás, mely a kalcifikálódott szövetek jelölésére szolgál, ugyan is kiterjedtebb kalcifikációt mutat az amino-biszfoszfonát kezelésen átesett állatok új-csont képződési zónájában (37C és 37D ábra).

78

A

B

C

D

37. Ábra: Amino-biszfoszfonát kezelés csontregenerációra gyakorolt hatásának jellemző hisztológiai képe patkány farokcsigolya csontosodási kazetta modellen. A) és C) kontroll minták, B) és D) Zometa kezelt állatok mintái. A) és B) PAS festés, C) és D) ezüst impregnáció. A): Kontroll minta subepiphysialis régió. Szabálytalan csont trabekulák láthatók enyhe intenzitású PAS-pozitivitást adó részletekkel (rózsaszín). 100x nagyítás. B): Láthatóan megnövekedett csont trabekula területeken enyhe PAS-pozitiv részletek láthatók (rózsaszín), 100x nagyítás. C): A kezeletlen kontroll állatok farokcsigolya metszet subepiphysealis régiójában kslcifikációra jellemző festődés látható (sötét szürke, ezüst impregnációval), 200x nagyítás. D) A patkány farokcsigolya subepipfyseális területein kalcifikált csontszövet látható a csontosodási üregnek megfelelően, kalcifikált trabekulára jellemzően. 200x nagyítás

4-B.3.4. -mikroCT morfometriai változások krónikus biszfoszfonát kezelés következtében. A művicsont-kazettában képződött új csont morfometriai elemzése nagyfelbontású mikroCT analízissel. A mikromorfometriai elemzés valamint a mikroCT morfometriai mérések a művi csontkazetta méretében meghatározott szöveti térfogatban történt (TV=ROIx1,5 mm =2,694 mm3), (33. ábra). a.) Rekonstruált digitális kép. A változásokat reprezentáló 3D-s rekonstreuált képet a 38. ábrán láthatjuk. Egy implantált csigolya rekonstruált 3D képe látható medián saggitális sík metszetben a 38. ábrán a 6 hetes Zometa kezelés után. Az implantátum körül (a csontosodási kazettának megfelelően – szaggatott vonalon belüli terület) - 3,5-4

79

mm mélységig finomszerkezetű szivacsos csont látható, amely a regenerálódott új csont. Megfigyelhető az implantátum felületével szorosan érintkező csontlemez, ami az osseointegráció létrejöttét igazolja. A 39. ábrán mutatjuk be a csontkazettának megfelelően elemzésre kijelölt csonthenger rekonstruált térbeli képeit. Lényeges eltérés látható a 6 hét alatt újonnan képződött csont mennyiségi és strukturális szerkezetében a kontroll (A) és a Zometával kezelt (B) minták esetén. Markánsan több és robosztusabb csonttömeg fejlődött a kezelt csoportokban (39. ábra), a számadatokat a 40. ábrán és 34. táblázat A-D oszlopában is összevethetjük. A csontkazettában (a szaggatott piros vonalon belül) az újonnan képződött csont

38.Ábra: Osszeointegrált csigolyatest, az implantátum kimozdítása előtt, egy median saggitális művi metszési síkban. Jól látható a csontosodási kazettában kialakult új szivacsos csont – piros szaggatott vonal jelzi a határát. Az megállapítható, hogy ebben az esetben az új csont szerkezete finomabb mikrostruktúrájú, mint a körülötte lévő, de nagymértékben egyező a csigolyatest proximális végén lévő csontstruktúrával.

b.) A kvantitatív morfometriai analízis eredményei. A számítógépes elemzés adatai alapján készült értékeket a 40-41. ábrák és a 3-4. táblázat foglalják össze. Az elemzett (konstans) térfogat valamennyi mérésnél azonos, az anyag és módszer fejezetben leírt és bemutatott alakú és nagyságú ROIx1,5mm =2,694 mm3 (Tissue Volume =TV). Az intakt caudalis-3 csigolyák a „Referencia” csont (A=kontroll és B=Zometa kezelt), míg az alatta lévő műtött caudalis-4 csigolyák az „Új” csont (C=kontroll és D=Zometa kezelt) csoportokat jelentik.

80

A

B

Kontroll „New Bone” ROIx1,5mm

ZOMETA „New Bone” ROIx1,5mm

39. Ábra: A patkány caudalis vertebrák csontosodási kazettájában létrejött új csontszövet microCT rekonstruált 3D-s kép. A) kontroll placebo kezelt és B) amino-biszfoszfonát (Zometa) kezelt állatok mintái. Megállapítható a lényegesen intenzívebb (3x-os) csontképződés a Zometa csoportban. A csonttérfogatban a Kontroll =0,58±0,26 mm3 , a Zometa = 1,72 ± 0,35 mm3 ; p<0,00002 , de kétszeresre nő a trabekula-vastagság (p<0,0002), ezzel parallel csökken a trabekulák közötti tér mintegy harmadára. Összességében lényeges a denzitás különbség.

A morfometriai mérések szerint a kezelt csoportban átlagosan mintegy 3-szoros a képződött új csont (40. ábra, p<0,002). Növekszik a trabekulák vastagsága és megduplázódik a számuk (41 ábra, p<0,002), ezzel párhuzamosan csökken az intertrabekuláris tér és háromszorosára nő a csontdenzitás (3-4. táblázat). A kontroll állatokban a „Referencia”-csont terület adatait az „A”–jelzés alatt láthatjuk. (3. táblázat). Az elemzett konstans 2,694 mm3 térfogat 57,72%.-a keményszövet ami 1,55 mm3 teljes felszíne 38,75 mm2, az egységnyi távolságra jutó trabekulaszám 7,192/mm, a trabeculák átlagos sugara (½ thickness) 40,23 µm, a trabekulák közötti átlagos távolság (Tb.Sp.) 59,08 µm. A referencia terület csontállománya a Zometával kezelt állatokban („B”-jelzés alatt) nem mutatott szignifikáns különbséget az előző kontroll értékekhez viszonyítva. A teljes csontvolumen a standard térfogatban 50,78% - ez enyhe csökkenés – a csont térfogat 1,368 mm3, a felszíne 35,79 mm2, a trabekula szám 6,64/mm, az átlagos trabekula sugár 38.05 µm. Az adatok összevethetők az 4. táblázatban, valamint 40-41.

81

ábrán az A és B értékeknél. Egyedül a csontlamellák közötti távolság (Tb.Sp.) nőtt a kezelt csoportban a szignifikancia határt megközelítő (p<0,03) mértékben 75,00 µm-re.

(mm3) 3,0

Kontroll ZOMETA®

2,5 2,0

*

1,5

*** **

1,0

*

0,5 0,0 Vizsgált teljes térfogat ROIx1,5mm (TV=100%)

Referencia csont térfogat (Ref.BV)

New Bone térfogat (New BV)

40. Ábra: Csont térfogati viszonyok patkány farok vertebra regenerációban amino-biszfoszfonát kezelés alatt (átlag ±SD.). A 6 hét Zometa hatás szignifikánsan fokozza az újonnan képződő csontszövet térfogatát. Az ábrán látható, a vizsgált teljes térfogat egységesen ROIx1,5mm = 2,694 mm3 - (TV=100%), a referencia térfogat (belső kontroll) az implantált csigolya (C4) feletti csigolya (C3) azonos blokkjának paraméterei (Ref.BV) valamint az implantátum körül képződött új csont paraméterei (NewBV). A kezeletlen és kezelt csoportokat a világos – sötét oszlopok szemléltetik. Nincs különbség a referencia csontszövetben (Ref.BV - *NS); az újonnan regenerálódó csont térfogat szignifikánsan elmarad a referencia értéktől a nem kezelt kontroll csoportban (**p>0,002), szemben a Zometa kezelt mintákban ahol a szignifikancia határon, enyhén meg is haladja a referncia térfogatot (NS p<0,05). Az újonnan képződő csont háromszor nagyobb térfogatot mutat a Zometával kezelt csoportban az implantátum körüli csontkazettában mint a kezeletlen állatokban (*** p<0,0002).

A harmadik adatcsoport („C”) reprezentálja a művi csontkazetta képzés és implantátum behelyezés utáni „Új-csont”-képződést a kontrolll állatokban. Az elemzett konstans térfogatban (2,694 mm3) ez esetben a 6 hét alatt képződő keményszövet csupán 21,67%, ami 0,583 mm3 új-csont, amelynek felülete 25,223 mm2. Az ez idáig képződött trabekulaszám 34,9%-al kevesebb, mint a referencia-csontban (4,682/mm). A

82

trabekulák vastagsága is még csak fele a referenciának, az átlagos sugár 22,445 µm. Jelentős, átlagosan 179.63 µm tér van a lamellák között (Tb.Sp.), ez háromszorosa a referenciának. A vizsgált valamennyi területtel összevetve – beleértve a Zometával kezeltet is – itt vannak a legnagyobb lamella közti terek (ABD-C ****p<0.002). A negyedik csoportot – a Zometa kezelt álatokban az „új-csont”-ot – a „D” jelölés alatti értékek reprezentálják a 4. táblázatban, valamint a 40-41. ábrán. A konstans elemzési térfogatban (2,694 mm3) 63,8% az újonnan képződött, kalcifikált csont, amely 3x-osa a kontrollnak (C) és referencia-csont értékeket is meghaladja (1,1x A ill. 1,25x B). 3-4 Táblázat: Összehasonlító mikro-Computer Tomograf (mCT) elemzés patkány farok vertebra regenerációban placebo kezelt kontroll és 6 hét amino-biszfoszfonát kezelésben. Markáns kvantitatív csontszöveti paramétereket mértünk a „Referencia csontnál” (3. táblázat) a kontrolll és Zometa kezelt („A” és „B” oszlopok) csoportokban, valamint a 6 hetes regeneráció alatt képződött „Új csont” szövetben (4. táblázat) a kontroll és Zometa kezelt („C” és „D” oszlopok) csoportokban. A bold-al kiemelt paraméterek a Zometa csontfejlődésre kifejtett progressziv hatást mutatják.

"B" Referencia- "A" Referencia3. táblázat: “Referencia Bone”

Bone ZOMETA

®

Bone Kontroll

B-A%

“AB” p<

mérték n=10 . egység

means

Sd

means

Sd

∆%

significance

Vizsgált össztérfogat (Tissue volume) (TV) ( = ROI x 1,5mm)

mm3

2,69

0

2,69

0

0

NS

Vizsgált össztérfogat felszíne (Tissue surface) (TS)

mm2

19,90

0,42

19,92

0,43

-0,1

NS

%

50,78

9,62

57,72

5,08

-12,0

5,8 x 10-2

1/mm

26,80

4,22

25,10

2,40

+6,7

NS

µm

75,00

18,44

59,08

8,84

+26,9

2,4 x 10-2

µm

152,23

23,14

160,93

15,45

-5,4

NS

µm

37,06

12,65

26,73

6,64

+38,6

3,4 x 10-2

1/mm

5,31

0,36

5,35

0,38

-0,7

NS

Csont térfogat % (Percent bone volume) (BV/TV) Csont felszín / Csont térfogat (Bone surface / Bone volume ratio) (BS/BV) Trabekula közti tér (Trabecular separation) (plate modell Tb.Sp) Trabekula átmérő (Trabecular diameter) (rod modell Tb.Dm) Trabekula közti tér (Trabecular separation) (rod modelll Tb.Sp) Trabekula szám (Trabecular number) (rod modell Tb.N)

83

"D"

"C"

New-Bone 4. táblázat: “New Bone”

ZOMETA

New-Bone

®

Kontroll

D-C%

"CD" p<

mérték

n=10 . egység

átlag

Sd

átlag

Sd

∆%

szignifikancia

( = ROI x 1,5mm)

mm3

2,69

0

2,69

0

0

NS

Vizsgált össztérfogat felszíne (Tissue surface) (TS)

mm2

20,79

1,26

21,07

0,53

-1,3

NS

%

63,80

12,87

21,67

9,58

+194,4

1,4 x 10-7

1/mm

20,99

3,60

46,39

9,20

-54,8

1,95 x 10-7

µm

59,97

35,20

179,63

56,85

-66,6

2,3 x 10-5

µm

195,50

32,21

89,77

20,31

+117,8

6,34 x 10-8

µm

23,15

23,38

84,95

21,79

-72,7

8,92 x 10-6

1/mm

4,66

0,68

5,77

0,57

-19,2

9 x 10-4

Vizsgált össztérfogat (Tissue volume) (TV)

Csont térfogat % (Percent bone volume) (BV/TV) Csont felszín / Csont térfogat (Bone surface / Bone volume ratio) (BS/BV) Trabekula közti tér (Trabecular separation) (plate modell Tb.Sp) Trabekula átmérő (Trabecular diameter) (rod modell Tb.Dm) Trabekula közti tér (Trabecular separation) (rod modell Tb.Sp) Trabekula szám (Trabecular number) (rod modell Tb.N)

Ez térfogatban 1,72 mm3, felülete 35,4 mm2, a trabekulák száma 6,58/mm. A trabekulák sugara 48,88 µm, ami jelentősen 2,17-szeresen vastagabb, mint a kontroll új-csont (C) esetén (p<6,34x10-8). A lamellák közötti távolság (Tb.Sp.) 59,97 µm, amely 1/3-a a kontrollokban lévő Új-csontlamellák közötti tereknek. A Zometa-kezelt állatokban egyértelműen fokozódott a regeneráció, összességében megháromszorozódott az új-csontképzés a 6 hetes periódus végére és a képződött csont szerkezete robosztusabb lett

84

6

"A" Referencia "B" Referencia Zometa® "C" New Bone "D" New Bone Zometa®

** 5

NS

NS **

4

***

*

3 2 NS

1

***

*

0 Trabekula ˝ vastagság (µm)

Csont felszín (mm2)

Trabekula szám1/mm

41. Ábra: A Trabekula vastagság (csonttérfogat/csontfelszín=½átmérő µm), a Csontfelszín (mm2) és az 1mm-re eső trabekulaszám (1/mm) mérési adatait viszonyítjuk placebo-kezelt kontroll és Zometa kezelt állatok Referencia és Újonnan képződött csontszövetében. A Zometának nincs hatása a referencia csontszövet trabekula vastagságára; a regenerálódó új csont a kontroll állatokban visszamarad és szignifikánsan kisebb átmérők mérhetők mint a normál referencia csontban (** p<0,0002); szignifikáns jelentős különbségek találhatók a Zometa kezelt és placebo kezelt kontroll állatok adatai között (*** p<0,00002). A csontfelszín redukált a kontrollokban a referenciához viszonyítva (* p<0,002); a 6 hét szisztémás Zometa kezelés viszont fokozza a csontképzést és szignifikáns eltérést mutat a kontrollok újonnan képződött csontszövet-felszínéhez viszonyítva (* p<0,002). A trabekulák számában nincs különbség a kísérleti csoportok között a referencia csontszövetnél (NS; p>0,05), de szignifikánsan visszamarad számuk a placebo kezelt kontrollokban az újonnan képződő csont területeken (*** p<0,00002). A Zometa 40.6%-al emeli a trabekulaszámot az új csontformációban, a placébó kezelt kontrollhoz képest. Az értékek arra utalnak, hogy Zometa jelenlétében a 6 hetes periódus elegendő a csontszerkezet visszaállásához, szemben a kontrollokkal, ahol ez idő alatt jelentős lemaradás mérhető.

85

5.) MEGBESZÉLÉS 5-A.1. EGF termelés szubtotális nagy-nyálmirigy eltávolítás (részleges abláció) után Vizsgálataink megerősítik, hogy a nyálmirigyek széles variációban szekretálnak EGF-et a nyálba [35, 60, 61]. Szintén bizonyítjuk, hogy az EGF elválasztás adrenerg kontroll alatt áll [22]. A nyálmirigyek-részleges eltávolítása (sialoadenectomia, ablatio), és a citromsavval történő krónikus gusztatórikus ingerlés egyaránt a funkcionáló nyálmirigyek, megnagyobbodását (hipertrófia, hiperplázia) indukálják. Korábbi megfigyelésekben számolnak be a funkcionális kompenzációs gl. parotis szöveti megnagyobbodásról [46, 196, 197] és a fokozott amiláz mRNS szintről [40]. Korábbi közleményben már beszámoltak a gusztatórikus stimulálást jelentő 0,5% citromsavas ivóvíz kezelésre kialakuló funkcionális nyálmirigy aktivitásról [47]. A komparatív nyálmirigy abláció, növekedet funkcionális alapokon jelentős mirigysúly fokozódást váltott ki a gl. Parotisban [37]. A parotisban a szöveti fehérje 25%-os csökkenése egybe vág a nyálban mért fehérje tartalom fokozott mértékével. Ezen állatkísérletes eredményekkel alátámasztható, hogy bizonyos humán kórképek esetén fokozott gusztatórikus ingerek alkalmazásával javíthatók a nyálmirigy funkciók [198]. Kisérleteinkben a nyálban mért EGF koncentráció csupán 10%-os csökkenést mutatott, a gl. Submandibuláris mirigyek eltávolítását követően, feltehetően a parotis és a kisnyálmirigyek aktiválódása nyomán. Egérben hasonlóan a gl. Submandibuláris ablációt követően jelentős csökkenést mértek a nyál EGF tartalomban [39]. A különbségek hátterében egyrészt az egér-patkány species különbség, másrészt a különböző kísérleti időperiódus és a különböző nyálelválasztást stimuláló drog állhat. A kísérleteinkben kompenzációs hatásra utal, hogy a parotis szövetben mért, 90%-nyi csökkenés, a közel változatlan nyál EGF tartalmat fedezi. Igen érdekes és kiemelendő adatunk, hogy szummálható az ablációt követő fokozott parotis funkcionális aktivitás, a krónikus gusztatórikus inger alkalmazásával. A citromsavval kiváltott gusztatórikus inger, intakt állatokban is fokozott nyálmirigy funkcionális aktivitást eredményez. Párhuzamosan a mirigysúllyal (+30%), a protein tartalom (+10%) is nő.

86

Más oldalról a parotis szöveti EGF-koncentráció egyezően az ablációssal 90%-al csökken és pilocarpin stimulációval tovább nem csökkenthető – nem üríthető „kötött” fázis(?). Citromsav krónikus itatással a nyál EGF tartalom 20%-al emelkedik. Ez az enyhe növekedés egy jelentős 80%-os fehérje növekedés mellett jelentkezik, ami csökkenti a nyál EGF/fehérje hányadost. A mirigysúly és fehérje tartalom a gl. szubmandibláris mirigyekben nem mutatott szignifikáns eltérést a citromsavas krónikus kezelésre. Más oldalról a gl. szubmandibuláris szöveti EGF tartalma 40% -al nőtt, mely pilocarpinnal üríthető. Kisérleti eredményeink összegzése: 1) A nyálmirigyekben az EGF secréció noradlenalin reguláció alatt van. 2) A gl. SM + gl. SL eltávolítás nem jelenti a szekretált nyál EGF komplett eltűnését. 3) A nyál EGF több mint egy nyálmirigy terméke. 4) A nyál EGF fokozható a nyálmirigy aktivitás stimulálásával. 5) A parotis mirigy egy alacsony szöveti pool mellett is képes jelentős fehérje és EGF szekrécióra. 6) Sérült vagy eltávolított nyálmirigy funkció kiesését a komplementer mirigy(ek) kompenzálhatják. 5-A.2. A kisnyálmirigy experimentális modell (teljes abláció). Nyál és EGFtermelés nagynyálmirigyek nélkül Alapvető fontosságú megállapítás, hogy a nagynyálmirigyek eltávolítása után patkányoknál a túlélési idő több mint 90 nap, tehát a nagynyálmirigyek nagy valószínűséggel nem életfontosságú szerveink. A kísérleti állatok igen rövid idő alatt új táplálkozási módot kénytelenek választani a fokozott szájszárazság miatt. A táp leharapását követően gyakran fordulnak az ivócsőre, mintegy „ráisznak” a száraz patkánytápra. Ez a gyors viselkedési változás (is) bizonyítja a patkányok fejlett központi idegrendszer működését. - Nagynyálmirigyek patkányban, pilocarpin stimulált nyálelválasztásánál az összes fehérje közel 85% -át, míg amiláz esetén az összes mennyiség 98% -át adják.- A nyáltermelés fennmaradó - összprotein esetén kb. 15 % ill. amiláz esetén kb. 2 % -ában a száj nyálkahártya felszínére közvetlen szekretáló nyálmirigyek adják, melyek vegetatív beidegzés alatt állnak. A nyálkahártya kisnyálmirigyek csekély mértékű, lassan kialakuló kompenzációra képesek a nagynyálmirigyek eltávolítása után a fehérje, amiláz és EGF termelésben. Az

87

eredmények arra a megállapításra engednek következtetni, hogy nagynyálmirigyek eltávolítása után is van EGF a szájüregi szekrétumban, melynek legvalószínűbb forrása a kisnyálmirigyek szétszórt rendszere. A kisnyálmirigyekből nyálkahártyára közvetlen kiválasztódó epidermális növekedési faktor jó eséllyel segítheti a nyálkahártya sérülések regenerációját ezzel gátolva a jelenlévő mikroflóra inváziós potenciálját. 5-B.1. A csont-fejlődési és csontregenerációs vizsgálatok számára optimális „monokróm” csontszövet feltárása Az idegen anyagok integrációjának időtartama és a stabilitás mértéke döntő problémakör a csontregenerációban. Nehézséget jelent, hogy számos esetben a kísérleti elemzésekre biológiailag nem a legadekvátabb modellt alkalmazzák. Példának említhetjük,

hogy

az

állcsontokba

helyezendő

dentális

implantátumok

osseointegrációját modellező experimentális kísérletekben minden további nélkül alkalmazzák azokat a csontterületeket (combcsont, koponya, csípőcsont) melyek funkcionálisan a hematopoetikus szövettel szoros funkcionális anatómiai egységet képeznek [137], így nem csupán a csontszöveti reakciókkal kell esetükben számolni. Keményszöveti regenerációval foglalkozó munkánk első részében kerestük azt a speciest és anatómiai helyet, ahol adekvát in vivo tesztrendszerrel lehet vizsgálatokat végezni „tiszta”- „monokróm” csontszövetben és összefüggésében lehet elemezni a csontregeneráció-neogenezis-osseointegráció minőségi és mennyiségi paramétereit, különböző lokális és szisztémás kondíciókban. Új

módszerünkben,

patkány

farokcsigolyacsontjának

szövetkörnyezete

bizonyítottan szegényes a hematopoetikus elemekben („monokróm”?)

és könnyen

hozzáférhető, sebészetileg egyszerűen kivitelezhető metodikai lehetőséget ad, a csontregeneráció biomechanikai

vizsgálatához, (rögzülési

az

erőmérés),

implantátum-osseointegrációjának mind

szövettani

(mikroszkópia),

mind mind

mikromorfológia (mikroCT) struktúr-elemzéseihez. Előzetes vizsgálatainkban elemeztük a szivacsos farokcsont sejtes állományát, mely igen szegényes parenchimalis csontvelői elemekben, de frekventáltan tartalmaz osteoblastokat (Blazsek I. és mtsai. folyamatban lévő nem publikált adat), és TRAP

88

pozitív osteoclastokat, biztosítva a feltételét, hogy a farokcsigolya alkalmazható a különféle típusú csontregenerációs vizsgálatokban. 5-B.2. Az új osseointegrációs („OSSI”) modell Új modell-elemként az implantátum körül létrehozott „művi-csontkazetta” lehetővé teszi, hogy vizsgáljuk különböző helyi bioaktív anyagok, növekedési és differentálódási faktorok, mesenchimalis őssejtek, biológiai-addhezívanyagok [126], egyedüli vagy szisztémás kezelésekkel kombinált hatásait. Meghatároztuk standard modellünk ossointegrációs biomechenikai paraméterét a csontregeneráció idejének függvényében kontroll alaphelyzetben (Blazsek J. és mtsai még nem publikált adat). Miután már rendelkeztünk kísérleti rendszerünkben az implantátum rögzülés standard értékeivel, behatárolhattuk a regenerációban mérhető változás érzékeny optimális időintervallumot, amely 6-8 hét. A csontregeneráció időfüggő értékeiből következtethető a vizsgálati rendszer „érzékeny” modifikációs zónája. A biomechanikai rögzítő erők biztonsággal mérhető, jól reprodukálható értékei az 5-6. hétre (35-42 nap) alakulnak ki. Ez a 20-30 N erejű rögzülés rendszerünkben, a remodelling stimulációja esetén akár 3-4szeresére is fokozódhat a normál strukturális viszonyok alapján, de az értékek csökkenését is regisztrálhatjuk gátló tényezők hatására. Ezzel paralell a mikromorfológia jellemző mérőszámaiban is kellő variabilitási tartalékok vannak mind a fokozott, mind a csökkent strukturális változások esetén. Megállapíthatjuk, hogy vizsgálati rendszerünk érzékeny korrelációja tehát az 5-7 hetes regenerációs periódusban optimális. 5-B.3. Amino-biszfoszfonát krónikus experimentális alkalmazása. Az utóbbi időben számos – az állcsontokra lokalizálódó - osteonekrotikus klinikai megfigyelés hívta fel a figyelmet a prosztata és emlő rák terápiájában csontmetasztázisok kivédésében kedvező eredményekkel alkalmazott újfejlesztésű amino biszfoszfonát – Zometa® – lehetséges oszteogén mellékhatására. A biszfoszfonátok elsődleges hatása az osteoclastok gátlásán keresztül a csontlebontás csökkentése [101, 103]. Az amino-biszfoszfonátok támadáspontja a sejtek mevalonate ciklusában van, ahol gátolják a farnesyl pyrophosphate (FPP) syntase enzimet, [128], amely a guanosine triphosphate (GTP)- kötő fehérjék (Rab, Ras, Rho,

89

Cdc42) prenylációjához szükséges. Mivel ezek regulátor fehérjék, az osteoclast sejtekben csökkenésük a sejt gátlását váltják ki [127, 129]. In vitro vizsgálatokban amino-biszfoszfonátokkal osteoblast sejtek proliferációjának és differenciálódásának fokozásával direkt csontképzést lehet stimulálni [135, 136]. [Allogén-csontvelő (BM) transzplantáltakban

ugyancsak

fokozódik

a

csontvelőben

a

kolónia-képző

mesenchimalis preosteoblastok frekvenciája, aminobiszfoszfonát kezelésre [175]. Valószínű, hogy a biszfoszfonátok kettőshatásának eredője, az osteoblastokon in vivo körülmények között is, a felépülés irányába segíti a csont remodelling folyamatát. Valószínű e hatások eredőjeként fokozódott a mi kísérleteinkben is az új csontképződési intenzitás háromszorosára a kontroll regenerálódó csonttérfogatához képest. A kontroll állatok sértetlen referenciacsont szerkezetét alapnak véve (100%), az újra képződő csont a hathetes periódus alatt a kontrollokban csak 37,5 %-ot ér el, a Zometá®val kezelt csoportban ezen idő alatt az implantátum körül 110,5% új-csonttérfogat fejlődik. A trabekulák száma nem különbözik számottevően az újonnan képződő csontokban, csak 20%-al több a Zometa® kezelt állatokban, mint a kontrollban. Összevetve ebből következik, hogy a kontrollokban az újonnan formálódó csont szerkezete gracilisebb trabekulákból és lamellákból áll, illetve a közöttük lévő terek tágabbak, mint a 6 hét Zometa® kezelést követően kialakuló robosztusabb, vastagabb trabekulákkal, kisebb lamella közti terekkel, fejlettebb szerkezetet mutató új-csont. A Zometával kezelt állatokban az új csont szerkezete e 6-hét alatt már az eredeti referencia csont szerkezetéhez hasonlóvá válik, sőt paramétereiben némileg túl is szárnyalja. Biomechanikailag az implantátumok ooseointegrációs rögzülése a 6-hetes regenerációs periódusban, arányaiban egyezik R. Bränemark által közölt értékekkel (R. Bränemark 1997). Az általunk alkalmazott (1,2 mm ø) implantátumok esetén a rögzülési erő 25-35 N. A Zometa® kezelés 6-hetes periódusa során ez a tangenciális rögzülési érték 30-40%al fokozódik, 30-60 N-ra. Gyulladás, csontszekvesztrálódás jelei, sem a sebészi feltárásban makroszkóposan (34.ábra), sem szövettani metszeten (37.ábra), sem röntgen mCT-vizsgálatokban (38.ábra) nem láthatók Kísérleti eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy betegség-mentes (disease-free)

regeneratív

feltételek

mellett

a

Zometa®

kezelés

fokozza

a

csontképződést, pozitív irányú remodelling hatással rendelkezik. A titán implantátum oseointegrációjában is kimutatható a Zometa kezelés pozitív hatása.

90

34. Ábra: 6 hetes regeneráció után – Zometa kezelés mellett - látható a per primam gyógyult farokvég. A feltárás után is látható a teljesen gyulladásmentes, konszolidált szövetállomány az iplantátum feje körül. Az implantátum fejben lévő luk átjárható. Gyulladás, nekrózis, csontszekvesztrálódás jelei nem láthatók! A Titánstift kihúzása utáni csontüreg falai és környéke sem mutat gyulladásos jeleket.

A titán implantátum patkány femur modellben alkalmazva indukálja a mátrix metalloproteázok (MMP-2, MMP-7, MMP-9) expresszióját, ezzel az MP-3, TNF-alpha szöveti gátlását az oszteocytákban, osteoclastokban. A hypertrofizált porcban és érkomponensei körül [176] biszfoszfonát alkalmazásával fixálhatók az osteoclastok [177], mind az osteoclastogenezis - így a rezorptív funkciók – csökkentésével mind az apoptózis-sejthalál indukciójával [93, 128, 178]. A biszfoszfonátokat széles körben alkalmazzák oszteoporózis kezelésére [101, 128, 129, 130], emlő és prosztata tumorok csontmetasztázisainak gátlására [[101, 102, 103], oszteoarthropátiában [179], fibrózus

91

diszpláziában [180]. A biszfoszfonátok alkalmazása során mellékhatásokról is beszámolnak, leggyakrabban az állcsontokban kialakuló oszteonekrózisról (ONJ) számolnak be [132]. Ennek értékelésére egy széles skálán kell vizsgálódni: 10.000 oszteoporózis esetben 1 ONJ fordul elő az éves kezeltek száma 100.000. Nagyságrendekkel nagyobb az ONJ előfordulás a tumorterápiák esetén, ahol hosszúideig, ismétlődően nagy dózisú biszfoszfonátot adnak intravénásan, ekkor 100 kezeltből 1-10 esetén jelentkezik az ONJ mellékhatás [133].

6.) KÖVETKEZTETÉSEK 6-A.1. Kompenzációs EGF termelődés lehetősége a gl. parotisban Ha a nyálkahártya egyik fő regenerációs tényezőjének, az EGF-nek rágcsálókban legintenzívebb termelési szövetét a gl. Submandibulárist eltávolítjuk, akkor akutan drámai csökkenést láthatunk a nyál EGF tartalmában. A nyáltermelés adaptációs mechanizmusában a megmaradt gl. Parotis intenzív növekedéssel és nyáltermeléssel csökkenti a hyposalivaciót. Ennek során jelentős mértékű acinussejt hypertrófia- hyperplázia látható. Kompenzációs funkció-fokozódás és megnagyobbodás jön létre a gl. parotisban, ha eltávolítják a submandibuláris-sublinguális mirigyeket, vagy az ellenoldali parotist [6, 57, 58, 59] viszont a kivezetőcső-rendszer volumene, illetve ennek gyarapodása arányaiban elmarad ettől. Miután az EGF a kivezetőcső területén képződik [28] az adaptációs mechanizmusban aránytalanul elmarad az EGF produkció. Más oldalról a gl. Parotis szöveti EGF tartalma, a gl. Submandibulárisok excisiója után ezres nagyságrenddel lecsökken, ami részben utalhat arra, hogy e parotisszöveti

szinthez

valamilyen

mechanizmussal

a

gl.

submandibulárisok

is

hozzájárulhattak. Másrészt az alacsony gl. Parotis szöveti tartalomhoz hozzájárulhat az extrém csúcsra járatott szekréciós mechanizmus, a kivezető csövek területe felől egy intenzív „kimosási effektus”-sal. Ennek bizonyos kompenzációs hatásfokozódás is lehet a következménye a szájüregi EGF-szintben

92

6-A.2. A kisnyálmirigyek EGF termelése A kisnyálmirigyekben, több kutatócsoport is (Brunner mirigyben: [23, 27]) kimutatott EGF termelést. Újdonság, hogy a kisnyálmirigyek adaptálódása is megfigyelhető a teljes abláció során, mely a fehérje és amiláz mellet EGF szekréciót is produkál. Erre utal, hogy az abláció után akutan végzett kísérletekben az állatok pilocarpin stimulációra adott 100 perces szummációs szintjét (2,233 ng), a 14 napos teljes ablációs hatás 18%-al (2,633 ng) „megnövelte”, amely nem jelentős, de ez esetben alapvető bizonyíték arra, hogy nagynyálmirigyek nélkül is tartalmaz EGF-et, a szájüregi nyálkahártyát bevonó folyadékfilm. E megfigyelés alátámasztja azt a szervezetben általánosan meglévő „törekvést”, hogy a biológiai mechanizmusok – főleg a védelmi struktúrák - többszörös „túl”-biztosítás alatt működnek. Tehát feltehetően lehet esélyünk humán viszonylatban is, ha baleset, tumor, stb. miatt megszűnik, vagy csökken a nagy nyálmirigyek EGF termelése, hogy a kismirigyek felől kerülhessen regenerációs faktor a szájnyálkahártyára. Mérési eredményeink alapján kimondható, hogy az általunk kidolgozott „totál-ablációs” módszer a kisnyálmirigyek funkcionális experimentális kísérleteire alkalmas, a nem nagynyálmirigy eredetű, szájüregbe szekretálódó szájfolyadék vizsgálatára. A részleges és

a

teljes

nagynyálmirigy

abláció

eredményeinek

együttes

értelmezése

a

kismyálmirigy-adaptáció sajátosan új oldalát tárja fel. Egyrészt a nyálkahártyát és fogakat bevonó biofilm peptid-fehérje komponensei között megtalálható az amilázenzim és az EGF. Másrészt hogy elválasztásukat, szekréciójukat a kevert hatásspektrumú pilocarpinnal stimulálni, illetve e stimulációt Propranolollal gátolni lehet. 6-B.1. Alapfelismerés: a Hox kod és a hematopoietikus őssejtek biológiája összekapcsolt A csont és csontvelő szövet struktúrájára és kapcsolatára vonatkozó összehasonlító vizsgálataink eredetileg arra a célra szolgáltak, hogy alapismereteket nyerjünk a caudális vertebrák szivacsos csontállományára vonatkozóan, melyeket a titán implantációs

kisérletekhez

modellként

alkalmaztunk,

a

„tisztán”

csontszöveti

osseointegráció vizsgálatára. Kísérleti adataink, az eredeti kérdés megválaszolásán túl, a hematolgia területén is új információkra világítottak rá.

93

1) A caudális vertebrák szivacsos csontállománya csontvelő parenchymában és őssejtekben rendkívül szegény. Ebből az alapvető szempontból hasonlít az állkapocs csontokhoz, így adataink alátámasztják alkalmasságukat a dentál-implantációs kísérletek modellezéséhez. 2) Az a tény, hogy a számos szivacsos csontban, mely gazdag osteoblastokban és osteoclastokban, nem folyik hematopoiesis, arra mutat, hogy az osteoblastok, egyedül, nem képesek a hematopoietikus őssejt-niche szerepét betölteni. Így megerősítik azt a modellt, amely szerint a csontvelő is, hasonlóan a legtöbb szövethez, szövet-specifikus funkcionális alegységekből (osteon, nephron, hajhagyma, izlelö bimbó, stb) épül fel, amit hematon-ként irtak le korábban. 3) Kísérleti adataink bizonyítják, hogy a fészek-szerű hematon egységek jelenléte szorosan összekapcsolt a teljes spektrumú csontvelősejt termeléssel. 4) A különböző anatómiai elhelyezkedésű csontokban folyó hematopoietikus aktivitás összevetése és korrelációjának analízise a csontvázrendszert meghatározó genetikai kóddal [85] felveti a lehetőséget, hogy a szövetek hematopoietikus kompetenciája szoros összefüggésben áll a csontváz felépítését és alapstruktúráját

meghatározó

genetikai kóddal. Az erre vonatkozó irodalmi ismeretek mind az embriológiai, mind a hematológiai irodalomban teljesen hiányosak. Ismeretes ugyan, hogy knockin technológiával integrált HoxB4 gén produktum pozitív irányban befolyásolja az őssejtek osztódási potenciálját, azonban a HoxB4 null egerek hematopoietikus aktivitása normális [89]. Megfigyeléseink arra a feltételezésre engednek, hogy a Hox kód, feltehetőleg a Hox13 komplex [90] és a caudális homeobox transzkripciós factor [91] és a hematopoietikus őssejtek biológiája valószínűleg összekapcsolt. 6-B.1.2. Perspektívák Az alapkutatások területén nyert új információk többirányú vizsgálatokhoz szolgáltatnak ismereti adatokat. Itt csak néhányat említünk. 1) Adataink lehetőséget adnak arra, hogy elmélyítsük ismereteinket a hematopoietikus szövetek kompetenciája, a szkeletogenézist meghatározó genetikai kód és a morfogén típusú szabályzó faktorok között fennálló kapcsolatokra (genomics, proteomics) 2) A caudális vertebrák, nem csak a csontregeneráció „modell szövete” lehet, de alkalmas az aregeneratív apláziák és a myelofibrózis kísérletes tanulmányozására is.

94

6-B.2. Az „OSSI”-modell széleskörű alkalmazhatósága 1) vizsgálati eredmények bizonyítják, hogy az újonnan kifejlesztett művi csontkazettás

farokcsigolya

modell

alkalmazásával

kvalitatíve

mérhető

a

csontregeneráció és az implantátum osseointegráció. Az általunk kifejlesztett és leírt kísérleti modell és protokol először teszi lehetővé az újonnan képződő csont kvalitatív és kvantitatív változásainak együttes elemzését, szisztémás és/vagy lokális kezelésekre. 2) A módszer alkalmazásával először mértük meg egy amino-biszfoszfonát (Zometa®) kvantitatív és kvalitatív stimulációs hatását csont neogenezisben és implantátum osseointegrációjában. 3) Jelen munkának váratlan eredménye volt az a felismerés, hogy a szivacsos farokcsigolyák alig tartalmaznak csontvelő parenchymát, de igen-igen gazdagok a csont remodelling építő és lebontó sejtjeiben. Ez a felismerés fontos lehet számos alapvető kérdésben. Először is a farokcsigolya ideális mikrokörnyezet lehet a csont-modifikáló anyagok széles skálájának preklinikai vizsgálatánál, hiszen itt nem zavar a hematopoetikus rendszer. Igen kedvező lehet például a hasonló kompartment felépítésű állcsontok modellezésére, dentális implantátum osseointegrációjának vizsgálatára. 4) A gyér csontvelő (csv.) parenchyma a farokcsigolyákban egy olyan kísérleti helyzet, mely lehetőséget ad a jelenlévő osteoblast környezetbe („niche”) beadva a hematopoetikus őssejtek és az osteoblastok közötti interakciók vizsgálatára [73, 78, 96]. 5) Korábbi publikációk [182] és saját, folyamatban lévő kísérleteink alapján nagy valószínűséggel

e

terület

a

pseudo-aplastikus

helyzethez

hasonló,

így

a

farokcsigolyában vizsgálható a hematopoetikus csontvelői celluláris diszreguláció a myelodyspláziás és preleukémiás szindróma [183] kialakulása és/vagy progressziója terén 6-B.3. A biszfoszfonátok therápiás lehetősége a csontregenerációs folyamatokban? Krónikus experimentális vizsgálatunk egyértelműen kizárta a biszfoszfonát – Zometa – csontnekrózist, gyulladást előidéző hatását. Feltételezhetően a biszfoszfonát terápiában ez az orális régiót érintő súlyos mellékhatás kizárólag nem szorosan a biszfoszfonáthoz társítható. A tumoros beteg egy multifaktoriális háttérrel rendelkezik, amelyben az alapbetegségen túl – ahol az esetek döntő részében az immunrendszer

95

rosszhatásfokú funkciója is fennáll - a citosztatikumok és egyéb sejtregulációra ható szerek, sugárterápia alkalmazása jelentősen rontja a sejtregenerációs állapotot, mely kifejezetten kedvezőtlen a szájüregi integritás fenntartásában. Különösen rontva a nyálkahártya regenerációt a szájüregi mikroflórával szembeni védelmi egyensúlyt. A szájnyálkahártyán fiziológiásan naponta százas nagyságrenddel keletkező mikrosérülés elhúzódó záródási effektusa kellő alapokat adhat a csontra terjedő inokulációknak, melynek következtében a csontnekrózisok kialakulhatnak. Ennek esélyeit erősen növeli, ha nagyobb sebképződést jelentő fogászati beavatkozás is történik a biszfoszfonáttal kezelt tumor ellenes terápián lévő betegen. De ilyen súlyos fertőzési kapu keletkezhet a szájnyálkahártyán, teljesen banálisan, pusztán az erősen nedvszívó tamponok nem kellően óvatos cseréi következtében, amikor is nagy felületen keletkezik hámsérülés. Hazánkban – ahol jelentős a szájüregi tumorok előfordulása – különösen kedvezőtlen helyzet állhat elő, főként a széles körben megtalálható szájnyálkahártyát károsító szokások miatt (dohányzás, tömény-alkohol fogyasztás, fűszeres és forró ételek fogyasztása, rossz higiénia, stb.). E tényezőket evidenciában tartva mégis valójában a biszfoszfonátok direkt hatását az osteoclastokra, a mellékhatások kialakulását, a terápia hatásosságát, az egyszeri dózisok és kezelési protokollok pontos ismeretét kell mérlegelni, mielőtt vészharangokat kongatnánk [175, 181]. Eredményeink az irodalmi adatokkal együtt alátámasztják, hogy a biszfoszfonátok kettős hatással rendelkeznek a csont remodelling folyamatában egyrészt serkentve az osteoblastok csontépítését [82, 135,], másrészt csökkentve az osteoclastok rezorpciós tevékenységét [101, 176, 177].

96

7.) ÖSSZEFOGLALÁS A nyálmirigyek szerepe a száj-nyálkahártya integritásának fenntartásában és regenerációjában. Az élet egyik princípiuma a szervezetek védelmi képessége. A bőr mellet a testfelszín másik alapvető védelmi eleme a nyálkahártya kompakt záró rétege. Az epithelium sérülése utáni gyors záródásának egyik domináns regulátor anyaga az Epidermális Növekedési Faktor (EGF) [1, 2]. 1) Vizsgálataink megerősítik, hogy a nyálmirigyek széles variációban szekretálnak EGF-t. A nyálmirigyek részleges eltávolítása (sialoadenectomia, ablatio, abláció), vagy citromsavval történő krónikus gusztatórikus ingerlés egyaránt a nyálmirigyek hypertrophiáját indukálják. A nyálmirigy abláció, jelentős mirigytömeg fokozódást vált ki a parotis mirigyben. Ugyanakkor, ablációt követően a fokozott gusztatórikus inger a parotis szöveti EGF-koncentrációját 90%-al csökkenti, mialatt a nyál EGF tartalma 20%-al emelkedik [3]. 2) Alapvető felismerés, hogy a nagynyálmirigyek eltávolítása után, a kísérleti patkányok túlélési ideje meghaladja a 90 napot, tehát a nagynyálmirigyek nagy valószínűséggel nem életfontosságú szervek. 3) A kisnyálmirigyek patkányban, pilocarpin stimulált nyálelválasztásánál kísérleti körülményeink között az összes fehérje közel 15%-át, míg amiláz esetén az összes mennyiség 1-2%-át adják és vegetatív reguláció alatt állnak. 4) A nagynyálmirigyek eltávolítása után, a kisnyálmirigyek csekély mértékű, lassan kialakuló kompenzációra képesek, a fehérje, amiláz és EGF termelése szintjén. Az eredmények azt mutatják, hogy a nagynyálmirigyek eltávolítása után is van EGF a szájüregi szekrétumban, melynek legvalószínűbb forrása a kisnyálmirigyek szétszórt rendszere. 5) Eredményeink azt sugallják, hogy új módszerünk a kisnyálmirigyek funkcionális experimentális kísérleteire alkalmazható, a nem nagynyálmirigy eredetű, szájüregbe

szekretálódó

folyadékfilm

vizsgálatára.

A

részleges

és

a

teljes

nagynyálmirigy abláció eredményeinek együttes értelmezése a kisnyálmirigy-adaptáció sajátosan új oldalát tárja fel. Egyrészt a nyálkahártyát és fogakat bevonó biofilm peptidfehérje komponensei között megtalálható az amiláz-enzim és az EGF. Másrészt hogy elválasztásukat,

szekréciójukat

pilocarpinnal

stimulálni,

illetve

e

stimulációt

Propranolollal gátolni lehet. Nagyon valószínű tehát, humán viszonylatban is, hogy

97

például baleset, tumor vagy más okozati tényező miatt, amikor a nagy-nyálmirigyek EGF termelése kiesik vagy csökken, a kismirigyek biztosítják, legalábbis részben, a nyálkahártya regenerációjához nélkülözhetetlen faktorokat [4]. Csontszövet-regeneráció analízise, egy új implantációs modellben, patkányokban A szövetregenerációs kísérleti adatok klinikai alkalmazhatósága döntően függ az adatok gyors és kvantitatív kiértékelésétől. A fogászati implantológia modellezése napjainkban is korlátozott, ezért kerestünk és dolgoztunk ki egy új modell rendszert, patkány farokcsigolyában. 1) Az új, általunk kifejlesztett farokcsigolya modell alkalmazásával kvantitatív mérhető a csontregeneráció és az implantátum osseointegrációja. Módszerünk először teszi lehetővé az újonnan képződő csont morfometriai kvalitatív és biomechanikai kvantitatív változásainak együttes elemzését, szisztémás és/vagy lokális kezelésekre. 2) A módszer alkalmazásával először mértük egy amino-biszfoszfonát (Zometa®) kvantitatív és kvalitatív stimulációs hatását csont neogenezisben és implantátum osseointegrációjában. Az általunk kifejlesztett állatkísérleti modell új adatokkal gyarapította az amino-biszfoszfonát hatást a csonthiány regenerálódásban, egyben igazolta, hogy új lehetőséget jelent szisztémás és lokális kezelési eljárások csontregenerációra gyakorolt hatásvizsgálatára [5, 6]. 3) Kísérleti munkáinknak váratlan eredménye volt, hogy a csontvelő parenchyma az összes caudális vertebrában apláziás jellegű, annak ellenére, hogy gazdagok a csontépítő és lebontó sejtekben. MEGÁLLAPÍTÁSOK:

A részleges nagynyálmirigy abláció 1) A nyálmirigyekben az EGF szekréció noradrenalin reguláció alatt áll. 2) A gl. SM + gl. SL eltávolítás nem jelenti a szekretált nyál EGF komplett eltűnését. 3) A nyálban mérhető EGF mennyisége több mint egy nyálmirigy terméke. 4) A nyál EGF fokozható a nyálmirigy aktivitás stimulálásával. 5) A gl. parotis egy alacsony szöveti pool mellett is képes fehérje és EGF szekrécióra. 6) Sérült vagy eltávolított nyálmirigy funkció kiesését a komplementer mirigy(ek) kompenzálhatják.

98

Teljes nagynyálmirigy abláció 7) Valamennyi nagy nyálmirigy eltávolítása után kísérleti patkányoknál a túlélési idő meghaladja a 90 napot, tehát a nagynyálmirigyek nagy valószínűséggel nem életfontosságú szervek. 8) A kisnyálmirigyek patkányban, pilocarpin stimulált nyálelválasztásánál az összes fehérje közel 15% -át, míg amiláz esetén az összes mennyiség 1-2% -át adják, és vegetatív reguláció alatt állnak. 9) A kisnyálmirigyek kompenzációra képesek a nagynyálmirigyek eltávolítása után, a fehérje, amiláz és EGF termelésben. Csontszövet regeneráció modellezése és patofiziológiai vizsgálatok 1) A farokcsigolya ideális mikrokörnyezetet képez csont-modifikáló anyagok preklinikai vizsgálatához, hiszen itt nem zavar a hematopoietikus rendszer. Igen kedvező lehet például a hasonló kompartment felépítésű állcsontok modellezésére, dentális implantátum osseointegrációjának vizsgálatára 2) A gyér csontvelő parenchyma a farokcsigolyákban egy olyan physiologiai alaphelyzet, mely lehetőséget ad a jelenlévő osteoblast-osteoclast környezetébe, hematopoetikus össejteket beadva, az őssejtek és osteoblastok közötti interakciók vizsgálatára. 3) Korábbi publikációk és saját, folyamatban lévő kísérleteink alapján nagy valószínűséggel

e

terület

a

pseudo-aplastikus

helyzethez

hasonló,

így

a

farokcsigolyában vizsgálható a hematopoetikus csontvelői celluláris diszreguláció, ami lényeges új információkhoz vezethet a myelodysplázia és pre-leukémiás syndróma esetében. 4)

Először mértük együttesen egy amino-biszfoszfonát (Zometa®) kvantitatív és

kvalitatív stimulációs hatását csont neogenezisben és implantátum osseointegrációjában.

99

8.) APPENDIX 8-1. Az osteoblastok és osteoklastok szerepe a hematopoiézisben A jelenlegi nézet szerint a niche funkciójában lényeges szerepet játszanak a csontépítő osteoblastok, az endotheliális sejtek, ugyanakkor más adatok szerint stimulált osteoclastok a niche destrukciójához vezetnek. Korábbiakban a 12. ábrán összefoglaltuk a jelenlegi adatokat, melyek a csontképző sejtek szerepét pontosítják a hematopoietikus őssejtek biológiai működésében. Az irodalomban jelenleg uralkodó elmélettel szemben felmerül számos ellentmondásos adat, kísérleti hiba és fiziológiai tény. Röviden: 1) az osteoblastok jelentős része a hematopoiézisre alkalmatlan robusztus, osteoblastokban dús csontokban található, 2) az őssejtek száma viszonylag elhanyagolható az osteoblastokhoz viszonyítva, 3) két, David Scadden csoportjától származó, munka ellentmondást takar, miszerint az osteoclastok “kieszik” az őssejteket az endosteumból (Osteoclasts eat stem cells out of house and home. Nat Med 2006, 12:610), ugyanakkor azt állítják hogy az őssejtek a Ca++-gradiens felé vándorolnak a Ca-sensing receptor révén (Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature 2006, 439:5), 4) az idézett munkákban a szerzők a csontsejteket vagy hormonkezeléssel (parathormon) vagy KO technikával (BMP4-R) modulálták, ugyanakkor a biológiai hatást az egész femur csontvelő parenchymában található őssejtekre nézve ítélték meg. 5) Másrészt megjegyzendő, hogy a szerzők a niche kvantitatív értékelésére nem szolgáltattak adatot. 6) Végül megemlítjük, hogy a hematopoietikus őssejtek in vitro fenntartására és kvantitatív meghatározására alkalmazott egér embrionális máj-eredetű AFT024 sztroma sejtvonal és a csontvelő eredetű MS5 sejtvonal eredeti állapotban nem mutat osteoblast markereket. 8-2. Rövid összefoglalás az implantológiai alapfogalmakról A csont regenerációjának implantátumokkal kapcsolatos kísérletes vizsgálatához ismerni kell az idevonatkozó alapfogalmakat, eljárásokat.

100

a.) Implantátum. (latin: beültetés) Az emberi vagy állati testbe beültetett mesterséges pótlás, vagy más meghatározott gyógyászati funkciójú segédeszköz. Külső borítása általában nem-testidegen, biokompatibilis anyagokból készül, ilyen például a titán és a platina. Esetenként az implantátum elektromos jeleket is kibocsát, mint a szívritmus-szabályzó (pacemaker). Beszélhetünk bioaktív implantátumokról is, ilyen a gyógyszeradagoló sztent, amelyet az aortába vagy a koszorúerekbe szoktak beépíteni. Az ortopédia területén az implantátum csontok, ízületek helyettesítésére szolgál, gyakoribb megnevezése a protézis. Beszélhetünk belső –vagyis zárt-(internal) és külső – vagyis részben zárt-(external) implantátumról, aszerint, hogy kizárólag a test belsejében, vagy bizonyos része a testen kívül is látható helyen helyezkedik-e el úgy, mint például a fogászatban a dentális implantátumok. b.) Osseointegráció. Direkt strukturális és funkcionális kapcsolat az élő csontszövet és a mesterségesen behelyezett implantátum-felület, mely általában Titán (Ti). Az orvosi csont és izületi terápiás eljárásoknál különleges fontosságú a szervezet kapcsolódása Titán-felszínéhez. Osseointegrációs teóriák: -

Dr. Per-Ingvar Brånemark - Osseointegráció [107]

-

Dr. A. Weiss - Fibro-ossealis integráció [138] Az osseointegráció Brånemark –teóriája

Brånemark volt aki 1950-ben látta meg, hogy a jól integrálódott implantátumok felszíne körül nagyon közel már csont van, nincs semmilyen kötőszövetes elem. A Titan-oxid elsődlegesen fúziót képez a csonttal. Az osseointegráció

definícióját is

ő

fogalmazta meg: 1.) Osseointegrációról beszélhetünk, ha a csont direkt kötődik vagy tapad a behelyezett alloplasztikus anyaghoz közbülső kötőszövet nélkül. 2.) Ha az endogén anyag felszíne és a befogadó csont közötti a csontosodási folyamat (és) eredménye nyilvánvalóan közvetlen kapcsolódáshoz vezet, közbülső kötőszövet nélkül. 3.) Direkt csatlakozás van az alloplasztikus anyag és a csont között. Feltételeként a gyógyulási, csontosodási periódus alatt az implantátumot nem funkcióba helyezni Weiss- fibro-ossealis integráció teóriája

101

lehet

Az implantátumfelszíne és a csont között létrejövő fibro-osseous ligamentum a behelyezett alloplasztikus anyagot megegyező módon, mint ahogy a

rögzíti

természetes

fogakat stabilizálja a periodontális ligamentum (gomphosis). Ő

mutatott ki kollagén

rostokat a csont és implantátum között és ő mutatta be, mint

egy

folyamatot az implantátum körüli ligamentumot. Ő hirdeti, az

implantátumok korai

csontosodási

megterhelésének szükségét. c.) Osseointegráció vagy Biointegráció Dr. C. de Putter vetette fel az implantátum stabilizálódásánál, rögzülésénél a

két

lehetőséget: a mechanikai és a bioaktív kapcsolódást [139]. 1) Mechanikai rögzülésnél hasonló a helyzet, mint két kemény anyag esetén – egyszerűen a csont és az implantátum (pl. titán) anyagai közötti rögzülés. Ennek kapcsán, pl. a horonyok, rücskök-gödrök, érdes felületek, csavarmenet stb. rögzítik az implantátumot. Ennél nincs kémiai kötési rögzítő-erő, és a rögzülés függ az érintkező felületek nagyságától – nagyobb felület = nagyobb rögzülés. 2) Bioaktív rögzülésnél szükséges egy bioanyag – pl.: hidroxiapatit (HA) -, vagy egyéb bioanyaggal bevont innert hordozó -pl. HA-borítású titánstift- . E bioaktív anyagok stimulálják a csontszövetépülést egy fiziko-kémia molekuláris kötési kapcsolat irányába. Az implantátum „ankylotikusan” kapcsolódik a csonthoz. d.) Osseointegrált implantátum: Különböző anyagú és formájú endosseális szerkezet (implantátum) és az őt körülvevő biológiai keményszövet-kompartment (csont) között biokémiai szintű strukturális és funkcionális egység kialakulásakor beszélhetünk osseointegrált implantátumról, a csont és implantátum között nincs más anyag. Tehát a csont-titán bioaktív rögzülése osseointegráció, de a kötőszövetek bioaktív rögzülése az implantátumhoz nem osseointegráció – vagyis nem minden kapcsolat

osseointegráció és nem minden osseointegráció

utóbbi esetben döntő az implantátum felület meghatározza a kémiai kötések kialakulását. 8-3. Biszfoszfonát hatás a csontregenerációra

102

molekuláris

bioaktív

bioaktív kapcsolat. Ez szerkezete,

mely

Miután a csontregeneráció és osseointegráció csontszöveti remodellingen keresztül történik, adódik a kérdés: a csontbetegségek széles skáláján alkalmazott biszfoszfonát kezelés hogy befolyásolja az erre a területre kidolgozott kísérleti modellünkben az osseointegrációt. Őszintén megvallva, a számos aggassztó mellékhatás esetet bemutató tanulmány alapján azt vártuk, hogy jelentősen romlik az implantátum rögzülés, kvázi ki fognak potyogni a stiftek, miközben lebomlik, szétesik a farokcsigolya! Ennek az esélynek hátterét ezért sokkal mélyebben kezdtük elemezni. Ebben a „nyomozati bűnüldöző” irodalmi munkában számos olyan adatot találtunk mely – bár túlhaladja e disszertáció keretét – mégis célszerűnek láttuk rövidítve itt közreadni. Mellesleg bízva a hozzánk közelálló fogászati szakma ez irányú fokozott érdeklődésében. 8-3.1. A biszfoszfonátok a. Bisz-foszfonátok szerkezete és általános hatása

29. Ábra: P-C-P "backbone": valamennyi biszfoszfonát gyógyszervegyület alapstruktúrája A biszfoszfonátról – szintéziséről - először 1865-ben, egy német folyóiratban számol be Menschutkin [142]. Először az iparban alkalmazták (textil, műtrágya, olaj ipar), ahol a vízkőképződés ellen használták a kalcium-karbonát kicsapódás megakadályozására. A biológiai alkalmazásához közel száz évnek kellett eltelni. Az 1960-as években folytak in vitro és in vivo kísérletek, melynek vezető egyénisége Herbert Fleisch volt, aki a kálcium homeosztázis és hydroxyapatit (HA) metabolizmust is vizsgálta [143, 144, 145], munkatársaival állatkísérleteket folytattak és bizonyították a difoszfonatok pathologiás kalcifikacióra gyakorolt gátlását [146]. Ugyancsak 1969-ben mutatták ki, hogy a pyrofoszfat gátolja a kálciumfoszfát lebontást in vitro és in vivo pedig kivédi az ectopiás kalcifikációt, de nincs hatással a normál mineralizációra és a helyi foszfatázokkal végbemenő

103

lebontásra, csontrezorpcióra. A biszfoszfonátok ezzel megegyező hatását is bizonyították [145, 146]. A 70-es évek elején számoltak be a difoszfonátok, kálcium metabolizmusra gyakorolt hatásáról [147], porc és csont kalcifikáció és rezorpció terén gyakorolt hatásáról, [148], a HA-kristályhoz való kötődés viszonyairól [149]. Humán alkalmazása először metabolikus csontbetegségeknél történt. Kezdetben azt a preventív hatását használták ki, mely a csont legfontosabb ásványi komponensének

a

hydroxylapatitnak

a

kioldódását

gátolta

és

így

a

csonttömegvesztést csökkentette. A csonttumorok lízisének gátlását Jung 1981-ben vizsgálta [150]. A különböző módon létrejövő hyperkalcémiák gátlásának alkalmazásáról Martodam munkacsoportja számolt be [151]. A pontos kémiai mechanizmust csak 1990-ben írták le [152, 153]. A molekulaszerkezet alapja két C-P kötés. Ha azonos szénatomhoz két foszfát kötődik, akkor beszélhetünk biszfoszfonátokról. Ha oxigént is tartalmaz a molekula, akkor az pyrofoszfát. A P – C – P szerkezet lehetőséget teremt a szénatomhoz számos oldallánc kötődésére. Kis változtatások a biszfoszfonát struktúrában jelentős különbségeket eredményez azok fizikokémiai, biológiai, ezen keresztül therápiás és toxikológiai karakterisztikájukban. Számos biszfoszfonát csontélettani hatását használják ki jelenleg humán csontbetegségek therápiás kezelésében. A fizikokémiai hatásra jellemző, hogy a pyrofoszfátok, bisz-foszfonátok már nagyon kis koncentrációban gátolják a Ca-foszfát kicsapódást [146], illetve e kristályok oldódását eredményezik [145]. Éppen erre vezethető vissza csontresorpciós hatásuk. Bizonyított tény, hogy in vitro a biszfoszfonátok gátolják a Ca-foszfát kristály oldódását. Erre építhetjük gondolatmenetünket, miszerint ezek az anyagok biológiai rendszerekben is működnek és képesek befolyásolni a csontrezorpciót. In vitro a bisz-foszfonátok csökkentik az embrionális csöves csontok és a neonatális koponya remodellingjét [145], valamint gátolták az osteoclastok hatását mineralizált mátrix anyagokon. In vivo képesek gátolni a csontrezorpciót, mind normál kontroll állatokban, mind a kísérleti csoportban, ahol a csontrezorpciót parathyroid hormonnal vagy retinoid származékokkal stimulálták [145]. Fejlődő patkányban a biszfoszfonátok blokkolják mind a csont mind a porc degradálódását, mind a metaphysis átépülését, melyek így radiológiai vizsgálatokban denzebb képet mutatnak a kontrollokhoz képest [149]. Ennek hátterében áll, hogy a csont Ca++ –

104

mérlegét növelik, így fokozzák a mineralizációt [148]. A biszfoszfonátok kivédik, vagy mérsékelik a számos experimentális betegség-modellben megfigyelhető csontvesztést, pl. az immobilizációs, ovarectómiás osteoporosis modell, vagy a corticosteroid kezelési modell esetében. A tumorok csontrezorpciós hatását is jó hatássfokkal gátolják mind in vitro mind in vivo [150, 151] és bizonyos körülmények

között

gátolják

a

csont-tumor

metasztázisát

[152].

Ennek

hatásmechanizmusában több tényező játszik szerepet: a biszfoszfonát csökkenti a csontpusztulást, ami limitálja a tumor-sejtek expanzióját. Szintén e hatással gátolja azt az önerősítő – tumorsejtosztódást fokozó – rendszert, mely a szövetszétesésnél felszabaduló faktorok indukálnak (pl.: transforming growth factor-TGFβ, insulinlike growth factor,) [153]. Ezen kívül in vitro a biszfoszfonátok képesek gátolni a tumorsejt kötődést a mineralizált szövetekhez [154,155]. Egy másik fontos hatásuk, hogy a tumorsejtek burjánzását is mérsékelik, a mevalonate-metebolizmus gátlása révén indukált apoptosis-on keresztül [156]. Gyógyszerkinetika (a gyári adatok alapján) A biszfoszfonátok tökéletesen felszívódnak orális úton, vagy intravénás infúzió során kerülnek a keringésbe. Kb. 50%-uk változatlan formában a vesén keresztül kiürül (ez valószínű fokozott terhet jelent a veséknek, melyeknél gyakori a kezelések közbeni probléma). A visszamaradt hányad nagyon nagy affinitással kötődik a csontszövethez, gyorsan abszorbeálódik a csontfelszínhez. 8-3.2. A biszfoszfonátok csontszöveti hatásai A biszfoszfonátok szerkezet-hatás összefüggései a csontban A számos molekula-variáns (30. ábra) nagyon széles spektrumát adja a csontszöveti reakcióknak. Az először alkalmazott molekulának, az etidronate (clodronate)–nak csontrezorpciót gátló hatását ma már több-ezerszeresre is növelték. Így csökkenteni lehet a dózist, ami az első molekula-variánsoknál igen magas – patkányban 1mg/kg/nap volt, parenterálisan – mely a mellékhatások kialakulásánál kedvezőtlen. A hatáserősségnél fontos az alifás szénlánc hossza, illetve a szén 1-es pozíciós kötőhelyén az OH-csoport. Jelentős aktivitásnövelő, az oldallánc végi amino csoport és maga az oldallánc-hossz. Nagy potencírozó hatású, a gyűrűbe vitt nitrogén atom is („risedronate”). Ezen ciklikus amino-biszfoszfonátok legaktívabb tagjai, a „minodronate” és a „zoledronate” (Zometa) (31. ábra).

105

30. Ábra: Biszfoszfonát variánsok A szerkezet-hatáserősség viszonyai: -Nem-N-tartalmú biszfoszfonátok esetén a hatásfok •

Etidronate (Didronel®) - hatáserőssége = 1 (hatás-alapérték etelon!)

•

Clodronate (Bonefos®, Loron®) – hatás10x

•

Tiludronate (Skelid®) – hatás10x

A nem N-tartalmú biszfoszfonátok a sejt ATP-oldalláncához kapcsolódnak és mivel nem képesek az energiát adó hidrolízisre a sejt energetikáját lerontják. Ennek következménye az osteoclastok apoptózisa és pusztulása, mely általánosan csökkenti a csontlebontást. -N-tartalmú biszfoszfonátok esetén a hatásfok jóval nagyobb •

Pamidronate (APD, Aredia®) – hatás100x

•

Neridronate – hatás100x

106

•

Olpadronate – hatás 500x

•

Alendronate (Fosamax®) – hatás 500x

•

Ibandronate (Boniva®) – hatás 1.000x

•

Risedronate (Actonel®) – hatás 2.000x

•

Zoledronate (Zometa®) – hatás 10.000x

A N-tartalmú biszfoszfonátok a csont metabolikus rendszerét gátolják, a Mevalonát útvonalon, ahol a farnezil difoszfát-szintáz enzimet (FPPS) blokkolják. Ez a gátlás, azt is eredményezi, hogy csökken az isoprenoid lipidek (farnezylpyrofoszfát és geranylgeranylpyrofoszfát) képződése. Az osteoclastokban a geranylgeranylpyrofoszfát csökkenés vezet az apoptózis inicializáláshoz, a sejthalálhoz.

31. Ábra: A Zoledronate (Zometa®, Novartis) tér és molekula szerkezete 8-3.3. A biszfoszfonátok csontresorpció-gátlás mechanizmusa Fiziológiás dózisban jellegzetes a biszfoszfonátok affinitása a csont-remodelling helyén, ahol a csontfelszínhez kötődve, közvetlen az osteoclastok alatt halmozódnak fel [157]. Így itt számos hatást fejtenek ki: 1-gátolják az osteoclast aktivitást, 2elősegítik az osteoclast programozott sejthalált (apoptózis) [158]. Ennek a csontturnover csökkenés lesz a következménye a csontrezorpció csökkenésen keresztül (32.ábra). Leírták az osteoclastok savtermelés csökkenését, a H+-ATPáz gátláson keresztül. Számolhatunk a lysosomalis enzimgátlással, a prosztaglandin szintézis

107

gátlásával, a

protein-tyrosin foszfatázok

gátlásával, valamint a mátrix

metalloproteináz gátlásával, és ezen hatások variálódásával.

Az első vizsgálati

eredményektől eltelt immár hosszú idő alatt, számos új kutatási eredmény és klinikai tapasztalat, megfigyelés eredményeként, igen változatossá vált a kép. A nitrogén-tartalmú biszfoszfonátok a farnezylpyrofoszfát szintáz gátlásával [159,160], bénítják a mevalonát anyagcserét [127,161]. Ez a gátlás azt is eredményezi, hogy csökken az isoprenoid lipidek (farnezylpyrofoszfát és geranylgeranylpyrofoszfát), képződése [200], amelynek révén csökken többek között a GTP-hez kapcsolódó fehérjék (Ras, Rho, Rac, és Rab) mennyisége, mely szükséges a poszt-transzlácionális prenylációhoz. Ezek a fehérjék számos sejtfunkcióhoz szükségesek, s ha zavar keletkezik aktivitásukban szerteágazó változásokat indukálnak – leginkább aktivitás csökkenést – a különböző sejttípusokban, végsőként az apoptózis révén programozott sejthalált idéznek elő. Az osteoclastokban a geranylgeranylpyrofoszfát kiesése tehető felelőssé e hatásokért [128, 159,162,] A nitrogén tartalmú biszfoszfonátok - a keményszövet mellett - egyéb sejtekre is hatást fejtenek ki. In vitro oesophagus irritációs modell kísérletekben, például gátolták a humán epidermális keratinocyta sejtek fejlődését, geranylgeranyláció és farnezilácó gátlással, viszont apoptózis indukálás nélkül [163]. Ez esetben mind az epithel sejtek, mind az osteoclastok gátlása azonos alapmechanizmussal történik. Más részről a nem nitrogén tartalmú biszfoszfonátok (etidronate, tiludronate és clodronate) – melyek közelebb állnak a pyrofoszfáthoz - nem ezen az alapmechanizmuson fejtik ki hatásukat, hanem az ATP szintézis útvonalán. A P-C-P kötések beépülnek az ATP – oldalláncába, de nem képesek hydrolizálni, amely energetikai problémát okoz a sejtnek. Az ilyen ATP-analógok gátolják a sejtfunkciókat és elősegítik az apoptózis beindulását, végül is sejthalált okoznak [164, 165]. 8-3.4. A biszfoszfonátok kalcifikációra kifejtett hatása A biszfoszfonátok mind parenterális mind per os módon preventív hatásúak a fokozott indukáltságú, különböző előfordulású kalcifikációkban. Így kedvező az artériák, vesék és a bőr kalcifikációs megbetegedéseinél [146]. Ha elegendően nagy a dózis és hatásos a biszfoszfonát variáns (pl. etidromate), akkor a normális

108

kalcifikált keményszöveteket, - mint a csont, a porc [149], vagy a dentin, zománc és cement – képes tönkretenni. A kezelés felfüggesztésével, e mellékhatások szüntethetők. Ide kapcsolhatók az orális mellékhatások, melyek speciális helyzetet teremtenek a krónikus betegek elongált biszfoszfonát kezelés alatti fogászati, szájsebészeti beavatkozásainál, dentálimplantációknál. 8-3.5. A biszfoszfonátok klinikai alkalmazása A biszfoszfonátokat a klinikumban olyan esetekben alkalmazzák, mikor fokozott a csontdestrukció, osteolísis, illetve ektópiás kalcifikáció vagy csontosodás áll a betegség hátterében: jelentős számban alkalmazzák csontrezorpció fokozódással járó kórképekben, mint pl.: a Paget kór, az osteoporosis, myeloma multiplex illetve csont-tumorok és tumor csont-metasztázisok (prostatarák, mellrák) esetén [102, 166, 167, 168, 169, 170]. Jól megválasztott protokoll esetén a csont-turnover normalizálható vele, a főleg ideg-kompressziós fájdalmak enyhíthetők, szüntethetők és sokszor hosszú ideig megmarad a hatás a kezelés megszakítása után is. Osteoporózisban (alendronate, risedronate) nem csak a leépülést gátolják, de nő a csontok mineralizáltsága és felére csökkenhet a spontán törések száma. Csonttumorok esetén alkalmazott biszfoszfonátok (pamidronate, clodronate) csökkentik a primér csontátépülést és a metasztázisokat (prostata, emlő rák) kialakulását, valamint csökkentik a tumorindukálta következményes fájdalmat. A biszfoszfonátok a

csontleépülésre

jellemző,

és

sok

esetben

kritikus

mértékre

fokozódó

hiperkalcémiát is csökkentik. Összességében javítják az életesélyt és életminőséget. Az utóbbi években számos új megállapítással, in vitro adattal gazdagodott a biszfoszfonátok ismeretanyaga. Az in vitro történések (Ca-foszfát kristály oldékonyság, osteoclast-sejtműködés, stb.) mechanizmusai viszont gyakran más módon, vagy sokkal összetettebb módon működnek in vivo. A biszfoszfonátok évi több százezres klinikai alkalmazása a terápiai hatékonyság és eredményesség mellett, szembesül a mellékhatások problémáival is, melyek a biszfoszfonát molekula-variánsoktól, dózisoktól, alkalmazási protokolloktól – és nem utolsó sorban a páciensektől - függően számos különböző támadásponton jelentkezhet. Megjelentek új kifejlesztésű nagyhatékonyságú biszfoszfonát molekula-variánsok: pl. -zolendronate (Zometa, Novartis, Basel, Switzerland) (31.ábra), -pamidronate (Aredia, Novartis), és -alendronate (Fosamax, Merck, Whitehouse Station, NJ),

109

[171]. A kezdeti formákhoz képest, ezek jobban akkumulálódnak a csontban, és nitrogén-tartalmuk révén lassabban metabolizálódnak, tartósabb hatásúak.

PreAdipocyta

MSC

PreOB

HSC

A Zameta támadási pontjai (ZT*)

Monocyta/Mac

M-CSF / c-fms RANK-L / RANK

Cbfa1 leptin

ZT*

OPG

HCO3+ Cl-

Ca2+

Ca2+

PTH PTH-R

H+CO3+

Cl-

H Cl

Osteoblast CSONT felépülés

Osteoclasts

ZT*

H+-ATPase Farnesyl-PPP

Cl- H+CO3-

APOPTÓZIS

„Bone Remodellmodellling Compartment” BRC-egység

32. Ábra: A csont-remodelling egység (BRC-U = Bone Remodelling CompartmentUnit), fő elemei és szabályozási folyamatai valamint az amino-biszfoszfonátok (Zometa) lehetséges gátló és serkentő celluláris - molekuláris célpontjai. 8-3.6. A biszfoszfonát mellékhatások Anélkül, hogy mélységébe merülnénk a mellékhatások feldolgozásának, bizonyos problémák alapvetők lehetnek, csak felsorolás szerűen: -

A per os alkalmazott biszfoszfonátok oesophagus eróziók, gyomor izgalmat és gyulladást okozhatnak. Ez a kellemetlenség főleg a N-tartalmú készítményeknél fordul elő, pedig kisebb dózisban alkalmazhatók.

-

Infúzióban adott biszfoszfonátoknál az első alkalom idején lehet láz és influenza-szerű állapot. A háttérben az aktiválódó humán γδT-lymphocyták állnak.

-

Jelentősen emeli az elektrolit zavarok rizikóját, ezért nem elég a szokványos labor ellenőrzés.

110

CSONT bontás

-

Krónikus vesebetegség kialakulás, vagy súlyosbodás mely a lassabb kiválasztás és a nagy dózisok esetén alakulhat ki.

-

Fogászati szempontból is nagyszámú, súlyos esetet közöl az irodalom biszfoszfonát kezelésekhez társuló osteonecrosis kialakulást az orális régióban [132]. Az állcsontok – mind a maxilla és mandibula - alveoláris része különösen veszélyeztetett területek, ahol a fogak, a periodontális zónával potenciális összeköttetést, inokulációs kaput jelentenek az orális mikroflórával. A mandibulán az osteonecrosisnak 2x gyakoribb az előfordulása, mint a maxillán. Főként olyan betegeken fordul elő, akik infúzióban a tumor therápiás kezelés során nagydózisokat kapnak. Az esetek 60%-ban szájsebészeti beavatkozások után alakulnak ki, melyből arra következtethetünk, hogy ezekben az esetekben, a fogászati beavatkozások erősen fokozzák az infekciót, mely az amúgy is csökkent kapacitású és túlterhelt immunrendszer következtében terjed a csontszövetre. Ha lehet, a kezelési időszakra ne tervezzünk fogászati, szájsebészeti beavatkozást, ha mégis szükséges, a minimál invazív beavatkozást válasszuk, és alkalmazzunk orális dezinficiáló szereket a beavatkozások előtt. [172].

-

Számos esetben beszámoltak a különböző csontokban, izületekben, vázizomban kialakuló fájdalmakról [173].

-

Az addig jól funkcionáló dentális implantátumok is áldozatul eshetnek a csontbetegségek során alkalmazott therápiás protokolloknak.

A probléma súlyát jelzi, hogy a világszerte jelentkező mellékhatások regisztrálására Internetes Website-okat hoztak létre. Ezek közül mutatom be a kiemelten figyelemmel kísért készítményeket, valamint az USA „Food and Drug Administration” web-oldalát és a Zometára külön készített web-oldal elérhetőségét: -Early Communication of an Ongoing Safety Review Bisphosphonates: Alendronate (Fosamax, Fosamax Plus D), Etidronate (Didronel), Ibandronate (Boniva), Pamidronate (Aredia), Risedronate (Actonel, Actonel W/Calcium), Tiludronate (Skelid), and Zoledronic acid (Reclast, Zometa) For current information on this issue, Please see http://www.fda.gov/cder/drug/infopage/bisphosphonates/default.htm

111

- Nation's Leading Legal Team, For Bisphosphonate Lawsuits - Zometa ® Side Effects Information: http://www.freewebs.com/jaw-loss-lawsuit/zometa.htm A mellékhatások súlyos következményei felvetik a kérdést, vajon a biszfoszfonátok milyen irányba befolyásolják a csontregeneráció folyamatát? Az implantátumok osseointegrációját gátolja, vagy elősegíti az osteoclastok gátlása? Megjelennek-e a mellékhatások, az egyéb therápiás kezelés nélkül is, az egészséges állatokon alkalmazott krónikus biszfoszfonát kezelés mellett? E kérdések megválaszolására kísérleti körülmények között osseointegrációs modellünkön - a nagyhatékonyságú de alkalmazásakor a klinikum felől különösen nagyszámú

mellékhatás

esetet

közölt

-nitrogéntartalmú

biszfoszfonátot,

a

zolendronátot (Zometa® - Novartis) alkalmaztuk a kísérleti módszerekben leírt 6 hetes periódusban.

112

9.) IRODALOMJEGYZÉK 1 -Fliedner TM, Flad HD, Bruch C, Calvo W, Goldmann SF, Herbst E, Hügl E, Huget R, Körbling M, Krumbacher K, Nothdurft W, Ross WM, Schnappauf HP, Steinbach I. Treatment of aplastic anemia by blood stem cell transfusion: a canine model. Haematologica, 61:141–156, 1976. 2 -Cohen S. Isolation of a Mouse Submaxillary Gland Protein Accelerating Incisor Eruption and Eyelid Opening in the New-born Animal, J. Biol. Chem, 237: 1555-1561, 1962. 3 -Cohen S, Elliott GA. The stimulation of epidermal keratinization by a protein isolated from the submaxillary gland of the mouse, J Invest Dermatol. 40:1-5, 1963. 4 -Cohen S. The stimulation of epidermal proliferation by a specific protein (EGF), Dev. BioL, 12:394-397, 1965. 5 -Fava RA, Cohen S. Isolation of a calcium-dependent 35-kilodalton substrate for the epidermal growth factor receptor/kinase from A-431 cells. J. Biol. Chem., 259:2636-2645, 1984. 6 -Silberner, Joanne. Collaborators Cohen, Levi-Montalcini win medical Nobel. (Stanley Cohen, Rita Levi-Montalcini). Copyright 1986 Science Service, Inc. Gale Group, Farmington Hills, Michigan. Science News. October 18, 1986. 7 -Blazsek J, Varga G. Secretion from minor salivary glands following ablation of the major salivary glands in rats. Arch Oral Biol, 45–48, 1999. 8 -Gorgoulis V, Giatromanolaki A, Iliopoulos A, Kanavaros P, Aninos D, Ioakeimidis D, Kontomerkos T, Karameris A. EGF and EGF-r immunoexpression in Sjögren's syndrome secondary to rheumatoid arthritis. Correlation with EBV expression ? Clinical and experimental Rheumatology, 6:623-627, 1993. 9 –Coley W B. Myositis ossificans traumatica: a report of three cases illustrating difficulties of diagnosis from sarcoma. Ann. Surg. 22: 305, 1913. 10 -Neuhof H. Fascia transplantation into visceral defects. Surg. Gynecol Obstet, 24: 383-427, 1917.

113

11 -Huggins CB. The formation of bone under the influence of epithelium of the urinary tract. Arch Surg, 22:377-408, 1931. 12 -Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science, 150:893–899, 1965. 13 -Selye H, Mahajan S, Mahajan RS. Histogenesis of experimentally induced myositis ossificans in the heart. Heart-J, 73:195-201, 1967. 14 -Selye H, Somogyi A, Mecs I. Calcergy inhibited by calciphylactic challengers. Science, 159:1361-1362, 1968. 15 -Hollinger JO, Hart CE, Hirsch SN, Lynch S, Friedlaender GE. Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor: Biology and Clinical Applications. The Journal of Bone and Joint Surgery (American), 90:48-54, 2008. 16 -Friedlaender GE, Goldberg VM (eds). Bone and Cartilage Allografts. Editors. Lippincott Williams & Wilkins ©, Inc. 2001. 17 -Das M. Epidermal growth factor: Mechanisms of action. Int Rev Cytol, 78:233256,1982. 18 -Zelles T. Purushotham KR. Macauley SP. Oxford GE. Humphreys-Beher MG. Saliva and growth factors: the fountain of youth resides in us all. J Dent Res, 74:1826-1832, 1995. 19 -Nagy A, Nagashima H, Cha S, Oxford GE, Zelles T, Peck AB, HumphreysBeher MG. Reduced Oral Wound Healing in the NOD Mouse Model for Type 1 Autoimmune Diabetes and Its Reversal by Epidermal Growth Factor Supplementation. Diabetes, 50:2100-2104, 2001. 20 -Clarke MY, Brayer J, Heintz K, Nagashima H, Cha S, Oxford GE, Nanni JM, Peck AB, Zelles T, Humphreys-Beher MG. Differential absorption and distribution of epidermal growth factor and insulin-like growth factor in diabetic NOD mice. J Diabetes Complications, 15:103-111, 2001. 21 -Byyny RL, Orth DN, Cohen S. Radioimmunoassay of epidermal growth factor. Endocrinology, 90:1261-1266, 1972. 22 -Olsen PS, Kirkegaard P, Poulsen SS, Nexo E. Adrenergic effects on exocrine secretion of rat submandibular EGF, Gut 25:1234-1240, 1984. 23 -Konturek JW, Bielanski W, Konturek SJ, Bodgal J, Olesky J. Distribution and release of epidermal growth factor in man. Gut 30:1194-1200, 1989. 24 -Thesleff I, Viinikka I, Saxen L, Lehtonen E, Perheentupa J, The parotid gland is the

114

main source of human salivary EGF. Life Sci, 43:13-18, 1988. 25 -McGurk M, Hanford L, Justice S, Metcalfe RA. The secretory characteristics of epidermal growth factor in human saliva. Arch Oral Biol, 35:653-659, 1990. 26 -Lohinai Z, Burghardt B, Zelles T, Varga G. Nitric oxide modulates salivary amylase and fluid, but not epidermal growth factor secretion in conscious rats. Life Sci, 64:953-963, 1999. 27 -Kirkegaard P, Olsen PS, Poulsen SS, Nexo E. Exocrine secretion of epidermal growth factor from Brunner`s glands. Stimulation by VIP and acetylcholine. Regul Pept, 7:367-372, 1983. 28 -Cobo J, Hernandez LC, del Valle ME, Vijande M, Vega JA. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor and its receptor during odontogenesis in the rat. Eur J Orthod, 14:333-338, 1992. 29 -Ino M, Ushiro K, Ino C, Yamashita T, Kumazawa T. Kinetics of epidermal growth factor in saliva. Acta Otolaryngol (Suppl) Stock, 500:126-130, 1993. 30 -Heitz PU, Kasper M, Noorden SV, Polak JM, Gregory H, Pearse AGE. Epidermal growth factor in the intestine. Gut 19:408-413, 1978. 31 -Hirata Y, Ucnihashi M, Nakajima M, Fujita T, Matsukura S. Presence of human EGF in human cerebrospinal fluid. J Clin Endocrinol Metab, 55:1174-1177, 1982. 32 -Hilaire J, Hradek GT, Jones AL. Hepatic sequestration and biliary secretion of epidermal growth factor: evidence for a high capacity uptake system. Proc Natl Acad Sci, 80:3797-3801, 1983. 33 -Kong W, Koldovsky O, Rao R. Absorption of rat epidermal growth factor (rEGF) from jejunum and ileum of suckling rats. Pediatr Res, 27:108A, 1990. 34 -Bergler W, Petroianu G, Metzler R. Diminution of epidermal growth factor in saliva of patients with carcinoma of the oropharynx. Acta Otorrinolaringol Esp, 43:173-175, 1992. 35 -Olsen PS, Poulsen SS, Kirkegard P, Nexo E. Role of submandibular saliva and EGF in gastric cytoprotection. Gastroenterology, 87:103-108, 1984. 36 -Tuomela T, Viinikka L, Perheentupa J. Mouse EGF contentrations are altered by gonadectomy and treatments with estradiol and progesteron. 31:143-147, 1989.

115

Horm. Res,

37 -Blazsek J, Zelles T, Tófalvy Á, Simon Gy. Compensatory enlargement of the rat parotid gland. Acta Physiol Hung, 66:314, 1985. 38 -Sarosiek J, Feng T, McCallum RW. The interrelationship between salivary epidermal growth factor the rat and the functional integrity of the esophageal mucosal barrier in. Am J Med Sci, 302:359-363, 1991. 39 -Noguchi S, Ohba Y, Oka T. Effect of salivary epidermal growth factor on wound healing of tongue in mice. Am J Physiol, 260:620-625, 1991. 40 -Purushotham KR, Zelles T, Blazsek J, Wang P, Paul GA, Kerr M, HumphreysBeher MG.Effect of EGF on rat parotid gland secretory function. Comp Biochem Physiol, 110:7-14, 1995. 41 -Gresik EW, Van der Noen H, Barka T. Epidermal growth factor-like material in rat submandibular gland. Am J Anat, 156:83-89, 1979. 42 -Byyny RL, Orth DN, Cohen S, Doyne ES. Epidermal growth factor: effects of androgens and adrenergic agents. Endocrinology, 95:776-782, 1974. 43 -Murphy RA, Pantazis NJ, Papastavros M. Epidermal growth factor and nerve growth factor in mouse saliva: a comparative study. Dev Biol, 71:356-370, 1979. 44 -Roberts ML. The in vitro secretion of epidermal growth factor by mouse submandibular salivary gland. Arch Pharmacol, 296:301-305, 1977. 45 -Kingsnorth AN, Smith P Richards RC. Epidermal growth factor in humans. Gastroenterology, 96:257, 1989. 46 -Hall HD, Schneier CA. Functional mediation of compensatory enlargement of the parotid gland. Cell Tissue Res, 184:249-254, 1977. 47 -Zelles T, Blazsek J, Kóbor A, Gelencsér F. Enlargement of the parotid gland induced by gustatory stimulus. Fogorv Szle, 77:315-318, 1984. 48 -Green DRJ, Embery G. Incorporation of inorganic[35S]-sulphate into glycoproteins of rat buccal and palatal minor salivary glands in vivo and in vitro.Archs Oral Biol, 29:335-341, 1984. 49 -Nicholas S, Redman RS.Ultrastructure of the anterior buccal gland of the rat.The anatomical record, 213:140-149, 1985. 50 -Törnvall J, Uusitalo H, Kottinen YT.The distribution and origin of nerve fibers immunoreactive for substance P and neurokinin A the anterior buccal gland of

116

the rat.Cell Tissue Res, 277:309-313, 1994. 51 -Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt Biochem, 72:248-254, 1976. 52 -Bernfeld P. Amylase, alpha and beta. Meth Enzym. 1:149-158, 1955. 53 -Booth AG, Olaniyan O, Vanderpuye OA. An improved method for the preparation of human placental syncytiotrophoblast microvilli. Placenta, 1:327-336, 1980. 54 -Simpson RJ, Smith JA, Moritz RL, O'Hare MJ, Rudland PS, Morrison JR, Lloyd CJ, Grego B, Burgess AW, Nice EC. Rat epidermal growth factor: complete amino acid sequence. Homology with the corresponding murine and human protein; isolation of a form truncated at both ends with full in vitro biological activity. Eur J Biochem,153: 629-637, 1985. 55 -Blazsek J, Offenmüller K, Burghardt B, Kisfalvi I, Birki K, Wenczl M, Varga G, Zelles T. Possible compensation in epidermal growth factor production by saliva in rat.Inflammopharmacology, 4:279-295, 1996. 56 -Schneier CA, Hall HD. Autonomic pathways involved in a sympathetic-like action of pilocarpine on salivary composition. Proc Soc Exp Biol Med, 121:96-101, 1966. 57 -Schwartz A, Shaw Jh. Studies on the effect of selective desalivation on the dental caries incidence of albino rats. J. Dent. Res, 34:239, 1955. 58 -Cheyne VD. A description of the salivary glands of the rat and a procedure for their extirpation. J Dent Res, 18:457, 1959. 59 -Alho A. Regeneration capacity of submandibular gland in rat and mouse. Acta Path Microbiol Scand, Suppl, 149, 1961. 60 -Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Ann. Rev. Biochem, 48:193-216, 1979. 61 -A. Ino M, Ushiro K, Ino C, Yamashita T, Kumazawa T. Kinetics of epidermal growth factor in saliva. Acta Otolaryngol Suppl Stockh, 500:126-130, 1993. 62 -Ema H, Morita Y, Yamazaki S, Matsubara A, Seita J, Tadokoro Y, Kondo H, Takano H, Nakauchi H.Adult mouse hematopoietic stem cells: purification and single-cell assays. Nat Protoc, 1:2979-2987, 2006.

117

63 -Weissman IL. Stem cells: Units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell, 100:157-168, 2000. 64 -Dieterlen-Lièvre F, and Martin C. Diffuse intraembryonic hemopoiesis in normal and chimeric avian development. Dev. Biol, 88:180-191, 1981. 65 -Pouget C, Gautier R, Teillet MA, Jaffredo T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development, 133:1013-1022, 2006. 66 -Medvinsky AL, Dzierzak EA. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell, 86:897-906, 1996. 67 -Taoudi S, Morrison AM, Inoue H, Gribi R, Ure J, Medvinsky. A Progressive divergence of definitive haematopoietic stem cells from the endothelial compartment does not depend on contact with the foetal liver. Development, 132:4179-4191, 2005. 68 -Tavian M, Coulombel L, Luton D, San Clemente H, Dieterlin-Lièvre F, Péault B. Aorta-associated CD34+ hemopoietic cells in the early human embryo. Blood, 87:67-75, 1996. 69 -Oberlin E, Tavian M, Blazsek I, Péault B. Blood-forming potential of vascular endothelium in the human embryo. Development, 129:4147-4158, 2002. 70 -Ema H & Nakauchi H. Expansion of hematopoietic stem cells in the developing liver of a mouse embryo. Blood, 95:2284-2288, 2000. 71 -Blazsek I, Oberlin E, Chagraoui J, Clay D, Uzan G, Péault B. Mesangiogenic niches control amplification and community development of hepato-biliary and hematopoietic stem cells into liver units. Development, (under revision), 2008. 72 -Blavier L, Delaissé JM. Matrix metalloproteinases are obligatory for the migration of preosteoclasts to the developing marrow cavity of primitive long bones. J Cell Sci, 108:3649-3659, 1995. 73 -Blazsek I, Chagraoui J, Péault B. Ontogenic emergence of the hematon, a morphogenic stromal unit that supports multipotential hemopoietic progenitors in mouse bone marrow. Blood, 96:3763-3771, 2000. 74 -Wolf NS, Trentin JJ. Hemopoietic colony studies. V. Effect of hematopoietic organ stroma on hematopoiesis. Blood, 90:2300-2311, 1968. 75 –Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the

118

haematopoietic stem cell. A hypothesis. Blood Cells, 4:7-25, 1978. 76 -Lajtha LG. Haemopoietic stem cells. Br J Haematol, 29:529, 1975. 77 -Adams GB, Chabner KT, Alley IR, Olson DP, Szczepiokowski ZM, Poznansky MC, Kos CH, Pollak MR, Brown EM, Scadden DT. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature, 439:599603, 2006. 78 -Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, Weber JM, Olson DP, Knight MC, Martin RP, Schipani E, Divieti P, Bringhurst FR, Milner LA, Kronenberg HM, Scadden D. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature, 425:841-846, 2003. 79 – Watt FM, Hogan BL. Out of Eden: stem cells and their niches. Science, 287:1427-1430, 2000. 80 -Arai F, Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, Ito K, Koh GY, Suda T. Tie/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell, 118:149-161, 2004. 81 -Haylock DN, Williams B, Johnston HM, Liu MC, Rutherford KE, Whitty GA, Simmons PJ, Bertoncello I, Nilsson SK. Hemopoietic stem cells with higher hemopoietic potential reside at the bone marrow endosteum. Stem Cells, 25:1062-1069, 2007. 82 -Tauchmanová L, Ricci P, Serio B, Lombardi G, Colao A, Rotoli B, Selleri C. Shortterm Zoledronic acid treatment increases bone mineral density and marrow clonogenic fibroblast progenitors after allogeneic stem cell transplantation. J Clin Endocrinol Metab, 90:627-634, 2005. 83 -Avecilla ST, Hattori K, Heissig B, Tejada R, Liao F, Shido K, Jin DK, Dias S, Zhang F, Hartman TE, Hackett NR, Crystal RG, Witte L, Hicklin DJ, Bohlen P, Eaton D, Lyden D, deSauvage F, Rafii S. Chemokine-mediated interaction of hematopoietic progenitors with the bone marrow vascular niche is required for thrombopoiesis. Nat Med, 10:64-71, 2004. 84 -Naresh KN, Lampert I, Haserjian R, Lykiis D, Elerfiel K, Horncastle D, Smith N, Murray-Brown W, Stamp GW. Optimal processing of bone marrow trephine biopsy: the Hammersmith protocol. J Clin Pathol, 59:903-911, 2006. 85 -Kaufman MH. The Atlas of Mouse Development. Academic Press, Harcourt Brace

119

& Company, London 1992. 86 -Charman J, Reid L. The Effect of Decalcifying Fluids on the Staining of Epithelial Mucins By Alcian Blue. Biotechnic and Histochemistry, 47:173-178,1972. 87 -von Kossa J, (1901), in Beitr. Path. The von Kossa reaction for calcium deposits: silver lactate staining increases sensitivity and reduces background. In The Histochemical Journal Springer Netherlands, 1573-6865,1993. 88 -Ploemacher RE, van der Sluijs JP, Voerman JS,Brons NHC. An in vitro limitingdilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood, 74:2755-2763, 1990. 89 -Eaves AC, Barnett MJ, Ponchio L, Cashman JD, Petzer AL, Eaves CJ. Stem Cells, 16:77–83, 1998. 90 -Wellik DM, Capecchi MR. Hox10 and Hox11 Genes Are Required to Globally Pattern the Mammalian Skeleton. Science, 301:363-367, 2003. 91 -Rawat VPS, Cusan M, Deshpande A, Hiddemann W, Q-Martinez L, Humphries RK, Bohlander SK, F-Buske M and Buske C. Ectopic expression of the homeobox gene Cdx2 is the transforming event in a mouse model of t(12;13)(p13;q12) acute myeloid leukemia. PNAS, 101:817-822, 2004. 92 -Ducy P, Schinke T, Karsenty G. The osteoblast: a sophisticated fibroblast under central surveillance. Science, 289:1501-1504, 2000. 93 -Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science, 289:1504-1508, 2000. 94 -Skillington J, Choy L, Derynck R. Bone morphogenetic protein and retinoic acid signalling cooperate to induce osteoblast differentiation of preadipocytes. J Cell Biol, 159:135-146, 2002. 95 -Ichida F, Nishimura R, Hata K, Matsubara T, Ikeda F, Hisada K, Yatani H, Cao X, Komori T, Yamaguchi A, Yoneda T. Reciprocal roles of Msx2 in regulation of osteoblast and adipocyte differentiation. J Biol Chem, 279:34015-34022, 2004. 96 -Hauge EM, Ovesel D, Eriksen EF, Mosekilde L, Melsen F. Cancellous bone remodeling occurs in specialized compartments lined by cells expressing osteoblastic markers. J Bone Miner Res, 16:1575-1582, 2001. 97 -Eriksen EF, Eghbali-Fatourechi GZ, Khosla S. Remodeling and vascular spaces in bone. J Bone Miner Res, 22:1-6, 2007. 98 -Kim JB, Leucht P, Luppen CA, Park YJ, Beggs HE, Damsky CH, Helms JA.

120

Reconciling the roles of FAK in osteoblast differentiation, osteoclast remodeling, and bone regeneration. Bone, 41:39-51, 2007. 99 -Zaidi M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Med, 13:791-798, 2007. 100 -Guise TA, Yin JJ, Taylor SD, Kumagai Y, Dallas M, Boyce BF, Yoneda T, Mundy GR. Evidence for a causal role of parathyroid hormone-related protein in the pathogenesis of human breast cancer-mediated osteolysis. J Clin Invest, 98:1544-1549, 1996. 101 -Rodan GA, Martin TJ. Therapeutic approaches to bone diseases. Science, 289:1508-1514, 2000. 102 -Boissier S, Ferreras M, Peyruchaud O. Bisphosphonates inhibit breast and prostate carcinoma cell invasion, an early event in the formation of bone metastases. Cancer Res, 60:2949–2954, 2000. 103 -Michaelson MD, Smith MR. Bisphosphonates for treatment and prevention of bone metastases. J Clin Oncol, 23:8219-8223, 2005. 104 -Zhao Z, Wang Z, Ge C, Krebsbach P, Franceschi RT. Healing cranial defects with AdRunx2-transduced marrow stromal cells. J Dent Res, 86:1207-1211, 2007. 105 -Laino G, d'Aquino R, Graziano A, Lanza V, Carinci F, Naro F, Pirozzi G, Papaccio G. A new population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res, 20:1394-1402, 2005. 106 -Ohazama A, Modino SA, Miletich I, Sharpe PT. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res, 83:518-522, 2004. 107 -Bränemark PI, Breine U, Lindstrom J. Intra-osseous anchorage of dental prostheses, I. Experimental studies. Scand J Plast Reconstr Surg, 3:81–100, 1969. 108 -Bränemark PI, Zarb GA, Albrektsson T. Tissue-Integrated Prostheses In: Osseointegration in Clinical Dentistry, Quintessence, Chicago, p211-232, 1985. 109 -Anderson HC, Marker PC, Fogh J. Formation of tumors containing bone after intramuscular injection of transformed human amnion cells (FL) into cortisonetreated mice. Am J Pathol, 54:507–513, 1964. 110 -Nevins M, Kirker-Head C, Nevins M. Bone formation in the goat maxillary

121

sinus induced by absorbable collagen sponge implants impregnated with bone morphogenetic protein-2. Int J Periodontics Restorative Dent, 16:9–19, 1996. 111 -Howell TH, Fiorellini J, Jones A. A feasibility study evaluating rhBMP2/absorbable collagen sponge device for local alveolar ridge preservation or augmentation. Int J Periodont Rest Dent, 17:125–139, 1997. 112 -Boyne PJ, Marx RE, Nevins M. A feasibility study evaluating rhBMP2/absorbable collagen sponge for maxillary sinus floor augmentation. Int J Periodontics Restorative Den, 17:11–25, 1997. 113 -Takatis DN, Wikesjo UM, Razi SS. Periodontal repair in dogs: effect of transforming growth factor-beta 1 on alveolar bone and cementum regeneration. J Clin Periodontol, 27:698–704, 2000. 114 -Wang EA, Rosen V, D’Alessandro JS. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA, 87:2220–2224, 1990. 115 -Wozney JM. The bone morphogenetic protein family and osteogenesis. Mol Reprod Dev, 32:160–167, 1992. 116 -Sellers RS, Peluso D, and Morris EA.The Effect of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) on the Healing of Full-Thickness Defects of Articular Cartilage J Bone and Joint Surg, 79:1452-1463, 1997. 117 -Celeste AJ, Song JJ, Cox K. Bone morphogenetic protein-9, a new member of the TGF-[beta] superfamily. J Bone Miner Res, 9:136, 1994. 118 -Boyne PJ. Reconstruction of discontinuity mandibular defects in rhesus monkeys using rhBMP-2. J Oral Maxillofac Surg, 53:92, 1995. 119 -Toriumi DM, Kotler HS, Luxenberg DP. Mandibular reconstruction with a recombinant bone-inducing factor. Functional, histologic and biomechanical evaluation. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 117:1101–1112, 1991. 120 -Thorarinn, Sigurdsson J. Bone morphogenetic protein-2 for peri-implant bone regeneration in osseointegration. Clin Oral Implants Res, 8:367–374, 1997. 121 -Bentz H, Thompson AY, Armstrong R. Transforming growth factor-beta 2 enhances the osteoinductive activity of a bovine-bone-derived fraction containing bone morphogenetic protein-2 and 3. Matrix, 11:269–275, 1991.

122

122 -Burchardt H. Biology of bone transplantation. Orthop Clin North Am, 18:187–195, 1987. 123 -Friedlander G. Current concepts review. Bone grafts: the basic science rationale for clinical applications. J Bone Joint Surg, 69:786, 1987. 124 -Lundborg G, Besjakov J, Bränemark PI. Osseointegrated wrist-joint prosthesis: a 15-year follow-up with focus on bony fixation. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg, 41:130-137, 2007. 125 -Evans EA, Calderwood DA. Forces and bond dynamics in cell adhesion. Science, 316:1148-1153, 2007. 126 -Wang DA, Varghese S, Sharma B, Strehin I, Fermanian S, Gorham J, Fairbrother H, Cascio B, Elisseeff JH. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nature Materials, 6:385-392, 2007. 127 -Luckman SP, Coxon FP, Ebetino FH, Russell RGG, Rogers MG. Heterocyclecontaining bisphosphonates cause apoptosis and inhibit bone resorption by preventing protein prenylation: evidence from structure-activity relationships in J774 macrophages. J Bone Miner Res,13:1668–1678, 1998. 128 -Fisher JE, Rogers MJ, Halasy JM, Luckman SP, Hughes DE, Masarachia PJ, Wesolowski G, Reszka AA. Alendronate mechanism of action: Geranylgeraniol, an intermediate in the mevalonate pathway, prevents inhibition of osteoclast formation, bone resorption, and kinase activation in vitro. Proc Nat Acad Sci USA, 96:133-138, 1999. 129 -Van Beek E, Lowik C, Van Der Pluijm G, Papapoulos S. The role of geranylgeranylation in bone resorption and its suppression by bisphosphonates in fetal bone explants in vitro: A clue to the mechanism of action of nitrogencontaining bisphosphonates. J Bone Mineral Res, 14:722-729, 1999. 130 -Lee YP, Schwarz EM, Davies M. Use of zoledronate to treat osteoblastic versus osteolytic lesions in a severe-combined-immunodeficient mouse model. Cancer Res, 62:5564–5570, 2002. 131 -Merigo E, Manfredi M, Meleti M, Corradi D, Vescovi P. Jaw bone necrosis without previous dental extractions associated with the use of bisphosphonates (pamidronate and zoledronate). J Oral Pathol, 34:613-614, 2005. 132 -Farrugia MC, Summerlin DJ, Krowiak E, Huntley T, Freeman S, Borrowdale R,

123

Tomich C. Osteonecrosis of the mandible or maxilla associated with the use of new generation bisphosphonates. Laryngoscope, 116:115-120, 2006. 133 -Khosla S, Burr D, Cauley J, Dempster DW, Ebeling PR, Felsenberg D, Gagel RF, Gilsanz V, Guise T, Koka S, McCauley LK, McGowan J, McKee MD, Mohla S, Pendrys DG, Raisz LG, Ruggiero SL, Shafer DM, Shum L, Silverman SL, Van Poznak CH, Watts N, Woo SB, Shane E. Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw: report of a task force of the American Society for Bone and Mineral Research. J Bone Miner Res, 22:1479-1491, 2007. 134 -Reinholz GG, Getz B, Pederson L, Sanders ES, Subramaniam M, Ingle JN, Spelsberg

TC.

Bisphosphonates

directly

regulate

cell

proliferation,

differentiation, and gene expression in human osteoblasts. Cancer Res, 60:60016007, 2000. 135 -Fromigué O, Body JJ. Bisphosphonates influence the proliferation and maturation of normal human osteoblasts. J Endocrinol Invest, 25:539-546, 2002. 136 -Von Knoch F, Jaquiery C, Kowalsky M, Schaeren S, Alabre C, Martin I, Rubash HE, Shanbhag AS. Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells. Biomaterials, 34:69416949, 2005. 137 -Ysander M, Branemark R, Olmarker K, Myers RR. Intramedullary osseointegration: development of a rodent model and study of histology and neuropeptide changes around titanium implants. J Rehabilit Res Dev, 38:183190, 2001. 138 -Weiss CM. Fibro-osteal and osteal integration: a comparative analysis of blade and fixture type dental implants supported by clinical trials. J Dent Educ, 52:706711, 1988. 139 -De Lange GL, De Putter C, De Groot K. Histology of the attachment of gingival fibres to dental root implants of Ca-hydroxyapatite. Biomater. Biochem, 5:452– 462, 1983. 140 -Flautner, Sárvári. A sebészet és traumatológia tankönyve Semmelweis Kiadó, Budapest, 2003. 141 -Roberts WE. Bone tissue interface. J. Oral, Implantol, 14:217-228, 1988. 142 -Menschutkin M. Ueber die Einwirkung des Chloracetyls auf phosphorige Säure.

124

Ann Chem Pharm, 133:317–320, 1865. 143 -Fleisch H, Russell RGG, Straumann F. Effect of pyrophosphate on hydroxyapatite and its implications in calcium homeostasis. Nature (London), 212:901–903, 1966. 144 -Fleisch H, Russell RGG, Bisaz S, Casey P, Mühlbauer R. The influence of pyrophosphate analogues (diphosphonates) on the precipitation and dissolution of calcium phosphate in vitro and in vivo. Calcif Tissue Res, 2(suppl):10–10a, 1968. 145 -Fleisch H, Russell RGG, Francis MD. Diphosphonates inhibit hydroxyapatite dissolution in vitro and bone resorption in tissue culture and in vivo. Science,165:1262–1264,1969. 146 -Francis MD, Russell RGG, Fleisch H. Diphosphonates inhibit formation of calcium phosphate crystals in vitro and pathological calcification in vivo. Science, 165:1264–1266, 1969. 147 -Gasser AB, Morgan DB, Fleisch HA, Richelle LJ. The influence of two diphosphonates on calcium metabolism in the rat. Clin Sci, 43:31–45, 1972. 148 -Schenk R, Merz WA, Mühlbauer R, Russell RGG, Fleisch H. Effect of ethane-1hydroxy-1,1-diphosphonate (EHDP) and dichloromethylene diphosphonate (Cl2MDP) on the calcification and resorption of cartilage and bone in the tibial epiphysis and metaphysis of rats. Calcif Tissue Res, 11:196–214, 1973. 149 -Jung A, Bisaz S, Fleisch H. The binding of pyrophosphate and two diphosphonates by hydroxyapatite crystals. Calcif Tissue Res, 11:269–280, 1973. 150 -Jung A, Mermillod B, Barras C, Baud M, Courvoisier B. Inhibition by two diphosphonates of bone lysis in tumor conditioned media. Cancer Res, 41:3233– 3237, 1981. 151 -Martodam RR, Thornton KS, Sica DA, d'Souza F, Flora L, Mundy GR. The effects of dichloromethylene diphosphonate on hypercalcemia and other parameters of the humoral hyper-calcemia of malignancy in the rat Leydig cell tumor. Calcif Tissue Int, 35:512–519, 1983. 152 -Sasaki A, Boyce BF, Story B, Wright KR, Chapman M, Boyce R, Mundy GR, Yoneda T. Bisphosphonate risedronate reduces metastatic human breast cancer burden in bone in nude mice. Cancer Res, 55:3551–3557, 1995.

125

153 -Mundy GR, Yoneda T. Facilitation and suppression of bone metastasis. Clin Orthop Relat Res, 312:34–44,1995. 154 -Van der Pluijm G, Vloedraven H, van Beek E, van der Wee-Pals L, Löwik C, Papapoulos S. Bisphosphonates inhibit the adhesion of breast cancer cells to bone matrices in vitro.J Clin Invest, 98:698–705, 1996. 155 -Boissier S, Magnetto S, Frappart L, Cuzin B, Ebetino FH, Delmas PD, Clezardin P. Bisphophonates inhibit prostate and breast carcinoma cell adhesion to unmineralized

and

mineralized

bone

extracellular

matrixes.

Cancer

Res,57:3890–3894,1997. 156 -Shipman CM, Croucher PI, Russell RGG, Hlfrich MH, Rogers MJ. The bisphosphonate incadronate (YM175) causes apoptosis of human myeloma cells in vitro by inhibiting the mevalonate pathway. Cancer Res, 58:5294–5297, 1998. 157 -Masarachia P, Weinreb M, Balena R, Rodan GA. Comparison of the distribution of 3H--alendronate and 3H-etidronate in rat and mouse bones. Bone, 19:281– 290, 1996. 158 -Hughes DE, Wright KR, Uy HL, Sasaki A, Yoneda T, Roodman GD, Mundy GR, Boyce BF. Bisphosphonates promote apoptosis in murine osteoclasts in vitro and in vivo. J Bone Miner Res, 10:1478–1487, 1995. 159 -Van Beek E, Löwik C, van der Pluijm G, Papapoulos S. The role of geranylgeranylation in bone resorption and its suppression by bisphosphonates in fetal bone explants in vitro: a clue to the mechanism of action of nitrogencontaining bisphosphonates. J Bone Miner Res, 14:722–729, 1999. 160 -Bergstrom JD, Bostedor RG, Masarachia PJ, Rewszka AA, Rodan GA. Alendronate is a specific, nanomolar inhibitor of farnesyl diphosphate synthase. Arch Biochem Biophys, 373:231–241, 2000. 161 -Luckman SP, Hughes DE, Coxon FP, Russell RGG, Rogers MG. Nitrogencontaining bisphosphonates inhibit the mevalonate pathway and prevent posttranslational prenylation of GTP-binding proteins, including Ras. J Bone Mineral Res, 13:581–589, 1998. 162 -Dunford JE, Thompson K, Coxon FP, Luckman SP, Hahn FM, Poulter CD,

126

Ebetino FH, Rogers MJ. Structure-activity relationships for inhibition of farnesyl diphosphate synthase in vitro and inhibition of bone resorption in vivo by nitrogen-containing bisphosphonátes. J Pharmacol Exper Ther, 296:235–242, 2001. 163 -Reszka AA, Halasy-Nagy J, Rodan GA. Nitrogen-bisphosphonates block retinoblastoma phosphorylation and cell growth by inhibiting the cholesterol biosynthetic pathway in a keratinocyte model for esophageal irritation. Mol Pharmacol, 59:193–202, 2001. 164 -Rogers MJ, Brown RG, Hodkin V, Russell RGG, Watts DJ. Bis-phosphonates are incorporated into adenine nucleotides by human aminoacyl-trna synthetase enzymes. Biochem Biophys Res Commun, 224:863–869, 1996. 165 -Frith JC, Mönkkönen J, Blackburn GM, Russell RGG, Rogers MJ. Clodronate and liposome-encapsulated clodronate are metabolised to a toxic ATP analog, adenosine 5' (β,γ-dichloromethylene)triphosphate, by mammalian cells in vitro. J Bone Miner Res, 12:1358–1367, 1997. 166 -Fleisch H. Bisphosphonates in Bone Disease From the Laboratory to the Patient New York: Academic Press, 2000. 167 - Hillner BE, Ingle JN, Berenson JR. American Society of Clinical Oncology Bisphosphonates Expert Panel. American Society of Clinical Oncology guideline on the role of bisphosphonates in breast cancer. J Clin Oncol, 18:1378–1391, 2000. 168 -Drake WM, Kendler DL, Brown JP. Consensus statement on the modern therapy of Paget's disease of bone from a Western Osteoporosis Alliance symposium. Biannual Foothills Meeting on Osteoporosis, Calgary, Alberta, Canada, September 9–10, 2000.Clin Ther, 23:620–626, 2001. 169 -Berenson JR, Hillner BE, Kyle RA. American Society of Clinical Oncology Bisphosponates Expert Panel. American Society of Clinical Oncology clinical practice guidelines: the role of bisphosphonates in multiple myeloma. J Clin Oncol, 20:3719-3736, 2002. 170 -Berenson JR. Recommendations for zoledronic acid treatment of patients with bone metastases. Oncologist, 10:52–62, 2005. 171 -Conte P, Guarneri V. Safety of intravenous and oral bisphosphonates and

127

compliance with dosing regimens. Oncologist, 9:28–37, 2004. 172 -Woo S, Hellstein J, Kalmar J. "Narrative [corrected] review: bisphosphonates and osteonecrosis of the jaws.". Ann Intern Med, 144: 753-761, 2006. 173 -Wysowski D, Chang J. Alendronate and risedronate: reports of severe bone, joint, and muscle pain. Arch Intern Med, 165:346-347, 2005. 174 -Saulacic N, Iizuka T, Martin MS, Garcia AG. Alveolar distraction osteogenesis: a systematic review. Int J Oral Maxillofac Surg, 37:1-7, 2008. 175 -Hashimoto T, Shigetomi M, Ohno T, Matsunaga T, Muramatsu K, Tanaka H, Sugiyama T,Taguchi T. Sequential treatment with intermittent low-dose human parathyroid hormone (1-34) and biszfoszfonáte enhances large-size skeletal reconstruction by vascularized bone transplantation. Calcif Tissue Int, 81:232239, 2007. 176 -Mundy GR, Yoneda T, and Hiraga T. Preclinical studies with zoledronic acid and other bisphosphonates: Impact on the bone microenvironment. Semin Oncol, 28:35-44, 2001. 177 -Sato M, Grasser W, Endo N, Akins R, Simmons H, Thompson DD, Golub E, Rodan GA. Biszfoszfonáte action. Alendronate localization in rat bone and effects on osteoclast ultrastructure. J Clin Invest, 88:2095-2105, 1991. 178 -Coxon FP, Helfrich MH, Van't Hof R. Protein geranylgeranylation is required for osteoclast formation, function, and survival: Inhibition by bisphosphonates and GGTI-298. J Bone Miner Res, 15:1467–1476, 2000. 179 -Amital H, Applbaum YH, Vasiliev L, Rubinow A. Hypertrophic pulmonary osteoarthropathy: control of pain and symptoms with pamidronate. Clin Rheumatol, 23:330-332, 2004. 180 -Chapurlat RD, Hugueny P, Delmas PD, Meunier PJ. Treatment of fibrous dysplasia of bone with intravenous pamidronate: long-term effectiveness and evaluation of predictors of response to treatment. Bone, 35:235-242, 2004. 181 -Amant N, McDonald M, Godfrey C, Bilston L, Little D. Optimal timing of a single dose of zoledronic acid to increase strength in rat fracture repair. J Bone Miner Res, 22:867-876, 2007. 182 -Blazsek I, Goldschmidt E, MachoverD, Misset JL, Benavides M, Comisso M,

128

Ceresi E, Canon C, Labat ML, Mathe G. Excess of lympho-reticular cell complexes in the bone marrow linked to T cell mediated dysmyelopoiesis. Biomed Pharmacother, 40:28-32, 1986. 183 -Epling-Burnette PK, Painter JS, Rollison DE, Ku E, Vendron D, Widen R, Boulware D, Zou JX, Bai F, List AF. Prevalence and clinical association of clonal T-cell expansion in Myelodysplastic Syndrome. Leukemia, 21:659-667, 2007. 184 -Ohmura E, Emoto N, Tsushima T, Watanabe S,Takeyuchi T, Shigemoto M, Shimuze K. Salivary immunreactive human epidermal growth factor (IR-hEGF) in patiens with peptic ulcer disease. Hepato-Gastroenterol, 34:160-163, 1987. 185 -Maccini DM, Veit BC. Salivary epidermal growth factor in patients with and without acid peptic disease. Am J Gastroenterol, 85:1102-1104, 1990. 186 -Hirasawa Y, Asaki S, Hongo M, Ohara S, Shibuya D, Yamaguchi N, Matsuda K, Toyota T. Salivary epidermal growth factor in patients with peptic ulcer. Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi, 88:1043-1050, 1991. 187 -Gray MR, Donnelly RJ, Kingsnorth AN. Role of salivary epidermal growth factor in the pathogenesis of Barrett's columnar lined oesophagus. Br J Surg, 78:14611466, 1991. 188 -Kirkegaard P, Skov Olsen P, Poulsen SS, Nexo E. Epidermal growth factor inhibits cysteamine-induced duodenal ulcers. Gastroenterology, 85:1277-1283, 1983. 189 -Royce LS, Baum BJ. Physiologic levels of salivary epidermal growth factor stimulate migration of an oral epithelial cell line. Biochim Biophys Acta, 1092:401-403, 1991. 190 -Siminoski K, Bernanke J, Murphy RA. Nerve growth factor and epidermal growth factor in mouse submandibular glands: identical diurnal changes and rates of secretagogue- induced synthesis.Endocrinology, 132:2031-2037, 1993. 191 -Dutta SK, Orestes M, Vengulekur S, Kwo P. Ethanol and human saliva: effect of chronic alcoholism on flow rate, composition, and epidermal growth factor. Am J Gastroenterol, 87:350-354, 1992. 192 -Hensten-Pettersen A. Some chemical characteristics of human minor salivary gland secretions.Acta-Odontol-Scand, 34:13-22, 1976.

129

193 -Eliasson L, Birkhed D, Heyden G, Strömberg N. Studies on human minor salivary gland secretions using the periotron method. Arc oral Biol, 41:1179-1182, 1996. 194 -Ferguson DB. The flow rate and composition of human labial gland saliva. Arc. of Oral Biology, 44:11, 1999. 195 -Boros I, Keszler P, Zelles T. Study of saliva secretion and the salivary fluoride concentration of the human minor labial glands by a new method. Arc. of Oral Biology, 44:59, 1999. 196 -Johnson DA, Cortez JE. Chronic treatment with beta adrenergic agonists and antagonists alters the composition of proteins in rat parotid saliva.J-Dent Res, 67:1103-1108, 1988. 197 -Humphreys-Beher MG, Zelles T, Maeda N, Purushotham KR, Cassisi N, Schneyer CA. Cell-surface galactosyltransferase acts as a modulator of rat and human acinar cell proliferation.Adv-Dent-Res, 4:45-60, 1990. 198 -Zelles T, Blazsek J, Kelemen É. A pilocarpin hatékonyságának elemzése a xerostomia kezelésében.Fogorvosi Szemle, 83:319-331, 1990. 199 -Kiel MJ, Yilmaz ÖH, Iwashita T, Yilmaz OH, Terhorst C & Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell, 121:1109-1121, 2005. 200 -James RA. Connective tissue-dentalimplant interface. J. Oral, Implantol, 13:607615, 1988. 201 -Shubayev VI, Bränemark R, Steinauer J, Myers RR. Titanium implants induce expression of matrix metalloproteases in bone during osseointegration. J Rehab Res Dev, 41:757-766, 2004. 202 -Van Beek E, Pieterman E, Cohen L, Löwik C, Papapoulos S. Farnesyl pyrophosphate synthase is the molecular target of nitrogen-containing bisphosphonates. Biochem

Biophys Res Commun, 264:108–111, 1999.

203 -Blazsek J, Dobó Nagy Cs, Blazsek I, Varga R, Vecsei B, Fejérdy P, Varga G. Amino-bisphosphonate stimulates bone regeneration and enforces consolidation of titanium implant into a new rat caudal vertebrae model. Pathology and Oncology Research, 2008 (in press). 204 -Blazsek I, Clay D, Blazsek J, Pierre-Louis O, Leclerc P, Le Bousse-Kerdilès MC,

130

Uzan G. Haematopoietic stem cell niches are complex, self-organizing, topological units providing autonomy and tissue robustness. Letter to Nature/2008. (közlés alatt) 10.) PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE In extenso közlemények folyóiratokban és proceedings kötetekben, 1972-2008 időszak publikációi:

kummulált IF: 10,756

10-1. Saját Közlemények

IF: 2,281

10-1.1. A disszertáció tárgykörében megjelent elsőszerzős dolgozatok -Blazsek J., Offenmüller K., Burghardt B., Kisfalvi I., Birki K., Wenczl M., Varga G., Zelles T. Possible compensation in epidermal growth factor production by saliva in rat Inflammopharmacology, 4:279-295, 1996.

IF: —

-Blazsek J., Varga G.: Secretion from minor salivary glands following ablation of the major salivary glands in rats Archives of Oral Biology 44:45-48, 1999.

IF: 1,04

-Blazsek J, Dobó Nagy Cs, Blazsek I, Varga R, Vecsei B, Fejérdy P and Varga G. Amino-bisphosphonate stimulates bone regeneration and enforces consolidation of titanium implant into a new rat caudal vertebrae model. Pathology and Oncology Research, 2008 (in press). IF: 1,241

10-1.2. Egyéb tárgykörben megjelent elsőszerzős dolgozatok -Blazsek J., Zelles T., Boros I., Vaskó A., Tankovics G.: Density distribution of secretory granules in the rat parotid gland Saliva and Salivation (Ed.T.Zelles), Pergamon Press-Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 159-166. 1981.

IF: —

-Blazsek J., Offenmüller K., Zelles T., Humphreys-Beher M.: Galactosyltransferase immunológiai módszerekkel történő kimutatásához alkalmazható antitestek előállítása Fogorv.Szle., 83:329-334, 1990.

IF: —

10-2. Társ Közlemények

IF: 8,475

131

10-2.1 A disszertáció tárgykörében megjelent társszerzős dolgozatok -Zelles T., Blazsek J., Kóbor A., Gelencsér F.: A glandula parotis gusztatórikus ingerrel létrehozott megnagyobbodása Fogorvosi Szle., 77:315-318, 1984.

IF: —

-Zelles T. Blazsek J., Kelemen É.:A pilocarpin hatékonyságának elemzése a xerostomia kezelésében Fogorv.Szle., 83:319-331, 1990.

IF: —

-Seok-Woo Lee, Purushotham K.R., Littlewood T., Evan G., Zelles T., Blazsek J., Yoichi Nakagawa and Humphreys-Beher M.G.: Down-regulation of cellular proto-oncogenes during inhibition of rat parotid acinar cell proliferation Biochim. Biophys. Acta, 1135:115-122, 1992.

IF: 2,610

-Purushotham K.R., Zelles T., Blazsek J., Pao-Li Wang, Paul G.A., Kerr M., Humphreys-Beher M.: Effect of EGF on rat parotid gland secretory function Comp. Biochem. Physiol 110C:7-14, 1995.

IF: 0,865

-Purushotham K.R., Offenmüller K., Bui A.T., Zelles T., Blazsek J. Schultz G.S., Humphreys-Beher M.G.: Absorption of epidermal growth factor occurs through the gastrointestinal tract and oral cavity in adult rats Am.J.Physiol., 269:867-873, 1995.

IF: 3,244

-Blazsek I, Clay D, Blazsek J, Pierre-Louis O, Leclerc P, Le Bousse-Kerdilès MC and Uzan G. Haematopoietic stem cell niches are complex, self-organizing, topological units providing autonomy and tissue robustness. Letter to Nature/2008. (közlés alatt)

10-2.2. Egyéb tárgykörben megjelent társszerzős dolgozatok -Boros I., Zelles T., Keszler P., Vaskó A., Blazsek J.: Osmotic pressure as a presumable factor influencing the zymogen granules in the parotid gland of rats Saliva and Salivation (Ed.T.Zelles), Pergamon Press- Akadémiai Kiadó, Budapest, pp.177-189, 1981.

IF: —

-Keszler P., Boros I., Zelles T., Blazsek J.: Preparation of zymogen granules with gel filtration: Distribution of amylase and carbonic anhydrase activity following "linear-discrete" density gradient centrifugation Saliva and Salivation (Ed.T.Zelles), Pergamon Press- Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 167-176, 1981.

IF: —

132

-Zelles T., Keszler P., Boros I., Blazsek J.: Amylase synthesis in the parotid gland of cortisone treated rats. Saliva and Salivation (Ed.T.Zelles), Pergamon Press- Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 249-255, 1981.

IF: —

-Zelles T., Blazsek J., Tófalvi Á., Végh A.: A ß-receptor blokkoló Visken hatása a gl. parotisának súlyára, valamint az elválasztott nyál mennyiségére és amiláz aktivátására Fogorvosi Szle., 77:346-348, 1984.

IF: —

-Zelles T., Blazsek J., Tófalvi Á., Póchs E.: The ultrastructure and secretory activity of rat parotid gland in experimental mucopolysaccharidosis Berichte der Humboldt Universität, Berlin, 14:19-23, 1985. IF: — -Zelles T., Blazsek J., Tófalvi Á.: Effects of suramin a trypanocidal drug on the rat parotid gland Zahn-Mund-Kieferheilkd., 74:683-690, 1986.

IF: —

-Purushotham K.R., Pao -Li Wang, Dolce C., Zelles T., Blazsek J., Humphreys-Beher M.G.: Effects of surgical ovariectomy on rat salivary gland function Arch. Oral Biol., 38:779-784, 1993.

IF: 0.972

-Purushotham K.R., Blazsek J., Humphreys-Beher M.G., Zelles T.: Cholecystokinin modulates isoproterenol induced changes in rat parotid gland Comp. Biochem. Physiol.,C 106: 249-254, 1993.

IF: 0.784

-Nagy G., Blazsek J., Bánóczy J. Sándor M. Fogorvostan-hallgatók és fogorvosok dohányzási szokásai Magyarországon A Magyar Fogorvos különszáma: Szájüregi daganatok, 4:279-295, 2003. IF: —

10-3. Könyv - könyvfejezet, jegyzet, jegyzet-fejezet: -Blazsek J.,: Rágás és nyelés Orálbiológiai Jegyzet Fogorvostanhallgatók részére, Szerk: Zelles T., Budapest, SOTE, FOK. pp. 195213, 1987.

IF: —

-Blazsek J.,: Rágás és nyelés Orálbiológia tankönyv, Szerk: Zelles T., Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest, 23. fejezet, 223-236, 2007.

IF: —

10-4. Elöadás absztraktok

Absztrakt kummulált IF: 28,092

133

Előadások melyek absztraktjai folyóiratokban és proceedings kötetekben jelentek meg. Az impakt faktorok tájékoztató jelleggel kerültek feltüntetésre. 10-4.1. A disszertáció tárgykörében elhangzott előadások a.) Elsőszerzős előadások -Blazsek J., Zelles T., Selmeci L., Tófalvi Á., Kulcsár Á.: Compensatory Hypertrophy of the Hyperfunctioning Rat Parotid Gland Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 63:304-305 (Abs.), 1984.

IF: 0.354

-Blazsek J., Zelles T., Tófalvi Á., Simon Gy.: Compensatory Enlargement of the Rat Parotid Gland Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 66:314-315 (Abs.), 1985.

IF: 0.359

b.) Társszerzős előadások -Zelles T., Blazsek J., Boros I., Keszler P., Kulcsár Á., Tófalvy Á.: Secretory Response of the Rat Parotid After Compensatory-Hyperfunctional Enlargement Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 63:395 (Abs.), 1984.

IF: 0,354

-Purushotham K.R., Offenmüller K., Bui A.T., Zelles T., Blazsek J., Humphreys-Beher M.G. Sublingual absorption of Epidermal Growth Factor (EGF) in the rat J.Dent.Res., 74:568 (Abs.), 1995.

IF: 3,810

-Offenmüller K., Blazsek J., Gyovai B., Szöllősi K., Zelles T., Examination of the epidermal growth factor level of saliva in healthy and dental implant provided patients Advances in Dental Research vol.13:189, 1999.

IF -

-Zelles T., Varga G., Blazsek J., Gresz V., Nagy Á., Humphreys-Beher M.: Chronic gustatory stimulation: a model for parotid hypertrophy in rats. J. dent. Res., 80:618 (Abs.), 2001.

IF: 3,350

10-5. Egyéb tárgykörben elhangzott előadások 10-5.1. Elsőszerzős előadások -Blazsek J.: Mitochondrion-secretory granule complexes (MSGC) in parotid acinar cells in rats J.Dent.Res.77:851 (Abs.), 1998.

IF:4,060

10-5.2. Társszerzős előadások -Boros I., Mózsik Gy, Keszler P., Zelles T., Blazsek J.: Amylase Activity and cAMP Level in the Parotid Gland of Rats Following F- Ingestion

134

Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 63:308 (Abs.), 1984.

IF: 0,354

-Bullis D., Zelles T., Keszler P., Boros I., Blazsek J. and Cutler L. S.: Effect of Chronic Cortisone Treatment on Secretion by Rat Salivary Glands IF: 2,276

J. Dent. Res., 63:210 (Abs.), 1984.

-Gintner Z., Zelles T., Blazsek J., Sülle T., Bródy A.: Animal Model for Producing Hepatogenic Sialosis in the Rat Parotid Gland by Carbon Tetrahydrochloride Treatment Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 63:329 (Abs.), 1984.

IF: 0,354

-Zelles T., Fazekas Á., Posch E., Tófalvy Á. and Blazsek J.: Effect of Body Temperature on Blood Flow in the Salivary Glands J. Dent. Res., 65:783 (Abs.), 1986.

IF: 2,533

-Purushotham K., Blazsek J., Humphreys-Beher M. and Zelles T.: Cholecystokinin Effects on Amylase Secretion in Rat Parotid J. Dent. Res., 72:648 (Abs.), 1992.

IF: 3,019

-Zelles T., Varga G., Blazsek J.: Soya feedind induces parotid hypertrophy in rats J.Dent.Res., 74:444 ( Abs.), 1995.

IF: 3,810

-Zelles T., Varga G., Blazsek J., Gresz V., Offenmüller K.: Does cholecystokinin have a direct trophic effect on the parotid gland? J.Dent. Res., 76:344 (Abs), 1997

IF: 3,459

135

11.) KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

PhD dolgozatom az orálbiológia két alapvető területén nyert közel húsz éves időszak kísérleti eredményeiből foglaltam össze, melyeket nagyrészt Zelles Tivadar Professzor, másrészt Varga Gábor Professzor vezetése mellett, közös útkeresések, tanácsok, segítségek, támogatások, baráti tusák hátterével végezhettem, melyért nem elegendő kifejezés az egyszerű köszönet és hála. Köszönettel és hálával tartozom az Orálbiológiai Tanszék valamennyi beosztású, jelenlegi és volt munkatársának segítő szeretetéért, készséges, odaadó és önzetlen együttműködéséért. Hasonlóan köszönet a Kórélettani Intézetben és a Fogorvosi Klinikákon végzett munkák lehetőségéért, a munkatársak segítő együttműködésért. Köszönöm testvérbátyámnak Blazsek Istvánnak, hogy kézen fogott és az atyai forrásból induló természetszeretetem kezdeti lépéseitől mostanáig terelgető őrömnek, tudományos mesteremnek tudhatom. Hálával tartozom a sorsnak, hogy együtt lehettem, okulhattam és még dolgozhattam is – sajnos már közülünk távozott – olyan tudósokkal, mint Hársing László professzor Úr és a floridai Michael Humphreys Beher professzor Úr. Köszönet az Egyetem és a Fogorvosi Kar Vezetésének, hogy bizonyos módon rendhagyó egyetemi tevékenységem mögé állt. Köszönöm édesanyámnak, hogy megélhettem a mindenek felett álló szeretetet, az immár csak égi felhőket festő édesapámnak és nővéremnek a természet szépségére nevelést, szeretteimnek és szerelmeimnek, hogy az élet csodáival mind újabb és újabb oldaláról ismerkedhetem meg.

136