A környezet hatása embrionális neuroektodermális őssejtek fejlődésére: implantációs vizsgálatok egy idegi őssejtvonallal Doktori értekezés
dr. Zádori Anita
Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Madarász Emília tudományos tanácsadó, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Komoly Sámuel egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Bereczki Dániel egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nagy M. György, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Tárnok Krisztián, egyetemi adjunktus, PhD
Budapest 2010
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ......................................................................................................................... 2 Rövidítések ................................................................................................................................. 4 Bevezetés .................................................................................................................................... 6 A felnőttkori neurogenezis és idegi őssejtek ........................................................................... 6 Sejtvesztéssel járó központi idegrendszeri betegségek gyógyítási lehetőségei ..................... 20 Az oxigén szerepe az agyi mikrokörnyezetben és hatásai az őssejtek elköteleződésére.................................................................................................................. 21 A sejtbeültetés terápiás hatásai központi idegrendszeri kórképekben ................................ 23 Az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal és alklónjai ......................................................... 29 Célkitűzések ............................................................................................................................. 33 Módszerek ................................................................................................................................ 34 A. Sejtes kísérletek ............................................................................................................... 34 Az NE-4C idegi őssejtvonal és alklónjai ............................................................................ 34 Implantált, agyszövetben növekedő GFP-4C sejtek izolálása a gazdaszövetből ............... 34 Primer asztroglia tenyészetek ............................................................................................. 35 Glióma- és glioblasztómavonalak ...................................................................................... 35 A sejtvonalak fenntartása.................................................................................................... 36 Az őssejtek in vitro neuronális indukciója retinsavval ....................................................... 36 Az őssejtek in vitro neuronális indukciója asztroglia ko-kultúrában ................................. 36 A sejtek által termelt szolubilis faktorok vizsgálata ........................................................... 37 A sejtek hipoxiás kezelése .................................................................................................. 37 A sejt-aggregáció vizsgálatai .............................................................................................. 38 A sejtproliferáció mérése .................................................................................................... 38 Kromoszómaszám-meghatározás ....................................................................................... 39 Életképesség-mérés ............................................................................................................ 39 RT-PCR .............................................................................................................................. 40 B. Állatkísérletek.................................................................................................................. 41 Felhasznált állatfajok és törzsek ......................................................................................... 41 Altatás ................................................................................................................................. 41 Fagyasztásos lézió .............................................................................................................. 41 Sejtbeültetés ........................................................................................................................ 42 Hiperbárikus oxigén terápia alkalmazása ........................................................................... 42 Viselkedésvizsgálatok ........................................................................................................ 44 C. A preparátumok feldolgozása .......................................................................................... 45 Fixálás, metszés .................................................................................................................. 45 TUNEL-reakció .................................................................................................................. 46 Immuncitokémiai festések .................................................................................................. 46 Mikroszkópos kiértékelés ................................................................................................... 48 Statisztikai próbák .............................................................................................................. 48
2
Eredmények .............................................................................................................................. 49 I. NE-4C sejtek „sorsa” intakt és sérült felnőtt agyi környezetben ....................................... 49 I.1 NE-4C sejtek fagyasztással sértett agykérgi területeken............................................... 49 I.2 Az NE-4C sejtek kölcsönhatása tumorsejtekkel .......................................................... 57 II. In vitro előindukált GFP-4C sejtek „sorsa” intakt és sértett agyi környezetben .............. 65 III. Változó oxigén-ellátottság hatásai az NE-4C sejtekre .................................................... 70 III.1 Az NE-4C őssejtek „viselkedése” hipoxiás környezetben ......................................... 70 III.2 Az NE-4C őssejtek intracerebralis „sorsa” magas in vivo oxigén tenzió mellett ...... 78 Megbeszélés.............................................................................................................................. 87 Következtetések ........................................................................................................................ 99 Összefoglalás .......................................................................................................................... 101 Summary................................................................................................................................. 102 Irodalomjegyzék ..................................................................................................................... 103 Saját publikációk jegyzéke ..................................................................................................... 126 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 127
3
Rövidítések ATCC – American Type Culture Collection AVE – anterior viszcerális entoderma BDNF – agyi neurotrófikus faktor, brain derived neurotrophic factor blbp – brain lipid-binding protein BMP – csont morfogén fehérje, bone morphogenetic protein Br – egérkoponyán Bregma és szaggitális varrat metszéspontja BrdU – 5-bromo-3‟-deoxiuridin c-myc – celluláris proto-onkogén CD133 – őssejt marker, cluster of differentiation 133 CNTF – sugártestizom neurotrófikus faktor, ciliary neurotrophic factor CSPG – kondroitin-szulfát proteoglikán, chondroitin sulfate proteoglycan DMEM – Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium ECM – extracelluláris mátrix EDTA – etiléndiamin-tetraecetsav EGF – epidermális növekedési faktor, epidermal growth factor EGL – external germinal/granule layer: kisagyi külső germinatív réteg ES – embrionális őssejt, embryonic stem cell EZ – ependimális zóna FACS – fluorszcens jel aktivált sejtválogatás, fluorescent activated cell sorting FCS – fötális borjúsavó, foetal calf serum FGF – fibroblaszt növekedési faktor, fibroblast growth factor GABA – gamma-amino vajsav, gammaaminobutyric acid GCL – granuláris sejtréteg, granule cell layer GD – gyrus dentatus GDNF – glia sejtvonal eredetű neurotrófikus faktor, glial cell linederived neurotrophic factor
GFAP – gliális fibrilláris savas fehérje, glial fibrillary acidic protein (e)GFP – (felerősített) zöld fluoreszcens fehérje, (enhanced) green fluorescent protein GFP-RC – agyból „visszatenyésztett” GFP-4C sejtvonal, GFP-Recultured HBO(T) – túlnyomásos oxigén (kezelés), hyperbaric oxygen (therapy) hc – hippocampus HE – hematoxilin-eozin HIF – hipoxia (által) indukálható faktor, hypoxia-inducible factor hnf-4 – hepatocita nukleáris faktor-4 gén HPRT – hipoxantin-guanin foszforibozil-transzferáz, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase HSPG – heparán-szulfát proteoglikán, heparan sulfate proteoglycan ICP – intracraniális nyomás, intracranial pressure IFN – interferon IL – interleukin iPSC – indukált pluripotens őssejt, induced pluripotent stem cell KM – kondícionált médium lacZ – béta-galaktozidáz enzim génje LIF – leukémia inhibítoros faktor, leukemia inhibitory factor MAG – myelin-asszociált glikoprotein, MEM – minimum essential medium (tápoldat) MHC – major hisztokompatibilitási komplex MTT – 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromid NBOT – normobaric oxygen therapy, normál nyomású oxigénkezelés NeuN – idegsejtspecifikus sejtmagfehérje, Neuronal nuclei NF – neurofilament
4
NG-2 – oligodendroglia prekurzor sejtek által termelt kondroitin-szulfát proteoglikán NGF – idegnövekedési faktor, nerve growth factor ngn-2 – neurogenin-2 gén Nogo – neurit kinövést gátló fehérje, neurit outgrowth inhibitory protein NSE – neuron specifikus enoláz NT – neurotrofin Nurr-1 – sejtmagi receptorhoz kapcsolódó fehérje 1, nuclear receptor-related protein 1 Oct-4 – octamer 4, transzkripciós faktor OD – optikai denzitás Olig2 – oligodendrocita vonal transzkripciós faktor 2, Oligodendrocyte lineage transcription factor 2 OMGp – oligodendrocita myelin glikoprotein, oligodendrocyte myelin glycoprotein p53 – sejtciklus-szabályozó fehérje PBS – foszfát pufferelt sóoldat, phosphate buffered saline PC12 – phaeochromocytoma sejtvonal PEDF – pigment-epitélium eredetű faktor, pigment epithelium-derived factor PFA – paraformaldehid PLAP – placentális alkalikus foszfatáz, placental alkaline phosphatase PSA-NCAM – polisziálsavas neurális sejtadhéziós molekula, polysialic acid neural cell adhesion molecule
RA – retinsav, retinoic acid RG – radiális glia RMS – rosztrális migrációs ösvény, rostral migratory stream ROS – reaktív oxigéngyökök, reactive oxygen species SEZ – szubependimális zóna SGZ/SGL –szubgranuláris zóna, subgranular zone/layer Shh – Sonic hedgehog, szekretált morfogén fehérje Sox – Sry-related HMG box (gén / traszkripciós faktor) SSEA – állapot-specifikus embrionális antigén, stage-specific embryonic antigen SV40 – Simian Vacuolating Virus 40 SVZ – szubventriculáris zóna, subventricular zone TGF – transzformáló növekedési faktor, transforming growth factor TNF – tumor nekrózis faktor, tumor necrosis factor TUNEL – Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling VEGF – érendotél növekedési faktor, vascular endothelial growth factor VZ – ventrikuláris zóna Wnt – szekretált morfogén-család / kódoló gének
5
Bevezetés A felnőttkori neurogenezis és idegi őssejtek Számos központi idegrendszeri kórkép létezik, amelyek maradandó károsodással, romló életminőséggel járnak. A kórképek mögött eltérő pathofiziológiai állapotok állnak, amelyekről egyre többet tudunk, de a gyógyításuk a legritkább esetben megoldott. Egyéb szervek, szervrendszerek kóros állapotaival ellentétben a központi idegrendszer sérüléseinek, betegségeinek gyógyítása azért jelent különösen nagy kihívást, mert a központi idegrendszer minimális regenerációs képességénél fogva a nagyobb definitív károsodásokat helyrehozni nem képes. Új idegsejtek a károsodásokat követően igen kis számban képződnek, új funkcionális hálózatok pedig csak ritkán szerveződnek. Az idegtudomány meghatározó Ramon y Cajal-i dogmája, miszerint a felnőtt központi idegrendszerben idegsejtképzés és érdemi regeneráció nincs, egészen az 1980-as évekig tartotta magát. Cajal „Degeneration and Regeneration in the Nervous System‟ c. könyvének
mondatai
szerint
(1928)
„a
fejlődés
lezárultával
az
axon-
és
dendritnövekedés és regeneráció forrásai végérvényesen elapadnak. A felnőtt agyi idegpályák végleges, megváltoztathatatlan, rögzített struktúrák. Minden elpusztulhat, de semmi sem születhet újjá.” Kortársait megelőzve, szerény eszköztárral Cajal a központi és perifériás idegrendszeri degeneráció, és -regeneráció tárgykörében kulcsfontosságú felismeréseket tett (1. ábra).
1. ábra Illusztráció Ramon y Cajal anyanyelvén 1913-ban, angolul 1928-ban megjelent könyvéből. Cajal az idegsérülést követő regenerációs folyamatokat több aspektusból részletesen megvizsgálta (Lobato 2008). Az ábrákon különböző körülmények között végzett idegátmetszést követő axonnövekedési folyamatok láthatók.
Az 1900-as években történtek az első kísérletek, amelyek igazolták, hogy a felnőtt központi idegszövetben új sejtek születnek. Évtizedekig a [3H]-timidin beépülés
6
technikájával bizonyították az új sejtek létrejöttét az agy több régiójában (Allen 1912), de ezek identitását nem tudták megállapítani. Az 1960-as években Altman és munkatársai – autoradiográfiás és hisztológiai módszerekkel - több tanulmányban kimutatták rágcsáló hippocampusban, anterior előagyban és bulbus olfactoriusban új idegsejteknek vélt- sejtek képződését (Altman és Das 1965). Az ‟70-es és ‟80-as években Kaplan és társainak elektronmikroszkópos vizsgálatai megerősítették, hogy a keletkező sejtek között neuron morfológiájú, szinaptikus bemenetekkel, idegi sejtnyúlványokkal rendelkező idegsejtek vannak mind a bulbus olfactoriusban, mind a hippocampus gyrus dentatusában (Kaplan és Hinds 1977). A neuron-specifikus immuncitokémiai festések hiánya, a pusztán morfológiai kritériumok alapján történő sejttipizálás miatt ezeket az eredményeket nem fogadták el széles körben. Nottebohm és munkatársai a ‟80-as években leírták, hogy felnőtt hím kanárimadarakban hormonális kezelés hatására illetve szezonális jelleggel is aktiválódnak neurogén folyamatok, amelyek a madarak dallamtanulását segítik. Az új idegsejtek a felső hangképző centrumba épülnek be, funkcionálisan aktívak, szezonálisan elpusztuló idegsejteket helyettesítenek (Goldman és Nottebohm 1983, Kirn és mtsai 1994). Az ezt követő intenzív kutatómunka, új technikák (éretlen és érett idegsejteket azonosító immunjelölések; BrdU-technika) alkalmazásával megerősítette a felnőtt neurogenezis tényét, emlős (rágcsáló, főemlős és humán) agyi mintákon (Cameron és mtsai 1993, Gould és mtsai 1999a, Eriksson és mtsai 1998). Pontosan feltérképezték a felnőtt agyban zajló neurogenezis régióit, a képződő idegi progenitorok vándorlási útvonalait, végső elhelyezkedésüket, a kialakuló új neuronok típusait. Az idegi őssejtek, mint minden őssejt, önmegújításra és önmaguktól eltérő utódsejt létrehozására is képesek. Ezt szimmetrikus és aszimmetrikus osztódás révén érik el. Míg szimmetrikus mitózis esetén két identikus utódsejt keletkezik, aszimmetrikus osztódásnál a keletkező sejtek eltérőek, az egyik őssejt, a másik elköteleződő, a differenciálódás útjára lépő utódsejt. Osztódás során meghatározó tényező a sejtek – a központi idegrendszerben a neuroepitheliális őssejtek/radiális gliasejtek - apico-basalis polarizáltsága. Osztódási síktól függően az utódsejtekben eltérő lehet bizonyos kulcsfontosságú citoplazmatikus faktorok és membránkomponensek eloszlása, ebből következik a sejtek eltérő génexpressziós mintázata és gyökeresen eltérő sorsa
7
aszimmetrikus osztódás esetén. Az osztódási folyamatok szabályozó tényezői között felismerték a mitotikus orsó orientációjának fontosságát, illetve az ún. SNARE (szolubilis N-ethylmaleimide-érzékeny fúziós fehérjéhez kötődő protein receptor) integráns membránproteinek fontos szerepét, amelyek a citokinezis során történő plazmamembrán-fúziót szabályozzák (Götz és Huttner 2005). A szabályozó folyamatok azonban részletekbe menően még nem ismertek. Az őssejtek osztódóképességüket megőrzik az egyed élete során. Az osztódások közt eltelt idő jelentősen változhat az osztódás G0-G1 fázisainak hosszúságától függően. Az őssejtek különböző típusai két vagy több sejttípus létrehozására képesek. Ettől függően nevezzük őket omni- vagy totipotensnek, pluripotensnek, multipotensnek vagy bipotensnek. Az omnipotens őssejtek az embrió morula stádiumát jellemzik, a szedercsírából izolált sejtek képesek az egész embriót extraembrionális függelékekkel együtt létrehozni. A pluripotens embrionális őssejtek az embrió hólyagcsíra stádiumából, a belső sejtcsomóból (inner cell mass) izolálhatók. Megfelelő körülmények között mindhárom csíralemez sejtjeit létrehozhatják
sejtkultúrában,
illetve
élőlénybe
visszaültetve.
Szaporításuk
és
fenntartásuk viszonylag egyszerű. Használatukat korlátozza, hogy komoly etikai kérdéseket vet fel az embrionális őssejtvonalak létesítése, különös tekintettel a humán vonalakra. Az embrió fejlődése során az őssejtek fejlődési potenciálja fokozatosan szűkül. Kialakulnak a magzati, majd posztnatális multipotens szöveti őssejtek, amelyekről ma azt tartjuk, hogy elsősorban a gazdaszövet sejttípusainak létrehozására képesek. A fejlődő, majd kifejlett organizmus különböző szerveinek körülírt részein, vagy elszórva rejtőznek. Izolálásuk, kultúrában való fenntartásuk általában az embrionális őssejtekénél bonyolultabb feladat, néhány típus azonban viszonylag egyszerűen hozzáférhető (pl. hemopoetikus őssejtek). A kifejlett élőlény szöveti plaszticitásának alapját képezik. Speciális körülmények között képesek lehetnek más szövetek sejttípusainak létrehozására is. Az őssejtek utódsejtjeinek nevezéktanát nem használják konzekvensen. Az őssejtekből kialakuló sokszorozó, gyorsan osztódó sejtpopulációt
progenitorsejteknek,
az
ezekből
kifejlődő
posztmitotikus,
elköteleződő sejteket prekurzoroknak nevezem dolgozatomban (2. ábra).
8
már
2. ábra Az őssejtek leszármazási sora
A központi idegrendszer sejtjeinek eredete; a germinatív zónák Az idegrendszer fejlődése az embrió gasztrulációjával egyidőben kezdődik el. Gasztruláció során az addig két sejtrétegű (epi- és hypoblast) embriópajzsban a sejtek egy része az embrió középvonalában a két réteg közé vándorol, így az embriópajzs három rétegűvé válik (ekto-, meso- és entoderma) és kialakul a hosszanti elhelyezkedésű primitív csík. A primitív csík elülső végén lévő Hensen-csomó organizátor régióként szerepel a fejlődés során, akárcsak az embrió elülső szélén kialakuló anterior viszcerális entoderma (AVE). A kettő között az epiblaszt velőlemezzé alakul. A mélybe vándorló sejtek a középvonalban létrehozzák a gerinchúrt (dorzális középvonali mezoderma), a gerinchúr felett húzódó primitív neuroektodermában pedig megkezdődik az idegi árok, majd az idegcső kialakulása. A neuruláció „defaultfolyamat”, azaz abban az esetben megy végbe, ha az organizátor régiókban felszabaduló morfogének (activin, BMP) gátló hatása nem érvényesül. A morfogének jelenléte térben és időben is pontosan szabályozza a neuruláció folyamatát. A pre-neurális (gli, zic, sox2) gének az AVE FGF-8 termelése következtében már a primitív ideglemez kialakulásakor aktiválódnak. A neuroektoderma a neuruláció során megvastagszik, hengerhámmá alakul. A sejtek gyors osztódásával kialakul az idegi árok, amely a későbbiekben velőcsővé záródik. A velőcsőből fejlődik ki a központi idegrendszer szinte minden sejtje, míg a cső két oldalán maradó vékony neuroektoderma csíkokból (velőlécek) alakulnak ki a perifériás idegrendszer alkotóelemei. A velőcső bazális, aláris- és tetőlemezében eltérő
9
morfogének (elsősorban Shh, Wnt) hatásai érvényesülnek a mezo- és epidermális ektodermától, valamint az organizátorként működő fenéklemeztől (notoplate) való távolság függvényében. Ennek megfelelően a velőcső különböző ventro-dorzális pozícióban elhelyezkedő sejtjei különböző későbbi sejt-fenotípusok kialakítására „szakosodnak”. A velőcső antero-posterior tagolódásával alakulnak ki az elsődleges agyhólyagok, a prosencephalon, a mesencephalon és a rhomboencephalon. Az embrionális fejlődés során a velőcső üreget határoló sejtrétegének neuroepitheliális sejtjei alakítják ki a központi idegrendszer primer germinatív zónáját, a ventrikuláris zónát (VZ). A primer germinatív réteg embrionális idegi őssejtjei neuroektodermális sejtsorsra kötelezettek, aszimmetrikus és szimmetrikus mitózisra képesek. A korai embrionális fejlődés során, utódsejtjeik osztódóképességüket elvesztő, az üregi felszíntől eltávolodó posztmitotikus idegi prekurzor sejtekké, majd neuronokká alakulnak. A prenatális egyedfejlődés során a zónából korán kivándorló idegsejtelőalakok nagy sejttestű, hosszú nyúlvánnyal bíró idegsejteket (nagy vetítő neuronokat), a később kilépő idegsejt-előalakok egyre kisebb sejttestű, rövidebb nyúlványú neuronokat (kis vetítő idegsejteket, majd interneuronokat) képeznek. Pasko Rakic a ‟70-es években leírta az ún. radiális gliasejtek (RG) jelenlétét a ventrikuláris zónában (1971). Ez a sejttípus a neuroepitheliális őssejtek egy jellegzetes funkcionális állapota lehet, amelyre jellemző, hogy belőle a primer neurogenezis folyamán sokszorozó progenitorsejteken át, vagy közvetlenül prekurzorokat kialakítva idegsejtek és később asztoglia- és oligodendroglia-sejtek is fejlődnek. A radiális gliasejtek a velőcső kamrai és piális felszíne között hidat képezve segítik az idegsejtelőalakok vándorlását a kamrafelszín felől a piális felszín felé (radiális migráció). A radiális gliasejtjek leszármazottai azonban a szekunder germinatív réteg szöveti őssejtjei is [3. ábra](Merkle és mtsai 2004).
10
3. ábra A neuroepitheliális őssejtek ontogenetikus fejlődése Alvarez-Buylla és mtsai (2001) alapján módosítva
A primer germinatív réteg fokozatosan (a brachiális régiótól előre és hátrafelé is meghatározott késéssel) az agykamrákat határoló kuboid epitheliális határsejtjekké, ún. ependimasejtekké alakul át, idegsejtképző aktivitását elveszíti. Az előagyhólyagok ventromediális és ventrolaterális részén elhelyezkedő gangliondombok mentén az ependima-sejtréteg alatt másodlagos germinatív régió, a szubventrikuláris zóna (SVZ) alakul ki, amelynek őssejtjei felnőtt agyban is az idegsejtképzés egyik forrását jelentik. A felnőtt korban is folyamatosan sejteket képző szubventrikuláris zóna az előagyi oldalsó agykamrák striatummal határos területén található (4. ábra). Sérülés hatására azonban a teljes kamrafal hosszában történhet sejtképződés az ependimaréteg mentén végighúzódó; potenciális germinatív zónában (1. táblázat).
4. ábra A szubventrikuláris zóna lokalizációja rágcsálóagy frontális metszetének sematikus ábráján. Chiasson és mtsai (1999) alapján módosítva. Ctx: agykéreg, cc: corpus callosum, LV: oldalkamra, str: striatum, sep: septum.
11
A felnőtt szubventrikuláris zónában található őssejtek gliális fibrilláris savas fehérjét (GFAP-t) expresszáló, gliaszerű sejtek (Doetsch és mtsai 1999). Belőlük sokszorozó progenitorok, posztmitotikus idegsejt prekurzorok, vagy gliális sejtalakok alakulhatnak ki. Az eddigi vizsgálatok tanúságai alapján a felnőtt központi idegrendszerben elsősorban gátló interneuronokat, a szaglógumó pótlandó idegsejtjeit, asztrogliasejteket és oligodendroglia prekurzorokat képezhetnek. Neurogén régióként, ún. harmadlagos germinatív zónaként írták le (Altman és Bayer 1990a, b) a hippocampus gyrus dentatusának szubgranuláris zónáját (SGZ). Emellett a kisagy területén azonosítottak egy peri- és korai posztnatális időszakban jelenlévő külső germinatív réteget (külső granuláris réteg, EGL) (Fujita 1967), amelyet a rhomboid árok negyedik agykamrával szomszédos részéből tangencionális vándorlással a felszínre növő progenitorsejtek alkotnak, és amelyből a kisagyi szemcsesejtek származnak. Ponti és kutatótársai (2008) szerint nyulakban pubertás- és felnőttkorban is megfigyelhető a kisagyban idegi progenitorsejt-képzés, amelynek forrása korai időszakban a külső granuláris rétegből létrejövő szubpiális réteg, később pedig feltehetően a kisagy molekuláris rétege. Egyes szerzők (Gould és mtsai 1999b, Zhao és mtsai 2003) a célterületekhez közeli szubependimális területekről származó új neuronok beépülését leírták mind az emlős substantia nigra-ban, mind a neocortex asszociációs kérgi régiójában; ezek az eredmények azonban megerősítésre várnak.
1. táblázat (13. oldal) Neurogenezis központi idegrendszeri károsodásokban Rövidítések: Hvt. – hivatkozások, nv – nem vizsgálták, LPS – lipopoliszacharid, 6-OH dopamin - 6hidroxi-dopamin, MPTP - 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, G93A-SOD1 - glicinalanin szubsztitúció a citoszolban lévő Cu, Zn-szuperoxid diszmutázban, APP – amiloid prekurzor protein, il – ipsilateralis, SVZ – szubventrikuláris zóna, SGZ – szubgranuláris zóna, RMS – rosztrális migrációs ösvény, bulb. olf. – szaglógumó, cc – corpus callosum, SEZ – szubependimális zóna, EZ – ependimális zóna, hc – hippocampus, fá – fehérállomány, GCL – granuláris sejtréteg, GD – gyrus dentatus, régióspec. – régióspecifikus. Az irodalmi adatok szerint nem egyértelmű, vagy nem kellőképpen bizonyított adatokat kérdőjelesen tüntettük fel. Hivatkozások: [1] Arvidsson és mtsai 2002; [2] Arvidsson és mtsai 2001; [3] Jin és mtsai 2001; [4] Jin és mtsai 2003; [5] Jiang és mtsai 2001; [6] Yamashita és mtsai 2006; [7] Gu és mtsai 2000; [8] Magavi és mtsai 2000; [9] Jin és mtsai 2006; [10] Grimaldi és Rossi 2006; [11] Picard-Riera és mtsai 2002; [12] Ekdahl és mtsai 2003; [13] Ke és mtsai 2006; [14] Rice és mtsai 2003; [15] Urrea és mtsai 2007; [16] Sun és mtsai 2007; [17] Chi és mtsai 2006; [18] Curtis és mtsai 2003; [19] Jin és mtsai 2004a; [20] Jin és mtsai 2004b; [21] Sharp és mtsai 2002; [22] Schmidt és Reymann 2002; [23] Parent és mtsai 2002; [24] Parent és mtsai 1997; [25] Aponso és mtsai 2008; [26] Baker és mtsai 2004; [27] Mao és mtsai 2001; [28] Freundlieb és mtsai 2006.
12
A károsodás típusa
Fokális tranziens agyi ischaemia (a. cerebri media elzárás)
Fototrombotikus stroke Célzott agykérgi apoptózis Ischaemia-s stroke
Faj
patkány
egér patkány egér humán
Purkinje sejt degeneráció (cerebellum toxikus lézió)
patkány
Kísérletes autoimmun encephalomyelitis
egér
LPS-indukált agykérgi gyulladás
patkány
Gerincvelő-sérülés (thoracolumbalis kompresszió)
egér
Detektált sejtproliferáció il SVZ SGZ dominánsan il SGZ, rostralis SVZ rostralis SVZ, stroke penumbra sérült cortex SVZ sérült cortex SVZ, cortex cortex
Neurogenezis il SVZ SGZ SGZ, rostralis SVZ rostralis SVZ (sérült cortex?) SVZ (sérült cortex?) SVZ, (cortex?) nv
patkány
Amyotrophia-s lateral sclerosis
egér (G93A-SOD1 mutáns)
Huntington-kór Alzheimer-kór Globális agyi ischaemia (kétoldali a. carotis communis leszorítás)
SVZ, RMS, OB, cc, striatum
SVZ
gerincvelő EZ
SVZ, RMS SGZ SVZ, sérült striatum
SVZ SGZ
patkány
érett neuron in situ
[14]
érett neuron, asztocita, oligodendroglia
[15]
régióspec. érett neuron érett neuron
[16]
nv SGZ, GCL, CA1 nv
érett neuron in situ érett neuron éretlen neuron in situ
[18] [19], [20]
GCL
régióspec. érett neuron, asztrocita
[21]
hc CA1 RMS, bulb. olf. GCL és ectopiás sérült striatum
érett neuron éretlen neuron érett neuron asztrocita
"in loco"
asztocita, kevés érett neuron
gerincvelő hátsó, majd elülső szarva felé
SVZ-ben csökken egér
Parkinson-kór (MPTP-lézió) makákó
striatum, substantia nigra
nv
SVZ-ben csökken
13
[11]
nv
GD
SGZ
Parkinson-kór (6-OH dopamin lézió)
érett neuron, asztocita, oligodendroglia
[13]
SGZ
SGZ
[4] [5] [6] [7] [8] [9]
érett neuronok
SGZ
gerbil
[3], [4]
gerincvelő hátsó szarv (a sérülés felé)
GCL, cortex, fá
n. caudatus környéki SEZ SGZ SGZ, SVZ
[1] [2]
[12]
(SVZ, SGZ?)
hc SGZ-GD, SVZ
patkány
Bulb. olf., striatum, cc, fimbria
SVZ, cortex, hc, fá
gerincvelő EZ
Hvt.
[10]
SGZ-ben csökken
humán humán egér (APP-mutáns)
Status epilepticus (pilokarpinindukált)
Differenciálódás régióspec. érett neuron érett neuron éretlen neuron éretlen és érett neuron érett neuron régióspec. érett neuron érett neuron régióspec. érett neuron éretlen és érett neuron
kisagyban nem detektálható
SGZ, SEZ a sérülés alatt Agyi trauma ("fluid percussion injury")
A sejtvándorlás iránya il striatum GCL nv il striatum, cortex nv il striatum nv il cortex nv
[17]
[22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]
Felnőttkori idegsejtképzés és vándorlás a germinatív rétegekben A szubventrikuláris zóna (SVZ) A felnőtt emlősök szubventrikuláris zónájában a kamrafalat alkotó ependimasejt-réteg (E-sejtek) alatt több sejttípust különböztettek meg (Doetsch és mtsai 1997). Leírtak megnyúlt alakú, egy-két nyúlvánnyal rendelkező, a sejt hossztengelye mentén rendezett mikrotubulusokkal bíró, csoportokba rendeződő A-sejteket, GFAP-t expresszáló, asztroglia jellegű, sok nyúlvánnyal rendelkező B-sejteket, valamint kerekded, nagy sejtmagvú, mitotikusan igen aktív C-sejteket. Funkcionálisan az A-sejteket migráló neuroblasztként, a B-sejteket őssejtként, a C-sejteket pedig gyorsan proliferáló, sokszorozó progenitorsejtként azonosították (5. ábra). 5. ábra A szubventrikuláris zóna elhelyezkedése és sejttípusai rágcsálóagy frontális metszetének sematikus ábráján (Alvarez-Buylla 2002). Az oldalkamra (LV) ependymarétege (E) alatt elhelyezkedő őssejtek (B) képezik a sokszorozó progenitorsejteket (C), majd a vándorló neuroblasztokat (A), amelyek GFAP-pozitív sejtek által alkotott „csőben” láncmigrációt végeznek.
A megfigyelések szerint a B-sejtek határfelületet képeznek a migráló neuroblasztok és az ependimasejtek, valamint a neuroblasztok és a striatum között. Nélkülözhetetlenek a neuroblasztok túléléséhez, a migrációjukhoz szükséges faktorok termeléséhez, és a megfelelő szöveti környezet fenntartásához. Néhány SVZ őssejt a radiális gliasejtekhez és a neuroepitheliális őssejtekhez hasonlóan az agykamrával kontaktust képez; ciliumot bocsát a cerebrospinalis térbe (Alvarez-Buylla és mtsai 2001). Rágcsálókban a prekurzorsejtek/neuroblasztok jellegzetes alakot öltve (A-sejtek) a szubventrikuláris zónából szigorúan meghatározott vándorlási útvonalon, az ún. rostralis migrációs ösvényen (RMS), a B-sejtek által képzett csőszerű struktúrában vándorolnak (5. ábra, 6. ábra).
14
6. ábra A szubventrikuláris zónából a rosztrális migrációs ösvényen keresztül a szaglógumóba vándorló sejtek útvonala a rágcsálóagyban (AlvarezBuylla 2002). OB: szaglógumó, RMS: rosztrális migrációs ösvény, cc: corpus callosum, LV: oldalkamra, NC: neocortex, CB: kisagy, vörös jelölés: vándorlási útvonal.
Céljukhoz, a szaglógumóhoz eljutva, granuláris és periglomeruláris interneuronokat képeznek (Alvarez-Buylla és mtsai 2002). A vándorlás gyökeresen eltér az embrionális központi idegrendszerben megfigyelt radiális és tangencionális migrációtól. A másodlagos germinatív réteg neuroblasztjai láncmigrációval jutnak el rendeltetési helyükre. A szigetelő asztocitaburkon belül homológ kölcsönhatásokat létesítő A-sejtek egymás felületén elcsúszva haladnak. A vándorlás segítésében nagy szerepe van a poliszialinizált NCAM (PSA-NCAM) és 1-integrinek, valamint az Eph/ephrin-receptor és a neuregulin/ErbB4 által közvetített adhéziós/szignalizációs folyamatoknak (Rousselot és mtsai 1995, Jacques és mtsai 1998, Conover és mtsai 2000, Ghashghaei és mtsai 2006). A felnőtt szekunder germinatív zóna őssejtjeinek azonosítását több kutatócsoport tűzte ki célul a ‟90-es évek végén. Feladatuk azért sem volt egyszerű, mert kizárólagosan specifikus őssejt-marker máig sincs a birtokunkban. Az őssejteket az in vitro proliferatív potenciállal rendelkező ependima- és szubependimasejtek között keresték (Johansson és mtsai 1999, Doetsch és mtsai 1999, Chiasson és mtsai 1999). A meggyőzőbb bizonyítékok azt támasztották alá, hogy a felnőtt őssejtek a szubventrikuláris zóna GFAP-t expresszáló, asztroglia jellegű sejtjei között keresendők (Doetsch és mtsai 1999, Chiasson és mtsai 1999). További vizsgálatok alapján kialakult a vélemény, hogy a radiális gliasejtek, amelyek idegsejtek és gliasejtek képződésének is forrásai voltak, valamint idegsejtek vándorlását is segítették, posztnatálisan átalakulnak az SVZ GFAP-immunpozitív őssejtjeivé (Merkle és mtsai 2004). Rágcsálókban a szubventrikuláris zónából kivándorló idegsejt-előalakok a szaglógumó cserélődő
neuronjainak
helyettesítésében,
a
környezeti
szagingerekhez
való
alkalmazkodásban, a szaglási memória kifejlődésében játszanak szerepet. Ennek szerepe
15
emberek esetén alárendelt, de sejtképzés a humán agyban is zajlik (Bédard és Parent 2004). Jelentőségének felderítésén sok kutatócsoport dolgozik. A szubgranuláris zóna (SGZ) A felnőtt emlősagy hippocampusának gyrus dentatusában új neuronok keletkezését már a ‟90-es évek első felében megfigyelték (Cameron és mtsai 1993). A gyrus dentatus szubgranuláris zónáját harmadlagos germinatív zónaként azonosították (Altman és Bayer 1990a, b). Szerkezetében (7. ábra) hasonlóságok és eltérések is tapasztalhatók a szubventrikuláris zónához képest. B-típusú, GFAP-pozitív, az SVZ-hez hasonlóan őssejtként azonosított, nyúlványos sejtekből D-típusú sokszorozó sejtek, majd G-típusú posztmitotikus szemcsesejt-előalakok fejlődnek (Seri és mtsai 2001, Alvarez-Buylla és mtsai 2002). A gyrus dentatus őssejtjei a szubventrikuláris zóna őssejtjeivel szemben a kamrafali régiótól jóval messzebb helyezkednek el. A granuláris zóna alapján ülő sejttestükből rövid tangencionális és hosszú, radiális irányú nyúlványokat bocsátanak ki, utóbbiak egészen a molekuláris rétegig nyúlnak. A nyúlványok segítséget nyújtanak a réteg basalis része felől elvándorló sokszorozó progenitoroknak és neuroblasztoknak. Az újonnan kialakuló szemcsesejtek ingerlő és gátló neuronok posztszinaptikus célpontjai és axonjaikat a CA3 és hilaris régióba bocsátva maguk is célsejteket (hilaris interneuronok, CA3 piramissejtek, mohasejtek) innerválnak (Toni és mtsai 2008). Az
újonnan
beépülő
hippokampális
idegsejtek
memóriafunkcióiban játszhatnak fontos szerepet.
16
az
élőlények
tanulási-
és
7. ábra A szubgranuláris zóna elhelyezkedése és sejttípusai rágcsálóagy frontális metszetének sematikus rajzán (Alvarez-Buylla és mtsai 2002 [A], Gage 2000 alapján módosítva [B]). A: A szubgranuláris zóna őssejtjei (B) sokszorozó progenitorsejteket (D), majd posztmitotikus szemcsesejtelőalakokat (G) képeznek. B: A hippocampus ábrázolása frontális metszet sémáján. B‟: A B ábrából kinagyított ábrán a szubgranuláris zónában történő sejt-proliferáció (1.), granuláris rétegbe vándorlás (2.) és szemcsesejtté való differenciálódás (3.) lépéseit kísérhetjük figyelemmel.
A neurogén környezet jellemzői A felnőtt agy szubventrikuláris és szubgranuláris/granuláris zónáját, a rosztrális migrációs ösvényt és a szaglógumót „neurogén régióknak” tartják. Ezek a régiók támogathatják a felnőtt őssejtek élethosszig tartó proliferációját (SVZ, SGZ), illetve a sejtvándorlás és elköteleződés folyamatait, sőt, nemritkán, a kívülről bejuttatott ős- és progenitorsejtek túlélését és régióspecifikus differenciálódási folyamatait is. Ettől eltérő régiókban („nem-neurogén területek”) az endogén sejtek körében neurogenezis nem zajlik,
és
az
exogén
őssejtek
korlátozott
túlélése,
legfeljebb
glia-irányú
differenciálódása jellemző (Gage és mtsai 1995a, Suhonen és mtsai 1996). Az ennek hátterében álló tényezők még csak kis részben ismertek. A sejtsorsok kialakulásában együtt érvényesülnek az intrinszik genetikai programok és a környezet sejtre ható, térben és időben rendezett jelzései (Doetsch 2003, Riquelme és mtsai 2008). A
17
germinatív
zónákban
a
helyi
ependimasejtek,
asztrociták
és
endotélsejtek
elengedhetetlen részesei a jelző- és szabályozó folyamatoknak. A mikrokörnyezet sajátos szerkezetű lamina basalissal és extracelluláris mátrixszal (ECM) bír (kollagén1, laminin, CSPG, HSPG), amely részese a szignalizációs folyamatoknak, hiszen a sejtproliferációhoz és differenciálódáshoz elengedhetetlen növekedési faktorokat, citokineket tárolja, kompartmentalizálja. Emellett letapadástól függő sejtek számára adhéziós felületet biztosít (Riquelme 2008). A lokális asztrociták által termelt szabályozó molekulák (Shh, Wnt, BMP-antagonisták), növekedési faktorok (EGF, bFGF, TGF-alfa, CNTF, BDNF, NT-3/4) fontos regulátorai a sejtgenezis és differenciálódás folyamatainak (Jiao és Chen 2008, Lie és mtsai 2005, Hirabayashi és mtsai 2004, Lim és mtsai 2000). Ezek lokális koncentrációja az egyedfejlődés során dinamikusan változik. Emellett számos neurotranszmitter, neuromodulátor (dopamin, GABA, glutaminsav, serotonin, noradrenalin, NO, endokannabinoidok) gyakorol hatást az SVZ és SGZ sejtproliferációjának mértékére, a neuronális migrációra és differenciálódásra (Riquelme és mtsai 2008, Hill és mtsai 2006, Goncalves és mtsai 2008). A depolarizáló és az intracelluláris kalciumszintet befolyásoló hatások összessége igen fontos tényező a sejtek proliferációja, túlélése, integrálódása szempontjából (Cameron és mtsai 1995, Herberth és mtsai 2002). Különböző hormonális hatások fiziológiás koncentráció-tartományban is befolyásolhatják a neurogenezis és agyi regeneráció folyamatait. A glükokortikoidok szinjének emelkedése (stresszhatás, depresszív zavarok esetén) feltehetően csökkenti a szubgranuláris és szubventrikuláris zónában folyó neurogenezist (Lennington és mtsai 2003, Lau és mtsai 2007). Rágcsálókban tett megfigyelések alapján, a női nemi ciklus különböző szakaszaiban, a változó ösztrogénszint és a terhességgel és szüléssel együttjáró prolaktinszint változás is befolyásolja a szekunder germinatív régiók neurogenezisét Az emelkedő ösztrogénszint az szubgranuláris zóna, az emelkedő prolaktinszint az szubventrikuláris zóna neurogenezisét növeli (Lennington és mtsai 2003). A neurogenezis és annak határai kóros központi idegrendszeri állapotokban A normál egyedben zajló szubventrikuláris és szubgranuláris neurogenezis mellett, pathológiás állapotokban, a központi idegrendszer teljes hosszában kiváltható sejtképzés a szubependimális rétegben. Többféle agyi kórállapotban figyelték meg a
18
sejtproliferáció-fokozódás
mellett
az
idegi
prekurzorok
agyi
vándorlását.
Régióspecifikus differenciálódást és integrálódást ritkábban tapasztaltak (1. táblázat). A megfigyelt sejtképzési és regenerációs folyamatok nem elég hatékonyak ahhoz, hogy nagyobb agyi elváltozásokat rendbehozzanak. A sérült neuronok nagyobb része elpusztul, csak kicsiny töredéke képes regenerálódni, az axonburjánzás pedig nem képes helyreállítani a károsodott idegi hálózatok funkcióját. A kellő mértékű sejtproliferációt, illetve parenchymális sejt- és axonregenerációt számos agyi mikrokörnyezeti tényező akadályozza. Ezek összesége a felnőtt emlősagy legtöbb területén a neurogén mikrokörnyezettől jelentősen eltér, az ős- és progenitorsejtek szaporodásához, vándorlásához, differenciálódásához nem biztosít megfelelő feltételeket. Ebben a környezetben
az újonnan képződő sejtek túlnyomórészt a glia sejt-fenotípus irányába fejlődnek,
a képződő idegsejtek száma igen alacsony, típusa korlátozott, életideje túlnyomórészt igen rövid,
az irányított axonnövekedést és szinapszis-képzést sok tényező gátolja.
A felnőtt emlősagy regenerációs képtelenségét részben az magyarázza, hogy a neurogén program
gátlódik.
A
parenchymában
megtalálható
progenitorsejtek
oligodendrogliasejteket és asztrocitákat képeznek (Levine és mtsai 2001), károsodás esetén a gliaheg képzésében játszanak szerepet. Az idegsejtek képződésének gátlását sérült felnőtt agykérgi környezetben részben az Olig2 transzkripciós faktor működésének tulajdonítják (Buffo és mtsai 2005). A felnőtt központi idegrendszer neurogenezisének és progenitor-proliferációjának szabályozói közé tartoznak a BMP, Shh és Wnt szignalizációs útvonalak. Ezek együttes működése a felnőtt emlős központi idegrendszerben gliogén irányba tereli a sejtek fejlődését. A felnőtt agyban a károsodást követően legtöbbször mikroglia-aktiváció jön létre (Dheen és mtsai 2007). A bevándorló makrofág- és aktiválódó mikroglia sejtek a törmeléket eltakarítják, antigént prezentálnak, citokineket termelnek, immunkompetens sejteket vonzanak a sérült területre, gyulladásos reakciót keltenek, asztrocitasejteket aktiválnak. Hatásuk az idegsejteket károsítja (reaktív oxigéngyökök, nitrogén-monoxid, glutamát felszabadulása), de bizonyos esetekben (neurotrofikus faktorok termelése) a túlélésüket segítheti is. A sérülést követően a reaktívvá váló asztrociták körülhatárolják
19
a károsodás régióját, „gliaheget” alakítanak ki (Fitch és Silver 2008). Ez speciális mikrokörnyezetet jelent, amelynek része a módosult, axonok be- és átlépését megakadályozó extracelluláris mátrix (ECM). Ennek gátló komponensei az asztrociták és oligodendroglia prekurzorok által termelt kondroitin-szulfát proteoglikánok (neurocan, versican, phosphacan, NG-2 [Liu és mtsai 2006b]). Bár korábban a reaktív glia kialakulását és működését az idegsejt-túlélés szempontjából egyöntetűen károsnak ítélték, mára nyilvánvalóvá vált, hogy a „reaktív gliózis” a glia-meninx-, glia-érkapcsolatok (vér-agy gát) újraformázását végzi, a sejthiányos területeket fokozatosan benépesíti, mérsékli a neuronok tápanyaghiányát, stablizálja a pH-t, csökkenti az excitotoxicitást és a szabadgyökök által kiváltott károsodást. Emellett neurotrofikus faktorokat, adhéziós molekulákat, ECM-komponenseket termel. Az idegi hálózatok regenerációját nehézíti, hogy az ECM-összetétel és a sejtadhéziós molekulák megoszlása (NCAM, N-cadherin, L1-adhéziós molekula, integrinek, PSANCAM, laminin, fibronectin), valamint a szekretált növekedési faktorok, neurotrofinok mennyisége a felnőtt emlős agyban jelentősen eltér a fejlődő és perifériás idegrendszerétől (Szente és Toldi, 1999, Skaper 2005, Buss és mtsai 2007, Kromer és Cornbrooks 1987, Lykissas és mtsai 2007). Az irányított axonnövekedést és regenerációt a kifejlett központi idegrendszerben myelin-eredetű gátlószerek (Nogo, OMGp, MAG) és kemorepulzív szignálmolekulák (ephrinek, semaphorinok, netrinek, „repulsive guidance” molekulák) is gátolják (Liu és mtsai 2006b, Mueller és mtsai 2006). A környezet exitotoxikus neurotranszmitterei, reaktív oxidáló szabadgyökök (reactive oxygen species; ROS), gyakori oxigén-, energia és tápanyaghiánya, következményes pH-eltolódása, nem megfelelő depolarizációs hatásai miatt, az újonnan képződő idegsejt-előalakok nagy része hamar elpusztul, illetve a károsodott idegsejtek elenyésző számban tudnak regenerálódni. Sejtvesztéssel járó központi idegrendszeri betegségek gyógyítási lehetőségei A sejtvesztéssel járó agyi károsodások gyógyításában az elvesztett sejtek pótlására két módszer is kínálkozik: az endogén „őssejt-raktárból” történő sejtmobilizáció és a külső forrásból származó, potenciálisan idegsejtté fejlődő sejtek bevitele a sérült területre. Az utóbbi évtizedek vizsgálatai azt mutatják, hogy mindkét esetben szükség van a felnőtt
20
agyi környezet módosítására, a permisszív, a neurogén régiókhoz hasonló „niche” megteremtésére. Az agyi környezet szignáljai a beültetett és endogén ős- és progenitorsejtek sorsát alapvetően meghatározzák. Azonos forrásból származó és azonos elkötelezettségi fokon álló beültetett sejtek is teljesen eltérően viselkedhetnek a környezeti tényezők eltérései következtében. A kísérleti egyed kora, a befogadó agy állapota (a sérülés természete, a gyulladás foka, a sérült terület nagysága, elhelyezkedése) kulcsfontosságú tényezők az endogén őssejtek és a beültetett sejtek szempontjából is (Magavi és mtsai 2000, Ekdahl és mtsai 2003, Demeter és mtsai 2004, 2005, Agoston és mtsai 2007). Implantált sejtek esetén meghatározó lehet a beültetés pontos helye (Modo és mtsai 2002, Jin és mtsai 2005). Az oxigén szerepe az agyi mikrokörnyezetben és hatásai az őssejtek elköteleződésére A szöveti oxigén tenzió az agyi mikrokörnyezet fontos tényezője és az őssejtek és „leszármazottaik” sorsának fontos szabályozója. A környezet módosításának egyik lehetősége a helyi oxigén tenzió megváltoztatása. Az in vitro akalmazott hipoxiás kezelés (különböző hipoxiás gáz-keverékek alkalmazása) hat a sejtek proliferációjára, az apoptózis mértékére, befolyásolja a sejtek túlélését, differenciálódási útvonalát és hatással van a különböző képződő érett sejttípusok arányára (Studer és mtsai 2000, Morrison és mtsai 2000, Chen és mtsai 2007, Pistollato és mtsai 2007, Horie és mtsai 2007, Zhang és mtsai 2006-2007). A hipoxia több sejtszintű hatását a hipoxia-indukálható faktorok (HIF-ek) működésén keresztül érvényesíti. A HIF-ek transzkripciós faktorként működnek, és több mint 100, metabolikus folyamatra, túlélésre, motilitásra, angiogenezisre és más funkciókra ható gén működését szabályozzák. Gustaffson és munkatársai (2005) felismerték, hogy miogén és idegi differenciálódási folyamatokban a hipoxia, a HIF közreműködésével, a Notch-jelátviteli út segítségével fenntartja az elkötelezetlen ős- és progenitorsejtállapotot. A hipoxia a Wnt- és Oct-4 molekuláris útvonalakon keresztül is hatást gyakorol az őssejt-funkciókra (Kaidi és mtsai 2007, Covello és mtsai 2006). Azonban a változó
oxigén
tenziók
hatásai
a
differenciálódás
sejtpopulációkban, részleteiben, nem ismertek.
21
különböző
fokán
álló
Sokkal kevesebb kísérlet fogalkozott ezidáig a hiperoxia hatásainak sejtkultúrákban vagy állatmodellekben való vizsgálatával. Az eredmények azt mutatják, hogy a hiperoxia az ischaemiás szívizomban hat a szöveti „remodelling” folyamatokra és befolyásolja a sejtdifferenciációt (Sen és mtsai 2006). PC12 adrenális sejtek tenyészeteiben a magas O2-tenzió a neuronális fenotípus kialakulásához vezet (Katoh és mtsai 1997, 1999). Koraszülött bronchopulmonalis dysplasia és retinopathia állatmodelljeiben (Das és mtsai 2004, Uno és mtsai 2007), a hiperoxia befolyásolja a sejtciklust, a sejtdifferenciációt, a sejtvándorlást és érfejlődést. A hiperbárikus oxigénkezelés A normobárikus és hiperbárikus oxigénterápiát már évtizedekkel ezelőtt javasolták neuroprotektív adjuváns kezelésként. Vizsgálatok során a hiperbárikus terápiát találták hatékonyabbnak (Beynon és mtsai 2007). Normál körülmények között az oxigén 97.5%-a hemoglobinhoz kötve, míg 2.5%-a a plazmában oldott állapotban szállítódik a véráramban. Hiperbárikus oxigénterápia (HBOT) során a terápiás kamrában a nyomást megnövelik (~2-3 atm), és a betegek 100%-os oxigént lélegeznek be arcmaszkon keresztül. A parciális oxigéntenzió és nyomás emelkedésével a plazmában oldott - és szövetekhez szállítódó - oxigén mennyisége jelentősen megnő a vérben, így a korábban oxigénhiányos szövetek a definitív károsodás (pl. érelzáródás) ellenére is elegendő oxigénellátást kaphatnak, s így további károsodástól menthetjük meg őket. A hiperbárikus hiperoxia hatásos módszer lehet a reverzibilisen károsodott agyszövet (pl. stroke penumbra) megmentésére. A HBOT képes a stroke penumbra oxigénszintjét az ischaemia előtti szinthez közeli értékre visszahozni. Szignifikánsan csökkenti az infarktus területét és javítja a funkcionális állapotot (Veltkamp és mtsai 2000, Schabitz és mtsai 2004). A kísérletes ischaemia-s és agyi traumás modelleken végzett tanulmányok szerint a HBOT kedvező hatásának hátterében az agyödéma mértékének csökkenése, a vér-agy gát károsodásának mérséklődése (Veltkamp és mtsai 2005), az ICP és a mikrocirkuláció változása (Niklas és mtsai 2004, Kohshi és mtsai 1991), a gyulladásos folyamatok mérséklődése (Vlodavsky és mtsai 2006) és az apoptózis csökkenése (Li és mtsai 2005a, Liu és mtsai 2006a) áll.
22
A központi idegrendszeri kórállapotokat legtöbbször bizonyos mértékű szöveti hipoxia kíséri. A hipoxia ellensúlyozása (pl. hiperbárikus oxigénkezeléssel) tehát agyi károsodásokban lehetőséget adhat a primer sérülés regenerációjának segítésére és a másodlagos károsodás (sejtpusztulás) folyamatainak megállítására. Emellett feltehetően az agyba kívülről bejuttatott őssejtek elköteleződési folyamataira is hatással van. A sejtbeültetés terápiás hatásai központi idegrendszeri kórképekben Sejtbevitellel
történő
terápiás
próbálkozások
léteznek,
amióta
laboratóriumi
körülmények között előűállítottak olyan sejtvonalakat, amelyek elméletileg segíthetnek központi idegrendszeri betegségek gyógyításában. A sejtimplantációk terápiás hatását a beültetett sejtek agyi környezettel való komplex együttes működése eredményezi. A beültetett sejtek potenciáljuktól függően – elméletileg - helyettesíthetik az agy elpusztult sejtjeit (ideg-, oligodendroglia-, asztrogliasejtek). Az implantált őssejtek neurotrofikus faktorokat szekretálhatnak és/vagy azok intracerebralis szekrécióját segíthetik (Qu és mtsai 2007, Mahmood és mtsai 2004), sejt-sejt kontaktus útján gén-, protein transzfert végezhetnek (Leng és mtsai 2008), angiogenezist indukálhatnak (Chen és mtsai 2003), befolyásolhatják az immunválaszt és gyulladásos folyamatokat (Aggarwal és Pittenger 2005). Parakrin hatásaik, diffúzibilis faktoraik révén kedvezőbbé alakíthatják a mikrokörnyezetetet. Emellett maguk is igénylik a „megengedő mikrokörnyezetet” ahhoz, hogy a károsodott agyterületen túléljenek, illetve csak kontrollált mértékben szaporodjanak. A beültetésre kerülő sejtek forrásai A beültetésre szánt sejtek forrásai igen sokfélék lehetnek. Alapvető követelmény, hogy nagy számban, azonos minőségben álljanak rendelkezésre, laboratóriumi körülmények között fenntarthatók, szaporíthatók, szükség szerint genetikailag módosíthatók legyenek, illetve – ha sejtpótlási célzattal ültetjük be őket - specifikus differenciálódási potenciállal rendelkezzenek. A korai idegrendszeri sejtpótlásos kísérletek során magzati korú állatok agyi szövetblokkjait emelték ki, majd ültették be pathológiás agyi környezetbe (Perlow és mtsai 1979). Az igény a hiányzó sejttípusok szelektívebb pótlására, a sejtek finomabb kiválogatására hamar megfogalmazódott. A ‟70-es, ‟80-as években létrehozták az első, korai egérembrió belső sejtcsomójából izolált, pluripotens embrionális őssejt (ES)-vonalat (Martin 1981, Evans és Kaufman 1981) és
23
teratokarcinómából származó pluripotens embrionális carcinoma vonalakat (Martin és Evans 1975, Robertson 1987). Az embrionális őssejt- és karcinóma vonalak sejtkultúrában fenntarthatóknak bizonyultak, állatkísérletekben beültetés céljára használhatók voltak. Széles potenciáljuknak köszönhetően belőlük in vitro és in vivo mindhárom csíralemez sejtjei kifejlődhettek, de a tumorképződés veszélye is fennállt (Erdő és mtsai 2003, Riess és mtsai 2007). Rágcsáló-eredetű fötális és embrionális őssejtek regeneratív kapacitását sok betegségmodellben vizsgálták a kutatók. Etikai megfontolások miatt azonban az embrionális és fötális humán őssejtek csak korlátozottan állnak rendelkezésre. A későbbiekben a technikai fejlődés lehetővé tette az embrionális-fötális agy számos területéről történő őssejt és progenitorsejt izolálást, majd rövidebb-hosszabb in vitro fenntartás után annak modellállatba való implantációját (Shin és mtsai 2000, Demeter és mtsai 2004, Kelly és mtsai 2004, Hicks és mtsai 2009). Később mind a felnőtt agy szekunder germinatív régióiból, mind a nem-neurogén régiókból sikerült izolálni multipotens,
aktiválható,
önmegújító
tulajdonsággal
rendelkező
ős-
és
progenitorsejteket (Gage és mtsai 1995b, Palmer és mtsai 1995, 1999, Shihabuddin és mtsai 1997, Weiss és mtsai 1996, Tropepe és mtsai 2000). A központi idegrendszerből izolált sejteket közvetlenül izoláció után, vagy változó idejű sejtkultúrában való fenntartás után ültetik be. Az agyból izolált, nem klónozott sejt-preparátumok hátránya, hogy igen heterogének; bennük a korai, el nem kötelezett idegi őssejtek mellett differenciált neuronok, asztrociták, fejlődő oligodendroglia sejtek, endothel- és meningeális sejtek is találhatók. A reicipiens szervezetben a fejlődő graft sejtek sorsa, fejlődése, pontos differenciálódási útja igen nehezen követhető. Ahhoz, hogy a sejtek tartós in vitro fenntartása és pontosabb karakterizálása, valamint homogén, nagy számú sejtpopulációk beültetése lehetséges legyen, egy-sejt eredetű, geno –és fenotípusosan azonos őssejt-populációkat hoztak létre laboratóriumi körülmények között (Martinez-Serrano és Björklund, 1997, Schlett és Madarász 1997). Ezek jól szaporíthatók, önmegújítók, pontos differenciáltsági fokuk beültetés előtt ellenőrizhető, a szöveti környezettől függően differenciált sejtté alakulhatnak, szükség esetén géntermék bevitelére is alkalmassá tehetők. Mivel a megfelelő mértékű és tartós laboratóriumi szaporíthatóság érdekében általában valamilyen sejciklusban történő
24
módosításra,
vagyis
immortalizálásra
szorulnak,
e
sejtvonalak
kizárólag
modellkísérletekben használhatók, humán alkalmazásuk a tumorigenezis veszélye miatt nem jön szóba. Immortalizáció létrejöhet egy onkogén mesterséges bevitelével (c-myc, SV40 T-antigén) és spontán is. Sejtpótlásra nem kizárólag pluripotens őssejteket és idegrendszerből izolált sejteket használtak fel. Már a korai kutatások alkalmaztak más szervrendszerekből származó szövetblokkokat / sejteket. A Parkinson-modellekben és betegeknél is alkalmazott mellékvesevelőből származó graftok autotranszplatációjával próbálták helyreállítani a dopaminerg rendszer működési zavarát (Herrera-Marschitz és mtsai 1984, Backlund és mtsai 1985). Ezzel egyrészt a fötális szövetgraftokat érintő etikai problémák, másrészt az immunológiai reakciók voltak elkerülhetőek. Mivel a felnőtt szervezet egyik könnyen hozzáférhető és etikai problémát fel nem vető őssejt-raktára a hemopoetikus rendszer, hamar felmerült, hogy őssejtjeit optimális forrásként lehetne használni, amennyiben képesek lennének más szervrendszerek sejtjeit helyettesíteni. Csontvelő-transzplantációkat követő vizsgálatok (Eglitis és Mezey 1997, Mezey és mtsai 2003) gyorsan tisztázták, hogy a szisztémás keringésbe került hemopoetikus őssejtek utódsejtjei több más szövetféleség mellett az agyban is megtalálhatók, és érett idegszöveti sejtekre (mikroglia, makroglia és idegsejt) jellemző markereket expresszálnak. A vizsgálatok során férfi donortól csontvelőt kapott nőbetegek agyában mutattak ki Y-kromoszómát hordozó sejteket. A leírt jelenséget bizonyos kutatócsoportok a hemopoetikus
őssejtek nagyfokú plaszticitásával,
„transzdifferenciációs képességével” magyarázzák, mások az említett jelenségek hátterében bizonyos kutatócsoportok által leírt sejtfúzión (Vassilopoulos és Russell 2003), valamint a magzat és anya közötti mikrokimérizmuson (Tan és mtsai 2005) alapuló jelenségeket sejtenek. A hemopetikus; köldökzsinórvér- és csontvelő-eredetű őssejtek felhasználhatóságát illetően jelenleg is sok vita és intenzív kutatás zajlik. Az implantálható sejtek azonosítása, genetikai módosítása és intracerebrális sorsának követése A felnőtt központi idegrendszerből történő őssejt-izoláció egyik nehézsége, hogy univerzális, vagy idegi őssejtekre specifikus marker nem létezik. Az őssejtek szelekciója történhet marker molekula-kombinációk (nestin, SSEA-1, CD133) és lektinkötési
25
jellegzetességek segítségével, amelyek együttesen nagy valószínűséggel jellemzik az őssejt-állapotot (Rietze és mtsai 2001, Capela és Temple 2002, Uchida és mtsai 2000). Lehetséges a szekunder germinatív régió környéki terület sebészi disszekciója, majd az ebből származó sokszínű, disszociáltatott „sejtkeverék” specifikus mitogének melletti tenyésztése és karakterizálása a neurális őssejtek kinyerésére. Kísérleti körülmények között (transzfektált sejtek vagy transzgenikus állatok felhasználásával), az idegi progenitorok specifikus promóterei (pl. mushashi, nestin) által meghajtott riportergének expressziója alapján történő sejtválogatása is lehetséges (Roy és mtsai 2000, Sawamoto és mtsai 2001). A felhasznált sejtvonalak befogadó szöveten belüli, in vivo azonosítására ún. markergéneket lehet bejuttani genetikai módosítással (transzfekció) a laboratóriumban fenntartott sejtvonalak sejtjeibe. A markergének előidézhetik mikroszkópos technikával azonosítható fluoreszkáló fehérjék (pl. zöld fluoreszcens fehérje [GFP]) megjelenését, vagy látható csapadékot képező/lumineszcenciát kiváltó új enzim termelődését (galaktozidáz lacZ, hőrezisztens placentáris alkalikus fosztatáz, luciferáz) a sejten belül. Hasonló technikával terápiás célú géntermékek termelődését is előidézhetjük a sejtvonalban. Ezek lehetnek
idegi növekedési faktorok, neurotrofinok (NGF, BDNF, NT-3), amelyek az
idegsejtek túlélését segítik (Martinez-Serrano és mtsai 1995, Grider és mtsai 2005)
enzimek (tirozin-hidroxiláz, béta-glükuronidáz, béta-hexózaminidáz), amelyek
hiányzó enzimeket pótolnak, vagy neurotranszmitter-hiányt mérsékelhetnek (Lundberg és mtsai 1996, Snyder és mtsai 1995, Lacorazza és mtsai 1996)
géntermékek (Nurr-1), amelyek a célzott differenciálódást segítik elő (Lindvall
és mtsai 2004)
citokinek (LIF, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-12), amelyek regenerációt segítő
(Blesch és mtsai 1999) vagy tumorellenes hatást gyakorolhatnak (Ehtesham és mtsai 2002a, b) A terápiás és markergének expressziója néhány osztódás után lecsökkenhet, eltűnhet, ha a gén a genomnak olyan részére épül be, amely az érett sejtben már nem íródik át.
26
Sejtimplantációt érintő problémák és lehetőségek Az igen sok korábbi implantációs kísérlet tanulságai alapján elmondható, hogy a terápia kapcsán fellépő fő problémák a következők: a sejtek nagy része elpusztul néhány héten belül, alig, vagy nem a megfelelő irányba differenciálódnak, funkcionálisan nem integrálódnak az agyszövetben, tumort képeznek, immunválaszt váltanak ki, kilökődnek, gyulladásos reakciót provokálnak, azonosíthatatlanná válnak, „eltűnnek”, nem termelik a szükséges enzimet, neurotranszmittert, a megfelelő mennyiségben történő kinyerése etikai vagy technikai problémába ütközik, használata humán klinikai próbákban nem lehetséges az alkalmazott vírusvektor vagy immortalizáció miatt. A nehézségek leküzdésére több megoldási lehetőség kínálkozik. Az őssejtek in vitro tenyésztésével és elődifferenciáltatásával kapcsolatos vizsgálatok segíthetnek abban, hogy viszonylag nagyszámú, a kívánt fejlődési stádiumban lévő sejtcsoportot juttassunk be az agyba. A sejtek implantáció előtti szelektálása (felszíni antigének és promóter/enhancer alapján) lehetővé teszi homogén sejtpopulációk beültetését. Az immunológiai nehézségek és az etikai akadályok kiküszöbölésében segíthet az autológ hemopoetikus őssejtek használata. A sejtvonalak genetikai módosításakor alkalmazott nem-virális génbejuttatási módszerekkel (Dieterlen és mtsai 2009), illetve a sejtvonalak sejtciklusába történő beavatkozások elkerülésével lehetnének a sejtes terápiák biztonságosabbak, juthatnának közelebb a humán használhatósághoz. A sejtforrások jelentős bővítését jelenthetik az embrionális és fötális őssejtek kiváltására létrehozott indukált pluripotens őssejt-vonalak (iPSC; Takahashi és Yamanaka 2006). A megfelelő implantálható sejtforrások feltárása mellett, a recipiens agyi környezet molekuláris hátterének alaposabb megismerése, permisszívvé tétele jelentene ugrásszerű előrelépést a terápiás sejtbeültetések terén.
27
Az idegszöveti implantációk immunológiai hátteréről Az utóbbi évtizedek kutatásai alapján némiképp módosult az a nézet, amely szerint a központi idegrendszer immunprivilegizált hely (Barker és Widner 2004). Mára tudjuk, hogy antigén-prezentáló sejtek jelen lehetnek az agyban, ha a rezidens mikroglia és a perivaszkuláris sejtek aktiválódnak, valamint gyulladás-mediátorok hatására perifériás makrofág/monocyta elemek vándorolnak az agyszövetbe. A vér-agy gát szigetelő és immunfolyamatokat „kivédő” hatása nem teljes, hiszen bizonyos károsodásoknál, sőt a parenchymába (vagy azon át) történő implantáció esetén is sérül a vér-agy gát. Emellett aktivált immunsejtek a vér-agy gát fizikai sérülése nélkül is átléphetnek rajta. A központi idegrendszer ugyan endotéllel bélelt nyirokereket nem tartalmaz, a nyirokelvezetést azonban bizonyos fokig a perivaszkuláris terek biztosítják, bizonyos jelzőanyagok kimutathatóan a nyaki nyirokcsomókba kerülnek az agyból. Az agyba bejuttatott szövetblokk/sejtcsoport tartós túlélése több immunológiai tényezőtől is függ. Alapvetően a donor és befogadó immunogén epitópjainak (pl. MHC antigének) egyezésén / eltérésén múlik, hogy a bejuttatott sejteket/szövetdarabokat a gazdaszervezet sajátként vagy idegenként ismeri fel. Az idegenként azonosított graftok ellen a befogadó szervezet védekező immunreakciót indít, és ennek eredményeképpen bekövetkezhet a transzplantátum/implantátum kilökődése. Autológ transzplantáció esetén a donor és recipiens megegyezik, syngén átültetés esetén pedig genetikailag azonosak. Allogén transzplantáció esetén a donor és recipiens azonos fajba, xenogén átültetés esetén különböző fajba tartozik. A xenotranszplantációk esetén legnagyobb a rejekció (kilökődés) veszélye, amely ilyen esetben függ a filogenetikai különbségtől. A graft túlélése függ az implantáció helyétől, a graft típusától és a recipiens életkorától. Sejtszuszpenziók nagyobb eséllyel élnek túl, mint erezett szövetblokkok. Fiatal szervezetbe került graftok jobb túlélést mutatnak, mint idős befogadóba bejuttatottak. Embrionális korban az idegen sejtekkel szemben immuntolerancia alakulhat ki, így ún. kiméra-állapot jöhet létre, amelyben a saját és idegen sejtek egyaránt jelen vannak a szervezetben (Sir Frank Burnet és Peter Medawar, Nobel-díj, 1960). A sejtterápiás módszerek terjedésével az őssejtek és progenitorok immunogén epitópjainak vizsgálata is elkezdődött. Humán embrionális őssejteken kevés MHC I mutatható ki, míg MHC II expressziót nem tudtak detektálni rajtuk. A „natural killer” (természetes ölő-) limfociták ligandumai vagy hiányoztak, vagy igen alacsony
28
mennyiségben voltak megtalálhatóak az ES-sejteken és differenciált utódsejtjeiken (Drukker és mtsai 2002). Humán idegi őssejteken és progenitorsejteken az MHCexpresszió szintén igen alacsony, IFN és TNF
kezeléssel azonban növelhető volt
(Johansson és mtsai 2008). A viszonylag kevés adat alapján, feltehetően, az embrionális őssejtek és leszármazottaik csökkent citotoxikus T-sejt, illetve természetes ölősejtaktiválódást indukálnak, és az eltérő sejtaktivációs és citokinhatások révén az immunológiai védekező mechanizmusok kevéssé károsítjak őket. Több idegrendszeri sejtimplantációs kísérletben ültettek be eltérő fajból származó sejteket. Ennek előnye lehet a könnyű sejt-követhetőség, a xenogén környezet okozta módosult viselkedés (nyúlványnövekedés, axonális útkeresés) megfigyelhetősége (Isacson és Deacon 1996), vagy a beültetésre szánt graft könnyebb hozzáférhetősége pl más élőlényből kiemelt vagy in vitro kialakított szerv-, szövet-modulok (pl. szívbillentyű) implantációja (Vesely 2005) esetén. Xenogén és allogén transzplantációk esetén – amennyiben hosszú megfigyelési időre van szükség - a kilökődés farmakológiai gátlása mindenképpen szóba jön. Erre többféle immunszuppresszív
gyógyszer
és
azok
kombinációi
is
alkalmazhatóak.
Az
immunszuppresszív kezelés - súlyos szisztémás mellékhatásaikból adódóan - a kísérletek eredményeit is befolyásolhatja. A sejtbeültetések kapcsán jelentkező immunológiai problémák kiküszöbölését jelenthetné az autológ hemopoetikus (pl. csontvelő-,
köldökzsinórvér-eredetű)
őssejtekkel
történő
kezelés,
amely
több
idegrendszeri betegségtípusban és azok modelljében áll intenzív vizsgálat alatt. Jelen
vizsgálataink
során
egérből
származó,
laboratóriumban
fenntartott
neuroektodermális őssejteket ültettünk allogén módon egerek agyi régióiba. Viszonylag rövid megfigyelési időt alkalmaztunk a sejtek követésére. Immunszuppresszív terápiát nem alkalmaztunk, hogy a beültetett sejt és gazdaszövet „teljes egymásra hatását” megfigyelhessük. Mivel egyes adatok szerint bizonyos őssejtek allogén transzplantációk esetén tumorképződést okoztak (Erdő és mtsai 2003), sejtjeink tumorképző kapacitását szoros figyelemmel kísértük. Az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal és alklónjai Munkánk során az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal feno- és genotípusosan megegyező sejtjeivel hajtottunk végre implantációs kísérleteket. Segítségükkel egy
29
homogén, in vitro jól karakterizált sejtcsoport sorsát tanulmányozhattuk agyi környezetben, többféle módszerrel módosított körülmények között. A laboratóriumunkban kifejlesztett és az ATCC törzsgyűjteménybe bekerült NE-4C idegi
őssejtvonal
(CRL-2925,
2926)
9
p53-deficiens,
napos
egérembrió
előagyhólyagjából származó, neuroektodermális sejtvonal (8/A ábra). A
B
C
NE-4C
PLAP-4C
GFP-4C
8. ábra A: Az NE-4C idegi őssejtvonal sejtjei tenyészetben. Fáziskontraszt mikroszkópos kép. B: Az NE-4C sejtvonal placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatázt expresszáló alklónjának (PLAP-4C) sejtjei tenyészetben. Fénymikroszkópos kép. C: Az NE-4C sejtvonal zöld fluoreszcens fehérjét expresszáló alklónjának (GFP-4C) sejtjei tenyészetben. Fluoreszcens mikroszkópia. Mérce: 20 m.
Egy sejt-eredetű klón, azaz sejtjei geno- és fenotípusosan azonosak. Munkatársaink a sejtvonal részletes jellemzését elvégezték (Schlett és Madarász 1997, Schlett és mtsai 1997, Herberth és mtsai 2002, Jelitai és mtsai 2002, Tárnok és mtsai 2002, Környei és mtsai 2005, Varga és mtsai 2008), tanulmányaik alapján elmondható, hogy az NE-4C sejtek sejtkultúrában, megfelelő körülmények között korlátlanul proliferálnak, önmegújító képességgel bírnak. Retinsavas kezelés vagy asztroglia sejtekkel való együtt-tenyésztés eredményeképpen elköteleződésük reprodukálható módon megindul az idegsejt és asztroglia fenotípus irányába (9. ábra). Sokszorozó progenitorok
Indukálatlan őssejtek
Apoptózis
Idegi prekurzorok Érő idegsejtek Kivándorlás
Érő asztrogliasejtek Aggregáció
Aljzatsejtek, progenitorok 10-6-10-8 M RA 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Indukciós napok 9. ábra Az NE-4C sejtvonal differenciálódási rendje in vitro retinsavas indukciót követően. RA: (all-transz) retinsav.
30
Az idegi differenciálódás folyamatainak in vitro tanulmányozása mellett munkatársaink az NE-4C őssejtvonalból markergénnel jelölt al-vonalakat hoztak létre, hogy a sejteket in vivo modellkísérletek során az agyszöveten belül is követni tudjuk (Demeter és mtsai 2004). A zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) és placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatázt (PLAP) expresszáló alklónok (8/B, 8/C, 10. ábra) az eredeti sejtvonal tuljadonságait megtartották. A
RA0-2, fix. 6
GFP / III-tubulin
B
Hoechst / GFAP
RA0-2, fix. 12
10. ábra A GFP-4C sejtek differenciálódása retinsav hatására. A: A GFP-4C sejtek 48 órás retinsavas (RA) indukciót (0-2. nap) követően III-tubulin pozitív idegsejteket képeznek tenyészetben az indukció kezdetétől számított 6. napra (fix. 6: fixálás a 6. napon). Zöld: GFPfluoreszcencia, vörös: III-tubulin immunreaktivitás. B: A GFP-4C sejtek 48 órás retinsavas indukciót (0-2. nap) követően GFAP-pozitív asztrocitákat képeznek tenyészetben az indukció kezdetétől számított 12. napra. Kék: Hoechst magfestés, vörös: GFAP immunreaktivitás. Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce: 20 m.
Implantációs vizsgálatok az NE-4C őssejtekkel Kollégáink az NE-4C jelölt alklónjaival implantációs kísérleteket végeztek különböző életkorú befogadó állatokon. A sejtsorsot illetően jelentős különbségeket tapasztaltak, amikor a GFP-4C/PLAP-4C sejteket embrionális, újszülött, illetve felnőtt befogadó állatokba ültették be. A jelölt idegi őssejtek korai embrionális csirke előagyhólyagjába implantálva („csirke-egér kiméra”) hetekig túléltek, kisebb sejtaggregátumot képeztek a befogadó szövetben és ezt elhagyva az agyi parenchymában vándorolni tudtak. Az aggregátumon belül és azon kívül is idegsejteket képeztek. Több idegsejt képződött a befogadó agyszövethez közelebbi graft területeken, ami jelezheti a befogadó szövet diffúzibilis faktorainak fontos szerepét a beültetett sejtek elköteleződésében. A technikailag jóval nehezebb embrionális egéragyba történő implantáció során a sikeresen elvégezhető műtét és fixálás időpontja között a kifejlett idegsejtek
31
keletkezéséhez kevés volt az idő, ezért a beültetett sejtek sorsáról csak korlátozott mennyiségű információra tudtak szert tenni (Demeter és mtsai 2004). Újszülött egér oldalkamrájába juttatva az idegi őssejtek tartós túlélést és fokozott proliferációt mutattak. Az újszülött agyi környezet nem instruálta a sejteket nagymértékű differenciálódásra, idegsejt és asztroglia fenotípusú sejt csak elvétve keletkezett belőlük. A nagymértékű sejtosztódás azonban gyakran vezetett tumorszerű képletek kialakulásához (Demeter és mtsai 2004). Felnőtt egér striatumba és oldalkamrába történt GFP-4C és PLAP-4C implantációt követően a bejuttatott őssejtek legtöbbje maximum 6 hétig élt túl. A sejtek az agykamra falához tapadtak, vagy a szöveti környezettől élesen elváló striatalis sejtaggregátumot képeztek, és csak a fehérállomány közeli rostkötegei (corpus callosum) mentén voltak képesek kismértékű vándorlásra. Az agykamra falában a szekunder germinatív régió neurogén mikrokörnyezetét elérő néhány őssejt azonban több mint 6 hetes túlélést mutatott. A felnőtt agyi környezeti hatások csupán elvétve váltottak ki asztroglia, még ritkábban idegi differenciálódást a bevitt sejteken. A GFP-4C sejtek a felnőtt agyi környezetben integrálódásra nem voltak képesek (Demeter és mtsai 2004, 2005).
32
Célkitűzések Munkám során azt vizsgáltam, hogy a szöveti környezet változtatása milyen hatást gyakorol a kívülről agyba juttatott idegi őssejtek sorsára. Ehhez geno- és fenotípusosan azonos, NE-4C neuroektodermális őssejteket ültettem be különböző élettani állapotú egerek előagykérgébe. Az alábbi kérdésekre kerestem választ: Milyen hatásokkal lehet a felnőtt agyi környezetet alkalmassá tenni multipotens idegi őssejtek befogadására és az őssejteket az agyi beilleszkedésre? I. Befolyásolja-e a sérült agyi környezet a beültetett őssejtek sorsát az intakt agyban tapasztaltakhoz képest? II. Milyen kölcsönhatások alakulhatnak az őssejtek és tumorsejtek között, in vitro és in vivo körülmények között? III. Befolyásolja-e az in vivo agyi környezetben történő sejtfejlődést, ha beültetés előtt az őssejteket, in vitro differenciáltatással, idegszöveti fejlődésre „elkötelezzük”? IV. Milyen szerepet
játszik
az
őssejtek túlélésében, szaporodásában,
elköteleződési folyamataiban az oxigén-tenzió változása?
33
idegi
Módszerek A. Sejtes kísérletek Az NE-4C idegi őssejtvonal és alklónjai Munkáim során őssejtként a 9 napos, p53 mutáns (p53 -/-) egérembrió előagyhólyagjából
származó
immortalizált,
egy-sejt
eredetű
neuroektodermális
sejtvonalat, az NE-4C-t és annak alklónjait használtam [ATTC: CRL-2925, 2926] (Schlett és Madarász, 1997). A PLAP-4C az NE-4C sejtvonal placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatázt konstitutívan expresszáló alklónja, amelyet dr. Herberth Balázs munkatársunk készített el, a GFP-4C pedig egy zöld fluoreszcens fehérjét konstitutívan kifejező alklón, amelyet munkatársaink Dr. Duda Ernő (MTA-SZBK Biokémiai Intézet) segítségével állítottak elő. Az alklónok neomycin rezisztenciagént hordoznak. A fluoreszcencia intenzitás megtartása érdekében a GFP-4C sejtvonal sejteit két hetes 400 g/ml-os
geneticin
(G-418;
Sigma-Aldrich)
kezeléssel,
vagy
fluoreszcens
sejtválogatással (FACS Vantage; BD) készítettük elő a kísérletekre. A GFP-vel jelölt alklón fixált sejtjeit fluoreszcens mikroszkópos technikával azonosítottuk. A PLAP-4C sejteket a placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatáz által katalizált hisztokémiai reakció segítségével tettük láthatóvá. A fixált sejteket alkalikus foszfatáz előhívó pufferoldatba helyeztük, majd magas hőmérsékleten (65°C) 30 percig inkubáltuk. Ezen a hőmérsékleten a placentáris alkalikus foszfatáz enzim nem inaktiválódik, szemben más, endogén foszfatázokkal. Az enzim szubsztrátjait, az NBT-t (nitro blue tetrazolium, 250 g/ml; Promega) és a BCIP-et (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 125 g/ml; Promega) hígítva az oldathoz adtuk, majd fénytől védve 10-15 perces előhívást végeztünk. Az enzimreakciót foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) oldott EDTA-val (etiléndiamin-tetraecetsav, 0,1 M, Sigma-Aldrich) állítottuk le. Implantált, agyszövetben növekedő GFP-4C sejtek izolálása a gazda-szövetből A GFP-4C sejteket kb. 2 hónapos agyi túlélést követően több agyból visszanyertük („visszatenyésztettük”). Összesen 5 db, fagyasztásos sértésen és sejtbeültetésen átesett állatot (az állatkísérletek részletes leírását ld. B fejezetben) túlaltattunk (250 mg/kg ketamin [CP-Pharma HmbH]; 50 mg/kg xylazin [Alfasan International BV]), majd a korábban lézionált és implantált agykérgi területet steril körülmények között
34
kimetszettük. A kiemelt szövetet feldaraboltuk, majd tripszines kezeléssel (0,05% v/v PBS-ben) disszociáltattuk, a nagyobb szövetdarabokat centrifugálással (800 g, 5-8 perc) eltávolítottuk,
majd
a
felülúszóban
lévő
sejtszuszpenziót
10%
FCS-MEM
tápfolyadékban 24-es lyukú szövettenyésztő tálcákba ültettük. A neomicin-rezisztens GFP-4C sejteket geneticin kezeléssel válogattuk ki, majd fluoreszcens mikroszkópiával azonosítottuk. A “visszatenyésztett” GFP-4C (GFP-RC), és retinsavval előindukált GFP-4C (RA-GFP-RC) sejteket további vizsgálatokra fenntartottuk. Primer asztroglia tenyészetek Asztroglia tenyészeteket újszülött vagy posztnatális 1, 2 napos (P0-P2) vad típusú CD1 és transzgenikus, humán GFAP promóter kontrollja alatt felerősített zöld fluoreszcens fehérjét (eGFP) expresszáló (hGFAP-eGFP) egerek előagyszövetéből készítettünk Környei és munkatársai (2005) módszere szerint. A koponyacsontok eltávolítása után steril körülmények között kiemeltük az agyat. Az agyhártyákat óvatosan eltávolítottuk, majd az előagy-szövetet feldaraboltuk. A szövetdarabkákat tripszines (0,05% v/v PBSben) emésztést követően 10% fötális borjúsavót (FCS, Gibco, Invitrogen), 4 mM glutamint (Sigma-Aldrich) és 40
g/ml gentamycint (Chinoin Rt., Sanofi-Aventis)
tartalmazó Minimum Essential Medium (MEM; Sigma-Aldrich) oldatban Pasteurpipettával trituráltuk. Az egyedi sejtekre disszociáltatott szuszpenziót poli-L-lizinnel (Sigma-Aldrich) bevont 90 mm-es átmérőjű Petri-csészékbe ültettük ki 3-5x105 sejt/cm2 sűrűségben. Ko-kultúrás kísérletek előtt az asztrociták mitotikus aktivitását 1 napos 10 M-os citozin-arabinozid kezeléssel gátoltuk. Glióma- és glioblasztómavonalak Az őssejt-tumorsejt kölcsönhatásokat vizsgáló munkáinkban felhasználtunk egér eredetű immortalizált LL-gliasejteket (Dr. Latzkovits László - Kísérletes Sebészeti Intézet ajándéka), egér eredetű GL261 glioblasztóma sejteket (Ausman és mtsai 1970, Désaknai és mtsai 2003, Szatmári és mtsai 2006) [Dr. Sáfrány Géza - OSSKI ajándéka], patkányból eredetű C6-gliómasejteket (ATCC No.: CCL-107) [Benda és mtsai 1968], illetve U87 humán asztroglióma sejteket (ATCC No.: HTB-14) [Ponten és Macintyre, 1968].
35
A sejtvonalak fenntartása Az NE-4C, GFP-4C, PLAP-4C, GFP-RC („visszatenyésztett” GFP-4C) és RA-GFP-RC (retinsavval indukáltan beültetett, majd visszatenyésztett GFP-4C) sejtvonalakat, valamint a primer asztroglia és LL-gliasejteket poli-L-lizinnel kezelt műanyag felületen, a GL261, C6 és U87-sejtvonalakat kezeletlen műanyag felületeken növesztettük 90 mm-es Petri-csészékben. Tápoldatként 5% fötális borjúsavót, 4 mM glutamint, 40 g/ml gentamycint és 2,5
g/ml amphotericin B-t (Sigma-Aldrich) tartalmazó Minimum
Essential Medium tápoldatot (FCS-MEM) használtunk. A tenyészeteket 37 °C-on, 5 % CO2-ot és telített vízgőzt tartalmazó gáztérben tartottuk. A sejtkultúrákon hetente kétszer végeztünk tápcserét. Rendszeres átültetések (foszfát pufferelt sóoldatban oldott 0,05%-os (v/v) tripszines „passzálás”) segítségével, a sejtsűrűséget a tenyészetekben ún. szemi-konfluens (felületet nem teljesen beborító) szinten tartottuk. Az őssejtek in vitro neuronális indukciója retinsavval Az idegsejt irányú differenciálódást az NE-4C sejtvonalnak és alklónjainak, valamint agyból visszatenyésztett klónjainak szemi-konfluens tenyészeteiben a tápoldathoz adott 10-6-10-8 végkoncentrációjú, tápoldatban oldott all-transz-retinsav (RA) (SigmaAldrich) segítségével indítottunk el. A retinsavas kezelést poli-L-lizinnel bevont 96- és 24-lyukú tenyésztőedényekben, illetve 60 mm-es Petri-csészékben végeztük, különböző sejtkoncentrációk mellett (0,1-4 x 105 sejt/cm2). A 24-lyukú tenyésztőedényekbe 12 mm átmérőjű üveglemezeket helyeztünk, erre ültettük ki a sejteket. 48 órás RA-kezelést követően a tápfolyadékot FCS-MEM-re cseréltük. Az őssejtek in vitro neuronális indukciója asztroglia ko-kultúrában A GFP-4C sejtek idegszöveti differenciálódásának megindításához asztroglia sejtekkel közös folyadéktérben való együtt-tenyésztést (nem-kontakt ko-kultúra) is alkalmaztunk (Környei, 2005). A ko-kultúrákban a GFP-4C őssejtek és P1 asztrogliasejtek közvetlen (kontakt) kölcsönhatásokat nem létesíthettek egymással. 90 mm-es Petri-csészékben növesztett, konfluens asztroglia sejtrétegben sejtmentes területeket hoztunk létre és ezeken szilikonzsír segítségével rögzítettük a GFP-4C sejteket hordozó 22 vagy 12 mmes, poli-L-lizinnel bevont tenyésztő lemezeket (11. ábra).
36
GFP-4C
GFP-4C
Primer egér asztrocita
11. ábra Primer egér asztrociták és GFP-4C idegi őssejtek nem kontakt ko-kultúrájának vázlatos képe.
Az asztoglia-GFP-4C ko-kultúrában a sejtek 4 napig éltek együtt, szérummentes (DMEM / F12 : 1/1 nutriens médiummal, glutaminnal, gentamycinnel, ITS-sel [inzulin, transzferrin, szelénium]) dúsított tápoldatban. Az üveglemezeket a kívánt időben eltávolítottuk a Petri-csészéből, majd az indukált GFP-4C sejteket („AG-GFP-4C”) implantációra, vagy immuncitokémiai vizsgálatokra használtuk. A sejtek által termelt szolubilis faktorok vizsgálata Az NE-4C sejteket, a primer asztrogliasejteket, az LL-glia, a C6-glióma, az U87 glióma és a GL261 glioblasztóma sejteket 24 óráin át inkubáltuk friss, szérummentes tápoldatban (definiált médium; Neurobasal-B27; Gibco-BRL Life Technologies) 37 C hőmérsékleten, 5% CO2 mellett. A sejtek által 24 óran át „kondicionált” médiumot 1:1 arányban friss definiált médiummal kevertük, és más sejtk tenyészeteihez adva vizsgáltuk a sejtproliferacióra gyakorolt hatását. A sejtek hipoxiás kezelése Indukálatlan, illetve az indukció 0., 2., 4., 6., 8. napján lévő sejttenyészeteket 6, 12 vagy 48 órára hipoxiás kamrába (Billups-Rothenberg, Modular Incubator Chamber) helyeztük. A kamrát alacsony O2-tartalmú gázkeverékkel (1%O2, 5% CO2, 94% N2) töltöttük fel. A 96-lyukú tenyésztő tálcákon növesztett hipoxia-kezelt, illetve kontroll sejttenyészeteken mértük a sejtek életképességét, 24-lyukú tenyésztőedényben növesztett sejteken elemeztük a sejtösszetétel (immuncitokémiai vizsgálatok) és a sejtpusztulás változásait (TUNEL-reakció), valamint a sejtproliferációt ([3H]-timidin), illetve a 60 mm-es Petri-csészében kezelt sejttenyészetekből RNS-t izoláltunk a génexpressziós változások vizsgálataira.
37
A sejt-aggregáció vizsgálatai GFP-4C,
NE-4C,
primer
GFP-jelölt
asztrocita,
LL-glia,
glióma-
és
glioblasztómavonalak tenyészeteit 0,05 v/v % tripszint tartalmazó PBS-sel felvettük a tenyésztő aljzatról, majd szérumos tápoldattal (5 % FCS-MEM) 100 sejt/ l sejtsűrűségű szuszpenziókat állítottunk elő. Egy vizsgálandó fluoreszcens jelzést hordozó és nemfluoreszcens sejt-pár szuszpenzióit 1:1 arányban kevertünk. A sejt-elegyből 5-5 db 20 l-es cseppet raktunk egy 35 mm átmérőjű Petri-csésze tetejének belső felszínére, amelyek átfordításkor a csésze tetejéről lefelé “lógtak”. A függőcseppek alá PBS-t helyeztünk és 12-72 óráig 37 °C-on, 5% CO2 mellett tartottuk fenn a cseppeket. A létrejött „kiméra aggregátumokat” 4% paraformaldehiddel (PFA, TAAB Laboratories Equipment Ltd.) 30 percig fixáltuk, óvatosan lecentrifugáltuk (800 g, 5 perc), bisbenzimidet tartalmazó Mowiolban (Calbiochem, EMD Chemicals) felvettük és emelt szélű tárgylemezre helyeztük. Lefedés után fluoreszcens mikroszkóp segítségével analizáltuk a zölden fluoreszkáló GFP-tartalmú sejtek és a kék magfestést mutató összes sejt viszonyát, az egyes sejttípusok keveredését/szegregációját. A sejtproliferáció mérése Az NE-4C és alklónjai, valamint a különböző tumorsejtvonalak proliferációjának mértékét [3H]-timidin inkorporáció mérésével határoztuk meg. A tenyészetek tápoldatához 4 órára 1μCi/ml végkoncentrációjú [3H]-timidint (Izinta) adtunk. Az inkubációs idő elteltével a tenyészeteket PBS-sel mostuk, majd a sejteket 0,6 ml nátrium-hidroxid
(0,1
N)
oldattal
feltártuk
és
ultrahanggal
szonikáltuk.
A
felszuszpendált sejtanyag 0,4 ml-ét 2 ml szcintillációs koktéllal (Ultima Gold) elegyítettük, majd Wallac 1409 szcintillációs számlálóban mértük a minták [3H]timidint tartalmát. (A beütésszámot [DPM] mintánként 120 sec ideig „számláltuk”). A sejtanyagot tartalmazó oldat 0,02 ml-ét 0,08 ml (5x higított) Bradford reagenssel (Biorad) kevertük össze, és a színreakció 570 nm teszt- és 690 nm referencia hullámhosszakon való mérésével (ELISA reader [Dynatech MR5000]) meghatároztuk a fehérjetartalmat (Bradford 1976). Minden mérést 4 azonosan kezelt tenyészetből származó mintán hajtottuk végre. A DPM értékeket és a fehérjetartalmat átszámoltuk a teljes minta-térfogatra, majd minden minta esetén megadtuk az egységnyi fehérjére korrigált, effektív szcintillációs beütésszámot (DPM/ g fehérje). A minimálisan 4
38
párhuzamos mérésből nyert adatokból átlagot és szórást számoltunk. A különböző kezelt tenyészetek közötti eltérések szignifikanciáját egy- és több szempontos varianciaanalízissel és Student-féle T-teszttel ellenőriztük. Kromoszómaszám-meghatározás A sejttenyészetet egy napra 10%-os FCS-MEM tápoldatba helyeztük. A következő napon 90 perces kolhicin-kezelést (0,5 g/ml; Sigma-Aldrich) végeztünk a sejtosztódás leállítására. A sejteket tripszines kezeléssel (0,05 v/v % PBS-ben) az aljzatról felszabadítottuk, és fugacsőbe helyeztük. Egy fugacsőbe 105 db sejt került 500 l 5%-os FCS-MEM tápoldatban. A médiumhoz cseppenként 1 ml hipotóniás (0,56 %) káliumklorid (KCl) oldatot, majd 2x0,5 ml desztillált vizet adtunk. A hipotonizálás során (összesen 10 perc) a sejteket 37 °C-on (5% CO2) inkubáltuk. Ezt követően a sejtes oldatot 12 percig centrifugáltuk (1500 g). A sejt-csapadékhoz, cseppenként 4 ml frissen készített, 4 °C-os ecetsav-metanol 1:3 elegyet (fixáló) adtunk, állandó enyhe rázás mellett, majd 30 percig termosztátban tartottuk. A folyamatot (centrifugálás-fixálásszuszpendálás-inkubáció) háromszor megismételtük. Végül a sejteket 0,5 ml fixálóban felvettük. Az oldatot zsírtalanított, száraz tárgylemezekre cseppentettük, cseppjeit hagytuk szétfutni a lemezeken. Száradás után 4%-os Giemsa oldattal (Fluka, SigmaAldrich) festettük (5 perc). A festett minta száradása után Depex-szel (Electron Microscopy Sciences) fedtük le a lemezeket. A láthatóvá vált kromoszómákat fénymikroszkópban számoltuk. A különböző sejttípusok kromoszómaszámának eltéréseit statisztikai próbákkal ellenőriztük (variancia-analízis, Student-féle T-teszt). Életképesség-mérés A sejtkultúrák „életképességének” meghatározására MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromid) (Sigma-Aldrich) (Mosmann 1983) és AlamarBlueTM (Biosource) (Ahmed 1994) redukciós tesztet alkalmaztunk. Az MTT teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő edénybe helyeztük 104 sejt/lyuk koncentrációban lyukanként 50 tápfolyadékba. Letapadás után 10
l 5%-os FCS-MEM
l MTT-t adtunk a tápfolyadékhoz és a tenyésztő
edényt 1 óráig 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk. A kialakuló kék formazán kristályokat a sejtekkel együtt 120 l savas izopropil-alkoholban (0,08 N) oldottuk fel.
39
Az AlamarBlueTM teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő edénybe helyeztük 104 sejt/lyuk koncentrációban 100
l 5%-os FCS-MEM
tápfolyadékba. Latapadás után 10% (v/v) AlamarBlueTM reagenst adtunk a táphoz. A viabilitásra mindkét vizsgálat esetén a mért optikai denzitás (OD) értékekből következtettünk. Az OD-t mindkét eljárás esetében 540 vagy 570 nm teszt- és 600, 630 vagy 655 nm referencia-hullámhosszon mértük (Biorad Microplate Reader és Dynatech MR5000 készülék). A mérések 6-16 parallel lyukból történtek, legalább 4 független kísérletben. RT-PCR A GFP-4C és GFP-RC sejttenyészetekből Tri-Reagens (Sigma-Aldrich) segítségével teljes RNS-mintát nyertünk és tisztítottunk ki. A genomiális DNS szennyeződést DNase-I kezeléssel (Fermentas) távolítottuk el. Az izolált RNS-t RNase/DNase-mentes vízben 0.3 mg/ml koncentrációban oldottuk fel és -70 °C-on tároltuk. Mintánként 3 g tisztított RNS-t felhasználva szintetizáltunk cDNS-t a “RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit” (Fermentas) segítségével. A neurogenin2 (ngn2), mash-1, math-2, nanog, sox2, blbp, GFAP, brachyury, hnf4, flk1, actin, hprt transzkriptumok specifikus szekvenciáinak kereséséhez a 2. táblázatban felsorolt primer párokat használtuk. A polimeráz láncreakciót Techne TC-512 géppel végeztük, Quiagen Hot Star Taq DNApolimeráz használata mellett. A felszaporított termékeket etídium bromidot tartalmazó 1%-os agaróz gélen futtattuk és UV átvilágítással vizualizáltuk. 2. táblázat Az RT-PCR vizsgálathoz használt primer-párok
Gének actin blbp brachyury flk1 (VGFR2) GFAP hnf4 hprt math2 nanog ngn2 sox2
Primer-párok 5‟ agctgagagggaaatcgtgc 3‟ 5‟ gatggaggggccggactcat 3‟ 5‟ aagacccgagttcctccagt 3‟ 5‟ atgccttttcataacagcga 3‟ 5‟ tccaggtgctatattgcc 3‟ 5‟ tgctgcctgtgagtcataac 3‟ 5‟ cacctggcactctccaccttc 3‟ 5‟ gatttcatcccactaccgaaag 3‟ 5‟ gactatcgccgccaactgc 3‟ 5‟ cgtccttgtgctcctgcttc 3‟ 5‟ cttccttcttcatgccag 3‟ 5‟ acagtccccatctgaag 3‟ 5‟ cacaggactagaacacctgc3‟ 5‟gctggtgaaaaggacctct3‟ 5‟tgagaatggcttgtccagaagg3‟ 5‟tggtagggtgggtagaatgtgg3‟ 5‟ gcgcattttagcaccccaca 3‟ 5‟ gttctaagtcctaggtttgc 3‟ 5‟aagaggactatggcgtgtgg3‟ 5‟atgaagcaatcctccctcct3‟ 5‟ gccctgcagtacaactccat 3‟ 5‟ acccctcccaattctcttgt 3‟
40
B. Állatkísérletek Az állatkísérletek végzését az MTA KOKI Állatkísérleti Etikai Bizottsága jóváhagyásával, a Fővárosi Élelmiszer és Állategészségügyi Ellenőrző Állomás hivatalos engedélyének (2291/003/Főv/2006; érvényesség: 2011. december 7.) birtokában végeztük. Az állatok kezelése, műtét utáni gondozása megfelelt az Állatvédelmi Törvény előírásainak. Felhasznált állatfajok és törzsek Implantációs kísérleteinkben az MTA-KOKI és az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet állatállományából származó felnőtt NMRI, CD1, C57BL egereket, sejtizolációhoz az MTA-KOKI állatházából származó újszülött (P0-P2) CD1 és transzgenikus hGFAP-eGFP egereket használtunk. Altatás A műtét előtt a felnőtt egerek testsúlyát lemértük. A kb. 20-30 gramm testsúlyú egereket xylazin (25 mg/kg) és ketamin (125 mg/kg) intraperitoneális injekciójával altattuk el. Az altatás mélységét többször ellenőriztük, szükség esetén kisebb kiegészítő dózist alkalmaztunk az altatószerekből. Az újszülött állatokat zárt dobozban, szárazjégre helyezett papírvattára raktuk, és 2-4 perc elteltével műtöttük. Fagyasztásos lézió Az alvó állatokat sztereotaxiás készülékben (Stoelting Co., Lab Standard) rögzítettük. A fejbőrt a sutura sagittalis felett a középvonalban 1 cm hosszan felvágtuk, majd a koponyacsontot a tervezett beavatkozás helyének megfelelő ponton, egy 1,6 mm átmérőjű fúróval átlyukasztottuk. Agykérgi fagyasztásos sértés létrehozásához a kívánt agyi régió felett, a dura materhez egy rézből készült, fertőtlenített fagyasztórúd 1.4 mm átmérőjű, lapos felszínét érintettük hozzá (a középpont koordinátái: Br: -0.7 mm, L:2.3 mm). A készüléket porított szárazjég és aceton keverékével (-60 oC) hűtöttük le és tartottuk hidegen műtét alatt. A fémrúd 30 másodpercig maradt a kemény agyhártya felszínén. A beavatkozás után a területet óvatosan tisztítottuk, fertőtlenítettük, a bőrt zártuk. A bakteriális fertőzések megelőzése érdekében gentamycinnel (1μg/ml) átitatott papírvattával tisztítottuk meg a seb környékét. Az állatokat a műtét alatt és azt követően
41
melegítettük, ébredésüket felügyeltük, majd ≤5-ös csoportokban 36 x 20 cm–es ketrecekbe helyeztük. „Ad libitum” táplálásban, és napi ellenőrzésben részesültek. A fagyasztás napját 0. napként jelöltük meg (D0). Sejtbeültetés Az alkalmazott sejtvonalak sejtjeit 0,05 %-os tripszin- vagy 1 mM EDTA-tartalmú PBS oldattal kezeltük, ezután szérumos tápoldattal a tenyésztő edény aljáról felszedtük. A sejteket Bürker-kamrában megszámláltuk, lecentrifugáltuk (800 g, 5-8 perc), majd a kívánt sűrűségben (104-105 sejt/ l) PBS-be vagy 1 mM EDTA-t tartalmazó PBS-be vettük fel őket közvetlenül az implantáció előtt. A beavatkozásig szobahőmérsékleten vagy 4°C-on tároltuk őket. Beültetés előtt óvatosan felszuszpendáltuk, majd 10 l-es Hamilton-fecskendőbe szívtuk fel a sejtes oldatot (Hamilton, Whittier). A fecskendőt a sztereotaxiás berendezés célzókészülékéhez rögzítettük. A sztereotaxiás készülékben rögzített állatok fejbőrét a sutura sagittalis felett, a középvonalban 1 cm hosszan felvágtuk, majd a koponyacsontot a tervezett beavatkozás helyének megfelelően óvatosan átfúrtuk. A fecskendőt a kívánt koordinátának megfelelően az agyszövetbe mélyesztettük, majd a sejtes oldat 1-1,5 l-ét lassan (0,5 l/perc) befecskendeztük. A beadás után a fecskendőt 90 másodpercig nem mozdítottuk, majd óvatosan visszahúztuk. Beavatkozás után a területet tisztítottuk, fertőtlenítettük, a bőrt zártuk. A bakteriális fertőzések megelőzése érdekében gentamycinnel (1μg/ml) átitatott papírvattával tisztítottuk meg a seb környékét. Az állatokat melegítettük, ébredésüket felügyeltük. Munkáinkban a sejteket a 3. táblázatban található koordináták szerint implantáltuk. A beültetés végeztével a sejtszuszpenziók maradékából sejteket ültettünk ki 96-os és 24-es tenyésztőedénybe, hogy ellenőrizzük túlélésüket, életképességüket és in vitro idegi irányú fejlődésüket. Hiperbárikus oxigén terápia alkalmazása A
hiperbárikus
oxigén
terápiát
(HBO)
a
budapesti
Hiperbár
Centrum
együttműködésével (dr. Gőbl Anna és mtsai) végeztük. A kezelés során a vizsgált állatok magas (2.5 ATA) nyomáson közel 100 %-os oxigént lélegeztek be napi 90 percben, hét napon át, a fagyasztásos sérülés napjától (D0-D6) vagy a sejtimplantáció napjától
(D7-D13)
kezdve.
Kontrollként,
42
fagyasztásos
sérülésben
és/vagy
sejtimplantációban nem
részesülő
állatcsoportokon
is
végeztünk
hiperbárikus
oxigénkezelést. 3. táblázat Az állatkísérletek adatai Egér törzs; állatszám
Műtéti beavatkozás
Implantáció helye (mm)
Implantált sejtek száma (db)
Túlélési idő
NMRI, CD1, C57BL 34 db
GFP-4C, PLAP-4C, GFP-RC implantáció
Br -0.1, L 3.2, V 1.4 Br -0.1, L 1.2, V 2.0 Br 0,0, L 1,6, V 2,5 Br 0,0, L 2,6, V 2,5 Br 0,0 L 1,1 V 2,0
1,5x104-105
7, 14, 21 nap, 1, 2 hónap
Fagyasztásos lézió
Br -0,7, L 2,3 105
14, 21, 30, 60-62 nap
5x104
7, 21 nap
5x104
7 nap, 1, 2 hónap 3, 7, 10, 14 nap
NMRI 42 db CD1 12 db
majd GFP-4C és GFP-RC implantáció RA-GFP-4C/ AG-GFP-4C implantáció Fagyasztásos lézió
Br -0.1, L 3.2, V 1.4 Br -0.1, L 1.2, V 2.0 Br -0,7, L 2,3
NMRI 30 db
majd RA-GFP-4C/ AG-GFP-4C implantáció
Br -0.1, L 2.5, V 2.0
C57BL 10 db
GL261 implantáció
Br 0,0, L 1,6 V 2,5
104
GL261 implantáció
Br 0,0, L 1,6, V 2,5
104
majd PLAP-4C implantáció GL261 és PLAP-4C ko-implantáció
Br 0,0, L 2,6, V 2,5/ Br 0,0 L 1,1 V 2,0
2.5x10
Br 0,0, L 1,6, V 2,5
GL261: 1.5x104 PLAP-4C: 1.5x104
3, 7, 11, 14 nap
Fagyasztásos lézió
Br -0,7, L 2,3
majd GFP-4C implantáció
Br -0.1, L 3.2, V 1.4
5x104-105
14, 21 nap, 2 hónap
majd HBO kezelés
-
GFP-4C implantáció
Br -0.1, L 3.2, V 1.4
majd HBO kezelés
105
-
14 nap, 2 hónap
Fagyasztásos lézió majd HBO kezelés
Br -0,7, L 2,3 -
-
Fagyasztásos lézió
Br -0,7, L 2,3
-
Viselkedés-kontroll
-
-
C57BL 10 db CD1 11 db NMRI 16 db
NMRI 6 db NMRI 15 db NMRI 14 db NMRI 27 db
7, 14 nap
43
4
7, 14, 42 nap, 2 hónap 7, 14, 42 nap, 2 hónap -
Viselkedésvizsgálatok A szenzorimotoros és koordinációs működések felmérésére a fagyasztásos sértés, sejtbeültetés, hiperbárikus oxigénterápiás kezelések után különböző időpontokban viselkedésteszteket végeztünk (Metz és Schwab 2004, Aronowski és mtsai 1996, Connor és mtsai 1999 alapján módosítva). A teszteket a beavatkozások előtt és kontroll állatokon is elvégeztük a “bázisparaméterek” felmérésére és kontroll adatok nyerésére. A műtött és kontroll állatcsoportokban a viselkedés-vizsgálatot a beavatkozást követő 1., 4., 7., 14., 30. és 60. napon végeztünk. „Sticky tape” teszt A teszt azt vizsgálja, hogy mennyi idő alatt veszi észre és távolítja el az állat a talpára ragasztott 0,8 cm x 0,8 cm-es ragasztószalagot. A ragasztószalag egyik hátsó végtagra való felhelyezése után, az állatokat maximum 4 percig figyeltük. A vizsgálatot, a jelzett posztoperatív időpontokban, mindkét hátsó végtagon elvégeztük. A kísérletekben időpontonként 3-12 állat szerepelt. A szalag eltávolításához szükséges időt az érintett és ép oldalon minden csoportban külön átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és variancia-analízissel vizsgáltuk az állatcsoportok közötti eltérések szignifikanciáját. “Tight rope” teszt Az állatok mellső lábait egy vízszintesen kifeszített, 120 cm hosszú, 4 mm átmérőjű madzagra helyeztük. 2 percig figyeltük, hogy az egyes állatok fel tudnak-e kapaszkodni és ki tudnak-e mászni a madzagon az azt tartó függőleges oszlopig. Minden állatot 3x teszteltünk. Az értékelésre a 4. táblázatban látható pontrendszert alkottuk meg. 4. táblázat Tight rope pontrendszer
7 pont
<30 mp alatt eléri az oszlopot
6 pont
30-60 mp alatt eléri az oszlopot
5 pont
60-90 mp alatt eléri az oszlopot
4 pont
90-120 mp alatt eléri az oszlopot
3 pont
90-120 mp-et a kötélen tölt
2 pont
60-90 mp-et a kötélen tölt
1 pont
30-60 mp-et a kötélen tölt
0 pont
<30 mp alatt leesik a kötélről
44
A kapott pontszámot minden csoportban átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és variancia-analízissel vizsgáltuk a csoportok közötti eltérések szignifikanciáját. Mellső végtag aszimmetria teszt Az állatokat 15 cm magas, 10 cm átmérőjű átlátszó műanyag hengerbe helyeztük. A henger felderítésekor az állatok hátsó végtagjaikra nehezedve mellső végtagjaikat a henger falának támasztották. A felderítő viselkedést videokamerával 3-5 perc hosszan rögzítettük, majd a mellső végtagok használatát, a végtagpreferenciát, az esetleges paresist, plégiát elemeztük. Az értékelésre az 5. táblázatban látható pontrendszert alkottuk meg. 5. táblázat Mellső végtagi aszimmetria teszt pontrendszer
4 pont
Szimmetrikus
3 pont
Enyhén aszimmetrikus
2 pont
Mérsékelten aszimmetrikus
1 pont
Súlyosan aszmmetrikus (forog a hengerben)
0 pont
mellső végtagmozgások
Hemiplegia
A kapott pontszámot minden csoportban átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és variancia-analízissel vizsgáltuk a csoportok közötti eltérések szignifikanciáját.
C. A preparátumok feldolgozása Fixálás, metszés Az állatokat mély altatásban, szíven át perfundáltuk. A bal szívkamrán át PBS-t, majd 4% PFA-t áramoltattuk át perfúzor segítségével. Az agyat a koponyaüregből eltávolítottuk, majd 4% PFA-val utófixáltuk egy napon át. Ezt követően nátrium-azidot (0,1%) tartalmazó 25%-os glükózoldatban legalább 1 napos krioprotekciót végeztünk. Fagyasztó szánkamikrotom segítségével az agyakból 30
m vastagságú úszó
metszeteket készítettünk. Hat-tíz párhuzamos metszetsorozat készült minden agyról, amelyeket különböző immuncitokémiai vizsgálatokban használtunk fel. A festéseket szabadon úszó metszeteken, vagy tárgylemezre rögzített metszetek esetén, cseppfestéssel végeztük. A tenyésztőedényekben, üveglemezeken növesztett sejttenyészeteket
45
PBS-sel átöblítettük, majd 4 %-os paraformaldehiddel 20 percig szobahőmérsékleten fixáltuk. Hif-1 festés esetén a mosást és fixálást is 4 °C-on végeztük. A tenyészeteket ezután háromszor PBS-sel mostuk. TUNEL-reakció A tenyészetekben és agymetszetekben az apoptotikus-(nekrotikus) sejtek detektálására TUNEL reakciót alkalmaztunk (TMR Red, Roche). Az eljárás alkalmazása során az apoptózisban gyakori DNS törések szabad 3‟ végeihez a TdT (terminális deoxinukleotidil-transzferáz)
enzim
jelölt
nukleotidokat
kapcsol,
amelyek
fluoreszcenciája alapján, a 3‟ végek felszaporodása detektálható. Immuncitokémiai festések Az úszó metszeteket PBS-ben oldott 0.5%-os Triton X-100 detergenssel (Calbiochem, EMD Chemicals) 5-10 percig, az üveglemezen lévő tenyészeteket 0.1% Triton X-100 detergenssel 10 percig permeabilizáltuk. Az aspecifikus antigén-kötés elkerülésére a metszeteket és sejttenyészeteket 1-2 %-os borjú szérum albumint (BSA) tartalmazó PBS vagy 5%-os FCS-PBS oldattal 90 percig szobahőmérsékleten kezeltük. Permeabilizálásnál és/vagy blokkolásnál kivételt képezett 1. az SSEA-1 sejtfelszíni antigén festése, ahol nem volt szükség permeabilizálásra, 2. a NeuN magi festés, ahol erős permeabilizálásra volt szükség, tehát a Triton X-et 0,1-0,5%-ban először a blokkolóban oldva 90 percig, majd az első réteg ellenanyaggal együtt blokkolóban oldva 0,1 % koncentrációban egy éjszakán át alkalmaztuk, 3. a Hif-1 magi festés, ahol 0,5%-os Triton X-100 vagy 1%-os NP-40 (nonylphenyl polyethylene glycol, Calbiochem, EMD Chemicals) detergenssel 20 perces permeabilizálást végeztünk. A 0,1 % nátrium-azid tartalmú blokkolóban oldott első réteg ellenanyag (6. táblázat) oldatában egy éjszakán át 4oC-on inkubáltuk a metszeteket/tenyészeteket. A második réteg ellenanyagot 0,1 % nátrium-azid tartalmú blokkolóban, vagy (peroxidáz enzim használata esetén) azidmentes PBS-ben hígítottuk fel, és 90 percig alkalmaztuk szobahőmérsékleten. Második réteg ellenanyagként biotinnal vagy Texas Red-del, illetve Alexa 594-gyel konjugált anti-egér vagy anti-nyúl IgG-t vagy IgM-t használtunk
46
(6. táblázat). Amennyiben a második réteg IgG- / IgM-biotin volt, az immuncitokémiai reakció során harmadik réteget is használtunk [avidin-Alexa488; avidin-Alexa594 (1/1000; Molecular Probes, Invitrogen), avidin-Texas Red (1/500; Vector Laboratories) fluoreszcens konjugátumokat vagy avidin-peroxidáz enzimet (1/1000; Sigma-Aldrich)]. A harmadik réteget 0.1%-os nátrium-azidos, vagy (peroxidáz enzim használata esetén) azidmentes PBS-ben higítottuk, metszeteinket/tenyészeteinket a harmadik réteg oldatában 60 percig inkubáltuk. A rétegek között 3x5-10 perces mosást végeztünk blokkolóval vagy PBS-sel. Peroxidáz enzim használatakor az enzimhez a 0.55 mg/ml 3,3'-diamino-benzidint (DAB, Sigma-Aldrich) adtunk 0.1%-os hidrogén-peroxid jelenlétében. A barna csapadék megjelenésekor 0.1%-os nátrium-aziddal gátoltuk az enzimet.
A peroxidáz-reakció
eredményét
fénymikroszkóppal,
a
fluoreszcens
konjugátumokkal történő festés eredményét fluoreszcens mikroszkópos technikával értékeltük. 6. táblázat Kísérleteinkben használt első és második réteg ellenanyagok
Antitest
Gyártó
Hígítás
Exbio
1 / 1000
Egér monoklonális IgG1
Chemicon, Millipore
1 / 1000
Egér monoklonális IgG1
Sigma-Aldrich
1 / 1000
Poliklonális nyúl szérum
Polysciences
1 / 1000
Egér monoklonális IgG1 Nyúl poliklonális immunglobulin Egér monoklonális IgG(2b)
Sigma-Aldrich
1 / 2000
Dako
1 / 250
Novus Biologicals
1 / 1000
SSEA-1
Egér monoklonális IgM
DSHB
1 / 1000
Nestin
Egér monoklonális IgG1
Chemicon, Millipore
1 / 1000
Egér IgG1
Ló poliklonális IgG biotin Kecske poliklonális IgG - Texas Red
Vector Lab. Jackson Immunoresearch Molecular Probes, Invitrogen Jackson Immunoresearch
1 / 1000
Specificitás III-tubulin
Típus Egér monoklonális IgG1
Neu-N NeurofilamentL NSE GFAP GFAP Hif-1
Nyúl IgG Nyúl IgG
Csirke IgG - Alexa 594
Egér IgM
Kecske IgM biotin
47
1 / 100 1 / 500 1 / 1000
Mikroszkópos kiértékelés A fagyasztott metszeteket közvetlenül krioprotekció után vagy immuncitokémiai festést követően tárgylemezekre húztuk fel, majd a lemezeket 10
g/ml bisbenzimidet
(Hoechst 33258, Sigma-Aldrich) tartalmazó Mowiol fedőanyaggal (Calbiochem, EMD Chemicals) fedtük le. A lemezen fixált és festett sejttenyészeteket desztillált vizes öblítést követően tárgylemezre cseppentett Mowiol-Bisbenzimidre (10 l) fordítottuk úgy, hogy a sejtek a tárgylemez és a tenyésztő lemez között helyezkedtek el. A kiértékelés és fotózás ApoTome technikával felszerelt Zeiss Axiovert 200M és Nikon Eclipse TS100 mikroszkóp segítségével történt. Sejtszámolás: 4-4 párhuzamos tenyészet 10-10 látóteréből készített felvétel alapján Image J program segítségével leszámoltam az összes sejt (Hoechst) és a specifikusan jelölt sejtek számát, majd ez alapján kiszámoltam a specifikus sejtek hozzávetőleges átlagos százalékos előfordulási arányát a tenyészetben. Sejtek által elfoglalt intracerebralis térfogat mérése: Sorozatmetszeteken mértük meg a GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogatot, majd az adatokból a metszetvastagság (30μm) és köztes metszetek számának ismeretében kiszámoltuk a közelítő sejttérfogatértékeket. A számításokat 3-5 agy feldolgozásával ismételtük; a csoportok eltéréseit statisztikai próbákkal vizsgáltuk. Mitózis-számlálás: Hoechst magfestéssel megjelölt agymetszeteken 6-6 reprezentatív területet választottunk ki a repopulált poszt-léziós zónából. Minden agyról sorozatfelvételeket készítettünk a metszet teljes vastagságában (Zeiss Axiovert, Apotome technika). A teljes, sejtek által lefedett területet Image J program segítségével határoztuk meg. Az egységnyi, sejtek által elfoglalt területre eső metafázisos kromoszómákat tartalmazó sejtek számát meghatároztuk, a csoportok eltéréseit statisztikai próbákkal vizsgáltuk. Statisztikai próbák A minták közötti eltéréseket egy- és többszempontos variancia analízissel (ANOVA), és Student-féle T-teszttel értékeltük. 0,05
48
Eredmények I. NE-4C sejtek „sorsa” intakt és sérült felnőtt agyi környezetben
A laboratóriumunkban korábban nyert adatok szerint, míg az NE-4C idegi őssejtek integrálódnak az embrionális agyszövetbe, túlélésüket és szöveti fejlődésüket a kifejlett agyszövet nem támogatja. Mivel a szövetgenezis és regeneráció sok lépése hasonlóan zajlik, felvetődött a kérdés, vajon a felnőtt sérült agyszövetben túlélnek és vándorolnake illetve idegszövetté differenciálódnak-e ugyanezen idegi őssejtek. I.1 NE-4C sejtek fagyasztással sértett agykérgi területeken Kezdeti munkám során megvizsgáltam a zöld fluoreszcens fehérjét expresszáló GFP-4C idegi őssejtek viselkedését „intakt” és fagyasztásos lézión átesett modellállatok agyában. A fagyasztásos sértést felnőtt egerek (n=42 db) előagykérgében idéztünk elő, Klatzo (1958) és Murakami (1999) metódusa alapján. Ennek előnye, hogy reprodukálható méretű károsodást eredményez. A fagyasztással elölt „magi régióban” gyors sejtpusztulás (nekrózis-apoptózis) indul meg, míg a távolabbi, mélyebb kérgi területen („széli zóna”) késleltetett apoptotikus folyamatok zajlanak. A fagyasztórúd méretétől, hőmérsékletétől és a fagyasztás időtartamától függően a magi és széli régió kiterjedése változtatható. Az általunk alkalmazott fagyasztásos beavatkozás 1,7 ( 0,4) mm átmérőjű félgömb alakú sérült területet eredményezett az agykéregben, amelynek középponti koordinátáit az alábbiakban határoztuk meg: Br: -0,7; L 2,3 mm. A műtét napját nulladik napként (D0) jelöltük. A fagyasztásos beavatkozást követő hetedik napon (D7) a sértett és kontroll állatok agykérgi régiójába GFP-4C idegi őssejteket ültettünk. Az időpont kiválasztásánál döntő szempont volt, hogy kivárjuk a vazogén agyödéma lecsengését (Murakami 1999). Az implantáció helyét és a beültetett sejtek számát előzetes vizsgálatok alapján úgy válaszottuk meg, hogy az agykérgi sérülés fénymikroszkóposan azonosítható nekrotikus határzónájától 1 mm-re lateralisan (Br:-0,1; L: 3,2; V: 1,4 mm), a sértés széli zónájába kerüljön a bejuttatandó 105 db GFP-4C sejt (12 / A, B. ábra).
49
Fagyasztásos lézió Kp: Br -0.7, L 2.3
Sejtbeültetés, (sejtvándorlás) Br -0.1, L 3.2, V 1.4 D7
D0
Nekrotikus mag
A
www.mbl.org Br 0.0
B
Peri-nekrotikus széli zóna
D14
12. ábra A: Agykérgi fagyasztásos sérülés és GFP-4C sejtbeültetés vázlatos képe a beavatkozások koordinátáival. B: Fáziskontraszt mikroszkópos kép az agykérgi sértés és implantáció területét mutató metszetről a fagyasztás utáni 14. napon. Világoskék betűk, kiemelés és nyilak: fagyasztás; zöld betűk, kiemelés és nyilak: sejtbeültetés és sejtvándorlás. Mérce: 1 mm.
A kontroll állatok implantációja azonos koordináták szerint történt. A beültetéshez fluoreszcencia intenzitás alapján (FACS) válogattuk ki a legerősebb fluoreszcenciát mutató GFP-4C sejteket. Az implantált sejtek túlélését, differenciálódását, vándorlását, proliferációját a kísérlet kezdetétől számított 14., 21., 30. és 60. napon vizsgáltuk. A beültetett sejteket fagyasztott metszeteken GFP-fluoreszcenciájuk alapján azonosítottuk. Idegsejt és asztroglia irányú differenciálódásukat
III-tubulin-, NeuN- és GFAP-
immunreakciók segítségével vizsgáltunk. A fagyasztást követő 14.-29. túlélési napon megvizsgált állatok közül a sértett agykérgű állatokban ~64%-ban, míg a kontroll állatokban csupán ~24%-ban találtunk élő GFP-4C sejteket. A 30.-60. túlélési napon vizsgált sértett és kontroll állatcsoportok között a különbség tovább nőtt. Míg a sértett agykérgű állatok ~71%-ában jelen voltak a beültetett sejtek, illetve azok leszármazottai, egyetlen ép agykérgű állatban sem találtunk túlélő implantált sejtet (7. táblázat). 7. táblázat A GFP-4C sejtek túlélése sértett agykérgű és kontroll állatok agyában
Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya Túlélési idő
Sértett agykérgű
Kontroll
D14-29
63,6% (22/14)*
23,8% (21/5)
D30-60
70,6% (17/12)
0% (10/0)
*zárójelben: összes kezelt állat/élő GFP-4C sejtet hordozó állat az adott napon
50
Ép állatokban - a korábbi kísérletek eredményevel egybecsengően - az implantált GFP4C sejtek az agykéregben kis aggregátumokat alkottak. A beültetés helyétől jelentős távolságra nem vándoroltak. A 60. napra nyom nélkül eltűntek a befogadó agyakból. Sérült agykérgű állatokban a túlélő GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat az agyban 34-szeresére nőtt a megfigyelés 8 hete alatt. A GFP-4C sejtek által elfoglalt területek átlaga a 14. napra 1,03 mm3, az 53. poszt-implantációs napra (a kísérlet kezdetétől
A GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat az agyban (mm3)
számított 60. nap) 3,63 mm3 térfogatot ért el (13. ábra). 5
13. ábra GFP-4C sejtkolóniák térfogata lézionált ( ) és ép (■) felnőtt agyban a beültetés utáni különböző időpontokban. Az átlag és szórás értékeket 4-5 állat adataiból számoltuk minden időpontban. A csoportok közötti eltéréseket többszempontos varianciaanalízissel értékeltük *: p<0,05
*
4
3
2
1
0 0
10
20
30
40
50
60
Beültetés utáni napok
Az első két posztimplantációs héten a sérülés magi zónájában kevés élő –gazda vagy implantált- sejtalakot találtunk. A nagyrészt elhalt magi régió a hisztológiai feldolgozás során esetenként az agyból kiesett, a további vizsgálat számára elveszett. GFP-4C őssejtek a lézió széli zónájában éltek túl, és a kérgestest rostkötegei mentén is vándoroltak (14. ábra). A
GFP
B
GFP / GFAP
Magi régió ctx
cc D14
Perinekrotikus széli zóna
D14
D14
str
14. ábra A: Túlélő implantált GFP-4C sejtek (zöld) a sérülés széli régiójában gliotikus zónával körülvéve (GFAP: vörös). (Sárga festődés a magi régióban: elpusztult sejtek maradványai.) Mérce: 60 m B: GFP4C sejtek (zöld nyilak) a sérülés széli zónájában és vándorló GFP-4C sejtek a corpus callosumban (cc). Str: striatum, ctx: cortex. Mérce: 300 m. Fluoreszcens (A) és fáziskontraszt (B) mikroszkópos képek.
51
A szürkeállományban nem találtunk egyedi, vándorló GFP-4C sejtet. Oldalkamrában túlélő GFP-4C sejtcsoportot több állatban azonosítottunk. Egy héttel a beültetés után a bejuttatott sejtek SSEA-1 őssejt markert hordoztak (15. ábra). SSEA-1
15. ábra Az oldalkamrában túlélő GFP-4C sejtcsoport sejtjei felszínükön hordozták az SSEA-1 őssejt-antigént. Fluoreszcens mikroszkópos felvételek. 14. kísérleti nap. SSEA-1-immuncitokémia, vörös (str: striatum, vl: oldalkamra) Mérce: 25 m
vl
str
D7
SSEA-1 immunreaktív sejteket azonban találtunk a GFP-t nem expresszáló sejtek között is. Bár nem zárható ki, hogy a beültetett sejtek egy részében a GFP-szint a detektálhatóság alá csökkent, fel kell tételeznünk, hogy a lézionált / implantált területen a gazda szövet differenciálatlan sejtjei is felszaporodtak. A sérülés széli zónájában erősen GFAP-pozitív gliotikus határzóna képződött, amely a túlélő őssejteket is körbefonta. A GFAP-immunreaktív asztrociták között előfordultak beültetett őssejteredetű sejtek is (16. ábra). A
GFP
B
GFAP
Hoechst
D
Hoechst / GFP / GFAP
D14 C
16. ábra A széli zónában a 14. napon GFAP-pozitív, asztrocitává alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) is jelen voltak. Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. (A: GFP, zöld, B: GFAP, vörös, C: Hoechst magfestés, kék, D: egymásra vetített hármas fluoreszcens kép) Mérce: 10 m
52
Hosszabb túlélés (5-8 hét) során a poszt-nekrotikus magi részt és az azt körülölelő penumbrát is sejtek népesítették be (17. ábra). A
Hoechst
B
ctx
ctx
ctx
cc cc
vl
GFAP
GFP C
cc vl
D60
vl
17. ábra A GFP-4C sejtek (fehér nyíl) a második kísérleti hónapra (60. nap) az agykérgi sérülés magi és széli régióját is benépesítették. A sérült terület határán lévő gliotikus zónát nem lépték át az ép szövet felé. Fluoreszcens mikroszkópos képek. (A: Hoechst magfestés, kék, B: GFP-fluoreszcencia, zöld, C: GFAP-immunpozitivitás, vörös) Ctx: agykéreg, cc: corpus callosum, vl: oldalkamra. Mérce: 500 m
A GFP-4C sejtekkel benépesített területen sok gazda- és GFP-4C-eredetű asztrocitát azonosítottunk. A „benépesített” régió egy gliotikus határral élesen elvált az intakt szövettől. A GFP-4C sejtek az ép parenchymába nem vándoroltak be. Növekvő, nyúlványos sejteket tartalmazó csoportjaikon belül csak egy-egy olyan sejtet észleltünk, amely idegsejtre rendelkező morfológiát mutatott és ( III-tubulin) idegsejt-markert is expresszált (18. ábra). A GFP-4C utódsejtek túlnyomó többsége azonban idegsejtirányú differenciálódást nem mutattott (19. ábra). A
GFP
B
III-tubulin
C
GFP / III-tubulin
D60
18. ábra A GFP-4C sejtek között a 60. napon csupán egy-egy III-tubulin pozitív idegsejtet találtunk. Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. (A: GFP fluoreszcencia, zöld, B: III-tubulin immunpozitivitás, vörös, C: kettős pozitivitás, sárga) Mérce: 20 m.
53
GFP B* B
A ctx
NeuN ctx
C
GFP / NeuN ctx
D60
19. ábra A beültetett őssejtek (zöld) NeuN idegsejtmarker-pozitivitást nem mutattak. Fluoreszcens mikroszkópos képek. D60: 60. kísérleti nap. Ctx: agykéreg. A: GFP fluoreszcencia, zöld, B: NeuN immunpozitivitás, vörös, C: egymásra vetített kettős kép. Mérce: 100 m.
Implantációs kísérleteink megmutatták, hogy a felnőtt, előzetesen nem sértett agykéreg szöveti környezete az őssejtek hosszútávú túlélését, elköteleződését, szövetspecifikus integrációját nem támogatja. Ezzel szemben a felnőtt, sérült cortex környezete hosszútávú túlélésüket, a sejthiányos szöveti tér benépesítésében való részvételüket
segíti,
gliogenezisüket
nem
gátolja,
azonban
idegsejt-irányú
elköteleződésüket nem segíti elő. Az ép és sérült agykéregben tapasztalt eltérő őssejt-viselkedést okozhatja az eltérő szöveti környezet (a sértés hatására megváltozott ECM, adhéziós molekulák, sejtes elemek, növekedési faktorok, stb.). Előfordulhat azonban, hogy az eltérő környezet a beültetett sejtklón sejtjei közül szelektálja az adott körülmények között leggyorsabban szaporodó „mutánsokat”, és ezzel a sejtpopuláció intrinszik tulajdonságai változtak meg. Utóbbi tényező vizsgálatára a lézió környéki agykérgi részt több modellállat agyából (n=3) 53 napi poszt-implantációs időszak után kimetszettük és egysejtes szuszpenziókra disszociáltattuk. A GFP-4C sejteket a szuszpenziókban azonosítottuk, a „visszatenyésztett” klónokat GFP-RC-ként jelöltük. A GFP-RC sejteket az “anyaklón” sejtjeivel összehasonlítottuk. A visszatenyésztett sejtek morfológiája minden esetben a GFP-4C klónnal azonos volt (20/ A ábra). A visszatenyésztett sejtek retinsavas indukció hatására az anyaklónhoz hasonlóan ideg- és gliasejtekké fejlődtek (20/B, C ábra). A sejtek 40%-a képezett immunhisztológiai módszerrel azonosítható idegsejteket a kezelés 5.-7. napjára. A sejtelköteleződés folyamata az NE-4C- és GFP-4C-elköteleződés korábban leírt karakterisztikájának megfelelt (Schlett 1997). Proliferációs rátájuk, ciklusidejük és kromoszómaszámuk az anyaklónnal azonosnak bizonyult (21. ábra).
54
A
B
III-tubulin
RA0-2, fix. 7
C
GFAP
RA0-2, fix. 14
20. ábra A: A GFP-RC sejtklón tenyészetben az „anyaklónnal” megegyező morfológiát mutatott. Fáziskontraszt mikroszkópos kép. B: A retinsavas indukció 7. napjára a GFP-RC tenyészetben a GFP-4Chez hasonló arányban jelentek meg III-tubulin pozitív idegsejtek (barna). Fénymikroszkópos kép. C: A retinsavas indukció 14. napjára a GFP-RC tenyészetben a GFP-4C-hez hasonló arányban jelentek meg GFAP-pozitív asztrociták (vörös). Fluoreszcens mikroszkópos kép. RA0-2: 48 órás retinsavas kezelés a kísérlet 0.-2. napján, fix.: fixálás időpontja (nap). Mérce: 25 m 20. ábra B: A GFP-4C ( ) és GFP-RC (■) sejtklónok in vitro MTT(oxidoredukciós) eljárással történő életképességvizsgálata azonos proliferációs rátát és ciklusidőt mutatott. Az y tengelyen szereplő életképességértékeket (módszert illetősen ld. Módszerek fejezetet) 4 független mérés adataiból nyertük. Az elvégzett statisztikai próbák a minták között releváns különbséget nem igazoltak.
A
Életképesség
0,6
0,4
0,2
0 0
10
20
30
40
50
60
70
C
Idő (óra) [kiültetés után]
B
Kromoszómaszám
80
60
40
D 20
0 GFP-4C
GFP-RC
Sejtklónok
21. ábra B: A GFP-4C és GFP-RC sejtklónok kromoszómaszámlálása azonos értéket mutatott (egyszempontos varianciaanalízis, p=0.186. C, D: A GFP-4C sejtek (C) és GFP-RC sejtek (D) kromoszóma-készlete. Fénymikroszkópos kép. Mérce: 10 m.
55
Összehasonlító RT-PCR elemzések nem jeleztek különbséget a GFP-4C és GFP-RC sejtek génexpressziós profilja között (22/ A ábra). A visszatenyésztett sejtek sem indukálatlan, sem indukált állapotban nem expresszálták az entoderma-specifikus (hnf4, flk1) géneket. Az indukálatlan állapotban jellemző brachyury-expesszió az idegi irányú differenciálódás beindulása után mindkét (GFP-4C, GFP-RC) preparátumban megszűnt, míg a ngn2 (neurogenin2) pro-neurális gén a neuronképzés időszakában (a retinsavas kezelés kezdetétől számított 7. napon) expresszálódott.
ctx
cc vl
21. ábra A: A GFP-4C és GFP-RC sejtklónok génexpressziós profiljai között RT-PCR vizsgálattal eltérést nem találtunk. RA : indukálatlan tenyészetek, RA 0-2: a kísérlet 0-2. napján 48 órás retinsavas kezelést kapott tenyészetek. Mintavétel az indukált tenyészetekből a 7. napon történt. -: negatív kontroll [RNS-mentes minta], +: pozitív kontroll [15 napos teljes egér embrió teljes RNS-minta]). B: A GFP-RC sejtek a GFP-4C sejtekhez hasonlóan intakt agyi környezetben néhány héten belül nyomtalanul eltűnnek (fehér nyíl: a GFP-RC beültetés helye az agykéregben). Fluoreszcens mikroszkópos kép. D21: 21. kísérleti nap. Ctx: agykéreg, cc: corpus callosum, vl: oldalkamra. Mérce: 500 m
In vivo viselkedésük összehasonlítására a GFP-RC-t és GFP-4C-t is felnőtt egerek (n=3) sértetlen agykérgébe ültettük a korábbi koordináták szerint. A GFP-RC sejtek, hasonlóan az “anyaklónhoz” rövid ideig éltek túl az agyi környezetben, nem integrálódtak, és a 6. hétre nyomtalanul eltűntek az agyból (22/ B ábra). Sejt-visszatenyésztés révén nyert adataink azt bizonyítják, hogy a GFP-4C sejtek eltérő viselkedése sérült agykérgi környezetben nem a sejtek klonális tulajdonságainak megváltozása révén következett be. A tapasztalt változásokat az eltérő szöveti környezet váltotta ki.
56
I.2 Az NE-4C sejtek kölcsönhatása tumorsejtekkel Az őssejtek és a tumorsejtek sejtfelszíni molekulái, illetve az igényelt ECM-kötött és diffúzibilis faktorok között jelentős hasonlóság mutatható ki. Bizonyos tumorok által termelt speciális ECM és diffúzibilis faktorok (kemokinek, citokinek, őssejt-faktor) az őssejtek tumor-irányú tropizmusát elősegítik (Ziu és mtsai 2006, Xu és Zhu 2007). Egyes őssejtekől bebizonyították, hogy képesek agytumorokba bevándorolni, tehát elméletileg alkalmasak lehetnek arra, hogy a tumoros szövetbe juttassanak sejtszaporodást gátló, apoptózist indukáló hatóanyagokat (infektált terápiás gének expresszióján keresztül) [Aboody 2000, Benedetti 2000, Ehtesham 2002a,b]. A neoplasztikus szövet agyi környezete sok tekintetben eltér a normál szöveti körülményektől, így érdemes volt megvizsgálni, hogy ebben a környezetben, illetve a tumor belsejében képesek-e vándorolni a kívülről bevitt őssejtek. Munkáink során tanulmányoztuk, hogy az NE-4C idegi őssejtek in vitro képesek-e kölcsönhatásokat kialakítani különböző típusú idegszöveti tumorsejtekkel. Ezek alapján választottuk ki in vivo kísérleteinkhez a megfelelő tumorsejttípust. Kísérleteinkhez C6 patkány glióma (Benda és mtsai 1968), GL261 egér eredetű glioblasztóma (Ausman és mtsai 1970, Désaknai és mtsai 2003, Szatmári és mtsai 2006), spontán immortalizált egér glia (LLglia, Dr. Latzkovits Lászlótól), és U87 humán asztroglióma (Ponten és Macintyre, 1968) sejtvonalakat használtunk. I.2.1 Kontakt kölcsönhatások vizsgálata függőcsepp-módszerrel A tumor-célzásra való alkalmazáshoz alapfeltétel, hogy az őssejtek és tumorsejtek egymással
keveredni
tudjanak,
adhéziós
sajátosságaik
megengedjék
kontakt-
kölcsönhatások létesítését. A különféle tumorsejtek és NE-4C őssejtek közötti sejt-sejt kölcsönhatások
tanulmányozására
közvetlen
kontaktus
kialakítására
alkalmas
függőcsepp-módszert alkalmaztunk (Wobus és mtsai 2002). A módszer megmutatja, hogy az adhezív felület hiányában egymáshoz tapadó, egymással kölcsönhatásokat létesítő sejtek csak a saját sejttípusukkal, vagy a tumorsejtekkel elkeveredve találhatóke a sejtaggregátumokban. Amennyiben az összekevert őssejtek és tumorsejtek/primer gliasejtek egymással nem tudnak kölcsönhatást teremteni, vagy a kölcsönhatás gyenge,
57
az aggregátumban a kétféle sejttípus szegregál („sorting out”) (Steinberg 1963). Az egymással erős kölcsönhatásokat kialakító sejttípusok sejtjei elkeverednek. A kísérlet során 103 db NE-4C/GFP-4C sejtet és 103 db GL261 vagy U87 vagy C6 tumorsejtet, mesenchymális őssejtet vagy GFP-vel jelölt primer egér asztrocitát egymással összekevertünk, majd 72 órán át közös függőcseppben tenyésztettük. Az elkeveredést/szegregációt a függőcseppek fixálását követően fluoreszcens mikroszkópos technikával vizsgáltuk. A GFP-4C sejtek vizsgálatainkban elkülönültek a primer asztrogliasejtektől és a C6 patkány glióma, U87 humán glióma és az LL-immortalizált egér gliasejtektől. Ezzel szemben egyenletesen elkeveredtek a GL261 egér glioblasztómasejtekkel és egér mesenchymális őssejtekkel (8. táblázat). A GFP-vel jelölt primer asztrogliasejtek minden gliómasejt-típussal elkeveredtek, míg az NE-4C sejtektől szegregáltak (8. táblázat, 23. ábra). A GFP-4C őssejtek tehát kizárólag a GL261 glioblasztóma tumortípussal
tudtak
sejt-sejt
kölcsönhatásokat
létesíteni,
azaz
sejtfelszíni
kölcsönhatásaik nem gátolták a kétféle sejt „együttélését”. 8. táblázat Az NE-4C/GFP-4C őssejtek és a hGFAP-eGFP asztrogliasejtek sejt-sejt kölcsönhatásai glióma- és egyéb sejttípusokkal
C6 glióma LL-glia GL261 glioblasztóma U87 glióma Mesenchymális őssejt NE-4C
GFP-4C
hGFAP-eGFP primer asztroglia
Szegregáció Szegregáció Keveredés Szegregáció Keveredés -
Keveredés Keveredés Keveredés Keveredés Szegregáció
I.2.2 Szolubilis kölcsönhatások in vitro vizsgálata Mivel az őssejtek és tumorsejtek „együttélése” folyamán mind az ős-, mind a tumorsejtek által
termelt
szolubilis faktorok
előidézhetik a másik
sejttípus
proliferációjának változását, amely nem kívánt eredményt adhat (őssejt-tumor, tumorprogresszió), megvizsgáltuk, hogy az NE-4C őssejtek és egyes tumorsejtek kondícionált médiumai hogyan hatnak a sejtek proliferációjára. Ehhez NE-4C, különböző tumor és primer egér asztrocita sejteket szérummentes tápoldatban növesztettünk 24 órán át, majd a sejtek médiumba bocsátott faktorait tartalmazó „kondícionált médiumokat” (KMNE-4C, KMASZTRO, KMC6, KMGL261, KMU87) használtunk
58
fel az eltérő sejtek kezelésére. A proliferáció mértékét [3H]-timidin inkorporációs teszt segítségével becsültük meg. Eredményeink szerint az NE-4C őssejtek proliferációját sem a primer asztrocita, sem a tumorsejtek kondícionált médiuma nem befolyásolta számottevően (24. ábra). Az NE-4C sejtek kondícionált médiuma viszont a C6-glióma és a primer asztrogliasejtek proliferációját szignifikánsan növelte, míg az U87 humán glióma és GL261 glioblasztóma sejtek proliferációjára nem gyakorolt szignifikáns hatást (25. ábra). Az őssejtek tehát nem használhatók C6-glióma sejtekkel végzett kísérletekben, mert azok proliferációját fokozzák, tumorprogressziót okozhatnak. GFP-4C és GL261 glioblasztóma
A
HGFAP-eGFP primer glia és GL261 glioblasztóma
GFP B
HGFAP-eGFP primer glia és NE-4C
C
Hoechst
B’
C’
A’’ GFP / Hoechst
B’’
C’’
A’
22. ábra Sejtkölcsönhatások vizsgálata kiméra-aggregációs módszerrel. A-A”: A GFP-4C őssejtek és a GL261 glioblasztóma sejtek összekeverednek a függőcseppben. B-B”: A hGFAP-eGFP primer asztrogliasejtek a GL261 glioblasztóma sejtekkel összekeverednek a függőcseppben. C-C”: Az NE-4C őssejtek és a hGFAP-eGFP primer asztrogliasejtek szegregálnak az aggregátumokon belül. Fluoreszcens mikroszkópos képek. A, B, C: GFP-fluoreszcencia, zöld, A‟, B‟, C‟: Hoechst magfestés, kék, A”, B”, C”: egymásra vetített kettős kép. Mérce: 25 m.
59
Relatív [3H]-timidin beépülés a kontroll százalékában
160 140 120 100 80 60 40 20 0 Asztrocita
GL261
C6
U87
kondicionált médiuma az NE-4C sejteken
23. ábra Az asztrocita és glióma kondicionált médiummal történő 1 napos kezelés az NE-4C sejtek relatív [3H]-timidin beépülésére (azaz a sejtek proliferációjára) szignifikáns hatást nem fejt ki. 5 kísérletsorozat 4-4 párhuzamos tenyészetéből származó átlag- és szórásértékek. A DPM/ g fehérje értékek átlagát 100%-nak vettük, ehhez viszonyítva adtuk meg a relatív [3H]-timidin beépülés értékét és szórását. Kontrollként friss definiált médiummal kezelt azonos típusú sejtek (n=5) szerepeltek, ezek szórás határértékeit a szaggatott vonalak jelzik. A csoportok timidin beépülésének eltérését csoportonként egyszempontos variancia-analízissel vizsgáltuk, p=0,503.
Relatív [3H]-timidin beépülés a kontroll százalékában
160
*
140
**
120 100 80 60 40 20 0 Asztrocita
GL261
C6
U87
sejtek az NE-4C kondícionált médiummal kezelve
24. ábra Az NE-4C sejtek kondicionált médiumával történő 1 napos kezelés a primer asztrocitákon és C6-glióma sejteken szignifikáns [3H]-timidin beépülés-növekedést váltott ki, azaz proliferációjuk fokozódott. Az egyéb vizsgált sejtekre az NE-4C kondicionált médiumnak nem volt szignifikáns hatása. 8 kísérletsorozat 4-4 párhuzamos tenyészetéből származó átlag- és szórásértékek. Kontrollként friss definiált médiummal kezelt azonos típusú sejtek (n=5) szerepeltek, ezek szórás határértékeit a szaggatott vonalak jelzik. A DPM/ g fehérje értékek átlagát 100%-nak vettük, ehhez viszonyítva adtuk meg a relatív [3H]-timidin beépülés értékét és szórását. A csoportok timidin beépülésének eltérését csoportonként egyszempontos variancia-analízissel vizsgáltam, *: p<0.05, **: p<0.005.
60
I.2.3 A GL261 tumorsejtek és az NE-4C őssejtek kölcsönhatásainak in vivo vizsgálata Az in vitro eredmények alapján tehát az NE-4C sejtek a GL261 glioblasztóma tumorok célzására alkalmazhatók lehetnek, mert velük sejtszintű kölcsönhatásokat képesek kialakítani, emellett az NE-4C és GL261 sejtek egymás proliferációját nem növelik. In vivo vizsgálatainkban ezért az NE-4C sejtek alklónjait és GL261 glioblasztóma tumorsejteket alkalmaztunk. Állatmodell-kísérletekben tanulmányoztuk, hogy az implantált őssejtek túlélését befolyásolja-e a tumoros sejtek jelenléte az agyban, valamint, hogy az NE-4C őssejtvonal sejtjei alkalmasak lehetnek-e „tumorcélzásra”. In vivo a GL261 glioblasztóma sejtek igen agresszív, gyorsan növekedő tumort képeznek az agyban (26. ábra). A
HE / GFAP A’
D10
B
vl C Th
25. ábra A GL261 tumorsejtek által elfoglalt térfogat növekedése az agyban. Hematoxilin-eozin (rózsaszín/lila) és GFAP- (barna) festés. Fénymikroszkópos képek. A sötétkék nyilak és szaggatott sötétkék vonallal körülrajzolt területek a GL261 tumort mutatják. Th: thalamus, Th RT: Nucleus reticularis thalami, CI: capsula interna. A-A‟: A GFAP-vel festődő GL261 glioblasztómasejtek az oldalkamra (vl) szögletében a 10. poszt-implantációs napon. A‟: az A ábra kinagyított, GL261 sejteket ábrázoló része. Mérce: A: 1 mm, A‟: 150 m B: A 14. poszt-implantációs napra a GL261 tumor térfogata nagymértékben nőtt az agyban. Mérce: 1 mm. C: A GL261 tumor invazívan terjeszkedik az agyi parenchymában. Mérce: 150 m
D14
CI
Nucl. ret. th.
D10
A 3-4 hetet meghaladó túlélés érdekében viszonylag kisszámú tumorsejt implantációját végeztük el egerek előagyi régiójába. Két eltérő kísérleti modellt alkalmaztunk: előzetesen „létrehozott” GL261 tumor mellé ültettünk be (az NE-4C PLAP-4C alklónjából származó) őssejteket, illetve PLAP-4C és GL261 sejteket összekeverve implantáltunk.
61
A tumor-növekedés mértékét előkísérletek (n=10) során becsültük meg. Ennek eredményei alapján végeztük el első in vivo vizsgálatainkat. Ennek során felnőtt, ép C57BL egerek (n=10) előagyába 104 db GL261 tumorsejtet implantáltunk (Br: 0,0; L: 1,6; V: 2,5 mm), majd 2,5x104 PLAP-4C őssejtet ültettünk be a tumor mellé (Br: 0,0; L: 2,6; V: 2,5 mm), vagy az oldalkamrába (Br: 0,0; L: 1,1; V: 2,0) az első beavatkozástól számított harmadik napon. Az állatokat 7 és 14 napos túlélést követően vizsgáltuk. A tumorsejtek a befogadó agyak 80%-ában voltak jelen, egyenlő arányban különböző túlélési idők esetén. A PLAP-4C sejteket 7 napos túlélést követően a befogadó agyak 80%-ában találtuk meg, míg 14 napos túlélés esetén PLAP-4C sejtet egy agyban sem azonosítottunk (9. táblázat). 9. táblázat A PLAP-4C idegi őssejtek és GL261 glioblasztóma sejtek túlélése először GL261, majd PLAP-4C sejtimplantációban részesült állatok agyában
Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya Túlélési idő
GL261-et hordozó
PLAP-4C-t hordozó
D7
80% (5/4)*
80% (5/4)
D14
80% (5/4)
0% (5/0)
* zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon
A megtalált őssejtek a tumor közelében, de attól elkülönülten helyezkedtek el (27. ábra). A’
A
ctx
HE / PLAP
ctx hc hc fi
fi
26. ábra A-A‟: 10 nappal a GL261 és 7 nappal a PLAP-4C sejtek implantációját követően mindkét sejttípus megtalálható az agyban, de a PLAP-4C sejtek (lila nyilak) nem keverednek a GL261 glioblasztómasejtekkel (szaggatott sötétkék vonallal körberajzolva) és nem mutatnak a tumorsejtek felé irányuló vándorlási hajlamot. Hematoxilin-eozin és PLAP-jelölés. Szürkeárnyalatos és színes fénymikroszkópos képek. (fi: fimbria hippocmapi, hc: hippocampus, ctx: cortex) A‟: A ábra kinagyított része. Mérce: A: 500 m, A‟: 250 m
62
Nem volt jele annak, hogy a tumorsejtek jelenléte az őssejtek vándorlását fokozta volna, vagy az őssejteket a tumor felé irányította volna. A PLAP-4C sejtek az ép agyban már látott korlátozott, rostkötegek mentén történő migrációs hajlamot mutatták. A tumoros agyakban a PLAP-4C sejtek túlélése megrövidült az intakt felnőtt agyban tapasztalthoz képest. Feltehetően a GL261 tumor az őssejtek túlélését és vándorlását segítő kemotaktikus anyagokat nem termelt. GL261 glioblasztóma és PLAP-4C sejtek együttes implantációját is elvégeztük CD1 felnőtt egerek (n=11) striatalis régiójába (Br: 0,0, L: 1,6, V:2,5). A tumorsejteket 1 és 2 hetes túlélés esetén is megtaláltuk minden befogadó agyban. A PLAP-4C őssejteket 1 hetes túlélésnél az állatok 100%-ában, 2 hetes túlélésnél pedig az állatok 80%-ában azonosítottuk (10. táblázat). 10. táblázat A PLAP-4C idegi őssejtek és GL261 glioblasztóma sejtek túlélése a GL261- és PLAP-4C ko-implantációban részesült állatok agyában
Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya Túlélési idő
GL261-et hordozó
PLAP-4C-t hordozó
D7
100% (6/6)*
100% (6/6)
D14
100% (5/5)
80% (5/4)
D0: sejtbeültetés napja, * zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon.
A hisztológiai feldolgozás megmutatta, hogy a tumor-őssejt aggregátumok fokozatosan növekedtek a befogadó agyban, ezen belül a PLAP-4C sejtek aránya csökkent (28 ábra). A
B ctx
ctx cc
cc
str
str
D3
D14
27. ábra A GL261-PLAP-4C sejtaggregátum a beültetés utáni 3. (A) és 14. napon (B). A tumorsejtek aránya szemmel láthatóan nőtt a PLAP-4C sejtekhez képest. Fáziskontraszt mikroszkópos képek a PLAP előhívás után. A PLAP-4C sejtek sötét foltokként jelennek meg (nyilak). Mérce: 500 m. (ctx: cortex, cc: corpus callosum, str: striatum)
63
Míg a tumorsejtek az ép parenchymába invazívan behatoltak (29/ A ábra), az őssejtek erre nem mutattak képességet. Egy-egy őssejt a környező agyi parenchyma felé nyúlványt bocsátott (29/ A‟ ábra). A tumorsejtek között fennmaradó PLAP-4C sejtek túlélése hosszabb volt, mint a tumorral közvetlen kapcsolatban nem lévő PLAP-4C sejteké. Az agykamrákban jelenlévő tumor-őssejt aggregátumokból az őssejtek nem tudtak kilépni a környező szövetbe, vagy tartósan túlélni az SVZ-ben (29/ B, C ábra). A’
A
GFAP / PLAP
ctx
cc str
vl D14
B
C
cc vl
cfv
vl
D7
E
28. ábra A: A PLAP-4C és GL261 sejtek egymással keverve helyezkedtek el a striatum területén fejlődő tumorban (pontozott vonal) az implantációt követő 14. napon. A GL261 sejtek invazívan terjeszkedtek, míg a PLAP-4C sejtek (lila) egy-egy nyúlványt (lila nyilak) bocsátottak a szomszédos agyi parenchyma felé. Mérce: 100 m A‟ ábra: az A ábra kinagyított része. Mérce: 25 m B: A PLAP-4C és GL261 sejtek a kamrafalhoz tapadó sejtaggregátumokat (fekete pontozott vonallal körberajzolva) képeztek. Mérce: 250 m. C: A kamrafali kevert sejtcsoportokból a PLAP-4C sejtek (lila nyilak) az ép szövetbe nem vándoroltak ki. Mérce: 30 m. GFAP (barna) immuncitokémiai és PLAP (lila) hisztokémiai festés. Ctx: cortex, cc: corpus callosum, str: striatum, vl: oldalkamra, E: ependymaréteg, cfv: commissura fornicis ventralis.
Tumorsejtekkel és őssejtekkel végzett munkáink megmutatták, hogy az NE-4C őssejtek sejt-sejt kölcsönhatásokat tudnak létesíteni egyes tumorsejtekkel (GL261 glioblasztóma). Az őssejtek által termelt faktorok bizonyos tumorsejttípusok proliferációját serkenteni képesek (C6-glióma, LL-glia), alkalmazásuk tehát a tumorprogresszió veszélyével is járhat. Agyi környezetben a GL261 glioblasztóma sejtek jelenléte a PLAP-4C őssejtek túlélését megengedi, de olyan kemotaktikus faktorokat nem (vagy nem elégséges mennyiségben) termel, amelyek segítenék az őssejtek tumorsejt-célzását, vagyis az őssejtek tumorhoz vándorlását.
64
II. In vitro előindukált GFP-4C sejtek „sorsa” intakt és sértett agyi környezetben Mivel adataink bizonyították, hogy a GFP-4C sejtek a felnőtt agyi környezetben igen kevéssé, vagy egyáltalán nem fejlődnek idegsejtekké, felvetődött a kérdés, hogy milyen idegi sejtfejlődési állapot teheti alkalmassá az NE-4C sejteket az intracerebralis túlélésre és integrációra. A GFP-4C sejteket két - laborunkban kidolgozott - módszerrel késztettem in vitro idegi fejlődésre. A GFP-4C tenyészeteken 48 órás retinsavas indukciót végeztem, az eképpen indukált sejteket RA-GFP-4C-nek neveztem. A másik indukciós módszer abból állt, hogy a GFP-4C sejteket perinatális (P0-P2) egér asztrocitákkal együtt tenyésztettem („nem-kontakt ko-kultúra”, 11. ábra). Utóbbi sejteket AG-GFP-4C-ként jelöltem. Kontroll lemezeken végzett immuncitokémiai vizsgálat segítségével megállapítottam, hogy a sejtek elköteleződése megindult a kezelés hatására. A kétfajta indukció kezdetétől számított 4. napon a sejteket tenyésztőedényükből szuszpenzióba vettem fel. Az előindukált őssejteket felnőtt, előzetesen nem kezelt CD1egerek (n=12) kamraközeli striatalis/oldalkamrai régióiba (Br -0,1, L 1,2, V 2,0) juttattam be (5x104 sejt/állat). Egy és három hetes túlélést követően értékeltem a sejtek sorsát a befogadó agyak hisztológiai - immuncitokémiai vizsgálataival (GFAP, NeuN, III-tubulin-festés). A beültetett retinsavval indukált GFP-4C sejtek túlélése az agyban igen csekély mértékű volt; a vizsgálat állatok csupán 33%-ában találtunk élő, zölden fluoreszkáló RA-GFP4C sejtet 1 hetes túlélés, 0%-ában 3 hetes túlélés esetén. Az asztroglia ko-kultúrában indukált GFP-4C sejtek 1 és 3 hetes túlélés után minden állatban megtalálhatók voltak (11. táblázat). 11. táblázat Az előindukált GFP-4C sejtek túlélése a befogadó állatok agyában
Túlélési idő
Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya RA-GFP-4C AG-GFP-4C
D7
33% (3/1)*
100% (3/3)
D21
0% (3/0)
100% (3/3)
* zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon
A sejteket az oldalkamra környéki striatalis régióban, az oldalkamrákban, a hippocampus közvetlen környezetében, illetve a corpus callosum rostkötegei mentén
65
találtuk meg. Az oldalkamrában lévő sejtaggregátum irányából a fehérállományi rostkötegek mentén a hippocampus felé igyekvő elnyúlt sejtalakokat is megfigyeltünk (30. ábra). GFP
A
A’
cc
hc
D21
vl
29. ábra A: Túlélő AG-GFP-4C sejtek (fehér nyilak) az oldalkamra szegletében a hippocampus környezetében. A sejtek a hippocampust (hc) megközelítik. Cc: corpus callosum, vl: oldalkamra, Mérce: 75 m A‟: Az A ábra kinagyított része. Migráló AG-GFP-4C (fehér nyilak) sejtalakokat mutat. Zöld fluoreszcencia: GFP. Mérce: 30 m.
A nyúlványos, differenciáltnak tűnő sejtalakok azonban idegi markereket nem expresszáltak, azaz nem voltak idegsejtnek tekinthetők. A következő lépésben felnőtt, előzetesen fagyasztással (Br -0,7, L 2,3) sértett felnőtt, NMRI egerek (n=30 db) lézió közeli agyi régiójába (Br -0,1, L 2,5, V 1,8) juttattam be 5x104, előzetesen retinsavas, vagy asztroglia-indukcióban részesített GFP-4C sejtet. A beültetés az indukció kezdetétől számított 4. napon történt. A tenyészeteken végzett kontroll immuncitokémiai eljárás azt mutatta, hogy az idegi indukció folyamatai megindultak a sejteken. A sérült agyi környezetben az előindukált sejtek nagy arányban túléltek. 1 hetes túlélési idő esetén csaknem minden állatban azonosítottunk élő GFP-4C sejtet; RA-GFP-4C sejtet az implantált állatok 80%-ában, míg AG-GFP-4C sejtet 100%-ukban találtunk. 1 hónapos túlélési idő után RA-GFP-4C sejtek az állatok 50%ában, míg AG-GFP-4C sejtek 100%-ukban voltak kimutathatók. 2 hónapos túlélési idő mellett ez az asztroglia ko-kultúrában indukált sejteknél 66%-ra csökkent, míg a retinsavval indukált sejteknél 50% maradt (12. táblázat).
66
12. táblázat Előindukált GFP-4C sejtek túlélése fagyasztásos beavatkozáson átesett állatok agyában
Túlélési idő
Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya RA-GFP-4C
AG-GFP-4C
D7
80% (5/4)*
100% (5/5)
D30
50% (4/2)
100% (5/5)
D60
50% (6/3)
66% (3/2)
D0: fagyasztás napja, * zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon.
A túlélő GFP-4C sejtek között a 30. naptól szórványosan asztrocitává alakult, GFAPpozitív sejteket észleltünk (31. ábra), azonban GFP-4C eredetű idegsejteket nem találtunk. A
GFP
GFAP
B
C
GFP / GFAP
D30
30. ábra Az agykérgi sérült területen elhelyezkedő, asztrocitává alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak). Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. A: GFP-fluoreszcencia, zöld, B: GFAPimmunpozitivitás, vörös, C: egymásra vetített kettős pozitivitás, sárga) Mérce: 10 m
2 hónapos túlélési idő mellett a befogadó agyakban esetenként, nem invazívan terjeszkedő, de mérete alapján tumorosnak tekinthető sejtszaporulatot észleltünk. Ez a jelenség a kétféleképpen indukált csoportban azonos arányban (33%) fordult elő. A tumorosnak tűnő térfoglalások vizsgálata sokszínű szöveti képet tárt fel. Az RA-GFP4C és AG-GFP-4C sejtcsoportokon belül differenciált, nyúlványos sejteket tartalmazó és teljesen differenciálatlannak tűnő sejtgócokat találtunk (32. ábra). GFP-4C-eredetű asztrocitákat 60 napos túlélést követően is detektáltunk a mintákban.
67
A
Hoechst / GFP
B
GFP
31. ábra A: Egyedi, nyúlványos, differenciált fenotípusú AGGFP-4C sejtek (zöld). B: Differenciálatlan AG-GFP-4C sejtgóc. D60: 60 napos túlélés. Fluoreszcens mikroszkópos képek. (Kék: Hoechst magfestés) A: egymásra vetített kettős fluoreszcens kép. Mérce: 20 m.
D60
A hagymahéjszerűen rétegzett gócokon belül jobbára a külső héjakon észleltünk GFPpozitivitást és – részben gazda-, részben implantátum-eredetű - asztrocitákat (33. ábra). A
Hoechst / GFP / GFAP
B
Hoechst / GFP
D60
32. ábra A-B: Proliferáló, hagymahéj-szerkezetű gócok a sérült, majd sejtekkel újra benépesített területen hosszú túlélési idő (60 nap) mellett. Fluoreszcens mikroszkópia. (Kék: Hoechst magfestés, zöld: GFP fluoreszcencia, vörös: GFAP immunpozitivitás, egymásra vetített képek) Mérce: A: 50 m, B: 40 m.
Felmerült a lehetősége annak, hogy a beültetett előindukált őssejtek a gócok közepén fluoreszcenciájukat elveszítve gyorsan szaporodó csoportokat alkottak, illetve, hogy az őssejtek által létesített kölcsönhatások és az általuk termelt szolubilis faktorok a befogadó szervezet sejtjei közül egyes sejteket gyors proliferációra késztettek. A retinsavval előindukált GFP-4C sejtek “visszatenyésztése” a befogadó agyból Hosszú (2 hónapos) túlélés után a modellállatok agyából (n=2) a retinsavval előindukált GFP-4C sejteket izoláltuk és újra jellemeztük. Az előindukált sejtekből származó RAGFP-RC klón az anyaklónhoz képest gyorsabban osztódott. A sejtek alakja megváltozott; szorosan illeszkedő, köbös epithél alakú, gyakran kettős/többes magvú sejtekké váltak (34/ A ábra), GFP-pozitivitásuk csökkent. Retinsavas indukció hatására a sejtek nem aggregáltak és a 7. napra mindössze 1-2%-uk differenciálódott neuronná.
68
(34/ B ábra). Tehát a retinsavval előindukált GFP-4C sejtekből a befogadó környezetben szelektálódtak az anyaklónhoz képest megváltozott sejtféleségek. A
B
III-tubulin
RA0-2, fix. 7
33. ábra A: A hosszú (2 hónapos) intracerebrális túlélést követően agyból „visszatenyésztett” RA-GFP4C sejtek (RA-GFP-RC) fenotípusa megváltozott. Kettős/többes magvú sejtek a tenyészetben gyakran előfordultak (sötétkék nyilak). Fáziskontraszt felvétel egy indukálatlan RA-GFP-RC tenyészetről. B: Retinsavas indukció hatására az indukció 7. napjára igen alacsony számban képeztek idegsejteket (barna: III-tubulin) a GFP-4C sejtvonalakhoz képest. RA0-2: 48 órás retinsavas kezelés a kísérlet 0.-2. napján, fix.: fixálás időpontja (nap). Fénymikroszkópos felvétel. Mérce: 20 m
Összefoglalva megállapítható, hogy az előindukált GFP-4C sejtek az agy szöveti környezetében asztrocita irányban tudtak differenciálódni, azonban idegsejtté nem alakultak. Az alkalmazott előindukciós eljárások nem javították a GFP-4C sejtek agyszöveti integrációját. További in vitro indukciós eljárások kidolgozása szükséges ahhoz, hogy a felnőtt agyba idegsejt-pótlásra alkalmas sejtalakokat juttathassunk. A hosszú túlélési idő után mindkét előindukált sejt esetén képződtek szórványosan tumor-jellegű struktúrák. A beültetett sejtek in loco sajátság-változásai az őssejtterápia egyik legfontosabb veszélyére, a tumorképződés lehetőségére hívják fel a figyelmet.
69
III. Változó oxigén-ellátottság hatásai az NE-4C sejtekre
Mivel az indukálatlan vagy in vitro előindukált GFP-4C idegi őssejtek beültetésével nem értünk el szöveti integrációt, a befogadó környezetet próbáltuk olyan irányba befolyásolni, hogy az kedvező hatást gyakoroljon a beültetett őssejtekre. Az oxigéntenzió változása alapjaiban befolyásolja a sejtek túlélését, szaporodását és elköteleződési folyamatait is. Vizsgálataimban a környezet oxigén tenziójának változtatásaival próbáltam befolyásolni -in vitro és in vivo- az idegi őssejtek sorsát. III.1 Az NE-4C őssejtek „viselkedése” hipoxiás környezetben In vitro modellkísérleteket folytattam hipoxiás kamra segítségével. A hipoxiás kamrába 1% O2, 5% CO2, 94% N2-t tartalmazó gázkeveréket juttattam. A kamrában, az alacsony (1% tf) oxigénkoncentrációtól eltekintve, a GFP-4C sejtek az előzőekben már bemutatott feltételek mellett nőttek. Az őssejteket indukálatlan állapotban és a retinsavas indukció különböző stádiumaiban (proliferáló progenitorok, idegi prekurzorok, fejlődő neuronok időszakai) helyeztem a hipoxiás kamrába 6, 12, vagy 48 órára. A tenyészetek kiültetésének napját 0. napként jelöltem. A retinsavas kezelést (mindig a 0.-2. napig tartott) RA0-2-vel jelöltem. A tenyészetek hipoxiás kezelésének idejét/időtartamát H-val jelöltem, és a 0. naphoz viszonyítva adtam meg (pl. H6, H6-8). A tenyészetek fixálásának idejét szintén a 0. naphoz viszonyítva adtam meg (pl. fix. 6). A különböző differenciációs állapotban különböző időtartamú hipoxiás kezelésen átesett tenyészetek életképességét, sejtproliferációját, apoptózis-arányát, neuronképzését és génexpressziós változásait a normoxiás környezetben tartott kontroll tenyészetekéhez hasonlítottam. Megvizsgáltam a tenyészetekben a HIF-1 jelenlétét is. 48 órás hipoxiás kezelést követően mind az indukálatlan, mind az indukált tenyészetekben jelentősen fokozódott a HIF-1
immunpozitivitás a normoxiás
kontrollhoz képest (35. ábra). A HIF-1 -változás tehát alkalmas volt arra, hogy a hipoxiás kezelés „megtörténtét” jelezze.
70
A
HIF-1
B
Nox
RA C
RA 0-2 fix. 6 D
Hipox
RA , H0-2
RA 0-2, H 4-6, fix. 6
34. ábra 48 órás hipoxiás kezelés (Hipox) hatására a GFP-4C sejttenyészetekben a normoxiás (Nox) kontrollhoz képest fokozott HIF-1 immunpozitivitás jelent meg. A, B: Indukálatlan vagy a retinsavasan indukált normoxiás tenyészetek HIF-1 festődése (kontroll). C, D: Parallel hipoxiás tenyészetek HIFfestődése. Fluoreszcens mikroszkópos képek. HIF-1 immunpozitivitás: vörös. Mérce: 40 m. A képeken a retinsavas kezelés (RA), hipoxia (H) és fixálás (fix.) időpontja/időtartama napokban van feltüntetve.
A sejtek életképességét AlamarBlue oxidoredukciós vizsgálat segítségével határoztam meg. Míg a különböző indukciós fázisban 6-12 órás hipoxiával kezelt tenyészetek életképessége a normoxiás eredményektől szignifikánsan nem tért el, a 48 órás hipoxiás kezelés jelentékeny változásokat okozott az elköteleződő tenyészetek esetében. A korai indukciós fázis (0-2. nap) sejtjeinek életképessége szignifikánsan megnőtt, míg az idegi fejlődésben „elkötelezettebb” (2-4. nap, 4-6. nap, 6-8. nap) sejtek életképessége szignifikánsan lecsökkent a hipoxiás kezelés hatására (36/ A ábra). A nem indukált őssejtek viabilitására ezzel ellentétben a hipoxia nem gyakorolt hatást. A sejtproliferációban bekövetkező változásokat [3H]-timidin beépülés mérésével vizsgáltam 48 órás hipoxiát követően. A beépített radioaktív timidin fehérjetartalomra normalizált [DPM/fehérje] értékei azt mutatták, hogy az indukálatlan őssejtek és az indukció korai stádiumaiban lévő tenyészetek (2. nap, 4. nap) hipoxiás és normoxiás körülmények között azonos mértékű sejtproliferációt mutatnak. Az idegi fejlődésben „elkötelezettebb” sejteket tartalmazó tenyészetekben (6. nap, 8. nap) azonban a hipoxia a proliferációs rátát szignifikánsan csökkentette a normoxiás társtenyészetekhez képest (36/ B ábra). A neuronális fejlődés retinsavas indukciója során a sejtproliferáció az idegsejt-érés előrehaladtával normoxiás körülmények mellett is csökken. A hipoxia a
71
sejtproliferáció mértékét azonban a normoxiás kontrollhoz képest is jelentősen csökkentette. A tenyészetekben a sejthalál mértékét TUNEL-reakció segítségével becsültem meg. Alacsony oxigén tenzió következtében mind a retinsavas indukción átesett, mind a nemindukált GFP-4C tenyészetek apoptózis-(nekrózis) aránya jelentősen nőtt. A TUNELpozitív sejtek aránya legszembeszökőbben a retinsavas indukció első két napján, az idegi elköteleződés elején nőtt meg a hipoxiás kezelés hatására (36/ C ábra). Az életképesség és sejtproliferáció vizsgálatai azt mutatták, hogy a GFP-4C idegi őssejtek és a belőlük differenciálódó utódsejtek – differenciációs állapotuktól függően eltérően reagálnak az alacsony oxigén-tenzióra. Míg az elkötelezetlen és a fejlődés korai stádiumában lévő sejtek életképességét és szaporodását a hipoxia nem csökkentette, az idegi fejlődés előrehaladottabb stádiumaiban 48 órás hipoxiás kezelés mindkét sejtfunkcióban mérhető csökkenést okozott. A hipoxiás kezelés az apoptotikus sejtalakok jelenlétét növelte a tenyészetekben.
35. ábra A GFP-4C sejtek „viselkedése” hipoxiás kezelést követően A: A tenyészetek életképessége a normoxiás kontrolltenyészetek százalékában (100%: fekete vonal) 48 órás hipoxiát követően. A számítások 5 független kísérlet során nyert 6-10 parallel minta adataiból történtek. Szaggatott fekete vonalak: normoxiás adatok szórásátlagai. B: Normoxiás tenyészetek és különböző idegi indukciós stádiumban (0-2., 2-4., 4-6., 6-8. nap) 48 órás hipoxiával kezelt tenyészetek [3H]-timidin inkorporációjának [DPM/ g fehérje] összehasonlítása (n=4). Normoxiás minták: , hipoxiás minták: . C: TUNEL-pozitív apoptotikus-(nekrotikus) sejtek aránya a tenyészetekben 48 órás hipoxiás kezelést követően indukálatlan, az indukció 2. és 8. napján lévő tenyészetekben. 40 látótérből történt sejtszámlálás minden kezelési csoportban. Normoxiás minták: , hipoxiás minták: . RAØ: indukálatlan tenyészetek, RA0-2: a kiültetést követően a 0-2. napon retinsavval indukált tenyészetek. Átlagok és szórások az ábrákon feltüntetve. Statisztika: A, B: ANOVA, C: Student T-teszt, *: p<0.05, ** p< 0.001.
72
A
RA
Relatív életképesség [%]
140
RA0-2
**
120 100 80
*
**
2-4
4-6
**
60 40 20 0 0-2
0-2
6-8
Hipoxiás kezelés ideje [napok]
B
140
RA0-2
RA
DPM/fehérje arány
120
100
80
* **
* 60
**
40
20
0 0-2
0-2
2-4
4-6
6-8
Hipoxiás kezelés ideje [napok]
TUNEL-pozitív sejtek aránya [%]
C
120
%
RA0-2
RA
100
** 80
60
**
*
40
20
0 0-2
0-2
Hipoxiás kezelés ideje [napok]
73
6-8
A következőkben azt vizsgáltuk, hogy befolyásolja-e az alacsony oxigén-tenzió a neuron-fenotípus kialakulását, és ha igen, az idegsejt-fejlődés melyik stádiuma a legérzékenyebb a hipoxiára. A hipoxia idegi elköteleződésre és az idegi prekurzorok és neuronok túlélésére kifejtett hatását 6, 12 és 48 órás hipoxiás kezelések mellett tanulmányoztam. Az érett idegsejteket III-tubulin-festés után morfológiai kritériumok alapján, illetve NeuN-immuncitokémia segítségével mutattam ki az érett idegsejteket tartalmazó 6.– 8. napos, differenciált tenyészetekben. Az elkötelezetlen tenyészeteken alkalmazott hipoxiás kezelés után, a 8. napon megközelítőleg ugyanannyi neuront találtunk, mint a normoxiás kontrollmintákban, tehát az őssejt stádiumban végrehajtott hipoxia nem gyakorolt számottevő hatást a tenyészetekben később spontán, retinsavas indukció nélkül kifejlődő idegsejtek mennyiségére (az összes sejtnek <1%-a, Schlett és RA 0-2, H 6-8, fix. 8
Madarász 1997). Az elköteleződés késői szakaszában (RA-indukció 6-8. napján) végzett 6 és 12 órás hipoxiás kezelés hatására a tenyészetekben található III-tubulin pozitív sejtek aránya lényegesen alacsonyabb volt, mint a normoxiás társtenyészetekben (37/ A-C ábra). 48 órás hipoxiás kezelés az elköteleződés korai (0-2., 2-4. napján) és késői (6-8. napján) szakaszaiban is csökkentette az idegsejt markereket hordozó GFP-4C sejtek számát (37/ D ábra). Az idegsejt-tartalmat a hipoxiás kezelés időzítésétől függetlenül, az indukció 8. napján határoztuk meg. A differenciált tenyészeteken végzett hipoxiás kezelés közvetlenül okozhatja az érzékeny idegsejtek pusztulását. A korai indukciós fázisokban történő hipoxiás kezelés esetén azonban még nincsenek jelen az érett idegsejtek, tehát a 8. napon tapasztalt idegsejt-szám csökkenést nem az idegsejtek pusztulása, hanem feltehetően az indukciós folyamatok károsodása okozza. Az adatok azt mutatják, hogy a fejlődő idegsejt-előalakokból történő neuron-képződést a 6-48 órán át tartó hipoxia jelentősen károsítja, míg az elkötelezetlen őssejtek spontán neuronképzését nem befolyásolja. A neuronszám csökkenése alapján úgy tűnik, hogy a retinsavas indukció első 48 órája (0-2. nap) és a posztmitotikus idegsejt-előalakok érési fázisa (6-8. nap) a legkritikusabb időszak.
74
Hoechst / III-tubulin
C III tubulin pozitív sejtek aránya [%]
A
RA0-2
120 100 80
*
60 40 20 0 H8 D8
Hipoxiás kezelés ideje [nap]
Normoxia RA0-2, fix. 6 D
B
RA0-2
NeuN pozitív sejtek aránya [%]
RA
200 180 160 140 120 100 80
** B*
60 40
*
**
B
20 0 0-2
0-2
2-4
4-6
6-8
Hipoxiás kezelés ideje [napok]
Hipoxia
36. ábra A, B: A retinsavas indukció 6. napján alkalmazott 12 órás hipoxiás kezelés a neuronszám jelentős csökkenését okozta a tenyészetekben. Az összes sejtmag (DAPI, kék) és a III-tubulin neuronok (vörös) normoxiás (A) és hipoxiával kezelt (B) tenyészetekben. Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce: 30 m. C: Az idegsejtek aránya [%] a 8. indukciós napon (D8) 6 órás hipoxiával kezelt tenyészetekben a normoxiás kontroll (100%: fekete vonal) százalékában. Szaggatott fekete vonalak: normoxiás minták szórása. D: A NeuN-pozitív idegsejtek aránya [%] a 8. indukciós napon különböző indukciós fázisokban (0-2, 2-4, 4-6, 6-8 napon) alkalmazott 48 órás hipoxiás kezelést követően a normoxiás minták százalékában. 100% (fekete vonal): normoxiás párhuzamos tenyészetek neuronaránya. Szaggatott fekete vonalak: normoxiás minták szórása. C, D: minden kísérleti csoport 10-10 látóteréből számolt adatok. Statisztika: ANOVA, **: p<0.001,*: p<0.05. RA : indukálatlan tenyészet, RA0-2: retinsav indukció 0-2. nap.
A neuronképzés változásának megértésére meghatároztam egyes gének expressziós mintázatát hipoxiás és normoxiás körülmények között. Indukálatlan, illetve különböző indukciós
fázisban
hipoxiával
kezelt
tenyészetekből,
valamint
a
normoxiás
kontrolltenyészetekből is teljes RNS-mintákat készítettem közvetlenül a 48 órás hipoxiás kezelés után, vagy az idegsejt-érés fázisában (a 8. napon). A gyűjtött RNS mintákból Hádinger Nóra munkatársunk segítségével RT-PCR vizsgálatokat végeztem. Teszteltük egyes „őssejt-gének” (nanog, sox2), pro-neurális (neurogenin2), korai gliális (blbp) és neuron- (math2) valamint asztroglia-specifikus (GFAP) gének expresszióját.
75
A nanog őssejt-gén expressziója a hipoxiás kezelés hatására nem változott, a sox2 őssejt-specifikus gén kifejeződése viszont az összes hipoxiás mintában megnőtt a normoxiás kontrollmintákhoz képest (38. ábra). RA0-2
RA
A N0-2
H0-2
N6-8
H6-8
HPRT nanog B
RA H0-2
RA0-2 H0-2
H2-4
H4-6
H6-8
N0-8
HPRT sox2 37. ábra A nanog (A) és sox2 (B) őssejtgének expressziója indukálatlan (RAØ; kiültetés 2. napján) és retinsav-indukált (RA0-2; az indukció 8. napján), normoxiás (N) és hipoxiával kezelt (H) tenyészetekben. HPRT: nukleinsav mennyiség kontrollja.
A proneurális, neuron- és glia-specifikus gének kifejeződését különböző időpontokban végzett hipoxiás kezelést követően, az indukció 8. napján lévő, érett sejteket tartalmazó tenyészetekben vizsgáltam meg. A neurogenin2 mRNS mennyisége a normoxiás kultúrákban az idegi indukció különböző időszakaiban eltérő; az aggregációs fázisban (az indukció 2. napja) jelenik meg, a fő neurogén fázisban (3-5. nap) akkumulálódik, és az idegi érés időszaka alatt (6. naptól) szintje csökken. A proneurális neurogenin2 (ngn2) és neuron-specifikus math2 gén expressziója hipoxiás kezelés hatására csökkent. Az elkötelezett idegi prekurzorok időszakában (a 2-4. vagy 4-6. napon) hipoxiával kezelt tenyészetek ngn2 génkifejeződése szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a normoxiás kontroll kultúráké. A neuron-specifikus math2 gén expressziója a neurogenezis kezdetén (2-4. nap) alkalmazott hipoxia esetén csökkent, míg az idegsejtképzés idején (a 4-6. és 6-8. napon) alkalmazott hipoxiás kezelés esetén szinte teljesen megszűnt a tenyészetekben (39. ábra). A blbp korai gliális gén expressziója a különböző indukciós időszakokban hipoxián átesett tenyészetekben a kontrollhoz képest nem változott. A GFAP gliális gén
76
expressziója a vizsgált időszakban sem a normoxiás, sem a hipoxiás kultúrákban nem indult meg (39. ábra). A
RA N0-2
RA0-2 H0-2
N2-4
H2-4
N4-6
H4-6
HPRT ngn2 B
HPRT
RA0-2
RA H0-2 H0-2
H0-2 H0-2
H2-4 H2-4
H4-6 H4-6
H6-8 H6-8
N0-8 N0-8
math2 blbp GFAP 38. ábra Az elkötelezett idegi prekurzorok időszakában (2-4., 4-6. nap) alkalmazott hipoxiás kezelés (H) a proneurális ngn2 gén expresszióját csökkentette a normoxiás körülményekhez képest (N) (A). Az idegsejtképzés időszakában (4-6., 6-8. nap) alkalmazott hipoxiás kezelés a neuron-specifikus math2 gén kifejeződését igen jelentősen csökkentette (B). A korai gliális gén, blbp expressziója nem változott a tenyészetekben hypoxia hatására, míg az asztrogliára jellemző GFAP a vizsgált időszak alatt nem jelent meg a kultúrákban (B). Teljes RNS minták gyűjtése a hipoxiát követően (A) és az indukció 8. napján (B) történt. HPRT: nukleinsav mennyiség kontrollja. RAØ: indukálatlan, RA0-2: retinsav-indukált tenyészetek.
A hipoxiás kezelés tehát az őssejt-gének kifejeződésében nem okozott csökkenést, míg a proneurális és neurális gének expressziójának csökkenéséhez vezetett. A korai és érett gliális génkifejeződés nem változott a normoxiás mintákhoz képest. Vizsgálataink alapján, az alacsony oxigéntenzió lényeges változásokhoz vezetett az őssejtek in vitro viselkedésében. Míg az elkötelezetlen őssejt-stádiumban nem volt különbség a hipoxiás kezelésen átesett és a normoxiás körülmények között lévő őssejtek életképessége és sejtproliferációs rátája között, az idegi sejtfejlődés előrehaladottabb stádiumaiban (4-6., 6-8. indukciós napokon) alkalmazott 48 órás hipoxiás kezelés mindkét sejtfunkcióban jelentős csökkenést okozott. Különböző elkötelezettségű tenyészetek idegsejt-képzése hipoxiás kezelés hatására eltérően változott. Az őssejt-tenyészetek spontán differenciációs képességére az alacsony O2-tenzió nem gyakorolt hatást. Az elköteleződés útjára lépett (indukálódó) tenyészetekben azonban az (elköteleződés korai vagy késői szakában) alkalmazott
77
hipoxia csökkentette a neuronszámot a normoxiás kontrollhoz képest. Ennek hátterében a proneurális és neurális gének expressziójának hipoxia okozta csökkenését is bizonyítottuk. A hipoxia, tehát, az in vitro idegsejt-fejlődést gátolja és a differenciálatlan ős/progenitor-sejtállapot fennmaradásának kedvez.
III.2 Az NE-4C őssejtek intracerebralis „sorsa” magas in vivo oxigén tenzió mellett Miután az in vitro adatok megmutatták, hogy az alacsony oxigén tenzió az idegi őssejtek idegsejt irányú differenciálódását gátolja, a felnőtt egéragyba beültetett őssejtek szöveti integrációját az oxigén tenzió növelésével kívántam segíteni. Ennek kivitelezését hiperbárikus oxigénterápia alkalmazásával oldottuk meg. A kísérletekhez szükséges berendezést és szakmai segítséget Dr. Gőbl Anna és munkatársai biztosították a budapesti Baromedical Hiperbár Centrumban. A kísérletekbe bevont, felnőtt, NMRI egereket a táblázatban feltüntetett kísérleti csoportokba osztottuk (13. táblázat). 13. táblázat A kísérletek során felhasznált állatok száma és kísérleti csoportjaik
Kísérleti állatok száma Műtéti beavatkozás
Normoxia
HBO
Fagyasztásos agykérgi lézió
14
15
Sejtbeültetés
31*
6
Lézió+beültetés
8
16
*ebben a csoportban felhasználtam a korábbi normoxiás körülmények között végzett sejtbeültetési eredmények adatait
Az agykérgi fagyasztásos léziót és sejtimplantációt a korábbi kísérletekkel megegyező módon végeztük. (A lézió koordinátái: Br -0.7 mm, L 2.3 mm, az implantáció helye: Br -0.1 mm, L 3.2 mm, V 1.4 mm) A fagyasztásos lézió napját 0. napként jelöltem (D0). Az állatokat a sejtimplantáció (D7) után 7 alkalommal (D7-D13) napi 90 perces hiperbár oxigén terápiában (2.5 ATA, közel 100% O2) részesítettem.
78
III.2.1 Az implantált állatok viselkedésvizsgálata Az agykérgi sérülés és sejtbeültetés után a beavatkozásokat követő 1-4-7-14-30-60. napokon megvizsgáltuk, hogy jelentkeznek-e változások az állatok viselkedésében. Mivel a lézió és a beültetés minden esetben csak a jobb oldali agykérget érintette, elsősorban
azt
vizsgáltuk,
hogy
a
jobb
és
bal
oldali
izomerőben
és
mozgáskoordinációban mutatkozik-e eltérés. A bilaterális aszimmetria-vizsgálat („sticky tape” teszt) során az állatok jobb vagy bal hátsó végtagjára ragadt tapasz eltávolításának idejét mértük. A mellső végtagi aszimmetria teszt során az állatokat átlátszó hengerbe helyeztük, és a henger falára való felkapaszkodás közben figyeltük mozgásukat. A „tight rope” teszt során pedig az állatokat mellső végtagjaikkal egy kötélre
helyeztük
és
kötélre
való
sikeres
felkapaszkodásukat,
az
oldalsó
felfüggesztéshez történő kimászásukat (vagy kötélről való leesésüket) értékeltük. Az agykérgi fagyasztásos sértés csak átmeneti neurológiai eltéréseket eredményezett a kísérleti állatokban. A sérült egerek a bilaterális aszimmetria teszt során szignifikánsan, a mellső végtagi aszimmetria teszt és „tight rope” teszt során tendenciájában rosszabb teljesítményt értek el a kontroll állatokhoz képest az első, léziót követő napon. A különbségek 3 napon belül teljesen megszűntek. Az implantált állatok hiperbárikus oxigénkezelését követően szignifikánsan jobb teljesítményt nyújtottak a bilaterális aszimmetria tesztben az 5. és 14. sejtbeültetés utáni vizsgálati napon (107±48 sec, 64±29 sec) a beültetésben részesült, de HBO-val nem kezelt kontrollhoz képest (194±55 sec, 189±63 sec). A későbbi időpontokban (a 23. és 53. posztimplantációs napon, vagyis 17 és 47 nappal HBO-kezelés befejezését követően) végzett viselkedéstesztek szignifikáns eltérést nem tártak fel a kísérleti csoportok között. A sértett agykérgű, sejtbeültetésben nem részesült állatok HBO-val kezelt és nem kezelt csoportjai között eltérést nem találtunk. Az eltérések értékeléséhez egy- és többszempontos, valamint ismételt méréses variancia-analízist és poszt-hoc tesztet használtunk. III.2.2 A különböző kezeléseken átesett állatok agyának hisztológiai vizsgálata 2 hetes, 1 és 2 hónapos túlélést követően vizsgáltam meg a GFP-4C sejtek túlélését, vándorlását,
differenciálódását
a
módosított
immuncitokémiai módszerekkel tanulmányoztam.
79
agyi
környezetben
hisztológiai,
Elsőként megvizsgáltam, hogy az egyes kísérleti csoportokban milyen gyakorisággal fordulnak elő élő implantált sejteket hordozó állatok különböző posztimplantációs időszakokban. A léziót és sejtbeültetést követő HBOT mellett rövid túlélés esetén az állatok 100%-ában találtunk élő GFP-4C sejtet, míg HBOT nélkül ez az arány ~64% volt. A HBO-val kezelt állatcsoportban hosszú túlélés mellett is nagyobb arányban találtunk élő GFP-4C sejteket, mint a kontroll állatok agyában (~88 vs. ~71 %). Ugyanakkor a lézió nélkül sejtimplantációban részesített állatokban a GFP-4C sejtek túlélése erősen korlátozott volt. Hiperbárikus terápia mellett a rövidtávú túlélési arány javult (~24%-ről ~66%-ra), de hosszútávon a GFP-4C sejtek nem éltek túl az intakt befogadó állatok agykérgében (14. táblázat). 14. táblázat Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya a fagyasztásos beavatkozáson, sejtimplantáción és hiperbárikus terápián átesett, illetve kontroll befogadó állatok között
Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya Sérült agykérgű Túlélési idő
Intakt agykérgű HBOT
HBOT
D14-29
63.6% (22/14)*
100% (8/8)
23,8% (21/5)* 66% (3/2)
D30-60
70.6% (17/12)*
87,5% (8/7)
0% (10/0)*
0% (3/0)
*ezekben a csoportokban felhasználtam a korábbi normoxiás körülmények között végzett sejtbeültetési eredmények adatait is. Zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon
Ezt követően az implantált sejtek lokalizációját, térfogatát, elköteleződését vizsgáltam. Hideglézióval sértett, majd hiperbárikus terápiával kezelt állatok többségében (85%) az agykéregbe beültetett GFP-4C sejtek túlélték az implantációt követő 2 hetet. Míg a beültetett sejtek nagy része az implantáció helye, azaz a lézió széle mentén maradt, néhány egyedi GFP-4C sejtet a striatum, az oldalkamrák és a corpus callosum területén is találtunk. A nekrotikus magrégió azonban nem tartalmazott élő beültetett sejteket. Szemben az intakt agyba ültetett sejtekkel a lézionált kéregben – HBO kezelés mellett vagy anélkül - 2 hónapos túlélést követően is jelentős mennyiségű beültetett sejtet, illetve azok utódsejtjeit láttuk. Hosszú túlélési idő esetén (≥ D60) a GFP-4C sejtek benépesítették a poszt-nekrotikus régiót és a lézió határzónáját is, és egyes állatokban az oldalkamrában is megjelentek
80
(40/ A ábra). A lézionált terület határán gliotikus zóna alakult ki, amelyben a befogadó agy asztrogliasejtjei mellett asztrogliává alakult GFP-4C sejtek is jelen voltak. A posztléziós hely és ép szövet határán a GFP-4C és befogadó agyi sejtek szoros kapcsolatot létesítettek (40/ B ábra). A GFP-4C sejtek az ép idegszöveti parenchymába nem vándoroltak be. GFP
A
B
GFP / NSE
ctx
vl
str
D60
39. ábra A: A poszt-léziós zónát és az azonos oldali oldalkamrát benépesítő GFP-4C sejtek 60 napi túlélés után, hiperbárikus oxigénnel kezelt modellállat agyában. Zöld: GFP-fluoreszcencia. Fehér pontozott jelölés: az agyban túlélő GFP-4C sejtcsoportok. Ctx: agykéreg, vl: oldalkamra, str: striatum. B: A beültetett GFP-4C sejtek (zöld) és a befogadó NSE (neuron specifikus enoláz, vörös) pozitív idegsejtjei egymás szoros közelségében. Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce: A: 500 m, B: 30 m.
A GFP-4C sejtek által elfoglalt intracerebrális térfogat az első sejtbeültetést követő időszakban (D7-D21) nőtt. Az hidegléziót elszenvedett, de sejtbeültetésben nem részesült állatokban a gazdasejtek a beültetett sejtekhez hasonlóan a lézió széli zónájában és a poszt-léziós területen nagy számban gyülekeztek. A jelenséget az igen sűrű sejtmag-jelölés (Hoechst-pozitivitás) jól felismerhetővé tette (41/ A, B ábra). A hiperbárikus oxigénkezelés hatására a sérülést benépesítő gazdasejtek térfogata a kezelést közvetlenül követő időszakban (D14) szignifikánsan kisebb volt, mint a kezelés nélküli csoportban. A kezelés végét követő későbbi időpontokban (D30-) ez a sejtakkumulációt gátló hatás már nem érvényesült (41/ C ábra). Ezzel szemben a hiperbárikus oxigénterápia a beültetett GFP-4C sejtek össztérfogatának növekedését hosszan meggátolta. A hiperbárikus kezelésen átesett állatokban a beültetett sejtek össztérfogatának növekedése a beültetést követő 2 héten belül megállt. A 60. kezelési napon a GFP-4C sejtek össztérfogata a HBO-kezelt csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt (pD60=0,048; ANOVA), mint a HBO-terápiában nem részesült csoportban (15. táblázat).
81
RA0-2, fix. 6
Hoechst
*
C
HBO HBO
Repopuláló sejtek össztérfogata [mm3]
0,8
0,6
Fig 7
0,4
0,2
0 14
D14 B
30
60
Túlélési idő (napok)
HBO D TUNEL-pozitív sejtek aránya
% 120 100
*
80 60
HBO
40
HBO
20 0
1
D14
Csoport
HBO
40. ábra A HBO-kezelés nélkül a lézió területén sűrű magfestés (kék, Hoechst) jelzi a gyülekező gazdasejteket sejtbeültetésben nem részesült állatokban (A). HBO-kezelés mellett a gazdasejtakkumuláció elenyésző mértékű (B). (14. kísérleti nap.) Mérce: 500 m. C: A 14. napon a sérülést benépesítő gazdasejtek össztérfogata szignifikánsan kisebb volt a HBO-kezelt (■), mint a kezeletlen (■) állatokban. A különbség a HBOT-kezeléstől számított későbbi időpontokban (D30, D60) megszűnt. D: A TUNEL-pozitív sejtek aránya a 14. napon alacsonyabb volt a HBO-kezelt egerek (■) agykérgi sérült területén, mint a HBO-kezelésben nem részesült kontrollcsoportban (■). A TUNEL-pozitív sejtek előfordulása az összes sejt között DNase I-kezelt pozitív kontroll (100%, fekete vonal) százalékában van megadva. Az átlagok és szórások 4-4 azonosan kezelt állat adataiból származnak, (*): p<0,05, ANOVA.
15. táblázat A GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat a gazda-agyszövetben hiperbárikus terápia mellett kisebb mértékben nőtt, mint anélkül.
Túlélési idő HBO terápia nélkül HBO terápiával
A GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat a sérült agyban [mm3] D7 D21 D60 0,1 2,50 3,22 0,1 1,38 1,19
D0: az implantáció napján a várható sejttérfogat-értéket a sejtek átlagos térfogata alapján kalkuláltam. Csoportonként 6-9 állatból származó adat. Variancia analízis alapján pD60=0,048 (*).
82
A kisebb repopuláló saját- és beültetett sejttömeg adódhat a hiperbárikus terápia sejtproliferációt visszaszorító, vagy sejtpusztulást indukáló hatásából. A következő vizsgálatokban ezért a sejtproliferációt, illetve a sejthalál mértékét becsültük meg a mintákban. A sejtproliferáció mértékének meghatározása technikailag nehéz volt a sérült és sejtekkel benépesített terület nagy mikroszkópos háttere miatt. Az egységnyi, sejtek által lefedett területre eső mitózisszámot becsültük meg a sérült agykérgi területeken sejtbeültetésben nem részesült állatokban. A hiperbárikus terápiában részesült állatok agyában kevesebb (2.2±2.7 mitózis/area) mitotikus gazdasejt-alakot találtunk a léziós zónában, mint a kontroll állatokban (4.8±3.1)(Student T-teszt:* p<0.05). A sejthalál (apoptózis-[nekrózis]) mértékének meghatározására TUNEL-reakciót alkalmaztunk. Az irodalmi adatokkal egybecsengően (Li és mtsai 2005a, Liu és mtsai 2006a), amelyek a HBO-terápia apoptózist mérséklő hatását írják le, a sérült területen a HBO-val kezelt csoportban szignifikánsan alacsonyabb számú TUNEL-pozitív sejtet találtunk, mint a kontrollcsoportban (41/ D ábra). A TUNEL-pozitív sejtek előfordulása a sérülés korábbi magi régiójának megfelelő területen viszonylag magas volt, a sérülés határzónájában és az oldalkamrában túlélő sejtek között mérsékelt (42. ábra). A
agyfelszín
B
TUNEL
TUNEL
ctx D60
ctx
D60
41. ábra Az apoptózis-(nekrózis) regionális különbségei az agyban sérülést, sejtbeültetést és hiperbárikus terápiát követően (60. nap). A: A korábbi nekrotikus magi régióban sok TUNEL-pozitív sejt (vörös) volt. B: A sérülés határzónájában lévő sejtek között az apoptózis mértéke jóval kisebb volt. Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce:50 m.
A vizsgálatok alapján a hiperbárikus terápiával kezelt állatcsoportban tapasztalt kisebb repopuláló sejttérfogat hátterében nem a megnövekedett sejtpusztulás, hanem a csökkent sejt-produkció (és sejt-bevándorlás) állhat.
83
Mint azt korábbi tanulmányainkban láttuk, a beültetett és gazdasejtek 2 hónapos intracerebralis túlélési idő után benépesítették a poszt-léziós zónát. Ebben a HBOkezelés változást nem okozott. Ezzel szemben a repopuláló sejtcsoportosulás sejtes összetételében, a sejtek elköteleződésében a hiperbárikus oxigénterápia mélyreható változásokhoz vezetett. Míg a sejtbeültetésben nem részesült állatokban HBO-kezelés nélkül a sérülést benépesítő
gazdasejtek
között
sporadikusan
megfigyelhetők
voltak
SSEA-1
őssejtmarkert hordozó sejtek, HBO-kezelés mellett SSEA-1 pozitív sejtek nem voltak jelen ugyanezen a területen (43/ A, B ábra). Sejtbeültetésen átesett állatok agykérgében jelen lévő SSEA-1 pozitív sejtek nagy része GFP-4C-eredetű volt, és HBO-kezelés mellett és anélkül is megtalálhatók voltak a poszt-léziós zónában (43/ C ábra). Az adatok azt mutatják, hogy az oxigenálás a beültetett differenciálatlan, SSEA-1 pozitív sejtek túlélését nem akadályozza meg, de meggátolja az SSEA-1-pozitív ős-/ progenitorsejtek megjelenését a sérült területen. A léziós zóna körüli határterületen és a lézióban GFP-4C-eredetű és gazdasejt-eredetű asztrociták is megfigyelhetőek voltak egymás közvetlen közelében, HBO-kezeléstől függetlenül (44. ábra). Míg a GFP-4C sejtek idegi irányú differenciációs folyamatait a sérült agyi környezet nem támogatta, hiperbárikus oxigénterápia mellett a beültetett őssejtekből sporadikusan III -tubulin- and neuron specifikus enoláz (NSE) immunreaktív idegsejtek képződtek (45. ábra). Az idegsejtek többsége a graft és az agykérgi parenchyma között helyezkedett el. Ez arra utalhat, hogy az oxigenálás neuronképzés szempontjából permisszívvé teheti a környezetet, de a beültetett ős-/progenitorsejtek idegsejt-irányú differenciálódásához elengedhetetlenek a regenerálódó parenchymából származó faktorok is. Összefoglalva megállapítható, hogy a hiperbárikus oxigénterápia alkalmazása lényeges változásokat idéz elő mind az agyba bejuttatott, mind a gazda-eredetű sejtek viselkedésében. A HBOT csökkenti a sérülést benépesítő sejtek apoptózisát, visszafogja az endogén és exogén eredetű differenciálatlan sejtek akkumulációját, és megengedőbb környezetet teremt az idegi irányú elköteleződés folyamatai számára.
84
Hoechst
A
A’
ctx
SSEA-1
A”
ctx B”
B’
B
ctx
ctx
C’ C’
C
C” C”
ctx
cc vl
42. ábra A 30. napon a sejtbeültetésben nem részesült állatokban (A-A”) SSEA-1 pozitív (fehér nyilak) differenciálatlan sejtek voltak jelen a lézionált területeken. HBO-terápiát követően SSEA-1 pozitív sejteket nem találtunk a parallel állatcsoportokban (B-B”). Sejtbeültetésben részesült állatokban (C-C”) SSEA-1 pozitív sejtek HBO-terápia mellett és anélkül is fellelhetők voltak a sértett területeken. Kék: DAPI, vörös: SSEA-1, ctx: agykéreg; cc: corpus callosum; vl: oldalkamra. Mérce: A, A‟, B, B‟: 60 m, C‟-C”: 30 m, A”, B”: 20 m, C: 500 m. A
GFP
B
GFAP
C
GFP / GFAP
D60 43. ábra GFAP pozitív, asztocitává alakult GFP-4C sejt (fehér nyíl) a sérülés környéki zónában, nem GFP-4C eredetű asztrociták között, hiperbárikus oxigénkezelést követően, a 60. napon. Fluoreszcens mikroszkópos képek. A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: GFAP immuncitokémia, vörös. C: kettős, egymásra vetített kettős fluoreszcens kép. Mérce: 20 m.
85
A
GFP
D
GFP str
D60
D60 B
III-tubulin
E
NSE str
C
GFP / III-tubulin
F
GFP / NSE str
44. ábra A-C: III-tubulin pozitív, idegsejtté alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) a sérülés környéki zónában hiperbárikus oxigénkezelést követően (60. nap). A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: III-tubulin immuncitokémia, vörös. C: kettős fluoreszcens kép. Mérce: 40 m. D-F: NSE-pozitív, idegsejtté alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) a striatum közelében hiperbárikus oxigénkezelést követően (60. nap). Fluoreszcens mikroszkópos képek. A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: NSE immuncitokémia, vörös. C: kettős fluoreszcens kép. Str: striatum. Mérce: 25 m.
86
Megbeszélés Teoretikusan a széles fejlődési potenciállal rendelkező, idegsejteket és oligodendroglia sejteket is képezni tudó őssejtek sokféle központi idegrendszeri betegségben nyerhetnének felhasználást. Az agyba bejuttatott őssejtek alkalmasak lehetnek arra, hogy helyettesítsék az agy elpusztult sejttípusait, benépesítsék az elhalt területeket. Létfontosságú neurotrofikus faktorok szekréciójára, immunmodulációra, angiogenezis indukálására, a gyulladás befolyásolására is képesek (Qu és mtsai 2007, Mahmood és mtsai 2004, Chen és mtsai 2003, Aggarwal és Pittenger 2005). Jelenlétük az agyi környezetet jelentősen megváltoztathatja, optimális esetben kedvezőbbé alakíthatja a regenerációs folyamatok számára. Előzetesen genetikailag módosított őssejtek beültetésével egyes – extracelluláris térben aktív – enzimek végzetes hiánya mérsékelhető vagy kivédhető, vagy elődifferenciáltatott őssejtek bevitelével agyi neurotranszmitter-hiányok enyhíthetők. Számos központi idegrendszeri betegség modelljében végeztek már őssejt-beültetéses kísérleteket, sőt, néhány kórkép esetén humán sejtbeültetéses klinikai vizsgálatok is történtek (16. táblázat). Noha a betegség-modellekbe történő sejtbeültetések bíztató részeredményekkel jártak (az őssejtek egy részének idegsejtté alakulása, reinnerváció, javuló neurotranszmitterszintek, esetenként funkcionális javulás), egyelőre az őssejtterápia egyetlen idegrendszeri kórkép esetén sem jutott abba a fázisba, hogy a klinikai gyakorlatban biztonsággal alkalmazható lenne. A laboratóriumi körülmények között jól jellemzett ős- és progenitorsejt-típusok viselkedése a komplex agyi környezetben egyelőre biztonsággal nem jósolható. Az idegsejtet képezni tudó sejtek implantációja komoly veszélyeket is hordoz. Idegszöveti integráció és funkcionális javulás helyett, a bevitt sejtek pusztulása gyulladásos folyamatokat indukálhat. Ennél is nagyobb veszély, hogy a differenciálatlan őssejtek kontrollálatlan növekedése folytán tumorok alakulnak, vagy szövetidegen heg-szerű szigetek képződnek. A sejtek elköteleződését meghatározó folyamatok összetevőinek alaposabb ismerete elengedhetetlen előfeltétele a jövőbeni sikeres sejtterápiáknak. 16. táblázat (88. oldal) Sejtimplantációs vizsgálatok központi idegrendszeri kórállapotokban
87
Betegség Parkinson-kór
Kórélettani alapja A nigrostriatalis dopaminerg neuronok puszulása
Ischaemia-s stroke
Huntington-kór
Alzheimer-kór
idegsejt-pótlás, idegi hálózatok regenerációja
[1]
Huntingtin génmutáció következtében a striatum közepes, tüskés neuronjainak pusztulása
fötális striatalis szövetgraft, embrionális őssejt, csontvelői őssejt, idegi progenitor sejt
idegsejt-pótlás, idegi hálózatok regenerációja
[1]
Oligodendroglia myelin károsodás, idegi ingerületátvitel károsodása Lizoszomális enzimműködési zavar Béta-amiloid plakkok és neurofibrillumok megjelenésével járó neurodegeneratív betegség
Gerincvelő-sérülés Gerincvelői pályarendszerek megszakadása
Agyi trauma
dopaminerg transzmisszió pótlása
Hivatkozás [1] [2] [3] [1], [4]
fötális agyi szövetgraft, felnőtt idegi őssejt, köldökzsinórvér-őssejt, csontvelői stromasejt, neuroepitheliális őssejt
Agykérgi, agytörzsi, gerincvelői motoneuron-degeneráció
Mucopolysaccharidosis-ok
A sejtterápia célja
Agyi érelzáródás
Amyotrophia-s lateral sclerosis
Demyelinizációs betegségek
Beültetett sejt/szövetblokk típusa fötális középagyi graft mellékvesevelő graft humán fötális neuron embrionális őssejt
Agyi sérülés és másodlagos elváltozások következtében jelentkező sejtpusztulás
fötális motoneuron köldökzsinórvér-őssejt GDNF-szekretáló idegi progenitor sejt és mesenchymális őssejt mesenchymális őssejt idegi őssejt hemopoetikus őssejt immortalizált fötális gerincvelői progenitorsejt embrionális őssejt-eredetű motoneuron oligodendrocita prekurzor felnőtt idegi őssejt genetikailag módosított idegi őssejt genetikailag módosított hemopoetikus őssejt genetikailag módosított, NGF-termelő sejt genetikailag módosított, acetil-kolint szekretáló fibroblaszt idegi őssejt, Schwann-sejt, autológ makrofág hemopoetikus és csontvelői őssejt, embrionális őssejtek, sejtes áthidalás ('scaffold'), "olfactory ensheating cell" növekedési faktor-termelő sejtes áthidalás sejtes áthidalás (idegi őssejttel) köldökzsinórvér-őssejt hemopoetikus és csontvelői őssejt fötális idegi őssejt
88
[1] [1], [5] [6], [7] motoneuronok helyettesítése, idegi hálózatok regenerációja
remyelinizáció
enzimpótlás kolinerg transzmisszió helyreállítása, idegsejt-pótlás sejtpótlás, parakrin hatások, axonregeneráció segítése, immunmoduláció, folytonossági hiány megszüntetése
parakrin hatások, sejtpótlás, folytonossági hiány megszüntetése
[8] [9] [10] [11], [12] [12], [13] [14] [15] [16] [17], [18] [19], [20] [21], [22] [23] [24], [25] [25] [26] [27] [28] [29], [30] [31]
16. táblázat Rövidítések: rev.: összefoglaló cikk, review, GDNF: glia sejtvonal eredetű neurotrófikus faktor, glial cell line-derived neurotrophic factor, NGF: idegnövekedési faktor, nerve growth factor Hivatkozások: [1] Lindvall és mtsai 2004 rev.; [2] Backlund és mtsai 1985; [3] Lindvall és mtsai 1989; [4] Björklund és mtsai 2002; [5] Garbuzova-Davis és mtsai 2008; [6] Suzuki és mtsai 2007; [7] Suzuki és mtsai 2008; [8] Zhao és mtsai 2007; [9] Corti és mtsai 2007; [10] Appel és mtsai 2008; [11] Roy és mtsai 2004; [12] Goldman és Windrem 2006 rev.; [13] Li és mtsai 2005b; [14] Windrem és mtsai 2004; [15] Pluchino és mtsai 2003; [16] Pluchino és mtsai 2004 rev.; [17] Snyder és mtsai 1995; [18] Lacorazza és mtsai 1996; [19] Pastores 2008 rev.; [20] Cartier és Aubourg 2008; [21] Kordower és mtsai 1994; [22] Blesch és Tuszynski 2004 rev.; [23] Fisher és mtsai 1993 rev.; [24] Rossignol és mtsai 2007 rev.; [25] Samadikuchaksaraei 2007 rev.; [26] Lu és Tuszynski 2008 rev.; [27] Tate és mtsai 2002; [28] Lu és mtsai 2002; [29] Lu és mtsai 2001; [30] Qu és mtsai 2008; [31] Gao és mtsai 2006
Vizsgálataim során tanulmányoztam, hogy a befogadó agyi környezet módosításai és az őssejtek in vitro előzetes indukciója milyen hatással bír az idegi őssejtek intracerebrális sorsára, idegi irányú differenciálódására. Sejtbeültetéshez az NE-4C neuroektodermális őssejtvonalat és annak jelölt, agyon belül könnyen detektálható alklónjait (GFP-4C, PLAP-4C) használtam. A p53deficiens, 9 napos egérembrió előagyhólyagjából származó NE-4C klón, egyetlen sejt feno- és genotípusosan azonos utódsejtjeit tartalmazó, neuroektodermális sejtvonal (Schlett és Madarász 1997, Schlett és mtsai 1997). A homogén sejt-preparátum előnye, hogy egy jól definiált sejt-stádiumból kindulva, megbízhatóan vizsgálható, hogy in vitro vagy in vivo, milyen irányba és milyen mértékben differenciálódnak a sejtek. Az NE-4C sejtek idegi elköteleződése többféle módon elindítható, és kiszámíthatóan, ismert „menetrend” szerint zajlik (Környei és mtsai 2005, Schlett és Madarász 1997, Schlett és mtsai 1997). A sejtek az in vitro differenciálódás bármely stádiumában implantálhatók, és ezzel út nyílik az adott agyterületi integrációra legalkalmasabb idegsejt-fejlődési állapot kiválasztására. Az NE-4C sejtvonal terápiás humán beavatkozásokra nem alkalmas: egér sejtek, amelyek p53-deficienciájuk révén immortalizáltak. A p53-hiány azonban nem akadályozza meg, hogy a sejtek kilépjenek a sejtciklusból és elkötelezett, posztmitotikus utódsejteket alakítsanak ki. A sejtvonal az in vitro idegi sejtfejlődés vizsgálatai mellett, alkalmasnak bizonyult modell-állatokon végzett implantációs kísérletek (Demeter és mtsai 2004, 2005, Ágoston és mtsai 2007) folytatására.
89
Saját kísérleteim során in vitro és in vivo is vizsgáltam az idegi őssejtek kölcsönhatásait ép és kóros idegszöveti sejtekkel és tanulmányoztam a megváltozott oxigén-tenzióra adott válaszreakcióikat. Az NE-4C sejteket elkötelezetlen őssejt-állapotban és előindukciót követően - elkötelezett idegi prekurzorsejtekként ültettük be különböző pathofiziológiás állapotú felnőtt modellállatok agyába. Megfigyeltük az őssejtek és utódsejtjek túlélését, differenciálódását, apoptózisát, integrációs képességét különböző túlélési időt követően. Emellett a sejtek agyban elfogalt méretét, szöveti invázióra való hajlamát, tumorsejtekkel való kölcsönhatásait is behatóan tanulmányoztuk, hogy az őssejtek esetleges tumorigén hatásáról adatot nyerjünk. A károsodott agyi környezet modellezésének egyik elterjedt módja az agyi ischaemia létrehozása agyi artériák tranziens vagy permanens leszorításával/elzárásával. Mivel az ischaemia-s stroke az egyik leggyakoribb halállal vagy hosszú távú életminőségromlással járó humán kórállapot, molekuláris-biokémiai folyamatainak pontos megértését és a betegség gyógyítását modellkísérletek sokasága célozza meg. Az agyi artériák leszorítása, vagy filamentummal történő okklúziója patkány és gerbil modellekben jó hatásfokkal elvégezhető. Egerekben az érhálózat kis mérete és ellátási varianciája miatt azonban más modellek, többek között a hidegléziós (fagyasztásos) (Klatzo és mtsai 1958, Murakami és mtsai 1999) vagy a fototrombotikus modell (Kim és mtsai 2000) alkalmazása terjedt el. A fagyasztásos lézió előnye az alacsony mortalitás, a jó reprodukálhatóság és a szabályozható
méretű,
felszíni
sérülés,
amelynek
kiterjedése
az
agykéregre
korlátozható. Ugyanakkor, a fagyasztásos lézió szövettani és (részben) biokémiai következményei hasonlóak az érelzáródás esetén tapasztaltakhoz. A vér-agy gát sérül, hipoperfúzió és hipoxia alakul ki, és mindezek következtében a helyi metabolizmus és az energia-ellátás zavart szenved, szabadgyök-okozta károsodások lépnek fel (Steinbach és mtsai 1999, Weinzierl és mtsai 2002, Plesnila és mtsai 2003, Zhuang és mtsai 1992). Pár órán belül, egy döntően nekrotikus magi régió és 1-2 napon belül egy részben károsodott, sok apoptotikus sejtet is tartalmazó „penumbra zóna” (késleltetett, másodlagos károsodás) alakul ki (Murakami és mtsai 1999, Steinbach és mtsai 1999). Munkáink során az egér-eredetű modell-sejtvonalunkat allogén módon, egér befogadóba ültettük be, így idegrendszeri sértésként a fagyasztásos modell alkalmazása mellett döntöttünk. A gazdaszövet immunszuppresszió nélküli, teljes
90
reakcióját vizsgáltuk. A hideglézió számottevő perioperatív halálozással nem járt, és a viselkedés-tesztek alapján, a modellállatokban csak átmeneti, néhány nap alatt teljesen elmúló neurológiai tüneteket okozott. A károsodott agykérgi környezet a beültetett GFP-4C őssejtek túlélését megnyújtotta. Míg a beültetett idegi őssejtek az intakt agyból 6 héten belül eltűntek, a sértett agyban 8 hétnél, azaz a vizsgálati időszaknál hosszabb túlélésre voltak képesek. A GFP-4C sejtek szaporodása a sértett agyi környezetben - a sejtaggregátum méretnövekedéséből számított érték alapján – lassabb volt, mint az indukálatlan tenyészetekben. A sejtnövekedés mértéke ugyanakkor, meghaladta a neuronális irányba differenciálódó sejtek in vitro szaporodásának ütemét. Az in vitro differenciálódás megindulását ugyanis az jelzi, hogy az indukált tenyészetek sejtjeinek átlagosan 40%-a megáll az osztódásban (Schlett és Madarász 1997). A lézió-közeli területre beültetett GFP-4C sejtek segítettek az elhalt terület benépesítésében, szórványosan asztrocitákat képeztek, de neuronná nem fejlődtek. A sejtek visszatenyésztését követő in vitro vizsgálatok tisztázták, hogy a sejtek klonális tulajdonságai nem változtak. Az ép és a lézionált agyban tapasztalt eltérő viselkedésüket a megváltozott környezeti feltételek magyarázhatják. A sértett agyi környezet, nem gátolja az elkötelezetlen sejtek osztódását és az asztroglia-képződést, de nem segíti, vagy éppenséggel gátolja a neuronirányú elköteleződést. Saját eredményeink összhangban vannak azokkal az irodalomi adatokkal, amelyek szerint bizonyos szöveti károsodások megváltoztatják a központi idegrendszer endogén sejtképző folyamatait és az implantált sejtek „sorsát”. Különböző pathológiás folyamatok hatására a neurogén területeken fokozódhat/csökkenhet az endogén őssejtek szaporodása, és egyes agyterületeken megfigyelhető az endogén prekurzorok bevándorlása, érése, beépülése (1. táblázat). A Macklis és munkatársai által 1993-2000 között kialakított sértési modell - amely gyulladás nélkül, apoptotikusan károsít meghatározott sejtrétegeket – segítette az endogén neurogenezist, prekurzor-migrációt, agykérgi régióspecifikus differenciációt (Magavi és mtsai 2000), és a beültetett progenitor sejtek letelepedését, differenciációját és integrációját is (Macklis 1993, Sheen és Macklis, 1995, Snyder és mtsai 1997, Shin és mtsai 2000, Fricker-Gates és mtsai 2002).
91
Az endogén/beültetett sejt-eredetű neurogenezis mértékét alapvetően megszabja, hogy a befogadó környezet mennyire „permisszív”; azaz hogyan működik együtt a proliferáló/differenciálódó sejtekkel. Ez függ attól, hogy
milyen típusú sérülés érte (nekrotikus/apoptotikus elhalás)
a gyulladásos kaszkád beindult-e, milyen fokú a gyulladás
milyen fokú a gliózis, hegképződés
van-e nagy kiterjedésű, nehezen áthidalható szövethiány
milyen a neurotrofikus faktorok helyi koncentrációja
az őssejtek és leszármazottaik által elérhető-e a sérülés területe
Ischaemia-s inzultust követően EGF és FGF-2 intraventrikuláris beadása fokozta az endogén progenitor-proliferációt és vándorlást, valamint a hippocampalis neurogenezist (Nakatomi és mtsai 2002). BDNF és neurotrofinok lokális adásával vagy vírus vektorral való génbejuttatás segítségével elért lokális termelésével, több károsodási modellben is részleges javulást értek el (Namiki és mtsai 2000, Grider és mtsai 2005). Az agyban indukált gyulladásos folyamatok endogén neurogenezist károsan befolyásoló hatásairól és a gyulladásgátlás ezt ellensúlyozó szerepéről is készültek tanulmányok (Ekdahl és mtsai 2003, Monje és mtsai 2003). A folyamatosan növekvő adatmennyiség ellnére, ma még távolról sem tisztázott, hogy egy-egy agyi régióban milyen növekedési, illetve gyulladást serkentő/gátló faktorok segítik vagy gátolják a lokális regeneratív folyamatokat, és messze nem ismertek azok a koncentráció-arányok, amelyek segíthetik az idegi őssejt-genezist, vagy lokális sejtdifferenciálódást. Az agykérgi fagyasztásos sértés alkalmazása a GFP-4C őssejtek túlélését lehetővé tette, azonban idegi irányú elköteleződésüket nem segítette. Ezért következő kísérleteinkben a GFP-4C őssejteket a beültetés előtt, in vitro, idegi differenciálódásra késztettük. A differenciálódást asztrocitákkal való együtt-tenyésztéssel vagy retinsavas kezeléssel indítottuk el. Az asztrocita ko-kultúrákban elköteleződő progenitor sejtek rövidtávon nagyobb arányban éltek túl az intakt agyban, mint a retinsavval előindukáltak. A jelenség magyarázatára további kísérletekkel kell meghatároznunk, hogy milyen asztrocita-eredetű faktorok segíthetik az őssejtek intracerebrális túlélését. Elvárásainkkal ellentétben, az előindukált, idegi prekurzorokban gazdag GFP-4C sejt-együttesből sem keletkezett jelentős számú idegsejt az agyi környezetben. Az
92
idegsejt-prekurzorok valószínűleg elpusztultak a befogadó környezetben, és a sejtekből csupán
asztrociták
alakultak
ki.
Ugyanakkor,
az
idegszöveti
irányba
nem
differenciálódó sejtek túléltek és szaporodtak. Hosszú túlélési idő mellett néhány esetben észleltünk nem invazívan terjeszkedő, de mérete alapján tumorosnak vélhető sejtaggregátumot a gazdaszöveten belül. A sejtek differenciáltsági fokának megváltoztatása tehát, önmagában, nem volt elégséges arra, hogy a felnőtt agyszövet
nem
permisszív
sajátosságát
„legyőzze”,
a
beültetett
sejtek
idegsejtképzését lehetővé tegye. Úgy tűnik, a sérült agyi mikrokörnyezetből hiányoznak azok a faktorok, amelyek lehetővé teszik (megindítják/fenntartják) az idegsejt-fejlődést. A hosszú (~2 hónap) intracerebrális túlélés során, egyes GFP-4C sejtek jelentős sejtbiológiai változást szenvedtek: az expandáló aggregátumokból izolált és újratenyésztett sejtek, in vitro is gyorsan szaporodó, morfológiailag megváltozott fenotípust mutattak. Ezek a tények az őssejt-terápia egyik legfontosabb veszélyére, a tumorigenezisre hívják fel a figyelmet. Tumorképződést sok laboratóriumban, különböző őssejtekkel végzett kísérlet kapcsán észleltek (Erdő és mtsai 2003, Riess és mtsai 2007, Amariglio és mtsai 2009). Ez a kockázat abból adódik, hogy az őssejtek széles fejlődési potenciállal bírnak, önmegújító képességgel rendelkeznek, korlátlanul szaporodhatnak, és hosszan fennmaradhatnak a szervezetben. Számos, a tumorsejtekhez hasonló tulajdonságuk van (Kopper és Hajdú 2004), amely segíti a sejtek fennmaradását, szaporodását. Ilyen a fokozott telomerázaktivitás, a sejtciklus-szabályozás és mitózis-indukció néhány jellegzetessége, az apoptózis útvonal gátlása, és egyes jellegzetes, sejtproliferációt, szöveti elköteleződést szabályozó szignalizációs folyamatok (Notch, Wnt, Shh-jelátvitel). Az őssejtek viszonylag hosszú életideje alatt elszenvedett mutációk a fent említett mechanizmusok kisebb változásai útján tumorképződéshez vezethetnek (Preston és mtsai 2003). A tumorok bizonyos elképzelések szerint hibásan működő ős- vagy progenitorsejtekből származnak, és erre bizonyos vérképző rendszeri tumorok példával is szolgálnak (Kopper és Hajdú 2004). Központi idegrendszeri daganatokból sikerült önmegújító, CD133-pozitív, multipotens sejteket („tumor-őssejt”) izolálni, amelyek tenyészetben megfelelő körülmények között ideg- és gliasejtekre jellemző markereket is expresszáltak (Singh és mtsai 2003). Bizonyos típusú idegi őssejtek esetén megfigyelték, hogy érbe-juttatás vagy lokális beadás esetén képesek voltak tumorokhoz
93
vándorolni, abban szétszóródtak. Az ilyen őssejtek terápiás anti-tumor gén-bevitelre lehetnek képesek (Aboody és mtsai 2000, Benedetti és mtsai 2000, Ehtesham és mtsai 2002a,b). Ez is megerősíti, hogy - legalábbis bizonyos típusú - őssejtek könnyen lépnek kontaktusba tumorsejtekkel, tehát sejtfelszíni molekuláik, az általuk preferált ECM- és diffúzibilis faktorok nem állnak távol egymástól. Az őssejtek-tumorsejtek kapcsolatainak kérdései további kísérletekre indítottak; tanulmányozni
kezdtük
az
NE-4C
idegi
őssejtek
tumorsejtekkel
való
kölcsönhatásait. A sejtadhéziós eltérések és hasonlóságok jelezhetik, hogy hasonló idegszöveti áreákban várható-e a bejuttatott sejtek „megtelepedése”, túlélése, és egyben azt is megmutatja, hogy valóban használhatók-e egyes idegi őssejtek tumorok „célzására”, azaz antitumor hatóanyagok célbajuttatására. A humorális kölcsönhatások ugyanakkor megmutatják, hogy termelnek-e az ős/progenitor, illetve tumor sejtek egymás szaporodására / differenciálódására ható autokrin/parakrin faktorokat. Kiméra-aggregációs kísérleti eredményeink jelezték, hogy az NE-4C őssejtek csak bizonyos tumorsejtekkel képesek kontakt kapcsolatokat létesíteni. Az adatok egyértelműen jelezték, hogy egységes őssejt – tumorsejt adhéziós preferenciáról nem lehet beszélni. A szolubilis kölcsönhatások tanulmányozása fényt derített arra, hogy az NE-4C őssejtek bizonyos tumorsejtek (C6-glióma) proliferációját fokozó hatóanyagokat bocsátanak a folyadékkörnyezetbe. Bár nem minden vizsgált tumoros sejtvonal esetén tapasztaltuk az őssejtek tumor-szaporodást fokozó hatását, az eredmények alátámasztják azokat a félelmeket, amelyek az őssejt-beültetések tumor-képződést elősegítő hatásaira hívják fel a figyelmet. Ugyanakkor, az általunk vizsgált tumorsejtek egyike sem termelt olyan természetű vagy olyan mennyiségű faktort, amely az NE-4C őssejtek szaporodását befolyásolta volna. Miután az őssejtekkel való együtttenyésztés nem befolyásolta a GL261 glioblasztóma sejtek proliferációját, továbbá a két sejtféleség egymással jól keveredett, kísérletet tettünk GL261 glioblasztóma tumorok NE-4C őssejtekkel való „célzására”. Az NE-4C őssejtek az egéragyban előidézett GL261 tumorban és annak közvetlen közelében túléltek ugyan, de a tumorsejtek szaporodása sokszorosan meghaladta az őssejtek proliferációját. A tumor feltételezett kemotaktikus hatása nem segítette a
94
tumortól távolabbra (500-1000 m) beültetett őssejtek célzott vándorlását, az agyi parenchymán való átjutását. Adataink azt mutatják, hogy csak nagyon meghatározott őssejt – tumorsejt „párok” esetén vethető fel az őssejttel való „tumor-célzás” gondolata, és ilyen esetben is kérdéses, hogy az ép agyszövet őssejtek migrációját gátló hatásait a tumor közelsége enyhíteni tudja-e. Közös tényező az őssejtek és tumorsejtek „viselkedésében”, hogy igen jól tűrik a hipoxiás környezetet. Hipoxiás (mikro)környezetű régiók léteznek a normálisan fejlődő embrióban, és az egészséges felnőtt szervezetben (pl. csontvelő) is. A központi idegrendszer és más szervek kórállapotaiban hipoxiás szövetterületek gyakran előfordulnak (agyi ischaemia, gyulladásos folyamatok, tumorok). A változó szöveti oxigén tenzió a hipoxia-indukált faktor (HIF) és egyéb molekuláris szignálok útján szabályozza az embrionális morfogenezist (szív- és érfejlődés, haemopoesis, placenta-, csont-, zsírfejlődés) és nemcsak engedi túlélni a környezetben jelenlévő őssejteket, de elköteleződésüket is szabályozza (Simon és Keith 2008). A tumoros folyamatokat kísérő hipoxia a hipoxia-indukált faktorok stabilizálódásán keresztül metabolikus alkalmazkodáshoz, érújdonképződéshez, és a sejtek proliferatív-differenciálódási útját befolyásoló szignálok megváltozásához vezet (Keith és Simon 2007). Eredményeink – más őssejtekről nyert irodalmi adatokkal egybehangzóan - igazolták, hogy az NE-4C idegi őssejtek jelentős sejtélettani változás (életképesség, sejtproliferáció, spontán differenciálódás terén) nélkül elviselik a hosszantartó (48 óra), súlyos ([O2] = 1 %) hipoxiát. A hipoxiás környezet azonban jelentős sejtsorsmódosító hatást gyakorolt az idegsejt fejlődés irányába elköteleződő sejtekre. A differenciálódásra indukált tenyészetekben az elkötelezettség szinte bármely fázisában alkalmazott hipoxiás kezelés szignifikánsan csökkentette neuronná fejlődő sejtek számát. A hipoxia szignifikánsan csökkentette a proneurális és neurális gének expresszióját. Eredményeink alapján tehát, a hipoxiás környezet a differenciálatlan őssejek működésében nem okoz zavart, míg az idegi elköteleződés fázisaiban lévő sejtek differenciációs folyamatait gátolja.
95
Az in vitro eredmények alapján feltételeztük, hogy az agykérgi sérülés hipoxiás környezete – bár sokkal komplexebb rendszerben – hasonlóképpen megengedi az őssejtek szaporodását, túlélését, de károsítja a differenciációs folyamatokat és így, a neuronképzést. Ezért megvizsgáltuk, hogy a hipoxiás állapot (részleges) korrekciója hiperbárikus oxigénterápiás kezeléssel (HBOT) megváltoztatja-e az őssejtek agyszöveten belüli sorsát, idegszöveti elköteleződését, és befolyásolja-e a sérült szövet regenerációját. A hiperbárikus oxigénterápia önmagában neuroprotektív hatással is bírhat, hiszen kivédheti a hipoperfúzió következtében kialakuló súlyos hipoxiát, és ezzel megelőzheti, mérsékelheti a szekunder károsodás kialakulását. A hiperbárikus terápia előnyös hatásait különböző agyi károsodások modelljeiben számos cikk taglalja (Matchett és mtsai 2009 [review]). Jelen munkánk célja nem a hiperbárikus terápia agyi „lézióméret-csökkentő” hatásának felmérése volt, hanem a beültetett sejtek oxigénérzékenységét kívántuk vizsgálni. Az általunk alkalmazott rövid - egy héten át naponta alkalmazott - HBO-kezelés figyelemre méltó változásokat okozott mind a beültetett őssejtek, mind a gazdaszövet sejtjeinek sorsában. A HBO-kezelés a sérülés területén a saját, repopuláló sejtek akkumulációját visszaszorította,
a
saját,
pozitív
SSEA-1
progenitorsejtek
megjelenését
megakadályozta. A HBO-kezelés a sérült területen mért apoptózist (a beültetett és gazdasejtek között) mérsékelte, az osztódó sejtalakok arányát csökkentette. Beültetett (GFP-4C) őssejt-eredetű idegsejteket csupán HBO-val kezelt állatokban találtunk. Várakozásainknak
megfelelően
tehát,
a
HBO-terápia
az
idegsejt-irányú
differenciálódás folyamatai számára megengedő környezetet teremtett, az elköteleződő sejtek túlélését nem gátolta. Az a megfigyelés, hogy a hipoxiás agyban az elkötelezetlen sejtek növekedése nagyobb mértékű, mint a HBO-kezelt állatok agyában, bár fontos adatnak látszik, további, közvetlen igazolást igényel. Az intracerebrális sejtproliferáció mérése (pl. BrdU- vagy [3H]-timidin beépülés meghatározásával) laboratóriumunk közvetlen, jelenlegi feladata. A hipoxiás környezet hatása magyarázatot adhat a sejtbeültetés
96
következtében szórványosan megfigyelt tumorképződésre az előzetesen sértett agyakban. Ugyanakkor a HBOT sejtproliferációt feltételezhetően csökkentő hatása még nem jelenti a potenciális tumorigenezis kiküszöbölését, hiszen a fennmaradó őssejt-sajátságú sejtek nem pusztulnak el alkalmazásakor. A HBOT hatásainak felmérése a sértett, sejtbeültetésben részesített és kontroll állatcsoportokban, illetve a HBOT idegi sejtdifferenciálódást segítő hatásainak elemzése is további kísérleteket igényel. Tisztázásra vár, hogy hosszabb időtartamú, vagy más időszakban történő alkalmazás mellett, milyen mértékű idegsejt-képzésre késztethetők az implantált sejtek. A HBO-kezelés feltételezhető káros mellékhatásai azonban ugyancsak komoly vizsgálatokat igényelnek. Vannak adatok a HBOT in vitro és in vivo genotoxikus hatásáról (Rothfuss és mtsai 1999, Speit és mtsai 2000, 2002, Eken és mtsai 2005), továbbá arról, hogy a HBOT sem az agyi erek lipid peroxidációs profilját, sem az agyi ischaemia során létrejövő c-fos proto-onkogén indukcióját nem befolyásolja számottevően (Shabitz és mtsai 2004). A sejtekben jelentkező oxidatív károsodások mértékéről és a szervezet adaptív válaszreakcióiól egyelőre nem egybehangzóak és meglehetősen hiányosak az eredmények (Rothfuss és mtsai 1998, Speit és mtsai 2000, 2002, Eken és mtsai 2005, Korkmaz és mtsai 2008). Tisztában vagyunk azzal, hogy a sejtbeültetések utáni sikeres idegszöveti integráció, az idegi hálózatalkotás az oxigén-ellátottság mellett igen sok élettani / bioelektomos tényezőtől függ. A differenciálódás és az idegszövetbe való végső beilleszkedés aktivitásfüggő folyamat (Ben-Ari és mtsai 1989). A felnőtt ép agyban a fiatal, beilleszkedésre képes idegsejt-prekurzorok kis eséllyel kapnak megfelelő ritmusú és amplitúdójú stimulust, ami a működő ideghálózatokba való beépülés, vagy új hálózatok kialakulásának kulcsa lenne. Új idegsejtek beépülése és túlélése a felnőtt agy hippocampus gyrus dentatus régiójában, illetve a szaglógumóban lehetséges. Ezekben a folyamatosan átépülő hálózatokban ható stimulusok leírása a fejlődés-neurobiológia egyik legizgalmasabb kutatási területe. Idegsejt-integráció és túlélés kizárólag akkor valósul meg, ha megfelelő időzítéssel, megfelelő paraméterű inger-mintázat van jelen (Kee és mtsai 2007, Tashiro és mtsai 2007, Petreanu és Alvarez-Buylla 2002). Ezeket a folyamatokat „az idegsejt-pótlás nyelvére lefordítani” nem egyszerű. Valószínűleg a jövőben a gerincvelői és agyi sejtpótlásokat olyan komplex rehabilitációnak kellene
97
követnie, amely a megfelelő kémiai környezet, O2-tenzió biztosításával, elektromos ingerléssel, gyógytornával, motoros, vegetatív és érzőkvalitások serkentésével lehetővé teszi az agyi idegpályák regenerációját vagy új pályák képződését. Az idegszöveti integráció
idegélettani
paramétereinek
vizsgálata
a
közeljövő
fejlődés-
neurobiológiájának és az idegi sejtterápiák kidolgozásának alapvető feladata. Munkám során bizonyítottam, hogy a multipotens őssejtek csak megfelelő állapotú agyban,
adekvát
környezeti
szignálok
hatására
válhatnak
elkötelezett
(ideg)sejtekké, integrálódhatnak a befogadó agyszövetbe. Az idegsejt-prekurzorok, képződő
idegsejtek
integrációja
az
agyszövetbe
komplex
idegrendszeri
együttműködést igényel. Más környezeti feltételek kellenek a differenciálatlan őssejtek
fennmaradásához,
szükségesek
a
szaporodásához,
posztmitotikus
egészen
idegsejt-előalakok
idegi
más
körülmények
hálózatokba
való
integrációjához. A jövőbeni hatékony és biztonságos őssejtterápiák kialakításához rendkívül fontos, hogy minél részletesebben megismerjük az agyi mikrokörnyezet különféle fejlettségű sejtekre gyakorolt hatásait, további adatokat nyerjünk arról, hogy a különböző környezeti tényezők változtatása miképpen hat az endogén őssejtképzésre és a beültetett őssejtek túlélésére, elköteleződésére, integrációjára.
98
Következtetések Munkánk során választ kerestük a kérdésre, hogy hogyan befolyásolja az agyba beültetett széles potenciálú, idegsejtet is képezni tudó őssejtek sorsát az agyi szöveti környezete. Megkíséreltük az agyi környezet módosításával és az őssejtek előkészítésével a sejtbeültetés eredményességét javítani, a sejteket idegi fenotípus irányába történő elköteleződésre, illetve integrációra segíteni. Az NE-4C geno- és fenotipikusan azonos neuroektodermális őssejtekkel és alklónjaival végzett implantációs kísérleteink megmutatták, hogy a felnőtt, előzetesen nem sértett agykéreg szöveti környezete az őssejtek hosszútávú túlélését, elköteleződését, szövetspecifikus integrációját nem támogatja. Ezzel szemben a felnőtt, sérült cortex környezete hosszútávú túlélésüket, a sejthiányos szöveti tér benépesítésében való részvételüket
segíti,
gliogenezisüket
nem
gátolja,
azonban
idegsejt-irányú
elköteleződésüket nem segíti elő. Sejt-visszatenyésztés révén nyert adataink azt bizonyítják, hogy a sejtek sérült környezetben tapasztalt eltérő viselkedését nem klonális tulajdonságaiknak megváltozása, hanem az eltérő szöveti környezet okozza. Tumorsejtekkel és őssejtekkel végzett munkáink megmutatták, hogy az NE-4C őssejtek csak bizonyos tumorsejttípusokkal (GL261 glioblasztóma) képesek sejt-sejt kapcsolatot kialakítani, és hogy egyes tumorok (C6 glióma) proliferációját az őssejtek által termelt parakrin faktorok serkentik, alkalmazásuk tehát a tumorprogresszió veszélyét hordozhatja. Agyi környezetben a GL261 tumorsejtek jelenléte az idegi őssejtek túlélését ugyan megengedi, de olyan kemotaktikus faktorokat nem (vagy nem elégséges mennyiségben) termel, amelyek segítenék az őssejtek tumorsejt-célzását, vagyis az őssejtek tumorhoz vándorlását. Az idegi indukció útján elindított őssejtek agyba ültetése tisztázta, hogy az in vitro indukció nem elégséges a sejtek agyszöveti integrációjának előkészítéséhez, emellett felhívták a figyelmet az őssejtekből történő tumorigenezis veszélyére. Vizsgálataink alapján a hipoxiás kezelés az elkötelezetlen őssejtek életképességét, sejtproliferációját és spontán differenciálódását nem befolyásolja, azonban az idegi sejtfejlődés előrehaladottabb stádiumaiban alkalmazott alacsony O2-tenzió nemcsak az életképességet és sejtproliferációt, hanem az idegsejt-képzés folyamatait is károsítotja.
99
Az egyes agyi kóros állapotokban jelentkező hipoperfúzió és hipoxia ellensúlyozására alkalmazott hiperbárikus oxigénterápiával lényeges változásokat idéztünk elő mind az agyba bejuttatott, mind a gazda-eredetű sejtek viselkedésében. A HBOT csökkentette a sérülést benépesítő sejtek apoptózisát, visszafogta az endogén és exogén sejtek akkumulációját és megengedőbb környezetet teremtett az idegi irányú elköteleződés folyamatai számára. Munkánk során bizonyítottuk, hogy az agy szöveti környezete alapvetően megszabja a beültetett idegi őssejtek viselkedését. A multipotens őssejtek csak megfelelő állapotú agyban, adekvát környezeti szignálok hatására válhatnak elkötelezett (ideg)sejtekké, integrálódhatnak a befogadó agyszövetbe. Más környezeti feltételek kellenek a differenciálatlan őssejtek fennmaradásához, szaporodásához, mint az elköteleződő és posztmitotikus idegsejt-előalakok túléléséhez, idegi hálózatokba való integrációjához.
100
Összefoglalás Az NE-4C neuroektodermális őssejtekkel és (GFP-4C, PLAP-4C) alklónjaival végzett implantációs vizsgálatok megmutatták, hogy az agy szöveti környezetének aktuális állapota alapvetően meghatározza a beültetett idegi őssejtek sorsát.
Az indukálatlan őssejtek intakt felnőtt agyszövetben rövid ideig élnek, nem integrálódnak. Az előzetesen sértett agykérgi környezetben a beültetett őssejtek túlélése megnyúlik, közreműködnek a sérült terület benépesítésében, de számottevő idegsejtképzést nem mutatnak (Zádori, Ágoston és mtsai 2007, Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22).
Az NE-4C őssejtek csak meghatározott tumorok megközelítésére lehetnek alkalmasak. (Demeter és mtsai 2005, Neurosci Res. 2005 53(3):331-42).
Az őssejtek fejlődésének in vitro megindítása, önmagában nem elégséges ahhoz, hogy a beültetett prekurzorsejtekből idegsejtek fejlődjenek az agyban.
Az alacsony O2-tenziójú in vitro közegben az őssejtek –látszólag - zavartalanul nőnek, míg az idegi elköteleződés különböző fázisaiban lévő progenitorok fejlődési potenciálja megváltozik, idegsejt-képzésük csökken (*).
A szövetkárosodás helyén jelentkező hipoxia csökkenti az idegsejt-képződést. A szöveti hipoxia ellensúlyozására alkalmazott hiperbárikus oxigénkezelés az intracerebralis sejtproliferációt és apoptózist visszaszorítja, az idegsejtképzés lehetőségét javítja (*). (*: Zádori és mtsai 2010, kézirat benyújtva).
Kísérleteinkkel bizonyítottuk, hogy a befogadó agy szöveti környezete meghatározó az implantált idegi őssejtek viselkedésére nézve. A sejtek elköteleződésének in vitro megindítása nem elégséges segítség a megfelelő agyszöveti idegi differenciálódás elindításához, az agyi környezetben tett egyes módosítások azonban segíthetik az őssejtek túlélését és idegsejtté alakulását. In vitro és in vivo vizsgálataink megmutatták, hogy a környezet oxigén tenziója igen lényeges vezérlő körülmény az őssejtek sorsát tekintve. További munkáinkkal szeretnénk több adatot nyerni a hiperbárikus terápia sejtproliferációra gyakorolt hatásairól, és szeretnénk megtalálni azt az in vitro elérhető differenciációs állapotot, amely a leginkább biztosítja a beültetett sejtek idegszöveti integrációját.
101
Summary Data obtained from in vitro and in vivo studies on NE-4C neuroectodermal stem cells and on sub-clones expressing histological markers demonstrated that the intracerebral fate of implanted neural stem cells is governed by the actual state of the host environment.
Non-induced stem cells do not survive in, and can not integrate into the intact
adult brain parenchyma. In contrast, implanted stem cells survive for long (>60 days) time in damaged brain cortices and can repopulate lesioned zones. The implanted neural stem cells, however, do not differentiate to neurons either in lesioned or in intact adult brain (Zádori, Ágoston et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22).
NE-4C neural stem cells can survive inside of some glioma-type neoplastic
tissues, but can not „find” the tumors inside the brain indicating that the investigated tumours do not produce (enough) chemotactic signals to attract stem cells (Demeter et al., Neurosci Res. 2005 53(3):331-42).
Neural precursors at early stages of in vitro induced neuronal differentiation did
not show improved tissue-integration or in situ neuron formation in comparison to non-committed stem cells.
In vitro, non-induced stem cells grow readily at low (1%) oxygen concentration
and, apparently, are not damaged by hypoxia. Committed neural precursors, on the other hand, display increased sensitivity to hypoxia. At defined stages of neural differentiation, low O2-tension reduces the rates of neuron-production, markedly (*).
The hypoxic environment in lesioned cortices seems to inhibit local neuron-
production, but does not prevent the proliferation of the implanted stem cells.
Hyperbaric oxygen therapy reduces both, the intracerebral cell proliferation and
apoptosis at the lesion site, and makes the environment more permissive for formation of neurons (*). (*: Zádori et al. 2010, submitted) Our studies proved, that the fate of implanted neural stem cells is determined by the host environment. The intracerebral neuron-formation was not improved by implanting committed progenitors at early phase of neural commitment. Among the parameters of the host environment, oxygen tension is one of the essential regulators of the stem cell fate.
102
Irodalomjegyzék Aboody KS, Brown A, Rainov NG, Bower KA, Liu S, Yang W, Small JE, Herrlinger U, Ourednik V, Black PM, Breakefield XO, Snyder EY. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Nov 7;97(23):12846-51. Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005 Feb 15;105(4):1815-22. Agoston VA, Zádori A, Demeter K, Nagy Z, Madarász E. Different behaviour of implanted stem cells in intact and lesioned forebrain cortices. Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22. Ahmed SA, Gogal RM Jr, Walsh JE. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J Immunol Methods 1994 Apr 15;170(2):211-24 Allen E. The cessation of mitosis in the central nervous system of the albino rat. J. Comp. Neurol. 1912, 22:547-568. Altman J, Das GD. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol. 1965 Jun;124(3):319-35. Altman J, Bayer SA. Migration and distribution of two populations of hippocampal granule cell precursors during the perinatal and postnatal periods. J Comp Neurol. 1990a Nov 15;301(3):365-81. Altman J, Bayer SA. Mosaic organization of the hippocampal neuroepithelium and the multiple germinal sources of dentate granule cells. J Comp Neurol. 1990b Nov 15;301(3):325-42. Alvarez-Buylla A, García-Verdugo JM, Tramontin AD. A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells. Nat Rev Neurosci. 2001 Apr;2(4):287-93. Review. Alvarez-Buylla A, Seri B, Doetsch F. Identification of neural stem cells in the adult vertebrate brain. Brain Res Bull. 2002 Apr;57(6):751-8. Review. Amariglio N, Hirshberg A, Scheithauer BW, Cohen Y, Loewenthal R, Trakhtenbrot L, Paz N, Koren-Michowitz M, Waldman D, Leider-Trejo L, Toren A, Constantini S, Rechavi G. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 2009 Feb 17;6(2):e29.
103
Aponso PM, Faull RL, Connor B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 2008 Feb 19;151(4):1142-53. Appel SH, Engelhardt JI, Henkel JS, Siklos L, Beers DR, Yen AA, Simpson EP, Luo Y, Carrum G, Heslop HE, Brenner MK, Popat U. Hematopoietic stem cell transplantation in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 2008 Oct 21;71(17):1326-34. Aronowski J, Samways E, Strong R, Rhoades HM, Grotta JC. An alternative method for the quantitation of neuronal damage after experimental middle cerebral artery occlusion in rats: analysis of behavioral deficit. J Cereb Blood Flow Metab. 1996 Jul;16(4):705-13. Arvidsson A, Kokaia Z, Lindvall O. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated increase of neurogenesis in adult rat dentate gyrus following stroke. Eur J Neurosci. 2001 Jul;14(1):10-8. Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 2002; 8: 963–70. Ausman JI, Shapiro WR, Rall DP. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 1970, 30(9):2394-400. Backlund EO, Granberg PO, Hamberger B, Knutsson E, Mårtensson A, Sedvall G, Seiger A, Olson L. Transplantation of adrenal medullary tissue to striatum in parkinsonism. First clinical trials. J Neurosurg. 1985 Feb;62(2):169-73. Baker SA, Baker KA, Hagg T. Dopaminergic nigrostriatal projections regulate neural precursor proliferation in the adult mouse subventricular zone. Eur J Neurosci. 2004 Jul;20(2):575-9. Barker RA, Widner H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRx. 2004 Oct;1(4):472-81. Review. Ben-Ari Y, Cherubini E, Corradetti R, Gaiarsa JL. Giant synaptic potentials in immature rat CA3 hippocampal neurones. J Physiol. 1989 Sep;416:303-25. Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W. Differentiated rat glial cell strain in tissue culture. Science. 1968, 161(839):370-1. Benedetti S, Pirola B, Pollo B, Magrassi L, Bruzzone MG, Rigamonti D, Galli R, Selleri S, Di Meco F, De Fraja C, Vescovi A, Cattaneo E, Finocchiaro G. Gene therapy of
104
experimental brain tumors using neural progenitor cells Nat Med. 2000 Apr,6(4):44750. Beynon C, Sun L, Marti HH, Heiland S, Veltkamp R. Delayed hyperbaric oxygenation is more effective than early prolonged normobaric hyperoxia in experimental focal cerebral ischemia. Neurosci Lett. 2007 Oct 2;425(3):141-5. Bédard A, Parent A. Evidence of newly generated neurons in the human olfactory bulb. Brain Res Dev Brain Res. 2004 Jul 19;151(1-2):159-68. Bjorklund LM, Sánchez-Pernaute R, Chung S, Andersson T, Chen IY, McNaught KS, Brownell AL, Jenkins BG, Wahlestedt C, Kim KS, Isacson O. Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model. Proc Natl Acad Sci USA 2002 Feb 19;99(4):2344-9. Blesch A, Uy HS, Grill RJ, Cheng JG, Patterson PH, Tuszynski MH. Leukemia inhibitory factor augments neurotrophin expression and corticospinal axon growth after adult CNS injury. J Neurosci. 1999 May 1;19(9):3556-66. Blesch A, Tuszynski MH. Gene therapy and cell transplantation for Alzheimer's disease and spinal cord injury. Yonsei Med J. 2004 Jun 30;45 Suppl:28-31. Review. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976, 72:248-54. Buffo A, Vosko MR, Ertürk D, Hamann GF, Jucker M, Rowitch D, Götz M. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci USA 2005 Dec 13;102(50):18183-8. Buss A, Pech K, Kakulas BA, Martin D, Schoenen J, Noth J, Brook GA. Growthmodulating molecules are associated with invading Schwann cells and not astrocytes in human traumatic spinal cord injury. Brain. 2007 Apr;130(Pt 4):940-53. Cameron HA, Woolley CS, McEwen BS, Gould E. Differentiation of newly born neurons and glia in the dentate gyrus of the adult rat. Neuroscience. 1993 Sep;56(2):337-44. Cameron HA, McEwen BS, Gould E. Regulation of adult neurogenesis by excitatory input and NMDA receptor activation in the dentate gyrus. J Neurosci. 1995 Jun;15(6):4687-92.
105
Capela A, Temple S. LeX/ssea-1 is expressed by adult mouse CNS stem cells, identifying them as nonependymal. Neuron. 2002 Aug 29;35(5):865-75. Cartier N, Aubourg P. Hematopoietic stem cell gene therapy in Hurler syndrome, globoid
cell
leukodystrophy,
metachromatic
leukodystrophy
and
X-
adrenoleukodystrophy. Curr Opin Mol Ther. 2008 Oct;10(5):471-8. Review. Chen HL, Pistollato F, Hoeppner DJ, Ni HT, McKay RD, Panchision DM. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2291-301. Chen J, Zhang ZG, Li Y, Wang L, Xu YX, Gautam SC, Lu M, Zhu Z, Chopp M. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res. 2003 Apr 4;92(6):692-9. Chi L, Ke Y, Luo C, Li B, Gozal D, Kalyanaraman B, Liu R. Motor neuron degeneration promotes neural progenitor cell proliferation, migration, and neurogenesis in the spinal cords of amyotrophic lateral sclerosis mice. Stem Cells. 2006 Jan;24(1):34-43. Chiasson BJ, Tropepe V, Morshead CM, van der Kooy D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J Neurosci 1999;19:4462–71 Connor B, Kozlowski DA, Schallert T, Tillerson JL, Davidson BL, Bohn MC. Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the striatum and substantia nigra of the aged Parkinsonian rat. Gene Ther. 1999 Dec;6(12):1936-51. Conover JC, Doetsch F, Garcia-Verdugo JM, Gale NW, Yancopoulos GD, AlvarezBuylla A. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat Neurosci. 2000 Nov;3(11):1091-7. Corti S, Locatelli F, Papadimitriou D, Del Bo R, Nizzardo M, Nardini M, Donadoni C, Salani S, Fortunato F, Strazzer S, Bresolin N, Comi GP. Neural stem cells LewisX+ CXCR4+ modify disease progression in an amyotrophic lateral sclerosis model. Brain. 2007 May;130(Pt 5):1289-305. Covello KL, Kehler J, Yu H, Gordan JD, Arsham AM, Hu CJ, Labosky PA, Simon MC, Keith B. HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth. Genes Dev. 2006 Mar 1;20(5):557-70.
106
Curtis, M. A., Penney, E. B., Pearson, A. G., van Roon- Mom,W. M., Butterworth, N. J., Dragunow, M., Connor, B. & Faull, R. L. 2003 Increased cell proliferation and neurogenesis in the adult human Huntington‟s disease brain. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 9023–9027. Das KC, Ravi D, Holland W. Increased apoptosis and expression of p21 and p53 in premature infant baboon model of bronchopulmonary dysplasia. Antioxid Redox Signal. 2004 Feb;6(1):109-16. Demeter K, Herberth B, Duda E, Domonkos A, Jaffredo T, Herman JP, Madarász E. Fate of cloned embryonic neuroectodermal cells implanted into the adult, newborn and embryonic forebrain. Exp Neurol. 2004 Aug;188(2):254-67. Demeter K, Zádori A, Agoston VA, Madarász E. Studies on the use of NE-4C embryonic neuroectodermal stem cells for targeting brain tumour. Neurosci Res. 2005 Nov;53(3):331-42. Désaknai S, Lumniczky K, Esik O, Hamada H, Safrany G. Local tumour irradiation enhances the anti-tumour effect of a double-suicide gene therapy system in a murine glioma model. J Gene Med. 2003, 5(5):377-85. Dheen ST, Kaur C, Ling EA. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 2007;14(11):1189-97. Review. Dieterlen MT, Wegner F, Schwarz SC, Milosevic J, Schneider B, Busch M, Römuss U, Brandt A, Storch A, Schwarz J. Non-viral gene transfer by nucleofection allows stable gene expression in human neural progenitor cells. J Neurosci Methods. 2009 Mar 30;178(1):15-23. Doetsch F, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Cellular composition and threedimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 1997 Jul 1;17(13):5046-61. Doetsch F, Caillé I, Lim DA, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 1999 Jun 11;97(6):703-16. Doetsch F. A niche for adult neural stem cells. Curr Opin Genet Dev. 2003 Oct;13(5):543-50. Review.
107
Drukker M, Katz G, Urbach A, Schuldiner M, Markel G, Itskovitz-Eldor J, Reubinoff B, Mandelboim O, Benvenisty N. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Jul 23;99(15):9864-9. Eglitis MA, Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci USA 1997 Apr 15;94(8):4080-5. Ehtesham M, Kabos P, Kabosova A, Neuman T, Black KL, Yu JS. The use of interleukin 12-secreting neural stem cells for the treatment of intracranial glioma. Cancer Res. 2002a Oct 15;62(20):5657-63. Ehtesham M, Samoto K, Kabos P, Acosta FL, Gutierrez MA, Black KL, Yu JS. Treatment of intracranial glioma with in situ interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha gene transfer. Cancer Gene Ther. 2002b Nov;9(11):925-34. Ekdahl CT, Claasen JH, Bonde S, Kokaia Z, Lindvall O. Inflammation is detrimental for neurogenesis in adult brain. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Nov 11;100(23):13632-7. Eken A, Aydin A, Sayal A, Ustündağ A, Duydu Y, Dündar K. The effects of hyperbaric oxygen treatment on oxidative stress and SCE frequencies in humans. Clin Biochem. 2005 Dec;38(12):1133-7. Erdö F, Bührle C, Blunk J, Hoehn M, Xia Y, Fleischmann B, Föcking M, Küstermann E, Kolossov E, Hescheler J, Hossmann KA, Trapp T. Host-dependent tumorigenesis of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 2003 Jul;23(7):780-5. Eriksson PS, Perfilieva E, Björk-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, Gage FH. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med. 1998 Nov;4(11):1313-7. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6. Fisher LJ, Raymon HK, Gage FH. Cells engineered to produce acetylcholine: therapeutic potential for Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 1993 Sep 24;695:278-84. Review. Fitch MT, Silver J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008 Feb;209(2):294-301. Review.
108
Freundlieb N, François C, Tandé D, Oertel WH, Hirsch EC, Höglinger GU. Dopaminergic substantia nigra neurons project topographically organized to the subventricular zone and stimulate precursor cell proliferation in aged primates. J Neurosci. 2006 Feb 22;26(8):2321-5. Fricker-Gates RA, Shin JJ, Tai CC, Catapano LA, Macklis JD. Late-stage immature neocortical neurons reconstruct interhemispheric connections and form synaptic contacts with increased efficiency in adult mouse cortex undergoing targeted neurodegeneration. J Neurosci. 2002 May 15;22(10):4045-56. Fujita S. Quantitative analysis of cell proliferation and differentiation in the cortex of the postnatal mouse cerebellum. J Cell Biol. 1967 Feb;32(2):277-87. Gage FH, Coates PW, Palmer TD, Kuhn HG, Fisher LJ, Suhonen JO, Peterson DA, Suhr ST, Ray J. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc Natl Acad Sci USA 1995a Dec 5;92(25):1187983. Gage FH, Ray J, Fisher LJ. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu Rev Neurosci. 1995b;18:159-92. Review. Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science. 2000 Feb 25;287(5457):1433-8. Review. Gao J, Prough DS, McAdoo DJ, Grady JJ, Parsley MO, Ma L, Tarensenko YI, Wu P. Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function in rats after traumatic brain injury. Exp Neurol. 2006 Oct;201(2):281-92. Garbuzova-Davis S, Sanberg CD, Kuzmin-Nichols N, Willing AE, Gemma C, Bickford PC, Miller C, Rossi R, Sanberg PR. Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS: optimization of cell dose. PLoS ONE. 2008 Jun 25;3(6):e2494. Ghashghaei HT, Weber J, Pevny L, Schmid R, Schwab MH, Lloyd KC, Eisenstat DD, Lai C, Anton ES. The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone. Proc Natl Acad Sci USA 2006 Feb 7;103(6):1930-5. Goldman SA, Nottebohm F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc Natl Acad Sci USA 1983 Apr;80(8):2390-4.
109
Goldman SA, Windrem MS. Cell replacement therapy in neurological disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006 Sep 29;361(1473):1463-75. Review. Goncalves MB, Suetterlin P, Yip P, Molina-Holgado F, Walker DJ, Oudin MJ, Zentar MP, Pollard S, Yáñez-Muñoz RJ, Williams G, Walsh FS, Pangalos MN, Doherty P. A diacylglycerol lipase-CB2 cannabinoid pathway regulates adult subventricular zone neurogenesis in an age-dependent manner. Mol Cell Neurosci. 2008 Aug;38(4):52636. Gould E, Reeves AJ, Fallah M, Tanapat P, Gross CG, Fuchs E. Hippocampal neurogenesis in adult Old World primates. Proc Natl Acad Sci USA 1999a Apr 27;96(9):5263-7. Gould E., Reeves J.A., Graziano S.A.M., Gross G.C. Neurogenesis in the neocortex of adult primates 1999b Science Vol. 286. Götz M, Huttner WB. The cell biology of neurogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 Oct;6(10):777-88. Review. Grider MH, Mamounas LA, Le W, Shine HD. In situ expression of brain-derived neurotrophic factor or neurotrophin-3 promotes sprouting of cortical serotonergic axons following a neurotoxic lesion. J Neurosci Res. 2005 Nov 1;82(3):404-12. Grimaldi P, Rossi F. Lack of neurogenesis in the adult rat cerebellum after Purkinje cell degeneration and growth factor infusion. Eur J Neurosci. 2006 May;23(10):2657-68. Gu W, Brannstrom T, Wester P: Cortical neurogenesis in adult rats after reversible photothrombotic stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2000, 20:1166-1173. Gustafsson MV, Zheng X, Pereira T, Gradin K, Jin S, Lundkvist J, Ruas JL, Poellinger L, Lendahl U, Bondesson M. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 2005 Nov;9(5):617-28. Herberth B, Pataki A, Jelitai M, Schlett K, Deák F, Spät A, Madarász E. Changes of KCl sensitivity of proliferating neural progenitors during in vitro neurogenesis. J Neurosci Res. 2002 Mar 1;67(5):574-82. Herrera-Marschitz M, Strömberg I, Olsson D, Ungerstedt U, Olson L. Adrenal medullary implants in the dopamine-denervated rat striatum. II. Acute behavior as a function of graft amount and location and its modulation by neuroleptics. Brain Res. 1984 Apr 9;297(1):53-61.
110
Hicks AU, Lappalainen RS, Narkilahti S, Suuronen R, Corbett D, Sivenius J, Hovatta O, Jolkkonen J. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural precursor cells and enriched environment after cortical stroke in rats: cell survival and functional recovery. Eur J Neurosci. 2009 Feb;29(3):562-74. Hill MN, Kambo JS, Sun JC, Gorzalka BB, Galea LA. Endocannabinoids modulate stress-induced suppression of hippocampal cell proliferation and activation of defensive behaviours. Eur J Neurosci. 2006 Oct;24(7):1845-9. Hirabayashi Y, Itoh Y, Tabata H, Nakajima K, Akiyama T, Masuyama N, Gotoh Y. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 2004 Jun;131(12):2791-801. Horie N, So K, Moriya T, Kitagawa N, Tsutsumi K, Nagata I, Shinohara K. Effects of oxygen concentration on the proliferation and differentiation of mouse neural stem cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 2008 Sep;28(6):833-45. Isacson O, Deacon TW. Specific axon guidance factors persist in the adult brain as demonstrated by pig neuroblasts transplanted to the rat. Neuroscience. 1996 Dec;75(3):827-37. Jacques TS, Relvas JB, Nishimura S, Pytela R, Edwards GM, Streuli CH, ffrenchConstant C. Neural precursor cell chain migration and division are regulated through different beta1 integrins. Development. 1998 Aug;125(16):3167-77. Jelitai M, Schlett K, Varju P, Eisel U, Madarász E. Regulated appearance of NMDA receptor subunits and channel functions during in vitro neuronal differentiation. J Neurobiol. 2002 Apr;51(1):54-65. Jiang W, Gu W, Brannstrom T, Rosqvist R, Wester P: Cortical neurogenesis in adult rats after transient middle cerebral artery occlusion. Stroke 2001, 32:1201-1207. Jiao J, Chen DF. Induction of neurogenesis in nonconventional neurogenic regions of the adult central nervous system by niche astrocyte-produced signals. Stem Cells. 2008 May;26(5):1221-30. Jin K, Minami M, Lan JQ, Mao XO, Batteur S, Simon RP, Greenberg DA. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 4710–15.
111
Jin K, Sun Y, Xie L, Peel A, Mao XO, Batteur S, Greenberg DA Directed migration of neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum. Mol Cell Neurosci. 2003 Sep;24(1):171-89. Jin, K., Peel, A. L., Mao, X. O., Xie, L., Cottrell, B. A., Henshall, D. C. & Greenberg, D. A. 2004a Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer‟s disease. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 343–347. Jin, K., Galvan, V., Xie, L., Mao, X. O., Gorostiza, O. F., Bredesen, D. E. & Greenberg, D.
A.
2004b
Enhanced
neurogenesis
in
Alzheimer‟s
disease
transgenic
(PDGFAPPSw, Ind) mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 13 363–13 367. Jin K, Sun Y, Xie L, Mao XO, Childs J, Peel A, Logvinova A, Banwait S, Greenberg DA. Comparison of ischemia-directed migration of neural precursor cells after intrastriatal, intraventricular, or intravenous transplantation in the rat. Neurobiol Dis. 2005 Mar;18(2):366-74. Jin K, Wang X, Xie L, Mao XO, Zhu W, Wang Y, Shen J, Mao Y, Banwait S, Greenberg DA. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci USA 2006 Aug 29;103(35): 13198-202. Johansson CB, Momma S, Clarke LD, Risling M, Frisén J. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell 1999; 96: 25–34 Johansson S, Price J, Modo M. Effect of inflammatory cytokines on major histocompatibility complex expression and differentiation of human neural stem/progenitor cells. Stem Cells. 2008 Sep;26(9):2444-54. Kaidi A, Williams AC, Paraskeva C. Interaction between beta-catenin and HIF-1 promotes cellular adaptation to hypoxia. Nat Cell Biol. 2007 Feb;9(2):210-7. Kaplan MS, Hinds JW. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 1977 Sep 9;197(4308):1092-4. Katoh S, Mitsui Y, Kitani K, Suzuki T. Hyperoxia induces the differentiated neuronal phenotype of PC12 cells by producing reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun. 1997 Dec 18;241(2):347-51. Katoh S, Mitsui Y, Kitani K, Suzuki T. Hyperoxia induces the neuronal differentiated phenotype of PC12 cells via a sustained activity of mitogen-activated protein kinase induced by Bcl-2. Biochem J. 1999 Mar 1;338 ( Pt 2):465-70.
112
Ke Y, Chi L, Xu R, Luo C, Gozal D, Liu R. Early response of endogenous adult neural progenitor cells to acute spinal cord injury in mice. Stem Cells 2006 Apr;24(4):1011-9 Kee N, Teixeira CM, Wang AH, Frankland PW. Preferential incorporation of adultgenerated granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus. Nat Neurosci. 2007 Mar;10(3):355-62. Keith B, Simon MC. Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell. 2007 May 4;129(3):465-72. Review. Kelly S, Bliss TM, Shah AK, Sun GH, Ma M, Foo WC, Masel J, Yenari MA, Weissman IL, Uchida N, Palmer T, Steinberg GK. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proc Natl Acad Sci USA 2004 Aug 10;101(32):11839-44. Kim GW, Sugawara T, Chan PH. Involvement of oxidative stress and caspase-3 in cortical infarction after photothrombotic ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 2000 Dec;20(12):1690-701. Kirn J, O'Loughlin B, Kasparian S, Nottebohm F. Cell death and neuronal recruitment in the high vocal center of adult male canaries are temporally related to changes in song. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Aug 16;91(17):7844-8. Klatzo I, Piraux A, Laskowski EJ. The relationship between edema, blood–brain barrier and tissue elements in a local brain injury. J Neuropathol Exp Neurol 1958; 17: 548– 64. Kohshi K, Yokota A, Konda N, Kinoshita Y, Kajiwara H. Intracranial pressure responses during hyperbaric oxygen therapy. Neurol Med Chir (Tokyo) 1991;31:575– 81. Kopper L, Hajdú M. Tumor stem cells. Pathol Oncol Res. 2004;10(2):69-73. Review. Kordower JH, Winn SR, Liu YT, Mufson EJ, Sladek JR Jr, Hammang JP, Baetge EE, Emerich DF. The aged monkey basal forebrain: rescue and sprouting of axotomized basal forebrain neurons after grafts of encapsulated cells secreting human nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Nov 8;91(23): 10898-902. Korkmaz A, Oter S, Sadir S, Topal T, Uysal B, Ozler M, Ay H, Akin A. Exposure time related oxidative action of hyperbaric oxygen in rat brain. Neurochem Res. 2008 Jan;33(1):160-6.
113
Környei Z, Szlávik V, Szabó B, Gócza E, Czirók A, Madarász E. Humoral and contact interactions in astroglia/stem cell co-cultures in the course of glia-induced neurogenesis. Glia. 2005 Feb;49(3):430-44. Környei Z, Gócza E, Rühl R, Orsolits B, Vörös E, Szabó B, Vágovits B, Madarász E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 2007 Aug;21(10):2496-509. Kromer LF, Cornbrooks CJ. Identification of trophic factors and transplanted cellular environments that promote CNS axonal regeneration. Ann N Y Acad Sci. 1987;495:207-24. Lacorazza HD, Flax JD, Snyder EY, Jendoubi M. Expression of human betahexosaminidase alpha-subunit gene (the gene defect of Tay-Sachs disease) in mouse brains upon engraftment of transduced progenitor cells. Nat Med 1996 Apr;2(4):424-9 Lau WM, Qiu G, Helmeste DM, Lee TM, Tang SW, So KF, Tang SW. Corticosteroid decreases subventricular zone cell proliferation, which could be reversed by paroxetine. Restor Neurol Neurosci. 2007;25(1):17-23. Leng S, He J, Fan W, Cheng S, Long D, He H. Bone mesenchymal stem cells for gene transfer of NGF to the adult rat brain: rescue the NGFR p75 positive neurons from fimbria-fornix lesion-induced degeneration. Neurosci Lett. 2008 Dec 31;448(3):282-7. Epub 2008 Oct 10. Lennington JB, Yang Z, Conover JC. Neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Reprod Biol Endocrinol. 2003 Nov 13;1:99. Review. Levine JM, Reynolds R, Fawcett JW. The oligodendrocyte precursor cell in health and disease. Trends Neurosci. 2001 Jan;24(1):39-47. Review. Li Y, Zhou C, Calvert JW, Colohan AR, Zhang JH. Multiple effects of hyperbaric oxygen on the expression of HIF-1 alpha and apoptotic genes in a global ischemiahypotension rat model. Exp Neurol. 2005a Jan;191(1):198-210. Li XJ, Du ZW, Zarnowska ED, Pankratz M, Hansen LO, Pearce RA, Zhang SC. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2005b Feb;23(2):215-21. Lie DC, Colamarino SA, Song HJ, Désiré L, Mira H, Consiglio A, Lein ES, Jessberger S, Lansford H, Dearie AR, Gage FH. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis. Nature. 2005 Oct 27;437(7063):1370-5.
114
Lim DA, Tramontin AD, Trevejo JM, Herrera DG, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis. Neuron. 2000 Dec;28(3):713-26. Lindvall O, Rehncrona S, Brundin P, Gustavii B, Astedt B, Widner H, Lindholm T, Björklund A, Leenders KL, Rothwell JC, et al. Human fetal dopamine neurons grafted into the striatum in two patients with severe Parkinson's disease. A detailed account of methodology and a 6-month follow-up. Arch Neurol. 1989 Jun;46(6):615-31. Lindvall O, Kokaia Z, Martinez-Serrano A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-how to make it work. Nat Med. 2004 Jul;10 Suppl:S4250. Review. Liu Z, Jiao QF, You C, Che YJ, Su FZ. Effect of hyperbaric oxygen on cytochrome C, Bcl-2 and Bax expression after experimental traumatic brain injury in rats. Chin J Traumatol. 2006a Jun;9(3):168-74. Liu BP, Cafferty WB, Budel SO, Strittmatter SM. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006b Sep 29;361(1473):1593-610. Review. Lobato RD. Historical vignette of Cajal's work "Degeneration and regeneration of the nervous system" with a reflection of the author. Neurocirugia (Astur). 2008 Oct;19(5):456-68. Lu D, Li Y, Wang L, Chen J, Mahmood A, Chopp M. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001 Aug;18(8):813-9. Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, Li Y, Wang L, Sanchez-Ramos J, Chopp M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant. 2002;11(3):275-81. Lu P, Tuszynski MH. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp Neurol. 2008 Feb;209(2):313-20. Review. Lundberg C, Horellou P, Mallet J, Björklund A. Generation of DOPA-producing astrocytes by retroviral transduction of the human tyrosine hydroxylase gene: in vitro characterization and in vivo effects in the rat Parkinson model. Exp Neurol. 1996 May;139(1):39-53.
115
Lykissas MG, Batistatou AK, Charalabopoulos KA, Beris AE. The role of neurotrophins in axonal growth, guidance, and regeneration. Curr Neurovasc Res. 2007 May;4(2):143-51. Review. Ma DK, Ming GL, Song H. Glial influences on neural stem cell development: cellular niches for adult neurogenesis. Curr Opin Neurobiol. 2005 Oct;15(5):514-20. Review. Macklis JD. Transplanted neocortical neurons migrate selectively into regions of neuronal degeneration produced by chromophore-targeted laser photolysis. J Neurosci. 1993 Sep;13(9):3848-63. Magavi SS, Leavitt BR, Macklis JD. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 2000 Jun 22;405(6789):951-5. Mahmood A, Lu D, Chopp M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2004 Jan;21(1):33-9. Mao L, Lau YS, Petroske E, Wang JQ. Profound astrogenesis in the striatum of adult mice following nigrostriatal dopaminergic lesion by repeated MPTP administration. Brain Res Dev Brain Res. 2001 Nov 26;131(1-2):57-65. Martin GR, Evans MJ. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1975 Apr;72(4):1441-5. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981 Dec;78(12):7634-8. Martínez-Serrano A, Lundberg C, Horellou P, Fischer W, Bentlage C, Campbell K, McKay RD, Mallet J, Björklund A. CNS-derived neural progenitor cells for gene transfer of nerve growth factor to the adult rat brain: complete rescue of axotomized cholinergic neurons after transplantation into the septum. J Neurosci. 1995 Aug;15(8):5668-80. Martínez-Serrano A, Björklund A. Immortalized neural progenitor cells for CNS gene transfer and repair. Trends Neurosci. 1997 Nov;20(11):530-8. Review. Matchett GA, Martin RD, Zhang JH. Hyperbaric oxygen therapy and cerebral ischemia: neuroprotective mechanisms. Neurol Res. 2009 Mar;31(2):114-21. Review.
116
Merkle FT, Tramontin AD, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Radial glia give rise to adult neural stem cells in the subventricular zone. Proc Natl Acad Sci USA 2004 Dec 14;101(50):17528-32. Metz GA, Schwab ME. Behavioral characterization in a comprehensive mouse test battery reveals motor and sensory impairments in growth-associated protein-43 null mutant mice. Neuroscience. 2004;129(3):563-74. Mezey E, Key S, Vogelsang G, Szalayova I, Lange GD, Crain B. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 4;100(3):1364-9. Modo M, Stroemer RP, Tang E, Patel S, Hodges H. Effects of implantation site of stem cell grafts on behavioral recovery from stroke damage. Stroke. 2002 Sep;33(9):2270-8 Monje ML, Toda H, Palmer TD. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 2003 Dec 5;302(5651):1760-5. Morrison SJ, Csete M, Groves AK, Melega W, Wold B, Anderson DJ. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7370-6. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55–63. Mueller BK, Yamashita T, Schaffar G, Mueller R. The role of repulsive guidance molecules in the embryonic and adult vertebrate central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006 Sep 29;361(1473):1513-29. Review. Murakami K, Kondo T, Yang G, Chen SF, Morita-Fujimura Y, Chan PH. Cold injury in mice: a model to study mechanisms of brain edema and neuronal apoptosis. Prog Neurobiol 1999; 57: 289–99. Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S, Yamamoto S, Hatano O, Kawahara N, Tamura A, Kirino T, Nakafuku M. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell. 2002 Aug 23;110(4):429-41. Namiki J, Kojima A, Tator CH. Effect of brain-derived neurotrophic factor, nerve growth factor, and neurotrophin-3 on functional recovery and regeneration after spinal cord injury in adult rats. J Neurotrauma. 2000 Dec;17(12):1219-31.
117
Niklas A, Brock D, Schober R, Schulz A, Schneider D. Continuous measurements of cerebral tissue oxygen pressure during hyperbaric oxygenation--HBO effects on brain edema and necrosis after severe brain trauma in rabbits. J Neurol Sci. 2004 Apr 15;219(1-2):77-82. Palmer TD, Ray J, Gage FH. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 1995 Oct;6(5):474-86. Palmer TD, Markakis EA, Willhoite AR, Safar F, Gage FH. Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS. J Neurosci. 1999 Oct 1;19(19):8487-97. Parent JM, Yu TW, Leibowitz RT, Geschwind DH, Sloviter, RS, Lowenstein DH. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J. Neurosci. 1997, 17, 3727– 3738. Parent JM, Valentin, VV, Lowenstein DH. Prolonged seizures increase proliferating neuroblasts in the adult rat subventricular zone-olfactory bulb pathway. J. Neurosci. 2002, 22, 3174–3188. Pastores
GM.
Laronidase
(Aldurazyme):
enzyme
replacement
therapy
for
mucopolysaccharidosis type I. Expert Opin Biol Ther. 2008 Jul;8(7):1003-9. Review. Perlow MJ, Freed WJ, Hoffer BJ, Seiger A, Olson L, Wyatt RJ. Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system. Science. 1979 May 11;204(4393):643-7. Petreanu L, Alvarez-Buylla A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 2002 Jul 15;22(14):6106-13. Preston SL, Alison MR, Forbes SJ, Direkze NC, Poulsom R, Wright NA. The new stem cell biology: something for everyone. Mol Pathol. 2003 Apr;56(2):86-96. Review. Picard-Riera N, Decker L, Delarasse C, Goude K, Nait-Oumesmar B, Liblau R, PhamDinh D, Evercooren AB. Experimental autoimmune encephalomyelitis mobilizes neural progenitors from the subventricular zone to undergo oligodendrogenesis in adult mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002 Oct 1;99(20):13211-6.
118
Pistollato F, Chen HL, Schwartz PH, Basso G, Panchision DM. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 2007 Jul;35(3):424-35. Plesnila N, Friedrich D, Eriskat J, Baethmann A, Stoffel M. Relative cerebral blood flow during the secondary expansion of a cortical lesion in rats. Neurosci Lett. 2003 Jul 17;345(2):85-8. Pluchino S, Quattrini A, Brambilla E, Gritti A, Salani G, Dina G, Galli R, Del Carro U, Amadio S, Bergami A, Furlan R, Comi G, Vescovi AL, Martino G. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 2003 Apr 17;422(6933):688-94. Pluchino S, Furlan R, Martino G. Cell-based remyelinating therapies in multiple sclerosis: evidence from experimental studies. Curr Opin Neurol. 2004 Jun;17(3):24755. Review. Ponten J, Macintyre EH. 1968. Long term culture of normal and neoplastic human glia. Acta Pathol Microbiol Scand. 74(4):465-86. Ponti G, Peretto P, Bonfanti L. Genesis of neuronal and glial progenitors in the cerebellar cortex of peripuberal and adult rabbits. PLoS ONE. 2008 Jun 4;3(6):e2366. Qu R, Li Y, Gao Q, Shen L, Zhang J, Liu Z, Chen X, Chopp M. Neurotrophic and growth factor gene expression profiling of mouse bone marrow stromal cells induced by ischemic brain extracts. Neuropathology. 2007 Aug;27(4):355-63. Qu C, Mahmood A, Lu D, Goussev A, Xiong Y, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in mice with marrow stromal cells. Brain Res. 2008 May 7;1208:234-9. Rakic P.Guidance of neurons migrating to the fetal monkey neocortex. Brain Res. 1971 Oct 29;33(2):471-6. Rice AC, Khaldi A, Harvey HB, Salman NJ, White F, Fillmore H, Bullock MR. Proliferation and neuronal differentiation of mitotically active cells following traumatic brain injury. Exp Neurol. 2003 Oct;183(2):406-17. Riess P, Molcanyi M, Bentz K, Maegele M, Simanski C, Carlitscheck C, Schneider A, Hescheler J, Bouillon B, Schäfer U, Neugebauer E. Embryonic stem cell transplantation after experimental traumatic brain injury dramatically improves neurological outcome, but may cause tumors. J Neurotrauma 2007Jan;24(1):216-25.
119
Rietze RL, Valcanis H, Brooker GF, Thomas T, Voss AK, Bartlett PF. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 2001 Aug 16;412(6848):736-9. Riquelme PA, Drapeau E, Doetsch F. Brain micro-ecologies: neural stem cell niches in the adult mammalian brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008 Jan 12;363(1489):123-37. Review. Robertson, Elizabeth J. Embryo-Derived Stem Cell Lines in Teratocarcinomas And Embryonic Stem Cells a Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1987, 108-112. Rossignol S, Schwab M, Schwartz M, Fehlings MG. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 2007 Oct 31;27(44):11782-92. Review. Rothfuss A, Dennog C, Speit G. Adaptive protection against the induction of oxidative DNA
damage
after
hyperbaric
oxygen
treatment.
Carcinogenesis.
1998
Nov;19(11):1913-7. Rothfuss A, Stahl W, Radermacher P, Speit G. Evaluation of mutagenic effects of hyperbaric oxygen (HBO) in vitro. Environ Mol Mutagen. 1999;34(4):291-6. Rousselot P, Lois C, Alvarez-Buylla A. Embryonic (PSA) N-CAM reveals chains of migrating neuroblasts between the lateral ventricle and the olfactory bulb of adult mice. J Comp Neurol. 1995 Jan 2;351(1):51-61. Roy NS, Benraiss A, Wang S, Fraser RA, Goodman R, Couldwell WT, Nedergaard M, Kawaguchi A, Okano H, Goldman SA. Promoter-targeted selection and isolation of neural progenitor cells from the adult human ventricular zone. J Neurosci Res. 2000 Feb 1;59(3):321-31. Roy NS, Nakano T, Keyoung HM, Windrem M, Rashbaum WK, Alonso ML, Kang J, Peng W, Carpenter MK, Lin J, Nedergaard M, Goldman SA. Telomerase immortalization of neuronally restricted progenitor cells derived from the human fetal spinal cord. Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):297-305. Samadikuchaksaraei A. An overview of tissue engineering approaches for management of spinal cord injuries. J Neuroeng Rehabil. 2007 May 14;4:15. Review. Sawamoto K, Yamamoto A, Kawaguchi A, Yamaguchi M, Mori K, Goldman SA, Okano H. Direct isolation of committed neuronal progenitor cells from transgenic mice coexpressing spectrally distinct fluorescent proteins regulated by stage-specific neural promoters. J Neurosci Res. 2001 Aug 1;65(3):220-7.
120
Schäbitz WR, Schade H, Heiland S, Kollmar R, Bardutzky J, Henninger N, Müller H, Carl U, Toyokuni S, Sommer C, Schwab S. Neuroprotection by hyperbaric oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI. Stroke. 2004 May;35(5):1175-9. Schlett K, Herberth B, Madarász E. In vitro pattern formation during neurogenesis in neuroectodermal progenitor cells immortalized by p53-deficiency. Int J Dev Neurosci. 1997 Oct;15(6):795-804. Schlett K, Madarász E. Retinoic acid induced neural differentiation in a neuroectodermal cell line immortalized by p53 deficiency. J Neurosci Res. 1997 Feb 15;47(4):405-15. Schmidt W, Reymann KG. Proliferating cells differentiate into neurons in the hippocampal CA1 region of gerbils after global cerebral ischemia. Neurosci Lett. 2002 Dec 16;334(3):153-6. Sen CK, Khanna S, Roy S. Perceived hyperoxia: oxygen-induced remodeling of the reoxygenated heart. Cardiovasc Res. 2006 Jul 15;71(2):280-8. Seri B, Garcia-Verdugo JM, McEwen SB, Alvarez-Buylla A. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci 2001; 21: 7153–60 Sharp FR, Liu J, Bernabeu R. Neurogenesis following brain ischemia. Brain Res Dev Brain Res. 2002 Mar 31;134(1-2):23-30. Review. Sheen VL, Macklis JD. Targeted neocortical cell death in adult mice guides migration and differentiation of transplanted embryonic neurons. J Neurosci. 1995 Dec;15(12):8378-92. Shihabuddin LS, Ray J, Gage FH. FGF-2 is sufficient to isolate progenitors found in the adult mammalian spinal cord. Exp Neurol. 1997 Dec;148(2):577-86. Shin JJ, Fricker-Gates RA, Perez FA, Leavitt BR, Zurakowski D, Macklis JD. Transplanted neuroblasts differentiate appropriately into projection neurons with correct neurotransmitter and receptor phenotype in neocortex undergoing targeted projection neuron degeneration. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7404-16. Simon MC, Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Apr;9(4):285-96. Review.
121
Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 2003 Sep 15;63(18):5821-8. Skaper SD. Neuronal growth-promoting and inhibitory cues in neuroprotection and neuroregeneration. Ann N Y Acad Sci. 2005 Aug;1053:376-85. Review. Snyder EY, Taylor RM, Wolfe JH. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 1995 Mar 23;374(6520):367-70. Snyder EY, Yoon C, Flax JD, Macklis JD. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci USA 1997 Oct 14;94(21):11663-8. Speit G, Dennog C, Eichhorn U, Rothfuss A, Kaina B. Induction of heme oxygenase-1 and adaptive protection against the induction of DNA damage after hyperbaric oxygen treatment. Carcinogenesis. 2000 Oct;21(10):1795-9. Speit G, Dennog C, Radermacher P, Rothfuss A. Genotoxicity of hyperbaric oxygen. Mutat Res. 2002 Dec;512(2-3):111-9. Review. Steinbach JP, Weissenberger J, Aguzzi A. Distinct phases of cryogenic tissue damage in the cerebral cortex of wild-type and c-fos deficient mice. Neuropathol Appl Neurobiol. 1999 Dec;25(6):468-80. Steinberg MS. Reconstruction of tissues by dissociated cells. Some morphogenetic tissue movements and the sorting out of embryonic cells may have a common explanation. Science. 1963, 141:401-8. Studer L, Csete M, Lee SH, Kabbani N, Walikonis J, Wold B, McKay R. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7377-83. Suhonen JO, Peterson DA, Ray J, Gage FH. Differentiation of adult hippocampusderived
progenitors
into
olfactory
neurons
in
vivo.
Nature.
1996
Oct
17;383(6601):624-7. Sun D, McGinn MJ, Zhou Z, Harvey HB, Bullock MR, Colello RJ. Anatomical integration of newly generated dentate granule neurons following traumatic brain
122
injury in adult rats and its association to cognitive recovery. Exp Neurol. 2007 Mar;204(1):264-72. Suzuki M, McHugh J, Tork C, Shelley B, Klein SM, Aebischer P, Svendsen CN. GDNF secreting human neural progenitor cells protect dying motor neurons, but not their projection to muscle, in a rat model of familial ALS. PLoS ONE. 2007 Aug 1;2(1):e689. Suzuki M, McHugh J, Tork C, Shelley B, Hayes A, Bellantuono I, Aebischer P, Svendsen CN. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 2008 Dec;16(12):2002-10. Szatmári T, Lumniczky K, Desaknai S, Trajcevski S, Hidvegi EJ, Hamada H, Safrany G. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Sci. 2006, 97(6):546-53. Szente M, Toldi J. A gerinces idegrendszer ontogenezise és plaszticitása Dialóg Campus, 1999. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76. Tan XW, Liao H, Sun L, Okabe M, Xiao ZC, Dawe GS. Fetal microchimerism in the maternal mouse brain: a novel population of fetal progenitor or stem cells able to cross the blood-brain barrier? Stem Cells. 2005 Nov-Dec;23(10):1443-52. Tashiro A, Makino H, Gage FH. Experience-specific functional modification of the dentate gyrus through adult neurogenesis: a critical period during an immature stage. J Neurosci. 2007 Mar 21;27(12):3252-9. Tate MC, Shear DA, Hoffman SW, Stein DG, Archer DR, LaPlaca MC. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 2002;11(3):283-95. Tárnok K, Pataki A, Kovács J, Schlett K, Madarász E. Stage-dependent effects of cellto-cell connections on in vitro induced neurogenesis. Eur J Cell Biol. 2002 Jul;81(7):403-12. Toni N, Laplagne DA, Zhao C, Lombardi G, Ribak CE, Gage FH, Schinder AF. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nat Neurosci. 2008 Aug;11(8):901-7.
123
Tropepe V, Coles BL, Chiasson BJ, Horsford DJ, Elia AJ, McInnes RR, van der Kooy D. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 2000 Mar 17;287(5460):2032-6. Uchida N, Buck DW, He D, Reitsma MJ, Masek M, Phan TV, Tsukamoto AS, Gage FH, Weissman IL. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Dec 19;97(26):14720-5. Uno K, Merges CA, Grebe R, Lutty GA, Prow TW. Hyperoxia inhibits several critical aspects of vascular development. Dev Dyn. 2007 Apr;236(4):981-90. Urrea C, Castellanos DA, Sagen J, Tsoulfas P, Bramlett HM, Dietrich WD. Widespread cellular proliferation and focal neurogenesis after traumatic brain injury in the rat. Restor Neurol Neurosci. 2007;25(1):65-76. Xu F, Zhu JH. Stem cells tropism for malignant gliomas. Neurosci Bull. 2007 Nov;23(6):363-9. Review. Yamashita T, Ninomiya M, Hernandez Acosta P, Garcia-Verdugo JM, Sunabori T, Sakaguchi M, Adachi K, Kojima T, Hirota Y, Kawase T, Araki N, Abe K, Okano H, Sawamoto K. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci 2006, 26:6627– 6636. Varga BV, Hádinger N, Gócza E, Dulberg V, Demeter K, Madarász E, Herberth B. Generation of diverse neuronal subtypes in cloned populations of stem-like cells. BMC Dev Biol. 2008 Sep 22;8:89. Vassilopoulos G, Russell DW. Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity and its therapeutic implications. Curr Opin Genet Dev. 2003 Oct;13(5):480-5. Review. Veltkamp R, Warner DS, Domoki F, Brinkhous AD, Toole JF, Busija DW. Hyperbaric oxygen decreases infarct size and behavioral deficit after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 2000 Jan 17;853(1):68-73. Veltkamp R, Siebing DA, Sun L, Heiland S, Bieber K, Marti HH, Nagel S, Schwab S, Schwaninger M. Hyperbaric oxygen reduces blood-brain barrier damage and edema after transient focal cerebral ischemia. Stroke. 2005 Aug;36(8):1679-83. Vesely I. Heart valve tissue engineering. Circ Res. 2005 Oct 14;97(8):743-55. Review. Vlodavsky E, Palzur E, Soustiel JF. Hyperbaric oxygen therapy reduces neuroinflammation and expression of matrix metalloproteinase-9 in the rat model of traumatic brain injury. Neuropathol Appl Neurobiol. 2006 Feb;32(1):40-50.
124
Weinzierl MR, Laurer HL, Fuchs M, Wolf-Ingo S, Mautes AE. Changes in regional energy metabolism after cortical cold lesion in the rat brain. J Mol Neurosci. 2002 Jun;18(3):247-50. Weiss S, Dunne C, Hewson J, Wohl C, Wheatley M, Peterson AC, Reynolds BA. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 1996 Dec 1;16(23):7599-609. Windrem MS, Nunes MC, Rashbaum WK, Schwartz TH, Goodman RA, McKhann G 2nd, Roy NS, Goldman SA. Fetal and adult human oligodendrocyte progenitor cell isolates myelinate the congenitally dysmyelinated brain. Nat Med 2004 Jan;10(1):93-7 Wobus AM, Guan K, Yang HT, Boheler KR. Embryonic stem cells as a model to study cardiac, skeletal muscle, and vascular smooth muscle cell differentiation. Methods Mol Biol. 2002, 185:127-56. Zádori A, Ágoston VA, Demeter K, Hádinger N, Várady L, Gőbl A, Nagy Z, Madarász E. Effects of oxygen tension on the survival and differentiation of neural stem cells. 2010, kézirat benyújtva. Zhang CP, Zhu LL, Zhao T, Zhao H, Huang X, Ma X, Wang H, Fan M. Characteristics of neural stem cells expanded in lowered oxygen and the potential role of hypoxiainducible factor-1Alpha. Neurosignals. 2006-2007;15(5):259-65. Zhao M, Momma S, Delfani K, Carlen M, Cassidy RM, Johansson CB, Brismar H, Shupliakov O, Frisen J, Janson AM. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Jun24;100(13):7925-30. Zhuang J, Schmoker JD, Shackford SR, Pietropaoli JA. Focal brain injury results in severe cerebral ischemia despite maintenance of cerebral perfusion pressure. J Trauma. 1992 Jul;33(1):83-8. Ziu M, Schmidt NO, Cargioli TG, Aboody KS, Black PM, Carroll RS. Gliomaproduced extracellular matrix influences brain tumor tropism of human neural stem cells. J Neurooncol. 2006 Sep;79(2):125-33.
125
Saját publikációk jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló publikációk: Zádori A, Ágoston VA, Demeter K, Hádinger N, Várady L, Gőbl A, Nagy Z, Madarász E. Survival and differentiation of neural stem cells at different oxygen supply. 2010, kézirat benyújtva. Zádori A - Ágoston VA, Demeter K, Nagy Z, Madarász E. Different behaviour of implanted stem cells in intact and lesioned forebrain cortices. Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22. IF: 2.86. Kettős első szerzős cikk. Demeter K, Zádori A, Ágoston VA, Madarász E. Studies on the use of NE-4C embryonic neuroectodermal stem cells for targeting brain tumour. Neurosci Res. 2005 53(3):331-42. IF: 2,184. Eltérő témájú publikációk: Vigh B, Manzano MJ, Zádori A, Frank CL, Lukáts A, Röhlich P, Szél A, Dávid C. Nonvisual photoreceptors of the deep brain, pineal organs and retina. Histol Histopathol. 2002 Apr;17(2):555-90. Review. Fejér Z, Röhlich P, Szél A, Dávid C, Zádori A, Manzano MJ, Vígh B. Comparative ultrastructure and cytochemistry of the avian pineal organ. Microsc Res Tech. 2001 Apr 1;53(1):12-24. Review.
126
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom a dolgozat megszületéséért mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Madarász Emíliának, aki bevezetett az idegi sejtbiológia világába, mindvégig rendkívüli türelemmel és megértéssel segítette munkámat, és nemcsak szakmai inspirációt adott, de emberi példát is mutatott. Köszönettel tartozom kutatótársamnak és mentoromnak, dr. Demeter Kornélnak, aki leglelkesebb oktatóm volt a laboratóriumi munkában, és dr. Ágoston Viktornak, állandó munkatársamnak, akivel együttműködésünk építő és örömteli volt. Köszönöm a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet vezetőjének, Prof. Freund Tamásnak, hogy lehetővé tette, hogy kutatásaimat ebben a nagyhírű intézetben végezhessem, és az Idegi Sejt- és Fejlődésbiológiai Labor összes munkatársának, hogy rengeteg szakmai segítséget nyújtottak és, hogy vidám perceket tölthettem velük. Köszönöm az egykori Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet vezetőjének, Prof. Nagy Zoltánnak munkánkban nyújtott elméleti és gyakorlati segítségét, és a Sejtbiológiai Labor munkatársainak közreműködését kísérleteinkben. Köszönöm Dr. Gőbl Annának és a Baromedical Zrt. munkatársainak munkánkban nyújtott segítségét. Köszönöm Vígh Béla Professzor Úrnak, hogy érdeklődésemet felkeltette a sejtbiológia és az idegtudományok iránt. Végül, de nem utolsósorban, köszönöm férjemnek, Gergőnek bátorítását és támogatását, sógornőmnek, Gabinak együttérző biztatását és Szüleimnek a mindig megértő és támogató családi hátteret.
127
