A HIDROGÉN PEROXID SZEREPE A MIKROEREK TÓNUSÁNAK LOKÁLIS SZABÁLYOZÁSÁBAN
(ROLE OF HYDROGEN PEROXIDE IN THE LOCAL REGULATION OF MICROVASCULAR TONE) Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Dr. Cseko Csongor
Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet
Témavezeto: Prof. Dr. Koller Ákos
Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Budapest, 2005
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK A kardiovaszkuláris betegségek világszerte a morbiditási és mortalitási statisztikák vezetoi. Sok, a szív - és érrendszert érinto betegség mint pl. a magasvérnyomás betegség, cukorbetegség, hiperhomociszteinémia, szöveti sérülés, gyulladás és ischémia-reperfúzió - a hidrogén peroxid (H2 O2 ) fokozott képzodésével jár. A megnövekedett H2 O2 szint a vaszkuláris szövetben (endothélium-, simaizomsejt) különbözo jelátvivo mechanizmusokat aktiválhat, amely az erek funkcionális és morfológiai változását eredményezheti. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a H2 O2 fajtól, értípustól és kísérleti protokolltól függoen a nagyerek kontrakcióját, vagy relaxációját okozza. Ezek az eltéro eredmények abból a ténybol adódhatnak, hogy az említett kísérletekben különbözo ereket, eltéro körülmények és H2 O2 koncentrációk között vizsgáltak, illetve az erek tónusát különbözo hatásmechanizmusú vazoaktív szerekkel - mint pl. epinefrin, tromboxán analógok, kálium klorid - indukálták, melyek mindegyike a H2 O2 által aktivált
celluláris
mechanizmusokkal
interferálhat.
Emberi
koszorúserekben az exogén és endogén képzodött H2O2
eltéro
mechanizmuson
felvetve
annak
függoen
eltéro
lehetoségét ,
keresztül
hogy
a
okozott
H2 O2
a
vasodilat ációt, hatás
helyétol
átmérováltozásokat okozhat. A H2 O2 vazomotor hatásának ezen aspektusa fontos lehet gyulladás esetén: azaz, amikor a H2O2 forrása lehet egyrészt intraluminális az aktivált leukociták hatására, másrészt extraluminális a makrofágok, illetve maguk az erek szövetei révén. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a H2 O2 a simaizomsejteket hiperpolarizálja és a nagyerek
1
relaxációját, illetve az arteriolák dilatációját nem NO, nem prostaglandin mediálta, endotheliális eredetu hiperpolarizáló faktor (EDHF)-függo módon hozza létre. Egy H2 O2 mediálta dilatátor mechanizmus fontos szerepet játszhat a szöveti keringés szabályozásában akkor, amikor a NO szintje csökkent, azonban bizonyos esetekben az erek patoló giás elváltozásához is vezethet. Néhány kísérletben az intraluminális nyomás változása és a H2 O2 koncentrációja között kapcsolatot találták. A H2 O2 magasvérnyomás betegségben fokozott konstrikciót okoz, melyet a K+-csatornák eltéro aktivációja hozhat létre. A legújabb eredmények szerint a H2 O2 mediálja az izolált
arteriolák
nyomás-indukálta miogén konstrikcióját. Ennek
megfeleloen a H2 O2 menövekedett szintje fokozott arterioláris tónushoz, s ezáltal csökkent mikrovaszkuláris perfúzióhoz vezethet. Érdekes módon azt találták, hogy a kataláz emberi pitvari koszorúserekben gátolja az áramlás-indukálta dilatációt, illetve, hogy a nyíróero hatására az endothélsejtek H2 O2-ot ürítenek az extracelluláris térbe. Mivel a szöveti keringést elsodlegesen az arteriolák határozzák meg a teljes perifériás ellenállás (TPR) nagy részét létrehozva, a H2O2 lokális keringésszabályozásban betöltött szerepének tanulmányozása hozzásegíthet bennünket ahhoz, hogy a H2 O2 fiziológiás és patológiás körülmények mint pl. atheroszklerózis, diabétesz mellitusz, magasvérnyomás és hiperhomociszteinémia - között játszott szerepét jobban megért sük. Patkányból izolált vázizom arteriolák vizsgálata során ezért a következoket tuztük ki célul:
2
1.
megvizsgáljuk az izolált vázizom arteriolákban az exogén (intra-, extraluminális)
H2O2-indukálta
spontán
tónusbeli
változások
hátterében álló celluláris mechanizmusokat, 2.
kimutatjuk, hogy az extralumin álisan adott kataláz hat az intralumin álisan bejuttatott H2 O2 eloidézte átmérováltozásokra,
3.
megvizsgáljuk a kataláz hatását az arteriolák miogén válaszára,
4.
megvizsgáljuk a kataláz hatását az arteriolák áramlás-indukálta dilatációjára
3
2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az arteriolák izolációja és a videómikrosz-kópos technika Kísérleteinket hím Wistar patkányok (250-350 g) izolált gracilis vázizom arterioláin (aktív belso átméro: 140±4 ? m, passzív belso átméro 230±4 ? m, 80 Hgmm-es intraluminális nyomáson) végeztük. Az arteriolák belso átmérojét videómikroszkóphoz kapcsolt mikroangiométerrel mértük, s a változásokat papír kiíron, illetve Powerlab analóg-digitális konverter segítségével számítógépen rögzítettük. Extraluminálisan adott H2O 2 hatása az átmérore A H2 O2 növekvo koncentráció it (10-6 -2x10 -4 M) juttattuk a szervfürdoben lévo fiziológiás sóoldatba. A H2 O2 minden dózisa után fiziológiás sóoldattal mostuk ki a szervfürdot és a következo dózist csak azt követoen adtuk, hogy a nyugalmi, kontroll átméro újra kialakult. Kísérleteink
következo
csoportjában
az
arteriolákat
különbözo
intracelluláris gátlószerekkel - mint pl. indomethacin, SQ 29,548, LNAME, clotrimazole, vagy sulfaphenazole -
inkubáltuk és újra
megvizsgáltuk a H2 O2 -indukálta válaszokat. A H2O2 átmérore való hatásait endothélium hiányában is megfigyeltük , amit az arteriola levegovel történo, ~ 1 percig tartó, alacsony nyomású perfundálásával távolítottunk el. Ezt követoen endothélium hiányában az arteriolákat különbözo káliumcsatorna gátlókkal - mint pl. charybdotoxin plusz apamin, glybenclamide, vagy tetrabutyl-ammonium (TBA) – inkubáltuk, majd újra megvizsgáltuk a H2 O2 -indukálta válaszokat. Intraluminálisan adott H 2O 2 hatása az átmérore A H2 O2 intraluminális bejuttatása végett konstant intraluminális
4
nyomáson (80 Hgmm), a nyomás állandóan tartása érdekében a ki- és bemeno kanülök azonos mértéku, de ellentétes irányú változtatásával intraluminális áramlást hoztunk létre. A H2 O2 növekvo koncentrációit (10-6 -10 -4 M) juttattuk be intraluminálisan, majd minden dózist követoen fiziológiás sóoldattal mostuk át a lument és a következo dózist csak azt követoen adtuk, hogy a nyugalmi, kontroll átméro újra kialakult. Extraluminális kataláz hatása az intraluminálisan adott H2O 2indukálta átmérováltozásokra Az extraluminálisan adott kataláz intra- és intercelluláris térben való hatékonyságának kontrollálása végett a kataláz különbözo dózisait és típusait használtuk. A kataláz ezen típusainak extraluminális adását követoen újra megvizsgáltuk az intraluminálisan bejuttatott H2 O2 patkány vázizom arteriolán indukált válaszait . A kataláz hatása a nyomás-indukálta átmérováltozásokra Áramlás hiányában megvizsgáltuk az arteriolák intraluminális nyomás-változás hatására kialakuló válaszait. A kataláz különbözo típusainak és dózisainak jelenlétében újra detektáltuk a nyomás-indukálta arterioláris válaszokat. A nyomás-indukálta passzív átméro (PD) görbe regisztrálásának érdekében az arteriolákat Ca2+-mentes, 10–5 M nifedipint és 10–4 M nátrium nitroprusszidot (SNP) tartalmazó fiziológiás sóoldatban inkubáltuk. A kataláz hatása az áramlás/fali nyíróero (WSS) - indukálta átmérováltozásokra Az intraluminális áramlást a fent leírt módon hoztuk létre (ld: a H2 O2 intraluminális adása). A kataláz különbözo típusainak és dózisainak jelenlétében az áramlás-indukálta válaszokat újra rögzítettük.
5
3. EREDMÉNYEK Az extraluminálisan adott H2O 2 okozta bifázisos átmérováltozások Az extraluminálisan adott H2 O2 növekvo koncentrációi a gracilis arteriolák bifázisos átmérováltozását okozták. A H2 O2 alacsonyabb koncentrációi (10-6 M – 3x10 -5 M) csak konstrikciót, míg a magasabbak (6x10 -5 M – 2x10-4 M) a kezdeti konstrikciót követoen jelentos dilatációt okoztak. A H2 O2 alacsonyabb koncentrációi növelik az arteriolák tónusát: Az endothélium eltávolítása szignifikánsan csökkentette a H2O2 hatására kialakuló
konstrikciót,
míg
az
endothélium-intakt
arteriolák
indomethacinnal, vagy SQ29548-cal történo inkubálása teljesen meggátolta a H2 O2 -indukálta konstrikciót. A H2O2 magasabb koncentrációi csökkentik az arteriolák tónusát: Az indomethacin , vagy az
SQ29548 jelenlétében a H2 O2
nagyobb
koncentrációi csak dilatációt okoztak. Endothélium-intakt arteriolákban sem a clotrimazole, sem a sulfaphenazole nem volt hatással a H2O2indukálta dilatációra, míg az L-NAME szignifikásan csökkentette azt . Az endothélium eltávolítása szignifikánsan csökkentette a H2 O2-indukálta arterioláris dilatációt. Az endothélium -fosztott arteriolákban a clotrimazole nem volt hatással a H2O2-indukálta válaszokra. A charybdotoxin és apamin szimultán adása, melyek a KCa-csatorna inhibitorai, szignifikánsan csökkentették a H2 O2
okozta dilatációt. A
KATP-csatorna
gátló
glibenclamide adása is szignifikánsan csökkentette a H2 O2-indukálta dilatációt,
míg a TBA
jelenléte csökkentette az alaptónust és
szignifikánsan, jelentos mértékben gátolta a H2O2-indukálta dilatációt.
6
Az intraluminálisan adott H 2O 2 okozta bifázisos átmérováltozások Az áramlás növekedése dilatációt okozott. Ezt követoen, amikor a perfuzátumban oldott H2 O2 elérte az intraluminális teret, bifázisos átmérováltozást okozott. A H2 O2 alacsonyabb koncentrációi (10 -6 M – 10 -5 M) csak konstrikciót okoztak, míg a H2 O2 nagyobb koncentrációi (10-4 M), a kezdeti konstrikciót követoen az arteriolák dilatációját eredményezték.
A kataláz hatása a gracilis arteriolák myogén válaszára Kontroll körülmények között az intraluminális nyomás emelése az arteriolák konstrikcióját okozták. A különbözo típusú és dózisú katalázok extraluminális adása (500 U/ml por, 1500 U/ml oldat, 250 U/ml PEGkataláz) egyaránt meggátolta az intraluminálisan adott H2O2 kiváltotta konstrikciót és dilatációt. A katalázok jelenlétében sem a miogén konstrikció, sem a miogén index görbe meredeksége nem változott.
A kataláz hatása a gracilis arteriolák áramlás-indukálta válaszára Kontroll arteriolákban az áramlás növekedése dilatációt okozott. A katalázok különbözo típusainak és dózisainak jelenléte (ld. fent: miogén válasz) nem okozott változást sem az áramlás-átméro görbében, sem az áramlás-, vagy a nyíróero-indukálta átmérováltozás görbe meredekségében.
7
4. MEGBESZÉLÉS Kísérleteink igazolták eloször, hogy 1. a H2 O2 koncentráció függoen és bifázisos módon modulálja az izolált vázizom arteriolák spontán tónusát. Az arteriolák tónusa növekszik a H2 O2 alacsonyabb koncentrációinak (10 -6 M - 3x10-5 M) hatására, elsodlegesen
az
endotheliális
és
simaizom
eredetu
PGH2 /TxA2
felszabadulásának következtében, míg csökken a H2 O2 magasabb koncentrációi hatására (6x10 -5 M - 2x10 -4 M), az endotheliális NO és a simaizom különbözo K+-csatornáinak, mint pl. a KATP- és KCa-csatornák hatására, 2. az extraluminálisan adott kataláz gátolja az intraluminálisan bejuttatott
H2 O2
okozta
átmérováltozásokat
az
izolált
vázizom
arteriolákban, 3. az intraluminális nyomás-növekedés kiváltotta miogén választ nem befolyásolja a kataláz, 4. az intraluminális áramlás-növekedés eloidézte dilatációt nem befolyásolja a kataláz. 1. A jelen kísérletek eredményei szerint a H2 O2 mindössze mikromoláris koncentrációi PGH2 /TxA2 -t szabadítanak fel az arteriolákból, mely a H2 O2 potenciálisan fontos élettani szerepét feltételezi a vázizom lokális véráramlásának szabályozásában. Eredményeink mások megfigyeléseivel összhangban állnak, ugyanis mások azt találták, hogy a H2O2 egér farok arteriában miogén konstrikció kifejlodéséhez vezet. Azt is kimutatták, hogy egyszeri hirtelen nyomásnövekedés, vagy krónikus magasvérnyomás megnöveli a H2 O2
8
termelést, amely fokozza a PGH2 /TxA2 képzodését a spontán tónus növekedéséhez vezetve. Az még nem teljesen világos, hogyan stimulálja a H2 O2 az endothélium fokozott konstriktor prosztaglandin szintézisét. Kimutatták, hogy a H2O2 gyorsan aktiválja a ciklooxigenáz enzimet, mely különbözo prosztaglandinok, köztük a TxA 2 szintézisét eredményezi. Érdekes, hogy a kezdeti konstrikciót követoen a H2 O2 a vázizom arteriolák maximális átmérojét megközelíto, dózisfüggo dilatációt okoz. Azt találtuk, hogy a H2O2 egy eddig ismeretlen mechanizmuson keresztül aktiválja az endotheliális NO szintázt , amely a vázizom arteriolák NOmediálta dilatáció ját idézi elo. Ezen eredményeink korábbi, aorta és bazális arteriola gyurubol származó megfigyeléseket támasztanak alá, ahol a H2O2indukálta dilatációt részben az NO mediálta. A dilatáció másik részét a simaizomsejtek hiperpolarizációja okozta. Azt találták, hogy patkány aortában a H2 O2 relaxációt okozó hatását a CYP450 enzim aktivációja mediálja. Ezzel ellentétben, vizsgálatainkban azt figyeltük meg, hogy akár endothélium jelenlétében, akár hiányában a CYP450 enzim clotrimazolelal, vagy sulfaphenazole-lal történo gátlása nem volt hatással a H2O2indukálta dilatációra, mutatva, hogy a H2 O2 nem a CYP450 aktiválásán keresztül hiperpolarizálja a vázizom arteriolák simaizmát. Eredményeink azt mutatják, hogy a H2O2 a KCa és a KATP-csatornákat, valamint egyéb típusú K+-csatornákat aktivál. Mások azt találták, hogy konduit típusú artériákban a nagy vezetoképességu Ca2+-aktiválta K+-csatornákat a H2 O2 közvetlenül stimulálja. Összefoglalva, a H2O2-indukálta konstrikciót az endotheliális PGH 2 /TxA 2 mediálja, míg a dilatációt elsodlegesen az endotheliális NO szintáz, valamint a vaszkuláris simaizom sejtek különbözo K+-csatornáinak
9
aktivációja okozza. Érdekes módon különbséget találtunk az extra- és intralumin álisan adott H2 O2 hatása között. Az intralumin álisan bejuttatott H2 O2 hasonló mértéku konstrikciót okozott, de kisebb dilatációt váltott ki, mint az extraluminálisan adott H2O2. A H2 O2 eredetének helyétol függoen a vázizom arteriolák spontán tónusára különbözo hatással van, melyet eltéro mechanizmussal vált ki. A H2 O2 vazomotor hatásának ezen aspektusa gyulladás esetén lehet fontos, amikor a H2 O2 eredete lehet intraluminális az aktivált leukocitáknak köszönhetoen, vagy éppen extraluminális a makrofágoknak, a migrált leukocitáknak, parenchyma sejteknek, vagy magának a vaszkuláris szövetnek köszönhetoen. 2. A kataláz különbözo dózisainak és típusainak extraluminális adása meggátolta az intraluminálisan bejuttatott H2 O2 által eloidézett konstrikciót és dilatációt egyaránt. Ez azt mutatja, hogy a kataláz hatékonyan képes lebontani akár az endothéliumban, akár a simaizomban képzodött H2O2-ot. Az egy érdekes kérdés, hogy a kataláz, fehérje molekula révén, hogyan éri el az endothél és a simaizom sejteket. Korábbi kísérletekben katalázt juttattak a kutyaszív bal pitvarába a 15 perces ischémiát közvetlenül megelozoen, valamint idotartama alatt is. 30 perc reperfúziót követoen az exogén katalázt kis vezikulákban lehetett megtalálni a kapilláris endothéliumban, az endothélium és simaizom közti térben, valamint a simaizomban elektronmikroszkópot használva. 3. Kontroll körülmények között az intraluminális nyomás emelése az arteriolák konstrikcióját okozta.
A kataláz különbözo típusainak
jelenlétében a miogén konstrikció meredeksége és a miogén index görbe nem változott. Eredményeink a Flavahan munka-csoportéval ellentétesek,
10
ugyanis ok azt találták, hogy az intraluminális nyomás egy lépcsoben 10rol 90 Hgmm-re történo emelése NADPH oxidáz-függo H2 O2 képzodést okoz az egér farok arteriolájának simaizmában. Ez az ellentét a eltéro érterület és kísérleti körülmény miatt lehet. 4. Kontroll arteriolákban az áramlás növekedése dilatációt okozott. A kataláz különbözo típusainak jelenlétében nem volt különbség az áramlásátméro és az áramlás-, vagy nyíróero-indukálta átmérováltozás görbék meredekségében.
Eredményeink
Gutterman
munkacsoportjáéval
ellentétesek, ugyanis ok azt találták, hogy az endothélium-eredetu H2 O2 az izolált, emberi koszorúserek áramlás-indukálta dilatációjához vezet. Kimutatták, hogy a H2O2 okozta dilatáció a vaszkuláris simaizom membránjának KCa-csatorna függo hiperpolarizációjához kapcsolódik, azt mutatva, hogy H2 O2 EDHF-ként hat az emberi koszorúserekben, mely dilatátor mechanizmus fontos szerepet játszik a miokardiális perfúzió fenntartásában, amikor az NO szintje csökkent. A mi és Gutterman munkacsoportjának eredményei közt lévo különbség az arteriolák különbözo eredete miatt lehet, ugyanis Gutterman munkacsoportja szívbeteg emberekbol származó ereket használt, míg mi egészséges patkányokból valót. A H2 O2 beteg koronária arteriola áramlás-indukálta dilatációjában való részvétele kompenzációs mechanizmus lehet abban az esetben, amikor az NO mediáció hiányzik .
11
Eredményeink élettani és kórélettani jelentosége Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy az extraluminálisan adott H2 O2 eltéro vazomotor válaszokat okoz. A jelen tanulmány új eredményei szerint a H2 O2 mind konstrikciót, mind dilatációt eloidéz, amely a H2 O2 koncentráció-függo
mediátor
szerepét
veti
fel.
Jelenleg
nehéz
meghatározni, hogy pontosan mekkora a vaszkuláris és egyéb sejtek által termelt H2O2 koncentrációja a különbözo élettani és kórélettani körülmények között. Hasonlóan nehéz meghatározni az érfalban lévo katalázok jelenléte miatt, hogy pontosan mekkora koncentrációban éri el a sejtek intracelluláris alkotórészeit az exogén adott H2O2. Érdekes módon azt találták, hogy 2x10 6 /ml polymorphonukleáris leukocita phorbol-12myristate-13-acetate-tal (PMA) történo stimulációja 0,3 mM-t eléro koncentrációban képes H2 O2 -ot termelni in vitro kürülmények között. Megjegyzendo azonban, hogy az intracelluláris peroxidázok in vivo körülmények közötti eroteljes aktivitása miatt a sejtek alkotórészeiben lévo H2 O2 koncentráció a mikromoláris, illetve az alacsony millimoláris koncentráció -tartományban lehet. Tehát a körülményektol függoen valószínuleg a sejtek különbözo H2 O2 koncentrációknak vannak kitéve, amely ennek megfeleloen növelheti, vagy éppen csökkentheti az arteriolák spontán tónusát, s így a véráramlást. Valószínu például, hogy a H2 O2 az arteriolák átmérojének megnöveléséhez elegendo koncentrációban szabadul fel akkor, amikor a szövetek oxidatív metabolizmusa fokozódik, s ezáltal megnöveli a lokális vázizomarteriola véráramlását
a
megnövekedett
oxigén
igényeknek
megfele-loen.
Másrészrol bizonyos patólógiás körülmények között, amelyek oxidatív
12
stresszel és gyulladással társulnak - mint pl. a magasvérnyomás betegség, hiperhomocisztei-némia és cukorbetegség -
a
H2 O2
alacsonyabb
koncentráció ja a spontán tónus megnöveke-déséhez vezethet, mely gyakran megfigyelheto ezekben a betegségekben.
13
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1.
Cseko C , Bagi Z, Koller A. Biphasic effect of hydrogen peroxide on skeletal muscle arteriolar tone via activation of endothelial and smooth muscle signaling pathways. J Appl Physiol. Sep;97(3):1130-7, 2004
2.
(IF: 3.027)
Bagi Zs., Cseko Cs., Toth E., Koller A. Oxidative stress-induced dysregulation of arteriolar wall shear stress in hyperhomocysteinemia is prevented by chronic vitamin -C treatment. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285:H2277-H2283, 2003
(IF: 3.658)
Egyéb közlemények 3.
Iking-Konert C, Cseko C, Wagner C, Stegmaier S, Andrassy K, Hansch GM. Transdifferentiation of polymorphonuclear neutrophils: acquisition of CD83 and other functional characteristics of dendritic cells. J Mol Med Aug;79(8):464-74, 2001
4.
(IF: 4.101)
Nemeth K, Furesz J, Adorjani E, Cseko C, Bielik H, Lakatos S. fMLP-induced respiratory burst and the intracellular Ca2+ signal are not interrelated in neutrophils. Haematologia 31(2):111-23, 2001 (IF: 0.4)
5.
Nemeth K, Furesz J, Adorjani E, Cseko C, Bielik H, Lakatos S. Azurophil granules are heterogeneous with respect to mobilization induced by different concentrations of fMLP. Haematologia 31(3):181-9, 2001
(IF: 0.4)
Referált tudományos folyóiratban megjelent közlemények összesített impakt faktora: 11,586
14
