Szent István Egyetem Gödöllő
A BURGONYA Y VÍRUS KÖPENYFEHÉRJE GÉN ÁLTAL INDUKÁLT REZISZTENCIA KIALAKÍTÁSA BURGONYA- ÉS DOHÁNYFAJTÁKBAN, ÉS EZEK SZÁNTÓFÖLDI ÉRTÉKELÉSE
Doktori értekezés JÓZSA RITA
Gödöllő 2002
2
A doktori iskola neve:
Biológiai Doktori Iskola
Tudományága:
Biológiatudomány
Vezetője:
Dr. Tuba Zoltán tanszékvezető egyetemi tanár Szent István Egyetem, Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Növénytani és Növényélettani Tanszék
Témavezető:
Dr. Balázs Ervin akadémikus, intézetigazgató Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet, Környezet Biotechnológiai Intézet
....................................
....................................
Dr. Tuba Zoltán
Dr. Balázs Ervin
a doktori iskola vezetője
témavezető
3
TARTALOMJEGYZÉK:
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE: ..................................................................................................6 1. BEVEZETÉS ..........................................................................................................................8 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................11 2.1. A BURGONYA Y VÍRUS (PVY) JELENTŐSÉGE......................................................11 2.2. A PVY RENDSZERTANI BESOROLÁSA ÉS JELLEMZÉSE....................................13 2.3. PATOGÉNTŐL SZÁRMAZTATOTT REZISZTENCIA..............................................18 2.3.1. Klasszikus keresztvédettség .....................................................................................18 2.3.2. Molekuláris módszerekkel kiváltott ellenállóképesség ............................................20 2.3.2.1. Köpenyfehérje (CP) jellemzése ..................................................................................... 21 2.3.2.2. A köpenyfehérje gén által közvetített rezisztencia (coat protein mediated resistance CPMR)........................................................................................................................................ 23 2.3.2.3. Köpenyfehérje által közvetített keresztvédettség ........................................................... 24 2.3.2.3.1. Potyvirus nemzetség .............................................................................................. 25 2.3.2.4. A köpenyfehérje gén által indukált rezisztencia lehetséges hatásmechanizmusai.......... 29 2.3.2.4.1. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia hatásmechanizmusai...................... 30 2.3.2.4.2. Az RNS-ek által közvetített rezisztencia hatásmechanizmusai, a géncsendesítés jelensége................................................................................................................................ 32 2.3.2.5. Kockázati tényezők a köpenyfehérje által mediált keresztvédettség technológiájának felhasználása esetén .................................................................................................................... 38 2.3.2.5.1. Hetero- és transzkapszidáció ................................................................................. 39 2.3.2.5.2. Homológ és heterológ rekombináció ..................................................................... 41 2.3.2.5.3. Szinergizmus ......................................................................................................... 42
3. ANYAG ÉS MÓDSZER......................................................................................................43 3.1. ANYAGOK ....................................................................................................................43 3.1.1. Növényi anyag.........................................................................................................43 3.1.2. Vírusizolátum ..........................................................................................................44 3.1.3. Génkonstrukció .......................................................................................................44 3.1.4. Baktérium törzs .......................................................................................................45 3.1.5. Táptalaljok, tápoldatok ...........................................................................................46
4
3.1.6. Oldatok, pufferek.....................................................................................................47 3.2. MÓDSZEREK ................................................................................................................48 3.2.1. Módszerek transzgénikus növények előállításához..................................................48 3.2.1.1. Növény transzformáció.................................................................................................. 48 3.2.1.2. Hajtásindukálás.............................................................................................................. 49 3.2.1.3. Gyökereztetés ................................................................................................................ 49 3.2.1.4. Kiültetés üvegházba....................................................................................................... 49
3.2.2. Transzgénikus növények vizsgálata.........................................................................50 3.2.2.1. A köpenyfehérje gén integrációjának vizsgálata............................................................ 50 3.2.2.2. Transzgén expresszió vizsgálata .................................................................................... 51 3.2.2.3. Rezisztenciavizsgálatok ................................................................................................. 52 3.2.2.3.1. A mesterséges fertőzés és körülményei ................................................................. 52 3.2.2.3.2. Szabadföldi kísérletek............................................................................................ 53 3.2.2.3.2.1. Kisparcellás, infektor növényes, szabadföldi kísérlet .................................... 55 3.2.2.3.2.2. ELISA vizsgálat ........................................................................................... 57 3.2.2.3.2.3. Solanum demissum A6 teszt ......................................................................... 58 3.2.2.3.2.4. Kertészeti oltás kísérletek.............................................................................. 58
3.2.3. Vírusmentesítés .......................................................................................................59 3.2.4. Vírustisztítás............................................................................................................59 4. EREDMÉNYEK ...................................................................................................................60 4.1. TRANSZGÉNIKUS NÖVÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSA ....................................................60 4.2. TRANSZGÉNIKUS NÖVÉNYEK VIZSGÁLATA ......................................................62 4.2.1. Az integrálódott CP gén kimutatása........................................................................62 4.2.2. Transzgén expresszió vizsgálata .............................................................................63 4.2.3. Rezisztenciavizsgálat üvegházban, dot-blot analízis ...............................................65 4.2.4. A molekuláris vizsgálatok eredményeinek összegzése.............................................69 4.2.5. Szántóföldi vizsgálatok............................................................................................71 4.2.5.1. Dohányvonalak szabadföldi vizsgálata .......................................................................... 71 4.2.5.2. A transzgénikus burgonyavonalak szabadföldi vizsgálata ............................................. 73
5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA, KÖVETKEZTETÉSEK .........................................85 6. ÖSSZEFOGLALÁS, ABSTRACT......................................................................................90 7. IRODALOM .........................................................................................................................92
5
A DISSZERTÁCIÓHOZ KAPCSOLÓDÓ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE: ...........................................................................................................................108 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................110 1.
MELLÉKLET ...............................................................................................................111 ALFAMOVIRUS NEMZETSÉG ....................................................................................................111 CARLAVIRUS NEMZETSÉG.......................................................................................................112 CUCUMOVIRUS NEMZETSÉG...................................................................................................112 ENAMOVIRUS NEMZETSÉG .....................................................................................................113 FUROVIRUS NEMZETSÉG ........................................................................................................113 GEMINIVIRUS NEMZETSÉG .....................................................................................................114 ILARVIRUS NEMZETSÉG ..........................................................................................................114 LUTEOVIRUS NEMZETSÉG ......................................................................................................114 NEPOVIRUS NEMZETSÉG ........................................................................................................115 POTEXVIRUS NEMZETSÉG ......................................................................................................115 TENUIVIRUS NEMZETSÉG .......................................................................................................116 TOBAMOVIRUS NEMZETSÉG ...................................................................................................117 TOBRAVIRUS NEMZETSÉG ......................................................................................................118 TOMBUSVIRUS NEMZETSÉG ....................................................................................................119 TOSPOVIRUS NEMZETSÉG ......................................................................................................119
2.
MELLÉKLET ...............................................................................................................122 KÖPENYFEHÉRJE GÉNEK ÁLTAL KIVÁLTOTT REZISZTENCIA VÍRUSNEMZETSÉGENKÉNT ...............122
6
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE: BAP BA bp CCC cDNS CP CPMR dpi dsRNS ELISA HDR H 11 IAA M NAA NCR PCR PDR PTGS SK ssRNS SC VLP VD
benzil-aminopurin benzil-adenin base pair, bázispár klór-kolin-klorid copy/komplementer DNS coat protein, köpenyfehérje coat protein mediated resistance, köpenyfehérje által közvetített rezisztencia days past inoculation, a fertőzést követő x. napon double stranded, dupla szálú RNS enzyme linked immunosorbent assay homology dependent resistance, homológiafüggő rezisztencia Hevesi 11 dohányfajta indol-ecetsav Mindenes burgonyafajta naftil-ecetsav non coding region, nem kódoló régió polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció pathogen derived resistance, patogéntől származtatott rezisztencia post-transcriptional gene silencing, poszt-transzkripcionális géncsendesítés Somogyi Kifli burgonyafajta single stranded, egyszálú RNS Stamm C2 dohány nemesítési vonal virus like particulum, vírus-szerű parikulum Virgin D dohányfajta
Vírusok: AMV ArMV BMV BNYVV BYMV CaMV CMV CyMV CyRSV INSV GBNV GCMV GRSV MDMV PAMV PEMV PepMoV
alfalfa mosaic virus, lucerna mozaik vírus arabis mosaic virus, arabis mozaik vírus brome mosaic virus, rozsnok mozaik vírus beet necrotic yellow vein virus, répa nekrotikus sárgaerűség vírus barley yellow mosaic virus, árpa sárga mozaik vírus cauliflower mosaic virus, karfiol mozaik vírus cucumber mosaic virus, uborka mozaik vírus cymbidium mosaic virus, cymbidium mozaik vírus cymbidium ringspot virus, cymbidium gyűrüsfoltosság vírus impatiens necrotic spot virus, nebántsvirág nekrotikus foltosság vírus groundnut bud necrosis virus, földimogyoró rügynekrózis vírus grapevine chrome mosaic virus, szőlő króm mozaik vírus groundnut ringspot virus, földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus maize dwarf mosaic virus, kukorica törpe mozaik vírus potato aucuba mosaic virus, burgonya aucuba mozaik vírus pea enation mosaic virus, borsó enációs mozaik vírus pepper mottle virus, paprika foltosság vírus
7
PLRV PPV PRSV PStV PVM PVS PVX PVY RSV SMV SHMV TCSV TEV TMV ToMV TRV TSWV TSV TuMV TVMV TYLCV WMV-2 ZYMV
potato leaf roll virus, burgonya levélsodródás vírus plum pox virus, szilva himlő vírus papaya ringspot virus, papaya gyűrüsfoltosság vírus peanut stripe virus, földimogyoró csíkosság vírus potato M carlavirus, burgonya M vírus potato S virus, burgonya S-vírus potato X virus, burgonya X vírus potato Y virus, burgonya Y vírus rice stripe virus, rizs csíkosság vírus soybean mosaic virus, szója mozaik vírus sunn-hemp mosaic virus, kender mozaik vírus tomato chlorotic spot virus, paradicsom klorotikus foltosság vírus tobacco etch virus, dohány karcolatos vírus tobacco mosaic virus, dohány mozaik vírus tomato mosaic virus, paradicsom mozaik vírus tobacco rattle virus, dohány rattle vírus tomato spotted wilt virus, paradicsom foltos hervadás vírus tobacco streak virus, dohány csíkosság vírus turnip mottle virus, tarlórépa tarkulás vírus tobacco vein mottling virus, dohány érfoltosság vírus tomato yellow leaf curl virus, paradicsom sárga levélgöndörödés vírus watermelon mosaic virus-2, görögdinnye mozaik vírus zucchini yellow mosaic virus, cukkíni sárga mozaik vírus
8
1. BEVEZETÉS Gazdasági növényeink termőképességének növelése vagy szinten tartása szorosan összefügg a növények betegségekkel, kórokozókkal szembeni ellenállóképesség fokozásával. A növénytermesztésben jelentős károkat okozó növényi vírusok ellen a mezőgazdaság szakemberei mindig is alkalmaztak különböző módszereket és alkalmaznak ma is. A védekezés korábban főként preventív jellegű volt, emellett intenzív nemesítő munka folyt és folyik jelenleg is a növények vírus-ellenállóságának kialakítása terén. A vad fajokban (pl. Solanum stoloniferum, S. brevidens) meglévő rezisztenciagének többnyire más tulajdonsággal kapcsoltak, így ezek felhasználása csak hosszadalmas és munkaigényes folyamat után válik lehetővé, ráadásul ezek a gének egy erősebb vírusfertőzés esetén már nem nyújtanak megfelelő védelmet. A vírusok által okozott károk elsősorban járványok megjelenésekor érnek el szembetűnő gazdasági veszteségeket. Világszerte komoly gondot okoz főképpen a burgonya- és dohánytermesztésben a burgonya Y vírus (PVY) kártétele. A vírus nemcsak a terméshozam csökkentésével idéz elő veszteségeket, hanem ezáltal értékes és kiváló tulajdonságokkal rendelkező régi magyar fajtákat kiszorít a köztermesztésből. Ezek a fajták a vírussal szembeni fogékonyságuk
következtében
a
növénytermesztés
számára
jelenleg
használhatatlanok, így csupán génbankokban találhatóak meg. Ennek következtében jelentős mértékben csökken a mezőgazdaság biodiverzitása. Az 1970-es éveket követően Magyarországon a burgonya leromlása jelentős méreteket öltött, így az államilag elismert fajták, mint például a Gülbaba,
az
Aranyalma,
a
Kisvárdai
Rózsa
vagy
a
Mindenes
a
köztermesztésből kiszorultak. A Hollandiából importált fajták, mint pl. a Desiree, vetőgumócserés rendszerével a hazai fajták nem tudtak versenyezni. A
9
leromlásra hajlamosító tényezők Magyarországon elsősorban a PLRV (potato leafroll virus), az Y, X, A, S burgonyavírusok, valamint más kórokozók közül a fitoftóra és az alternária, így az ezekkel szembeni jó szántóföldi rezisztenciájú fajták előállítása vált fontossá. A fitoftórával illetve az alternáriával szembeni védekezés vegyszeresen részben megoldott, viszont a vírusokkal szemben a rezisztencianemesítés illetve a génsebészeti módszerek a leghatékonyabbak. A levéltetűvektorok elterjedését ugyan vegyszeres védekezéssel vissza lehet szorítani, azonban a leghatékonyabb megoldás mégis a vírusrezisztens transzgénikus növények előállítása, melyek felhasználásával csökkenthető a vírusvektorok ellen alkalmazott inszekticidek mennyisége is és megvalósítható egy környezetkímélőbb növényvédelem. A nyolcvanas években terjedt el hazánkban egy új PVY törzs, mely a korábbi rezisztens burgonyafajtákat is képes volt megbetegíteni (Beczner és mtsai, 1984). Ez a vírustörzs rezisztencia-áttörő képességgel rendelkezik (Le Romancer-Kerlan, 1992., Van den Heuvel et al., 1994) és jellegzetes nekrotikus tüneteket okoz a gumókon. A burgonya gumó nekrotikus gyűrűsfoltosság (PVYNTN) nevet kapta. Jelenleg az egész világon elterjedt és károsít. Mára már két évtized telt el azóta, hogy géntechnológiai módszerekkel valamely élő szervezetből tetszőlegesen kiválasztott tulajdonságokat hordozó gének izolálására van lehetőség. Ezen gének egy másik szervezetbe történő működőképes beépítésével a kívánt tulajdonság megnyilvánítható és örökíthető (Balázs és Gáborjányi, 1984). Az így előállított transzgénikus növények (pl. toleráns vagy rezisztens fajták) előállítása költségkímélőbb és időtakarékosabb, mint a hagyományos módszerekkel nemesített fajtáké (Tepfer és Balázs, 1997). A kórokozók újonnan megjelenő törzsei, biotípusai vagy rasszai azonban még így is folyamatosan új kihívást jelentenek a szakemberek számára.
10
A genetikailag módosított növényekkel történő kutatásokat, szántóföldi vizsgálatokat, engedélyeztetésüket és a köztermesztésbe kerülésüket törvények szabályozzák (Balázs, 1997). Az elmúlt közel két évtizedben a molekuláris biológiai eszközök felhasználásával a világ különböző laboratóriumaiban vírusellenálló növényeket hoztak létre. A víruseredetű géneket transzgénként felhasználó módszerek közül legelterjedtebben alkalmazott a köpenyfehérje gént tartalmazó konstrukciókkal történő növényi transzformáció, melyet számos növény-vírus kombinációban használtak már sikerrel. Ezzel a módszerrel váltottak ki vírus-ellenállóságot más jól ismert burgonyafajtáknál is, mint pl. Russet Burbank, Bintje és Desiree. Munkánk során célul tűztük ki, hogy a hazai flórából származó burgonya Y vírus köpenyfehérje génjét a vírussal szemben fogékony, régi magyar burgonya- és dohányfajtákba építsük be és az így létrehozott transzgénikus növények által új, vírusellenálló vonalakat alakítunk ki. Célul tűztük ki azt is, hogy
az
így
előállított
vonalak
közül
molekuláris-
és
előzetes
rezisztenciavizsgálatok által kiválasztott legkiválóbb vonalakat szántóföldi, propagatív körülmények között is vizsgáljuk és bebizonyítsuk, hogy ezzel a módszerrel előállított transzgénikus növények nagy hatékonysággal és biztonsággal használhatóak a növénytermesztésben, visszaadva a rég elfeledett, egykor kiváló fajtákat a mezőgazdaság számára.
11
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A BURGONYA Y VÍRUS (PVY) JELENTŐSÉGE A
zöldség
és
dísznövények
egyik
gazdaságilag
legjelentősebb
víruskórokozója a PVY, mely főképpen a Solanaceae családba tartozó növényeket károsítja. Jelenlegi ismereteink szerint 405 növényfajt fertőz 31 családon és 72 nemzetségen belül (Edwardson és Christie, 1997). Megfertőzi a burgonya, dohány (1., 2. ábra), paradicsom, paprika kultúrákat, és néhány gyomot is, mint például a Solanum nigrum L., Portulaca oleracea L. A PVY a burgonya legfontosabb és legsúlyosabb károkat előidéző vírusbetegségének a kórokozója, mely minden burgonyatermesztő országban előfordul. A vírus a burgonya X (PVX) és a burgonya levélsodródás vírussal (PLRV) együtt okozza a burgonya vírusos leromlását, amely így akár 10-80%-os terméskiesést is eredményezhet (Hollings és Brunt, 1981, Horváth, 1995).
1. ábra PVY által okozott tünetek dohánylevélen.
12
2. ábra A PVY kártétele dohánytermesztésben. (Debrecen-Pallag)
A PVY levéltetvek által terjed, nem perzisztens módon, azaz terjedése gyors, de csak néhány óráig. Ellentétben a perzisztens módon terjedő vírusokkal, mint pl. a PLRV, amely több napig a levéltetvek nyálmirigyében maradva fertőz. Egyetlen fertőzőképes levéltetű több növényt is képes megfertőzni. A vírus átvitelére mintegy 20 különböző nemzetségbe tartozó levéltetű faj képes. A PVY a parenchimában lokalizálódó vírusok közé tartozik. A PVYNTN legfontosabb természetes gazdanövénye a burgonya (Solanum tuberosum ssp. tuberosum). Az elsődleges fertőzés általában kevésbé súlyos következményekkel jár, mint a másodlagos, amely a burgonyagumókban megmaradó vírusokból indul ki (3. ábra).
13
3. ábra PVY fertőzési ciklus burgonyánál (Farinelli, 1992). A vírusterjedés függ a korai levéltetű-populációtól és a fertőzött növények mennyiségétől. Az egészséges növények más növényfajokról, de gyakran a fertőzött gumókból kihajtó növényekről kapják meg a vírust a levéltűvektorok által. Fertőzött gumó pedig fennmaradhat a talajban átvészelve a telet, de az is előfordulhat, hogy betakarítás után nem vehető észre a fertőzöttség és felhasználják vetőburgonyaként a gumókat a következő évben.
2.2. A PVY RENDSZERTANI BESOROLÁSA ÉS JELLEMZÉSE A Potyviridae család a nevét a PVY-ról kapta. A vírust először a XX. század első felében Smith (1931) írta le Nagy-Britanniában. Majd Harrison és Roberts (1971) sorolta a PVY-t és a hozzá hasonló vírusokat egy csoportba és később a legjellemzőbb tagjáról nevezték el Potyvírus nemzetségnek. A legnépesebb és gazdaságilag a legjelentősebb víruscsalád. Több, mint 200 tagja
14
van öt nemzetségen belül: Potyvírus-, Bymovírus-, Rymovírus-, Ipomovírus- és Macluravírus nemzetség. (Shukla és mtsai,1994). A potyvírusok hajlékony, fonal alakú növényi vírusok, átmérőjük 11-15 nm hosszúságuk 650-900 nm, és megközelítőleg 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaznak (Dougherty és Carrington,1988). A virionok egyszálú, pozitív, szensz RNS-t tartalmaznak, amely megközelítőleg 10.000 nukleotidból áll. A potyvírusok genomszerkezetének pontosabb feltárása a vírusok nukleotid szekvenciájának ismeretével és a vírus RNS komplementer DNS-éről (cDNS) szintetizálódó fertőzőképes transzkriptumok létrehozásával vált lehetővé. A vírust burkoló köpenyfehérje 2000 alegységből áll össze. Az RNS genom 5' végéhez egy fehérje kötődik, a 3' végen pedig poliadenilált szekvencia található, melynek hossza a vírus fertőzőképességét befolyásoló tényező (Riechmann és mtsai, 1990). A potyvírus nemzetség tagjai és az egyes vírusok izolátumai között nagy különbségek vannak a 3’ vég méretében és szekvenciasorrendjében (Laín és mtsai, 1988, Dolja és Carrington, 1992). A nemkódoló régiók közül az 5’ vég sokkal konzervatívabb, mint a 3’ vég, így pl. az egyes víruscsaládokat a 3’ vég bázissorrendje alapján lehet megkülönböztetni (Atreya, 1992). A genomi RNS-ről egy nagy poliprotein prekurzor (340-368 kDa) keletkezik (Allison és mtsai, 1986), amelynek hasítása vírus által kódolt proteázokkal történik. A poliprotein prekurzor hasítási termékei az N-terminális végtől a C-terminális vég felé haladva a következők: P1- első fehérje, HC-Pro- segítő komponensproteáz, P3-harmadik fehérje, 6K1- feltételezett első 6 kDa-os fehérje, CIhenger alakú zárványfehérje, 6K2- második 6kDa-os fehérje, VPg-NIa- kis nukleáris zárványfehérje, NIb- nagy nukleáris zárványfehérje, valamint a CPköpenyfehérje. (Riechmann és mtsai,1992), (4. ábra).
15 6K1
6K2 poly A
VPg
P1
Hc-Pro
P3
CI
NIa
NIb
CP
4. ábra Potyvírusok genomszerveződése és a géntermékek elnevezése VPg- genomhoz kötött fehérje, P1- első fehérje, HC-Pro- segítő komponensproteáz, P3- harmadik fehérje, 6K1- az első 6 kDa-os fehérje, CI- henger alakú zárványfehérje, 6K2- a második 6 kDa-os fehérje, NIa (VPg-Pro)- kis nukleáris zárványfehérje, NIb- nagy nukleáris zárványfehérje, CP- köpenyfehérje, polyApoliadenilált régió. A potyvírusok által termelt fehérjék nagy részének funkciója többnyire ismert, de teljesen még nem tisztázott. A fehérjék többsége általában többféle folyamatban is részt vesz. Egyes fehérjék szerepére csak más, ismert funkciójú fehérjékhez való hasonlatosság alapján következtetnek. A P1 proteináz a P1/HC-Pro hasítást végzi, rendelkezik nukleinsav kötő tulajdonsággal, aminek a sejtről sejtre való terjedésben lehet szerepe, illetve részt vehet a tünetfejlődésben és szinergista kölcsönhatásokban (Verchot és mtsai, 1991, Soumounon és Laliberté, 1994, Pruss és mtsai, 1997). A HC-Pro proteináz a HC-Pro/P3 hasítást végzi, részt vesz a levéltetűvel történő átvitelben, a sejtrőlsejtre- és a hosszú távú terjedésben, de szerepe lehet még a virulencia és a tünetek erősségében (Carrington és mtsai, 1989, Maia és mtsai, 1996, Rojas és mtsai, 1997, Kasschau és mtsai, 1997). A P3 feltételezett szerepe a tünetfejlődésben lehet, valamint a vírusreplikációban (Rodrigez-Cerezo és mtasi, 1993, Riechmann és mtsai, 1995), a 6K1 szerepe nem ismert, a 6K2 a vírusreplikációban vesz részt (Riechmann és mtsai, 1992). A CI helikáz aktivitással rendelkezik és a sejtről-sejtre történő terjedésben vesz részt (Rodriguez-Cerezo és mtsai, 1997, Carrington és mtsai, 1998). Minden potyvírusnál megtalálható jellegzetes szélkerék alakú zárványok formájában
16
(Brakke és mtsai, 1987). Az NIa kis sejtmagi zárványfehérje proteáz aktivitással rendelkezik (Carrington és Dougherty, 1987), részt vesz a hosszú távú mozgásban, N-terminális doménje a genomhoz kötött protein (VPg), amely a replikáció során kötődik a vírus RNS-hez (Murphy és mtsai, 1990). A NIb RNS függő RNS polimeráz (Shukla és mtsai, 1994), a CP a vírus RNS becsomagolásában, a vektorokkal való terjedésben (DAG motívum), a hosszú távú mozgásban és a genom amplifikációban vesz részt (Shukla és mtsai, 1994, Haldeman-Cahill és mtsai, 1998, López-Moya és Pirone, 1998). Az 5’-NCR (nem kódoló régió) részt vesz az enkapszidációban, valószínűsíthető, hogy a transzlációban és a replikációban, illetve szerepe lehet a fertőzőképesség alakulásában is (Shukla és mtsai, 1994, Xu és Shaw, 1998, Palkovics és mtsai, 1998). A 3’-NCR pedig a vírusreplikációban vesz részt (Haldeman-Cahill és mtsai, 1998). A potyvírusok mechanikai sérüléseken keresztül jutnak be a gazdaszervezet sejtjeibe, amelyeket fizikai behatások vagy a vírus vektorai okoznak. A potyvírusok replikációs ciklusa a növényi sejtbe való bekerülést követően a vírus RNS kicsomagolódásával, majd a transzlációt követő poliprotein hasítással folytatódik. A genomreplikáció a negatív szál intermedieren keresztül történik. A vírus a gazda által termelt energiát és anyagokat használja fennmaradásához és replikációjához, önmaga csak a genomi RNS-ben tárolt információt szolgáltatja. A szisztemikus és lokális vírustünetek eltérő jellege alapján több PVY törzs különböztethető meg. Magyarországon túlnyomó többségben a PVYNTN törzs fordul elő (Wolf és Horváth, 2000). Az általános PVYO törzs, az egész világon elterjedt (Ellis és mtsai, 1997) és többféle kórképet okoz. Gyűrődéses, nekrotikus szimptómákat eredményez burgonyán valamint levélszáradást, fodrosodást,
levélhullást,
dohányon
pedig
foltokat,
szisztemikus
17
márványozottságot (Smith és Dennis, 1940, Horváth, 1966). A PVYN törzs szintén előfordul az egész világon. Érnekrózist okoz dohányon, paprikán és paradicsomon, valamint enyhe foltosodást hoz létre a legtöbb termesztett burgonya esetében. Magyarországi előfordulását Szirmai (1958) írta le először. A PVYC törzs előfordulása Ausztráliában, Európában, Indiában és DélAfrikában ismert. Burgonyán hiperszenzitív reakciókat vált ki, nekrotikus léziókat foltokkal a levélen és a száron (de Bokx és Huttinga, 1981). A dohányon okozott tünetek megegyeznek a PVYO törzs által okozottakkal. A PVYAn (anomale törzs) az N törzshöz hasonlóan érnekrózist okoz, de szerológiailag az O és az N törzsek között helyezkedik el. A PVYNTN (new tuber necrosis) törzs, mely a burgonya gumó nekrotikus gyűrűsfoltosság nevet kapta, Európában és a világ számos más országában is elterjedt. A burgonya levelén nekrotikus léziókat, a gumón és a bogyón nekrotikus gyűrűsfoltosságot okoz,
és
rezisztencia-áttörő
tulajdonsága
miatt
jelentős.
A
gumók
tárolhatatlanná válnak, sérülékenyekké és eladhatatlanokká. A megemlített fontosabb törzsek mellett még előfordulnak PVYNN, PVYMM és PVYMN törzsek is, melyek csoportosítása az általuk okozott tünetek alapján történt (Gooding és Tolin, 1973, Sudarsono és mtsai, 1993, Chachulska, 1998). A magyarországi flórából izolált burgonya Y vírus (PVY-H), mely a PVYNTN törzsébe tartozik, 9703 nukleotid hosszúságú genomi RNS-sel rendelkezik és egy poli(A) véggel (Thole és mtsai, 1993). A PVY-H nukleotid szekvenciája egy nagy olvasási keretet tartalmaz, amely egy 3061 aminosavhosszú poliprotein prekurzort kódol, valamint egy 189 nukleotidból álló 5' nemkódoló régióval és egy 330 nukleotid-hosszú 3' nem transzlálódó régióval rendelkezik. A PVY törzsek általában nagyobb mértékű szekvencia heterogenitással rendelkeznek, mint más potyvírus törzsek, amelyek nukleotid
18
szekvencia azonossága 95 %-nál magasabb. (Robaglia és mtsai, 1989, Shukla és mtsai, 1991).
2.3. PATOGÉNTŐL SZÁRMAZTATOTT REZISZTENCIA A Patogéntől Származtatott Rezisztencia (PDR) fogalma 1985-ből Sanfordtól és Johnsontól ered. E megfogalmazás szerint a gazdanövényben expresszálódó vírus génjének, génszakaszának RNS transzkriptuma, illetve génterméke
a
víruseredetű
komponensek
természetes
egyensúlyát
megváltoztathatja, így a vírus replikáció, valamint a vírus növényen belüli terjedése megakadályozható, illetve megzavarható, ami a növény enyhített vagy elmaradó fertőzését eredményezi. 2.3.1. Klasszikus keresztvédettség A növénykórtanban jól ismert a keresztvédettségi reakció, amelyet a gyakorlati mezőgazdaság számos esetben alkalmaz sikerrel (visszaszorítva a vad típusú vírus által okozott betegségtüneteket illetve a vírus replikációját). A gyengített vírustörzzsel kialakított klasszikus keresztvédettség jelenségét először McKinney írta le 1929-ben. TMV (tobacco mosaic virus) gyengített törzsével történő fertőzés esetén azt tapasztalta, hogy a későbbi vírustámadásnál a növény a vírus különböző vonalaival szemben rezisztens volt. Üvegházi vizsgálatokkal kimutatták, hogy a fertőzés után a felülfertőző vírus csak kis mennyiségben van jelen a növényben, esetenként ki sem mutatható. A rezisztencia nem jelenik meg minden esetben, például "A" vírus nyújthat védelmet "B"-vel szemben, míg "B" már nem "A"-val szemben (Palukaitis és
19
Zaitlin, 1984). Általánosságban elmondható, hogy főképpen rokon törzsek között figyelhető meg a jelenség kialakulása, ami szekvencia homológiára vezethető vissza. A jelenség felismerését követően többféle hipotézis született a klasszikus keresztvédettségi reakció működésének magyarázatára. Zaitlin 1976-ban felvázolta az RNS : RNS interakciók egyik lehetséges módját. Azt feltételezte, hogy a keresztvédettség molekulák közötti hibridizáció eredménye, a gyengített vírus RNS és a fertőző vírus RNS között. De Zoeten és Fulton szerint (1975) egy ún. második becsomagolódása történik a fertőző vírus RNS-nek, a gyengített vírustól származó szabad köpenyfehérjébe. 1982-ben Sherwood és Fulton azt feltételezte, hogy a fertőző vírus képtelen kicsomagolódni, ha gyengített vírussal szisztemikusan fertőzött növényt támad. Zinnen és Fulton (1986) keresztvédettségi kísérletet végeztek SHMV (sunn hemp mosaic virus) és TMV felhasználásával. Azt tapasztalták, hogy a védettség kialakítása céljából gyengített SHMV-vel fertőzött növényt, ha TMV RNS-el fertőznek és az SHMV CP-be becsomagolódik, 5-27-szer kevésbé lesz fertőzőképes, mint amikor TMV CP-be csomagolódik be az RNS. Azt a következtetést vonták le, hogy a szabad, homológ CP képes csökkenteni a fertőzőképességet, de feltételezték, hogy egyéb, nem ismert tényezők is szerepet játszhatnak a folyamatban. 1981-ben Sarkar és Smitamana, valamint 1989-ben Gerber és Sarkar olyan mutáns, CP nélküli TMV vonalat állítottak elő, amely szintén képes volt keresztvédettséget kiváltani. Ezek alapján arra következtettek, hogy nagyobb szerepük lehet a rezisztencia kialakításában az addig még nem ismert tényezőknek, mint magának a CP-nek. Más vélemények szerint a gazdasejtben valamiféle verseny alakul ki a védő vírus és a fertőző vírus között a replikációhoz szükséges valamely komponensért. Ez lehet például maga a replikáz gén. Horikoshi és mtsai (1987) leírták, hogy a BMV (brome mosaic
20
virus) CP blokkolta a replikáz kötőhelyét, ezáltal megzavarta az RNS szintézist. Azt feltételezték, hogy a CP által szabályozott vírusreplikáció képezi a keresztvédettség hatásmechanizmusának alapját. Az módszer azonban nem terjedt el, mert ezek a gyengített vírustörzsek más gazdanövényeken súlyos betegséget, esetleg teljes pusztulást okoztak. Az attenuált törzsek felhasználása magában hordozza azt a lehetőséget is, hogy mutáció során az eredetileg gyengített vírustörzs patogenitása megváltozik. További kockázati tényezőt jelenthet a szinergisztikus hatás, mely valamely más vírussal való együttes fertőzésekor léphet fel. Ekkor a két vírus egyidejű jelenléte ugyanazon növényben fokozottabb kártételt eredményez, mint a kettő külön-külön. A molekuláris biológiai módszerek fejlődésével azonban lehetőség nyílt a növénykórtanban
jól
ismert
keresztvédettségi
reakció
kialakítására,
hatékonyabb és biztonságosabb módon, a gyengített vírus által hordozott kockázati tényezők nélkül..
2.3.2. Molekuláris módszerekkel kiváltott ellenállóképesség A molekuláris biológia módszereinek fejlődésével lehetőség nyílt arra, hogy a vírus eredetű gének növényi genomba építésével és azok növényen belüli
megnyilvánításával
az
előzőekben
ismertetetthez
hasonló
keresztvédettségi reakciót alakítsanak ki. Széles körben és sikeresen használt a vírus köpenyfehérje génje, melyet elsőként alkalmaztak a klasszikus keresztvédettség vizsgálatainak eredményei alapján. Transzgénikus növények előállításához a köpenyfehérje gén mellett számos más vírusgén is felhasználható: pl. a replikázkomplex komponenseinek génjei, szatellit RNS-ek,
21
defektív interferáló elemek, ribozimok, antiszensz RNS-ek és mozgási fehérjék génjei (Wilson, 1993, Lindbo és mtsai, 1993b, Baulcombe, 1996, Tacke és mtsai, 1996, Ares és mtsai, 1998).
2.3.2.1. Köpenyfehérje (CP) jellemzése
A köpenyfehérje a legjobban jellemzett fehérje a potyvírusoknál. Elsődleges feladata a vírus RNS becsomagolása, de ezen túl részt vesz a levéltetvekkel történő terjedésben (Pirone, 1991, Salomon és Bernardi, 1995), a tünetek kialakításában és a sejtről-sejtre történő terjedésben (Dolja és mtsai, 1995, López-Moya és Pirone, 1998, Varrelman és Maiss, 2000), de kimutatták a CP
replikációban
betöltött
szerepét
is
(Mahayan
és
mtsai,
1996).
A CP egy erősen konzervált központi magból és a változékonyabb N- és Cvégekből áll. A virion felületén helyezkednek el a CP N- és C-terminális részei (Ward és Shukla, 1991), melyek nem szükségesek a víruspartikulumok összeszerelődéséhez, sem a mechanikai inokulációval történő fertőzéshez (Shukla és mtsai, 1994). Az N-terminális szakasz, mely mind hosszban, mind szekvenciáiban változékony, részt vesz gazda-vektor-vírus kölcsönhatásokban, alkalmas víruscsaládon belüli elkülönítésre és izolátumok megkülönböztetésére, azonban nem játszik szerepet a sejtről-sejtre történő terjedésben és a plazmodezmákkal kialakított kapcsolatban (Rojas és mtsai, 1997) (5. ábra).
22
5. ábra A PVY CP harmadlagos struktúrájának sematikus vázlata (Shukla és Ward, 1989) Az N-terminális végen elhelyezkedő DAG triplet a levéltetvek általi átvitelben játszik fontos szerepet (Salomon és Raccah, 1990). A CP a segítő komponenssel kapcsolatba lépve egyes feltevések szerint a levéltetvek szájszervéhez kapcsolódik (Pirone és Blanc, 1996). A C- és N-terminális régió felelős a növényen belüli hosszú távú mozgásért (Dolja és mtsai, 1995). A vírus nukleoprotein komplexet alkotva jut át a plazmodezmákon (Rodriguez-Cerezo és mtsai, 1997). Az enkapszidációhoz viszont nem feltétlenül szükségesek, eltávolításuk nem befolyásolja a vírus fertőzőképességét (Shukla és mtsai, 1994). A potyvírusok képesek másik, de a nemzetségbe tartozó vírus köpenyfehérje alegységeit is felhasználni a burok felépítéséhez, így levéltetvekkel át nem vihető vírus átvihetővé válik. Ez a heteroenkapszidáció jelensége.
23
2.3.2.2. A köpenyfehérje gén által közvetített rezisztencia (coat protein mediated resistance -CPMR)
A második vírustörzzsel történő fertőzéskor fellépő rezisztenciát a növényi sejtekben már megtalálható vírus eredetű köpenyfehérje jelenlétével is magyarázták (de Zoeten és Fulton, 1975). A biotechnológiai módszerek fejlődésével felismerték a lehetőséget, hogy a köpenyfehérje génnel történő transzformáció segítségével a keresztvédettséghez hasonló eredmények érhetők el. A gént megfelelő vektorba építve és növényi genomba integrálva a köpenyfehérje növényen belüli termelődését lehet kiváltani. Az így létrehozott rezisztenciát nevezzük köpenyfehérje által közvetített rezisztenciának. A védettség mértéke függ az adott vírustól, az inokulum koncentrációjától és a transzformált növényi vonaltól. A rezisztencia szintje azonban változó: a szimptómák kifejlődése időben késhet, a megjelenő tünetek lehetnek enyhébbek, előfordulhat alacsonyabb vírusszám, létrejöhet felépülési reakció („recovery”: amikor a növény elsődlegesen fertőződik, azonban a később megjelenő fiatal levelek már tünet- és vírusmentesek), valamint kialakulhat immunitás.
A
védettség
esetenként
fennállhat
magasabb
inokulum-
koncentrációval szemben is. Az első kísérletet köpenyfehérje közvetítette rezisztencia kialakítására Bevan és munkatársai 1985-ben végezték. Dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus -TMV) köpenyfehérje (coat protein -CP) gént építettek be dohánynövényekbe Agrobacterium tumefaciens segítségével. A felnevelt növények leveleiből 0.001 %-ban mutatták ki a CP-t az összes oldható fehérjéhez viszonyítva, azonban TMV fertőzéskor a transzgénikus növények a kontrollokhoz hasonlóan fogékonynak bizonyultak.
24
Mintegy 18 évvel ezelőtt Powell-Abel és munkatársai (1986) szintén TMV köpenyfehérje gént építettek be dohány és paradicsom növényekbe, amelyek ezáltal nagyfokú ellenállóképességet mutattak a felülfertőző vírussal szemben. A TMV CP génjét tartalmazó konstrukcióval transzformálták a növényeket, mely konstrukció a 35 S promótert és poly (A) régiót is tartalmazta. A transzgénikus növények leveleiből származó fehérjekivonatban immunoblot segítségével 0.1 %-os arányban mutatták ki a vírus köpenyfehérjét. TMV-vel történő mesterséges fertőzés során a CP-t szintetizáló növényeken késéssel jelentkeztek a tünetek, illetve egy részük tünetmentes is maradt. A transzformánsokon megfigyelt rezisztenciát a hasadó utódpopulációkon is ki lehetett mutatni. Ez volt az első sikeres tanulmány, amely bebizonyította, hogy vírusrezisztencia
kialakításának
céljából
a
genetikai
transzformációt
eredményesen lehet alkalmazni. Ezáltal egy új, korszerű génsebészeti eljárás felhasználásával vált lehetővé a vírus-ellenállóság kialakítása. Ma már több mint száz vírus-gazdanövény kapcsolatban alkalmazták sikeresen az ún. „köpenyfehérje gén által közvetített ellenállóság” jelenségét. Az utóbbi években az így előállított transzgénikus növények közül számos köztermesztésbe is került.
2.3.2.3. Köpenyfehérje által közvetített keresztvédettség
1986 óta CP által kiváltott védettséget számos esetben hoztak létre a világ különböző laboratóriumaiban, mintegy 16 vírusnemzetség egyes tagjaival szemben és több gazdaságilag fontos növényfaj esetében. Az 2-es számú melléklet tartalmazza az e célra már felhasznált vírusnemzetségek és
25
növényfajok összefoglaló táblázatát, a 1-es számú mellékletben pedig ugyanezt tárgyaljuk kissé részletesebben, az egyes vírusnemzetségek szerint csoportosítva.
2.3.2.3.1. Potyvirus nemzetség
Különböző laboratóriumokban számos sikeres kísérletet végeztek a Potyvirus nemzetség több tagjával, így a PVY felhasználásával is. Cassidy és Nelson (1995) például a földimogyoró csíkosság vírus (peanut stripe potyvirus –PStV) CP gént tartalmazó konstrukciókkal transzformáltak N. benthamiana
növényeket.
Létrehoztak
ATG
transzlációs
start
kóddal
rendelkező és e nélküli, teljes hosszúságú konstrukciókat, valamint ATG-vel rendelkező, de csonkított CP-t tartalmazó vektorokat. A két -teljes gént tartalmazó- „ATG+” konstrukciókkal transzformált vonalaknál mechanikai fertőzés esetén nem alakultak ki vírustünetek és vírusakkumuláció sem volt. A többi vonalnál csupán a tünetfejlődés késését tapasztalták. A később fejlődő szisztemikus, fiatal levelek tünetmentesek voltak és a CP-t sem lehetett belőlük kimutatni. További vizsgálatokkal bebizonyították, hogy a felépülési „recovery” jelenséget mutató növények tünet nélküli levelei rezisztensek az újabb PStV fertőzésekkel szemben, azonban TEV fertőzéssel szemben nem. A PStV-re immunis transzgénikus növények ellenállóképessége nem fejeződött ki más poty- vagy tobamovírusokkal történő fertőzés esetén. A vizsgálatok nem mutattak ki korrelációt a CP akkumulációs szint és a rezisztencia mértéke között. Dinant és mtsai (1993) saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus – LMV) CP génnel transzformáltak N. tabacum cv. Xanthi dohánynövényeket, majd ezeket PVY-nal fertőzték. A 34 vizsgált növényi vonalból 17 esetben
26
mutattak ki CP akkumulációt. Ezek a vonalak rezisztensek voltak PVYN fertőzéssel szemben, holott PVY és az LMV CP-k közötti aminosavhomológia csupán 66 %. A második generációból 5 vonalat vizsgálva azt tapasztalták, hogy a növények ellenállóak voltak a PVYN és még négy másik PVY törzzsel szemben is. Két vonalban teljes rezisztenciát tapasztaltak, két másik vonalban csupán a tünetek kialakulásának késését, egy vonalban pedig a kontrollokhoz hasonló erősségű tüneteket figyeltek meg, melyek késve, de megjelentek. Murry és mtsai (1993) kukorica törpe mozaik vírus (maize dwarf mosaic potyvirus –MDMV) 'B' törzsének CP génjét felhasználva állítottak elő transzgénikus kukoricanövényeket. A vonalak mindegyike expresszálta a CP gént. A növényeket MDMV 'A' és 'B' törzsekkel fertőzték, valamint kukorica klorotikus foltosság vírussal (maize chlorotic mottle machlomovirus –MCMV) együtt, keverten. A transzgénikus növényeket egyik vírus sem tudta megfertőzni. A replikácó és a vírusterjedés gátlása a heterológ fertőzésnél nem volt teljes, a transzgén jelenléte mégis elősegítette a növények életben maradását. Lindbo és Dougherty (1992b) nem-transzlálódó, szensz és antiszensz dohány karcolatos vírus (tobacco etch virus –TEV) CP génnel transzformáltak dohánynövényeket. A 7 vizsgált, antiszensz gént hordozó vonalból 1 esetben tapasztaltak tünetgyengülést, míg a tíz szensz vonalak mindegyike tünetmentes volt. Mechanikai és levéltetvek általi inokulációt is alkalmaztak. A védettség TEV specifikus volt, mely elsősorban a vírus replikáció csökkentésében nyilvánult meg, és független volt az inokulum koncentrációjától és a növény méretétől. A rezisztencia RNS-függőnek bizonyult, mivel fehérjetermék hiányában is megnyilvánult. Ravelonandro és mtsai (1993) PPV CP génnel transzformáltak N. tabacum cv. Xanthi, N. benthamiana és N. clevelandii növényeket. A N. benthamiana
27
vonalakban ellenállóképesség kialakulását tapasztalták PPV fertőzés esetén, míg a N. tabacum cv. Xanthi és a N. clevelandii vonalakban csupán részleges védettséget figyeltek meg PPV és PVY inokulációkat követően. 20 µg/ml PVYnal történő fertőzés esetében a vonalak 90-100 %-a megfertőződött, ami a rezisztencia inokulum-koncentrációtól való függőségét jelzi. Egyes N. benthamiana növényeknél a hosszú távú vírusmozgás blokkolását és a felépülési jelenséget figyelték meg, ez azonban szintén függött az alkalmazott víruskoncentrációtól. Stark és Beachy (1989) szója mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus – SMV) 'N' törzs CP génjét használták fel transzgénikus dohánynövények előállításához. A növények ellenállóak voltak PVY-nal és TEV-vel szemben, míg dohány mozaik vírus (tobacco mosaic virus –TMV) 'U1' fertőzés esetén fogékonyként viselkedtek. Dohány érfoltosság vírussal szemben (tobacco vein mottling potyvirus – TVMV) Murphy és mtsai (1990) hoztak létre rezisztens transzgénikus dohányvonalakat, melyek nemcsak TVMV-vel szemben voltak ellenállóak, hanem TEV fertőzéssel szemben is rendelkeztek rezisztenciával. PVY 'O' törzsének CP génjével végeztek transzformációt Lawson és mtsai (1990)
és
azt
tapasztalták,
hogy
a
transzgénikus
Russet
Burbank
burgonyanövények védettek voltak PVY 'O' fertőzéssel szemben, míg PVX-szel szemben fogékonynak mutatkoztak. Scorza és mtsai (1991) papaya gyűrűsfoltosság vírus (papaya ringspot potyvirus –PRSV) CP génnel transzgénikus szilvákat fertőztek PPV-vel (átoltással) és két éven keresztül vizsgálták a reakciókat. A legtöbb transzgénikus növény megfertőződött, viszont a tünetek a kontrollokhoz képest enyhébbek voltak, illetve egy esetben a védettség megjelenését is tapasztalták.
28
Ling
és
mtsai
(1991)
szintén
PRSV
CP
gént
expresszáltattak
dohánynövényekben. TEV, PVY és paprika foltosság vírus (pepper mottle virus –PepMoV) fertőzést követően a tünetek gyengült és késő kifejlődését figyelték meg. Az ellenállóképesség TEV és PepMoV esetében hatékonyabbnak bizonyult, mint PVY-nal szemben. Da Camara Machado és mtsai (1992) Prunus armeniaca sejtkultúrát transzformáltak szilva himlő vírus (plum pox potyvirus –PPV) CP génjét hordozó
konstrukcióval.
A
sikeres
kajszibarack
regeneráció
fejletlen
embriókból történt. Ez volt az első tanulmány, mely eredményes gyümölcsfatranszformációról számolt be. Kollár és mtsai (1993) szintén PVY köpenyfehérje génnel transzformáltak N. tabacum növényeket. A CP-t expresszáló vonalak rezisztensek voltak PVY fertőzéssel szemben azonban a vizsgálatok során kimutatták, hogy a rezisztencia nem függ a CP jelenlététől. Hasonló eredményeket kaptak van der Vlugt és mtsai (1992) dohánynövények és PVY 'N' izolátum esetén. Fang és Grumet (1993) cukkíni sárga mozaik vírus (zucchini yellow mosaic potyvirus –ZYMV) CP-t tartalmazó konstrukció felhasználásával hoztak létre ZYMV fertőzéssel szemben ellenállóságot sárgadinnyében. Scorza és mtsai (1994) szilva hipokotil szeleteket transzformáltak PPV CP génnel. 1800 szeletből 22 transzformáns klónt kaptak, melyek közül 5 termelte a CP-t. A mRNS szint a kimutathatatlantól a nagy mennyiségig terjedt és a CP mennyiség
korrelált
a
mRNS
szinttel.
A
termelődött
köpenyfehérje
mennyiségét a beépülési kópiaszámmal és az integráció helyével hozták összefüggésbe. 1994 -ben Malnoë és mtsai számoltak be sikeres szántóföldi kísérletekről PVY CP génnel transzgénikus Bintje burgonyafajta esetében. Azt tapasztalták,
29
hogy a rezisztencia levéltetvekkel történő természetes fertőzés esetén is megmaradt, sőt a gumóval történő vírusterjedés is lelassult vagy meggátlódott. Palkovics és munkatársai (1995) az SK-68 jelű PPV izolátum köpenyfehérje génjét építették be N. benthamiana növényekbe. Két vonal esetében a „recovery” jelenséget figyelték meg, míg a vonalak nagy része rezisztens volt a fertőző PPV vírussal szemben.. Regner és mtsai (1992) is hasonló eredményekről számoltak be, azonban N. clevelandii növények esetében is megfigyelték a fertőzést áttörő, új, tünetmentes levelek kialakulását. A rezisztencia szintje és a CP expresszió között ugyanakkor fordított korrelációt figyeltek meg. Smith és mtsai (1995) PVY CP-vel transzformáltak burgonyanövényeket, melyek vizsgálata során szintén fordított korrelációt figyeltek meg a köpenyfehérje akkumuláció és a rezisztencia erőssége között. A magas fokú ellenállóképességet kifejező vonalak több transzgén kópiát tartalmaztak és alacsony alapállapotú RNS szinttel rendelkeztek. Ez a megfigyelés általánosan is jellemző a potyvírus eredetű CP gének által kiváltott ellenállóképesség molekuláris hátterére.
2.3.2.4.
A
köpenyfehérje
gén
által
indukált
rezisztencia
lehetséges
hatásmechanizmusai
A vírusszekvenciákkal transzformált növények ellenállóságát előidézhetik a fehérjék vagy a víruseredetű nukleinsavak. A proteinek által közvetített rezisztencia általában széles spektrumú, azaz többféle vírussal szemben nyújthat védelmet, azonban gyengébb hatékonyságú és vírus nukleinsavval történő fertőzés esetén áttörhető. Az RNS-ek által közvetített ellenállóság magas inokulum koncentrációval szemben is hatékony, a növény korától független
30
(fiatal növény esetében is működőképes). Az utóbbi nemcsak virionnal, hanem nukleinsavval történő fertőzést követően is megmarad és protoplaszt-szinten is fennállhat, viszont sokkal inkább vírus specifikus. A csonkított vagy kiméra CP-k alkalmazása bizonyos esetekben bővítheti a rezisztencia hatásspektrumát illetve fokozhatja hatékonyságát. Nem mutattak ki minden esetben egyértelmű korrelációt a CP akkumuláció és a rezisztencia szintje között, sőt, esetenként CP-t akkumuláló vonalak a nem-transzformáns vonalakhoz hasonlóan érzékenyek voltak a fertőzéssel szemben. A rezisztencia erőssége függ az adott vírustól és a transzformáns növényi vonaltól. A rezisztencia mértéke változó, előfordulhat csupán a tünetek erősségének csökkenése vagy időben későbbi kifejlődése, de megfigyelhető a tünetmentesség és az immunitás is. Előfordult, hogy a növények először megfertőződtek és mutatták a tipikus tüneteket, majd idővel teljesen tünetmentessé váltak (Hammond és Kamo, 1993., Lindbo és Dougherty, 1992a).
2.3.2.4.1. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia hatásmechanizmusai
A CP által közvetített rezisztencia esetében egyenes arányosság áll fenn az ellenállóság mértéke és a proteinakkumuláció szintje között. A védettség intakt virionokkal történő fertőzést követően nyilvánul meg, vírus RNS-t használva inokulumként a rezisztencia áttörhető. Működésének magyarázatára számos hipotézis született, mivel a proteinek által közvetített rezisztencia valószínűleg többféle
mechanizmus
által
fejti
ki
hatását
a
gazda-vírus-transzgén
kombinációtól függően. Előfordulhat, hogy a fertőző vírus RNS-ének egy ún. második becsomagolódása, enkapszidációja történik a transzgénről képződő CP-be, így gátolva annak terjedését. Lehetséges az is, hogy már a vírus dekapszidációja gátolt. Voltak olyan feltételezések is, hogy a köpenyfehérje a
31
vírus RNS replikációját befolyásolhatja (Baulcombe és English, 1996), valamint gátolhatja a vírus RNS kötődését a riboszómákhoz (Clark és mtsai, 1995). A legtöbb köpenyfehérje által indukált rezisztencia esetében a fertőzést követően a szisztemikus tünetek nem fejlődnek ki, vagy kialakulnak, de késéssel. Ez a jelenség a vírus sejtről-sejtre történő terjedésének, a szállítószövet-rendszerbe és a nem-inokulált levelekbe való bejutásának gátlásából adódhat, vagy a fertőzés kezdetének megakadályozásából (Beachy, 1990, Wisniewski és mtsai, 1990). Egyes vírusoknál, mint pl. a TMV, kísérletekkel alátámasztva mutatták ki a fehérjetermék közvetlen szerepét a rezisztencia kiváltásában (Powell-Abel, 1986). Powell-Abel és mtsai (1990) AUG transzlációs start kodon nélküli TMV CP-t tartalmazó konstrukcióval transzformáltak növényeket, melyek fogékonynak bizonyultak TMV fertőzéssel szemben, bizonyítva, hogy ez esetben nem a mRNS a rezisztencia kiváltója, hanem a fehérjetermék. Van Dun és mtsai (1988) csonkított AMV CP-t állítottak elő, amely nem volt alkalmas a rezisztencia kiváltására. A köpenyfehérjét expresszáló növényekből nyert protoplasztokkal végzett kísérletek alapján megállapították, hogy a transzgén által termelt CP a fertőző vírus kicsomagolódásába avatkozik be, így replikációs ciklusának kezdeti lépését gátolja. Ennek módja lehet a vírus szét- és összeszerelődési egyensúlyának eltolása az összeépülés irányába, de előfordulhat, hogy a sejten belüli vírus partikulum szétszerelődéshez szükséges speciális helyek vagy receptorok
lekötöttségében
bekövetkezett
változások
okozzák
a
kicsomagolódás-gátlást. A transzgén eredetű CP alegységek vírusszerű partikulumokat
(VLP)
képezve
elfoglalják
ezeket
a
helyeket,
így
megakadályozzák a fertőzést (Lomonosoff, 1995). Éppen ezért a CP által indukált rezisztencia függ az elsődlegesen fertőzött epidermális sejtekben megnyilvánuló CP produkciótól (Reimann-Philip és Beachy, 1993). Ezt olyan
32
kísérletekkel
bizonyították,
amelyekben
a
levél
mezofillumsejtekben
expresszáltatták a CP-t specifikus promóterrel, rezisztencia kialakulása nélkül. A CP által indukált rezisztencia kialakításához általában vad típusú vírus köpenyfehérje génjét használják, azonban Bendahmane és mtsai (1997) olyan mutáns TMV CP konstrukciókkal transzformáltak növényeket, melyek köpenyfehérje alegységei közötti kölcsönhatások kísérletenként eltérőek voltak. TMV fertőzés esetén azok a növényi vonalak bizonyultak rezisztensnek, melyek
transzgénjéről
expresszálódó
mutáns
CP
alegységek
közötti
kölcsönhatás erős volt, mivel képesek voltak vírusszerű partikulumokat létrehozni, ezáltal elfoglalni a fertőző vírus szétszerelődéséhez szükséges receptorhelyeket. Az így kialakult rezisztencia magasabb fokú volt, mint a vad típusú vírus CP-k által kiváltott. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a köpenyfehérje által indukált rezisztencia kialakításában fontos szerepet játszanak a transzgén eredetű- és a fertőző vírus eredetű köpenyfehérje alegységek közötti kölcsönhatások.
2.3.2.4.2. Az RNS-ek által közvetített rezisztencia hatásmechanizmusai, a géncsendesítés jelensége
A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia tanulmányozásában számos olyan példa található, amelyekben a rezisztencia a transzgénről származó fehérjetermék hiányában is kialakul. Ilyenkor a transzgénikus növényekben a védettséget maga a transzgén vagy az erről átíródott transzkriptum váltja ki. A jelenséget
megfigyelték
pl.
a
TSWV
köpenyfehérje
génnel
való
transzformációkor De Haan és mtsai (1992), PVY esetében Van der Vlugt és mtsai (1992) és TEV-nél Lindbo és Dougherty (1992b). Az RNS által
33
közvetített rezisztencia, amely a géncsendesítés (gene silencing) mechanizmusa által nyilvánul meg, jellemzően alacsony vagy nem detektálható transzgén expresszióval jár együtt. Mechanizmusának kutatását előremozdította a „recovery” jelenség felfedezése és vizsgálata (Lindbo és Dougherty, 1992a, Lindbo és mtsai, 1993b). TEV-vel inokulált transzgénikus növények kezdetben mutatták a fertőzés tüneteit, majd 3-5 héttel később a fiatal, kifejlődő levelek tünet- és vírusmentesek voltak. A felépült növények a későbbi TEV fertőzéssel szemben is ellenállóak voltak. A növényeknek számos módszerük van a vírusfertőzés elkerülésére, ezek egyike a géncsendesítés, amikor a vírus RNS egy szekvenciaspecifikus mechanizmus által degradálódik (Carrington és mtsai, 2001). Az antiszensz konstrukciókkal kiváltott rezisztencia gyakran nagyobb hatékonyságú, mint ugyanaz a szekvencia szensz orientációban (Smith és mtsai, 1995). Az RNS által közvetített rezisztencia egyik fajtája a homológia-függő rezisztencia, mivel kialakulása a transzgén és a célszekvencia (vírus RNS) közötti homológiától függ (Sonoda és mtsai, 1999, Mäki-Valkama és mtsai, 2000). A jelenség működésének magyarázatára egy kvantitatív és egy kvalitatív modellt állítottak fel. A kvantitatív modell szerint ha a transzgén eredetű RNS szint meghalad egy küszöbértéket, aktiválódik egy citoplazmatikus RNS degradáló mechanizmus, mely lebontja az endogén és az ezzel homológ exogén vírus RNS-eket. Ezzel a modellel magyarázták a felépülési jelenséget is. A küszöbérték átlépéséhez azonban nagy transzkripciós aktivitás vagy nagyobb beépülési kópiaszám szükséges (Lindbo és mtsai, 1993a, Smith és mtsai, 1994, Goodwin és mtsai, 1996). A kvalitatív jellegű modell alapeleme a normál poliadenilált traszkriptumoktól eltérő, un. aberráns RNS-ek képződése, melyek egy szekvenciaspecifikus RNS degradáló mechanizmus által lebontódnak (Mueller és mtsai, 1995, English és mtsai, 1996). A géncsendesítésnek két
34
fajtája van: egyik a transzkripcionális géncsendesítés, mely a sejtmagban nyilvánul meg. Ekkor a gének nem íródnak át DNS metiláció vagy promóter inaktiváció következtében. A másik a poszttranszkripcionális géncsendesítés, mely a citoplazmában történik. Ez esetben a gének átíródnak, de a transzkriptumok
már
degradálódnak.
géncsendesítésnek
(hatástalanításnak)
három
A
poszttranszkripcionális
szakasza
különíthető
el:
kiváltódás, terjedés és fenntartás (Voinnet és mtsai, 1998, Palauqui és Balzergue, 1999) és három fő tulajdonsága van: adaptív, mobilis és specifikus (Voinnet, 2001). A mechanizmus aktiválódhat transzgén vagy vírus eredetű, nagy mennyiségű duplaszálú RNS (dsRNS) molekulák által (mivel egészséges, nem transzgénikus növényben dsRNS nincs). A mechanizmus eredményezheti a homológ RNS-ek degradációját a citoplazmában és a homológ nukleáris DNS-ek metilációját a sejtmagban (Matzke és mtsai, 2001). A dsRNS-ek az RNS vírusok replikációjának köztitermékeként is termelődhetnek. Ezt egy dsRNS-specifikus nukleáz (Dicer) ismeri fel és hasítja ssRNS-ekké, így mindkét polaritású, a géncsendesítésre jellemző 21-23 nukleotid hosszúságú kis RNS molekulák jelen vannak a sejtben, melyek a további RNS degradáció irányítói (Bass, 2000, Dalmay és mtsai, 2000a, b). Ezek valószínűleg különböző RNáz-szerű proteinekhez kapcsolódnak, szekvencia-specifikus nukleázokká alakítva őket, melyek képessé válnak a célszekvenciák felismerésére (Carrington és mtsai, 2001). A DNS-metiláció szabályozásával közvetve az aberráns RNS-ek képződésében is szerepet játszanak. Kezdeti lépés lehet aberráns RNS-ek kialakulása is, mely többféleképpen történhet, pl. metilációval vagy az ektopikus párosodás (ectopic pairing) jelensége által (Vaucheret és mtsai, 1998). Ez esetben a transzgének és a homológ endogének közötti bázispárosodás interferál a transzkripcióval, így nyújtva lehetőséget aberráns RNS-ek létrejöttére (Baulcombe és English, 1996). Mivel ezek az aberráns
35
RNS-ek bizonyos szintű homológiát mutatnak az eredeti transzkriptumokkal, szintén templátként szolgálhatnak az RNS függő polimerázoknak, így számos rövid
komplementer
szekvenciát
képeznek,
melyek
a
funkcionális
transzkriptumokhoz hibridizálhatnak és az így kialakuló kétszálú RNS-eket specifikus RNázok lebonthatják. Palauqui és mtsai (1997) oltási kísérleteket végeztek koszupressziót mutató alanyt és koszupresszió nélküli oltványt használva, mely homológ transzgént hordozott.
A
transz-
és
endogének
lecsendesítése
minden
esetben
bekövetkezett. A jelenséget szisztemikus, szerzett géncsendesítésnek nevezték el. Megfigyeltek azonban géncsendesítést olyan estekben is, amikor promóter nélküli
transzgénkonstrukcióval
(petunia
chalcon
szintáz
génnel)
transzformáltak növényeket. Ez arra utal, hogy maga a szekvenciahomológiát mutató DNS szakasz is képes indukálni a folyamatot akár szensz akár antiszensz orientációban (Sijen és Kooter, 2000). A poszttranszkripcionális géncsendesítés terjedése a vírusok, viroidok terjedéséhez hasonlóan, a plazmodezmákon és a phloem-en keresztül történik. A terjedését egy nem-metabolikus, gén-specifikus szignál biztosítja, ami akár RNS is lehet (Waterhouse és mtsai, 2001b). Mivel a mobilis szignál terjedése a vírusterjedéssel paralel, így a fertőzés bekövetkezése a szignál és vírus növényen belüli terjedési idejétől függ. (Vaucheret és Vance, 2001). Ha a vírus gyorsabb, kialakul a szisztemikus fertőzés, ha a szignálterjedés gyorsabb, akkor a vírus olyan sejteket talál, ahol a géncsendesítési apparátus már készen áll, így elmarad a fertőzés. Egyes feltételezések szerint a 21-23 nt RNS-ek nemcsak a Dicer-komplex degradációjának eredményei, hanem azok a jelek is, amelyek bejutnak a sejtmagba és a DNS metilációt irányítják, valamint sejtről-sejtre terjedve az RNS degradációt és a DNS metilációt szabályozzák (Waterhouse és mtsai, 2001a). Mások szerint az aberráns RNS-ek is részt vehetnek a
36
terjedésben, és a szignál lehet a metilált target gén egy módosított alakja vagy maga a dsRNS. Oltási kísérletekkel azonban kimutatták (Mallory, 2001), hogy valószínűleg nem a dsRNS-ek a szignálmolekulák. A géncsendesítő mechanizmust elsőnek transzgénikus növényekben figyelték meg, ahol a transzgén és az azzal homológ endogén inaktiválódott. Mivel a vírusok mind kiváltói, mind célpontjai lehetnek a géncsendesítésnek, feltételezhető, hogy a poszttranszkripcionális géncsendesítés egy természetes növényi antivirális reakció. Ez a jelenség egy olyan hatékony mechanizmus, mely idegen RNS molekulák ellen irányul, amelyek lehetnek ssRNS-ek és dsRNS-ek és ha egyszer aktiválódott, bármely más, a citoplazmában előforduló szekvenciahomológiát mutató RNS-ekkel szemben működésbe lép. A tobamo-, potex- és geminivírusok aktivátorai és célpontjai a géncsendesítésnek megfelelő nukleinsavhomológia
esetén.
A
caulimo-
és
nepovírusok
a
poszttranszkripcionális géncsendesítéshez hasonló reakciót indukálnak, mint rezisztenciamechanizmust, akkor is, ha nincs szekvenciahomológia a vírus és a nukleáris gének között (Ratcliff és mtsai, 1997, Covey és mtsai, 1997). Ezáltal a szisztemikusan fertőzött levelek tünetmentesekké válnak, lecsökken a vírusszám és kialakul egy RNS szekvenciaspecifikus rezisztencia a fertőző vírussal szemben. A vírusok is kifejlesztettek valamiféle védekező mechanizmust a poszttranszkripcionális géncsendesítésének elkerülésére vagy gyengítésére. Megfigyelték pozitív szálú RNS és DNS vírusoknál is, hogy vírusfertőzéskor korábban lecsendesített gének is reaktiválódhatnak. Néhány vírus olyan fehérjéket kódol, amelyek képesek a géncsendesítést visszaszorítani, azáltal, hogy a fertőzéskor képződő szignál létrejöttére vagy mozgására hatnak. Az eddig felismert szupresszorok a következők: a potyvírusok Hc-Pro fehérjéje, a potexvírusok p25 fehérjéje, a cucumovírusok 2b-, a sobemovírusok P1-, a
37
tombusvírusok p19- és a geminivírusok Ac2 fehérjéje (Brigneti és mtsai, 1998, Li és mtsai, 1999, Voinnet és mtsai, 1999, Marathe és mtsai, 2000). Megemlítendő, hogy ezek a szupresszorok azonban eltérőek evolúciós eredetükben, szekvenciáikban, struktúrájukban és funkcióikban. Brigneti és mtsai (1998) GFP-t expresszáló N. benthamiana növényeket infiltráltak azonos GFP konstrukciót hordozó Agrobacterium tumefaciens-szel, majd 10 nappal később teljes géncsendesítést tapasztaltak. A koszupresszió megjelenését követően a növényeket fertőzték PVY-nal, CMV-vel és PVX-szel. A PVY és CMV esetében a GFP poszttranszkripcionális gén csendesítésének gátlását tapasztalták a vírusok okozta tünetek mellett, míg a PVX nem hatott a jelenségre. A mechanizmus vizsgálata érdekében a PVY és a CMV egyes fehérjéit expresszáltatták PVX vektorban, és kimutatták, hogy a PVY HC-Pro és
a
CMV
2b
proteinek
részt
vesznek
a
poszttranszkripcionális
géncsendesítésének gátlásában. A PVY és a CMV vírusok fehérjéi a növény eltérő részein szupresszálják a géncsendesítést, így ezek valószínűleg a folyamat különböző szakaszait blokkolják. Feltételezték, hogy a jelenséget inkább a proteinek váltják ki, mint az RNS-ek, ugyanis a PVX vektorba épített módosított, nem transzlálódó szekvenciák nem idéztek elő szupressziót. A HCPro valószínűleg a poszttranszkripcionális gén csendesítés fenntartását gátolja, míg a 2b protein a szignál bejutását, azaz a jelenség kialakulását akadályozza meg. Goodwin és mtsai (1996) TEV CP konstrukcióval transzformált növényeken végzett vizsgálatok alapján megállapították az RNS által kiváltott rezisztencia és a transzgén beépülési kópiaszáma közötti összefüggéseket. Azt tapasztalták, hogy egy vagy két kópiában történő beépülés „recovery” fenotípust eredményez, három vagy több kópia pedig magas szintű rezisztenciát vált ki, melyben a poszttranszkripcionális RNS degradáló mechanizmus a vírus
38
eredetű RNS célszekvencia specifikus hasításával lép működésbe, intermedier termékeket képezve. Azok a növényi vonalak pedig, melyek nyolcnál több transzgén kópiával rendelkeznek, fogékonyak voltak TEV fertőzéssel szemben. Ezekben az esetekben a transzgén transzkripcióját nem tudták kimutatni, ami egy DNS-szintű géncsendesítési mechanizmus jelenlétére és működésére utal. Mäki-Valkama és mtsai (2000) PVYO törzs P1-génnel transzgénikus Pito burgonyanövényeket fertőztek PVYN törzzsel, és nem tapasztaltak védettséget, csupán PVYO fertőzés esetében. A jelenség érdekessége az, hogy a két törzs P1 génjei 96%-nál nagyobb homológiával rendelkeztek és kimutatható struktúrális eltérés sem volt közöttük. Az eredmények alapján feltételezték, hogy a közel azonos transzgén- és célszekvenciák ellenére nemcsak a homológiának, hanem más egyéb faktoroknak is szerepe lehet a géncsendesítés megnyilvánulásában.
2.3.2.5. Kockázati tényezők a köpenyfehérje által mediált keresztvédettség technológiájának felhasználása esetén
A legtöbb növényi vírus RNS a köpenyfehérjébe csomagolódik be, ez azonban nemcsak védi azt, hanem részt vesz különféle interakciókban a gazdanövény és a vírus replikációjának egyes szakaszainál. A CP funkciói függnek az adott vírustól, ami lehet pl. replikációs szerep (AMV), növényen belüli mozgás (TMV), felismerési pont a gazdanövény rezisztenciamechanizmusaiban (TMV) és részt vehet a vektorokkal történő vírusterjedésben (Tepfer, 1993). A CP általi rezisztencia többnyire csak a donorvírussal szemben hatékony, olykor a közeli rokon vírusok esetében is, de legritkábban a távolabbi rokon vagy nem-rokon vírusokkal szemben. Ezért egy transzgénikus növényt
39
legvalószínűbben egy távoli rokon vagy nem-rokon vírus fertőzhet meg, így számolnunk kell a transzgén és a fertőző vírus közötti esetlegesen előforduló interakciók kialakulásával. A transzgénikus növényekben expresszálódó vírusgének három különböző jelenség következtében hordoznak magukban kockázati tényezőt: hetero/transzkapszidáció, rekombináció, szinergista hatás.
2.3.2.5.1. Hetero- és transzkapszidáció
A köpenyfehérje gént expresszáló növényekben egy esetleges rokon vírustörzs felülfertőződése során kialakulhat a hetero- vagy transzkapszidáció jelensége, ami annyit jelent, hogy a felülfertőző vírus RNS-ét a transzgénből származó CP csomagolja be részben vagy egészben, kialakítva a viriont. A hetero- vagy transzkapszidáció gyakorisága hasonlóan a rekombinációhoz a kevert fertőzések miatt jól ismert jelenség a növénykórtanban. Az egyik kockázati tényezőt az jelentheti, ha olyan CP képződik a növényben, amely a vírus vektorokkal való terjedését segíti és így egy eredetileg vektorral nem terjedő vírus heteroenkapszidációja lehetővé teszi ennek a vírusnak pl. levéltetvekkel történő újabb növényre terjedését. A PPV CP-t expresszáló transzgénikus növényekben ZYMV ’NAT’ törzs levéltetvekkel történő átvitelét tapasztalták Jaquet és mtsai (1998a), miközben ez az izolátum a saját köpenyfehérjéje által levéltetvekkel nem képes terjedni. Mivel a vírus genomjában változás nem történt, az új növényen már az eredeti állapot állt helyre, azaz ott már nem alakult ki a transzkapszidáció. Ugyanezt a jelenséget korábban is megfigyelték Atreya és mtsai (1991), Bourdin és Lecoq (1991) ill. Candelier-Harvey és Hull (1993).
40
Jacquet és mtsai, (1998b) pl. DAG aminosav triplet nélküli CP transzgénkonstrukció használatával mutatták ki ennek a kockázati tényezőnek az egyik elkerülési lehetőségét. A fehérje alegységek közül némelyik ugyan részt vesz a heteroenkapszidációban, azonban a DAG triplet hiányában a géntermék a levéltetűvel való terjedést nem teszi lehetővé. Csonkított CP génkonstrukciókkal is sikerült keresztvédettséget kialakítani, amely konstrukció terméke nem képes a vírus RNS-t becsomagolni, tehát a vírus nem tud terjedni, miközben a keresztvédettség jelensége megfigyelhető (Lecoq és mtsai, 1993). Varrelmann és Maiss (2000) mutáns PPV CP géneket építettek fertőzőképes, teljes hosszúságú PPV klónba, melyben megváltoztatták a virion összeszerelődéséhez szükséges (R3015Q3016 és D3059) motívumokat. Az így létrehozott konstrukciókkal fertőztek transzgénikus, vad típusú PPV CP-t expresszáló- és nem transzgénikus N. benthamiana növényeket. A nem transzgénikus növényekben nem tapasztaltak vírusterjedést és a virionok sem alakultak ki, míg a CP-t expresszáló növényekben megfigyelték a vírus szisztemikus mozgását és a víruspartikulumok összeszerelődését. A vad típusú vírus CP-t tartalmazó fertőzőképes klón esetében a nem transzgénikus növényekben azonban megfigyelték a vírus mozgását, ezzel bebizonyították, hogy a mutáns klónok esetében a szisztemikus fertőzés hiányát egyedül a vírus CP összeszerelődési motívumainak megváltoztatása okozta. Ezeket az eredményeket
felhasználva
létrehoztak
transzgénikus
N.
benthamiana
növényeket, melyek a mutáns CP-ket expresszálták. A korábbi megfigyeléseket igazolva a transzgénikus növények fertőzését követően a heteroenkapszidáció kialakulásának jelentős csökkenését állapították meg a transzgén eredetű CP-k és a fertőző potyvírusok köpenyfehérjéi között.
41
A különböző kísérletekben felvázolt transzgén konstrukciók (melyek különféle köpenyfehérje modifikációkat kódolnak) megfelelő és körültekintő alkalmazásával a hetero- és transzkapszidáció veszélye bizonyíthatóan minimálisra csökkenthető.
2.3.2.5.2. Homológ és heterológ rekombináció
Vírus
eredetű
köpenyfehérje
gént
expresszáló
növény
esetleges
felülfertőződése rokon vírussal nem különbözik a természetben is meglévő fogékony növényben előforduló két vagy több vírussal történő szimultán fertőződéstől. Ezt a jelenséget minden egyes vírus esetében megtaláljuk, hiszen szinte kivétel nélkül több vírustörzs van jelen egy fertőzött növényben. Irodalmi adatok szerint egy természetes vírusfertőzés esetén például a polio- és influenzavírusoknál a rekombináció elérheti a 35%-os gyakoriságot, a növényi vírusoknál azonban ez a szám nagyságrendekkel kisebb. Azonosításra kerültek a CP gént kódoló RNS 3’ végén elhelyezkedő rekombinációs „forró pontok”, melyek eltávolítása mellett is sikerrel lehet olyan konstrukciókat előállítani, amelyekkel
a
keresztvédettség
indukálható.
A
CP
gént
expresszáló
növényekben, ha azok ellenállóak, elvileg vírussal nem fertőzhetők felül, így a rekombináció sem alakulhat ki. Falk és mtsai (1994) szerint a korábbiaktól eltérő,
új
károkat
okozó
vírusok
nem
a
transzgénekkel
történő
rekombinációkból eredhetnek, hanem a már meglévő vírusgenomok közötti variációkból.
A
vírusevolúció
szerves
részének
kell
tekintenünk
a
rekombinációt, melynek gyakorisága a természetben igen alacsony értéket mutat, vagyis nehezen mutatható ki, mivel a replikáció alatt leggyakrabban homológ szakaszok között jön létre (Bruyere és mtsai, 2000). Kísérleti adatok
42
szerint a transzgénikus növényekben előforduló rekombináció gyakorisága messze
elmarad
a
természetben
előforduló
vírusfertőzések
esetében
kialakulóktól (Vö. Tepfer és Balázs 1997). Chiang és mtsai (2001) különböző összetételű rekombináns CP gént hordozó PRSV-vel és PRSV-HA CP génnel transzgénikus papaya növényeken végeztek kísérleteket a vírusok virulenciájának vizsgálatára. Megfigyelték, hogy a vírus fertőzőképessége nagyobb mértékben függ a transzgén CP és a vírus kiméra CP-je közötti szekvenciaazonosság helyzetétől, mint a fokától. A rekombinánsok virulenciájának eltéréseire magyarázatként szolgálhat a géncsendesítés jelensége. Megállapították, hogy a PTGS elsősorban a transzgén 3’ vég régióját célozta meg, ezért ha a vírus CP génje és a transzgén 3’ régiója homológ, akkor a fertőzés enyhébb, vagy el is maradhat.
2.3.2.5.3. Szinergizmus
A növénykórtanban jól ismert az a jelenség, amikor két vagy több vírus ugyanazon növényegyeden történő együttes fertőzésekor kialakuló tünetek súlyosabbak, mint a vírusok külön-külön okozott tünetei. Jól példázza ezt a burgonya X vírus és Y vírus együttes fertőzése esetén a növény igen súlyos kórképe, amely akár teljes pusztuláshoz is vezethet. A jelenség érdekessége az, hogy a burgonya X vírus egyedüli fertőzés esetén szinte tünetmentes a burgonyanövényen. Nem tudjuk még, hogy egyes vírusgének megnyilvánítása a kultúrnövényekben egy felülfertőző vírussal együttesen kialakíthat-e ilyen szinergista hatást, azaz a betegség kórképének megváltozását, vagy a növény esetleges pusztulását. Ennek a rizikótényezőnek a kísérletes tanulmányozása mindenképpen napjaink és a jövő feladata.
43
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. ANYAGOK 3.1.1. Növényi anyag A transzformációs kísérletben felhasznált növények a Magyarországon régebben elterjedt, ma már érzékenységük miatt a köztermesztésből kiszorult, steril körülmények között, táptalajon nevelt Solanum tuberosum L. cv Mindenes (M) és Somogyi Kifli (SK) magyar burgonyafajták, melyek a Veszprémi Egyetem
Georgikon
Mezőgazdaságtudományi
Kar
Burgonyakutatási
Osztályának génbankjából, Keszthelyről származnak. A Nicotiana tabacum Virgin D (VD), Stamm C2 (SC) és Hevesi 11 (H11) dohányfajták az AGROTAB Nemesítő és Vetőmagtermeltető Kft-ből (Debrecen- Pallag) származnak. A Virgin D német fajta, a Stamm C2 német nemesítési vonal, míg a Hevesi 11 magyar fajta, melytől az állami elismerést visszavonták a vírusérzékenysége miatt. Mindhárom fajta rendelkezik bizonyos szintű genetikai vírus-ellenállósággal a PVY-nal szemben, azonban ez egy erősebb fertőzöttségű évben nem nyújt megfelelő védelmet. A burgonyanövények fenntartása steril hajtáscsúcs-tenyészetek formájában, RB táptalajon (Ishida és mtsai, 1989), míg a dohánynövények fenntartása hasonlóképpen,
de
RM
táptalajon
történt,
körülmények között (23 oC, 16 óra megvilágítás).
fényszobában,
kontrollált
44
3.1.2. Vírusizolátum A kísérletben használt PVY-H a nekrotikus törzsek közé tartozó magyar izolátum, Dr. Beczner Lászlótól származik (Növényvédelmi Kutatóintézet, Budapest), melynek jellegzetessége, hogy a burgonyagumón és a bogyón nekrotikus gyűrűsfoltosságot okoz, illetve rezisztencia áttörő képességgel is rendelkezik. Az izolátum patológiailag (Beczner és mtsai, 1984) és molekulárisan is jellemzett (Thole és mtsai, 1993). A PVY-H vírustörzs folyamatos fenntartásához és felszaporításához Nicotiana tabacum cv Xanthi-nc dohányfajtát használtunk. 3.1.3. Génkonstrukció A növények transzformálásához az MBK virológia csoportjában korábban előállított génkonstrukciót tartalmazó pGAYHCP plazmidot használtuk (Kollár és
mtsai,
1993).
A
pGA482
növényi
expressziós
vektor
alapú
génkonstrukcióban az AUG transzlációs start kodonnal ellátott PVY-H köpenyfehérje gén a karfiolmozaik vírus (CaMV) 35 S promóter és a NOS terminációs szabályozórégiók között helyezkedik el. A plazmid tartalmaz tetracyclin és kanamycin rezisztenciagéneket is (6. ábra).
45
6. ábra A transzformációkhoz használt génkonstrukció sematikus ábrája
3.1.4. Baktérium törzs A növényi transzformációhoz a Rhizobiaceae családba tartozó Gramnegatív Agrobacterium tumefaciens talajbaktérium C58C1 (Rifr) törzsét használtuk (Zambryski és mtsai, 1983). A pGAYHCP plazmidot tartalmazó Agrobacterium törzset antibiotikumokkal kiegészített YEP táptalajon tartottuk fenn. Átoltáskor 2-3 napig 28 oC-on, majd 4 oC-on tároltuk. A növényi transzformációt megelőzően pedig folyékony CPY tápoldatban szaporítottuk fel. 12-24 óráig, 30 oC-on rázatva 180-200 fordulat/perc.
46
3.1.5. Táptalaljok, tápoldatok CCC táptalaj (Ishida és mtsai, 1989): /1000ml/: 50ml MSI (20x makro) /Murashige and Skoog, 1962/, 5ml MSII (200x mikro), 5ml MSIII, 5mg BA, 500mg CCC /klór-kolin-klorid/, 2mg glicin, 0.5mg nikotinsav, 0.5mg piridoxin, 0.4mg thiamin, 100mg mezoinozit, 80g szacharóz, 6.5g agar, pH: 5.8. CPY tápoldat /1000ml/: 1g Bacto yeast extract, 5g pepton vagy kazeinhidrolizátum, 5g szacharóz. G80 táptalaj /1000ml/: 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 2.5mg thiamin, 12.5mg piridoxin, 12.5mg nikotinsav, 10mg AgNO3, 50mg glicin, 0.5mg folsav, 0.05mg biotin, 100mg mezoinozit, 30g szacharóz, 6.5g agar, pH: 5.7, 500mg cefotaxim, 80mg kanamycin. MSS táptalaj /1000ml/: 50 ml MSI, 5 ml MSII, 5ml MSIII, 100mg mezoinozit, 0.4g thiamin, 0.5mg nikotinsav, 0.5mg piridoxin, 1mg BAP, 1mg NAA, 30g szacharóz, 6.5g agar, pH:5.8 MSR táptalaj /1000ml/: 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 100mg mezoinozit, 0.4g thiamin, 0.5mg nikotinsav, 0.5mg piridoxin, 2mg glicin, 1mg IAA, 20g szacharóz, 6.5g agar, pH:5.8 MSI /1000ml/: 33g NH4NO3, 38g KNO3, 8.8g CaCl2.H2O, 7.4g MgSO4, 3.4g KH2PO4. MSII /500ml/: 0.083g KJ, 0.062g H3BO4, 0.223g MnSO4.4H2O, 0.025g NaMo4.2H2O, 0.086g ZuSO4.7H2O, 0.0025g CuSO4.5H2O, 0.0025g Cl2.6H2O. MSIII /100ml/: 0.55g FeSO4.7H2O, 0.74g Na2EDTA. RB táptalaj (Ishida és mtsai, 1989): /1000ml/ 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 0.4mg thiamin, 100mg mezoinozit, 30g szacharóz, 6.5g agar, H2O, pH: 5.7
47
RB1 táptalaj (Ishida és mtsai, 1989): /1000ml/ : 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 0.4mg thiamin, 100mg mezoinozit, 20g szacharóz, 6.5g agar, pH: 5.7 RB2 táptalaj (Ishida és mtsai, 1989): /1000ml/: 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 2.5mg thiamin, 12.5mg piridoxin, 12.5mg nikotinsav, 50mg glicin, 0.5mg folsav, 0.05mg biotin, 100mg mezoinozit, 0.03mg NAA (naftil-ecetsav), 1mg BA, 0.5mg zeatin, 10mg AgNO3, 30g szacharóz, 6.5g agar, pH: 5.8, 50mg kanamycin, 500mg cefotaxim. RM táptalaj /1000ml/: 50ml MSI, 5ml MSII, 5ml MSIII, 20g szacharóz, 6.5g agar, pH:5.8. YEP táptalaj /1000ml/: 10g Yeast Extract (élesztőkivonat), 10g pepton, 5g NaCl, 15 g agar, pH: 7.0, 25mg kanamycin, 100mg rifampicin, 5mg tetracyclin.
3.1.6. Oldatok, pufferek Prehibridizáló és hibridizáló oldat (Sambrook és mtsai,1989): 5x SSPE, 5x Denhard's oldat, 0.5%-os SDS, 1mg Yeast RNA, 50% H2O. Extrakciós puffer /60ml/: 3ml 1M Tris-HCl, 1.2ml 5M NaCl, 120µl 0.5M EDTA, 3ml 10% SDS, 2-ME (merkapto-etanol) 0.3%, pH:7.6. Hibridizációs mosóoldat: 100ml 20xSSC, 5ml 10%-os SDS, 895ml H2O. PCR reakció: templát DNS (10µl-ben), 3 µl MgCl2 (25mM) USB, 5 µl Buffer (10x), 2 µl dNTPs (5mM), 1-1 µl oligonukleotid (0.15 µg/ µl), 2.5 unit Taq polimeráz, 27.5 µl H2O. 10x TBE puffer /1000ml/: 121.1g Tris, 51.35g bórsav, 3.72g EDTA-Na, pH: 8.3.
48
20xSSC oldat /1000ml/: 175,3g NaCl, 88,2g Na-citrát, pH: 7.0.
3.2. MÓDSZEREK 3.2.1. Módszerek transzgénikus növények előállításához 3.2.1.1. Növény transzformáció
A növények felszaporításához és transzformációjához steril tenyészetekből indultunk ki. A PVY-H CP gént tartalmazó PGAYHCP plazmidot Agrobacterium tumefaciens segítségével építettük be burgonya- és dohánynövényekbe. A transzformációhoz 28 oC-on, egy éjszakán át növesztett baktériumkultúrát, kb 0.5-1 cm-es levélkorongokat és szárszegmenseket, valamint burgonya esetében 0.5-1 cm-es mikrogumók 2-3 mm-es korongjait használtuk (Ishida és mtsai, 1989). A levéldarabkák esetében a sebzési felületet steril szikével történő bemetszésekkel növeltük. A növényi részeket petricsészébe helyeztük antibiotikummentes RM (dohány), illetve RB1 (burgonya) táptalajra, majd ezek felületére pipettával cseppentve vittünk fel 5-20 µl folyékony CPY tápoldatban felszaporított Agrobacterium tenyészetet. A 2 napon át fényszobában, kontrollált körülmények között inkubált mikrogumó korongokat illetve a levélés szárszegmenseket a baktérium elölése céljából 0.5-3 órán át 500mg/l cefotaxim oldatban mostuk, majd megszárítottuk.
49
3.2.1.2. Hajtásindukálás
A lemosott, majd megszárított mikorgumó korongokat, szár- és levélszegmenseket kanamycint (300mg/l) és cefotaximot (500mg/l) tartalmazó RB2 táptalajra helyeztük burgonya esetében (Ishida és mtsai, 1989), míg dohánynövényeknél MSS táptalajra és fényszobában 23
o
C-on, 16 órás
megvilágítás mellett neveltük. A tenyészeteket 2 hetente új RB2 illetve MSS táptalajra helyeztük át. 4-5 hét elteltével jelentek meg a hajtások a mikrogumó korongok illetve a levél- és szárszegmensek szélein.
3.2.1.3. Gyökereztetés
Két- három hét elteltével az 1-2 cm-es méretet elért burgonyahajtásokat steril körülmények között leválasztottuk a mikrogumó-, levél- vagy szárdarabkákról, majd G80, 80 mg/l kanamycint tartalmazó ún. gyökereztető táptalajba helyeztük 100ml-es Erlenmeyer lombikba, illetve "Magenta" és VEGBOX® műanyag dobozokba. A mikrogumó-, levél- és szárszegmenseket friss RB2 táptalajra helyeztük vissza, újabb hajtásnövekedést indukálva. Dohánynövényeknél ugyanezen célból az MSR, 150 mg/l kanamycint tartalmazó táptalajt használtunk.
3.2.1.4. Kiültetés üvegházba
Megfelelő
méretű
gyökérzet
kifejlődésekor
a
maradék
táptalajt
leválasztottuk, majd lemostuk a növényekről, és a gyökeres hajtásokat steril földbe ültettük, illetve üvegházi körülmények között neveltük tovább.
50
Folyamatos fenntartásukat egyrészt fényszobában, másrészt üvegházban önmegtermékenyítéssel
és
magfogással
a
dohányfajtáknál
illetve
a
burgonyafajtáknál az előző évben megtermelt gumóik folyamatos elültetésével biztosítottuk. 3.2.2. Transzgénikus növények vizsgálata 3.2.2.1. A köpenyfehérje gén integrációjának vizsgálata
A transzgén beépülését a növényi genomba PCR-rel (polymerase chain reaction) vizsgáltuk. A növényi DNS kivonása Rubino és mtsai (1992) által leírt módszer szerint történt. A kb. 200mg-os levéldarabkákat 400 µl extrakciós pufferrel dörzscsészében eldörzsöltük. 2 µg kivont növényi DNS-t és két, a PVY CP génre és a 3 NTR-re tervezett oligonukleotid primert használtunk, melyek a 8776-8800 illetve a 9376-9394 nukleotid szakaszokkal homológok: YCP 2 oligonukl. pr.: 5’-CACTTGCTCGAGTATGCTCCACAGC- 3’, YCP 4 oligonukl. pr.: 5’-CGTCCGGAGAGACACTACA –3’. A primerek egy 618 bp-nyi DNS szakasz kiemelését tették lehetővé. Az 5 perces 94 oC-os denaturáló lépést 35 ciklus követte (15 sec 94 oC, 30 sec 60 oC, 90 sec 72 oC). Az utolsó polimerizáló lépés 10 percig tartott. Mindezt Perkin Elmer Cetus / DNA Thermo File készülékkel végeztük. A PCR termékeket gél elektroforézissel és Southern hibridizációval (Sambrook és mtsai, 1989) ellenőriztük: a PCR termékeket 1:1 arányban kloroformmal extraháltuk, majd 10 µl-t mintánként 1%-os agarózt tartalmazó TBE gélben megfuttattunk 120 V feszültség mellett. A DNS-t 20xSSC oldat által Hybond-N membránra (Amersham) blottoltuk, majd a DNS megkötődése érdekében a membránt 3 percre UV fény alá helyeztük.
51
o
A prehibridizálás és a hibridizálás 65 utasításai szerint történt. A próba jelölése
T7
C-on, a gyártó (Amersham)
Quick Prime Kit alapján, random
priming úton történt a gyártó (Pharmacia Biotech) előírásai szerint. A jelöléshez 17 µl 25-50ng-ot tartalmazó pGAPVYHCP plazmidot és α-32P dCTP izotópot használtunk, majd másnap hibridizációs mosóoldatban történő többszöri mosás után a membránról autoradiogramot készítettünk.
3.2.2.2. Transzgén expresszió vizsgálata
Az
RNS
átíródását
Northern
analízissel
vizsgáltuk.
A
növényi
totálnukleinsavat White és Kaper (1989) által leírt módszer szerint izoláltuk, formaldehidet tartalmazó gélen elválasztottuk, majd Hybond-N membránra (Amersham) blottoltuk. A mintákat ezután α-32P dCTP izotóppal jelölt próbával hibridizáltattuk 42 oC-on, az Amersham által megadott leírás szerint. A géntermék megjelenésének kimutatására Western analízist (Sambrook és mtsai, 1989) végeztünk. A levélből kivont összes proteint 12 %-os poliakrilamid
gélen
elválasztottuk,
majd
Hybond-C
extra
membránra
(Amersham) blottoltuk. A megkötött fehérjék kimutatásához a kereskedelmi forgalomban kapható alkalikus foszfatázzal konjugált anti- PVY CP antitestet (Boehringer Mannheim GmbH) és kromogenikus szubsztrátjait (5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphatepara-toluidine-t chloride) használtuk.
és
para-nitro-blue-tetrazolium-
52
3.2.2.3. Rezisztenciavizsgálatok 3.2.2.3.1. A mesterséges fertőzés és körülményei A transzgénikus dohánynövényeket tisztított PVY-H -val fertőztük az ellenállóképesség vizsgálatának céljából. 0.1M-os Na-foszfátpufferrel (pH:7.2) hígított 0.5 µg/ml, 5 µg/ml és 20µg/ml víruskoncentrációt használtunk a dohányvonalak fertőzéséhez (1.táblázat). A Virgin D dohányfajta esetében 6 vonalat, az Stamm C2 és a Hevesi 11 fajtáknál 12-12 vonalat fertőztünk. Vonalanként 3-3 dohánynövényt használtunk egy-egy víruskoncentrációhoz. Az alsó két levelet fertőztük mechanikailag, carborundum por és üvegspatula segítségével. A mintavétel a fertőzést követő 5., 10., 15., 20. és 25. napon történt a növények felsőbb leveleiből. A minták kiértékeléséhez dot-blot analízist végeztünk. A fertőzést követően a növényekből kivont RNS-t HybondN
membránra
(Amersham)
csepegtettük
kétféle
koncentrációban.
A
membránról α-32P dCTP izotóppal jelölt CP specifikus próbával történő hibridizációt követően autoradiogramot készítettünk.
53
1. táblázat Az üvegházi rezisztenciavizsgálatok paramétereinek összefoglaló táblázata.
Megfertőzött dohányvonalak
Fertőzéshez használt víruskoncentráció (PVY-H)
Mintavétel ideje (dpi)
Virgin D: 6 vonal 0.5 µg/ml
5, 10,
Stamm C2: 12 vonal
5 µg/ml
15, 20,
20 µg/ml
25.
Hevesi 11: 12 vonal
3.2.2.3.2. Szabadföldi kísérletek
22 Mindenes és 4 Somogyi Kifli transzgénikus burgonyavonalat vontunk be a szántóföldi vizsgálatokba. Ezek egy részével 1999-ben kezdődtek a kísérletek, míg egy másik csoporttal 2000-ben.
54
1999-ben vizsgálatba vont vonalak:
Mindenes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 21, 24. Somogyi Kifli 1, 2.
2000-ben vizsgálatba vont vonalak:
Mindenes 1, 8, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 27, 33. Somogyi Kifli 3, 4.
A szántóföldi vizsgálatok első lépése a vonalak in vitro vírusmentesítése volt, ezt követte a felszaporításuk. Az 1999-es évben vizsgálatokba vont vonalaknál megkezdett kísérleti módszerek a következők voltak: - mesterséges mechanikai fertőzés PVYNTN D-10 izolátummal, ELISA teszt (2000), - szabadföldi infektor növényes vizsgálat (2000), - kertészeti oltás (2001), - morfológiai-, gazdasági- és felhasználhatósági értékvizsgálatok (2001). A 2000-ben szántóföldi vizsgálatokba vont vonalaknál is vírusmentesítés volt az első lépés. Ezeknél a vonalaknál az eddigi vizsgálati módszerek a következők voltak: - mesterséges mechanikai fertőzés PVYNTN D-10 és PVYO/C Ka-49 izolátumokkal, ELISA vizsgálat (2001), - Solanum demissum A6 bioteszt (2001). Ezen vonalak felszaporítása és további, több ismétléses vizsgálata jelenleg is folyik.
55
3.2.2.3.2.1. Kisparcellás, infektor növényes, szabadföldi kísérlet
A transzgénikus burgonyavonalak szántóföldi vizsgálatát Dr. Horváth Sándorral és Dr. Wolf Istvánnal együttműködve, a Veszprémi Egyetem Georgikon
Mezőgazdaságtudományi
Kar
Burgonyakutatási
Központtal
(Keszthely) végeztük. A transzgénikus vonalak szabadföldre, kisparcellákba kerültek kiültetésre, kukorica szegélyvetéssel, mely körbevette az egész kísérleti területet. Soronként 20 gumó elültetése történt, vonalanként egy illetve két sorban. Egy sor 5 m hosszú volt. Negatív kontrollként vírusmentes, nem transzgénikus Somogyi Kifli és Mindenes sorok, illetve mechanikailag PVYNTN-nel inokulált Somogyi Kifli sorok, mint infektor növények helyezkedtek el a transzgénikus sorok között. A növények kisparcellán belüli elrendezését a 7. ábra szemlélteti.
56
fertőzött Somogyi Kifli Somogyi Kifli 2- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli vírusmentes Somogyi Kifli kontroll- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 3- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 5 Mindenes 6 fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 10- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli vírusmentes Mindenes kontroll- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 11- dupla sor fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 12 Mindenes 21 fertőzött Somogyi Kifli Mindenes 21 fertőzött Somogyi Kifli 7. ábra A transzgénikus burgonyavonalak és kontrollok elrendezése a kisparcellás szabadföldi kísérletben.
57
3.2.2.3.2.2. ELISA vizsgálat
A
növényi
vírusok
detektálására
a
módszer
egyszerűsége
és
megbízhatósága miatt a double antibody sandwich (DAS) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technika alkalmazására került sor (Clark és Adams, 1977). A módszer előnye, hogy nagy érzékenységű, nanogram mennyiségű vírusfehérje jelenléte is kimutatható. A transzgénikus Mindenes és Somogyi Kifli burgonyagumókból kifejlődő növények 4-leveles állapotában történt a mechanikai fertőzés (karborundum por - üvegspatula módszerrel). A fertőzést követő 36. napon történt a vizuális felvételezés, a 37. napon pedig a DAS-ELISA vizsgálatok. A felhasznált antitestek a Boehringer Mannheim Gmbh illetve a Loewe Biochemia Gmbh által gyártott poliklonális antitest- és alkalikus foszfatázzal konjugált antitest alapú kitek voltak. Vírusizolátum:
PVYNTN, D-10, származás: Dunaegyháza burgonya PVYO/C, Ka-41, származás: Kaba burgonya (Wolf és Horváth, 2000)
Présnedvhígítás:
1/10, 1/15
Antitest hígítás:
1/1000 (150 µl/vályat)
Lemez: Corning Costar, Cat No: 3590. Az extinkciós érték mérése EPD-1 fotométerrel, 405 nm-en történt.
58
3.2.2.3.2.3. Solanum demissum A6 teszt
A Solanum demissum A6 a Solanum demissum x S. tuberosum cv Aquilla fajta származéka, mely biotesztekhez elterjedten használatos. A PVY minden törzsével szemben nekrotikus lokális léziókkal reagál (in: Takács, 2001). A S. demissum A6 teszt leválasztott S. demissum A6 levelek fertőzésével történik. A vizsgálathoz vonalanként 4-4 burgonyanövény és növényenként 2-2 S. demissum A6 levél fertőzése történt a transzgénikus növények szövetnedvével azok PVYNTN és PVYO/C fertőzését követő 37. napján. A leválasztott és inokulált
levelek
„nedves
kamrában”,
azaz
petricsészében,
nedves
szűrőpapíron, szobahőmérsékleten inkubálódtak. A vírusfertőzés tüneteinek vizsgálata a 6-7. napon történt.
3.2.2.3.2.4. Kertészeti oltás kísérletek
A szabadföldi vizsgálatok eredményei alapján kiválasztott Mindenes 11, 12 és 21-es vonalak kerültek kertészeti oltással történő kísérletekbe. A PVYNTN-nel mesterségesen fertőzött dohány- és paradicsom alanyra történt a transzgénikus burgonyanövények oltása, illetve transzgénikus burgonya alanyra a fertőzött paradicsom oltóág. A kísérletekben azonos korú, 8-10 leveles alany és oltóág vett részt. Dohány alany esetében vonalanként 2-2 növény, paradicsom- és burgonya
alany
esetében
3-3
növény
vizsgálata
történt
meg.
A
víruskoncentrációt az ELISA vizsgálatok eredményei mutatták az oltást követő 4. héten. Határérték kiszámítása mutatta, hogy egy növény mikor tekinthető fertőzöttnek: Az extinkciós értékekből lettek kivonva a vak oldat (csak puffer) értékek. Az így kapott maximum és minimum érték különbségének a
59
háromszorosához kell hozzáadni a negatív kontrollok (nem fertőzött növények) átlagértékét, és az így kapott érték a fertőzési határérték, mely alatt a növény nem tekinthető fertőzöttnek, míg ennél magasabb érték esetében vírusfertőzött. Az eredmények megerősítése S. demissum A6 bioteszttel történt. 3.2.3. Vírusmentesítés A transzgénikus burgonyavonalak szántóföldi vizsgálatait megelőző vírusmentesítés
szövettenyésztés,
hőterápia
és
kemoterápia
együttes
alkalmazásával történt. A gumóról leválasztott hajtáscsúcs (nem merisztéma) MS táptalajon inkubálódott, majd miután egész növénnyé fejlődött, vonalanként 10 nodális szegment 30 mg/l virazolt (ribavirin) tartalmazó táptalajra került, majd 2 hétig 21 oC-on 16/8 órás fény/sötét periódus mellett nevelkedtek. 2 hét elteltével a szegmentek 4 hétre hőterápiás kamrába kerültek, ahol 4 óra sötét 32 o
C és 4 óra fény 37 oC váltakozott. 4 hét után minden növény hajtáscsúcsa
visszakerült MS táptalajra, 21 oC-os és 16 órás megvilágítottságú körülmények közé.
3.2.4. Vírustisztítás A transzgénikus növények fertőzéséhez a tisztított vírust Leiser és Richter (1978) által leírt módszer néhány módosításával nyertük. A részletes leírás Thole (1993) kandidátusi értekezésében található.
60
4. EREDMÉNYEK 4.1. TRANSZGÉNIKUS NÖVÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSA A PVY-H CP gént tartalmazó pGAYHCP plazmidot Agrobacterium tumefaciens segítségével építettük be burgonya- és dohánynövényekbe. A transzformációhoz levélkorongokat, szárszegmenseket és burgonya esetében mikrogumó korongokat is használtunk, melyeket kanamycint (300mg/l) tartalmazó táptalajon szelektáltunk. A transzformációt követő 4-6 héten jelentek meg a hajtások (8/A ábra). Kontrollkísérletek elvégzésével igazoltuk, hogy a szelektív
táptalajon
hajtásnövekedés.
A
csak
a
transzformált
transzformánsokat
növényi
150mg/l
részeken
kanamycint
történik
tartalmazó
táptalajon gyökereztettük (8/B ábra) fényszobában (16h megvilágítás / 23 °C), majd üvegházban földbe ültettük és neveltük tovább (8/C ábra). A Virgin D dohányfajta esetében 38, Stamm C2 esetében 55 és Hevesi 11 esetében 23 transzgénikus vonalat kaptunk. A Mindenes burgonyafajtából 37 vonalat és a Somogyi Kifli fajtából 4 vonalat tudtunk előállítani. A kapott transzgénikus vonalak mindegyikét vizsgáltuk molekuláris módszerekkel, a dolgozatban azonban nem mutatjuk be részletesen mind a 116 dohány- és 41 burgonyavonal molekuláris vizsgálatainak eredményét, ezek összefoglalása a 8. és 9. táblázatban (74. o.) található. Ábráinkon egyes kiválasztott, reprezentatív vonalak vizsgálatainak pozitív eredményeit követjük nyomon.
61
A
B
C
8. ábra A: Mikrogumó korongon, steril tenyészetben fejlődő transzgénikus burgonya hajtás B: G80 táptalajon nevelt gyökeresedő transzgénikus burgonyanövény C: Üvegházi körülmények között nevelt transzgénikus burgonyanövény
62
4.2. TRANSZGÉNIKUS NÖVÉNYEK VIZSGÁLATA 4.2.1. Az integrálódott CP gén kimutatása A transzgén növényi genomba épülését PCR-rel, majd ezt követően Southern analízissel vizsgáltuk (9. és 10. ábra). Az adott génre specifikus, radioaktívan jelölt próbával végzett hibridizáció megerősítette a PCR termékek CP génnel való azonosságát. A további molekuláris vizsgálatokat a pozitív PCR eredmények ismeretében végeztük.
9. ábra Southern blot transzgénikus dohánynövényekből 32
P dCTP izotóppal jelölt CP specifikus próbával hibridizáltatott transzgénikus dohánynövények PCR termékeinek autoradiogramja. 1. sáv: VD1, 2. sáv: VD2, 3. sáv: VD3, 4. sáv: VD4, 5.sáv: VD5, 6. sáv: VD6, 7. sáv: nem transzgénikus dohánynövény, mint negatív kontroll, 8. sáv: PVY-nal fertőzött, nem transzgénikus dohánynövény, mint pozitív kontroll.
63
10. ábra PCR termékek transzgénikus burgonyanövényekből és ezek Southern blot-ja Burgonyanövények PCR termékei (felső ábra), illetve ezek 32P dCTP izotóppal jelölt CP specifikus próbával hibridizáltatott autoradiogramja (alsó ábra). 1. sáv: nem trg. Mindenes kontroll, 2. sáv: Mindenes 2, 3. sáv: Mindenes 3, 4. sáv: Mindenes 4, 5.sáv: Mindenes 5, 6. sáv: Mindenes 6, 7. sáv: Mindenes 7, 8. sáv: Mindenes 8, 9. sáv: fertőzött növény, mint pozitív kontroll, 10. sáv: negatív kontroll (víz), 11 sáv: méretmarker.
4.2.2. Transzgén expresszió vizsgálata A fehérjetermék kimutatásához Western analízist végeztünk. A dohánynövényeknél a Virgin D fajta 38 vonala esetében az összes pozitívnak bizonyult, a Stamm C2 fajta 55 vonalából egyértelműen pozitív 26 vonal, gyenge jelet kaptunk 8 vonal esetében. A Hevesi 11 fajta 23 vonalában pedig 17 volt egyértelműen pozitív. Negatív kontrollként nem transzformált,
64
egészséges növény összfehérje kivonatát választottuk el a gélen, pozitív kontrollként pedig fertőzött nem transzgénikus növényt használtunk (11. ábra).
11. ábra Western blot dohánynövényekből Transzgénikus növények fehérjekivonataiból kimutatható köpenyfehérje. 1 sáv: pozitív kontroll, fertőzött, nem transzgénikus növény, 2. sáv: negatív kontroll, 3.sáv: VD2, 4. sáv: VD3, 5. sáv: VD4, 6. sáv: VD5, 7. sáv: VD6, 8.sáv: VD7, 9. sáv: VD8, 10. sáv: VD9. A burgonyafajtáknál a Mindenes 37 vonala esetében 34 vonal termelte a köpenyfehérjét, 3 vonal pedig nem (12. ábra). A Somogyi Kifli fajta 4 vonalából 3-ban tapasztaltunk köpenyfehérje termelődést, ebből 1 esetben alacsony szinten, míg a 4. vonal egyáltalán nem termelte a transzgén terméket.
65
12. ábra Western blot burgonyanövényekből Transzgén eredetű köpenyfehérje kimutatása membránhoz kötötten. 1. sáv: pozitív kontroll, fertőzött, nem transzgénikus növény, 2. sáv: negatív kontroll, 3. sáv: Mindenes 2, 4. sáv: Mindenes 3, 5. sáv: Mindenes 4, 6. sáv: Mindenes 5, 7. sáv: Mindenes 7, 8. sáv: Mindenes 8, 9. sáv: Mindenes 9, 10. sáv: Mindenes 10.
4.2.3. Rezisztenciavizsgálat üvegházban, dot-blot analízis A Virgin D dohányfajta esetében 6 vonalat, az Stamm C2 és a Hevesi 11 fajtáknál
12-12
vonalat
fertőztünk
PVY-H-val.
Mindhárom
használt
víruskoncentráció esetén (0,5µg/ml, 5µg/ml, 20µg/ml) 3-3 növényt, azaz a VD fajtánál összesen 54 növényt, SC és H11 fajtánál 198-198 növényt vizsgáltunk üvegházi körülmények között. A Mindenes burgonyafajta esetében 22 vonalat, a Somogyi Kifli fajtánál 3 vonalat fertőztünk 5 µg/ml-es víruskoncentrációval.
66
Az üvegházi rezisztenciavizsgálatokban használt transzgénikus dohány- és burgonyavonalak: Virgin D (dohány):
VD1, VD2, VD3, VD4, VD5, VD6.
Stamm C2 (dohány):
SC35, SC36, SC39, SC40, SC41, SC43, SC44, SC45, SC46, SC47, SC48, SC49.
Hevesi 11 (dohány):
H11-1, H11-2, H11-3, H11-4, H11-6, H11-7, H11-8, H11-9, H11-10, H11-11, H11-12, H11-16.
Mindenes (burgonya):
M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M11, M12, M13, M17, M18, M20, M23, M24, M28, M29, M32, M35, M36, M37.
Somogyi Kifli (burgonya):
SK 1, SK 2, SK 4.
A negatív kontrollként használt nem transzgénikus dohánynövények mindegyikén a fertőzést követő 7-10. napon megjelentek az első szisztemikus tünetek. A levélér kivilágosodást, később érnekrózis és levélfoltosodás követte. A nem transzgénikus kontroll- és a transzgénikus burgonyanövények között tünetes növényt nem találtunk, sem vizuálisan, sem a dot-blot vizsgálatok által. Az eredmények megerősítéséhez azonban a burgonyavonalakat szántóföldi vizsgálatokban teszteltük tovább. A transzgénikus dohánynövények között sem találtunk ebben az időszakban megbetegedett növényt. Néhány Virgin D dohányvonal esetében (VD2, VD3, VD4, VD6) egy hónappal a fertőzés után érnekrózis jelent meg, vonalanként 1 vagy 2 növénynél, de minden esetben az 5 µg/ml–es koncentrációval fertőzöttek között (VD2 –5A, 5C; VD3 –5B, 5C; VD4 –5C; VD6 –5A, 5B) (2. táblázat és 13. ábra). Két hónappal a fertőzés után a tünetes transzgénikus növények fiatal levelei tünetmentesekké váltak, ez a
67
„recovery” jelensége (Lindbo és Dougherty, 1992a; Lindbo és mtsai, 1993). A vizsgált Virgin D vonalak közül 2-ben (VD1, VD5) nem találtunk megfertőződött vagy „recovery” növényeket sem a vizuális vizsgálatok által, sem a dot-blot eredmények alapján. 2. táblázat Az üvegházi rezisztenciavizsgálat eredményei Virgin D növények esetében Transzgénikus Virgin D dohányvonalak VD1 PVY konc. (µg/ml)
0.5
5
VD2 20 0.5
5
VD3 20 0.5
5
VD4 20 0.5
5
VD5 20 0.5
5
VD6 20 0.5
5
20
Növényegyedek
A
E E E E R E E E E E E E E E E E R E
B
E E E E E E E R E E E E E E E E R E
C
E E E E R E E R E E R E E E E E E E
Rövidítések: A, B, C –a növényegyedek megkülönböztető jelölése, E –Ellenálló, R –Recovery.
68
13. ábra Transzgénikus dohánynövények összehasonlítása a fertőzést követően 1 hónappal Transzgénikus ellenálló (1.- VD1-5C) és megfertőződött, de később tünetmentessé váló- „recovery” (2.- VD6-5B) dohánynövények. A Stamm C2 és a Hevesi 11 dohányfajták vizsgált transzgénikus vonalai között nem találtunk megfertőződött növényeket sem a vizuális vizsgálatok által, sem a dot-blot eredmények alapján. Ezt a tünetmentességet a növények életük végéig megőrizték. A dot-blot hibridizációs eljárás eredményeivel bizonyítottuk, hogy a tünetmentes növények nem tartalmaztak vírust. Azok a növények, amelyeknél érnekrózist, később „recovery” jelenséget tapasztaltunk, gyenge jelet adtak, tehát kis mennyiségben, de akkumulálták a kórokozót, majd később ezek a növények is vírusmentesekké váltak. A 14. ábrán a fertőzést követően egy hónappal begyűjtött minták dot-blot analízisének részlete látható. Ekkor a
69
megfertőződött transzgénikus növények még vírustünetesek voltak és a vírust is hordozták.
14. ábra Dot-blot analízis 1. transzgénikus „recovery” dohánynövényből származó RNS kivonat, 2. rezisztens transzgénikus dohánynövény RNS kivonata, 3. megfertőződött, nem transzgénikus kontrollnövény RNS kivonata, 4. vírus RNS hígítási sor.
4.2.4. A molekuláris vizsgálatok eredményeinek összegzése Az előállított transzgénikus dohány- és burgonyavonalakkal végzett molekuláris vizsgálatok eredményeinek összefoglalását tartalmazza a 3. és 4. táblázat. A Virgin D dohányfajta 38 vonalából mind a 38 termelte a köpenyfehérjét. Az üvegházi körülmények között, mesterségesen fertőzött 6 vonalból 4 vonal 1-
70
2 növénye esetében tapasztaltunk „recovery” jelenséget, a többi ellenállónak bizonyult. A Stamm C2 dohányfajta 55 előállított vonalából 37 termelte a köpenyfehérjét, de 10 vonal esetében az expresszió alacsony szintű volt. A 12 fertőzött vonalból egyben sem találtunk vírusfertőzésre utaló jeleket sem vizuálisan, sem a dot-blot vizsgálat eredményei alapján. A Hevesi 11 dohányfajta esetében 23 transzgénikus vonalat állítottunk elő, melyek közül 17 vonalban volt köpenyfehérje termelődés. A 12 fertőzött vonal mindegyike vírus-
és
tünetmentesnek
bizonyult
a
molekuláris
és
az
üvegházi
vizsgálatokban. Előállítottunk 37 Mindenes burgonyavonalat, melyek közül 34 esetben tudtunk
köpenyfehérje
termelődést
kimutatni.
A
Somogyi
Kifli
burgonyafajtából 4 transzgénikus vonalat állítottunk elő és 3 esetben volt kimutatható a köpenyfehérje növényen belüli termelődése.
3.
táblázat
Transzgénikus
dohányvonalak
laboratóriumi-
és
vírusrezisztencia
vizsgálatainak összefoglalása.
Dohányfajták
Transzgénikus
Köpenyfehérjét
Vizsgált/
vonalak száma
termelő vonalak
fertőzött vonal 6/4
Virgin D
38
38
(1-2 „recovery” növ. /vonal)
Stamm C2
55
37
12/0
Hevesi 11
23
17
12/0
71
4.
táblázat
Transzgénikus burgonyavonalak laboratóriumi vizsgálatainak összefoglalása Transzgénikus
Köpenyfehérjét termelő
vonalak száma
vonalak
Mindenes
37
34
Somogyi Kifli
4
3
Burgonyafajták
4.2.5. Szántóföldi vizsgálatok 4.2.5.1. Dohányvonalak szabadföldi vizsgálata
Az
üvegházi
körülmények
között
ellenállónak
bizonyult
és
a
rendelkezésünkre álló magok alapján, más kiválasztott vonalak közül néhányat szántóföldi körülmények között vizsgáltuk tovább. Mindezt Dr. Nagy Gyula közreműködésével, az AGROTAB Nemesítő és Vetőmagtermeltető Kft-vel (Debrecen-Pallag) együttműködve végeztük. 19 Virgin D és 4 Stamm C2 transzgénikus vonal bevonását terveztük további vizsgálatokba. Virgin D:
VD1, VD2, VD3, VD4, VD5, VD6, VD8, VD9, VD10, VD11, VD13, VD14, VD15, VD16, VD17, VD18, VD20, VD21, VD34.
Stamm C2:
SC1, SC2, SC3, SC4.
Az 1998-as 27-es a Géntechnológiai tevékenységről szóló törvény értelmében kért és kapott engedély mellett mindeddig 4 kiválasztott transzgénikus vonal vehetett részt szántóföldi vizsgálatokban: Virgin D 5 és 17,
72
Stamm C2 1 és 4. A VD 5 és 17, illetve az SC 4 termelték a köpenyfehérjét, míg az SC 1 nem. A kísérleti területre kiültetett vonalakban a természetes úton történő vírusfertőzöttséget vizuálisan vizsgáltuk. A 2000-ben és 2001-ben vonalanként 25-25 tő kiültetésére került sor. A PVY fertőzöttség mellett, mely közepes erősségű volt mindkét évben, előfordultak más vírusok is, pl. CMV és TMV. A transzgénikus növények ellenállónak bizonyultak a PVY fertőzéssel szemben is (15. ábra), míg a fogékony fajtákban, mint pl. a Coker 254, 100%-os PVY fertőzést tapasztaltunk (16. ábra). A további vizsgálatok elvégzése érdekében a transzgénikus növények szántóföldi kiültetésére vonatkozó újabb engedélyeztetésre kell várnunk.
15. ábra Vírusellenálló transzgénikus dohánynövények szántóföldi kísérletben (Debrecen-Pallag)
73
16. ábra Az előtérben PVY-nal megfertőződött fogékony, nem transzgénikus dohánynövények, a háttérben transzgénikus, vírusellenálló növények (Debrecen-Pallag)
4.2.5.2. A transzgénikus burgonyavonalak szabadföldi vizsgálata A transzgénikus burgonyavonalak szántóföldi vizsgálatokba történő bevonására két szakaszban került sor. A kísérletek elsődleges célja a vírusrezisztencia
mesterséges
illetve
természetes
körülmények
közötti
megnyilvánulásának vizsgálata volt. A többi vizsgálat adatai főképpen tájékoztató
jellegűek,
melyekkel
a
transzgénikus
növények
egyéb
tulajdonságainak változását illetve változatlanságát kívántuk figyelemmel kísérni. Az 1999-ben vírusmentesített vonalak mechanikai fertőzése, ELISA tesztje és a szabadföldi infektor növényes kísérlet 2000-ben, ugyanezen vonalak kertészeti oltással történő vizsgálata, illetve a morfológiai-, gazdasági- és
74
felhasználhatósági
értékvizsgálatai
2001-ben
történtek.
A
2000-ben
vírusmentesített vonalak mesterséges mechanikai fertőzésére PVYNTN és PVYO/C izolátumokkal, majd ezek ELISA vizsgálatára és a Solanum demissum A6 biotesztjére pedig 2001-ben került sor. A
transzgénikus
burgonyavonalak
vírus-ellenállóságának
vizsgálata
PVYNTN fertőzést követő ELISA módszerrel történt (5. táblázat). Az eredmények azt mutatják, hogy a transzgénikus burgonyavonalak nagy része megfertőződött PVY-nal. Három vonal esetében azonban minden növény tünetés vírusmentes volt nemcsak vizuálisan, hanem az ELISA eredmények alapján is. Ezek a Mindenes 11, Mindenes 12 és Mindenes 21 vonalak. A 37 illetve 4040 vizsgált növény egyike sem fertőződött meg a vírussal.
75
5.
táblázat
Az 1999-ben vizsgálatokba vont transzgénikus burgonyavonalak (és kontrollok) PVYNTN fertőzésének ELISA eredményei.
Burgonyavonalak
PVY-nal megfertőződött növények/ összes növény
nem trg. Somogyi Kifli kontroll
40/40
Somogyi Kifli 2
37/37
nem trg. Mindenes kontroll
38/38
Mindenes 3
40/40
Mindenes 5
20/20
Mindenes 6
18/18
Mindenes 10
39/39
Mindenes 11
0/37
Mindenes 12
0/40
Mindenes 21
0/40
A kisparcellás, szabadföldi kísérlet elsődleges célja a rezisztencia illetve a vírusfertőzés megjelenésének vizuális nyomon követése volt. A tüneti felvételezés és az adatok többnyire előzetes, tájékoztató jellegűek. A vonalak több ismétléses vizsgálata a következő évben folytatódik. A kiültetett transzgénikus burgonya állomány vírusfertőzöttségének vizuális vizsgálatakor begyűjtött adatok (6. táblázat) egyrészt azt mutatják, hogy a növények mekkora %-a milyen erősségű tüneteket mutatott, azaz táblázatban szereplő %-os adatok az adott vonalban a legsúlyosabb, feltüntetett tüneterősségre vonatkoznak. A fennmaradó % érték az ennél enyhébb tüneteket
76
mutató növényegyedek arányát jelenti. Nyomon követhető a táblázatban az egyes növényi vonalak magasságának alakulása, illetve kiegyenlítettsége is, mely azt az értéket adja meg, hogy a növények mekkora %-a tartozott az átlagmagassághoz. 6.
táblázat
Transzgénikus burgonyavonalak vizuális felvételezése infektor növényes szabadföldi kísérletben. Kiültetett vonalak
Vírusfertőzöttség Magasság (átlag) Kiegyenlítettség mértéke (PVY)
(cm)
(%)
10% súlyos
60
90
SK-2
tünetmentes
55
80
SK-2
tünetmentes
55
80
fertőzött SK
10% súlyos
55
80
vírusmentes SK
tünetmentes
50
80
vírusmentes SK
tünetmentes
50
80
fertőzött SK
10% súlyos
50
80
Mindenes-3
90% súlyos
40-45
60
Mindenes-3
10% enyhe
40-45
60
fertőzött SK
15% súlyos
65
80
Mindenes-5
80% súlyos
35
50
Mindenes-6
95% súlyos
35
40
fertőzött SK
15% súlyos
55
80
Mindenes-10
80% súlyos
35
50
Mindenes-10
80% súlyos
35
50
fertőzött SK
20% súlyos
55
90
vírusmentes Mindenes
97,5% súlyos
40
60
vírusmentes Mindenes
97,5% súlyos
40
60
fertőzött Somogyi Kifli (SK)
77
6. táblázat folytatása Kiültetett vonalak
Vírusfertőzöttség Magasság (átlag) Kiegyenlítettség mértéke (PVY)
(cm)
(%)
fertőzött SK
25% súlyos
55
80
Mindenes-11
tünetmentes
70
80
Mindenes-11
tünetmentes
70
80
fertőzött SK
20% súlyos
60
85
Mindenes-12
tünetmentes
75
80
Mindenes-21
tünetmentes
75
80
fertőzött SK
25% súlyos
55
80
Mindenes-21
tünetmentes
75
80
fertőzött SK
35% súlyos
40
55
Az eredmények alapján Mindenes 11, 12 és 21-es vonalak tünetmentesnek bizonyultak. A táblázatban szereplő Somogyi Kifli 2 és SK vírusmentes kontrollok meglepő, korábbi táblázatokban leírt eredményeinktől eltérő adatokra a vírus hosszabb lappangási ideje adhat magyarázatot. A szabadföldi kísérletekben kitűnő Mindenes 11, 12 és 21-es vonalak vírus-ellenállóságának további tesztelése a következő évben kertészeti oltásokkal folytatódott. PVYNTN-nel fertőzött dohány alanyra oltva a burgonyavonalakat
2-2
növény
esetében
történt
a
víruskoncentráció
alakulásának nyomon követése, mely érték minden esetben a fertőzési határ alatt mozgott. A fertőzött paradicsom alany esetében a víruskoncentráció nulla vagy ahhoz közeli értékeket mutatott az oltóágban, míg az alanyban a határértékek 10-14-szerese volt. Ez a kísérlet vonalaként 3-3 növény bevonásával történt. Egészséges burgonya alanyra oltott fertőzött paradicsom
78
oltóág esetében is hasonlóan alakultak az eredmények. Míg a fertőzött oltóágban a víruskoncentráció a határérték 10-14-szerese volt, addig a transzgénikus burgonya alanyokban a vírus nem volt kimutatható. A vonalanként vizsgált 3-3 növény mindegyike vírusmentes volt. Morfológiai-, gazdasági- és felhasználási értékvizsgálatok elvégzésére is sor került (7. táblázat). Az áprilisi ültetést követően a kelési % meghatározása 1015 cm-es méret elérésekor következett. Volt olyan növény, amely ebben az időpontban még nem kelt ki (Mindenes 10), de a második felvételezéskor (június közepén) már volt értékelhető adat. Az átlagos növénymagasság felvételezése
ekkor
történt.
A
hektáronkénti
termésmennyiség
a
parcellamérethez viszonyítva lett kiszámolva, így a táblázatban szereplő adatok közelítő értékeket adnak. A három, korábban már kiemelt Mindenes vonal (11, 12 és 21) nemcsak vírus-ellenállóságával tűnt ki a többi transzgénikus burgonyavonal közül, hanem a termésmennyiségük is átlagon felüli volt. A keményítő %, mely fajta-függő, transzgénikus vonalainkban is a magyarországi 17.5%-os átlagérték körül mozgott. A már említett három Mindenes vonal a keményítő % alakulása szerint az alábbi besorolás alapján a vegyesen felhasználható burgonyák csoportjába sorolható: A: sütésre való ill. salátaburgonya (13 -14%) B: vegyesen felhasználható (15 -17 %) C: burgonyapüré (18 -19%) D: takarmány, szesz, ipari burgonya (19 -20% fölött)
79
7.
táblázat
Transzgénikus burgonyavonalak kelése, fejlődése, termése és beltartalmi értéke. Átl. növény-
Vonal
magasság
Termés
Keményítő
(t/ha)
%
megnevezése
Kelési %
Somogyi K. 2
90
55
25.0
17.61
SK kontroll
100
50
28.8
16.95
Mindenes 3
70
45
12.5
-
Mindenes 5
25
35
9.94
-
Mindenes 6
60
35
12.74
-
Mindenes 10
0
35
16.7
-
Mindenes 11
90
70
38.25
15.46
Mindenes 12
70
80
26.9
15.66
Mindenes 21
100
85
43.0
16.12
A
2001-ben
szántóföldi
(cm)
vizsgálatokba
bevont
transzgénikus
burgonyavonalak (vonalanként 4-4 növényt) mesterséges fertőzése PVYNTN és PVYO/C izolátumokkal történt. A fertőzést követő 37. napon került sor a DASELISA vizsgálatokra (8. táblázat). Negatív kontrollként nem transzgénikus in vitro növények illetve a transzgénikus vonalak kiültetett, nem fertőzött egyedei szerepeltek, pozitív kontrollként pedig mesterségesen megfertőzött Nicotiana tabacum Xanti-nc, Mindenes és Somogyi Kifli növények.
80
8.
táblázat
A 2001-ben szántóföldi tesztelésbe vont burgonyavonalak mesterséges mechanikai fertőzésének ELISA-vizsgálati eredményei.
Vonalak megnevezése
Fertőzött / vizsgált minták PVYO/C
PVYNTN
Mindenes (nem trg.)
1/1
1/1
Mindenes- 1
4/4
4/4
Mindenes- 3
2/4
4/4
Mindenes- 5
4/4
3/4
Mindenes- 6
3/4
4/4
Mindenes- 8
1/4
0/4
Mindenes- 9
0/4
0/4
Mindenes- 10
4/4
4/4
Mindenes- 14
3/4
4/4
Mindenes- 15
0/4
0/4
Mindenes- 16
0/4
4/4
Mindenes- 17
4/4
4/4
Mindenes- 18
2/2
3/3
Mindenes- 20
2/4
4/4
Mindenes- 27
4/4
4/4
Mindenes- 33
3/4
4/4
Somogyi Kifli (nem trg.)
1/2
1/2
Somogyi Kifli- 4
1/4
4/4
N. tabacum Xanthi-nc (nem trg)
2/2
2/2
A 9. és 10. táblázat a növényeken (vonalanként 4-4) okozott tüneteket részletezi külön-külön a PVYNTN és PVYO/C izolátumok esetében. A táblázatok tartalmazzák a Solanum demissum A6 teszt eredményeit is, azaz, hogy a
81
fertőzött transzgénikus növény tartalmaz-e vírust, illetve az átvihető-e a tesztnövény levelekre. A vizsgálatokban három Mindenes vonal ( M8, M9 és M15) eredményei tűnnek ki a többi közül. Ezek a vonalak eddigi adataink alapján a mesterséges PVY fertőzéssel szemben ellenállónak bizonyultak. 9.
táblázat
A PVYO/C törzzsel fertőzött transzgénikus növények tünetei és a S. demissum A6 teszt eredményei PVYO/C által okozott tünetek a tesztnövényeken
Trg. vonal neve M1 M3 M5 M6 M8 M9 M 10 M 14
1.
2.
3.
4.
Mo, Nsp,
Mo, Nsp,
Mo, Nri,
Mo, Vn,
Lab
Nri, Vn
Vn, Lab
Lab
Nsp, Nri,
Nsp, Vn,
Cl, Vn
Clsp
Neg.
Clsp
Nsp,
Nsp, Nri,
Nsp, Nri,
Nsp, Nri,
Vn
Vn, Lab
Clri, Lab
Vn
Vn,
Mo, Nsp,
Neg.
Nri
Nri, Vn
Clsp, Vn
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Mo, Nsp,
Nsp, Vn,
Nsp, Nri,
Mo, Vn,
Vn, Clsp
Stn, Lab
Vn, Stn
Nsp, Nri
Nri,
Nsp, Nri,
Nsp, Vn,
Vn,
Vn
Vn, Stn
Lab
Lab
Nsp, Vn
Nsp,
Nsp, Nri,
S. demissum A6 + + + + + (1 növény) + +
82
9. táblázat folytatása PVYO/C által okozott tünetek a tesztnövényeken
Trg. vonal neve M 15 M 16
1.
2.
3.
4.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Mo, Nri,
Nsp, Vn,
Vn, Clsp,
S. demissum A6 +
Lab
Neg.
Vn, Lab
Stn, Lab
Mo, Nsp,
Mo, Nsp,
Mo, Nsp,
Mo, Nsp,
Nri, Vn
Nri, Vn
Nri, Vn
Nri, Vn
Mo, Nsp,
Mo, Nsp,
Vn, Lab
Vn, Lab
-
-
Nsp, Nri,
Mo, Nsp,
Mo,
Mo, Nsp,
Vn, Lab
Nri, Vn
Vn
Nri, Vn
Nsp
Nsp, Vn
Nsp, Vn,
Nsp, Vn,
Nri
Nri
Nsp,
Nsp, Vn
Lab
Lab
SK kontr.
Nsp
Nsp
-
-
+
M kontr.
sMo, Vn
sMo, Vn
sMo, Vn
sMo, Vn
+
M 17 M 18 M 27 M 33 SK 4
Nsp
Nsp, Vn Lab
+ + + + +
Rövidítések: M- Mindenes, SK- Somogyi Kifli, Cl- klorózis, Clri- klorotikus gyűrű, Clspklorotikus folt, Lab- levélhullás, Mo- mozaik, sMo- súlyos mozaik, Neg- negatív, Nrinekrotikus gyűrű, Nsp- nekrotikus folt, Stn- törpülés, Vn- érnekrózis.
83
10. táblázat A PVYNTN törzzsel fertőzött növények tünetei és a S. demissum A6 teszt eredményei PVYNTN által okozott tünetek a növényeken
Trg. vonal
S. demissum
1.
2.
3.
4.
M1
mMo, Vn
mMo, Vn
Vn
mMo, Vn
+
M3
Vn
Vn
Vn
Vn
+
M5
sMo, Ld, Vn
Vn
Nsp
Nsp
+
M6
Vn
Vn
Vn
mMo
+
M8
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
-
M9
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
-
M 10
Vn
mMo, Vn
mMo, Vn
mMo, Vn, Ld
+
M 14
Vn
Vn
Vn
Vn
+
M 15
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
-
M 16
mMo, Vn
Vn
sMo, Vn
mMo, Vn
+
M 17
Vn
Lc, sMo, Vn
Vn
Vn
+
M 18
mMo
Lc, sMo, Stn
Lc, sMo,
-
+
M 27
Vn
Nsp
Vn
mMo, Vn
+
M 33
Vn
mMo, Vn
mMo, Vn
mMo, Vn
+
SK 4
Vn
Vn
Vn
Vn
+
SK kontr.
mMo
Nsp
-
-
+
M kontr.
Mo, Ld, Vn
Mo, Ld, Vn
Mo, Ld, Vn
Mo, Ld, Vn
+
neve
A6
Rövidítések: M- Mindenes, SK- Somogyi Kifli, Lc- levélgöndörödés, Ld- levéldeformáció, Mo- mozaik, mMo- enyhe mozaik, sMo- súlyos mozaik, Neg- negatív, Nsp- nekrotikus folt, Stn- törpülés, Vn- érnekrózis.
84
Az összes, korábban felsorolt transzformáns burgonyavonalat vizsgáltuk előbb molekuláris vizsgálatokkal, majd többféle módszerrel szántóföldi körülmények között is. A kísérleteink adatai azt mutatják, hogy a különböző transzgénikus vonalakban a rezisztencia megnyilvánulása változó volt, fogékony vonalak mellett gyenge és erős mértékű vírus-ellenállóságot mutató növényeket is megfigyeltünk. A vizuálisan tünetmentes növényegyedek az ELISA-vizsgálatok alapján is rezisztensnek bizonyultak. Két egymást követő évben három olyan különböző Mindenes vonalat találtunk (M11, M12 és M21), amelyek magas fokú rezisztenciával rendelkeztek a mesterséges, illetve természetes körülmények között fertőző PVYNTN törzzsel. Ezek a vonalak más vizsgálatokban is értékesnek bizonyultak, különösen a Mindenes 21, mely 43 t/ha termésmennyiséget adott. Azok közül a vonalak közül, melyek vizsgálatát a 2000-es évben kezdtük meg szintén három Mindenes vonal tűnt ki (M8, M9 és M15), melyek fertőzést követő ELISA vizsgálatainak eredményei alapján mesterséges PVY inokuláció esetén ellenállónak bizonyultak. A Mindenes 8-as vonal vizsgált nyolc növénye közül egy azonban fertőződött PVYO/C-vel, és ezt a Solanum demissum bioteszt is igazolta, a maradék 7 vizsgált M8-as növény tünetmentessége azonban a vonal ellenállóképességének vizsgálatához további kísérletek elvégzését teszi indokolttá. Így tehát az M8 vonal további 7 növénye és az említett másik két vonal (M9 és M15) egyik növénye sem fertőződött meg sem PVYNTN-nel, sem PVYO/C-vel. Ezeken a vizsgált növényeken nem találtunk vírustüneteket és a vírus replikáció hiányát igazolták a Solanum demissum A6 bioteszt eredményei is.
85
5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA, KÖVETKEZTETÉSEK Az előállított transzgénikus vonalak közül a Virgin D dohányfajta esetében 38 vonalat hoztunk létre, melyek mindegyike hordozta a transzgént és magát a köpenyfehérjét is termelte. Üvegházi kísérletben 6 vonalat fertőztünk mesterségesen, tisztított PVY-H-val. Ezek a VD1, VD2, VD3, VD4, VD5, VD6 vonalak voltak. A VD1 és a VD5 vonalban nem találtunk fertőzött növényeket sem vizuálisan, sem a dot-blot vizsgálatok által. A többi négy vonalban (VD2, VD3, VD4, VD6) a fertőzés után egy hónappal érnekrózis megjelenését figyeltük meg. A vírus akkumulációt a dot-blot vizsgálatok adatai is alátámasztották. Minden esetben olyan növényeken tapasztaltuk ezt, melyeket 5µg/ml víruskoncentrációval fertőztünk. A fertőzést követő két hónap elteltével azonban ezek a tünetek eltűntek, a növények újból vírusmentesek voltak, melyet a vizuális megfigyelések mellett a dot-blot eredmények is igazoltak. Ezeknél a vonalaknál a „recovery” jelenséget fedezhettük fel, azaz a kezdeti fertőzést követően a növények fiatal levelei már vírusmentesen fejlődtek. A kezdetben kialakuló tünetek enyhébbek voltak és késéssel jelentek meg a kontrollokhoz képest, amelyeken már a fertőzést követő 7-10. napon észrevehető és kimutatható vírusfertőzés tüneteit tapasztaltuk. Szántóföldi körülmények között mindeddig két vonal (VD5 és VD17) vizsgálatára volt lehetőségünk. A két éves vizsgálati idő alatt a PVY fertőzöttség közepes erősségű
volt.
A
fogékony
fajták
100%-osan
megfertőződtek,
míg
transzgénikus vonalaink egészségesek maradtak. A Stamm C2 dohányfajta esetében 55 transzgénikus vonalat hoztunk létre, melyek mindegyikét vizsgáltuk molekuláris módszerekkel. A transzgén terméket összesen 34 esetben tudtuk biztosan kimutatni, ebből 8 esetben az expresszió
alacsony
szintű
volt.
Az
üvegházi
körülmények
között,
86
mesterségesen megfertőzött 12 vonal mindegyike ellenállónak bizonyult mind vizuálisan, mind a dot-blot vizsgálatok eredményei szerint. A 12 vonal között voltak olyan vonalak, melyek alacsony szinten expresszálták a köpenyfehérjét (SC35, SC46, SC47, SC48) és voltak olyanok, melyekből nem tudtuk kimutatni a transzgén expressziót (SC36, SC39, SC40, SC41, SC43, SC44, SC45, SC49). Ezzel párhuzamosan szántóföldi vizsgálatok elvégzésére 2 vonal esetében volt lehetőségünk (SC1, SC4). Az SC1 nem termelte a köpenyfehérjét, míg az SC4 igen. A VD vonalaknál leírtak igazak az SC vonalak eredményeire is, azaz a közepes erősségű PVY fertőzés mellett mindkét vizsgált transzgénikus vonal ellenálló volt a vírussal szemben, ellentétben a fogékony, 100%-ban megfertőződött fajtákkal. A Hevesi 11 dohányfajtából 23 transzgénikus vonalat állítottunk elő, ezek közül 17 vonal termelte a köpenyfehérjét. Az üvegházi vizsgálatokban 12 vonal vett részt, melyek egy része nem termelte a CP-t (H11-12, H11-16), míg nagy részük termelte (H11-1, H11-2, H11-3, H11-4, H11-6, H11-7, H11-8, H11-9, H11-10, H11-11). A növények egyike sem fertőződött meg a tisztított PVY-Hval történő inokulálást követően, amit a vizuális- és a dot-blot vizsgálatok is igazoltak. Szántóföldi vizsgálatokban ezek a vonalak mindeddig nem vettek részt. A Mindenes burgonya fajtából 37 transzgénikus vonalat állítottunk elő, melyek közül 34-ben tudtuk a köpenyfehérje termelődést kimutatni. A Somogyi Kifli fajtából 4 transzgénikus vonalat kaptunk, ezek közül 3 esetben volt köpenyfehérje termelődés. Az üvegházi körülmények között fertőzött 22 Mindenes és 3 Somogyi Kifli vonal egyike sem fertőződött a PVY-nal. Ezeket az eredményeket szántóföldi vizsgálatokkal pontosítottuk. A szabadföldi vizsgálatokban tesztelt 22 Mindenes és 4 Somogyi Kifli közül voltak olyan vonalak, melyek magas szinten expresszálták a köpenyfehérjét (SK1, SK2, M1,
87
M3, M4, M7, M11, M12, M14, M15, M17, M18, M20, M21, M24, M27, M33), néhány vonal esetében alacsony szintű CP termelődést tapasztaltunk (SK3, M2, M5, M8, M10) és néhány vonal egyáltalán nem termelte a CP-t (SK4, M6, M9, M16). A két éven át tartó különféle szántóföldi vizsgálatokban folyamatosan ugyanazok a vonalak tűntek ki ellenállóságukkal: Mindenes 11, Mindenes 12 és Mindenes
21.
Mindhárom
vonalban
tapasztaltunk
transzgén
eredetű
köpenyfehérje termelődést. A transzgénikus vonalak második csoportjával végzett kísérletek alapján szintén három vonal tűnt ki: Mindenes 8, Mindenes 9 és Mindenes 15. Az M8-ban alacsony szintű volt a kimutatható CP, az M9 nem termelte, az M15 pedig termelte a CP-t. A vírussal szemben ellenálló vonalak között tehát CP-t termelő-, nem termelő- és alacsony szinten termelő vonalak is előfordultak Ezek alapján azt a következtetést vontuk le, hogy a PVY-nal szembeni rezisztencia, a korábbi, más kutatócsoportok által leírt eredményekhez hasonlóan, nem fehérjetermék-függő. Ez a Potyvírusok mindegyikére általánosan is jellemző. Regner és mtsai (1992) például PPV CP génnel transzgénikus N. benthamiana és N. clevelandii növényeknél tapasztalták, hogy a PPV-vel szembeni ellenállóság kiváltásához nem szükséges a fehérjetermék jelenléte. Lindbo és Dougherty (1992b) szintén RNS-függő rezisztenciát tapasztaltak TEV CP gént transzgénként hordozó dohánynövények TEV-vel történő fertőzése esetén. Számos más kísérlet is bizonyítja, alátámasztva az eredményeinket, hogy a Potyvírusoknál nincs összefüggés a rezisztencia mértéke és a transzgén expressziós szintje között (van der Vlugt és mtsai, 1992, Kollár és mtsai, 1993, Smith és mtsai, 1995, Hammond és Kamo, 1995). A munkánk során tapasztaltak alapján elmondható, hogy a védettséget elsősorban maga a transzgén vagy az erről átíródott transzkriptum (RNS) váltja ki. Az ellenállóság kialakulását nagy valószínűség szerint a géncsendesítés
88
jelensége idézi elő, mely jellemzően alacsony vagy nem detektálható transzgén expresszióval jár együtt. Az üvegházi vizsgálatoknál tapasztalt „recovery” jelenség magyarázata is a géncsendesítés lehet. Ez a szekvenciaspecifikus lebontó mechanizmus transzgénikus növényeknél a „küszöbérték modell” (Smith és mtsai, 1994) szerint úgy nyilvánulhat meg, hogy a nagy mennyiségben jelenlévő, transzgén eredetű RNS-ek mennyisége meghalad egy szintet, mely beindítja a citoplazmatikus RNS degradáló folyamatot. Ennek következtében a transzgénnel homológ fertőző vírus-eredetű nukleinsavak is lebontódnak, ezáltal elmarad a vírusfertőzés és a növények ellenállóak lesznek a későbbi vírustámadásokkal szemben is. Goodwin és mtsai (1996) szerint a „recovery” jelenség magyarázatához tartozhat a transzgén alacsonyabb, egy-két kópiás beépülése a genomba, míg a rezisztencia kialakulásához három vagy több kópia szükséges. A „recovery” jelenség esetében a transzgén eredetű RNS mennyiség a vírus eredetű transzkriptumokkal együtt éri el a határértéket, mely beindítja a specifikus nukleinsav lebontást, így a kezdeti fertőzést vírusmentes állapot követi. A géncsendesítés beindításával, a szignálmolekula terjedésével és a specifikus nukleázok kialakulásával a növény egész élettartamára megőrzi ellenállóképességét
a
transzgénnel,
illetve
transzkriptumával
homológ
nukleinsavval rendelkező vírusokkal szemben. A transzgénikus növények vizsgálatai alatt nem tapasztaltuk semmiféle hátrányos tulajdonság
megjelenését.
A
transzgénikus
burgonyavonalak
beltartalmi értéke az átlag körül mozogott, míg egyes vonalak terméshozama a Magyarországon átlagosnak ítélt 17-19 t/ha-hoz képest jelentősen nagyobb volt: 38, 26 és 43 t/ha. Ezeket a kiugró értékeket a termésmennyiség tekintetében a már említett Mindenes 11, a Mindenes 12 és a Mindenes 21 transzgénikus vonalak esetében tapasztaltuk.
89
Eredményeink azt mutatják, hogy a vírus eredetű köpenyfehérje gén növényekbe való beépítése és ezáltal ellenálló fajták létrehozása haszonnal járulhat a növénynemesítési munkákhoz. Hasonlóan a külföldi eredményekhez, ahol más burgonyafajták esetében pl. Russet Burbank, Bintje már létrehoztak PVY-nal szemben ellenálló transzgénikus burgonyavonalakat, hazánkban is fontossá vált az itt előforduló PVY vírusizolátum felhasználásával hazai fajták vírusellenállóvá alakítása. Munkánk így a magyarországi növénytermesztés, elsősorban
a
burgonyatermesztés
számára
jelentős
lépés,
mivel
a
köztermesztésből kiszorult régi magyar fajták - melyek mára már többnyire csak génbankokban találhatóak meg - újra visszakerülhetnek a szántóföldekre, bővítve a mezőgazdaság számára hasznosítható növényeink körét.
90
6. ÖSSZEFOGLALÁS A vírusok elleni védekezésben az egyik leghatékonyabb megoldás vírusrezisztens transzgénikus növények előállítása. Az elmúlt két évtizedben a molekuláris
biológiai
eszközök
felhasználásával
a
világ
különböző
laboratóriumaiban vírusellenálló növényeket állítottak elő. Az általunk is alkalmazott módszer a köpenyfehérje gén által indukált keresztvédettségi reakción alapul. A növénytermesztésben nagy károkat okozó burgonya Y vírussal (PVY) szembeni ellenállóságot váltottunk ki transzgénikus növények létrehozásával. A PVY-H (magyar izolátum) köpenyfehérje (CP) génjét Agrobacterium tumefaciens vektor segítségével építettük burgonya- és dohánynövényekbe. A transzformált sejteket szelektív táptalajon illetve üvegházban egész növényekké neveltük, majd molekuláris módszerekkel vizsgáltuk. A kísérlethez 3 dohányfajtát használtunk: Virgin D, Stamm C2, Hevesi 11, melyekből sorrendben 38, 55 illetve 23 transzgénikus vonalat sikerült előállítani, valamint 2 burgonyafajtát: Mindenes és Somogyi Kifli, melyekből 37 és 4 vonalat állítottunk elő. A transzgén integrációt PCR technika segítségével ellenőriztük, a transzkripciót illetve transzlációt Northern és Western
analízisekkel
mutattuk
ki.
A
vírus-ellenállóságot
üvegházi
körülmények között mesterségesen, tisztított PVY-H-val történő fertőzést követő dot-blot analízissel vizsgáltuk. A kiválasztott vonalak szántóföldi tesztelésre kerültek. A természetes körülmények között fertőző vírussal szemben a négy vizsgált dohányvonal (VD 5 és 17, SC 1 és 4) ellenállónak bizonyult. A szántóföldi vizsgálatok eredményei által hat Mindenes vonalat találtunk, melyek nagy fokú ellenállóságot mutattak a vírussal szemben (M 8, 9, 11, 12, 15, 21). Eredményeink rávilágítanak arra, hogy ez a módszer nagy hatékonysággal és biztonsággal használható a szántóföldi növénytermesztésben.
91
ABSTRACT To protect the cultivated plants from virus diseases one of the most effective solution is to produce transgenic plants. During the last twenty years virus resistant transgenic plants were produced by genetic engineering in several laboratories all over the world. The method used by us is based on the cross-protection phenomenon caused by the coat protein. We produced resistant transgenic plants against PVY (potato virus Y), which causes severe loss in crop production. The CP (coat protein) gene of the PVY-H (hungarian isolate) was used by the help of Agrobacterium tumefaciens binary vector, to produce tobacco and potato transformants. The plantlets were grown on selective media and later in greenhouse conditions. We used three tobacco cultivars: Virgin D, Stamm C2 and Hevesi 11, and we got 38, 55 and 23 transgenic lines. The two potato cultivars are: Mindenes and Somogyi Kifli, and we got 37 and 4 transgenic lines. The integration of the coat protein gene to the plant was confirmed by polymerase chain reaction, the transcription and the translation were followed by Northern and Western blots. To test the resistance against viruses we infected the plants in greenhouse with purified PVY-H and made dot-blot tests. Some of the lines were choosen and grown in field conditions. The four tested tobacco lines (VD 5 and 17, SC 1 and 4) were resistant against the naturally infecting PVY, and we found six Mindenes lines (M 8, 9, 11, 12, 15, 21) which also shown high level of resistance. Our results show that this method is safe and effective, and give new possibilities for the plant breeding but especially for old hungarian potato cultivars to get back to the fields and to save the biodiversity of the agriculture.
92
7. IRODALOM Allison, R., Johnson, R. E. and Dougherty, W. G. (1986): The nucleotide sequence of the coding region of tobacco etch virus genomic RNA: evidence for the synthesis of a single polyprotein. Virology 154: 9-20. Anderson, E. J., Stark, D. M., Nelson, R. S., Beachy, R. N. (1989): Transgenic plants that express the coat protein genes of tobacco mosaic virus of alfalfa mosaic virus interfere with disease development of some nonrelated viruses. Phytopathology 79: 1284-1290. Angenent, G. C., van den Ouveland, J. M. and Bol, J. F. (1990): Susceptibility to virus infection of transgenic tobacco plants expressing structural and nonstructural genes of tobacco rattle virus. Virology 175: 191-198. Ares, X., Calamante, G., Cabral, S., Lodge, J., Hemenway, P., Beachy, R. N. and Mentabery, A. (1998): Transgenic plants expressing potato virus X ORF 2 protein (p24) are resistant to tobacco mosaic virus and Ob tobmoviruses. Journal of Virology 72: 731-738. Atreya, P. L., Atreya, C. D. and Pirone, T. P. (1991): Amino acid substitutions in the coat protein results in loss of insect transmissibility of a plant virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7887-7891. Atreya, C. D. (1992): Application of genome sequence information in potyvirus taxonomy: an overview. In: Barnett, O. W. (ed.) Potyvirus taxonomy. Springer, New York 1992. Balázs, E. és Gáborjányi, R. (1984): A génátültetés alkalmazása: a korszerű növényvédelem új lehetősége. Növényvédelem 20: 145-151. Balázs, E. (1997): A növényvédelem új feladata a géntechnológiai úton módosított szervezetekről alkotott törvény végrehajtása. Növényvédelem 33: 582-584. Barker, H., Reavy, B., Kumar, A., Webster, K. D., Mayo, M. A. (1992): Restricted virus multipication in potatoes transformed with the coat protein gene of potato leafroll luteovirus: similarities with a type of host gene-mediated resistance. Ann. Appl. Biol. 120: 55-64. Bass, B. L. (2000): Double stranded RNA as a template for gene silencing. Cell 101:235-238. Baulcombe, D. C. (1996): Mechanism of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. The Plant Cell 8: 1833-1844. Baulcombe, D. C. and English, J. J. (1996): Ectopic pairing of homologous DNS and posttranscriptional gene silencing in transgenic plants. Current Opinion in Biotechnology 7: 173180. Beachy, R. N. (1990): Coat protein-mediated resistance against virus infection. Annu. Rev. Phytopathol. 28: 451-474.
93
Beczner, L., Horváth, J., Romhányi, I., Förster, H. (1984): Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato. Potato Res. 27: 339-352. Bendahmane, M., Fitchen, J. H., Zhang, G. and Beachy, R. N. (1997): Studies of coat proteinmediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. Journal of Virology 71: 7942-7950. Bertioli, D. J., Cooper, J. I., Edwards, M. L., Hawes, W. S. (1992): Arabis mosaic nepovirus coat protein in transgenic tobacco lessens disease severity and virus replication. Ann. Appl. Biol. 120: 47-54. Bevan, M. W., Mason, S. E., Goelet, P. (1985): Expression of tobacco mosaic virus coat protein by a cauliflower mosaic virus promoter in plants transformed by Agrobacterium. EMBO J. 4:1921-1926. de Bokx, J. A. and Huttinga, H. (1981): Potato Virus Y. CMI/AAB Description of Plant Viruses No. 242. Bourdin, D. and Lecoq, H. (1991): Evidence that heteroencapsidation between two potyviruses is involved in aphid transmission of a non-aphid-transmissible isolate from mixed infections. Phytopathology 11: 1459-1464. Brakke, M. K., Ball, E. M., Hsu, Y. H. and Langenberg, W. G. (1987): Wheat streak mosaic virus cylindrical inclusion body protein. Journal of General Virology 68: 281-287. Brault, V., Candresse, T., le Gall, O., Delbos, R. P., Lanneau, M. and Dunez, J. (1993): Genetically egineered resistance against grapevine chrome mosaic nepovirus. Plant Mol Biol. 21: 89-97. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W. X., Ji, L. H., Ding, S. W. and Baulcombe, D. C. (1998): Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17: 6739-6746. Bruyere, A., Wantoba, M., Flasinski, S., Dzianott, A. and Bujarski, J. J. (2000): Frequent homologous recombination events between molecules of one RNA component in a multipartite RNA virus. J. of Virology, 9: 4214-4219. Burgyán J., Perkáta, K., Salamon P., Havelda, Z. (1998): A paradicsom foltoshervadás-vírus hazai izolátumának molekuláris jellemzése és vírusrezisztens dohány előállítása genetikai transzformációval. Növényvédelem 11:607-612. Candelier-Harvey, P. and Hull, R. (1993): Cucumber mosaic virus genome is encapsidated in alfalfa mosaic virus coat protein expressed in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 2: 277-285. Carrington, J. C. and Dougherty, W. G. (1987): Small nuclear inclusion protein encoded by a plant potyvirus genome is a protease. Journal of Virology 61: 2540-2548.
94
Carrington, J. C., Freed, D. D. and Sanders, T. C. (1989): Autocatalytic processing of the potyvirus helper component proteinase in Escherichia coliand in vitro. Journal of Virology 63: 4459-4463. Carrington, J. C., Jensen, P. E. and Schaad, M. C. (1998): Genetic evidence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement. Plant Journal 14: 393-400. Carrington, J. C., Kasschau, K. D. and Johansen L. K. (2001): Activation and suppression of RNA silencing by plant viruses. Virology 281: 1-5. Cassidy, B. G. and Nelson, R. S. (1995): Differences in protection phenotypes in tobacco plants expressing coat protein genes from peanut stripe potyvirus with or without an engineered ATG. Mol. Plant-Microbe Interact. 8: 357-365. Chachulska, A. M. (1998): Potato virus Y phylogeny and engineered virus resistance. Ph.D. Thesis, Warsaw 1998. pp 106. Chia, T. F., Chan, Y. S. and Chua, N. H. (1992): Characterization of cymbidium mosaic virus coat protein gene and its expression in transgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol. 18: 10911099. Chiang, C-H., Wang, J-J., Jan, F-J., Yeh, S-D. and Gonsalves, D. (2001): Comparative reactions of recombinant papaya ringspot viruses with chimeric coat protein (CP) genes and wild-type viruses on CP-transgenic papaya. J. of General Virology 82:2827-2836. Chowrira, G. M., Cavileer, T. D., Gupta, S. K., Lurquin, P. F., Berger, P. H. (1998): Coat protein-mediated resistance to pea enation mosaic virus in transgenic Pisum sativum L. Transgenic Res. 7: 265-271. Clark, M. F. and Adams, A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for the detection of plant. J. Gen. Virol. 34: 475-483. Clark, W. G., Register, J. C., Nejidat, A., Eichholtz, D. A., Sanders, P. R., Fraley, R. T. and Beachy, R. N. (1990): Tissue-specific expression of the TMV coat protein in transgenic tobacco plants affects the level of the coat protein-mediated virus protection. Virology 179: 001-008. Clark, W. G., Fitchen, J., Nejidat, A., Deom, C. M. and Beachy, R. N. (1995): Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus (TMV). II. Challenge by a mutant with altered virion surface does not overcome resistance conferred by TMV coat protein. J. of General Virology 76: 2613-2617. Covey, S. N., Al-Kaff, N. S., Lángara, A. and Turner, D. S. (1997): Plants combat infection by gene silencing. Nature 385: 781-782. Cuozzo, M., O'Conell, K. M., Kaniewski, W., Fang, R. X., Chua, N. H. and Tumer, N. E. (1988): Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisense RNA. Bio/Technology 6: 549-555.
95
Da Camara Machado, M. L., da Camara Machado, A., Mattanovich, D., Regner, F., Hanzer, V., Durniok, B., Steinkeller, H., Himmler, G., Katinger, H. (1990): Expression of the plum pox coat protein in Nicotiana clevelandii. Acta Horticulturae 280: 577-580. Da Camara Machado, L. M., da Camara Machado, A., Hanzer, V., Weiss, H., Regner, F., Steinkeller, H., Mattanovich, D., Plail, R., Knapp, E., Kalthoff, B., Katinger, H. (1992): Regeneration of transgenic plants of Prunus armeniaca containing the coat protein gene of Plum pox virus. Plant Cell Reports 11: 25-29. Dalmay, T., Hamilton, A., Mueller, E. and Baulcombe, D. (2000a): Potato virus X amplicons in Arabidopsis mediate genetic and epigenetic gene silencing. The Plant Cell, 12: 369-379. Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S. and Baulcombe, D. (2000b): An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell, 101: 543-553. Dinant, S., Balise, F., Kuziak, C., Astier-Manifacier, S. and Albouy, J. (1993): Heterologous resistance to potato virus Y in transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of lettuce mosaic virus. Phytopathology 83: 818-824. Dolja, V. V. and Carrington, J. C. (1992): Evolution of positive-strand RNA viruses. Semin. Virol. 3: 315-326. Dolja, V. V., Haldeman- Cahill, R., Montgomery, A. E., Vadenbosch, K. A., Carrington, J. C. (1995): Capsid protein determinants involved cell-to-cell and long distance movement of tobacco etch potyvirus. Virology 206: 1007-1016. Dougherty, W. G. and Carrington, J. C. (1988): Expression and function of potyviral gene products Ann. Rev. Phytopathology 26: 123-143. Dougherty, W. G., Lindbo, J. A., Smith, H. A., Parks, T. D., Swaney, S. and Proebsting, W. M. (1994): RNA-mediated virus resistance in transgenic plants: exploitation of a cellular pathway possibly involved in RNA degradation. Mol. Plant-Microbe. Interact. 7: 544-552. van Dun, C. M. P., Bol, J. F. and van Vioten-Doting, L. (1987): Expression of alfalfa mosaic virus and tobacco rattle virus coat protein genes in transgenic tobacco plants. Virology 159: 229-305. van Dun, C. M. P. and Bol, J. F. (1988): Transgenic tobacco plants accumulating tobacco rattle virus coat protein resist infection with tobacco rattle virus and pea early browning virus. Virology 167: 649-652. van Dun, C. M. P., Overduin, B., van Vioten-Doting, L. and Bol, J. (1988): Transgenic tobacco expressing tobacco streak virus or mutated alfalfa mosaic virus coat protein does not crossprotect against alfalfa mosaic virus infection. Virology 164: 383-389. Edwardson, J. R. and Christie, R. G. (1997): Viruses infecting peppers and other solanaceous crops. Volume II, Florida Agricultural Experiment Station, Monograph 18-II.
96
Ellis, P., Stace-Smith, R., de Viliers, G. (1997): Identification and geographic distribution of serotypes of potato virus Y. Plant Dis. 81: 481-484. English, J. J., Mueller, E. and Baulcombe, D. C. (1996): Supression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes. Plant Cell 8: 178-188. Falk, B. W. and Bruening, G. (1994): Will transgenic crops generate new viruses and new diseases? Science 263: 1395-1396. Fang, G. and Grumet, R. (1993): Genetic engineering of potyvirus resistance using constructs derived from zucchini yellow mosaic virus coat protein gene. Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 358-367. Farinelli, L. (1992): Coat protein gene-mediated resistance to the potato virus Y /PVY/ in tobacco and potato. (Thesis) 1-121. Farinelli, L., Malnoë, P. and Collet, G. F. (1992): Heterologous encapsidation of potato virus Y strain O (PVYO) with the transgenic coat protein of PVY strain N (PVYN) in Solanum tuberosum cv. Bintje. Bio/Technology 10: 1020-1025. Farinelli, L. and Malnoë, P. (1993): Coat protein gene-mediated resistance to potato virus Y in tobacco: examination of the resistance mechanisms -is the transgenic coat protein required for protection? Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 284-292. Fehér, A., Skyrabin, K. G., Balázs, E., Preiszner, J., Shulga, O. A., Zakharyev, V. M. and Dudits, D. (1992): Expression of PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants. Plant Cell Rep. 11: 48-51. Fitch, M. M. M., Manshardt, R. M., Gonsalves, D., Slightom, J. L., Sanford, J. C. (1992): Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Bio/Technology 10: 1466-1472. Gerber, M. and Sarkar, S. (1989): The coat protein of tobacco mosaic virus does not play a significant role for cross-protection. J. Phytopathology 124: 323-333. Gielen, J. J. L., De Haan, P., Kool, A. J., Peters, D., Van Grinsven, M. W. J. M. and Goldbach, R. W. (1991): Engineered resistance to tomato spotted wilt virus, a negative-strand RNA virus. Bio/Tecnology 9: 1363-1367. Goldbach, R. and de Haan, P. (1993): Prospects of engineered forms of resistance against tomato spotted wilt virus. Seminars in Virology 4: 381-387. Gonsalves, D., Chee, P., Provvidenti, R., Seem, R. and Slightom, J. L. (1992): Comparison of coat protein-mediated and genetically-derived resistance in cucumbers to infection by cucumber mosaic virus under field conditions with natural challenge inoculations by vectors. Bio/Technology 10: 1562-1570. Gooding, G. V. and Tolin, S. A. (1973): Strains of potato virus Y affecting flue-cured tobacco in the southeastern United States. Plant Dis. Rep. 57:200-204.
97
Goodwin, J., Chapman, K., Swaney, S., Parks, T. D., Wernsman, E. A. and Dougherty, W. G. (1996): Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance. Plant Cell 8: 95-105. de Haan, P., Gielen, J. J., Prins, M., Wijkamp, I. G., van Schepen, A., Peters, D., van Grinsven, M. Q. and Goldbach, R. (1992): Characterization of RNA-mediated resistance to tomato spotted wilt virus in transgenic tobacco plants. Bio/Technology (NY) 10: 1133-1137. Haldeman-Cahill, R., Daros, J. A. and Carrington, J. C. (1998): Secondary structures in the capsid protein coding sequence and 3’ nontranslated region involved in amplification of the tobacco etch virus genome. Journal of Virology 72: 4072-4079. Halk, E. L., Merlo, D. J., Liao, L.W., Jarvis, N. P. and Nelson, S. E. (1989): Resistance to alfalfa mosaic virus in transgenic tobacco and alfalfa. In: Staskawicz, B., Ahlquist, P., Yolder, O. (eds.) Molecular biology of plant-pathogen interactions, Alan R. Liss, New York. Hammond, J. and Kamo, K. K. (1993): Resistance to bean yellow mosaic virus /BYMW/ and other potyviruses in transgenic plants expressing BYMW antisense RNA, coat protein or chimera coat proteins. Acta Horticult. Hammond, J. and Kamo, K. K. (1995): Effective resistance to potyvirus infection conferred by expression of antisense RNS in transgenic plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 8: 674-682. Harrison, B. D. and Roberts, I. M. (1971): Pinwheels and crystalline structures induced by atropa mild mosaic virus with particles 925 nm long. J. gen. Virology 10: 71-78. Hayakawa, T., Zhu, Y., Itoh, K., Kimura, Y., Izawa, T., Shimamoto, K. and Toryama, S. (1992): Genetically engineered rice resistant to rice stripe virus, an insecttransmitted virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9865-9869. Hemenway, C., Fang, R-X., Kaniewski, W. K., Chua, N-H. and Tumer, N. E. (1988): Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA. EMBO J: 7: 1273-1280. Hill, K. K., Jarvis-Eagan, N., Halk, E. L., Krahn, K. J., Liao, L. W., Mathewson, R. S., Merlo, D. J., Nelson, S. E., Rakha, K. E. and Loesch-Fries, L. S. (1991): The development of virus resistant alfalfa, Medicago sativa L. Bio/Technology 8: 373-377. Hoekema, A., Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. and Cornelissen, B. J. C. (1988): The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Bio/Tecnology 7: 273-278. Hollings, M. and Brunt, A. A. (1981): Potyvirus group. CMI/AAB Description of Plant Viruses #245: 7pp. Horikoshi, M., Nakayama, M., Yamaoka, N., Furosawa, I. and Shishyama, J. (1987): Brome mosaic virus coat protein inhibits viral RNA synthesis in vitro. Virology 158: 15-19.
98
Horváth, J. (1966): Studies on strains of potato virus Y. 2. Normal strain. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1: 333-352. Horváth, J. (1995): A szántóföldi növények betegségei. Mezőgazda kiadó, Budapest 1996, 328 pp. Ishida, B.K., Snyder, G.W. and Belknap, W.R. (1989): The use of in vitro-grown microtuber discs in Agrobacterium-mediated transformation of Russet Burbank and Lehmi Russet potatoes. Plant Cell Reports 8:325-328. Jacquet, C., Delecolle, B., Raccah, B., Lecoq, H., Dunez, J. and Ravelonandro, M. (1998a): Use of modified plum pox virus coat protein genes developed to limit heteroencapsidationassociated risks in transgenic plants. Journal of General Virology 79: 1509-1517. Jacquet, C., Ravelonandro, M. and Dunez, J. (1998b): High resistance and control of biological risks in transgenic expressing modified plum pox virus coat protein. Acta Virol. 42. (4): 235237. Jongedijk, E., de Schutter, A. A. J. M., Stolte, T., van den Elzen, P. J. M. and Cornelissen, B. J. C. (1992): Increased resistance to potato virus X and preservation of cultivar properties in transgenic potato under field conditions. Bio/Tecnology 10: 422-429. Kallerhoff, J., Perez, J., Bouzoubaa, S., Bentahar, S. and Perret, J. (1990): Beet necrotic yellow vein virus coat protein-mediated protection in sugarbeet /Beta vulgaris/ protoplasts. Plant Cell Rep. 9: 224-228. Kaniewski, W., Lawson, C., Sammons, B., Haley, L., Hart, J., Delannay, X. and Tumer, N. E. (1990): Field resistance of transgenic Russet Burbank potato to effects of infection by potato virus X and potato virus Y. Bio/Technology 8: 750-754. Kasschau, K. D., Cronin, S. and Carrington, J. C. (1997): Genome amplification and longdistance movement functions associated with the central domain of tobacco etch potyvirus helper component-proteinase. Virology 228: 251-262. Kawchuk, L. M., Martin, R. R. and McPherson, J. (1990): Resistance in transgenic potato expressing the potato leafroll virus coat protein gene. Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 301-307. Kawchuk, L. M., Martin, R. R. and McPherson, J. (1991): Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 4: 247-253. Kollár, Á., Thole, V., Dalmay, T., Salamon, P. and Balázs, E. (1993): Efficient pathogenderived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco. Biochimie 75: 623-629. Kunik, T., Salomon, R., Zamir, D., Navot, N., Zeidan, M., Michelson, I., Gafni, Y. and Chosnek, H. (1994): Transgenic tomato plants expressing the tomato yellow leaf curl virus capsid protein are resistant to the virus. Bio/Technology 5: 500-504.
99
Laín, S., Riechmann, J. L., Méndez, E. and García, J. A. (1988): Nucleotid sequence of the 3’ terminal region of plum pox virus RNA. Virus res. 10: 325-342. Lawson, C., Kaniewski, W., Haley, L., Rozman, R., Newell, C., Sanders, P. and Turner, N. (1990): Engineering resistance to mixed virus infection in a commercial potato cultivar: resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic Russet Burbank. Bio/Technology 8: 127-134. Le Romancer, M., Kerlan, C., Nedellec, M. (1992): Potato necrotic ringspot disease: a genetic approach of the phenomenon and studies about hypersensitive or extreme susceptible behaviour of several cultivars. Proceedings of the EAPR Virology Section Meeting, 91-95. Leclerc, D. and AbouHaidar, M. G. (1995): Transgenic tobacco plants expressing a truncated form of the PAMV capsid protein (CP) gene show CP-mediated resistance to potato aucuba mosaic virus. Mol. Plant-Microbe Interact. 1: 58-65. Lecoq, H., Ravelonandro, M., Wipf-Scheibel, C., Monsion, M., Raccah, B. and Dunez, J. (1993): Aphid transmission of a non-aphid-transmissible strain of zucchini yellow mosaic potyvirus from transgenic plants expressing the capsid protein of plum pox potyvirus. Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 403-406. Leiser, R.-M. and Richter, J. (1978): Reinigung und einige Eigenschaffen des Kartoffel-YVirus. Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz 14:337-350. Li, H. W., Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X., Ji, L. H., Wong, S. M. and Ding, S. W. (1999): Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism. EMBO J. 18: 2683-2691. Lindbo, J. A. and Dougherty, W. G. (1992a): Pathogen-derived resistance to a potyvirus: immune and resistance phenotypes in transgenic tobacco expressing altered forms of a potyvirus coat protein nucleotide sequence. Mol. Plant-Microbe Interact. 5: 144-153. Lindbo, J. A. and Dougherty, W. G. (1992b): Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189: 725-733. Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L. and Dougherty, W. G. (1993a): Pathogen derived resistance to potyviruses: working, but why? Seminars in Virology 4: 369-379. Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W. M. and Dougherty, W. G. (1993b): Induction of highly specific antiviral state in transgenic plants: Implications for regulation of gene expression and virus resistance. Plant Cell 5: 1749-1759. Lindbo, J. A., Fitzmaurice, W. P. and della-Chioppa, G. (2001): Virus-mediated reprogramming of gene expression in plants. Current Opin. in Plant Biology 4:181-185. Ling, K., Namba, S., Gonsalves, C., Slightom, J. L. and Gonsalves D. (1991): Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya ringspot virus coat protein gene. Bio/Technology 9: 752-758.
100
Loesch-Fries, L. S., Merlo, D., Zinnen, T., Burhop, L., Hill, K., Krahn, K., Jarvis, N., Nelson, S. and Halk, E. (1987): Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance. EMBO J. 6: 1845-1851. Lomonossoff, G. P. (1995): Pathogen-derived resistance to plant viruses. Annual Review of Phytopathology 33: 323-343. López-Moya, J. J. and Pirone, T. P. (1998): Charge changes near the N-terminus of the coat protein of two potyviruses affect virus movement. J. Gen. Virol. 79: 161-165. MacKenzie, D. J. and Tremaine, J. H. (1990): Transgenic Nicotiana debneyi expressing viral coat protein are resistant to potato virus S infection. J. Gen. Virology 71: 2167-2170. MacKenzie, D. J., Tremaine, J. H. and Pherson, J. (1991): Genetically engineered resistance to potato virus S in potato cultivar Russet Burbank. Mol. Plant-Microbe Interact. 4: 95-102. MacKenzie, D. J. and Ellis, P. J. (1992): Resistance to tomato spotted wilt virus infection in transgenic tobacco expressing the viral nucleocapsid. Mol. Plant-Microbe Interact. 5: 34-40. Mahayan, S., Dolja, V. V. and Carrington, J. C. (1996): Roles of the sequence encoding tobacco etch virus capsid protein in genome amplification: requirements for the translation process and a cis-active element. J. Virol. 70: 4370-4379. Maia, I. G., Haenni, A. L. and Bernardi, F. (1996): Potyviral HC-Pro: a multifunctional portein. Journal of General Virology 77: 1335-1341. Mäki-Valkama, T., Valkonen, J. P. T., Kreuze, J. F. and Pehu, E.( 2000): Transgeinc resistance to PVYO associated with post-transcriptional silencing of P1 transgene is overcome by PVYN strains that carry highly homologous P1 sequences and recover transgene expression at infection. Mol. Plant-Microbe Interact. 4:366-373. Mallory, A. C. (2001): HC-Pro suppression of gene silencing eliminates the small RNAs but not the transgene methylation or the mobile signal. Plant Cell 13: 571-583. Malnoë, P., Farinelli, W., Collet, G. F. and Reust, W. (1994): Small-scale field tests with transgenic potato, cv. Bintje, to test resistance to primary and secondary infections with potato virus Y. Plant Mol. Biol. 25: 936-975. Marathe, R., Anandalakshmi, R., Smith, T. H., Pruss, G. J. and Vance, V. (2000): RNA viruses as inducers, suppressors and targets of post-transciptional gene silencing. Plant Mol. Biol. 43: 295-306. Matzke, M. A., Matzke, A. J. M., Pruss G. J. and Vance V. B. (2001): RNA-based silencing strategies in plants. Curr. Opin. in Genetics and Development 11:211-227. McKinney, H. H. (1929): Mosaic disease in the Canary Islands, West Africa and Gibraltar. Journal of Agricultural Researche 39: 557-558.
101
Mueller, E., Gilbert, J. E., Davenport, G., Brigneti, G. and Baulcombe, D. C. (1995): Homology-dependent resistance: Transgenic virus resistance in plants related to homologydependent gene silencing. Plant Journal 7: 1001-1013. Murashige, T. and Skoog, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497. Murphy, J. F., Hunt, A. G., Rhoads, R. E. and Shaw, J. G. (1990): Expression of potyviral genes in transgenic tobacco plants. Abstr. VIII. Int. Congr. Virol. Berlin, aug. 26-31. P84-007. Murphy, J. F., Rhoads, R. E., Hunt, A. G.and Shaw, J. G. (1990): The VPg of tobacco etch virus RNA is the 49- kDa proteinase or the N-terminal 24 kDa part of the proteinase. Virology 178: 285-288. Murry, L. E., Elliot, L. G., Capitant, S. A., West, J. A., Hanson, K. K., Scarafia, L., Johnston, S., DeLuca-Flathery, C., Nichols, S., Cuanan, D., Dietrich, P. S., Mettler, S. D., Warnick, D. A., Rhodes, C., Shinibaldi, R. M. and Brunke, K. J. (1993): Transgenic corn plants expressing MDMV strain B coat protein are resistant to mixed infections of maize dwarf mosaic virus and maize chlorotic mottle virus. Bio/Technology 11: 1559-1564. Nakajima, M., Hayakawa, T., Nakamura, I. and Suzuki, M. (1993): Protection against cucumber mosaic virus /CMV/ strains O and Y and chrisanthemum mild mottle virus in transgenic tobacco plants expressing CMV-O coat protein. J. Gen. Virol. 74: 319-322. Namba, S., Ling, K., Gonsalves, C., Gonsalves, D. and Slightom, J. L. (1991): Expression of the gene encoding the coat protein of cucumber mosaic virus /CMV/ strain WL appears to provide protection to tobacco plants against infection by several different CMV strains. Gene 107: 181188. Namba, S., Ling, K., Gonsalves, C., Gonsalves, D. and Slightom, J. L. (1992): Protection of transgenic plants expressing the coat protein gene of watermelon mosaic virus II or zucchini yellow mosaic virus against six potyviruses. Phytopathology 82: 940-946. Nejidat, A. and Beachy, R. N. (1990): Transgenic tobacco plants expressing a coat protein gene of tobacco mosaic virus are resistant to some other tobamoviruses. Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 247-251. Nelson, R. S., McCormick, S. M., Delannay, X., Dubé, P., Layton, J., Anderson, E. J., Kaiewski, M., Proksch, R. K., Horsch, R. B., Rogers, S. G., Fraley, R. T. and Beachy, R. N. (1988): Virus tolerance, plant growth and field performance of transgenic tomato expressing coat protein from tobacco mosaic virus. Bio/Technology 6: 403-409. Okuno, T., Nakayama, M., Yoshida, S., Furusawa, I. and Koyima, T. (1993): Comparative susceptibility of transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of cucumber mosaic virus to infection with virions and RNA. Phytopathology 83: 542-547. Palauqui, J. C., Elmayan, T., Pollien, J. M. and Vaucheret, H. (1997): Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions. EMBO J. 15: 4738-4745.
102
Palauqui, J. C. and Balzergue, S. (1999): Activation of systemic acquired silencing by localised introduction of DNA. Current Biology 9: 59-66. Palkovics, L., Wittner, A. and Balázs, E. (1995): Pathogen-derived resistance induced by integrating the plum pox virus coat protein gene into plants of Nicotiana benthamiana. Acta Horticulturae 386:311-317. Palkovics, L., Karamova, N., Pribék, D. and Balázs. E. (1998): Changes in the 5’ non-coding region of plum pox virus in connection with symptom development. 7th International Congress of Plant Pathology, Edinburgh, Scotland; Abstracts, Vol. 2./ 1.11.34. Palukaitis, P. and Zaitlin, M. (1984): A model to explain the "crossprotection" phenomenon shown by plant viruses and viroids, in "Plant-Microbe Interactions. Molecular and Genetic Perspectives." Vol.1. (T. Kosuge and E. W. Nester, eds.) Macmillan publishing company, New York. pp. 420-429. Pang, S. Z., Slightom, J. L. and Gonsalves, D. (1993): Different mechanisms protect transgenic tobacco against tomato spotted wilt and impatiens necrotic spot tospoviruses. Bio/Technology 11: 819-824. Pirone, T. P. (1991): Viral genes and gene products that determine insect transmissibility. Semin. Virol. 2: 81-87. Pirone, T. P. and Blanc, S. (1996): Helper-dependent vector transmission of plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 34: 227-247. Powell-Abel, P., Nelson, R. S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S. G., Fraley, R. T. and Beachy, R. N. (1986): Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232: 738-743. Powell-Abel, P., Sanders, P. R., Turner, N., Fraley, R. T. and Beachy, R. N. (1990): Protection against tobacco mosaic virus infection in transgenic tobacco plants requires accumulation of coat protein rather than coat protein RNA sequences. Virology 175: 124-130. Prins, M., de Haan, P., Luyten, R., van Heller, M., van Grinsven, M. Q. J. M. and Goldbach, R. (1995): Broad resistance to tospoviruses in transgenic tobacco plants expressing three tospoviral nucleoprotein sequences. Mol. Plant-Microbe Interact. 1: 85-91. Pruss, G., Ge, X., Shi, X. M., Carrington, J. C. and Bowman Vance, V. (1997): Plant viral synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that transactivates replication of heterologous viruses. The Plant Cell 9: 859-868. Quemada, H. D., Gonsalves, D. and Slightom, J. L. (1991): Expression of coat protein gene from cucumber mosaic virus strain C in tobacco: Protection against infection by CMV strains transmitted mechanically or aphids. Phytopathology 81: 794-802. Ratcliff, F., Bryan, D. H. and Baulcombe, D. C. (1997): A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558-1560.
103
Ravelonandro, M., Monsion, M., Delbos, R. and Dunez, J. (1993): Variable resistance to plum pox virus and potato virus Y infection in transgenic Nicotiana plants expressing plum pox virus coat protein. Plant Science 91: 157-169. Regner, F., da Camara Machado, A., da Camara Machado, M. L., Steinkeller, H., Mattanovich, D., Hanzer, H., Weiss, H. and Katinger, H. (1992): Coat protein mediated resistance to plum pox virus in Nicotiana clevelandii and N. benthamiana. Plant Cell Rep. 11: 30-33. Reimann-Philip, U. and Beachy, R. N. (1993): The mechanism(s) of coat protein-mediated resistance against tobacco mosaic virus. Seminars in Virology 6: 349-357. Riechmann, J. L., Laín, S. and García, J. A. (1990): Infectious in vitro transcripts from a plum pox potyvirus cDNA clone. Virology, 177: 710-716. Riechmann, J. L., Lain, S. and Garcia, J. A. (1992): Highlights and prospects of potyvirus molecular biology. J. Gen. Virology 73: 1-16. Riechmann, J. L., Cervera, M. T. and Garcia, J. A. (1995): Processing of the plum pox virus polyprotein at the P3-6K1 junction is not required for virus viability. Journal of General Virology 76: 951-956. Robaglia, C., Durand-Tardif, M., Trochet, M., Boudazin, G., Astier-Manifavier, S. and CasseDelbart, F. (1989): Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA. J. Gen. Virol. 70: 935-947. Rodriguez-Cerezo, E., Ammar, E. D., Pirone, T. P. and Shaw, J. G. (1993): Association of the non-structural P3 viral protein with cylindrical inclusions in potyvirus-infected cells. Journal of General Virology 74: 587-592. Rodriguez-Cerezo, E., Findlay, K., Shaw, J. G., Lomonossoff, G. P., Qiu, S. G., Linstead, P., Shanks, M. and Risco, C. (1997): The coat and cylindrical inclusion proteins of a potyvirus are associated with connections between plant cells. Virology 236: 296-306. Rojas, M. R., Zerbini, F. M., Allison, R. F., Gilbertson, R. L. and Lucas, W. J. (1997): Capsid protein and helper component-proteinase function as potyvirus cell-to-cell movement proteins. Virology 237:283-295. Rubino, L., Carrington, J. C., Russo, M. (1992): Biologically active cymbidium ringspot virus satellite RNA in transgenic plants suppresses accumulation of DI RNA. Virology 188: 429-437. Rubino, L., Caprioti, G., Lupo, R. and Russo, M. (1993): Resistance to cymbidium ringspot tombusvirus infection in transgenic Nicotiana benthamiana plants expressing the virus coat protein gene. Plant Mol. Biol. 21: 665-672. Salomon, R., Raccah, B. (1990): The role of the N-terminus of potyvirus coat protein in aphid transmission. VIII. International Congress of Virology, Berlin. Abstract p83-87.
104
Salomon, R. and Bernardi, F. (1995): Inhibition of viral aphid transmission by the N-terminus of the maize dwarf mosaic virus coat protein. Virology 213: 676-679. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989): Molecular cloning: Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory) Sanders, P. R., Sammons, B., Kaniewski, W., Haley, L., Layton, J., Lavallee, B. J., Delannay, X. and Tumer, N. E. (1992): Field resistance of transgenic tomatoes expressing the tobacco mosaic virus or tomato mosaic virus coat protein genes. Phytopathology 82: 683-690. Sanford, J. C. and Johnston, S. A. (1985): The concept of pathogen derived resistance: Deriving resistance genes from the parasites own genome. J. Theor. Biol. 113: 395-405. Sarkar, S., Smitamana, P. (1981): A proteinless mutant of tobacco mosaic virus: evidence against the role of a viral coat protein for interference. Mol. Gen. Genet. 184: 158-159. Scorza, R., Cordts, J. M., Mante, S., Gonsalves, D., Damsteegt, V. D., Yepes, L. M. and Slightom, J. L. (1991): Agrobacterium-mediated transformation of plum (Prunus domestica L.) with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Third Int. Congr. Plant Mol. Biol. 6-11. Oct. 1991. Tuscon, AZ. abstract 1167. Scorza, R., Ravelonandro, M., Callahan, A. M., Cordts, J. M., Fuchs, M., Dunez, J. and Gonsalves, D. (1994): Transgenic plums (Prunus domestica L.) express the plum pox virus coat protein gene. Plant Cell Reports 14: 18-22. Sherwood, J. L., Fulton, R. W. (1982): The specific involvement of coat protein in tobacco mosaic virus cross protection. Virology 119: 150-158. Shukla, D. D., and Ward, C. W. (1989): Structure of potyvirus coat proteins and its application in the taxonomy of the potyvirus group. Adv. Virus Res. 36: 273-314. Shukla, D. D., Frenkel, M. J. and Ward, C W. (1991): Structure and function of the potyvirus genome with special reference to the coat protein coding region. Can. J. Plant Pathology 13: 178-191. Shukla, D. D., Ward, C. W., Brunt, A. A. (1994): The Potyviridae. CABI, University Press, Cambridge UK Sijen, T. and Kooter, J. M. (2000): Post-transcritional gene-silencing: RNAs on the attack or on the defense? Bioessays 22: 520-531. Smith, K. M. (1931): Composite nature of certain potato viruses of the necrotic group. Nature 127, 702. Smith, K. M. and Dennis, R. W. G. (1940): Some notes on a suspected variant of Solanum virus 2 (potato virus Y). Ann. Appl. Biol. 27: 65-70.
105
Smith, H. A., Swaney, S. L., Parks, T. D., Wernsam, E. A. and Dougherty, W. G. (1994): Transgenic plant virus resistance mediated by untranslatable sense RNAs: expression, regulation, and fate of nonessential RNAs. Plant Cell 6: 1441-1453. Smith, H. A., Powers, H., Swaney, S. L., Brown, C. and Dougherty (1995): Transgenic potato virus Y resistance in potato: Evidence for an RNA-mediated cellular response. Phytopathology 85: 864-870. Sonoda, S., Mori, M. and Nishiguchi, M. (1999): Homology-dependent virus resistance in transgenic plants with the coat protein gene of sweet potato feathery mottle potyvirus: Target specificity and transgene methylation. Virology 5:385-391. Soumounon, Y. and Laliberté, J. F. (1994): Nucleic acid-binding properties of the P1 protein of turnip mosaic potyvirus produced in Echerichia coli. Journal of General Virology 75:25672573. Stark, D. M. and Beachy, R. N. (1989): Protection against potyvirus infection in transgenic plants: evidence for a broad spectrum resistance. Bio/Technology 7: 1257-1262. Sudarsono- Woloshuk, S. L., Xiong, Z., Hellmann, G. M., Wernsman, E. A., Weissinger, A. K. and Lommel, S. A. (1993): Nucleotide sequence of the capsid protein cristons from six potato virus Y (PVY) isolates infecting tobacco. Arch. Virol. 132:161-170. Szirmai, J. (1958): A burgonya Y-vírusának érbarnulást okozó változata a dohánykultúrákban. Növénytermelés 7: 341-350. Tacke, E., Salamini, F. and Rohde, W. (1996): Genetic engineering of potato for broad-spectrum protection against virus infection. Nat. Biotechnology 14: 1579-1601. Takács, A. P. (2001): A burgonya Y vírus (potato Y potyvirus, PVY) jellemzése, az NTN törzzsel szembeni rezisztencia a vad Solanum fajokban. Doktori (PhD) Értekezés Tepfer, M. (1993): Viral genes and transgenic plants (What are the potential environmental risks?) Bio/Technology 11: 1125-1129. Tepfer, M. and Balázs, E. (1997): Virus-resistant Transgenic Plants: Potential Ecological Impact. 1997. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, INRA Paris. Thole, V., Dalmay, T., Burgyán, J. and Balázs, E. (1993): Cloning and sequencing of potato virus Y (Hungarian isolate) genomic RNA. Gene Thole, V. (1993): A magyarországi flórából származó burgonya Y vírus teljes genomjának molekuláris klónozása, nukleotid sorrendjének meghatározása és mesterséges vírus rezisztencia kialakítása. Kandidátusi értekezés. 1-103. Tumer, N. E., O'Conell, K. M., Nelson, R. S., Sanders, P. R., Beachy, R. N., Fraley, R. T. and Shah, D. M. (1987): Expression of alfalfa mosaic virus coat protein gene confers crossprotection in transgenic tobacco and tomato plants. EMBO J. 6: 1181-1188.
106
Tumer, N. E., Kaniewski, W., Haley, L., Gehrke, L., Lodge, J. K. and Sanders, P. (1991): The second amino acid of alfalfa mosaic virus coat protein is critical for coat protein-mediated protection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2331-2335. Vaira, A. M., Semeria, L., Crespi, S., Lisa, V., Allavena, A. and Accotto, G. P. (1995): Resistance to tospoviruses in Nicotiana benthamiana transformed with the N gene of tomato spotted wilt virus: Correlation between transgene expression and protection in primary transformants. Mol. Plant-Microbe Interact. 1: 66-73. Van den Heuvel, J. F. J. M., van der Vlugt, R. A. A., Verbeck, M. N., den Haag, P. T. and Huttinga, H. (1994): Characteristics of a resistance-breaking strain of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease. European Journal os Plant Pathology, 100: 347-356. Varrelmann, M. and Maiss, E. (2000): Mutations in the coat protein gene of plum pox virus suppress particle assembly, heterologous encapsidation and complementation in transgenic plants of Nicotiana benathamiana. J. Gen. Virol. 81: 567-576. Vaucheret, H., Beclin, C., Elmayan, T., Feuerbach, F., Godon, C., Morel, J. B., Mourrain, P., Palauqui, J. C. and Vernhettes, S. (1998): Transgene-induced gene silencing in plants. Plant Journal 16: 651-659. Vaucheret, H. and Vance, V. (2001): RNA silencing in plants- defence and counterdefence. Science, 292: 2277-2280. Verchot, J., Koonin, E. V. and Carrington, J. C. (1991): The 35-kDa protein from the Nterminus of the potyviral polyprotein functions as a third virus-encoded proteinase. Virology 185: 527-535. van der Vlugt, R. A. A., Ruiter, K. R. and Goldbach, R. (1992): Evidence for sense RNAmediated protection to PVYN in tobacco plants transformed with the viral coat protein criston. Plant Mol. Biol. 20: 631-639. Voinnet, O. (2001): RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics, 17, 8:449-459. Voinnet, O., Vain, P., Angell, S. and Baulcombe, D. (1998): Systemic spread of sequencespecific transgene RNA degradation in plants is inhibited by localised introduction of ectopic promoterless DNA. Cell 95: 177-187. Voinnet, O., Pinto, Y. M. and Baulcombe, D. C. (1999): Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14147-14152. Ward, C. W. and Shukla, D. D. (1991): Taxonomy of potyviruses: Current problems and some solutions. Intervirology 32: 269-296. Waterhouse, P. M., Wang, M-B and Finnegan, E. J. (2001a): Role of short RNAs in gene silencing. Trends in Plant Science 6; 7: 297-301.
107
Waterhouse, P. M., Wang, M-B. and Lough, T. (2001b): Gene silencing as an adaptive defense against viruses. Nature, 411:834-842. White, J. L. and Kaper, J. M. (1989): A simple method for detection of viral satellite RNAs in small plant tissue sampls. J. Virol. Methods 23: 83-94. van der Wilk, F. P.-L., Willink, D., Huisman, M. J., Huttinga, H. and Goldbach, R. (1991): Expression of potato leafroll luteovirus coat protein gene in transgenic potato plants inhibits viral infection. Plant Mol. Biol. 17: 431-439. Wilson, T. M. A. (1993): Strategies to protect crop plants against viruses: Pathogen-derived resistance blossoms. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3134-3141. Wisniewski, L. A., Powell, P. A., Nelson, R. S., Beachy, R. N. (1990): Local and systemic spread of tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants. Plant Cell 2: 559-567. Wolf, I. és Horváth, S. (2000): A burgonya Y vírus (potato Y potyvirus, PVY) törzseinek előfordulása burgonya-termőterületeken Magyarországon. Növényvédelem 36, 449-453. Xu, X. and Shaw, J. G. (1998): Evidence that assembly of a potyvirus begins near the 5’ terminus of the viral RNA. Journal of General Virology 79: 1525-1529. Yushibov, V. and Loesch-Fires, L. S. (1995): High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8980-8984. Zaitlin, M. (1976): Viral cross protection: more understanding is needed. Phytopathology 66: 382-383. Zambryski, P., Joos, H., Gentello, C., Leemans, J., Van Montagu, M. and Shell, J. (1983): Tiplasmid vector for the introduction of DNA into cells without altering their normal regeneration capacity. The EMBO Journal 2:2143-2150. Zinnen, T. M., Fulton, R. W. (1986): Cross-protection between sunn-hemp mosaic and tobacco mosaic viruses. J. Gen. Virology 67: 1679-1697. de Zoeten, G. A., Fulton, R. W. (1975): Understanding generates possibilities. Phytopathology 65: 221-222.
108
A disszertációhoz kapcsolódó tudományos közlemények jegyzéke:
Józsa, R., Stasevski, Z., Wolf, I., Horváth, S. and Balázs, E. (2002): Potato virus Y coat protein gene induced resistance in valuable potato cultivars. Acta Phytopathologica et Entomologica 1-2. Józsa, R., Stasevski, Z. and Balázs, E. (2002): High level of field resistance of transgenic tobaccoes induced by integrated potato virus Y coat protein gene. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 37 311-316. Józsa, R., Balázs, E. (2000): Víruseredetű köpenyfehérje gének által közvetített rezisztencia transzgénikus növényekben I. (Helyzetkép az ezredfordulón) Review, Növénytermelés 49, No. 1-2: 165-184. Józsa, R., Balázs, E. (2000): Víruseredtű köpenyfehérje gének által közvetített rezisztencia transzgénikus növényekben II. (Hatásmechanizmusok, lehetséges kockázati tényezők) Növénytermelés 49, No. 4: 447-453. Józsa, R. és Balázs, E. (2000): Burgonya Y vírus ellenállóság kialakítása génsebészeti úton dohány- és burgonyanövényekben. Az MTA általános Mikorbiológiai Bizottságának Tanácsadó Testületének űlése. 2000 október 4. Budapest. Józsa, R. és Balázs, E.: Burgonya Y vírus köpenyfehérje gén beépítése burgonyába. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest 1997. február 2425. Szilassy, D., Józsa, R., Palkovics, L., Salánki, K., Wittner, A., Szász, A. and Balázs, E. (1997): Coat protein mediated cross protection in different plant virus interactions. VIII th International Congress of Biotechnology, Budapest, Hungary; August 17-21. (Poster) Horváth, S., Wolf, I., Józsa, R. és Balázs, E.: Burgonya Y-vírus köpenyfehérje génnel transzformált burgonyavonalak rezisztenciája a burgonya Y (potato Y, PVY) potyvírussal szemben. VIII. Növénynemesítési Tudományos Napok. 2002. febr. 12-13. Budapest.
109
I. Wolf, R. Józsa, E. Balázs, S. Horváth: Resistance of an old Hungarian variety transformed with PVY-CP gene against PVY strains. European Association for Potato Research, Triennial Conference, Hamburg, july 15-19. 2002. L. Palkovics, R. Kryldakov, J. Nádudvari, R. Józsa and E. Balázs (2003): Sequence variants of potato virus Y in field grown tobacco with different resistance background including transgenic ones. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica ( közlésre benyújtva)
110
Köszönetnyilvánítás
Köszönetet szeretnék mondani Dr. Balázs Ervinnek, a Környezet Biotechnológiai Intézet igazgatójának, témavezetőmnek illetve Dr. Hornok Lászlónak, programvezetőmnek, hogy megteremtették a körülményeket kutatásaim elvégzéséhez és lehetővé tették disszertációm elkészítését. Köszönettel tartozom kollégáimnak Dr. Wittner Anitának, Dr. Szilassy Dénesnek, Dr. Palkovics Lászlónak és még sokan másoknak munkám során nyújtott értékes elméleti és gyakorlati segítségükért. Köszönöm Dr. Horváth Sándornak, Dr. Wolf Istvánnak és Dr. Nagy Gyulának, hogy lehetővé tették a transzgénikus vonalak szántóföldi vizsgálatát. A technikai téren nyújtott segítségükért pedig köszönet illeti Nagy Ágnest, Nádudvariné Novák Julikát és Takács Gábort.
111
1. Melléklet Vírusrezisztencia kiváltására irányuló kísérletek a transzgén CP eredete szerint, vírusnemzetségenként csoportosítva Alfamovirus nemzetség Tumer és munkatársai (1987) a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus –AMV) 4-es RNS-ét használták fel transzgén konstrukciók előállításához. Dohány és paradicsom növényeket használtak a transzformációkhoz, melyek leveleiből a kivonható összfehérjékből 0.1-0.8 %ban immunoblot analízissel mutatták ki a CP-t. A transzgénikus dohánynövényeket inokulálták 5 és 50 µg/ml koncentrációjú AMV-vel. Két héttel a fertőzés után a CP-t expresszáló (CP+) növényeken nem jelentek meg a vírustünetek, míg a CP-t nem termelő (CP-) növényeken léziók és szisztemikus mozaik tünetek fejlődtek ki. Ezekben a fogékony növényekben 400-szor nagyobb vírusmennyiséget találtak, mint a „CP+” növényekben. Loesch-Fries és munkatársai (1987) dohány és lucerna növényeket transzformáltak kétféle génkonstrukcióval. Az egyik a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus –CaMV) 19S promóterét és az AMV CP konstrukciót tartalmazta, míg a másik a CaMV 35S promótert és a CP:T-DNS ORF 25 3' vég szekvenciákat. A P19S:CP konstrukciót hordozó dohánynövények (33 vonal) leveleiből 0.05 %-ban mutatták ki a levél összfehérjéihez viszonyítva a CP-t, a P35S:CP konstrukcióval rendelkezőkből (34 vonal) pedig 0.13 %-ban. A P19S:CP transzgénikus utódok, melyek a legmagasabb szinten akkumulálták a CP-t, kevesebb elsődleges fertőzési tünetet mutattak, mint a „CP-” növények és ezekben a „CP+” növényekben a szisztemikus tünetek is lassabban fejlődtek ki. A 0.006 %-ban CP-t tartalmazó növények már nem voltak rezisztensek. Az ellenállóképesség hatásosnak bizonyult két AMV törzzsel szemben, de AMV RNS-el és TMV-vel történő fertőzéssel szemben már nem. Anderson és mtsai (1989) megfigyelték, hogy az AMV CP-t tartalmazó transzgénikus növények TMV-vel szemben érzékenyek, azonban 0.01-0.5 µg/ml burgonya X vírus (potato X potexvirus –PVX) vagy uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus –CMV) fertőzés esetén a szimptómák kifejlődésének késését tapasztalták.
112
Van Dun és mtsai (1987) lucernát transzformáltak P35S:AMV CP konstrukcióval. A vizsgált 240 növény 40 %-a expresszálta a CP gént, mely 0.05 %-ban volt jelen a levél összfehérjéiben. A transzgénikus növények ellenállóak voltak AMV fertőzéssel szemben. 5 hónappal az inokulációt követően sem fejlődtek ki a vírustünetek és az ezekből előállított protoplasztok is rezisztensnek mutatkoztak. Később dohánynövényeket is transzformáltak P35S:AMV CP:NOS 3' konstrukcióval. A 15 regeneráns vonalból 11-ben tapasztaltak CP expressziót, melyek megközelítőleg 0.05 %-ban tartalmazták a CP-t a levél kivonható fehérjéiben. A növények rezisztensek voltak AMV 'YSMV' törzzsel történő fertőzést követően, míg fogékonynak bizonyultak AMV RNS és dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus –TSV) fertőzés esetében is. Egy "frame-shift" mutációt tartalmazó konstrukcióval transzformált növények (melyek csak a CP mRNS-t akkumulálták, magát a CP-t nem) fogékonyak voltak AMV fertőzéssel szemben. Ezek az eredmények a fehérjetermék szerepére utalnak a rezisztencia kialakításában. Yushibov és Loesch-Fries (1995) szintén AMV CP-vel transzformáltak Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi dohánynövényeket, melyek hatékony védelmet nyújtottak a donorvírussal szemben. Mutáns, nem-transzlálódó CP gént tartalmazó konstrukciók használatát követően gyenge rezisztenciát tapasztaltak. Ez az eredmény arra mutatott rá, hogy az ellenállóképesség kialakításához nincs szükség a CP-k és az AMV RNS-ek közötti interakcióra. Carlavirus nemzetség Köpenyfehérje által kiváltott rezisztenciát hoztak létre a burgonya M vírus (potato M carlavirus –PVM) és burgonya S vírus (potato S carlavirus –PVS) köpenyfehérje gének felhasználásával is. MacKenzie és Tremaine (1990) ill. MacKenzie és mtsai (1991) dohánynövényekbe építették be a PVS 'An' izolátum CP génjét, mely által sikerült rezisztenciát kiváltani a transzgénikus vonalakban. Russet Burbank burgonyanövényeket transzformáltak a konstrukcióval és azt tapasztalták, hogy a CP-t expresszáló vonalak ellenállóak voltak PVS 'An'-nel szemben, míg PVM-mel szemben kevésbé. Cucumovirus nemzetség Quemada és mtsai (1991) CMV 'C' törzsének CP-jével transzgénikus N. tabacum L. cv. Xanthi vonalakat állítottak elő. A rezisztencia mértéke változó volt és függött a fertőzéshez használt törzstől (CMV 'C' subgroup 1, 'Chi' sg. 1, 'WL' sg. 2). A fertőzéseket mechanikailag és levéltetvek segítségével is elvégezték. Megfigyelték, hogy a köpenyfehérjét expresszáló vonalak CMV 'C'-
113
vel szemben magas fokú rezisztenciát mutattak, míg CMV 'Chi'-vel szemben megközelítőleg 20 %-uk illetve CMV 'WL'-lel szemben mintegy 50 %-uk megfertőződött. A köpenyfehérjét nem termelő vonalak CMV 'C' esetén 50 %ban fertőződtek, míg a CMV 'Chi' és 'WL' törzsek esetében 100 %-os volt a fertőzöttség. Okuno és mtsai (1993) CMV köpenyfehérje génnel transzgénikus dohánynövényeket fertőztek CMV virionnal és RNS-el. A növények mindkét esetben ellenállóak voltak, míg protoplasztok RNS-el történő fertőzésekor nem maradt fenn az ellenállóképesség. 34 0C-on végzett hőkezeléses kísérletek során azt tapasztalták, hogy a növényekben csökkent a rezisztencia szintje vagy akár teljesen el is tűnt. Mivel a CP magas hőmérsékleten instabil, ez az eredmény a köpenyfehérje szerepére utal CMV-vel szembeni rezisztencia kialakulásában. CMV 'D', 'WL' és 'O' izolátumok köpenyfehérje génjeivel transzformáltak dohánynövényeket Cuozzo és mtsai (1988), Namba és mtsai (1991) és Nakajima és mtsai (1993). CMV 'D' esetében védettséget tapasztaltak CMV 'C'vel szemben, CMV 'WL' eredetű transzgént hordozóknál CMV 'C', 'Chi' és 'WL'-el szemben, valamint CMV 'O' CP használatakor CMV 'O' fertőzést követően. Enamovirus nemzetség A borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus –PEMV) CP génjét tartalmazó konstrukció felhasználásával Chowrira és mtsai (1998) vírusellenállóságot hoztak létre borsóban. Axilláris merisztémasejteket transzformáltak injektálással és elektroporálással. A transzgénikus növényekben a kontroll növényekhez képest késői és alacsonyabb szintű PEMV replikációt, illetve gyengült tünetek kifejlődését tapasztalták. Furovirus nemzetség Kallerhoff és mtsai (1990) a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein furovirus /újabban benyvirus/ -BNYVV) CP génjét használták fel cukorrépa protoplasztok Agrobacterium-os transzformációjára. A sejtszuszpenzióból CP-t expresszáló transzformált protoplasztokat izoláltak, melyeket fertőzve rezisztenciát tapasztaltak. Megközelítőleg a sejtek 2 %-a volt transzformáns, melyek 200 mg/l kanamicint tartalmazó szelektív táptalajon is képesek voltak növekedni. A rezisztencia magas inokulum koncentráció mellett is megmaradt és RNS-el történő fertőzés esetében sem tapasztaltak vírusreplikációt.
114
Geminivirus nemzetség Kunik és mtsai (1994) transzgénikus paradicsomnövényeket állítottak elő a paradicsom sárga levélgöndörödés vírus (tomato yellow leaf curl geminivirus – TYLCV), amely egyszálú DNS-t tartalmazó vírus, köpenyfehérje génjének felhasználásával. A növények ellenállóak voltak a későbbi vírustámadással szemben. A kísérlethez a Lycopersicon esculentum x L. pennellii hibrid F1 nemzedékét használták, mivel ez a természetes paradicsommal azonos fogékonyságú, viszont a regenerációs kapacitása annál nagyobb. A CP génnel (V1) transzformált növényeket, fehérlegyek segítségével fertőzték meg. A tünetek kifejlődésének késését és recovery jelenséget is tapasztaltak. Ismételt fertőzések esetében sem mutatták ki a rezisztencia csökkenését, inkább annak erősödését figyelték meg. Kilenc transzgénikus vonalból hatban fordult elő fehérje akkumuláció. A kontrollokhoz hasonlóan érzékeny transzformált növények csak a V1 RNS-t expresszálták, míg azok, melyek magát a CP-t is termelték, képesek voltak felépülni, vagy ellenállóságot kialakítani. Ilarvirus nemzetség Van Dun és mtsai (1988) TSV 'WC' törzsének CP génjével transzformáltak N. tabacum cv. Samsun és Xanthi dohánynövényeket. A növények fertőzését 10 µg/ml koncentrációjú TSV inokulummal végezték. A szisztemikus szimptómák a kontroll és a „CP-” növényeken 3 héten belül kifejlődtek, míg a „CP+” vonalakban 3 hét után sem alakultak ki. Luteovirus nemzetség Kawchuk és mtsai (1990) burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll luteovirus –PLRV) köpenyfehérje gént használtak Desiree, majd Russet Burbank burgonyafajták transzformációjához. A gént hordozó vonalak rezisztensnek bizonyultak PLRV fertőzéssel szemben, bár a magas transzkriptumszint ellenére alacsony köpenyfehérje mennyiséget mutattak ki: 0.01 %-ot az összes levélproteinhez viszonyítva. Ennek magyarázata lehet a CP mRNS alacsony transzlációs hatékonysága vagy a protein alegység instabilitása, de előfordulhat, hogy a köpenyfehérje csak egy bizonyos szövettípuson belül stabil, pl a floem sejtekben. A transzgénikus vonalak ellenállóképességét, sem a levéltetűvel történő fertőzés, sem a magas inokulumkoncentráció nem törte át.
115
Nepovirus nemzetség Az arabis mozaik vírus (arabis mosaic nepovirus –ArMV) és a szőlő króm mozaik vírus (grapevine chrome mosaic nepovirus –GCMV) köpenyfehérje génjeit használták fel Brault és mtsai (1993) köpenyfehérje által indukált keresztvédettség kialakításához dohánynövényekben. A GCMV CP-t hordozó növények magas szinten expresszálták a köpenyfehérje gént, ami rezisztenciát is eredményezett. Néhány növény megfertőződött ugyan, de a kontrollokhoz képest alacsony szinten akkumulálták a vírus RNS-t. Az ellenállóság tisztított vírus RNS-sel történő fertőzés esetében is megmaradt. Azt tapasztalták, hogy csak a magas szintű CP expresszió eredményez csak rezisztenciát. Néhány növény 1 µg/ml inokulum koncentrációnál is megfertőződött, míg magas koncentrációnál (10 µg/ml) már a nagy részük. Ezek azonban jóval kevesebb RNS-t halmoztak fel, mint a szintén megfertőződött kontrollnövények. RNS-sel történő fertőzésnél is hasonló eredményeket kaptak. Potexvirus nemzetség Leclerc és AbouHaidar (1995) burgonya aucuba mozaik vírus (potato aucuba mosaic potexvirus –PAMV) köpenyfehérje génnel transzformáltak Nicotiana benthamiana növényeket. Négyféle génkonstrukciót állítottak elő: teljes hosszúságú (full length) CP gén, két csonkított CP gén (az egyikben az Nterminális régióból 46 aminosavat kódoló génszakaszt vágtak ki „NT 138”, míg a másikban a konzervatív „core” régióból 86 aminosavat kódoló szakaszt töröltek „CT 258”) és egy antiszensz CP gén konstrukciót. A teljes hosszúságú és az NT 138 transzgéneket hordozó növényekből kimutatták a mRNS-t és a fehérjeterméket, míg a CT 258 és az antiszensz konstrukciókkal transzformált vonalakból csak a mRNS-t tudták kimutatni, a fehérjét nem. PAMV-vel történő fertőzést követően a tünetek kialakulásának késését tapasztalták a teljes hosszúságú, a CT 258 és az antiszensz géneket hordozó vonalakban. Az NT 138 konstrukciót hordozó növényekben azonban nem alakult ki ellenállóképesség. A leghatékonyabbnak az antiszensz géneket hordozó konstrukciók bizonyultak. A csonkított „core” régió felhasználásával kimutatták, hogy CP általi rezisztencia kiváltásához nemcsak a teljes hosszúságú géneket hordozó konstrukciókat lehet felhasználni. Chia és mtsai (1992) cymbidium mozaik vírus (cymbidium mosaic potexvirus –CyMV) CP génjével transzformáltak dohánynövényeket, melyek rezisztensek voltak a későbbi CyMV fertőzésekkel szemben. Hoekema és mtsai (1988) PVX CP génnel transzformáltak burgonyanövényeket, és 1 µg/ml PVX koncentrációval történő fertőzés esetén
116
a tünetkifejlődés késését és vírusakkumuláció-csökkenést tapasztaltak a transzgénikus vonalakban. Jongedijk és mtsai (1992) Bintje és Escort burgonyafajtákat transzformáltak szintén PVX köpenyfehérje génnel. A szántóföldi vizsgálatok során pozitív korrelációt tapasztaltak az akkumulált CP szint és a rezisztencia szintje között, azonban ez a korreláció a közepes szinten expresszálóknál nem volt egyértelműen kimutatható. PVX-szel szembeni ellenállóságot váltottak ki van der Wilk és mtsai (1991) dohánynövényekben, míg Lawson és mtsai (1990) Russet Burbank burgonyában. Ebben az esetben a transzgénikus növény fogékony volt PVY-nal szemben, azonban egy olyan konstrukció használata által, mely nemcsak a PVX, hanem a PVY köpenyfehérje génjét is tartalmazta, a növények ellenállóvá váltak mindkét vírussal szemben. Fehér és mtsai (1992) a PVX 'G' izolátumának CP génjét használták fel burgonya transzformációkhoz. Desirée és Gracia gumókorongokat transzformáltak Agrobacterium segítségével. A CP gén expressziós szintje alacsony, de kimutatható volt (Northern, Western analízissel). Az inokulált levelekben a kontrollokhoz képest a vírus RNS csökkent akkumulációját tapasztalták a transzformánsok nagy részében, sőt 18 nappal a fertőzés után egy vonalban 4-10-szeres csökkenést észleltek. Potyvirus nemzetség (lásd a dolgozatban, 25. old) Tenuivirus nemzetség Rizsprotoplasztok elektroporációs transzformációjához Hayakawa és mtsai (1992) a rizs csíkosság vírus (rice stripe tenuivirus –RSV) köpenyfehérje génjét használták fel, és ennek következtében RSV fertőzéssel szemben ellenálló növényeket kaptak. Minden egyes kalluszvonalból számos növényt regeneráltak. A transzgénikus növények magas szinten (0.5 %-ban) expresszálták a CP-t az összes oldható fehérjéhez viszonyítva. A rezisztenciavizsgálatokat az utódnemzedékeken végezték. A fertőzést sarkantyús kabócákkal (Delphacidae család) végezték. Nyolc héttel a fertőzést követően a transzgénikus növényekben nem volt kimutatható a vírus által kódolt protein, ami arra utalt, hogy a védekezőmechanizmus a vírusreplikáció előtt lépett fel. A nem-transzgénikusok 80 %-a, valamint a CP-t nem termelő transzgénikusok azonban 15 nappal a fertőzés után megbetegedtek. Ez a kísérlet bizonyította, hogy a köpenyfehérje által indukált rezisztencia jelensége
117
kiterjeszthető a gabonafélékre is és olyan vírusok esetében is létrejöhet, amelyek csak rovarvektorokkal terjednek. Tobamovirus nemzetség Paradicsom transzformációhoz használták fel Sanders és mtsai (1992) valamint Nelson és mtsai (1988) a TMV 'U1' törzs illetve a paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus –ToMV) CP génjét. A TMV CP-vel transzgénikus növények rezisztensek voltak az 'U1' és egy súlyosabb károkat okozó, un. 'PV 230'-as törzzsel szemben, viszont ToMV fertőzés esetén fogékonyként viselkedtek. A ToMV köpenyfehérjét hordozó vonalak védettek voltak ToMV fertőzéssel szemben. A CP-t alacsonyabb szinten expresszáló vonalak erősebb rezisztenciával rendelkeztek, mint a magasabb szinten expresszálók. A TMV CP és a ToMV CP-k közötti homológia eléri a 88 %-ot, ez azonban a korábban tapasztaltaktól függetlenül, mégsem eredményezett ellenállóságot a TMV CP - ToMV fertőzéssel szemben. Clark és mtsai (1990) dohánynövényeket transzformáltak TMV CP-t tartalmazó konstrukciókkal. Egy esetben promóterként a 35 S promótert használták, más konstrukciókban pedig az rbcS promótert, mely elsődlegesen a mezofillumsejtekben működik. A vizsgált transzgénikus növényvonalak eltérő rezisztenciával rendelkeztek, melyet a felhasznált promóter kimutathatóan befolyásolt. A 35S esetében az ellenállóképesség a növény egészében erősebb volt, kivéve a mezofillumsejteket illetve a protoplasztokat, ahol a két különböző promóter használata esetén nem találtak különbséget a rezisztencia szintje között. Reimann-Philip és Beachy (1993) kimutatták, hogy a TMV köpenyfehérje génnel transzformált dohánynövényekben a rezisztencia kialakításához szükséges a CP jelenléte. Tisztított vírus RNS-sel történő fertőzésnél az ellenállóképesség erőteljesen lecsökkent, de teljesen nem tűnt el. A köpenyfehérjét felhalmozó vonalak nem fertőződtek meg, míg azok, amelyek nem halmozták fel a CP-t alacsonyabb víruskoncentrációnál is fertőződtek. A köpenyfehérje termelődése nemcsak TMV-vel szemben eredményezett rezisztenciát, hanem más, a tobamovírus nemzetségbe tartozó rokon törzsekkel szemben is, ez viszont függött a CP-k aminosavhomológiájától. Feltételezték, hogy a köpenyfehérje valószínűleg az RNS 5' végére kötődve gátolja a riboszómákhoz kötődését. A CP által kiváltott rezisztencia TMV esetében eltér a klasszikus keresztvédettség jellemzőitől, mivel abban az esetben közvetlen kapcsolata van a fertőző vírusnak a gyengített vírus köpenyfehérjéjével, illetve RNS-ével vagy valamely növényi védekezési reakcióval, míg CPMR esetében a
118
dohány és a TMV kapcsolatban nem találtak speciális vagy általános növényi válaszreakciót. Clark és mtsai (1995) is azt tapasztalták, hogy transzgénikus dohánynövények, melyek a TMV 'U1' törzsének köpenyfehérje génjét expresszálták rezisztensek voltak több tobamovírussal szemben is. A fertőző vírus felületi fehérjéi szerepének vizsgálatára mutáns TMV 'U1' konstrukciót hoztak létre, mely a bengáliai kender vagy Crotalaria mozaik vírus (sunn hemp mosaic tobamovirus –SHMV) amino- vagy karboxiterminális régióját tartalmazta. A mutáns vírus nem törte át a TMV által előidézett rezisztenciát, viszont az a kiméra konstrukció, melynek köpenyfehérje génje teljes mértékben az SHMV-től eredt, az SHMV-hez hasonló tüneteket idézett elő. Ez az eredmény az ellenállóság kialakításának szempontjából a transzgéntermék és a fertőző vírus aminosavszekvenciái közötti interakcióra utal, melyben valószínűleg nem a köpenyfehérje felületén található aminosavak játszanak fő szerepet. Tobravirus nemzetség Van Dun és mtsai (1987), illetve van Dun és Bol (1988) dohány rattle vírus (tobacco rattle virus –TRV) 'TCM' törzsének köpenyfehérje génjét használták fel Samsun dohánynövények transzformációjához. A cDNS a CP-n kívül tartalmazott szekvenciákat az 5' nemkódoló és a 3' nemkódoló régiókból is, több, mint 400 nukleotidot. Ezt a 35 S promóter és a NOS terminátor közé építették be. A „CP+” vonalakban 0.05 %-ban mutatták ki a köpenyfehérjét az összfehérjéhez viszonyítva. Ezekben a vonalakban enyhe nekrózist figyeltek meg 1 µg/ml TRV 'TCM' fertőzést követően, viszont nem tudták kimutatni a TRV RNS-t. Ezzel szemben a „CP-” növényekben nekrotikus foltok jelentek meg az inokulált leveleken és súlyos nekrózis a szisztemikusan fertőződött száron és leveleken. A „CP+” vonalakat további vizsgálatokba bevonva fertőzték TRV 'PLB' törzzsel valamint borsó korai barnulás vírussal (pea early browning tobravirus –PEBV). A TRV 'TCM' és 'PLB' törzseinek köpenyfehérjéi közötti aminosavszekvencia-homológia megközelítőleg 39 % és mindkét CP képes a másik törzs RNS-ének becsomagolására. A PEBV izolátum és a 'TCM' törzs köpenyfehérjéi közötti homológia ennél alacsonyabb szintű, ezért meglepő, hogy míg a „CP+” növények TRV 'PLB' fertőzéssel szemben érzékenyek voltak, addig PEBV-vel szemben rezisztensnek bizonyultak. Mindebből arra következtettek, hogy valószínűleg nem az RNS:CP interakció a köpenyfehérje által kiváltott rezisztencia fő hatásmechanizmusa, hiszen a két TRV képes a másik RNS-t becsomagolni, viszont védelmet nem nyújtottak egymással szemben.
119
Angenent és mtsai (1990) pedig TRV 'PLB' izolátum CP génjével transzformáltak dohánynövényeket, melyek TRV 'PLB' fertőzéssel szemben rezisztensek voltak, TRV 'TCM' fertőzés esetén azonban fogékonyak. Tombusvirus nemzetség Dohánynövények transzformációjára használták fel a cymbídium gyűrűsfoltosság vírus (cymbidium ringspot tombusvirus –CymRSV) CP génjét Rubino és mtsai (1993). A N. benthamiana növények csupán 0.05 µg/ml CymRSV inokulumkoncentráció esetén voltak védettek. A rezisztencia szintje az alacsonytól a közepesig terjedt. Magasabb, azaz 0.5 vagy 5 µg/ml víruskoncentráció esetén csupán néhány napos tünetkifejlődés-késést tapasztaltak. RNS-sel történő fertőzést követően pedig a növények fogékonyak voltak. Tospovirus nemzetség De Haan és mtsai (1992) valamint MacKenzie és Ellis (1992) a paradicsom foltoshervadás vírus (tomato spotted wilt tospovirus –TSWV) N génjét használták fel dohánynövények transzformációjára. A vírus negatív szálú RNS-t tartalmaz, melynek N génje képezi a nukleokapszidot. TSWV-vel történő fertőzést követően magas szintű rezisztenciát figyeltek meg tripsz átvitel esetén is, amely azonban más tospovírusokkal szemben nem működött, holott akár 80 %-os homológia is előfordul az egyes vírusok között. 23 vonalból 4-ben transzlációdefektív transzgén volt, de ezekben szintén nagyfokú rezisztenciát tapasztaltak. Megfigyelték, hogy a rezisztencia a nem-transzlálódott N gén RNS akkumulációjának függvényében változott illetve függött a transzgén és a fertőző vírusgén közötti homológia mértékétől. Goldbach és de Haan (1993) szintén TSWV N génnel transzformáltak növényeket, melyek tripsz általi fertőzéssel szemben is rezisztensek voltak. A transzlációdefektív transzgéneket hordozó vonalak is ellenállónak bizonyultak, mely eredmények az előzőekkel egybevágóan a rezisztencia RNS-függőségét bizonyították. Pang és mtsai (1993) TSWV 'BL' szensz és antiszensz nemtranszlálódó N génekkel transzformáltak dohánynövényeket, melyek rezisztensek voltak homológ és közeli rokon izolátumokkal szemben, azonban távolabbi rokon tospovírusok esetében nem. Az így létrejövő RNS-függő rezisztencia azoknál a vonalaknál volt a leghatékonyabb, melyek alacsony szinten expresszálták az RNS-t. Protoplasztkísérletekből levont következtetések alapján feltételezték, hogy az ellenállóság a replikáció gátlásából ered. Ellentétben a szensz RNS
120
általi rezisztenciával, az antiszensz RNS-ek esetében a védelmi reakció függött az inokulumkoncentrációtól és a növény korától. Korábbi tapasztalatokhoz hasonlóan a homológ és a közeli rokon vírusokkal szembeni rezisztencia esetében alacsony szintű volt az N gén expressziója és nem volt kimutatható a fehérjetermék. Vaira és mtsai (1995) TSWV egyik olasz izolátumának N génjével transzformáltak N. benthamiana növényeket. A transzgénikus vonalakat tesztelték TSWV izolátumokkal és 3 másik tospovírussal szemben: földimogyoró rügynekrózis vírus (groundnut bud necrosis tospovirus –GBNV), földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus (groundnut ringspot tospovirus –GRSV), nebántsvirág nekrotikusfoltosság vírus (impatiens necrotic spot tospovirus – INSV). Tizenhárom vizsgált vonalból kettő bizonyult rezisztensnek a többi TSWV izolátummal szemben, azonban ezekben a növényekben a transzgén expresszió alacsonyabb volt, mint bármelyik fogékony vonalban, és az N protein hiányzott vagy nem volt detektálható. Más tospovírusokkal történő fertőzésekkel szemben viszont fogékonyak voltak, egyedül GRSV esetében tapasztaltak enyhébb szimptómákat. Azokban a vonalakban, melyek nagyobb mennyiségű proteint termeltek, 2-3 hetes késéssel fejlődtek ki a fertőzésre utaló tünetek legalább egy TSWV izolátummal szemben. Szintén késést vagy gyengülést észleltek INSV és/vagy GRSV által okozott tünetekben. Megfigyelték tehát, hogy a magas N gén expresszió esetenként visszatarthatja a szimptómák kifejlődését TSWV és INSV-vel történő fertőzésnél, azonban a detektálható expresszió hiánya TSWV-specifikus rezisztenciát eredményez. Pang és mtsai (1993) kimutatták, hogy a TSWV rezisztencia alacsony szinten expresszálóknál RNS-függő, míg magas szinten expresszálóknál TSWV-vel és INSV-vel szemben protein-függő. Gielen és mtsai (1991) azonban nem találtak összefüggést a rezisztencia szintje és a fehérjetermék mennyisége között. Feltételezték, hogy a védettség RNS-függő. GRSV esetében magas szinten expresszálóknál tünetkifejlődés -késést tapasztaltak, míg a korábbi kutatási eredmények nem találtak összefüggést az expressziós szint és a rezisztencia között ennél a vírusnál. GBNV-vel szemben minden vonal fogékonynak bizonyult, ami valójában nem meglepő, mivel genetikailag távolabb helyezkedik el a TSWV-től. Prins és mtsai (1995) transzgénikus dohánynövényeket állítottak elő olyan génkonstrukcióval, mely 3 tospovírus köpenyfehérje génjeit tartalmazta 35 S promóter és NOS terminációs szignálok közé építve. A TSWV, a GRSV és a paradicsom klorotikus foltosság vírus (tomato chlorotic spot tospovirus – TCSV) köpenyfehérje géneket hordozó transzgénikus vonalak magas fokú rezisztenciával rendelkeztek mindhárom vírussal szemben, ezáltal lehetőséget adva széles spektrumú rezisztencia kialakítására.
121
Burgyán és mtsai (1998) TSWV 'Hm' izolátumának nukleoprotein/N génjét építették be Agrobacterium segítségével dohánynövényekbe. 82 független transzfománs vonalat kaptak, melyek közül 8 bizonyult vírusellenállónak. Ezek a vonalak az ismételt felülfertőzéssel szemben is ellenállóak voltak. A tesztelés TSWV 'Hm' izolátummal fertőzött dohánynövények szövetnedvével, mechanikai úton történt. 14 nappal ezt követően a növények fele a transzgénmentes kontrollokhoz hasonló tüneteket mutatott (erős szisztemikus mozaik, levéldeformáció, nekrotikus lokális léziók). Majd ezek a növények lassú ütemben el is pusztultak. 13 tünetmentes növényt újra inokuláltak, amelyekből 5 vonal esetében két héttel később még nem, de egy hónap elteltével már lokális léziókat figyeltek meg, majd ezek egyre súlyosabb tünetekké fejlődtek. Így ezek vírusellenállósága részleges volt, míg a tünetmentes 8 növényen két hónap elteltével sem alakultak ki a tünetek. A vírust is csupán a tünetes növényekből tudták kimutatni.
122
2. Melléklet Köpenyfehérje gének által kiváltott rezisztencia vírusnemzetségenként Vírus-
beépített
transzformált
nemzetség
CP
növény
AMV AMVYSMV Alfamo-virus
dohány, paradicsom dohány
AMV-425
dohány, lucerna
AMV
lucerna
AMV
dohány
AMV
dohány, lucerna
AMV PVS-An Carla-virus
dohány (Xanthi) N. debneyii burgonya
PVS-An
(Russet Burbank)
CMV-C CMV-C
dohány dohány (Xanthi)
rezisztencia AMV (+) AMV-YSMV (+), TSV (-)
referencia Tumer és mtsai, 1987, 1991 van Dun és mtsai, 1987
AMV-425 (+),
Loesch-Fries és mtsai,
AMV-McKinney (+)
1987
AMV (+)
Halk és mtsai, 1989
PVX (+), CMV (+-),
Anderson és mtsai,
TMV(-)
1989
AMV (+)
Hill és mtsai, 1991
AMV (+) PVS-ME (+)
Yushibow és mtsai, 1995 MacKenzie és Tremaine, 1990
PVS-An (+),
MacKenzie és mtsai,
PVM (+-)
1991
CMV-C (+)
Cuozzo és mtsai, 1988
CMV-C (+), CMVChi(+), CMV-WL(+-)
Quemada és mtsai, 1991
CMV-WL (+), CMV-C Cucumo-
CMV-WL
dohány
(+),
Namba és mtsai, 1991
CMV-Chi (+)
virus CMV
tök
CMV-O
dohány
CMV-Y
dohány
CMV (+)
Gonsalves és mtsai, 1992
CMV-O (+),
Nakajima és mtsai,
CMV-Y (+)
1993
CMV-Y (+)
Okuno és mtsai, 1993
123
Vírus-
beépített
transzformált
nemzetség
CP
növény
Enamo-virus
PEMV
borsó
Furo-virus
BNYVV
Gemini-virus
TYLCV
cukorrépa (protoplaszt) paradicsom dohány
Ilar-virus
TSV-WC
(Xanthi, Samsun)
rezisztencia
referencia
PEMV (+)
Chowrira és mtsai, 1998
BNYVV (+) TYLCV (+) TSV-WC (+), AIMV (+)
dohány, PLRV
burgonya
PLRV (+)
(Desiree) burgonya Luteo-virus
PLRV
(Russet
PLRV (+)
Burbank)
Nepo-virus
Kallerhoff és mtsai, 1990 Kunik és mtsai, 1994 van Dun és mtsai, 1988
Kawchuk és mtsai, 1990 Kawchuk és mtsai, 1991 van der Wilk, 1991,
PLRV
burgonya
PLRV (+)
ArMV
dohány
ArMV (+)
Bertioli, 1992
GCMV
dohány
GCMV (+)
Brault és mtsai, 1993
Barker, 1992
van der Wilk és mtsai, PVX
dohány
PVX (+)
1991, Hemenway, 1988 Hoekema és mtsai,
PVX
burgonya
PVX (+)
1988, Kaniewski és mtsai, 1990
burgonya Potex-virus
PVX
(Russet Burbank)
PVX+ PVY PVX
PVX (+), PVY (-)
burgonya (Russet
Lawson és mtsai, 1990 Lawson és mtsai, 1990
PVX+PVY (+)
Burbank) burgonya (Bintje, Escort)
PVX (+)
Jongedijk és mtsai, 1992
PVX-G
burgonya
PVX-G (+)
Fehér és mtsai, 1992
CyMV
dohány
CyMV (+)
Chia és mtsai, 1992
124
Vírus-
beépített
transzformált
nemzetség
CP
növény
PAMV
N. benthamiana
SMV-N
dohány
BYMV
N. benthamiana
PPV
N. clevelandii
Potex-virus folyt.
PPV
N. clevelandii,
rezisztencia PAMV (+) PVY (+), TEV (+), TMV-U1 (-)
referencia Leclerc és AbouHaidar, 1995 Stark és Beachy, 1989
BYMV (+-), PepMoV
Hammond és Kamo,
(-), TuMV (-)
1995
?
da Camara Machado és mtsai, 1990
PPV (+)
Regner és mtsai, 1992
(Xanthi),
PPV (+),
Ravelonandro és mtsai,
N. clevelandii,
PVY (+)
1993 Scorza és mtsai, 1994
N. benthamiana
dohány PPV
N. benthamiana
Poty-virus
PPV
szilva
PPV (+)
PPV
N. benthamiana
PPV (+)
dohány
LMV (+),
(Xanthi)
PVY (+)
LMV MDMV WMV II, ZYMV ZYMV
kukorica N. benthamiana sárgadinnye burgonya
PVY-O
(Russet Burbank)
PVY-N
MDMV (+), MCMV (+) WMV II (+), ZYMV (+) ZYMV (+) PVY-O (+) PVX (-)
burgonya
PVY-N (+),
(Bintje)
PVY-O (-) PVY-N (+),
PVY-N
dohány
PVY-N (+), PVY-O (+)
Palkovics és mtsai, 1995 Dinant és mtsai, 1993 Murry és mtsai, 1993 Namba és mtsai, 1992 Fang és Grumet, 1993 Lawson és mtsai, 1990
Farinelli és mtsai, 1992 van der Vlugt és mtsai, 1992 Farinelli és Malnoe, 1993
125
Vírus-
beépített
transzformált
nemzetség
CP
növény
PVY
dohány
rezisztencia
referencia
PVY-NTN (+)
Kollár és mtsai, 1993 Smith és mtsai, 1995,
PVY
burgonya
PVY (+)
Stark és Beachy, 1989, Kaniewski és mtsai, 1990
TVMV Poty-virus folyt.
TVMV (+), TEV (+)
Murphy és mtsai, 1990
PVY, PepMoV, TEV PRSV
dohány, papaya
(+),
Ling és mtsai, 1991
CMV-C(-) PRV
papaya
PStV
N. benthamiana
TEV
dohány
TEV Tenui-virus
dohány
dohány (Burley 49)
PRV (+)
Fitch és mtsai, 1992
PStV (+),
Cassidy és Nelson,
TEV (-)
1995
TEV (+-) TEV (+)
RSV
rizs
RSV (+)
TMV-U1
dohány
TMV-U1 (+)
Lindbo és Dougherty, 1992b Dougherty és mtsai, 1994 Hayakawa és mtsai, 1992 Powell és mtsai, 1986
TMV-U1, TMV-PV230 TMV-U1
paradicsom
(+), ToMV-L (+), ToMV-2
Nelson és mtsai, 1988
(+-) TMV, ToMV,
Tobamovirus
TMV
dohány
TMGMV, ORSV, PMMV (+),
Nejidat és mtsai, 1990
RMV, SHMV (-) Anderson és mtsai, TMV
dohány
TMV (+)
1989, Clark és mtsai, 1990, Reimann-Philip és Beachy, 1993
126
Vírus-
beépített
transzformált
nemzetség
CP
növény
TMV-U1
dohány
referencia
mut. TMV (+),
Clark és mtsai, 1995
TMV-U1+SHMV CP
Tobamovirus folyt.
rezisztencia
(-) ToMV-C
paradicsom
TMV-U1 (+),
Sanders és mtsai, 1992
ToMV-C (+) TRV-
dohány
TRV-TCM (+)
van Dun és mtsai, 1987
TRV-
dohány
TRV-TCM (+), PEBV
van Dun és Bol, 1988
TCM
(Samsun)
TCM Tobra-virus
(+), TRV-PLB(-)
TRV-PLB Tombus-
dohány
TRV-PLB (+),
Angenent és mtsai,
TRV-TCM (-)
1990
CyRSV
dohány
CyRSV (+)
Rubino és mtsai, 1993
TSWV
dohány
TSWV (+)
MacKenzie és Ellis,
virus 1992, de Haan és mtsai, 1992, Goldbach és de Haan, 1993 TSWV-
dohány
TSWV-BL (+)
Pang és mtsai, 1993
dohány
TSWV (+),
Prins és mtsai, 1995
BL Tospo-virus
TSWV+T CSV+GR
TCSV (+),
SV
GRSV (+)
TSWV
N. benthamiana
olasz iz.
TSWV, INSV,
Gielen és mtsai, 1991
GRSV(+-),
Vaira és mtsai, 1995
GBNV(-) TSWVHm
dohány
TSWV-Hm (+)
Burgyán és mtsai, 1998
