A biotinidáz defektus laboratóriumi diagnosztikája Milánkovics Ilona Dr. Somogyi Csilla Dr. Ujvári Anna Dr. Schuler Ágnes Budai Gyermekkórház Budapest
A biotinidáz defektus laboratóriumi diagnosztikája
Az újszülöttkori tömegszőrés és ezen belül a biotinidáz defektus szőrésének történeti áttekintése A jelenlegi szőrési módszerünk bemutatása A biotinidáz defektus molekuláris genetikai diagnosztikája
Az újszülöttkori tömegszőrés története 1908 – Sir Archibald Garrod elıször írja le, hogy VELESZÜLETETT ANYAGCSEREBETEGSÉG (inborn error of metabolism). Egy alkaptonúriás gyermeket diagnosztizál.
Az újszülöttkori tömegszőrés története 1934 – Egy norvég orvos, Asbjörn Fölling leírja a fenilketonúriát. Egy fiatal nı 4 és 7 éves mentálisan retardált gyermekeivel kereste fel az orvost. Mindkét gyermeknek rendkívül furcsa szaga volt… Ferri-klorid teszt segítségével a vizeletben fenilketonokat mutat ki.
Az újszülöttkori tömegszőrés története 1951 – Prof. Horst Bickel kifejleszti a PKU terápiás módszerét. Fehérje szegény diéta és fehérje pótló ital.
Az újszülöttkori tömegszőrés története 1958 – Robert Guthrie kidolgozza a PKU, majd késıbb a galaktozémia szőrésének módszerét. Az İ zseniális ötlete a szőrıpapíros vérminta alkalmazása is.
Az újszülöttkori tömegszőrés története A szőrés követelményei: Egyszerő Gyors Olcsó Szállítható vérminta Ismételhetı vizsgálat
Az újszülöttkori tömegszőrés története 1966 – A Guthrie-teszt és ezzel együtt az újszülöttkori szőrés az egész világon orvosi gyakorlattá válik. Robert Guthrie számos interjút ad és mindenhol igyekszik a metodikát ismertetni, de hamarosan az eredmények önmagukért beszélnek. Sorra szőrik ki a PKU-s és galaktozémiás babákat világszerte.
Az újszülöttkori tömegszőrés története Magyarországon 1968 - kísérleti jelleggel a Szegedi Klinikán Dr. Szabó Lajos irányítása alatt elindul a fenilketonúria szőrése. (1965 – New York államban és Angliában elindul a törvényileg szabályozott tömegszőrés.)
Az újszülöttkori tömegszőrés története Magyarországon
1975 – Egészségügyi Minisztériumi rendelet alapján a szőrést kiterjesztik országos mérető tömegszőréssé, két központot hozva létre: Szegedi Gyermekklinika Budapesti Központ
Az újszülöttkori tömegszőrés története Magyarországon 1976 – elindul a galaktozémia szőrése Guthrie-teszttel. 1982 – elindul a kongenitális hipotireózis szőrése.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története 1936 – F. Kogel biotint izolál. 1940 – P. György és munkatársai H vitaminként határozzák meg a molekulát.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története
1954 – R.W. Thoma és W.H. Peterson leírja a biotinidáz enzimet. 1963 – J. Knappe és munkatársai leírnak egy módszert a biotinidáz enzim kimutatására.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története
A következı évtizedekben számos kutatás indul. Megismerjük a biotin ciklust, a biotin dependens karboxilázokat ill. ezek mőködését.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története
1980-as évek elején számos tanulmány jelenik meg, mely tisztázza a különbséget a holokarboxiláz szintetáz defektus, illetve a biotinidáz defektus között. Egyre többet tudunk a biotinidáz defektus klinikai megjelenésérıl.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története 1984 – Gregory S. Heard (Barry Wolf csoport) továbbfejleszti Knappe 1963-ban leírt biotinidáz kimutatási metodikáját. Ezáltal lehetıvé válik a biotinidáz defektus újszülöttkori tömegszőrése.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története Magyarországon 1988 – Schuler Dezsı professzor úr a Gyermekgyógyász Társaság egyik rendezvényén együtt vacsorázott a Bugaci Csárdában Horst Bickel professzorral. „A biotinidáz defektus minden tömegszőrési kritériumnak megfelelı betegség.”
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története Magyarországon 1988 – Schuler professzor, mint az Országos Csecsemı és Gyermekegészségügyi Intézet fıigazgatója konzultált az ügyben Szabó Lajos tanár úrral. 1988 – Gyermekgyógyász Szakmai Kollégium elıtt kellett referálni, ahol a várható költségeket is részletezni kellett.
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története Magyarországon
1989 – Mindkét szőrıközpontban megkezdıdik a biotinidáz defektus újszülöttkori tömegszőrése!
A biotinidáz defektus újszülöttkori szőrésének története Magyarországon Módszer: Heard által leírt szemikvantitatív kolorimetriás enzimaktivitás mérés. A lila szín a reakció végén arányos a vérben lévı biotinidáz enzim aktivitásával. Szemmel detektáltunk.
Problémák jelentkezése Bár a Guthrie-teszt a maga idejében forradalminak számított, mégis számos probléma jelentkezett a módszerrel kapcsolatosan: Problémát jelentett a baktérium törzs folyamatos fenntartása. Mikrobiológiai teszt lévén, az antibiotikumot kapott újszülötteknél értékelhetetlen volt. Ezért kiegészítı vizsgálatokra volt szükség. Szemikvantitatív vizsgálat. Idı probléma. Csak másnapra kaptunk eredményt.
Probléma a biotinidáz defektus szőrésében A biotinidáz defektus szőrésében leginkább az okozott problémát, hogy szemikvantitatív módszerrel szőrtünk. Így itt is szükségessé vált az új módszerre való áttérés.
2004 a módszerváltás éve ELISA technika !
A vizsgált 4 betegség szőrése ezzel a módszerrel. Kvantitatív!
2004 a módszerváltás éve
A biotinidáz defektus szőrésének reformja a Budapesti Központban Dr. Somogyi Csilla irányítása alatt történt.
A Heard által kidolgozott módszer fejlesztettük tovább. Jelenleg kvantitatív kolorimetriás mérést végzünk ELISA technikával.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Postabontás Naponta kb. 200 - 400 vérmintát kapunk postai úton. A vérmintákat a kórházakban nem szabad „összegyőjteni”, hanem minden nap elsıbbségi postával kell feladni a területileg illetékes szőrıközpontnak.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Számozás Automata sorszámozóval minden vérminta sorszámot kap.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Szőrıpapír A jelenleg alkalmazott szőrıpapír a Bécsi Központ szőrıpapírjának mintája alapján készült el. 4 kb. 1,5 cm átmérıjő vérrel átitatott korongot tartalmaz. Nagyon fontos, hogy a korongok teljes terjedelmükben és mindkét oldalon át legyenek itatva vérrel.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Szőrıpapír Személyes adatok: név, nem, szül. idı, anya neve, lakcím, telefonszám Gesztációs kor, születési súly Transzfúzió, vércsere idıpontja, gyógyszerek Tejtáplálás kezdete, vérvétel idıpontja Beküldı intézmény, orvos, orvosi pecsétszám
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Lyukasztás A számítógéppel összekapcsolt lyukasztó meghatározott mérető korongot vág ki a szőrıpapírból és a korongot a mikrotiter plate megfelelı vályújába helyezi.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Adatrögzítés Minden vérmintát a beérkezése napján rögzítünk a számítógépes nyilvántartásban. Beírásra kerül: a gyermek neve, neme, sorszáma a szőrésben, anyja neve, születési ideje, beküldı intézmény, beküldı orvos, az orvos pecsétszáma.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával 1. oldat Kálium-foszfát puffer Biotinil-para-aminobenzoesav
A biotinidáz defektus szőrése Reakció A szőrıpapírra vett vérmintában lévı biotinidáz enzim mesterséges szubsztrátból (biotinil-paminobenzoesavból) p-amino-benzoesavat szabadít fel, mely kémiai reakcióval színreakcióba vihetı. biotinidáz
Biotinil-PABA
⇒
biotin + PABA
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Inkubáció
A plateket nedves papírvattával takarjuk. Majd mőanyag zacskóba helyezzük. A reakció tökéletes lezajlása érdekében a plateket 16 órán keresztül, 37 °C-os termosztátba helyezzük.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával 2. oldat 30 %-os triklór-ecetsav oldattal a reakciót leállítjuk.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Centrifugálás 10 percen keresztül, 13000 rpm-en centrifugálunk egy ún. plate centrifugával. Ezáltal egy elkülönült, víztiszta felülúszót kapunk, ami tartalmazza az általunk reakcióba vinni kívánt PABA-t.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Színreakció A színreakció kialakulása érdekében 3 további reagenst pipettázunk az oldatunkhoz.
3. oldat Nátrium-nitrit 4. oldat Ammónium-szulfamát
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával 5. oldat N-1-naftiletiléndiamindihidroklorid
A képzıdött színreakció arányos a vérben lévı biotinidáz enzim aktivitásával.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Mérés 545 nm-en ELISA readerrel mérjük a pontos enzimaktivitást.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Normál eredmény ~ 104 % Parciális biotinidáz defektus ~ 25% Profound biotinidáz defektus ~ 5%
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Ha az eredmény pozitív, másnap megismételjük a mérést. Ha akkor is pozitív, akkor postai úton kérünk egy újabb szőrıpapíros vérmintát a gyermektıl. Amennyiben az ismétlés is kétszer pozitív eredményt ad, behívjuk a családot és szérumból is elvégezzük a biotinidáz enzimaktivitás mérését.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Mérés szérumból Szérumból történı mérés során a biotinidáz aktivitást a felszabaduló nmol p-aminobenzoesav/perc/ml szérum mértékegységben adjuk meg. A vizsgálat során PABA standardet használunk. Normál enzimaktivitás: 7,1 nmol/min/ml
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával
Quality controll Rendkívül fontos, hogy a laboratóriumban elvégzett munka minısége ellenırzés alatt legyen. Sokáig ezt külföldi kollaborációval oldottuk meg. J. Sander professzor (Hannover) validálta a kiszőrt gyermekek biotinidáz enzimaktivitását.
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Quality controll 2004 óta vagyunk tagjai
Biotinidáz defektus szőrése ELISA technikával Quality controll
Negyedévente 5 minta Eddig összesen 70 minta Ebbıl 15 pozitív Se fals pozitív, se fals negatív mérésünk nem volt idáig.
Biotinidáz defektusos betegek molekuláris genetikai vizsgálatai Milánkovics Ilona Kámory Enikı Dr. Csókay Béla Dr. Fodor Flóra Dr. Somogyi Csilla Dr. Schuler Ágnes
Géndiagnosztika jelentısége:
A mutációanalízis a diagnózis specifikációját eredményezi. Befolyásolja a klinikai kezelést. Lehetıvé teszi a prognosztikát és a prenatális diagnosztikát.
Anyagcsere betegségek genetikai vizsgálatai gondozó központunkban: → SE II. Gyermekklinika Prof. Dr. Fekete György
PKU
Galaktozémia → Pécsi Klinika és külföldi kollab. → LabOrigo Kft. (2004)
Biotinidáz defektus → Külföldi kollab. (B.Wolf) → LabOrigo Kft. (2004)
Egyéb acs. betegségek → Külföldi kollaboráció
A biotinidáz defektus öröklıdésmenete:
Autoszómális recesszív öröklıdésmenet Az obligát heterozigóta szülıknek 25%-os eséllyel születhet beteg gyermekük.
A biotinidáz defektus öröklıdésmenete:
BTD gén: 3p25 4 exon Kb. 90 mutációt írtak le eddig Módszer: a teljes kódoló régió bidirekcionális szekvenálása
Biotinidáz defektus
Profound (totális) biotinidáz defektus:
10 % alatti enzimaktivitás, kezeletlenül súlyos klinikai tünetek: bırproblémák, ataxia, organikus aciduria, alopecia, halláscsökkenés, mentális retardáció mindig szükséges biotin szubsztitúció számos „klasszikus” mutáció okozhatja
Parciális biotinidáz defektus:
10 –30% közötti enzimaktivitás, enyhébb klinikai tünetek nem mindig szükséges biotin szubsztitúció D444H mutáció az egyik allélon
Eredményeink:
17 év alatt kb. 950000 gyermek szőrése 11 profound BTD gondozott (0-10% ea.) 41 parciális BTD gondozott (10-30% ea.) Incidencia: 1:20000 MUTÁCIÓANALÍZIS → 21 különbözı germinális mutáció: 17 missense mutáció – ebbıl 3 új! 1 nonsense mutáció – új! 1 egybázisos deléció 1 deléciós – inzerciós komplex mutáció 1 intronikus splice site mutáció
4 új mutáció:
3 missense T152P, R157C, N195S A pontmutáció aminosav cserét eredményez. 1 nonsense E46X A pontmutáció Stop kodont eredményez.
Profound biotinidáz defektus kialakulása
Mindkét szülı hordozó egy ún. „klasszikus” mutációra. Szülık enzimaktivitása: 50% Ha a gyermek mindkét szülıtıl a mutációt hordozó allélt örökli, akkor megközelítıleg 0%-os enzimaktivitása lesz.
Parciális biotinidáz defektus kialakulása
Az egyik szülı „klasszikus” mutációt (50% ea.), míg a másik szülı D444H mutációt (75%ea.) hordoz. Ha a gyermek örökli mindkét szülıtıl a mutációt hordozó allélt kb. 25%-os enzimaktivitása lesz. (hasonlóan a Duarte2 variánshoz galaktozémiában).
Szőrıpapíros véminta
Folyamat ábra
Szőrés biotinidáz defektusra Pozitív
Negatív
Ismétlés kérése Pozitív
Negatív
A gyermek és a szülık behívása a gondozóközpontba Orvosi-, laborvizsgálat és szérum biotinidáz meghatározás
Mutációanalízis Biotin terápia megkezdése
Köszönetnyilvánítás Dr. Schuler Ágnes és Dr. Somogyi Csilla Dr. Ujvári Anna a Budai Gyermekkórház Központi Laboratóriumának vezetıje Apáti Annamária a szőrılabor szakasszisztense Dr. Csókay Béla, Dr. Fodor Flóra és Kámory Enikı a LabOrigo Kft. munkatársai
Köszö szönöm a figyelmet!
