8.1.
ÉLİ CSÍRASZÁM MEGHATÁROZÁSI MÓDSZEREK TENYÉSZTÉSES ELJÁRÁSSAL
Az élısejtszám meghatározási módszerek lehetıvé teszik, hogy egy vizsgált közegben (élelmiszer, takarmány, talaj stb.) a számunkra hasznos, vagy káros szaporodni képes mikroorganizmusok számát meghatározzuk. A gyakorlatban legelterjedtebben alkalmazott négy vizsgálati módszer: • Határhígítás • Telepszámlálásos módszer o Lemezöntés o Szélesztés • Membránszőrés A határhígításos módszernél a csíraszámot nem közvetlenül olvassuk le, hanem statisztikai alapon számítjuk ki: a tenyésztést folyékony tápközegben végezzük. A másik három módszernél a tenyésztés szilárdított táptalajon vagy táptalajban történik, a kifejlıdı mikroorganizmus telepek tehát közvetlenül számolhatók. E különbségektıl eltekintve valamennyi élıcsíraszám meghatározási módszer megegyezik abban, hogy a tulajdonképpeni tenyésztés elıtt a vizsgálandó anyagból szuszpenziót készítünk, amit fokozatosan addig hígítunk, amíg az élı sejtek száma, a tenyésztés után, értékelhetıvé válik. DECIMÁLIS HÍGÍTÁSI SOR KÉSZÍTÉSE A vizsgálati mintában (élelmiszer-, víz-, talajminta stb.) a keresett mikroorganizmusok számát mindig a minta 1g-jára, vagy 1 cm3-ére vonatkoztatva adjuk meg. A "Mintaelıkészítés" címő fejezetben már szó volt róla, hogy tekintettel a minták mikrobiotájának egyenlıtlen eloszlására a vizsgálati anyagot elıször homogenizálni kell, célszerően kilencszeres mennyiségő hígítóvízzel. Egy steril edénybe vagy steril mőanyag zacskóba mérjük ki a vizsgálati mintát reprezentáló m g tömeget vagy V cm3 térfogatot. Általában a vizsgálati anyag a minta 10 g-ja, illetve 10 cm3-re, egyes esetekben fıleg patogén mikroorganizmusok jelenlétének vizsgálatakor (Salmonella, Listeria monocytogenes) a vizsgálati anyag 25, esetleg 100 g, illetve cm3 is lehet. Adjunk hozzá 9Xm g-mal vagy 9XV cm3 -rel
egyenlı hígítófolyadék-mennyiséget. A hígítófolyadék steril élettani (fiziológiás) sóoldat (8,5 g NaCl 1000 cm3 ioncserélt vízben).
A homogénezéssel elkészített un. alaphígítás (10-1) képezi az alapját az alábbiak szerint elkészítendı, un. decimális hígítási sornak (16. ábra): az
alaposan összerázott alaphígításból steril pipettával 1 cm3-t kell 9 cm3 hígítófolyadékhoz mérni a következı (2-es hígítás, 10-2) elkészítéséhez, majd a folyamatot folytatni a szükséges hígítási fokig. Minden hígítás elkészüléséhez új pipettát kell használni. A hígítási fokokat úgy kell megválasztani, hogy telepszámlálásos módszer esetén a várható telepszám 10-300 legyen, míg MPN-módszer esetén az utolsó hígításban feltételezhetıen már ne legyen a vizsgálandó mikroorganizmus. 1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
9-9 cm3 hígítófolyadék
Alaphígítás (10-1) 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hígítási fok: 1 2 3 4 5 6 7 18. ábra: Decimális hígítási sor készítési módja szilárd mintából Ügyelni kell a pipettázás pontosságára, továbbá az aszeptikus munkára. Könnyen belátható, hogy a hígítás annál pontosabb, minél pontosabbak a pipetták ill. a hígítóoldatok térfogata. Minél nagyobb mérvő a hígítás, tehát minél kisebb a sejtszám, annál fontosabb a fertızıdés megakadályozása. 1000-es csíraszámnál még nem okoz bajt, azonban a cm3-ként 1-2 sejtet, vagy esetleg még annyit sem tartalmazó hígításoknál többszáz százalékos hibát eredményezhet. 8.1.1. Mikroorganizmusok számának meghatározása MPNmódszerrel Az MPN (Most Probable Number = legvalószínőbb élı sejtszám) módszer használatakor a mikroorganizmusokat folyékony táptalajban
szaporítjuk el, és a mikrobaszaporodást mutató csövek száma alapján, statisztikai alapon következtetünk a keresett mikroorganizmusok számára. Az MPN-módszer alkalmazhatóságnak alapfeltétele, hogy • a sejtek eloszlása az alapszuszpenzióban véletlenszerő legyen, vagyis a sejtek a szuszpenzió bármely részében azonos valószínőséggel legyenek megtalálhatók, és • a folyékony táptalajban mikrobaszaporodás legyen tapasztalható már 1 élı sejtet tartalmazó inokulum beoltása esetén is. A határhígításos módszer - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen egyaránt alkalmazható az összes (aerob mezofil) élı csíraszám és valamely kiválasztott mikrobacsoport vagy mikroorganizmus számának meghatározására. A vizsgálandó anyagból alapszuszpenziót kell készíteni, majd ezt decimális alapon addig hígítani, míg az utolsó hígítás 1 cm3-ében már valószínőleg már nem található a keresendı mikroorganizmus egyetlen sejtje sem. Ezért azt a technikát határhígításos módszernek is nevezik. Azt, hogy melyik az a hígítás, amelybıl kioltva már feltehetıleg nem tapasztalunk mikrobaszaporodást a minta jellege, és a keresett mikroorganizmus határozza meg. A hígításokból steril pipettával 1-1 cm3-t kioltunk folyékony táptalajt tartalmazó csövekbe. Amennyiben a kioltást a hígabb szuszpenziótól kezdjük, a kioltás végrehajtható egy pipettával is. A sejtszámmeghatározás pontosságának megbízhatósága növelhetı • a hígítás léptékének csökkentésével (pl. 2-es alapú hígítás), • a hígítási fokokból történı leoltások (párhuzamosok) számának növelésével, és • az ismétlések, vagyis az alaphígítások számának növeléséve. A mindennapi gyakorlatban általában a párhuzamosok számának növelésével emelik a megbízhatóságot. A megkívánt pontosságtól függıen 2-5 párhuzamos leoltására van szükség. Leggyakrabban a 3-3 párhuzamos leoltással hajtják végre a legvalószínőbb élıcsíra-szám meghatározását. Az elbírálás elsı lépése az elıírt inkubálás után a kulcsszám meghatározása (17. ábra). A kulcsszám egy háromjegyő szám, amelyet három egymást követı hígítási szinten a mikrobaszaporodást mutató pozitív csövek számából határozunk meg. A kulcsszám elsı tagjának azt az utolsó hígítási szintet kell kijelölni, amelyen a pozitív csövek száma még maximális (ha pl. 3 párhuzamos leoltást végeztünk, akkor lehetıleg 3). A második számjegy az ezután következı hígítási lépcsıben talált pozitív csövek számát adja meg. A harmadik számjegy pedig a következı nagyobb hígítás pozitív csöveinek számára utal. Elıfordulhat az értékelés
során, hogy olyan kulcsszámot kapunk, amelyben a magasabb hígításhoz több pozitív csı tartozik. Ez a mikroorganizmusok egyenlıtlen eloszlására vagy a hígítás hibájára utal! Hígítási szint
Pozitív csövek száma:
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
3
3
2
1
0
Jelmagyarázat: pozítív csı negatív csı aláhúzás: kulcsszám 19. ábra: A kulcsszám meghatározásának módja Ezt követıen az un. Hoskins-féle táblázatból ki kell keresni a kapott kulcsszámhoz tatozó alapértéket, majd ezt meg kell szorozni a kulcsszám elsı tagjához tartozó hígítási fokkal. Az így kapott értéket normál alakba hozva adjuk meg a vizsgálat eredményét CFU/cm3-ben vagy CFU/g-ban. CFU=Colony Forming Unit, azaz Telepképzı egység (TKE). 4. táblázat Hoskins-féle táblázat a milliliterenkénti legvalószínőbb élısejtszám megállapításához (hígításonként 3-3 leoltás esetén) (részlet) Kulcsszám Alapérték Kulcsszám Alapérték 000 0 300 2,3 100 0,36 310 4,3 110 0,73 311 7,5 111 1,1 320 9,3 200 0,91 321 15 210 1,5 322 21 211 2,0 330 24 220 2,1 331 46
221 2,8 332 110 222 3,5 333 Tovább higítani! A kulcsszám a példánkban (17.ábra): 3 2 1 (aláhúzott számok). Az ennek megfelelı alapérték (a 4. táblázatból kikeresve): 15. A kulcsszám elsı tagjának hígítási szintje: 10-2. Ezekbıl az adatokból az alapszuszpenzió legvalószínőbb élıcsíraszáma: 15x102=1,5x103 CFU/cm3 13. GYAKORLAT Mezofil (szulfitredukáló) anaerob spórás baktériumok (vegetatív és spórás alak) számának meghatározása MPN-módszerrel. Mezofil (szulfitredukáló), spóraképzı anaerob baktériumok alatt azokat a Clostridium-ok nemzetségébe tartozó, 30 °C hımérsékleten anaerob körülmények között növekvı mikroorganizmusokat értjük, amelyek adott feltételek mellett a szulfitot szulfiddá redukálják. szulfit redukció →(vas ) − szulfid A vizsgálathoz D-glükóz - nátrium-diszulfit - ammónium- vas(II)-citrát B-polimixin tartalmú folyékony szelektív és differenciáló táptalajt (DRCM) használunk. A táptalaj szelektivitását a Bacillus polimixa által termelt polimixin nevő antibiotikum biztosítja, amely gátolja a nem spórásodó mikrobióta szaporodását. A Bacillus nemzetség tagjainak fejlıdését az anaerob; viszonyok akadályozzák. A táptalaj alkalmas a szulfitredukció kimutatására, amelynek alapanyaga a nátrium-szulfit; a keletkezı szulfidionokat a vas-ammónium-citrát "jelzi" oly módon, hogy a vas-ion a szulfid-ionokkal kapcsolódva feketére színezi a tápközeget. Az anaerobiozis ellenırizhetısége érdekében a táptalaj rezazurin nevő redoxindikátort tartalmaz. Az oxigénmentes táptalaj világos vörösesbarna színő, oxigén hatására pedig rózsaszínő. A táptalajból felhasználás elıtt az oxigénnyomokat forralással el kell távolítani. Szükséges anyagok és eszközök: Vízfürdı, steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm3-ként csövekbe adagolva, DRCM-leves 10 cm3-ként csövekbe adagolva, paraffinolaj Mikroorganizmus: Clostridium butyricum vizes szuszpenziója
A gyakorlat menete: A vizsgálathoz két alapszuszpenziót kell készíteni, és az egyiket vízfürdıben 75 °C-on 15 percen át kell hıkezelni a vegetatív alakok inaktiválása céljából. Ezt követıen mindkét alaphígításból decimális hígítási sort kell készíteni, majd a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni DRCM-levest tartalmazó csövekbe. A beoltott csöveket az anaerob körülmények kialakítása érdekében 2-3 mm vastagságban parafinolajjal kell fedni, majd 30 °C-on 44 ± 4 órán át inkubálni. Pozitív esetben a beoltott tápközeg fekete elszínezıdést mutat. A hıkezeletlen mintából kapott eredmény adja meg az összes (vegetatív és spórás) mezofil szulfitredukáló klosztridiumok számát, a hıkezelt mintából pedig a spórás alakok számát kapjuk meg. Eredmények: 14. GYAKORLAT Kóliform baktériumok és feltételezetten Escherichia coli számának meghatározása MPN-módszerrel Kóliform baktériumok alatt értjük azokat az Enterobacteriaceae családba tartozó aerob és fakultatív anaerob, G(-), spórát nem képzı baktériumokat, amelyek a laktózt 30 °C hımérsékleten 24-48 óra alatt sav- és gáztermelés közben bontják. Ezek a baktériumok MPNmódszerrel szelektív, laktóztartalmú táptalajokban mutathatók ki. A kóliform baktériumok határhígításos módszerrel történı kimutatásához leggyakrabban a lauril-szulfát tartalmú szelektív levestáptalajt (LS) használják. A magas tápanyagtartalom és a foszfát puffer jelenléte gyors növekedést és fokozott gázképzıdést eredményez még a „lassú laktózfermentáló” kóliform baktériumoknál is. A laktózbontást kísérı gáztermelés a táptalajba szájával lefelé elhelyezett Durham-féle fermentációs csı segítségével vizsgálható. A lauril-szulfát gátolja a kísérıflóra szaporodását. A kóliform baktériumok csoportjába tartozik az egyik legjelentısebb ételmérgezı baktérium, az E. coli. Ennek kimutatása a kóliform baktériumokkal egyidejőleg a táptalajhoz adott "MUG" (4-metilumbelliferil-ß-D-glükuronid) nevő adalékanyag segítségével történik. A MUG az E. coli baktériumok által termelt glükuronidáz enzim egyik lehetséges szubsztrátja. Az enzim a MUG-ról lehasítja a glükuronsavat, a visszamaradó 4-metil-umbelliferon nevő termék UV-fényben fluoreszkál. A fluoreszkálás mértéke néhány csepp 1 mólos nátrium-hidroxid oldattal felerısíthetı.
Szükséges anyagok és eszközök: Steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm3-ként csövekbe adagolva, MUG-ot tartalmazó LS-leves 10 cm3-ként csövekbe adagolva Mikroorganizmus: Kóliform baktériumok és E. coli vegyes vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz alaphígítást, majd abból decimális hígítási sort kell készíteni, és a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni MUG-os BBL-levest tartalmazó, Durham-féle fermentációs csıvel ellátott csövekbe. A beoltott csöveket 30 °C-on 24-48 órán át kell inkubálni. Az értékelést a Hoskins-táblázat alapján kell elvégezni. Kóliformokra nézve pozitívnak kell tekinteni minden olyan csövet, amelyben a Durhamcsınek legalább 1/10 részét gázbuborék tölti ki. A kóliform pozitív csövek közül E. coli baktériumot tartalmaznak a fluoreszkáló csövek. Megjegyzés: A címben a feltételezetten E. coli-szám meghatározás arra utal, hogy ez a vizsgálat nem teljes körő, az E. coli jelenlétét a továbbiakban még meg kell erısíteni. (Biokémiai vizsgálatok) 8.1.2. Mikroorganizmusok számának meghatározása telepszámlálásos módszerrel A telepszámlálásos módszerek esetében a tenyésztést szilárd táptalajon végezzük, így - szemben az MPN-módszerrel, ahol a csíraszámot indirekt úton, statisztikai módszerrel határoztuk meg - a kifejlıdött telepek közvetlenül megszámolhatók. A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy • a táptalajokon kinıtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és • a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek elıállítása, amelyen az egyedülálló (soliter) telepek száma 10-300 közötti. Akárcsak az MPN-módszerrıl, a telepszámlálásos módszerekrıl is elmondható, hogy - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen alkalmas mind az összcsíraszám; mind pedig valamely tetszıleges mikrobacsoport számának meghatározására.
8.1.2.1 Élısejtszám meghatározás lemezöntéses módszerrel A lemezöntéses módszert fıként kevéssé hıérzékeny, nem obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére használjuk. Alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíra-számának meghatározásához. A vizsgálat elsı lépése - mint miden élıcsíra-szám meghatározást célzó tenyésztéses módszer esetében - a megfelelıen elıkészített mintából decimális hígítási sor készítése. Ezt követıen a hígítási sor tagjaiból 2-2 egyértelmő jelzéssel (mintaszám, leoltás dátuma, alkalmazott táptalaj rövidített neve, hígítás foka) ellátott - Petri-csészébe 1-1 cm3 szuszpenziót kell pipettázni steril pipettával a legmagasabb hígítástól kezdve a nagyobb sejtsőrőségő tagok felé haladva (19. ábra). Pipettázáskor nem vesszük le teljesen a csészék fedelét, csupán annyira emeljük fel, hogy a pipettával be tudjunk nyúlni (1) (20.ábra). A sterilezett, 45-50 °C hımérséklető, táptalajból kb. 15 cm3 mennyiséget öntünk a megemelt fedelő Petri-csészékbe (2), majd egyenletes rotáló mozgatással a - még folyékony - táptalajt alaposan elkeverjük a Petricsészében lévı szuszpenzióval (3). Ügyelni kell arra, hogy mozgatás közben a tápközeg ne kerüljön a Petri-csésze falára és tetejére, valamint ne szennyezze a környezetet. Az inokulum szétosztása és a táptalaj öntése közötti idıtartam ne haladja meg a 15 percet. A tápközeg megszilárdulása (4) után a Petri-csészéket meg kell fordítani úgy, hogy a lemez kerüljön felülre (5). Ennek célja egyrészt a képzıdı kondenzvíz visszacsöpögésének, a gyors kiszáradásnak, valamint a telepek elvándorlásának megakadályozása. A lemezeket ezt követıen megfelelı hımérséklető termosztátba kell helyezni, és elıírt ideig tenyészteni.
1-1 cm3
20. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata I. O= Petri-csésze
21. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata II. Kerüljük a termosztátok túlterhelését. A csészeoszlopok között, az oszlopok és termosztát falai, valamint az oszlopok és a polc lapjai között legalább 29 mm hézagot kell hagyni. Egy oszlopban legfeljebb 6 csésze legyen. Az inkubálás lejárta után a lemezeket kivesszük a termosztátból, és a rajtuk kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Csak azokat a lemezeket vonjuk be az értékelésbe, amelyeken a telepszám 10-300 (nagymérető telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevont lemezeken (két egymást követı hígítás) megszámlált telepszámok
súlyozott átlagaként adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapján:
C=
∑c (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d
ahol C = telepszám súlyozott középértéke ∑ c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n1 =az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 1 cm3) A kapott értéket minden esetben normál alakba hozva adjuk meg eredményként. Ennél a vizsgálati módszernél célszerő az alkalmazott táptalajt úgy megválasztani, hogy az tiszta, áttetszı legyen, mert az opálos színő táptalajok zavarhatják a kolóniák felismerhetıségét. 15. GYAKORLAT
Pasztırözött tej összcsíraszámának meghatározása lemezöntéses módszerrel Összcsíraszám alatt értjük azoknak az élı mikroorganizmusoknak a számát, amelyek 30 °C hımérsékleten aerob körülmények között 48-72 óra alatt telepet képeznek (összes élı, aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszichrotróf mikrobák száma). A vizsgálatot szilárd alaptáptalajon kell végezni, mint pl. a triptont, élesztıkivonatot és glükózt tartalmazó Plate-Count agar
Szükséges anyagok és eszközök: 90 cm3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm3-es steril pipetta, 5 x 9 cm3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm3-es steril pipetta, 6 db steril Petri-csésze, olvasztott Plate-Count agar
Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm3-ét bemérjük 90 cm3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígításokat készítünk 10-5 hígítási fokig. A hígítási sor utolsó három tagjából 1-1 cm3 t pipettázunk hígításonként 2; azonosítható jelöléssel ellátott steril Petri-csészébe, majd felolvasztott és 45 °C-ra visszahőtött Plate-Count agarral lemezt öntünk. Szilárdulás után a lemezeket 48-72 órára 30 °C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm3-ére vonatkoztatott összcsíraszámot. Ha valamely képletrıl szabad szemmel nem tudjuk eldönteni, hogy telep-e, célszerő lupéval is megvizsgálni. Megjegyzés: a módszer alkalmas az aerob spóraszám meghatározására is, ha a mintát vagy a hígítási sor tagjait 80 °C-on 10 percen át kezelve a vegetatív alakokat elpusztítjuk. Eredmények:
8.1.2.2 ÉLİSEJTSZÁM MEGHATÁROZÁSA FELÜLETI SZÉLESZTÉSSEL A felületi szélesztés alkalmazható hıérzékeny, obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére is. Ennél a módszernél alkalmazhatunk opálos színő (általában tojássárga-emulziót tartalmazó) táptalajokat, mivel a mikrobaszaporodás a táptalaj felszínén történik, így a telepek szabad szemmel is jól láthatók. A felületi szélesztéses módszer - akár az MPN, vagy a lemezöntéses eljárás - alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíraszámának meghatározásához. A felületi szélesztéses eljárás során a már elıre leöntött és megszilárdított, szikkasztott felülető lemez felületére pipettázunk hígításonként 0,1 cm3 szuszpenziót (19. ábra). Ha nincs más elıírás a szárítást beoltás elıtt fedı nélkül, lefelé nézı agarfelülettel kell elvégezni egy 50 °C-os termosztátban 30 percig. A táptalaj szikkasztására azért van szükség, mert
a nedves felülető lemezen nehéz a szélesztés, és a kifejlıdı telepek szétfutnak. Beoltás után a megfordított lemezeket megfelelı körülmények között meghatározott ideig inkubáljuk. Az inkubációs idı letelte után a kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Az értékelésbe csak azokat a lemezeket vonjuk be, amelyeken a telepszám 10-300 (nagy telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszám meghatározása súlyozott átlag számításával az elıbb már említett képlet alapján történik: C=
∑c (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d
ahol C = telepszám súlyozott középértéke ∑ c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n1 =az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 0,1 cm3)
0,1-0,1 cm3
22. ábra: A felületi szélesztéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata O= Petri-csésze Látható, hogy a lemezöntéses módszernél a lemezekre vitt inokulum mennyisége 1 cm3, a felületi szélesztéses módszernél 0,1 cm3. Az
eredményt minden esetben normál alakba hozva kell megadni CFU/ cm3 vagy CFU/g mértékegységgel. A fentiekbıl következik, hogy szilárd minták esetében, a vizsgálat érzékenysége legalább 102 mikroba/g, folyékony minták esetében pedig; 101 mikroba/ cm3. Elıfordulnak azonban olyan vizsgálati minták, amelyekben a keresendı mikroorganizmus ennél kisebb számban, fordul elı. Ezek kimutatását célozza az un. "három-lemez"-módszer. Ennek lényege, hogy a hígítási sor elsı tagjából - szilárd minták esetében ez az les hígítás (alapszuszpenzió), folyékony minták esetében pedig maga a minta (0-s hígítás) - összesen 1 cm3 mennyiséget három lemez felületén oszlatunk el, majd a megfelelı inkubálás eltelte után a telepeket mindhárom lemezen megszámláljuk, és a kapott értékeket összeadjuk. Ez a szám megmutatja, hogy - szilárd minták esetében - az alapszuszpenzió, illetve - folyékony minták esetében - a minta 1 cm3-ében hány mikroba található. 16. GYAKORLAT Pasztırözött tej összes Staphylococcus-, és feltételezhetıen Staphylococcus aureus számának meghatározása felületi szélesztéses módszerrel A Staphylococcus nemzetség tagjai megtalálhatók az ember és az állatok bırén, felsı légutaiban, a húgy és nemi szervek nyálkahártyáin, illetve egyes fajaik a tejben és tejtermékekben is. Élelmiszerhigiéniai szempontból legjelentısebb képviselıjük a Staphylococcus aureus, amely hıtőrı enterotoxin-termelése révén az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A Staphylococcus-ok szelektív tenyésztésére a szulfamethazin-tojássárgatellurit tartalmú szelektív és differenciáló agarlemezt alkalmazzuk. A szulfamethazin visszaszorítja a kísérı mikroflórát, a tellurit a Staphylococcusok-ra jellemzı tellurit-redukció kimutatását célozza, amelynek eredményeként a telepek fekete vagy grafitszürke színben tőnnek föl. A táptalajon vizsgálható a Staphylococcus aureus-ra jellemzı lipáz-lecitináz aktivitás. A lipáz pozitívak azok a telepek, amelyek felülete a keletkezı zsírsavak miatt gyöngyházfényő. A lecitináz aktivitást az un. Nagler-reakció mutatja. Ennek lényege, hogy a lecitin elbontása miatt a telepek körül - a tojássárga-tartalom miatt - egyébként opálos táptalaj feltisztul.
Szükséges anyagok és eszközök:
90 cm3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm3-es steril pipetta, 9 cm3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm3-es steril pipetta, 4 db Baird-Parker agarlemez, steril Wassermann-csövek Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája
A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm3-ét bemérjük 90 cm3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígítást készítünk 10-2 hígítási fokig. A hígítási sor tagjaiból 0,1 – 0,1 cm3-t pipettázunk hígításonként 2, azonosítható jelöléssel ellátott steril Baird-Parker agarlemezre. A lemezeket 24-48 órára 37 °C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött fekete vagy grafit szürke telepeket, valamint ezek közül a gyöngyházfényő és Naglerreakciót mutató telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm3-ére vonatkoztatott Staphylococcus-, valamint feltételezett Staphylococcus aureus-számot Számolási példa telepszám súlyozott átlagának kiszámítására lemezöntéses módszer esetében Tegyük fel, a lemezeken kinıtt telepek leszámolása után az alábbi eredményeket kaptuk a nyers tej összcsíraszámának vizsgálatakor. Hígítási szint Hígítási fok 1. párhuzamos lemezein kinıtt telepek száma (c) 2. párhuzamos lemezein kinıtt telepek száma (c)
10-1 1
10-2 2
10-3 3
10-4 4
10-5 5
sok
sok
280
27
3
sok
sok
235
23
2
A kiértékelésbe csak a fekete négyzettel körülvett telepszámokat vonhatjuk be, mert ezek felelnek meg a 10
∑c
280 + 235 + 27 + 23 565 = = −3 (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d (2 + 0,1 * 2 ) * 1 * 10 2,2 * 10 −3 = 256,82 * 10 3 = 2,57 * 10 5 CFU 3 cm
C=
=
2,57*105 a nyers tej mintánk összcsíraszáma. 1 Figyelem: 10-3=0.001=1/1000, így −3 = 10
1 = 1000 = 10 3 1 1000
8.1.3. Membránszőréses módszer A membránszőréses módszert alacsony csíraszámú folyadék- és gázminták vizsgálatára alkalmazzuk. A minta meghatározott mennyiségét membránfilteren átszívatva annak pórusain a mikrobák visszamaradnak. A membránfiltert táptalajra helyezve a filteren átdiffundáló tápanyagok révén a telepek magán a filteren alakulnak ki. A membránszőréses módszer alkalmazásáról és technikai kivitelezésérıl részletesen a "Víz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő gyakorlat keretében lesz szó.
