6 FYZIOLOGIE MIKROORGANISMŮ 6.1 ÚVOD Mikroorganismy nežijí ve vzduchoprázdnu, ale jsou v neustálém kontaktu se svým životním prostředí a působí na ně nejrůznější vnější faktory. Tyto faktory lze rozdělit do několika skupin: • Fyzikální podmínky, jako jsou teplota, tlak či pH. • Chemické podmínky, jako jsou obsah a kvalita živin, kyslíku, množství vody, přítomnost inhibujících látek apod. • Biologické podmínky, zejména přítomnost dalších organismů. • Mechanické podmínky, např. vliv proudění vody, střižné síly, či třepání. • Prostorové podmínky, koncentrace mikroorganismů, kontakt s pevným materiálem apod. Působení různých faktorů prostředí vede ke změnám ve vlastnostech mikroorganismů. Změny vlastností se dají rozdělit na dvě hlavní skupiny: • Změny evoluční. Tyto změny nastávají dlouhodobým působením prostředí na mnoho generací mikroorganismů. Prostředí zde působí selektivním tlakem a zvýhodňuje ty skupiny mikroorganismů (i v rámci jednoho druhu či kmenu), které mají pro dané podmínky lepší genetickou výbavu (vzniklou např. mutacemi či výměnou genetické informace, viz kapitola…) a z ní vyplývající vhodnější vlastnosti. Evoluční adaptace jsou dlouhodobé a předávají se na potomstvo. • Změny fyziologické. Tyto změny nastávají v důsledku přirozených regulačních mechanismů každého mikroorganismu. Organismus tak reaguje na změny prostředí a snaží se jim přizpůsobit. Fyziologické adaptace jsou obvykle rychlé (v řádech sekund až hodin) a nedědí se (potomek má ale pochopitelně schopnost reagovat podobně). Fyziologická reakce mikroorganismů na změny prostředí může být různá, např.: • změna rychlosti rozmnožování • aktivace či deaktivace metabolických drah • změny ve vnitřním prostředí buněk • aktivní cílený pohyb • aktivace ochranných mechanismů • spolupráce v rámci společenstev Fyziologický stav mikroorganismu koresponduje i s jeho spokojeností. Daří-li se v daných podmínkách organismu dobře, pak obvykle nespouští žádné regulační mechanismy, které by vedly ke změně. Daří-li se mu naopak špatně, snaží se regulační a obranné mechanismy aktivovat. Termín fyziologický a nefyziologický se někdy také interpretuje jako přirozený podobně jako např. v medicíně (srovnej fyziologický – přirozený porod s nefyziologickým císařským řezem). Např. řekneme-li, že mikroorganismus je ve fyziologickém stavu, myslíme tím, že je v přirozených podmínkách a daří se mu dobře. Naopak provedeme-li nefyziologický zásah, obvykle to povede k poškození či smrti mikroorganismů.
Znalost vnějších vlivů na mikroorganismy je velmi důležitá pro praxi. Mnoho mikroorganismů je nežádoucích a v takovém případě je vhodné vědět, jaké podmínky jim nevyhovují (viz kapitola 9). Naopak potřebujeme-li využít mikroorganismus prakticky, např. v biotechnologických procesech, je vhodné vytvořit mu optimální prostředí. V neposlední řadě umožňuje znalost těchto vlivů odhadovat zásahy do ekosystému, kde mikroorganismy tvoří významnou součást (kapitola 8). U každého faktoru prostředí je možné vysledovat několik stupňů působení na konkrétní organismus. Organismu se nejlépe daří při optimální hodnotě faktoru a v jeho určitém okolí. V okolí optima ho toleruje bez výrazného vlivu na vlastní fyziologii. Vychýlí-li se faktor příliš z normálního rozsahu, nastává stresové působení. Mikroorganismy ve stresu ještě obvykle přežívají, nicméně jejich fyziologie je narušena, např. je přerušeno dělení nebo nefungují některé metabolické dráhy. Při extrémním vychýlení působí faktor letálně a organismus zabíjí.
6-1
Faktory, jejichž působení vede ke smrti mikroorganismů se nazývají mikrobicidní. Faktory, které pouze brání rozmnožování nazýváme mikrobistatické. Působí-li faktor jen na některé skupiny mikroorganismů, připojují se přípony –cidní a –staticky ke konkrétní předponě vyjadřující skupinu mikroorganismů. Známe tak faktory např. bakteriocidní / bakteriostaticé (působí jen na bakterie), fungicidní / fungistatické (působí jen na houby) apod.
6.2 VLIV FYZIKÁLNÍCH FAKTORŮ 6.2.1
VLIV TEPLOTY
Teplota je dominantní faktor silně ovlivňující mikroorganismy. Závislost růstové rychlost na teplotě je obvykle nesymetrická, nižší teploty dělení pouze zpomalují, ale nebrání mu. Při extrémně nízkých teplotách už se mikroorganismus dělit nemůže, nicméně obvykle přežívá. Naopak vyšší teploty působí na mikroorganismy destruktivně, čehož se prakticky využívá při jejich likvidaci. Z hlediska teplotní tolerance lze mikroorganismy rozdělit na několik základních skupin: • Psychrofilní1 organismy mají optimální teploty nižší než 20°C a jsou obvykle schopné rozmnožovat se i pod bodem mrazu. • Mezofilní organismy mají optimální teplotu mezi 20-40°C, maximální obvykle nižší než 60°C. • Termofilní organismy mají optimální teplotu vyšší než 40°C a maximální mezi 60 a 80°C. • Extrémně termofilní jsou schopné se rozmnožovat i při teplotách přesahujících bod varu vody (až při 120°C), optimální teplota je cca 90-110°C a minimální obvykle vyšší než 50°C. Různé skupiny mikroorganismů mají různý teplotní rozsah, ve kterém mohou přežít. Organismy vyskytující se v přírodě, mají obvykle rozsah tolerance širší a optimální teplotu spíše nižší. Oproti tomu lidské patogenní mikroorganismy jsou obvykle adaptované na přesných 37°C a i malé vychýlení této teploty vede k jejich inhibici i smrti. Toho také tělo využívá zvýšenou teplotou až horečkou. Letální teplota je nejnižší teplota, při které je organismus za definovaných podmínek zahuben během definované doby, obvykle se používá 10 minut. Určuje se zejména pro organismy významné v medicínské, potravinářské a technologické praxi. Běžné mezofilní bakterie mají letální teplotu kolem 60-70°C, jejich spory ale až 120°C. Letalitní křivka je pak závislost mezi letální teplotou a dobou působení. Obvykle má logaritmický tvar. Vysoké teploty působí v mikroorganismech zejména denaturaci bílkovin, tím pádem i enzymů, s čímž souvisí zastavení metabolismu a smrt organismu. Vysoká teplota také poškozuje cytoplasmatickou membránu, zvyšuje její propustnost, což se při překročení určité hranice projeví vylitím buněčné cytoplazmy do okolního prostředí. Působení nižších teplot je složitější a obvykle není letální. Většina mikroorganismů je schopna přežít dlouhou dobu při teplotě nižší než je jejich minimální teplota růstu, pouze se nerozmnožují. Působení teplot pod bodem mrazu závisí na rychlosti ochlazení. Čím pomalejší ochlazení, tím vznikají větší krystalky ledu a tím větší je poškození buněčné struktury. I při nejpomalejším ochlazení ale nikdy nezabijeme všechny jedince. Ochlazování není proto vhodná sterilační metoda. Provedeme-li zmražení rychle a na hlubokou teplotu, většina populace sice zmrzne, ale přežije. Toho se také využívá při dlouhodobém uchovávání kultur ve zmraženém stavu. Pro zvýšení jejich životaschopnosti se ale obvykle kultura zmražuje s vhodnými ochrannými látkami (kryoprezervativa, např. perlit nebo glycerol). K dlouhodobému uchovávání se používá ještě tzv. lyofilizace (mrazová vakuová sublimace). Při této metodě je kultura rychle zmražena ve vakuu. V takových podmínkách voda sublimuje a většina jí je odstraněna. Výsledná kultura je proto vysušená a metabolicky neaktivní, může být ale znovu oživena resuspendací do vhodného média za nízké teploty. Nedostane-li se do lyofilizované kultury voda, je oživitelná i po mnoha letech a nemusí být ani skladována pod bodem mrazu. Negativní působení nízkých teplot závisí také na fázi buněčného cyklu a metabolické aktivitě. Aktivnější buňky jsou zranitelnější. Přeneseme-li exponenciálně rostoucí kulturu do prostředí s nižší 1
Termín pochází z latiny: psychros = mráz, fileo = miluji
6-2
než minimální teplotou, způsobíme kultuře tzv. teplotní šok. Ten část populace obvykle zahubí, část ale zůstane životaschopná a dá se později regenerovat. Citlivost k teplotnímu šoku je značně variabilní, některé mikroorganismy snáší šok velice dobře, jiné zahynou téměř kompletně. Adaptace mikroorganismů na teplotu je jednak genetická, která předurčuje mikroorganismus k životu v prostředí s určitou teplotou, a jednak fyziologická, která mu umožňuje přizpůsobit se lokálním změnám teploty. Genetická adaptace je dlouhodobá (jedná se o evoluční změnu) a zahrnuje zejména změny ve strukturách bílkovin. Bílkoviny termofilních organismů mají v molekulách více disulfidických můstků a menší podíl hydrofóbních aminokyselin. Takové bílkoviny jsou tepelně stabilnější, ale při nižších teplotách jsou rigidnější (ztuhlejší). Díky tomu se termofilní organismy při nižších teplotách nerozmnožují. Bílkoviny psychrofilních organismů jsou naopak podstatně ohebnější, v jejich molekulách je více hydrofóbních aminokyselin. Díky tomu bílkoviny při nižších teplotách neztuhnou a jsou i nadále schopné plnit svou biologickou úlohu. Takové bílkoviny jsou ale tepelně méně stálé a snadněji denaturují. Je třeba dodat, že pro adaptaci mikroorganismu na extrémnější teplotu je potřeba adaptace všech důležitých bílkovin zúčastněných na metabolismu. Oproti tomu mutace v některé důležité bílkovině způsobí celkovou ztrátu adaptace. Porovnání příbuzných mikroorganismů s různou teplotní odolností potvrdilo evoluční mechanismus adaptace. Konkrétní porovnání odlišností jejich bílkovin odhalilo, že pozorované změny aminokyselin lze dosáhnout vždy jen jednou mutací v tripletu pro tuto aminokyselinu.
Fyziologická adaptace na teplotu zahrnuje změny ve složení cytoplazmatické membrány a ochranu bílkovin před denaturací. Cytoplasmatická membrána si potřebuje uchovat svou stálou fluiditu a propustnost. Té se dosahuje změnou poměru mezi nasycenými masnými kyselinami na jedné straně a nenasycenými a rozvětvenými na straně druhé. Nasycené mastné kyseliny mají pravidelnější tvar a lépe se uspořádávají. Proto tvoří hustší membránu a jejich teplota tuhnutí je vyšší. Oproti tomu nenasycené a rozvětvené mastné kyseliny se do krystalu uspořádávají hůř, jedna mastná kyselina zabírá díky nepravidelnotstem více místa. Taková membrána tuhne při nižších teplotách, ale při vyšších je řidší a snadněji propouští2. Ochrana bílkovin spočívá zejména v produkci tzv. bílkovin teplotního šoku (heat shock proteins, hsp). Ty mají jednak ochranou funkci (např. zabraňují denaturaci jiných bílkovin), jednak působí jako „úklidová četa“ a označují poškozené bílkoviny určené k likvidaci. Bílkoviny teplotního šoku bývá zvykem označovat podle velikosti molekul v Daltonech, např. hsp70 je heatshock-protein s molekulovou velikostí 70kDa = relativní molekulovou hmotností 70 000. Bílkoviny teplotního šoku byly poprvé objeveny právě při působení vyšších teplot na organismy. Pozdější výzkumy ale ukázaly, že to není zdaleka jejich jediná funkce. Mnohé z nich jsou produkovány i jako odpověď na šoky způsobené jinými faktory. Některé hsp jsou syntetizovány konstitutivně (tedy bez ohledu na vnější podmínky) a napomáhají např. dosáhnout správného prostorového uspořádání nové bílkoviny.
6.2.2
VLIV PH
Hodnota pH má výrazný vliv na fyziologii mikroorganismů, zejména metabolismus. Protonace a deprotonace ovlivňuje konformace bílkovin a tím i aktivitu enzymů. Stejně tak pH ovlivňuje ionizaci meziproduktů metabolismu. To kromě metabolických drah ovlivňuje i průchodnost látky přes membrány. Ztratí-li molekula náboj, může lépe projít přes membránu, naopak získá-li ho, ztrácí schopnost samovolné difůze. Hodnota pH také výrazně ovlivňuje teplotní odolnost mikroorganismů. Např. tepelně velice odolné spory ztrácejí tuto odolnost v kyselém prostředí. Podobně mnohé patogenní mikroorganismy (adaptované na přibližně neutrální pH těl vyšších organismů) umírají v kyselém prostředí při výrazně nižších teplotách. Těchto poznatků se využívá i prakticky. Např. kyselé potraviny stačí sterilovat při nižších teplotách (80°C), protože v kyselém prostředí většina patogenů i jejich spor už při nich umírá. Naopak např. masové konzervy 2
Pro praktický příklad doporučuji porovnat máslo a margarín. Zatímco chlazené máslo s převahou nasycených mastných kyselin v lednici snadno ztvrdne, margarín z rostlinného oleje s vyšším obsahem nenasycených masných kyselin je stále dobře mazlavý.
6-3
s neutrálním pH by se měly sterilovat při vyšší teplotě (100 °C) delší dobu (1-2 hodiny) a opakovaně, aby se zničili i bakteriální spóry a patogenní mikroorganismy. Z podomácku vyrobených a špatně vysterilovaných masových konzerv např. pochází nejvíce otrav tzv. botulotoxinem, který je produkován bakterií Clostridium botulinum, jejíž spory jsou tepelně velmi odolné.
Rozsah tolerance pH je u mikroorganismů velmi rozdílný. Nejmenší rozsah mají živočišné patogeny, které obvykle nesnášejí jiné prostředí než cca neutrální. Většina bakterií je schopná přežít v pH intervalu cca 3-5 jednotek (např. E. coli 4,3-9,5, optimum 7,0, Thiobacillus thiooxidans 0,5-6,0, optimum 2,7). Kvasinky mají podobnou odolnost. Nejširší interval odolnosti mají plísně, které jsou schopné přežít v intervalu až 10 jednotek pH, tedy i v dost extrémních prostředích.
6.2.3
VODNÍ AKTIVITA
Voda je jednou z nejzákladnějších součástí všeho živého a většina životních pochodů probíhá ve vodných roztocích. Koncentraci rozpuštěných látek v prostředí ale tolerují mikroorganismy různě. Většina jich vyžaduje pouze nízké koncentrace, maximálně cca 2%. Některé skupiny mikroorganismů ale vydrží více. Osmotolerantní mikroorganismy vydrží až cca 10% rozpuštěných látek v prostředí. Halofilní3 organismy vyžadují pro svůj život vysokou koncentraci solí (přes 20%). Extrémně halofilní mikroorganismy vyžadují i nasycený roztok solí. Halofilní organismy nacházíme ve všech doménách (i mezi vyššími organismy, např. u rostlin), většina extrémních halofilů je z domény Archea. Vodní aktivita je definována jako podíl látkového množství (nebo molární koncentrace) vody v prostředí : aw =
Nw , kde aw je vodní aktivita, Nw je látkové množství vody, NS je látkové Nw + NS
množství rozpuštěných látek. Příklady některých prostředí a v nich žijících organismů jsou shrnuty v tabulce. Prostředí aw Adaptované mikroorganismy Čistá voda 1 Bakterie Krev ~1 G- bakterie Mořská voda ~0,99 Bakterie Chléb 0,95 G+ bakterie, houby Salámy 0,85 Staphylococcus Slaná jezera 0,75 Halobacterium, Aspergillus Čokoláda, med 0,60 Saccharomyces rouxii Většina mikroorganismů má schopnost regulovat vnitřní osmotickou hladinu (obsah rozpuštěných látek), tak aby ustály výchylky vnějšího prostředí. Tato regulace má ale pochopitelně své druhově závislé hranice. U většiny mikroorganismů nacházíme ve vnitřním prostředí poněkud vyšší koncentraci rozpuštěných látek než je ve vnějším prostředím. To udržuje mírný osmotický tlak cytoplazmatické membrány na stěnu, která ale rozpínání buněk brání. Udržování vnitřní osmotické hladiny se děje za pomoci tzv. kompatibilních látek, které mají vysokou osmotickou aktivitu, ale nezasahují příliš do metabolismu. Jedná se např. o některé aminokyseliny, glycerol, sacharidy, polyoly (látky s více OH skupinami v molekule) a též ionty (hlavně u halofilních organismů). Sporulující bakterie snižují ve svých sporách obsah vody, čímž snižují metabolickou aktivitu a zvyšují odolnost proti záření a vyšším teplotám. Velmi významně ovlivňuje obsah vody aktivitu většiny hub. Je-li vody nedostatek, houby sice přežívají, ale prakticky v klidovém stavu. Naopak při dostatku vody se rychle rozrůstají. Vláknité houby si navíc umí pomoci transportem vody skrz svá mycelia z té části houby, která má vody větší dostatek4. Naopak některé vláknité plísně si vytvořily schopnost absorbovat i vzdušnou vlhkost. Díky tomu mohou růst i na relativně suchých substrátech. Fakt, že plísním se dobře daří ve vlhkém prostředí je dlouho empiricky známý. Sucho je mj. jednou z účinných ochran proti plísním.
3 4
Z latinského hals = sůl, fileó = miluji. Vlákna hub např. v lese mohou dosahovat i kilometroých délek.
6-4
6.2.4
POVRCHOVĚ AKTIVNÍ LÁTKY
Povrchově aktivní látky (tenzidy) jsou látky, které mají část molekuly hydrofilní a část hydrofobní. V prostředí se orientují obvykle na povrchu nebo na fázovém rozhraní mezi dvěma nemísitelnými fázemi. Podle náboje hydrofilní části je lze rozdělit na neionogenní, anionaktivní a kationaktivní. Všechny typy mají vliv na fyziologii a životaschopnost mikroorganismů. Neionogenní tenzidy (TWENN apod.) mají obecně horší smáčivost. Jejich účinek na mikrobní membrány je malý a biocidní účinek je také malý. V nižších koncentracích snižují shlukování buněk a snižují sílu vazby na pevný podklad. Toho se využívá např. při extrakcích mikroorganismů z různých prostředí (půdy apod.) nebo pro zvýšení rychlosti růstu pomalurostoucích mikroorganismů (odloučením buněk se zvyšuje jejich specifický povrch a příjem živin). Anionaktivní tenzidy mají výbornou smáčecí schopnost a používají se proto zejména jako čistící prostředky (jar apod.). Ve vyšších koncentracích poškozují buněčné membrány a způsobují denaturaci bílkovin a působí tak biocidně. Dobrá smáčivost spolu s poškozováním membrán také zvyšuje účinnost ostatních desinfekčních činidel. Kationaktivní tenzidy (ajatin apod.) mají horší smáčivost a nejsou proto vhodné jako mycí prostředky. Mají ale vysokou biocidní schopnost už při nižších koncentracích. Vazbou na membrány způsobují jejich neprůchodnost a také fungují jako inhibitory enzymů. Ve vyšších koncentracích pak podobně jako anionaktivní tenzidy poškozují membrány. Je třeba dodat, že při smíchání kationaktivních a anionaktivních tenzidů se tyto vzájemně vážou a jejich účinnost se rapidně snižuje.
6.2.5
ZÁŘENÍ
Záření výrazně ovlivňuje životaschopnost i fyziologii buněk. Účinek záření závisí na jeho energii a částicovém složení. Energie elektromagnetického záření roste s klesající vlnovou délkou: • Rádiové záření má malou energii a na organismy obvykle nepůsobí. • Mikrovlnné a infračervené záření (infra red = IR) působí zejména tepelným efektem a nemá obvykle letální účinky. • Viditelné světlo má různé účinky. Pro fototrofní mikroorganismy představuje zdroj energie. U některých mikroorganismů vyvolává fyziologické reakce, např. fruktifikaci některých plísní. U bakterií se také vyskytuje inhibice dělení viditelným světlem. Empiricky je prokázáno, že většina bakterií roste rychleji ve tmě než na světle. Mechanismus tohoto působení ale není znám. • Ultrafialové záření (ultraviolet = UV) má obecně negativní účinky na mikroorganismy. Tzv. germicidní lampy využívají ultrafialového záření v oblastech 260-270 nm k likvidaci mikroorganismů. Hlavní působení UV záření je na DNA, kde způsobuje vznik dimerů sousedních nukleotidů. To způsobuje hlavně zastavení exprese genů a může způsobit i mutace. U mnohých bakterií byl popsán snížený účinek UV záření při současném ozáření viditelným světlem. Viditelné světlo indukuje (zapíná) u těchto bakterií tzv. fotoreparaci, tedy obranné mechanismy, které snižují následky poškození UV zářením. • Gama záření má velmi vysokou energii a má silné letální účinky. Působí zlomy v nejrůznějších molekulách (DNA, bílkoviny atd.). V přítomnosti vody je účinek ještě zvýšen vznikem radikálů (peroxidový, superoxidový), které jsou velmi reaktivní a poškozují další součásti buněk. Gama záření se používá pro speciální sterilace při nízkých teplotách. Radioaktivní záření působí obvykle silně mikrobicidně, záleží na pronikavosti a energii. Účinky jsou podobné jako u gama záření, zejména poškození DNA a vznik radikálů.
6.2.6
TLAK
Většina mikroorganismů vyžaduje normální tlak. Vyšší tlaky působí obvykle negativně; ovlivňují zejména syntézu buněčné stěny. S tím souvisí např. vznik protažených buněk při dělení. Mnohé mikroorganismy se při vyšších tlacích nerozmnožují vůbec. Organismy, které vyžadují vysoký tlak pro
6-5
svůj život nazýváme barofilní5. Žijí obvykle v hloubkách moří a nejsou příliš prozkoumané. Jako barotolerantní označujeme mikroorganismy, které zvýšené tlaky přežijí, ale nevyžadují je k životu.
6.2.7
ELEKTRICKÝ PROUD
Účinek elektrického proudu na mikroorganismy záleží na povaze proudu (střídavý / stejnosměrný), proudu a napětí. Střídavý elektrický proud má menší negativní účinek a působí zejména tepelně. Stejnosměrný proud způsobuje elektrolýzu rozpuštěných látek. S tím souvisí vznik biocidních meziproduktů (např. chloru) a podstatně silnější negativní účinek.
6.3 MECHANICKÉ VLIVY Mikroorganismy jsou obecně malé a vliv mechanických faktorů na ně je proto také malý. Mezi mechanické vlivy je možné zařadit i dále probíraný ultrazvuk. Při intenzivním míchání (ať už v reaktoru nebo v proudu řeky) působí na mikroorganismy tzv. střižné síly. Ty působí zejména na delší buňky a vláknité organismy (např. houby). Mechanické poškození buněk mohou způsobit také abraziva (např. jemný písek nebo drcené sklo) při intenzivním drcení. Vyšší účinnost tohoto procesu lze dosáhnout při jejich zmražení.
6.3.1
ULTRAZVUK
Jako ultrazvuk označujeme kmitání zvuku o frekvenci vyšší než 20 kHz (hranice slyšitelnosti u člověka). Ultrazvuk o frekvence kolem 20 kHz způsobuje tzv. kavitaci, tedy pulzování membrán a jejich potenciální protržení. Tyto frekvence také vyvolávají některé chemické reakce, např. rozklad některých látek za vzniku biocidních produktů. Ultrazvuk obvykle působí více na protáhlé buňky (tyčinky), kulatý tvar membrány kokovitých buněk je termodynamicky nejvýhodnější a protržení je méně pravděpodobné. Kokovité buňky jsou proto proti ultrazvuku odolnější. Ultrazvuk okolo 20 kHz se používá ve výzkumu při dezintegraci (rozkladu) buněk. Vysokofrekvenční ultrazvuk (v řádech MHz) už kmitá tak rychle, že membrány nestačí pulzovat a nehrozí jejich protržení. Takový ultrazvuk proto nemá na mikroorganismy vliv6.
6.4 CHEMICKÉ VLIVY Dnes je popsáno několik miliónů chemických látek a každá má nějaký efekt na fyziologii a životaschopnost mikroorganismů. Podle působení na mikroorganismy lze chemické látky rozdělit podle několika hledisek: • Podle místa působení v organismu nebo buňce (působení na membrány, buněčnou stěnu, DNA, inhibice enzymů apod.). • Podle metabolismu látky. Jako primární účinek označujeme přímé působení látky na organismus. Sekundární účinek znamená, že látka je nejprve metabolicky přeměněna a teprve tyto metabolické produkty působí na organismus. • Podle podobného účinku. • Podle podobné chemické struktury.
6.4.1
ANTIBIOTIKA
Jako antibiotika je označována skupina látek, které mají negativní účinek na mikroorganismy (mikrobicidní nebo mikrobistatiscký), přičemž jejich negativní účinek na vyšší organismy je významně nižší. Antibiotika nemají jednotnou chemickou strukturu ani jednotný mechanismus účinku a jako skupina nejsou přesně vymezena ani definována. Historicky se za antibiotika považovaly látky s negativním účinkem na mikroorganismy, které byly produkty jiných mikroorganismů. Látky umělé byly označovány jako chemoterapeutika. Dnes je rozdíl setřen. Antibiotka resp. jejich účinek nepřímo znali už staří Číňané, kteří zjistili, že obklady z plesnivého mléka mají léčivý účinek na některé infekce. Za první objevené antibiotikum je považován penicilin objevený v roce 1929 Alexandrem Flemingem7. 5 6
Z latinského baros = tíha, fileó = miluji. Ultrazvuk v řádu MHz nemá obecně vliv na živé organismy, proto je také možné jeho použití v lékařství.
6-6
Chemická struktura antibiotik je velice variabilní, mezi dnes v lékařství používanými antibiotiky jsou např. aminoglykosidy, peptidy, tetracykliny, sulfonamidy a mnohé další struktury. Antimikrobiální účinek je také velice variabilní, mohou zasáhnout prakticky jakoukoliv životně důležitou součást mikrobiálního organismu. Mezi nejdůležitější inhibice patří: • Inhibice růstu buněčné stěny. Tato antibiotika ovlivňují zejména grampozitivní bakterie (díky jejich tlusté peptidoglykanové stěně). Takto působí např. penicilin, β-laktamy, bacitracin a další. • Narušení cytoplazmatické membrány. Tato antibiotika ovlivňují integritu a propustnost cytoplazmatické membrány. Takto působí např. polyenoá antibiotika, polymyxiny a další. • Inhibice syntézy DNA a RNA. Bez replikace není rozmnožování, bez transkripce není exprese genů. Takto působí např. aminoglykosidy či chinolony. • Inhibice proteosyntézy. Bílkoviny mají obvykle rychlý obrat a bez jejich syntézy není možné rozmnožování ani dlouhodobé přežití. Inhibice může být na mnoha úrovních, např. inhibice funkce ribozómů či inhibice aktivity aminoacyl-tRNA-syntetázy. • Inhibice syntézy kyseliny listové. Kyselina listová je v aktiviní formě tetrahydrofolátu kofaktorem mnoha enzymů, hlavně transferáz. Metabolismus bez nich nemůže fungovat. Takto působí např. sulfonamidy. Antibiotika jsou získávána buď z přírodních zdrojů nebo uměle. Nejbohatšími producenty jsou houby (např. penicilin je produktem některých plíšní rodu Penicillium) a bakterie, hlavně streptomycety (např. streptomycin). Většina producentů tvoří antibiotika jako prostředek konkurenčního boje proti jiným mikroorganismů. Obvykle jsou syntetizovány při přechodu kultury z exponenciální fáze do stacionární, kdy začíná být akutní nedostatek živin. Mnohá antibiotika jsou získávána chemickou cestou, buď modifikací přírodních antibiotik nebo zcela kompletní chemickou syntézou. Velkým problémem je rezistence8 mikroorganismů (zejména bakterií) k antibiotikům. Kmeny mikroorganismů, na které antibiotikum působí, jsou nazývány citlivými, kmeny, na které nepůsobí, jsou pak nazývány rezistentními. Rezistence k antibiotiku může být buď pasivní nebo aktivní. Aktivní rezistence spočívá v syntéze enzymů, které antibiotikum rozkládají (např. penicilináza). Je zajímavé, že geny pro tyto enzymy jsou často kódovány na plazmidech, nezřídka je na jednom plazmidu několik genů pro různé enzymy působící proti různým antibiotikům. Mnohé bakterie umí tyto plazmidy vzájemn vyměňovat při konjugaci a to i mezi nepříbuznými rody. To přispívá k šíření rezistence. Pasivní rezistence spočívá obvykle ve změně místa, kde antibiotikum negativně působí. Vazba je pak znemožněna a antibiotikum nemá účinek. Taková změna nastává nejčastěji náhodnou mutací některého genu a následnou změnou struktury kódované bílkoviny v neprospěch vazby antibiotika. Taková mutace může být i mírně negativní pro organismus, ale je-li vystaven zároveň působení antibiotika, je to pro něj výhoda ve smyslu Darwinova přirozeného výběru. Příkladem může být působení tetracyklinu. Ten se váže na malou ribozomální podjednotku a blokuje syntézu bílkovin. Vhodnou mutací je tato vazba znemožněna a proteozyntéza funguje. Vznik takovýchto rezistentních mutantů je možné snadno provést v laboratoních podmínkách (evoluce „ve zkumavce“). Vystavíme-li rostoucí kulturu přiměřené koncentraci antibiotika (takovou, která nebude mít účinek na cca 50% jedinců), v řádech několika dnů se objeví mutanti, kteří za několik dalších dnů původní kulturu přerostou díky vyšší růstové rychlosti. Nahradíme-li antibiotikum jiným, objeví se časem kultura rezistentní na toto nové antibiotikum a původní opět přeroste.
Vznik rezistentních kmenů je velkým problémem současného lékařství, kde antibiotika hrají nezastupitelnou roli při léčení některých chorob. Stará antibiotika časem ztrácejí účinnost a musí se 7
Fleming objevil penicilin vlastně díky své nepořádnosti a dobrému postřehu. Kdyby si poctivě zlikvidoval kultury streptokoků, se kterými dělal před dovolenou experimenty, a kdyby si nevšiml, že plíseň, která na nich přes dovolenou vyrostla, inhibuje jejich růst, možná bychom na první antibiotikum čekali ještě dlouho. Předpokládá se, že peníze vydělané následkem tohoto objevu (se kterých ale Fleming moc neměl) by pokryly veškeré náklady investované od té doby do základního výzkumu. Penicilin dostal jméno podle plísně, která ho produkovala (Penicillium notatum). 8 Z latinského resistenia = odolnost.
6-7
nahrazovat novými. Člověk sám vzniku těchto rezistencí pomáhá tím, že užívá antibiotika nadbytečně, a často nesprávně či úplně zbytečně. Dříve byl např. skot přikrmován antibiotiky preventivně proti zánětům zejména mléčné žlázy. V dnešní době jsou tyto záněty velkým problémem, protože stará antibiotika na ně už nepůsobí. V humánní medicíně jsou často antibiotika předepisována bez řádného potvrzení, že jde o bakteriální chorobu (proti virům jsou neúčinná). Také je rozšířené použití širokospektrálních antibiotik (tj. takových, které zasáhnou mnoho různých druhů) bez detailního vyšetřování.
6.4.2
KYSLÍK
Kyslík je nejrozšířenější oxidační činidlo na Zemi a je proto mnohými organismy využíván při získávání energie. Podle vztahu mikroorganismů ke kyslíku lze organismy dělit do několika skupin: • Aerobní organismy, které kyslík využívají. • Anaerobní organismy, které kyslík k životu nepotřebují. • Mikroaerofilní, které kyslík k životu nepotřebují, ale jeho menší koncentrace podporuje růst a množení. • Aerotolerantní, které kyslík nevyužívají, ale nevadí jim. Mnohé mikroorganismy mají schopnost přepínat svůj metabolismus podle vnějších podmínek. Jako obligátní (povinné) označujeme ty mikroorganismy, které neznají jiný způsob získávání energie popř. uhlíku. Jako fakultativní se označují ty mikroorganismy, které mají schopnost přepínání metabolismu. • Obligátní aerobové nemají možnost přepínat metabolismus na anaerobní. Bez kyslíku rychle hynou. Patří sem většina hub (s výjimkou kvasinek) a mnohé bajterie • Obligátní anaerobové využívají pouze anaerobní procesy získávání energie. Kyslík je navíc obvykle zabíjí (např. bakterie rodu Clostridium). Fakultativně aerobní organismy umí obvykle přepínat mezi aerobním a jedním či několika anaerobními způsoby získávání energie. Nejčastěji je při nedostatku přepínána respirace na kvašení, popř. na anaerobní respiraci (např. nitrátovou). Umí-li mikroorganismus více způsobů, obvykle dává přednost tomu energeticky nejúčinnějšímu (nejprve aerobní respiraci, pak anaerobní respiraci a nakonec fermentaci).
6.5 REGULACE METABOLISMU I relativně velmi jednoduché organismy jako jsou bakterie mají pořád velice složitý metabolismus, který vyžaduje regulaci, aby úspěšně obsloužil všechny potřeby organismu v měnícím se prostředí. Metabolismus většiny mikroorganismů funguje obvykle velice úsporně. Mikroorganismy disponují velice účinnými regulačními mechanismy, které umožňují rychlé změny v metabolismu. Regulace může probíhat na několika úrovních, každá se má svoje výhody a své uplatnění: • Inhibice a aktivace enzymů • Exprese genů (transkripce, translace) • Odbourávání enzymů
6.5.1
REGULACE AKTIVITY ENZYMŮ
Koncentrace většiny substrátů v buňce je cca na úrovni Michaelisovy konstanty, tj. změna koncentrace substrátu vede k výrazné změně rychlosti reakce. Díky tomu se v buňce meziprodukty obvykle nehromadí. Mnohé enzymy mají proměnlivé prostorové uspořádání, se kterou souvisí i proměnlivá aktivita. Takové enzymy nazýváme alosterické9 a jsou to obvykle klíčové enzymy jednotlivých metabolických drah. Změny prostorového uspořádání lze dosáhnout několika způsoby, např. vazbou konkrétní regulační látky mimo aktivní místo enzymu nebo kovalentní modifikací enzymu, např. fosforilací. Tímto způsobem lze aktivitu enzymu snížit (inhibice) i zvýšit (aktivace). Regulační vazby existují obvykle mezi klíčovými meziprodukty a klíčovými enzymy jednotlivých drah. Nejčastěji se setkáváme s tzv. zpětnovazebnou inhibicí, kdy konečný produkt dráhy inhibuje 9
Alosterický znamená s proměnlivou strukturou.
6-8
jeden z počátečních enzymů dráhy. Přebytek produktu tak vede k zastavení celé dráhy. Pro organismus má tato regulace výhodu v tom, že se neprodukují ani žádné zbytečné meziprodukty.
6.5.2
REGULACE EXPRESE GENŮ
Regulace exprese genů je nejekonomičtější a proto i nejčastější používanou formou regulace metabolismu. Enzymy metabolismu lze rozdělit do čtyřech skupin podle toho, jak jsou syntetizovány v závislosti na podmínkách prostředí: • Konstitutivní10 enzymy jsou syntetizovány stále bez ohledu na vnější podmínky. Jedná se obvykle o enzymy základních metabolických drah, např. glykolýzy. • Induktivní enzymy jsou takové, jejichž syntéza je zapínána popř. zesilována v reakci na vnější podnět (induktor), např. přítomnost určité látky. Jedná se např. o katabolické dráhy pro rozklad neobvyklých substrátů. Není-li substrát přítomen, byly by syntéza enzymů zbytečným plýtváním. • Represivní enzymy jsou takové, jejichž syntéza je vypínána nebo zeslabována v reakci na vnější podnět (represor), např. přítomnost určité látky. Obvykle se jedná o anabolické syntetické dráhy, jejichž syntéza je vypínána konečným produktem. Má-li mikroorganismus tento produkt k dispozici v prostředí, nemusí ho syntetizovat a metabolickou dráhu proto nepotřebuje. • Induktivní enzymy podléhající ještě represi. Jejich syntéza vyžaduje dva podněty, induktor musí být přítomen, represor nesmí být přítomen. Represe má obvykle přednost, tj. je-li represor přítomen, pak je syntéza vypnutá i tehdy, je-li přítomen induktor. To umožňuje mikroorganismům např. postupné využívání substrátů od nejjednoduššího k nejsložitějšímu. Oblíbeným příkladem jsou enzymy pro rozklad laktózy u bakterií (jejichž geny jsou sdružené v tzv. laktózovém operonu). Celý operon je indukován laktózou a reprimován glukózou. Využití laktózy vyžaduje více enzymů než využití glukózy, využití glukózy je proto výhodnější a organismus mu dává přednost. Má-li organismus k dispozici glukózu i laktózu, pak represe glukózy zabrání expresi operonu. Není-li k dispozici laktóza, pak exprese operonu také nemá smysl. Operon je tak exprimován jen tehdy, je-li k dispozici pouze laktóza a glukóza není přítomna.
6.5.3
REGULACE ODBOURÁVÁNÍ ENZYMŮ
Regulace odbourávání enzymů je méně častá a také méně prozkoumaná. K částečnému rozkladu všech bílkovin navíc dochází prakticky pořád. Nachází-li se buňka v exponenciální fázi růstu, obvykle enzymy příliš nerozkládá, pouze částečně obnovuje ty poškozené („údržba“). Větší rozklad enzymů je pozorován při přechodu do jiného fyziologického stavu, např. do stacionární fáze, při přechodu výživy na jiný substrát, při sporulaci apod. Hlavním důvodem je uvolnění zásoby aminokyselin, které by jinak byly zbytečně vázány v už nepotřebných enzymech.
6.5.4
PASTEURŮV EFEKT
Pasteurův efekt je jev, který byl poprvé pozorován Louisem Pasteurem. Podstatou jevu je fakt, že v přítomnosti kyslíku se u kvasinek zpomaluje kvašení a zrychluje se růst kultury. Vysvětlení tohoto jevu je celkem prosté. Aerobní respirace uvolní z glukózy 19x více energie než anaerobní fermentace. Kvasince tak zajišťuje více energie pro metabolismus. Pasteurův efekt není jen záležitostí kvasinek, ale je rozšířen i u většiny fakultativně anaerobních bakterií. Potravinářský průmysl prakticky využívá Pasteurova jevu v obou směrech. Je-li cílem produkce alkoholu alkoholovým kvašením, je kultura udržována v anaerobním stavu. Je-li naopak potřeba vyprodukovat hodně biomasy (např. při produkci kvasnic), je kultura aerována a roste rychleji.
6.5.5
KYSLÍKOVÝ EFEKT
Tzv. kyslíkový efekt představuje zobecnění Pasteurova efektu na více metabolických drah. Ukázalo se, že u fakultativně aerobních organismů kyslík obvykle reprimuje nejrůznější metabolické dráhy, které nejsou v jeho přítomnosti potřebné, kromě fermentace např. i anaerobní respirace a další. Naopak se ukázalo, že kyslík indukuje dráhy, které jsou pro jeho využití potřebné, např. citrátový 10
Konstituce = ustanovení
6-9
cyklus či dýchací řetězec. Regulační mechanismy nejsou příliš prozkoumané a obvykle probíhají na úrovni transkripce.
6.5.6
CRABTREEHO EFEKT
Tzv. Crabtreeho efekt byl poprvé pozorován Herbertem Crabtreem. Jedná se do jisté míry o opak Pasteurova efektu. Mají-li kvasinky k dispozici velkou koncentraci glukózy, pak fermentují i v přítomnosti kyslíku. Vysoká koncentrace glukózy tedy. reprimuje aerobní metabolismus. Preference fermentace proti respiraci nemá jednoduché logické zdůvodnění, organismus tak získá méně energie. Jev není dosud spolehlivě objasněn, v zásadě jsou navrženy dvě hypotézy. První hypotézou je plýtvání. Crabtreeho efekt se projevuje jen při opravdu velkých koncentracích glukózy. Je proto možné, že při takovém nadbytku substrátu si organismus dovolí „plýtvat“, tedy využívat glukózu neekonomicky fermentačně. Fermentace sice uvolní méně energie, ale vyžaduje podstatně méně enzymů a je tak pro organismus jednodušší. Druhou hypotézou je konkurence. Protože kvasinky (a mnohé další mikroorganismy schopné etanolového kvašení) jsou k etanolu poměrně odolné, předpokládá se, že produkce etanolu inhibuje potenciální konkurenční mikroorganismy v boji o bohatý zdroj energie. Uplatní se např. na uzrálém ovoci, které je plné sacharidů.
6.5.7
GLUKÓZOVÝ EFEKT
Glukózový efekt představuje zobecnění Crabtreeho efektu. Podstatou je represe mnoha metabolických drah glukózou. Projevuje se u mnoha organismů, zejména bakterií a kvasinek. Represe se týká např. těchto metabolických pochodů: • Využívání jiných zdrojů uhlíku • Transport těchto zdrojů uhlíku do buňky • Citrátový cyklus • Dýchací řetězec • Dělení mitochondrií u kvasinek • Fotosyntéza • Sporulace bakterií • Tvorba bičíků • Produkce toxinů • a mnoha dalších. Glukózový efekt není zdaleka objasněn. Zatímco smysl některých represí je jasný, (např. využití jiných zdrojů uhlíku je reprimováno proto, že glukóza je snadněji a rychleji využitelná obvykle konstitutivními enzymy), u jiných je v oblasti spekulací (např. u represe dýchání se spekuluje na jednodušší metabolismus nebo ochranu proti kyslíku) a u některých je zcela nejasná (represe tvorby bičíků a toxinů). Klíčová role glukózy v metabolismu je dána pravděpodobně evolucí a není vyloučena, že volba pro glukózu padla v minulosti jen náhodou výběrem mezi dalšími rozšířenými substráty. Zajímavé je vzájemné porovnání glukózového a kyslíkového efektu. V zásadě platí, že co kyslík indukuje, to glukóza reprimuje a naopak. V reálném prostředí, kde jsou mikroorganismy vystaveny měnícím podmínkám, umožňují tyto protichůdné efekty vyladění metabolismu přesně podle potřeb organismu.
6.5.8
KATABOLICKÁ REPRESE
Katabolická represe představuje zobecnění glukózového efektu na další snadno využitelné substráty. Bylo zjištěno, že má-li mikroorganismus k dispozici několik různých substrátů, utvoří si mezi nimi hierarchii postupného využívání od nejjednoduššího (glukóza) po nejhůře odbouratelné. Dokud je k dispozici snadněji využitelný substrát, nejsou hůře využitelné metabolizovány. Projevuje se tu podobná represe metabolismu v hierarchii nižších substrátů vyššími NH2 podobná represi glukózou. Přesné mechanismy katabolické represe nejsou N N
N O
6-10 O
P
O O- H O
H
H H OH
N
zdaleka prozkoumané, nicméně represe se projevuje už při transportu látek do buňky a dále při expresi genů pro metabolismus horších substrátů. Klíčovou roli hraje regulační molekula tzv. cyklický adenosinmonofosfát (cAMP, viz obrázek), který je potřebný pro indukci mnohých genů. Produkce cAMP je reprimována už při transportu lépe využitelného substrátu do buňky. Působení cAMP je univerzální a nacházíme ho jak v mikroorganismech tak ve vyšších organismech.
Hlavní význam katabolické represe je opět ve vyladění mezi katabolismem a anabolismem. V ideálním případě je potřeba, aby katabolismus produkoval právě tolik energie (v podobě zejména ATP) a redukčních činidel (v podobě zejména NADPH), kolik potřebuje anabolismus. Neměl by tu být ani nedostatek ani přebytek11.
6.5.9
DIAUXIE
Diauxie je jev pozorovaný na růstové křivce, který souvisí s postupným využíváním substrátů. Mikroorganismus se nejprve adaptuje na snadněji využitelný substrát a na něm exponenciálně roste. Po jeho vyčerpání se na růstové křivce objeví nová lag-fáze, při které se organismus adaptuje na druhý substrát a přejde znovu ndo exponenciální fázi až do vyčerpání druhého substrátu. Na růstové křivce se tak objeví „schod“ (viz obrázek). 9 8 7 6
OD
5 4 3 2 1 0 -1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Čas [min]
6.5.10 OPERONY Operony představují velice efektivní způsob exprese genů a její regulace. Operonem nazýváme soubor genů, které leží v DNA za sebou a které mají společnou regulaci a společnou expresi. Přepisují se do jedné (polygenní) mRNA. Operon obvykle nese geny nějakým způsobem související, nejčastěji celou metabolickou dráhu nebo její samostatnou část. To je velmi ekonomické, neboť to umožňuje exprimovat celou metabolickou dráhu jen tehdy, je-li skutečně potřeba. Regulační mechanismus operonů funguje obvykle už na úrovni transkripce (nejekonomičtější způsob) a na úrovni molekul a genů může být v zásadě dvojího typu: • Negativní regulace, při které je transkripci bráněno. • Pozitivní regulace, při které je transkripci pomáháno (zvyšuje se pravděpodobnost zahájení transkripce). Hlavní roli v těchto mechanismech hrají regulační bílkoviny, které mají schopnost vázat se na DNA a současně vstupovat do efektivní interakce s některou součástí transkripčního aparátu (např. RNA11
Nabízí se analogie s elektrickou energií. Cílem elektrárenských společností je také dosáhnout stavu, kdy produkce elektrické energie je v rovnováze s její spotřebou.
6-11
polymerázou). Regulační bílkoviny mají také aktivní místo pro vazbu induktoru nebo represoru. Tato vazba pak změní konformaci (prostorové uspořádání) regulační bílkoviny a touto změnou je ovlivněna i interakce s DNA a transkripčním aparátem. Změna interakce tak vede ke změně exprese určitého genu a vyvolá fyziologickou odpověď. Než probereme detaily regulace operonů, je třeba zdůraznit, že negativní i pozitivní regulační mechanismus souvisí skutečně jen s průběhem na molekulární úrovni a nemá nic společného s tím, zda se jedná o indukci nebo represi. Jak indukce tak represe operonů mohou mít pozitivní i negativní mechanismus. Typická negativní indukce spočívá v tom, že regulační bílkovina se váže na regulační místo v DNA. Touto vazbou je bráněno RNA polymeráze v zahájení transkripce a nedojde tak k expresi operonu. Vazbou induktoru na regulační bílkovinu dojde ke změně konformace, po které už se nemůže bílkovina vázat na DNA. To otevírá prostor pro RNA polymerázu, která může transkripcí zahájit expresi operonu. Typická pozitivní indukce spočívá v tom, že promotor operonu nemá standardní sekvenci a RNA polymeráza na něm proto zahajuje transkripce s výrazně nižší pravděpodobností než u jiných genů (tzv. slabý promotor). Regulační bílkovina v tomto případě pomáhá RNA polymeráze zahájit transkripci, čímž je expresu operonu častější. Tuto funkci má regulační bílkovina ale jen tehdy, je-li na ní navázán induktor. V nepřítomnosti induktoru je neaktivní. Kromě molekulárního mechanismu je stěžejní rozdíl mezi pozitivní a negativní indukcí v míře exprese genů. Negativní indukce funguje prakticky jako vypínač, operon buď je exprimován nebo není. Naopak pozitivní indukce funguje spíše jako zesilovač, v nepřítomnosti induktoru není exprese genů úplně vypnutá, ale je slabá. V přítomnosti induktoru dochází k výraznému zesílení exprese genů (o řád i několik řádů). Molekulární mechanismus represe je analogický indukci, hlavní rozdíl je v opačné aktivitě regulační bílkoviny po vazbě represoru. Při negativní represi dojde vazbou induktoru na regulační bílkovinu ke změně konformace na aktivní formu, která brání expresi. Při pozitivní represi je tomu naopak. Uvedené principy jsou modelové, obecné. V reálu bývají molekulární mechanismy poněkud komplikovanější a mají mnohá individuální specifika. Příkladem reálné pozitivní indukce je indukce dráhy pro odbourávání naftalenu. Tyto dráhy jsou poměrně rozšířené u mnoha gramnegativních bakterií, např. u rodu Pseudomonas. Naftalenová dráha slouží těmto bakteriím k využití naftalenu (a strukturně podobných látek) jako zdroje uhlíku a energie. Geny pro tuto dráhu jsou ale buňce bez naftalenu celkem k ničemu a proto má indukce ekonomický význam. Jako u mnoha podobných drah je i tato rozdělená na dvě, tzv. horní a spodní. Horní dráha převádí naftalen na salicylovou kyselinu, spodní dráha pak převádí salicylovou kyselinu až na centrální meziprodukty metabolismu. Geny pro enzymy obou drah jsou sdruženy do dvou operonů (naftalenový a salicylátový), oba mají stejnou regulaci. Induktorem obou drah není naftalen, ale právě meziprodukt odbourávání salicylová kyselina. Promotor této dráhy je slabý a bez salicylové kyseliny je exprese obou operonů velmi malá. Několik enzymů obou drah je nicméně v buňce stále přítomno a umožňuje i nepřímou indukci naftalenem. Stačí pár molekul naftalenu převést na salicylovou kyselinu. Regulační bílkovina (tzv. NahR protein) má po navázání salicylové kyseliny schopnost vázat se na promotor operonů a pomáhat v iniciaci transkripce. Zesílení exprese genů je cca řádové. Biologický význam nepřímé indukce přes meziprodukt odbourávání je v tom, že umožňuje indukci celou řadou dalších látek (kromě naftalenu se jedná o četné substituované naftaleny i některé polyaromatické uhlovodíky), které jsou shodně převáděny na salicylovou kyselinu (konvergence metabolismu).
6.6 BAKTERIÁLNÍ POHYB Pohyb mikroorganismů nazýváme taxe. Pohyblivých mikroorganismů i mechanismů pohybu je popsáno několik. U bakterií, které disponují bičíkem, je pospán cílený aktivní pohyb. Podle toho, za jakým cílem se bakterie pohybuje, je označován různými termíny, např. aerotaxe je pohyb za kyslíkem, chemotaxe za živinami, fototaxe za světlem apod. Bakterie se směřuje vždy ve směru či proti směru gradientu (rostoucí koncentrace) faktoru, podle toho, co jí více vyhovuje. Např. v gradientu kyslíku se aerobní bakterie pohybují směrem k vyšším koncentracím kyslíku, naopak anaerobní se pohybují směrem k nižším koncentracím. Pozorujeme-li bakteriální pohyb pod mikroskopem, vidíme, že se nepohybuje rovnoměrně přímočaře, ale její pohyb často mění směrem („cik-cak“), nicméně ve výsledku se pohybuje v žádaném směru. Tento pohyb souvisí s mechanismem správného směřování.
6-12
Bičík svou funkcí připomíná lodní šroub, otáčí se a pohání bakterie přímo kupředu. Čas od času je ale tento pohyb přerušen a bakterie se točí na místě. Po několika otáčkách opět pokračuje v přímočarém pohybu, ale v jiném směru. Je-li prostředí homogenní, bakterie se pohybuje sem a tam, ale zůstává prakticky na místě. Je-li ale v prostředí gradient žádané látky, je rovnoměrný pohyb ve správném směru delší, než ve špatném. Bakterie totiž umí měřit změnu koncentrace žádané látky podél svého pohybu a mění-li se koncentrace žádaným směrem, snižuje se pravděpodobnost zastavení a otáčení. Mění-li se koncentrace nežádoucím směrem, je pravděpodobnost naopak menší. Výsledkem je postupný posun bakterie správným směrem.
6.7 SPORULACE BAKTERIÍ Některé rody bakterií (zejména grampoztiviních) mají schopnost tvořit v nepříznivých podmínkách odolné útvary, tzv. spory. Spora je klidové stádium bakterie s velmi vysokou odolností vůči nepříznivým podmínkám. Má velice nízký obsah vody a je prakticky bez metabolismu. Spora může přežít v nevhodných podmínkách velmi dlouhou dobu, mnohdy se hovoří i o desítkách, ne-li tisících let. Ve vhodných podmínkách pak spora tzv. vyklíčí a přemění se zpět na původní bakterii, která dále roste a dělí se. Nejdéle známé, nejprozkoumanější a též technicky i lékařsky nejvýznamnější jsou spory rodů Bacillus, Clostridium a Desulfotomaculum.
6.7.1
STAVBA A SLOŽENÍ SPOR
Spora je obvykle kulovitá a obvykle zůstává umístěna v původní buňce. Díky tomu vypadají buňky nesoucí sporu jako vypouklé (rozšířené), nejčastěji uprostřed nebo na konci (typické pro rod Clostridium). Spory mají několik dodatečných obalových vrstev, které zvyšují jejich odolnost. Kortex a sporová stěna jsou složeny z peptidoglykanu. Plášť je tvořen bílkovinami s vysokým obsahem aminokyseliny cysteinu, která dává plášti pevnost díky disulfidickým můstkům. Vnější exosporinum, které nacházíme jen u některých sporulujících rodů, je komplexní struktura složená zejména z bílkovin, sacharidů a lipidů. Bakteriální spory obsahují hodně dipikolinátu vápenatého, který slouží jako zásobní látka a zároveň i jako ochrana DNA. Oproti živému stádiu má bakterie velmi snížený obsah vody (jen cca 15%).
6.7.2
ODOLNOST SPOR
Odolnost spor se liší rod od rodu, nicméně je obecně vysoká: • Teplotní odolnost. Spory obvykle přežijí i několikahodinový var a jsou usmrceny až při 115120°C působících po delší dobu (15-30 minut). • Odolnost k záření. Spory snesou bez újmy řádově vyšší dávky UV záření i radioaktivního záření. • Chemická odolnost. Spory jsou odolné proti četným desinfekčním prostředkům. Odolnost spor spoluutváří několik faktorů: • Dodatečné obalové vrstvy. Díky nim se většina spor nebarví žádným chemickým barvivem, což naznačuje velkou nepropustnost obalových vrstev pro mnohé chemické látky. Desinfekční činidla se tak nedostanou na místo působení. • Nízký obsah vody spoluutváří zejména teplotní odolnost a odolnost proti zářením. Právě pohyblivé molekuly vody působí při vyšších teplotách četné škody, např. denaturace bílkovin. Negativní účinek záření je také významně způsoben rozkladem vody a vznikem radikálů. • Dipikolinát vápenatý obaluje DNA a chrání ji před vnějšími vlivy. • Nízká metabolická aktivita způsobuje, že případný výpadek některé metabolické dráhy např. z důvodu denaturace enzymu nemá tak škodlivý dopad na život buňky.
6.7.3
PRŮBĚH SPORULACE
Sporulace je ve srovnání s dělením buňky proces podstatně pomalejší, vznik spory trvá obvykle cca 56 hodin. Rozhodování o vzniku spory nastává v G2 fázi buněčného cyklu. Pokud se buňka nerozhodne ke sporulaci, vzniknou dvě dceřinné. Pokud ke sporulaci dojde, vznikne pouze jedna spora. Protože sporulace nastává v nepříznivých podmínkách, spoléhá se buňka obvykle na vlastní energetické
6-13
zásoby (hlavně poly-β-hydroxymáselnou kyselinu). Aerobní bakterie vyžadují pro sporulaci hodně kyslíku. Zejména v přípravné fázi jsou také vyžadovány četné ionty (vápenatý, manganatý, amonný, kobaltnatý, nikelnatý, fosforečný, síranový, dusičnanový a další). Celý proces lze rozdělit do několika fází: 1. Tvorba septa. Chromozómy se uspořádají podélně do jedné linie. Poté dojde k vchlípení cytoplazmatické membrány a oddělení budoucí spory cytoplazmatickou membránou od cytoplazmy původní buňky. 2. Tvorba prespory. Dalším vchlípením membrány septa vzniknou dva membránové obaly (vnitřní a vnější), čímž vznikne tzv. prespora. 3. Tvorba obalových vrstev. Mezi oběma membránami prespory je nejprve syntetizován kortex, poté sporová stěna a nakonec vnější plášť. U některých rodů vznikne ještě exosporinum. 4. Zrání spory. Spora se zbavuje vody a syntetizuje dipikolinát vápenatý. 5. Uvolnění spory. U některých druhů dojde k uvolnění spory z původní buňky. Ta v každém případě hyne.
6.7.4
KLÍČENÍ SPORY
Dostane-li se spora do vhodných podmínek, pak tzv. vyklíčí, tedy se přemění na aktivní buňku, která se dále dělí. Celé klíčení trvá obvykle 30-60 minut a má tři fáze: • Aktivace. Jsou-li podmínky vhodné pro klíčení, dojde k aktivaci genů, které jsou pro klíčení potřebné. • Zrání. V této fázi přijímá spora vodu, buněčné obaly praskají a uvolňuje se část sporových látek. • Růst buňky. Oživená buňka aktivuje metabolismus, syntetizuje buněčné komponenty, roste a připravuje se na dělení.
6.8 QUORUM SENSING Quorum12 sensing je fyziologická odpověď bakterie (resp. bakteriální populace) na koncentraci jedinců. Obvykle znamená aktivaci některých pochodů, dojde-li ke zvýšení buněčné koncentrace nad určitou úroveň. V bakteriálním světě je to poměrně rozšířený jev, např. při tvorbě biofilmů. Quorum sensing se neprojevuje jen při reakci na jedince stejného druhu, ale často probíhá i v rámci bohatšího společenstva. Mechanismus quorum-sensing spočívá v produkci nízkomolekulárních signálních látek (např. homoserinlaktonů) a detekci jejich koncentrace. Je-li koncentrace buněk nízká, je nízká i koncentrace signálních látek a fyziologická odezva není aktivována. Překročí-li koncentrace signálních molekul určitou hranici, dojde k aktivaci fyziologické odpovědi. Že je aktivaci fyziologické odpovědi skutečně vyvolána koncentrací signálních molekul lze snadno dokázat jejich přidáním do kultury v baňce. Fyziologická odpověď je tak vyvolána i při nedostatečné koncentraci buněk.
12
Quorum = množství, kvóta
6-14
