4. APLIKACE SUPRAMOLEKULÁRNÍ CHEMIE PRO VÝVOJ SENZORŮ - SENZOROVÁ ANALÝZA

4. APLIKACE SUPRAMOLEKULÁRNÍ CHEMIE PRO VÝVOJ SENZORŮ - SENZOROVÁ ANALÝZA Vladimír Král, Radko Volf, Tatjana Shishkanova, Martin Kronďák, Gabriela Broncová, Miloslav Šťastný, VŠCHT Praha a ÚOCHB AV ČR Praha Obsah: 4.1. Historické perspektivy 4.2. Od receptoru k senzorům 4.3. Hmotnostní, teplotní, vodivostní, elektrochemické a optické senzory 4.4. Literatura ÚVOD Supramolekulární chemie, a to především v počátcích, byla soustředěna pouze na návrh a syntézu vhodného receptoru pro zvolený analyt, substrát. Dosažení požadované selektivity bylo považováno za cíl. Nyní se důraz v supramolekulární chemii přesouvá na funkci navrženého systému, kde rozpoznávací proces představuje pouze první nutný krok. Soustředění na funkční systémy se v současnosti realizuje především v oblasti samoskladných systémů (rozpoznání stavebních kamenů vedoucí ke vzniku požadované architektury supramolekuly), supramolekulární katalýze (rozpoznání a transformace substrátu), cíleného transportu léčiv (komplexace a cílený transport léčiva založený na rozpoznání povrchu buněk). Molekulární rozpoznání je stále více využíváno v současné analytické chemii a to jak pro vývoj nových separačních technik (napodobujících afinitní chromatografii), tak pro návrh a využití chemických sensorů a biosensorů, jejichž popis tvoří hlavní část tohoto příspěvku. Základní náplní analytické chemie jako vědní disciplíny je vývoj nových metodik důkazů a stanovení. Řešení souvisí s širším pohledem na analytickou chemii zahrnutím poznatků řady nově vznikajících oborů pro potřeby analytické chemie tak, aby byla schopna odpovídat na jednotlivé potřeby současnosti. Zatímco prvková analýza a principy analýzy anorganických materiálů postačuje i současným nárokům (obvykle se řeší již jen metodika jednotlivých stanovení pro danou konkrétní aplikaci), největší tlak je v současnosti na analýzu organických látek a biologických materiálů. Jaké řešení se v současné době nabízí? Jediné řešení, které má budoucnost, je formulováno velmi přehledně jedním z nejvýznamnějších analytických chemiků současnosti, prof. Umezawou z University v Tokiu. Ten demonstruje velmi dobře, že moderní analytická chemie 21. století nemůže jako vědní obor obstát bez aplikace nových poznatků biochemie, fyzikální chemie, kvantové chemie, molekulárního designu, kombinatoriální chemie a matematiky. Jeho pohled na filosofii analytické chemie byl nedávno uveřejněn v časopise Analytical Chemistry.

105

Methods of Analysis „I teach analytical chemistry as chemical and physical methods of analysis. Physical methods of analysis are based on the direct interaction of materials (analyte) with electromagnetic waves; corpuscular beams, such as electrons and neutrons; or electric, magnetic, and gravimetric fields. Chemical methods of analysis are based on the selective interaction of materials (receptors, chromatographic media, etc.) with analytes. It is important to appreciate that various methods of instrumental analysis, including all kinds of spectroscopies, have completely changed the nature of chemical research. For example, until the end of the 19th century, organic chemistry developed with little support from physical methods because they were simply not available. Instead, organic chemists invented their own chemical methods, such as extraction, elemental analysis, melting point measurements, and functional group analysis using specific colorimetric reactions. Modern chemistry owes much to the various physical methods of analysis developed by modern, 20th century physics. Physical and chemical methods of analysis are, in fact, not clearly separated. The molecularrecognition processes in chemical senzors, chromatography, and immunoassay methods, for example, are surely chemical, but signal transduction and amplification often rely on physical methods. Even in the case of biosenzors, molecular recognition is certainly based on bioreceptors such as enzymes, antibodies, and nucleotides, but the process of following the signal transduction is mostly physical. On the other hand, in biological systems such as cells, all processes from molecular recognition to signal transduction and amplification are governed by chemical mechanisms. In analytical chemistry, the pursuit of sensitivity, selectivity, precision, and accuracy has been a priori praised and rewarded. Among these parameters, selectivity has a unique position. In most chemical methods of analysis, selectivity for analytes against interfering substances is essentially governed by the competitive binding constants between the analyte and its molecular-recognition reagent. This is generally the basis for binding assays, such as immunoassays. As a result, chemical methods of analysis owe much to natural bioreceptors, as well as to group reagents, chelating agents, and various supramolecular receptor molecules developed by organic chemists. Binding assays are typically used for analyzing bioactive substances. Conventional binding assays can neither discriminate agonists from antagonists nor give sufficient information on their physiological activities. Physical methods such as NMR and MS cannot provide this information either. The bioassay that uses intact biological tissue or whole bodies has a unique position in analysis, because it can target bioactive substances. However, the bioassay cannot give molecularlevel information because of this inherent black box approach. During the past 50 years, molecular biology has developed primarily by taking advantage of physical and chemical methods of analysis, which have elucidated the molecular chemistry behind cellular mechanisms. If analytical methods for bioactive substances are based not only on receptor binding but also on known molecular-level processes involved in signal transduction along signaling pathways (reconstructed in vitro or taken, in part, from in vivo data), these methods will be able to provide physiologically relevant analyte selectivities in terms of cellular mechanisms at the molecular level. This is of prime importance for screening and targeting pharmaceutically, toxicologically, and environmentally relevant bioactive substances. Chemical analysis methods for bioactive substances thus will rely more and more on molecular-recognition and cellular signal transduction, mimicking how living things on earth see ions and molecules.“ Yoshio Umezawa The University of Tokyo (Japan) [email protected]

4.1. HISTORICKÉ PERSPEKTIVY

106

Zatímco klasická analytická chemie dosáhla v mnoha oblastech svých metodik skutečného mistrovství a pro řadu jednosložkových systémů poskytuje přesné, správné, reprodukovatelné a robustní metodiky, naráží v současné době na řadu nových výzev, kde už nestačí klasický přístup a je třeba přijmout zcela nové metodiky řešení. To lze demonstrovat velmi dobře na největším analytickém projektu posledních 10 let, kterým byla analýza lidského genomu. Tento „Human genome project“ představoval intenzivní mezinárodní úsilí řady týmů, a to jak univerzitních tak soukromých biotechnologických společností (Celera Genomic). Motivací bylo určení sekvence nukleotidů lidské DNA (lidského genomu), neboť to by mělo umožnit následné porozumění individuálním rozdílům mezi lidmi (genomy žádných dvou lidí kromě monozigotních dvojčat nejsou identické; interindividuální variabilita sekvence DNA u člověka dosahuje asi 0,1 %), a dále např. možnost regrese genetických onemocnění. Účinné metody sekvenování DNA byly už sice vyvinuty v druhé polovině 70. let dvacátého století, ale záměr analyzovat pořadí celého lidského genomu byl poprvé formulován v roce 1986. Již v roce 1990 bylo v USA oficiálně zahájeno financování projektu „Human genome project“. Tento úkol, který byl původně plánován na více než 20 let, byl ale dokončen velmi rychle díky vývoji nových automatických metodik stanovení, miniaturizaci a automatizaci založené především na senzorové analýze. A tak již v červnu 2000 oznámili společně jak zástupci akademických laboratoří tak zástupci firmy Celera dokončení předběžné verze lidského genomu. První výsledky byly publikovány v roce 2001. Mezi daty získanými oběma týmy je několik rozdílů. Celera použila strategii založenou na fragmentaci celého genomu s finálním počítačovým složením celé sekvence, zatímco v mezinárodním akademickém projektu byl genom nejprve mapován a pak byly analyzovány fragmenty DNA lokalizované na jednotlivých chromosomech (50-250 milionů párů nukleotidů). Analýza sekvence ukazuje, že genom člověka obsahuje asi 40 000 genů. Dnešní verze sekvence lidského genomu není definitivní, protože obsahuje mnoho mezer a nepřesností. Předpokládá se, že úplná analýza, která bude obsahovat méně než jednu chybu na 10 000 nukleotidů (celkový počet je asi 3,2 miliardy párů nukleotidů), bude dokončena do konce roku 2005. Tento projekt, samozřejmě kromě vlastního cíl určení sekvence, byl obrovským přínosem pro vývoj nových metodik analytické a bioanalytické chemie. Využití DNA čipů v diagnostice pro detekci známých mutací je sice teprve v počátcích, ale již dnes je patrna řada výhod této moderní hybridizační techniky – jednoduchost, rychlost a velká kapacita. Do stejné kategorie výzev současné analytické chemie patří také analýza milionů nových látek, potenciálních léčiv, produkovaných kombinatoriální chemií ve farmaceutickém průmyslu. Vývoj „high throughput“ metodik je výzvou současné analytické chemii pro analýzu kombinatoriálních knihoven. V neposlední řadě si novou metodiku vyžaduje také analytická chemie uvnitř buněk, případně analýza velmi malého subpikomolárního látkového množství sledovaného analytu. Již toto zadání indikuje potřebu nových přístupů stejně jako v jiných oblastech, např. stanovení velmi nízkých koncentrací těžkých kovů a organických polutantů. Jaké separační a analytické metody lze k tomu použít? Nové výzvy je možné nejlépe demonstrovat na běžném zadání současného analytického problému, jakým je např. analýza množství nukleové kyseliny nebo proteinu, jejichž obsah je na úrovní pikomolů, přičemž požadovanou informací je nejenom stanovení kvantitativní, ale také kvalitativní, což v případě těchto látek znamená nejenom určení primární struktury, sekvence, ale i struktury

107

sekundární, její konformace a funkce. Tím jsme vstoupili z období genomiky do období proteomiky jako hlavního cíle výzkumu příštích desetiletí. Základní náplní analytické chemie jako vědní disciplíny je vývoj nových metodik důkazů a stanovení. Řešení souvisí s širším pohledem na analytickou chemii zahrnutím poznatků řady nově vznikajících oborů pro potřeby analytické chemie tak, aby byla schopna odpovídat na jednotlivé potřeby současnosti. Zatímco prvková analýza a principy analýzy anorganických materiálů postačují současným nárokům (obvykle se řeší již jen metodika jednotlivých stanovení pro danou konkrétní aplikaci), největší tlak je v současnosti na analýzu organických látek a biologických materiálů.

4.2. OD RECEPTORU K SENZORŮM Senzorová analýza Výsledky studia mechanismu molekulárního rozpoznání aplikované do oboru analytické chemie se uplatňují především při vývoji senzorů, což je dnes „horký bod“ chemické analýzy. Selektor navržený na základě molekulárního modelování pro selektivní komplexaci analytu našeho zájmu dovoluje vývoj nových senzorových elementů. Spojení selektoru, který rozpoznává daný analyt, s fyzikálním převodníkem umožňuje převedení interakce na vhodný analytický signál; v principu jde tedy o konverzi chemické informace na fyzikální informaci. Existuje celá řada typů senzorů, v předkládané práci jde o nalezení vhodných selektorů pro biologicky významné aniontové analyty. Rozpoznání analytu na úrovni interakce molekul je cesta, kterou ve vydala současná analytická chemie. Z původní laboratorní vědecké kuriozity se vývoj senzorů stal předmětem širokého zájmu, a to jak na akademických tak firemních pracovištích. Je to důsledek ohromného potenciálu, který senzory a biosenzory nabízejí pro revoluční změny analytických postupů. Přednostmi jsou vysoká selektivita, měření bez speciálních reagencií, nízké náklady a snadná obsluha. Současné odhady uvádějí, že více než 90 % stanovení v klinické praxi bude založeno na využití senzorů, především selektivních elektrod, fluorescenčních senzorů a biosenzorů. Vedle uplatnění v klinické praxi jsou stále více využívány při kontrole výrobních procesů, především v potravinářském průmyslu (on line analýzy), a monitorování znečištění životního prostředí, především znečištění zdrojů pitné vody. V minulém desetiletí byl zájem soustředěn na stanovení biologicky významných nízkomolekulárních látek v klinické praxi, a to především elektrochemickými senzory – hlavně potenciometrickými a amperometrickými metodami. Nové směry jsou zaměřeny na použití bioafinitních systémů založených na vysoce specifických vazebných interakcích biomolekul, zejména protilátek s odpovídajícími antigeny a hapteny. Výzkum se také soustředí na miniaturizaci senzorů, přípravu a chemickou modifikaci povrchů matric a senzorů. Ale klíčovým prvkem stále zůstává nalezení vysoce selektivního receptoru (selektoru) pro sledovaný analyt. Senzorová analýza je založena na tvorbě komplexu receptoru s analytem, který je pomocí převodníku monitorován. Výsledkem tohoto procesu je analyticky užitečný signál. Toto uspořádání představuje obrovskou výhodu proti klasickým analytickým metodám, kde činidlo se stanovovaným analytem kvantitativně reaguje a výsledkem je tedy pouze jednorázová analýza. Základním přínosem senzorové analýzy je právě to, že senzorové uspořádání 108

umožňuje opakované (často v řádu desetitisíců až milionů opakovaných vzorků) stanovení sledovaného analytu. To umožňuje tvorba nekovalentního komplexu a analytem a možnost prosté regenerace receptoru. V senzorové analýze je úspěšnost metody často označována SSS, tedy stabilitou, sensitivitou a selektivitou vůči danému analytu. Proto je nutné pro každý nově vyvíjený receptor určit pro celou škálu analytů, které chceme potenciálním senzorem stanovovat, určit hodnotu konstant stability komplexů, pak můžeme z naměřených dat udělat závěr o selektivitě daného receptoru. Konstanty stability komplexu receptor-analyt V supramolekulární chemii, při studiu komplexů receptorů se substráty, je určení konstant stability zcela běžným úkolem. Jaké metody jsou k tomu používány, bude diskutováno v následující části. Obvykle vyžadujeme dostatečnou hodnotu konstanty stability komplexu, obvykle vyšší než 108, abychom dosáhli prakticky použitelného detekčního limitu a citlivosti. To ale není jediný požadavek. Pro stanovení také požadujeme, aby nedocházelo k rušení celou řadou analytů, které mohou být také přítomny. V senzorové analýze se samozřejmě chceme vyhnout často časově náročné a obtížně automatizovatelné separaci, proto pro prakticky použitelný receptor musí být hodnota konstanty stability komplexu o 3-4 řády vyšší než pro ostatní přítomné analyty. Obecně řečeno, tvorba komplexu mezi receptorem a substrátem (analytem) má základní význam v teorii senzorové analýzy pro určení vhodnosti receptoru pro daný analytický problém. Vazebná konstanta je použita jako kriterium pro vyhodnocení komplexačního procesu host-hostitel. Vazebné konstanty musí být určeny pro kvantitativní analýzu, samozřejmě při znalosti složení, stechiometrie komplexu. I přes nesporný význam určování vazebných konstant je obtížné najít literaturu, kde lze najít nejenom teoretické odvození a aproximace používané při jejich určení, ale i praktické pokyny k určení. Řešení tohoto problému vyžaduje zvolení vhodné metody. Komplexační jev může být charakterizován různými fyzikálními, především spektrálními a elektrochemickými metodami, mezi nejdůležitější patří NMR, UV-Vis, fluorescence, CD spektroskopie, hmotnostní spektrometrie, potenciometrie, polarografie a isotermální kalorimetrie (ITC). Dalším krokem při určení Kas je zpracování experimentálních dat, použité aproximace a regresní metody pro vlastní výpočet asociační konstanty. Pro návrh a syntézu nových receptorů je používán racionální design. V současné době vykazuje možnosti ušít na míru receptor dle sledovaného analytu s vysokou selektivitou. Přechod od receptoru k senzoru vyžaduje transdukční mechanismus, fyzikální převodník, který poskytuje informaci o vazebném ději, o tom, že cílový analyt byl rozpoznán a receptor s ním vytvořil přesně definovaný komplex. Tento děj pak umožní konverzi receptoru v senzor. Oblast molekulárního rozpoznání dosáhla úrovně, která dovoluje spolehlivě navrhnout a syntetizovat receptor pro sledovaný substrát (analyt) s dobrou až vysokou spolehlivostí (selektivitou) pro komplexaci (rozpoznání) malých a středně velkých molekul. Vhodný transdukční mechanismus (hmotnostní, termický, optický, elektrochemický) pak dovoluje následnou konstrukci chemického senzoru. Cílem základního i aplikovaného výzkumu bylo porozumět vazebným mechanismům a vytvořit systém, kdy receptor má tvar zámku, do kterého jako klíč zapadne sledovaný 109

analyt. Toto poučení z přírody vedlo k přípravě a aplikaci celé řady elegantních receptorů, např. kryptandů (komplexace iontů), cyklofánů (komplexace aromátů), receptorů na bázi boronových kyselin pro sacharidy a guanidinových receptorů pro anionty. Sice ještě stále nedosahují selektivity pozorované v přírodě při tvorbě enzym-substrát, antigen-protilátka, ale mohou být ušity na jakýkoliv zvolený analyt. Návrh takového receptoru pak zahrnuje identifikaci vhodných rozpoznávacích a vazebných míst, které musí obsahovat receptor aby umožňoval selektivní komplexaci zvoleného analytu. Takovými receptorovými systémy mohou být zkoumány síly molekulárního rozpoznání, zahrnující efekt rozpouštědla, vodíkové vazby a párování iontů. I přes pokrok racionálního návrhu a molekulárního modelování je konečnou fází testování forma trial and error pro dosažení optimálního rozpoznání sledovaného analytu navrženým receptorem. Nezbytnou podmínkou pro automatizované řízení je dostupnost informací o řízeném systému. Informace, respektive veličina, fyzikální či chemické povahy je pomocí vhodného senzoru převedena na veličinu, která je zpracovatelná (typ signálu je daný typem použitého převodníku) a se kterou je schopen pracovat rozhodovací člen automatu. Především na vlastnostech samotného senzoru záleží, jak kvalitní informace budou a jak kvalitní pak bude i vlastní řízení. Senzor jako kompozitní zařízení Vlastní senzor se skládá z několika částí (obr. 1).

Přítomnost analytu (detegované látky) generuje chemickou změnu v aktivní vrstvě senzoru. Aby však mohl senzor úspěšně pracovat, je nezbytnou podmínkou, aby se tato chemická změna odrazila i ve fyzikálních vlastnostech aktivní vrstvy. Typické jsou například změny barvy, změny náboje či vodivosti. Na tuto změnu fyzikálních vlastností pak reaguje fyzikální převodník signálu, jehož výstupem je informace zpravidla v elektrické formě. Jak již bylo řečeno, molekulární rozpoznání je jedním ze základních kamenů supramolekulární chemie. Pro daný substrát (neutrální molekulu, kation, anion) supramolekulární přístup spočívá v návrhu odpovídajícího receptoru, který má strukturní a chemické (vazebné) rysy, charakteristiky pro rozeznání požadovaného substrátu. Na základě řady nevazebných interakcí lze při současných metodikách syntetické chemie připravit téměř jakýkoli receptor. Ovšem v praktickém smyslu i ten nejlépe propracovaný systém z hlediska komplexace substrátu je neužitečný, pokud neexistuje operátor (transducer), který by informoval o tom, že došlo ke vzniku komplexu receptor-substrát. Tak můžeme ilustrovat rozdíl mezi ligandem/re-

110

ceptorem na jedné straně a senzorem na druhé straně. K přeměně receptoru na senzor je nutné připojit signální skupinu, která kvantitativně monitoruje interakci receptor-substrát. A právě takové spojení specifického receptoru a podjednotky schopné signalizovat interakci receptorsubstrát vytváří senzor. Efektivita senzoru pak závisí na selektivitě vazby pro daný substrát a snadnosti detekce a měření signálu (chemické informace) monitorujícího tuto vazbu (aktivní a kontrolní jednotka spojená spojkou). Nomenklatura chemických senzorů Výše zmíněná chemická informace může pocházet z chemické reakce analytu nebo z fyzikálních vlastností zkoumaného systému. Chemický senzor se skládá ze dvou funkčních jednotek: receptorové a převodníkové (transdukční) části. V receptorové časti senzoru je chemická informace transformována do energie, která je měřena fyzikálním převodníkem (transducerem). Ten převádí energii do analyticky užitečného signálu. Transducer jako takový nevykazuje selektivitu, ta je dána receptorem. Receptorová část senzoru může být založena na různých principech, a to fyzikální, neprobíhající při interakci chemické reakce, chemické, kdy chemická reakce s účastí analytu dává vznik analytickému signálu, a biochemické, kde biochemický proces je zdrojem analytického signálu (biosenzory). Chemické senzory mohou být klasifikovány podle operačního principu transduceru jako elektrochemické, optické, termální a hmotnostní. Elektrochemické senzory transformují efekt elektrochemické interakce mezi analytem a elektrodou na užitečný signál. Jedním z nejvýznamnějších analytických nástrojů současnosti se stávají fluorescenční senzory vzhledem k tomu, že jsou schopny analyzovat koncentrace analytu v submikromolárních koncentracích. Fluorescenční jednotka (fluorofor) je obvykle připojena kovalentní vazbou k rozpoznávací receptorové části. V porfyrinových a safyrinových systémech má makrocyklus dvojí roli, poskytuje vazbu analytu a současně reprezentuje inherentní fluorescenční jednotku. Vazba substrátu bývá obvykle založena na zhášení fluorescence vazbou substrátu, nebo naopak výrazným zvýšením fluorescence, jak bylo zjištěno při monitorování vazby nukleotidů ve vodném prostředí na safyrinové receptory díky jejich deagregaci. Současný trend v designu senzorů Velký zájem o rozpoznání aniontů začal kolem roku 1990, kdy si nová oblast supramolekulární chemie kladla za cíl nalezení receptorů anion-selektivních potenciometrických senzorů. Vývoj supramolekulární chemie v mnoha směrech změnil strategii řešení problémů jak v technologii tak především v analytické chemii. Téměř od začátku tohoto oboru supramolekulární chemie byly nové vlastnosti makrocyklických polyetherů spojovány s možným využitím v analytické chemii a s technologickou aplikací. Byly popsány extrakční studie a vývoj ISE spolu s vývojem nových specifických syntetických ligandů. Odhalení jejich potenciální užitečnosti v analytické chemii se táhne jako zlatá niť supramolekulární chemií. Základní aspekt sledované chemické interakce je rozpoznání cílové molekuly pomocí receptoru, a to jak přírodního, tak syntetického. Tento jev může být použit pro vývoj senzoru. Proces rozpoznání substrátu musí být spojen s amplifikací nejčastěji elektrického signálu, který je výsledkem přítomnosti chemické látky, která má být monitorována. Obecně proces sestává ze dvou stupňů: rozpoznání a zesílení. Ve většině případů je rozpoznání zajištěno chemickou interakcí, zatímco zesílení je dosaženo fyzikálním prostředkem. Návrh senzorů je nejdůležitější částí ve vývoji selektivního rozpoznání. Ačkoliv senzor 111

může být založen na různých mechanismech, funkce a kvalita senzoru závisí na tom, jak dobře umí rozeznat analyt (svou receptorovou částí), pro který byl navržen, vzhledem k ostatním látkám přítomným v mediu. Chemický senzor je tedy dle definice IUPAC nástroj, který dovoluje transformovat chemickou informaci (např. o koncentraci či přítomnosti specifického substrátu ve směsi) na analyticky užitečný signál. Dvě hlavní oblasti při návrhu senzorových elementů jsou selektivita a způsob, jak ji postihnout, monitorovat. Centrální otázka selektivity je řešena na úrovni návrhu, syntézy a testování nových selektivních ligandů pro daný substrát, kde nejlepší kandidáti mají šanci se proměnit v komerční senzory různých typů. Selektivita je proměněna na pozorovatelný jev pomocí fyzikálního převodníku, který může být různého typu. Transdukční metoda může být elektrochemická (potenciometrická – neutrální nosič/přenašeč pro kationty a anionty; amperometrická – neutrální nosič/přenašeč s redoxním charakterem; UV-Vis a fluorescenční pro barevný nosič/přenašeč a fluorescenční substráty). Dosud používané elektrochemické prostředky transdukce jsou převážně potenciometrické. Existují také ionofory poskytující transdukci pro amperometrickou detekci. Moderní trendy v této oblasti vedou k miniaturizaci elektrod pro komerční využití. Potenciometrické mikroelektrody jsou velice populární ve fyziologii, biochemii a bioanalytické chemii. Pro mnoho výše zmíněných aplikací musí být ligand rozpuštěn v polymerní membráně s použitím plastifikátorů, které samy také mají vliv na selektivitu a musí být pro každý speciální případ detekce optimalizovány. Požadavkům na selektivitu pro daný ligand není vždy plně porozuměno, ale vztahují se k relativní rovnováze mezi ligandem a dvěma konkurujícími substráty. Pozice rovnováhy je určena rychlostmi tvorby a disociace komplexu. U mnoha případů je tvorba komplexů velice rychlá a to, co rozhoduje, je rychlost disociace. Jestliže rychlost tvorby komplexu je nízká, pak takový ligand není vhodný ani jako přenašeč ani jako receptor pro vývoj senzoru. Úžasná citlivost očí na barvy činí senzory založené na detekci analytu určované na základě barevné změny velice atraktivní. Kolorimetrické senzory byly vyvinuty pro řadu kovových kationtů od Li+ k Pb2+. V současné době zavedení chromogenní funkce k selektivnímu karieru nečiní problém. Tak se staly design a syntéza chromoionoforů velice populární. Alternativně lipofilní anionty s vhodnou barvou jsou použity k extrakci kationtů do membrány. Ty jsou pak analyzovány jako barevné iontové páry. Klinické požadavky jsou hnací silou pro vývoj v oblasti senzorů, např. dnes dovolují stanovení lithia, sodíku, draslíku, vápníku, chloridů, uhličitanů, fosfátů a ostatních iontů v tělních tekutinách. Analýzy vody a znečištění životního prostředí (těžké kovy, nitráty) jsou také dnes už často řešeny pomocí specifických senzorů. Renesance koordinační chemie alkalických kovů v šedesátých letech měla jako jeden z hlavních motorů biologický ionofor valinomycin a syntetický ionofor dibenzo-18-crown-6. Chemické senzory založené na těchto a podobných ionoforech byly tím, co nastartovalo bouřlivý rozvoj celé této oblasti. První selektivní elektrody draselných iontů pro klinické využití byly navrženy Simonem a spolupracovníky. Vedle aplikačních záležitostí se v celé oblasti rozvíjelo studium mechanismu syntetických ionoforů pro iontově-selektivní elektrody (ISE), které ve svém důsledku umožnilo porozumění dějů vedoucích k vysoké selektivitě a navržení nových ligandů pro chemické senzory. Jednou z nejužitečnějších aplikací jsou ISE, kde je specifická odpověď k jednomu iontu v přítomnosti ostatních. Selektivitu neovlivňuje pouze typ ligandu, ale také složení membrány dané typem polymeru, plastifikátorem a solí (lipofilní protiion). Tato směs je často nazývána koktejl a činí

112

přesné srovnání výsledku z různých laboratoří obtížné. Dostatečná lipofilita a schopnost selektivně rozpoznávat daný ion je základním požadavkem na ligand pro přípravu odpovídajícího senzoru. Selektivita karieru (nosiče/přenašeče) může být alternována, je-li inkorporován do membrány – všechny faktory, jako druh polymeru, plastifikátor a protiion, jsou podstatné. Operační mechanismus ISE byl studován řadou fyzikálně chemických metod, které sledují relativní kinetiku interakce karieru a sledovaných iontů a interferujících iontů. Dále se sleduje dielektrické prostředí membránové fáze, měření impedance a kvalita membránového povrchu na rozhranní s vodnou fází. Pozoruje se také relativní disociační rychlost komplexů ligandů se sledovanými ionty. Důležitost kinetiky v elektrochemických teoriích popisujících ISE je dnes všeobecně přijímána a ovlivňuje časovou konstantu (response time) ve vztahu k tloušťce a propustnosti membrány. Výsledky ukazují, že sledovaný ion (analyt) proniká pouze na povrch membrány. Elektrický efekt není způsoben přenosem iontu analytu na druhou stranu membrány, karier nepracuje v modu ekvivalentu k analytu, jak je tomu v membránových transportních systémech. Závěr o selektivitě, založený na studiu výměny radioaktivních stopových iontů, je v souhlasu s představou, že to, co určuje selektivitu, je reverzní děj, kdy disociační rychlost komplexu ion-karier je rozhodující; membrána vykazuje selektivitu pro ion, který je nejpomaleji uvolňován z komplexu v membráně. Aniontové senzory Velký zájem o rozpoznání aniontů vzhledem k jejich významu jak biologickému, tak z hlediska monitorování znečištění životního prostředí vedl k hledání selektivních senzorů pro stanovení aniontů. Jedním z nejdůležitějších je vývoj anion-selektivních potenciometrických senzorů. Vytvořit receptor pro anionty je komplikovanější úkol než je tomu v případě kationtů, protože anionty mají vesměs složitější tvar, vykazují pH závislost a mají vysokou solvatační energii. Anionty mohou mít tvar koule, např. chloridy či bromidy, mohou být lineární (thiokyanáty, kyanidy, azidy, hydroxidy, …), planární (uhličitany, dusičnany, …), tetraedrické (fosforečnany, sírany, vanadičnany, molybdenany, manganistany, …), případně mít tvar oktaedru (hexakyanoželeznatany, hexakyanokobaltitany, …). Další významnou komplikací je závislost na pH. V případě, že se nejedná o anionty silných kyselin (dusičnany, sírany, chloridy a chloristany), uplatňují se disociační rovnováhy, kdy při bazických pH je přítomen pouze aniont, ale s postupným okyselováním roztoků začnou volné anionty přecházet na nedisociovanou formu kyselin, která má z hlediska tvaru a rozpoznání zcela odlišné vlastnosti. Proto je třeba udržovat vhodné pH, což není vždy jednoduché. Třetí komplikací je vysoká solvatační energie aniontů. Anionty se ve vodných roztocích nevyskytují samostatně, ale jsou obklopeny tzv. primární hydratační sférou, která se v roztoku pohybuje s nimi. Těchto několik molekul vody je z aniontu obtížně odstranitelných. Všechny anionty lze seřadit do Hoffmeisterovy série podle jejich lipofilicity, tj. podle toho, jak ochotně přecházejí z vodné fáze do organické fáze. Protože většina senzorů je založena na organické vrstvičce, téměř všechny senzory vykazují selektivitu pro lipofilní část Hofmeisterovy řady, a naopak při stanovení hydrofilních aniontů je třeba vysoce selektivních receptorů. Klasické aniontově selektivní elektrody jsou založeny na využití kvarterních amoniových solí jako nabitých ionoforů, kde je selektivita kontrolována právě relativní lipofilicitou aniontů, Hoffmeisterovou serií zmíněnou nahoře, která sleduje obecnou sekvenci: perchlorát > thiokyanát > iodid > nitrát > bromid > chlorid > bikarbonát > fluorid. 113

Cílem v této oblasti je vyvinout elektrody s odlišným trendem, pořadím selektivity, který je dán specifickou interakcí mezi sledovaným aniontem a ligandem. Vazebná energie komplexu, který je vytvořen asociací aniontu a receptoru, redukuje přenosovou energii, která je potřeba k extrakci aniontu z vodné fáze do membrány. V kontrastu k velkému množství ionoforů, které jsou známy pro selektivní komplexaci aniontů, existuje pouze malé množství ionoforů, které jsou vhodné pro konstrukci anion-selektivních membránových elektrod. Ty lze rozdělit do několika typů podle interakce na které jsou založeny: elektrostatické interakce, klasická aniontová výměna; ligandy jsou dusíkaté makrocykly s protonovaným nebo kvarterním dusíkovým atomem a guanidinové deriváty. Dalším vazebným modem je výměna ligandu, např. u metaloporfyrinových komplexů, kde bylo dosaženo zcela odlišné selektivity než jaká je dána Hoffmeisterovou serií (např. pro dusitanové ionty). Další interakce spočívá v koextrakci aniontu a kationtu receptorem (dosud ale nebyla popsána analytická aplikace), dále ve vytváření kovalentní vazby mezi receptorem a substrátem, např. trifluoracetofenony jako neutrální kariery pro tvorbu kovalentní vazby s uhličitany, a dále i receptory typu Lewisovské kyseliny (boronové sloučeniny, rtuťnaté, organické sloučeniny cínu a rtuti) pro interakci se substráty typu Lewisovských bazí. Vitamín B12 je znám svými koordinačními schopnostmi pro anionty. Několik hydrofobních derivátů vitamínu B12 bylo použito pro vývoj iontově selektivních elektrod. Objev vazby aniontů v porfyrinu se podobajících makrocyklech a metaloporfyrinech vedl k vývoji dusitanových selektivních elektrod a salicylát-selektivních elektrod. Bylo pozorováno, že povaha plastifikátoru ovlivňuje selektivitu elektrody, často mechanismem, který je založen na stacking interakci plastifikátoru a substrátu; toto bylo pozorováno u benzoátů. Protonované lipofilní makrocyklické polyaminy byly použity pro vývoj potenciometrických senzorů pro nukleotidy AMP, ADP a ATP ve formě jejich aniontů, resp. polyaniontů. V nedávné době bylo popsáno použití expandovaných porfyrinů pro rozpoznání aniontů. Tento nový přístup ke komplexaci aniontů pomocí nových pyrrolových makrocyklů dovoluje podle velikosti cyklu a jeho náboje selektivní komplexaci různých aniontů. Tyto látky jsou v současné době testovány jako receptory pro vývoj aniontově selektivních elektrod s důrazem na fosfáty a nukleotidy. Další zvýšení selektivity bylo dosaženo zavedením nukleobáze (C, G) na periferii makrocyklu – tyto ligandy rozpoznávají současně jak anion (fosfát), tak komplementární nukleobázi příslušného nukleotidu. Předběžné výsledky ukazují na reálnou možnost jejich využití jako senzorových elementů. Senzory organických molekul Vývoj senzorů pro organické ionty a neutrální molekuly je stimulován převážně farmaceutickým výzkumem a klinickou bioanalytickou chemií. Neutrální ligandy typu makrocyklických etherů byly použity pro vývoj senzorů pro biologicky významné kationty (guanidinium, adenosinium, amfetaminium, amoniové ionty). Lipofilní cyklodextriny byly použity pro selektivní vazbu a detekci oniových iontů a ukázaly selektivitu pro kvartérní amoniové ionty před kationty kovů. Významnou vlastností lipofilních cyklodextrinů je jejich schopnost chirálního rozpoznání, čehož bylo využito pro monitorování aryl-substituovaných aminoalkoholů, kde mechanismus dělení je založen na inkluzi aromatické části molekuly. Na tomto principu byly založeny ISE pro měření enantiomerní čistoty efedrinu v přítomnosti ostatních kationtů. Senzory neutrálních organických molekul detegovaných prostřednictvím jejich protonovaných forem byly popsány v literatuře. Tento princip byl použit pro ISE na bázi substituovaných kalixarenů pro selektivní detekci primárních, sekundárních a terciárních aminů založené na tvaru molekuly.

114

Organizované monomolekulární vrstvy a dvojvrstvy představují jedinečné prostředí pro studium molekulárního rozpoznání. Takovéto systémy jistě budou v budoucnu důležité pro vývoj molekulárních senzorů. Pionýrská práce Kunitakeho ukázala, že molekulární rozpoznání je založeno na vzniku vodíkových vazeb na monovrstvě vystavené vodné fázi. Jeli monovrstva tvořena selektivním ligandem, tak jako v případě resorcinolových cyklotetramerů, může být využita pro přípravu modifikovaných elektrod pro monosacharidy. Pro zvýšení selektivity pro anionty či neutrální molekuly je možné kombinovat vazbu kationtů, která modifikuje konformaci ligandu a vytváří selektivní velikost a tvar pro vazbu sledovaného analytu. Takováto heterotropní kooperativita (alosterická regulace) je velmi vhodnou a slibnou metodikou pro konstrukci senzorových systémů. Důležitým cílem v analytické chemii v následujícím desetiletí bude vývoj molekulárních systémů obsahujících receptorové molekuly, které budou schopny převádět chemickou interakci na molekulární úrovni na fyzikální kvanta na makroskopické úrovni. Pro takové systémy byl Lehnem navržen název molekulární elektronika, která spočívá na vytvoření molekulárního systému skladbou vhodně navržených molekul, který je pak schopen předávat a shromažďovat informace přes chemickou interakci, fyzikální převod bude zajištěn elektronickými nebo optickými signály. Alternativní přístup navržený Reinhoudtem je založen na integraci syntetického receptoru s čipem pomocí litografické techniky. Chemický senzor je zařízení poskytující odezvu při interakci s konkrétním analytem. Tato interakce musí být selektivní a reversibilní a takovýto senzor se pak uplatní pro kvantitativní a kvalitativní analýzu. Vlastní senzor je kompozitní zařízení, které se skládá z několika částí (obr. 4.2). Přítomnost analytu (detegované látky) generuje chemickou změnu v aktivní vrstvě senzoru. Aby však mohl senzor úspěšně pracovat, je nezbytnou podmínkou, aby se tato chemická změna odrazila i ve fyzikálních vlastnostech aktivní vrstvy. Na tuto změnu fyzikálních vlastností pak reaguje fyzikální převodník signálu (v anglické literatuře transducer), jehož výstupem je informace zpravidla v elektrické formě. Tu už není obtížné dále převést na napětí a dále na číslicová data, jak je naznačeno na obrázku 4.2. Aktivní vrstva senzoru

Fyzikální převodník signálu

Zesilovač

A/D převodník

Číslicové zpracování signálu

Obrázek 4.2: Schéma chemického senzoru Typickými fyzikálními převodníky signálu jsou: elektrochemické převodníky zahrnující iontově-selektivní elektrody (ISE), iontově-selektivní a chemicky citlivé polem řízené tranzistory (ISFET a ChemFET), plynové sensory s pevným elektrolytem a polovodičové plynové senzory. Selektivita Jako u každého měřícího zařízení, i u senzorů je třeba definovat parametry ovlivňující kvalitu získaného signálu. Mezi nejvýznamnější kritéria patří selektivita. Ta určuje míru s jakou je signál citlivý právě na určitý analyt, a to relativně vzhledem k ostatním analytům či interferentům (neměřeným složkám ovlivňujícím signál) obsaženým v matrici analyzovaného systému. Vzhledem k velmi odlišným vlastnostem chemických snímačů různých typů je selektivita kvantifikována různě. 115

Mějme lineární měřící systém odpovídající soustavě lineárních nezávislých kalibračních rovnic: y1 = S11c1 + S12c2 + K + S1n cn y 2 = S21c1 + S22c2 + K + S2n cn M

(0.0.1),

y m = Sm1c1 + Sm 2c2 + K + Smn cn

kde počet měření je m (tj. měření senzorovým polem o m senzorech či na m kanálech přístroje), počet všech měřitelných složek (analytů plus interferentů) je n a platí m ≥ n. Signály jsou označeny yj (pro j-tý kanál), měřené koncentrace ci a kalibrační koeficienty (vlastně selektivní citlivosti pro j-té měření a i-tou složku zjistitelné kalibrací) Sji. Pokud je m > n a matice soustavy (1) je alespoň řádu n, pak lze provést regresní vyrovnání na čtvercovou soustavu transformací matice soustavy Sm×n na Kn×n podle maticového vztahu ST y = ST Sc = Kc

(0.0.2)

Zde STy = Kc je tedy soustava n rovnic o n neznámých, která vznikla vyrovnáním nepřímého měření podle systému (1), a to, jak je možné dokázat statistickou analýzou (při normálním rozdělení chyb), na základě metody nejmenších čtverců. U tohoto systému seřadíme jednotlivé řádky (měření) tak, aby j-té měření bylo nejcitlivější na j-tou složku, tj. koeficient kjj byl v absolutní hodnotě největší ze všech |kji| (na diagonále budou absolutně největší prvky). Pak je selektivita definována pro každou j-tou měřitelnou složku jako

ηj =

k jj

∑

i≠ j

k ji

(0.0.3)

Vidíme, že u dokonale selektivního měření, jehož selektivita ηj bude limitovat k nekonečnu, jsou všechny kalibrační koeficienty ostatních složek nulové, takže koncentraci měřené složky bude možné spočítat pouze na základě tohoto jediného měření. U nedokonale selektivních systémů je třeba řešit celou soustavu STy = Kc a zde přistupují samozřejmě další ukazatelé kvality měření vzhledem k řešitelnosti a chybám, jako např. velikost determinantu soustavy. Dále se používají kritéria srovnávající pouze 2 složky, z nichž jedna je měřeným analytem a druhá nežádoucím interferentem. Tzv. koeficient selektivity udává, kolikrát nižší poskytne senzor signál při měření interferentu než při měření sledovaného analytu, přičemž jak interferent tak analyt mají stejnou koncentraci. Tento ukazatel tedy charakterizuje jednotlivé interferenty vzhledem k nominálně určenému jedinému analytu, pro nějž byl daný senzor vytvořen. Pro stanovení koeficientů selektivity u iontově selektivních elektrod, které mají logaritmickou odezvu na koncentraci analytu (viz dále), však mezinárodní normy a doporučení stanovují jinou definici koeficientu selektivity a několik různých metod jeho měření, které zpravidla závisejí i na dalších experimentálních podmínkách. Proto je někdy vhodné selektivitu elektrod ověřit experimentálně a vždy publikovat použitou metodu. Deklaruje se zde koeficient selektivity ki,j definovaný v Nicolskii-Eisenmanově rovnici: E = K + S log(ai + k i , j a nj / z ) (0.0.4),

kde E je potenciál indikační elektrody senzoru, ai je aktivita primárního analytu (určeného k měření) o nábojovém číslu n, a aj aktivita interferentu s nábojovým číslem z, K a S jsou 116

konstanty Nernstovy rovnice (viz dále) stanovené většinou kalibrací [Aktivita iontu je poměrová termodynamická veličina zohledňující energetický stav všech iontů v dm3 roztoku a pro dostatečně zředěné roztoky (ca < 10-3 mol.dm-3) se číselně (nikoliv rozměrem) přibližně rovná molární koncentraci (v mol.dm-3).]. Zde je na místě upozornit na problémy všech potenciometrických měření, které do analytického výsledku zavádějí přesně nespočítatelné, ale přibližně odhadnutelné chyby. Ty jsou způsobeny tím, že elektrody reagují na aktivity, nikoliv koncentrace, a navíc samotné potenciály elektrod jsou přímo nezměřitelné a při jejich vyhodnocení z napětí galvanických článků se používají teoretické předpoklady, které vedou k jejich odhadům. Z těchto důvodů nelze při vyhodnocování potenciometrické odezvy spoléhat jen na teoretické vztahy, ale je třeba tento měřicí systém důsledně kalibrovat. Koeficient selektivity vlastně zhodnocuje vliv interferentu j na měření analytu i, pro který je elektroda nominálně určena. Je zřejmé, že by měla být jeho hodnota co nejmenší – za přijatelnou se považuje nanejvýše 10–3, ale záleží také na aktivitě přítomného interferentu (člen ki,j ajn/z je zde z hlediska měření chybový – je-li nulový, rovnice (0.0.4) přechází v jednodušší tvar Nernstovy rovnice). Citlivost, koncentrační rozsah Jednou z dalších základních charakteristik senzorů je citlivost, která bývá udávána jako změna výstupního signálu na jednotkovou změnu koncentrace. Senzory s lineární odezvou mají citlivost konstantní pro koncentrace spadající do tzv. oblasti linearity, u nelineárních odezev se citlivost určuje jako reciproká derivace kalibrační křivky. Dále bývá u chemických snímačů uváděn použitelný koncentrační rozsah, který je někdy definován oblastí linearity (vyhodnocovaným na základě statistiky); nicméně v praxi nemusí být odezva striktně lineární, stačí je-li monotónní a dostatečně strmá. Pak je definována tabulkou nebo nelineární funkcí – empiricky získaným polynomem nebo empiricky stanovenými parametry teoretické závislosti (např. Nernstovy rovnice, viz dále). Limitní statistické parametry Dalším parametrem posuzovaným u senzorů i kompletních analytických systémů je statistický limitní parametr označovaný jako mez detekce, detekční limit. Tato veličina udává nejmenší možnou koncentraci analytu, která je ve vzorku detekovatelná danou metodou s určitou maximální velikostí statistické chyby 1. druhu α. Norma IUPAC definuje detekční limit jako trojnásobek směrodatné odchylky signálu, který je získán opakovaným měřením slepého vzorku (vzorku o nulové koncentraci analytu), dělený citlivostí (přepočet na koncentrační jednotky). Uzanční koeficient 3 však vede k hodnotě α = 0,0013 (předpoklad normálního rozdělení pravděpodobnosti) a tím k pravděpodobnosti 99,87 %, což je při statistických testech nezvykle vysoká hodnota (obvykle je to 95 %, maximálně 99 %). Tato definice má některé nevýhody (nedostupnost slepého vzorku, nelinearita odezvy, interference). V praxi je proto ke stanovení hodnoty limitu někdy používána extrapolace kalibračního grafu při koncentracích řádově srovnatelných s mezí detekce na nulový signál. Směrodatná odchylka se pak vypočítá pomocí lineární regrese jako výběrová směrodatná odchylka úseku regresní kalibrační přímky na ose signálu (tj. pro nulovou koncentraci). Citlivost je zde dána směrnicí regresní kalibrační přímky. Vyjádření limitu detekce v koncentračních jednotkách je obvyklejší u kompletního analytického systému než u samotného senzoru. Zde je často vhodnější jiná veličina, a tou je odhad směrodatné odchylky či střední kvadratická integrální hodnota (rms) šumu signálu získaného při měření prázdného roztoku. Z této hodnoty se vynásobením třemi získá tzv. 117

instrumentální detekční limit v signálových jednotkách, který je nezávislý na citlivosti měření. Pro kontrolu čistoty životního prostředí, potravin, léků apod. má podstatný význam jiný limitní parametr, tzv. limit záruky čistoty (Limit of Guarantee of Purity). Ten je odvozen od limitu detekce, ale závisí též na statistické chybě druhého druhu β, která se opět, v souladu s limitem detekce, stanoví nanejvýše na 0,0013. Limit záruky čistoty je dvojnásobkem detekčního limitu (o 3 směrodatné odchylky vyšší) a určuje minimální koncentraci, kterou můžeme danou metodou (měřením určitým senzorem) s velkou pravděpodobností (99,87 % a vyšší) vyloučit. Bude to právě tehdy, když látka nebude detekována, tj. naměříme-li koncentraci menší než limit detekce. Naměříme-li vyšší koncentraci, lze přítomnost analytu vyloučit s touto pravděpodobností v koncentraci opět o 3 směrodatné odchylky vyšší. Dalším limitním parametrem je limit stanovitelnosti senzoru. Limit stanovitelnosti je nejmenší koncentrace analytu, kterou lze kvantitativně změřit s relativní směrodatnou odchylkou (koeficientem variace) rovnou alespoň 10 % měřené hodnoty. Je-li naměřena koncentrace mezi limitem stanovitelnosti a detekčním limitem, je analyt přítomen s pravděpodobností nejméně 99,87 %, ale nelze určit s výše stanovenou přesností jeho koncentraci. U potenciometrických senzorů (např. iontově selektivních elektrod) se výše uvedené definice nedají dost dobře aplikovat. Potenciometrická odezva je lineární s logaritmem koncentrace a tzv. praktický detekční limit se stanoví jako koncentrační parametr průsečíku extrapolované lineární části signálu s nenulovou směrnicí (nenulová odezva senzoru) a lineární části s nulovou směrnicí (kdy senzor na daný analyt nereaguje). V odborné literatuře existují polemiky o správnosti různých přístupů. Proto se doporučuje vždy uvádět způsob, jakým byl daný praktický detekční limit získán. Dynamické vlastnosti, stabilita Dynamické vlastnosti senzorů charakterizuje nejčastěji časová konstanta přechodové charakteristiky, tj. jsou hodnoceny v běžném významu zavedeném obecně v měřící technice. Dlouhodobá časová, resp. teplotní stabilita je popisována poklesem citlivosti, případně změnou ofsetu, která se udává v % za jednotku času, resp. na stupeň Kelvina. S tím souvisí i maximální časový interval přípustný mezi dvěmi rekalibracemi; tento interval zpravidla určuje výrobce. Design aktivní vrstvy senzoru Jak již bylo uvedeno výše, informace o chemických vlastnostech analyzovaného média vzniká v aktivní vrstvě, která obsahuje vlastní receptor (nebo také ionofor), tedy molekulu, které interaguje s molekulou detekované látky. Receptor je zpravidla velká molekula, která obsahuje místo (kavitu), do kterého svým tvarem přesně zapadne molekula analytu, molekuly ostatních látek do kavity nezapadnou zdaleka tak přesně a ke komplexaci dochází v mnohem menší míře. Tento rozpoznávací princip je nazýván „zámek a klíč“. V anglosaské literatuře je nazýván „host-guest recognition“, tedy rozpoznávání hostitel-host, a je v centru zájmu odvětví zvaného supramolekulární chemie. Při vlastním rozpoznávání nedochází k vytvoření klasické kovalentní vazby, nýbrž je dílem t.zv. mezimolekulárních interakcí. Mezi receptorem a analytem může nastat několik typů interakcí, jejich účinek se sčítá a může být dokonce významnější než by tomu bylo v případě běžné vazby. Pro úspěšnou komplexaci je nutná komplementarita jednak co do smyslu velikosti kavity receptoru a analytu a jednak co do prostorového umístění jednotlivých interagujících vazebných center. 118

Nejsilnějšími mezimolekulárními interakcemi jsou elektrostatické síly, které se uplatňují při interakci dvou nabitých částic (Coulombické interakce), případně částic vykazujících permanentní dipólmoment či kvadrupólmoment (látky s nesymetrickým rozložením elektronové hustoty). Je zřejmé, že přitažlivá síla se projeví mezi opačně nabitými póly. Toho lze s výhodou využít při návrhu molekuly receptoru pro kationty či anionty, nicméně tato interakce nemůže být jediná, neboť, na rozdíl od dalších, není směrová. Dalším druhem možných interakcí jsou lipofilní interakce. Ty jsou založeny na známém pravidle, že podobné se rozpouští v podobném, tedy látky polární v polárních rozpouštědlech a látky nepolární v rozpouštědlech nepolárních. Obsahuje-li molekula receptoru nějakou výrazně nepolární část, bude tato vytvářet interakci s nepolární částí detegované molekuly. Tento komplexační mód se tímto způsobem uplatní pouze v polárním prostředí. V opačném případě by došlo k soutěži mezi nepolárními molekulami rozpouštědla a analytu a interakce by byla výrazně oslabena. Třetím druhem nekovalentních interakcí, významných pro molekulární rozpoznávání, jsou vodíkové vazby. Navzdory názvu se nejedná o opravdovou chemickou vazbu, nýbrž o slabou donor-akceptorovou interakci. Ta, jak už z názvu vyplývá, nastává mezi vodíkem, který má prázdný elektronový orbital a chová se jako příjemce (akceptor) elektronů, a jejich donorem, většinou kyslíkem, který má naopak dva volné elektronové páry a tendenci elektrony nabízet. Samozřejmě donor-akceptorová interakce může nastat i mezi jinou dvojicí donor-akceptor, ale interakce vodík-kyslík je v přírodě nejčastější a je mj. odpovědná za některé vlastnosti vody. 4.3. HMOTNOSTNÍ, TEPLOTNÍ, VODIVOSTNÍ, ELEKTROCHEMICKÉ A OPTICKÉ SENZORY V předchozí části jsme definovali požadavky na senzor a nastínili možnosti designu molekuly receptoru pro různé kategorie analytů. Avšak samotná molekula receptoru schopná komplexovat analyt je nepoužitelná bez vhodného fyzikálního převodníku, který transformuje chemickou změnu na měřitelnou, zpravidla elektrickou veličinu. O principu některých druhů těchto převodníků a jejich vlastnostech bude pojednáno zde. V praxi se používá několik různých typů fyzikálních převodníků, které lze rozčlenit mnoha způsoby. Prvé rozdělení je na základě nosiče informace na elektrické, které poskytují elektrický výstupní signál, a na neelektrické, např. mechanické senzory. Elektrické senzory z mnoha praktických důvodů dominují a lze je dále z praktické hlediska rozdělit na i) elektronické, ii) polovodičové a iii) mikroelektronické. Jiný způsob klasifikace fyzikálních převodníků je podle druhu snímané veličiny na snímače i) mechanické (poloha, otáčky,…), ii) tepelné (teplota, tepelný tok,…), iii) elektrické (proud, napětí, výkon,…), iv) magnetické (magnetická indukce, intenzita pole,…), v) radiační (intenzita záření ve viditelné oblasti, UV, infračervené, α, β, γ, RTG,…) a konečně vi) chemické senzory. Třetí možností klasifikace je dělení na aktivní snímače, které jsou zdrojem energie, a na pasivní snímače, které samy o sobě zdrojem energie nejsou. Čtvrtým způsobem dělení je rozdělení podle způsobu interakce s měřeným prostředím na snímače dotykové a bezdotykové. Jako u každého zařízení vyvstává potřeba popsat parametry jednotlivých senzorů. Prvním kritériem hodnocení chemických senzorů je jejich selektivita. Koeficient selektivity udává kolikrát poskytne senzor nižší signál při měření interferentu než při měření sledovaného analytu, přičemž jak interferent tak analyt jsou o stejné koncentraci. Pro stanovení tzv. koeficientů selektivity u iontově selektivních elektrod lze v odborné literatuře

119

nalézt mnoho různých metod, které jsou mnohdy ovlivňovány vnějšími podmínkami. Proto je vždy vhodné selektivitu experimentálně ověřit při těchto konkrétních podmínkách. Pro praktická měření by koeficient selektivity měl být alespoň 0,001, mnohdy se však musíme spokojit se selektivitou podstatně nižší. Dalším parametrem posuzovaným u senzoru je mez detekce. Tato veličina udává nejmenší možnou koncentraci analytu, která je ve vzorku detegovatelná. Norma IUPAC definuje detekční limit jako trojnásobek směrodatné odchylky signálu, který je získán měřením slepého vzorku (vzorku o nulové koncentraci analytu). Tento způsob má však i některé nevýhody a v praxi je mnohem častěji využívána metoda, kdy se lineární částí (pro koncentrace, kde je signál přímo úměrný koncentraci) a konstantní částí (pro nízké koncentrace, při kterých signál nezávisí na koncentraci) proloží dvě přímky a detekční limit je roven jejich průsečíku. Někdy se též nazývá praktický detekční limit. V odborné literatuře existují velice bouřlivé polemiky o relevantnosti obou přístupů. Doporučuje se vždy uvádět způsob, jakým byl daný detekční limit získán. Analogicky lze získat tzv. „horní“ detekční limit, který však nemá takovou důležitost jako detekční limit „spodní“, neboť v případě příliš koncentrovaného vzorku lze tento snadno naředit. Třetím parametrem je koncentrační rozsah senzoru. Koncentrační rozsah je rozmezí koncentrací, mezi kterými lze stanovit koncentraci analytu. Je-li koncentrace mezi dolní mezí koncentračního rozsahu a dolním detekčním limitem, lze určit, zda je analyt přítomen či nikoli, ale nelze určit jeho koncentraci. Totéž analogicky platí pro horní mez koncentračního rozsahu a horní detekční limit. Koncentrační rozsah je někdy též nazýván rozsahem linearity, nicméně v praxi nemusí být odezva striktně lineární, stačí je-li monotónní a dostatečně strmá. Čtvrtou základní charakteristikou senzoru je citlivost, která bývá udávána jako změna výstupního signálu na jednotkovou změnu koncentrace. Předpokladem pro toto vyjádření je lineární odezva senzoru. Obecně platí, že čím strmější je jeho kalibrační křivka, tím lépe. Dynamické vlastnosti senzorů charakterizuje časová konstanta senzoru v jejím běžném významu v měřící technice. Dlouhodobá časová stálost je popisována poklesem citlivosti, který se udává v % za jednotku času. Pro praktické použití hromadně vyráběných senzorů je důležitá i doba mezi rekalibrací senzoru, tento časový interval zpravidla určuje výrobce. Hmotnostní senzory Hmotnostní senzory tvoří asi 6 % používaných chemických senzorů a jsou navíc i velice prespektivní. Přírůstek hmotnosti na aktivní ploše senzoru generuje změnu elektrického signálu. První typem jsou QCM senzory (z anglického Quartz Crystal Microbalances). Na povrchu piezokrystalu, zapojeného v oscilátoru, je nanesena aktivní vrsta s receptorem, který je schopen selektivně komplexovat analyt. Na této vrstvičce se vratně sorbuje analyt z plynného vzorku a to tím více, čím vyšší je jeho koncentrace ve stanovovaném médiu. Změna kmitočtu oscilátoru souvisí se změnou hmotnosti citlivé vrstvičky deponované na povrchu piezokrystalu podle vztahu ∆f = f 2 ⋅

∆m N ⋅ρ ⋅F

(0.5),

kde ∆f je změna frekvence, f je základní frekvence oscilátoru, ∆m je změna hmotnosti na povrchu krystalu, N je frekvenční konstanta, ρ je hustota sorbentu a F jeho plocha. Touto sorpcí dochází ke změně hmotnosti vrstvičky a tím i změně vlastní frekvence oscilátoru. Schematicky je systém znázorněn na obrázku (n). Základní frekvence oscilátoru se pohybuje v řádu 1 až 10 MHz a systém musí být dobře temperován na konstantní teplotu a navíc je

120

teplotně kompenzován použitím diferenčního uspořádání zařízení. To je rovněž citlivé na průtok média a proto musí být průtok udržován konstantní. Určitou nevýhodou je nelinearita odezvy. Dosahované detekční limity jsou typicky 110 ppm pro plyny. V praxi se QCB používají pouze pro plyny. Mezi používané sorbenty patří například trietanolamin (na SO2), kyselina sorbová s AgNO3 (NH3), carbowax550 (toluen), Pd (H2, detekční limit 10 ppb!) a LiCl v želatině (stanovení vlhkosti).

Referenční oscilátor

Směšovač frekvencí

A/D

Měřící oscilátor

Rozdílová frekvence

Měřící cela

Křemenný výbrus se sorbentem

Obrázek 4.3: Schéma hmotnostního senzoru QCM Jiným, obdobným druhem hmotnostích snímačů jsou tzv. SAW snímače, kde SAW je zkratkou z anglického Sourface Acoustic Wave, tedy povrchová akustická vlna. Principem techniky je vygenerování Rayleighovy akustické vlny, která se šíří po povrchu podložky modifikovaném selektivně reagujícím sorbentem, přičemž změna hmotnosti tohoto povrchu způsobí změnu rezonanční frekvence (∆f) senzoru vlivem absorbovaného analytu. Změna rezonanční frekvence je přímo úměrná čtverci rezonanční frekvence a plošné hmotnosti citlivé vrstvy. Pracovní frekvence senzoru se volí v rozsahu od 10 MHz do řádově jednotek GHz a dosahované detekční limity jsou velmi nízké, typicky 10-9 až 10-15 g, což odpovídá např. koncentraci 100 ppb SO2 ve vzduchu. Schéma měřící aparatury je znázorněno na obrázku 4.4..

121

VF generátor

Fázový posun

Komparátor

A/D převod

Obrázek 4.4: Schéma hmotnostního senzoru SAW Teplotní senzory Teplotní senzory jsou nejčastěji založeny na vzniku tepelného efektu na fázovém rozhraní kapalina – tuhá fáze nebo plyn – tuhá fáze, přičemž plyn nebo kapalina jsou analyzovaným vzorkem a tuhá fáze je teplotním senzorem, jehož povrch je vhodným způsobem upraven látkou (katalyzátorem), která umožňuje reakci analyzované složky vzorku a reagencie a která se ke vzorku v dostatečném množství přidává. Možné je také uspořádání, kdy látka nanesená na povrch teplotního senzoru přímo reaguje s analytem v plynné nebo kapalné fázi za vzniku tepelného efektu. Příkladem prvního typu senzoru jsou diferenční teplotní biochemické senzory, přičemž na povrchu jednoho z nich je zakotven enzym (biokatalyzátor) a druhý senzor je srovnávací. Vysoce selektivní biokatalyzátory, např. typu oxidas, jsou schopny za přítomnosti kyslíku selektivně konvertovat (oxidovat) některé organické látky, například jednoduché cukry, za uvolnění značně velkého množství reakčního tepla (řádově 104 – 105 kJ/mol). Detekční limity pro stanovení glukosy, fruktosy a dalších cukrů pro výše uvedené senzory jsou na úrovni 10-6 až 10-7 mol/l. Jako teplotních činidel bylo v minulosti používáno dnes již zastaralých a necitlivých termočlánkových baterií, v současné době pak především platinových odporových teploměrů, termistorů a teploměrů pracujících na pyroelektrickém principu. Nevýhodou všech teplotních chemických senzorů je, že je nutno stabilizovat teplotu okolí jejich umístěním v termostatu a, jak již bylo výše naznačeno, využít diferenčního zapojení s jedním aktivním a jedním srovnávacím čidlem. Vodivostní chemické senzory Pro vodivostní senzory, jak již název sám napovídá, je charakteristická změna vodivosti citlivé vrstvičky v závislosti na koncentraci analytu. Citlivou vrstvou může být vodič prvního druhu – napařený kov. Jako příklad je možno uvést destičku z izolantu (např. ze slinutého oxidu hlinitého-aluminy) s napařenou vrstvou zlata o tloušťce 100 až 200 nm. Tento

122

senzor lze použít pro detekci vysoce reaktivních sodíkových par ve vakuu. Odpor zlaté vrstvičky prudce naroste za vzniku slitiny AuNa(x) a to dokonce o několik řádů. Příkladem vodivostního senzoru založeného na vodiči druhého druhu, tedy elektrolytu, je destička opatřená platinovými elektrodami s naneseným polymerem (směsí polyvinylacetátu a polyvinylalkoholu) obsahujícím hydroskopický chlorid lithný. Pomocí takovýchto senzorů je pak možno měřit relativní vlhkost plynů v mezích od 10 do 99 % při teplotách od –40 do +60 °C. Třetí kategorií materiálů pro citlivou vrstvu je polovodič, např. na bázi oxidu cíničitého. Konkrétní vlastnosti senzorů tohoto typu se značně liší jednak podle jejich provedení, tj. zda-li se jedná o sintrovaný, tlustovrstvý či tenkovrstvý senzor, a v nemenší míře podle přítomnosti některých dopujících látek, které selektivitu ovlivňují velice dramaticky (obr. 4.5). 1

H2

R/R 50

Odporové topení

CO Pt přívody

i-C4H10 0,2

C2H5OH koncentrace [ppm]

3000

A citlivá vrstva

10

H2

izolátor

i-C4H10 + CO

R/R 50

topení

Pt přívody ferit

1 3000

C2H5 OH

0,2 koncentrace [ppm]

B napařená citlivá vrstva

1,4

Pt přívody

CO

R/R 50

SiO2 ferit

i-C4H10 + H2

1 3000

topení

C 2H5OH

0,6 koncentrace [ppm]

C Obrázek 4.5: Schema konstrukce různých typů SnO2 senzorů a příklady jejich odezvy na vodík, oxid uhelnatý, isobutanol a páry etanolu. A) sintrovaný SnO2 senzor se stopami palladia a kovového kovového cínu, B) tlustovrstvý SnO2 senzor s aktivní vrstvou dopovanou

123

palladiovou černí a C) příklad tenkovrstvého SnO2 senzoru s napařenou vrstvou dopovanou Pd černí. R50 je odpor vrstvy při koncentraci 50 ppm. Selektivita jednotlivých typů senzorů je ovlivněna způsobem interakce analyzovaného plynu s aktivní vrstvou a eventuelně přítomností některých dalších složek. Vodivost oxidu cíničitého, který je polovodičem typu N, vzrůstá za přítomnosti donorů elektronů (F-, O2, Sb, apod.). Přítomnost plynů, jako je vodík, metan či isobutan, ve směsi se vzduchem, které vytěsňují resp. reagují za zvýšené teploty s kyslíkem (nebo přesněji s kyslíkovými radikály na povrchu polovodivého SnO2), způsobí, že vodivost aktivní vrstvy senzoru bude klesat. Naopak za přítomnosti kyslíku, oxidu uhličitého či par etanolu, tj. kyslík obsahujících látek, se bude vodivost aktivní vrstvy zvyšovat. Z toho také plyne, že při měření je nutno zachovávat konstantní koncentraci okolního kyslíku a samozřejmě i teplotu. Jako konstrukčních materiálů vodivostních senzorů bylo využito ve výrobě i ve výzkumu i jiných polovodivých oxidů (oxid inditý, oxid železitý, směsné oxidy hlinité a vanadičné, oxid nikelnatý a další), které samozřejmě mají odlišnou selektivitu. Některé jejich typy jsou vyráběny v obrovských seriích. Používají se téměř výhradně pro analýzu plynných směsí. Potenciometrické senzory Iontově selektivní elektrody Iontově-selektivní elektrody (ISE) patří, co do počtu prováděných analýz, k nejdůležitějším a nejfrekventovanějším analytickým technikám vůbec a přitom s využitím cenově dostupných elektrod a měřících přístrojů (zpravidla digitálních voltmetrů s vysokým vstupním odporem). Jejich princip je založen na měření potenciálu mezi dvěma elektrodami, jedné pomocné, referenční, jejíž potenciál nezávisí na koncentraci analyzovaných iontů, a měrné, jejíž potenciál závisí, v ideálním případě, na koncentraci podle Nernstovy rovnice:

E = Ef +

0,059 ⋅ log c z

(0.6),

kde E je potenciál měrné elektrody, Ef je tzv. formální potenciál elektrody, který je zpravidla konstantní, z je nábojové číslo analyzovaného iontu a c jeho koncentrace v roztoku. Z této rovnice plyne, že je-li elektroda citlivá na kationty, pak s rostoucí koncentrací roste i její potenciál a naopak, je-li citlivá na anionty, pak s rostoucí koncentrací její potenciál klesá. Potenciometricky nelze přímo stanovovat nenabité neutrální molekuly. Typickým reprezentantem iontově-selektivních elektrod je skleněná elektroda citlivá na vodíkové ionty, respektive kyselost (obr. 4.6a), jejíž základem je speciální lithné sklo. Skleněná elektroda poskytuje lineární, Nernstovskou odezvu v širokém rozsahu pH od 2 do 12, tedy v rozmezí koncentrací vodíkových iontů od 0,01 mol.l-1 do 10-12 mol.l-1 (obr. 4.6b). U skleněných elektrod je možno se setkat s tzv. kyselou a alkalickou chybou. Jedná se o odchylky od „Nernstovské“ odezvy při nízkých hodnotách pH a při vysokých hodnotách pH se uplatňuje tzv. alkalická chyba skleněné elektrody. Alkalická chyba je vysvětlitelná interferencí vysoké koncentrace alkalických kovů (resp. prakticky velmi častou přítomností Na+ a K+) a matematicky popsaná zobecněním Nernstovy rovnice, rovnicí Nicholsky-Eisenmanovou. 124

Kromě skleněné elektrody citlivé na vodíkové ionty existují též elektrody založené na jiných druzích skel, která jsou citlivá na Li+, Na+, K+, Ag+ a některé další kationty. Skleněné elektrody náleží do skupiny elektrod s tuhou membránou. Kromě nich do této kategorie patří ještě elektrody krystalové a elektrody s „kapalnou membránou“. Krystalové iontově-selektivní elektrody lze dále rozdělit na monokrystalické, kam patří především fluoridová iontově selektivní elektroda (obr. 4.6c), jejíž membrána je tvořena monokrystalem fluoridu lanthanitého (LaF3) dopovaného fluoridem europia pro zvýšení vodivosti. Elektroda poskytuje Nernstovskou směrnici 59 mV na koncentrační dekádu v koncentračním rozsahu 1 mol.l-1 až 10-6 mol.l-1. Nejvýznamnějším interferentem jsou hydroxylové ionty. Kromě monokrystalových elektrod jsou v analytické chemii užívány i elektrody polykrystalické, selektivní na ionty sulfidové, chloridové, bromidové, stříbrné či rtuťnaté a elektrody směsné citlivé např. na chloridy, bromidy, iodidy, kyanidy, ionty kademnaté, olovnaté, měďnaté či stříbrné.

G

F C E D A B

Obrázek 4.6a: Kombinovaná skleněná elektroda (měrná a referenční elektroda v jednom korpusu) patří k nejčastěji používaným potenciometrickým čidlům v laboratoři. A…lithné sklo, B…vnitřní roztok skleněné elektrody, C…vnitřní svodová argentchloridová elektroda, D…frita referenční elektrody, E…vnitřní roztok referenční elektrody, F…vlastní argentchloridová referenční elektroda, G…koaxiální kabel (jádro…měrná elektroda, plášť…referenční elektroda). E

2

12

pH

Obrázek 4.6 b: Odezva skleněné elektrody na pH

125

C

B

A

Obrázek 4.6c: Krystalová fluoridová elektroda. A…monokrystal LaF3, B…napájený kontakt, C…přívodní drátek. Zvláštním typem iontově-selektivních elektrod jsou elektrody s „kapalnou“ membránou. Ta je nejčastěji tvořena základním polymerem, např. polyvinychloridem (PVC), nepolární přísadou, např. o-nitrofenyloktyleterem (oNPOE), popřípadě změkčovadlem, které zlepšuje mechanické vlastnosti membrány. Obě látky po rozpuštění v organickém rozpouštědle, s výhodou v tetrahydrofuranu, a po jeho odpaření vytvoří tenkou membránu (obr.4.7), ve které je kapalný oNPOE fixován v polymerní sítí PVC. Zatímco PVC ovlivňuje především mechanické vlastnosti membrány, pak nepolární látka typu oNPOE má zásadní vliv na mechanismus její funkce. Kationty a anionty jsou totiž hydrofilní částice, které nemají zájem samovolně přecházet do nepolární organické fáze, avšak přidá-li se do membrány malé množství receptoru, pak do membrány selektivně přechází pouze ion, na který je receptor citlivý. Vhodnou volbou receptoru lze vytvořit ISE selektivní na různé analyty. Kromě receptoru se do membrány zpravidla ještě přidává tzv. lipofilní přídavek, což je látka, která výrazně zlepšuje odezvu elektrody. ISE s „kapalnou membránou“ lze rozčlenit podle použitého receptoru na membrány s receptorovým iontoměničem, má-li receptor povahu organického kationtu či aniontu, a na membrány s neutrálním nosičem, jedná-li se o neutrální molekulu.

Obrázek 4.7: Membrány pro iontově-selektivní elektrody s „kapalnou membránou“ Zvláštní kategorií iontově-selektivních elektrod jsou tzv. „coated wire“ elektrody, které jsou tvořeny, jak název napovídá, drátkem z inertního kovu (Pt, Au) pokrytého polymerem, který obsahuje vazebná místa pro analyt. Tento polymerní povlak se velice dobře vytváří například elektrolyticky. Je známo, že při vhodném potenciálu se na elektrodu v roztoku některých organických látek (anilín, pyrrol, thiofén,…) na podkladové kovové

126

elektrodě (Pt,Au atp.) vytváří kompaktní elektricky vodivý polymerní film (obr. 4.8). Pro jeho lepší homogenitu se polymerace někdy provádí cyklováním potenciálu, respektive cyklickou voltametrií. Nechá-li se polymerovat látka, která má na molekule jednak polymerizovatelnou skupinu a jednak citlivou receptorovou skupinu, pak je vzniklý povlak citlivý na ionty, na které je citlivá receptorová skupina.(obr. 4.8). Nutným předpokladem pro to, aby takto připravená elektroda fungovala, je to, že musí být umožněn přenos náboje mezi receptorovými skupinami a elektricky vodivou skupinou (spojka mezi těmito skupinami nesmí mít velký ohmický odpor).

NH2

CoIII+

testovaný roztok

N

NH

NH

NH

NH

s cysteinem

80°C

voltametrie

n

n

n

NH

+

+

+ cyklická

N

N

N

N

HN

N

N

HN

H S

NH2 OH

Co

Co N

N

N

N

N

O

Obrázek 4.8: Příklad přípravy a použití „coated wire“ iontově-selektivních elektrod Moderní a přitom sériově vyráběné jsou v současnosti miniaturní potenciometrické senzory, vycházející z tranzistorů řízených polem, označované IS-FET („Ion-selective FET“), CHEMFET (citlivé na sloučeniny nebo ionty), ENFET (využívající biokatalyzátorů-enzymů) a celé řady dalších. Jedná se o polem řízené tranzistory, které mají na řídící elektrodě umístěnu vrstvičku látky selektivně reagující s analytem. Jako selektivně reagující látky se využívají v podstatě stejné vrstvy jako v iontově-selektivních elektrodách s kapalnou membránou a i jejich vlastnosti jsou podobné. Výhodou IS-FETů, CHEMFETů, ENFETů aj. je, že neobsahují vnitřní elektrolyt, a proto mohou pracovat i v nakloněné poloze. Ke zpracování jejich signálu se používá jednoduché zapojení s operačním zesilovačem (obr. 4.9). V posledním desetiletí se objevují na trhu, především pro potřeby klinické biochemie, integrované senzory, které umožňují stanovení několika složek vzorků souběžně.

127

Obrázek 4.9: Kombinovaný senzor IS-FET – REFET

Amperometrické senzory Senzory pracující na amperometrickém principu využívají zpravidla dvou elektrod, z nichž jedna, měřící elektroda, je rozměrově malá (polarizovatelná), druhá pak je velkoplochá, nepolarizovatelná (referenční, zpravidla argentchloridová) elektroda. Mezi měřící a referenční elektrodu se vkládá tak velké napětí, že je zaručeno, že sledovaná látka na pracovní elektrodě podlehne elektrochemické přeměně (elektrooxidaci nebo redukci). Elektrolytický proud, který protéká mezi oběma elektrodami, je přímo úměrný množství sledované látky, které podlehne elektrochemické reakci na měřící (polarizované) elektrodě. Řídícím dějem, který rozhoduje o velikosti proudu, bývá zpravidla difúzní transport elektroaktivní látky k elektrodě. Jako příklady amperometrických senzorů je možno uvést typického zástupce amperometrického membránového senzoru, kterým je tzv. Clarkovo kyslíkové čidlo a z něho odvozené vysoce selektivní enzymové amperometrické senzory organických látek. Clarkovo čidlo, ve velkých seriích vyráběné různými firmami po celém světě, je určeno pro sledování obsahu kyslíku ve vodě nebo vodných roztocích. Vychází z planárního elektrodového systému, který je tvořen měřící elektrodou, zhotovenou z Au, Pt, Ag, a velkoplochou referenční elektrodou (Ag/AgCl). Elektrodový systém je překryt membránou o permeabilitě Pm, která je definována jako takové množství látky, které projde membránou o jednotkové ploše při její jednotkové tloušťce a při jednotkovém rozdílu parciálního tlaku na obou stranách membrány za časovou jednotku. Mezi membránou a elektrodami je pomocí separátoru vymezena tenká vrstva elektrolytu (např. roztok KCl a NaHCO3). Na elektrody je

128

vkládáno konstantní napětí například 0,65 V, přičemž pracovní elektroda je připojena na (-) pól zdroje (polarizována katodicky). Na této elektrodě probíhá reakce O2+ 2 H2O + 4 e-= 4 OH–. Pro proud tekoucí Clarkovým čidlem platí vztah i = konst.n.F.A.Pm.c(O2)/b, ve kterém n je počet elektronů vyměňovaný při elektrodové reakci, b je tloušťka membrány, A plocha měřící katody, F je Faradayova konstanta (náboj) a c (O2) koncentrace kyslíku. Pokud k plynopropustné membráně vhodným způsobem zafixujeme ze strany měřeného roztoku polyamidovou síťku, na které je vhodným imobilizačním postupem zakotven enzym, obdržíme tzv. enzymová čidla, která se uplatňují v současných biochemických laboratořích k vysoce selektivním stanovením četných organických látek. Například pro stanovení glukosy je využívána reakce katalyzovaná enzymem glukosooxidasou, která probíhá podle reakce glukosa + O2 + H2O

glukosoxidasa

> kyselina glukonová + H2O2

Při reakci spotřebovaný kyslík je indikován Clarkovým kyslíkovým čidlem, které je součástí enzymového senzoru. Pro potřeby klinické biochemie byly vyvinuty senzory využívající obecně oxidas, které umožňují stanovení celé řady dalších látek, např. cholesterolu, kyseliny močové aj. Amperometrická membránová čidla nejsou co do aplikací omezena pouze na stanovení, u kterých je signál zprostředkován měřením koncentrace kyslíku. Z dalších plynů je možno uvést jako příklad měřící celu pro SO2, kdy se používá rovněž Clarkovo čidlo nebo jeho anodická oxidace (na grafitové elektrodě), přičemž katoda je zhotovena z mědi. Obě elektrody jsou v galvanickém kontaktu s roztokem obsahujícím CuSO4 a H2SO4. Pracovní oblast je 10 – 10000 ppm (obj.). Optické senzory Objev optických vláken v roce 1966 umožnil vznik zcela nových aplikací. Přenos světla na dlouhé vzdálenosti umožnil rychlé přenosy dat s malým zkreslením a optická vlákna se téměř stala synonymem pro moderní telekomunikace. Nicméně i v oblasti senzorů se pilně využívá výhod, které vláknová optika nabízí. Světlovody umožňují měření na dlouhé vzdálenosti, jejich ohebnost a možnost miniaturizace usnadňuje jejich použití v místech s obtížným přístupem, případně v nebezpečných prostředích. Oddělení vlastní citlivé vrstvy od jeho elektrické části světlovodem významně zvyšuje bezpečnost při měření v explozivních prostředích a snižuje vliv elektromagnetického rušení. V chemických senzorech slouží světlo pouze jako nosič informace. Je vedeno optickým vláknem ze zdroje do citlivé vrstvy, která je v kontaktu se vzorkem. Zde je absorbováno, odraženo nebo vyvolává emisi fluorescenčního záření. Takto změněné světlo je vedeno zpět do optického systému buď stejným nebo jiným vláknem. Nakonec je zaostřeno, filtrováno a převedeno na elektrický signál. Na rozdíl od makro-měření není u absorbčního a fluorescenčního měření třeba, aby světelný paprsek procházel napříč citlivou vrstvou – využívá se tzv. evanescentní vlna na rozhraní povrchu světlovodu a aktivní vrstvy (ATR, Attenuated Total Reflection, zesílený povrchový rozptyl). Ze srovnání s elektrochemickými senzory, které jsou hlavním konkurentem optod, vyplynou kromě výše uvedených výhod i nevýhody, jako je interference okolního světla (lze odstranit modulací zdroje), nelinearita odezvy daná Lambert-Beerovým zákonem a mnohem 129

menší dynamický rozsah (pouze jeden až dva koncentrační řády). Proti elektrochemickým technikám je též mnohem komplikovanější instrumentace. Klasickým zástupcem této skupiny senzorů je optoda citlivá na pH založená na fenolové červeni imobilizované na polyamidových částicích, které byly naplněny do špičky dutého vlákna překryté plynopropustnou membránou (obr. 9.10). Fenolová červeň je klasický pH indikátor používaný v titrační analýze, který má barevný přechod v uvedené oblasti. Jeho kyselá forma je žlutá a bazická forma má červenou barvu. Obdobná je rovněž konstrukce, kde je polyakrylamid nahrazen roztokem bromthymolové modři, která má barevný přechod ze žluté do modré v rozsahu pH od 6,0 do 7,6. Výhodnější je však analogická konstrukce s fluorescenčními indikátory umbelliferonem či hydroxypyrensulfonovou kyselinou, kdy je možné, při stejné citlivosti detektoru, použít tenčí citlivou vrstvu a tím snížit dobu odezvy časovou konstantu senzoru. Polyakrylamid s fenolovou červení Ucpávka ∅ 0,8 mm

Pórovitá stěna

Obrázek 4.10: Acidobazický optický senzor citlivý na pH v rozmezí pH 7,0 až 7,4. Systém s bifurgovanými vlákny Podobně jako optody pro pH pracují i optody pro stanovení jiných kationtů a aniontů v roztocích. Konkrétním příkladem jsou senzory s aktivní vrstvou obsahující kalcein či akridin, kdy fluorescence prvého klesá s rostoucí koncentrací kobaltnatých, nikelnatých a měďnatých iontů a druhého s rostoucí koncentrací jodidů, bromidů a chloridů. Obdobným způsobem jako iontová čidla jsou řešeny senzory pro plynovou analýzu. Jako příklad je možno uvést čidla pro stanovení plynných sloučenin, jakými jsou oxid uhličitý, amoniak, kyslík či vzdušná vlhkost. Další kapitolou, dále podrobně diskutovanou, jsou optické biosenzory založené na enzymatických reakcích či interakci antigen-protilátka. V případě enzymových senzorů se používají senzory citlivé např. na kyslík, amoniak či pH, na kterých je imobilizován vhodný enzym, který katalyzuje reakci analytu, při které vzniká jeden z výše uvedených produktů. Tímto způsobem pracují senzory citlivé na glukosu, laktáty, močovinu, penicilin, organické estery, ethanol a mnohé další. V případě imunologických senzorů je na optickém vláknu imobilizována protilátka. Je-li antigen specifickými interakcemi vázán na imobilizovanou protilátku, je možné pozorovat změnu v odrazivosti aktivní vrstvy. Druhým přístupem je přidání známého množství fluorescenčně značeného antigenu, který se naváže na elektrodu. S vyšší koncentrací neznačeného antigenu v roztoku dochází k intenzivnější kompetici se značeným antigenem a fluorescence klesá. Kromě výše uvedených technik se začíná užívat např. plasmonové resonance. Biosenzory V biologii jsou senzory základním prostředkem komunikace živých systémů s prostředím. V přírodě nacházíme senzory pro světlo, tlak, teplotu, vlhkost, osmotický tlak, zvuk, chuť, zápach či vůni. Pouze posledně zmíněné jsou podle definice chemické senzory používající molekulární rozpoznání pro svou funkci. 130

Molekulární rozpoznání substrátů pomocí specifických receptorů, a to jak v roztoku tak na povrchu membrán, je základní proces, který kontroluje důležité biologické děje (interakce antigen-protilátka, enzymové reakce, přenos signálu, imunitní odpověď organismu a membránový transport). V biologii jsou senzory na bázi receptorů klíčovým prostředkem komunikace živých systémů s prostředím. Z hlediska analytické chemie může být tento princip efektivně využit při přenosu signálu a otevírá tak řadu možností pro návrh selektivních biosenzorů cílových substrátů. Obecné schema je na obr. 4.11.

převodník

elektronická

(transducer)

výstupní signál

jednotka

biorekogniční vrstva analyt Obrázek 4.11: Obecné schéma biosensoru Biosenzor, přenosné analytické zařízení, se skládá ze dvou základních komponent: z biologické složky, tzv. selektoru (enzym, protilátka, antigen, lektin, nukleová kyselina), který rozpoznává analyt našeho zájmu a může podléhat konformačním změnám při vazbě substrátu (indukované přizpůsobení), a z fyzikálního převodníku (transducer), který interakci převádí na vhodný analytický signál. V principu jde tedy o konverzi biochemické informace na určitý druh fyzikální informace. Ačkoliv biosenzor může být založen na různých mechanismech, jeho funkce a kvalita závisí na tom, jak dobře umí rozeznat analyt (svou receptorovou částí), pro který byl navržen vzhledem k ostatním látkám přítomným v mediu. Transdukční metoda pak může být např. elektrochemická (potenciometrická – neutrální nosič pro kationty a anionty; amperometrická – neutrální nosič s redoxním charakterem) či spektrální (UV-VIS a fluorescenční pro barevné nosiče a fluorescenční substráty, SPR – povrchová plasmonová rezonance pro objemné biomolekuly apod.). Výzkum biosenzorů začal s enzymovými elektrodami. Dnes představuje oblast, ve které se publikuje více než 1000 prací a patentů ročně. V minulosti byl zájem soustředěn především na biokatalytické systémy pro stanovení biologicky významných nízkomolekulárních látek v klinické praxi. Stimulujícím faktorem byla například potřeba rychle a spolehlivě sledovat hladinu glukosy u diabetiků. V současné době se pozornost přesouvá na bioafinitní systémy založené na vysoce specifických vazebných interakcích biomolekul, např. monoklonálních protilátek s odpovídajícími antigeny. Hnací silou pro vývoj v této oblasti jsou především požadavky kladené farmaceutickým výzkumem a bioanalytickou chemií využívanou v klinické praxi. Molekulární rozpoznání je také nedílnou součástí vnitřní komunikace mezi buňkami a orgány pomocí hormonů a přenašečů nervových vzruchů. Vznik komplexů mezi enzymem a substrátem, antigenem a protilátkou, hormonem a receptorem je založen na existenci kom131

plementárních struktur a konformací, které poskytují odpovídající distribuci polárních a nepolárních skupin, které spolu interagují za využití řady nekovalentních interakcí. Specificita biologických rozpoznávacích systémů může být extrémně vysoká, což je známo z oblasti duplikace nukleových kyselin (nutnost bezchybného přepisovaní informace) a také např. známý biotin-avidin komplex (s asociační konstantou Ka ~ 1015). Rozpoznání substrátů enzymy se vyznačuje vysokou specifitou, která často dovoluje přesné rozpoznání chirálních center. Byly také odhaleny chemické a elektrické způsoby zesílení signálů (faktorem 103-109), obvykle katalytickými kaskádovými procesy, které jsou v přírodních senzorech používány. Na těchto skutečnostech je založen vývoj biosenzorů jako skutečně interdisciplinární odvětví vyžadující spolupráci analytických chemiků, biologů, fyziků a matematiků. Jeho aplikační výstupy dnes pokrývají řadu oborů zahrnující humánní a veterinární medicínu, zemědělství, potravinářský a farmaceutický průmysl a ochranu životního prostředí. Rozpoznání analytu na úrovní interakce molekul obecně dovoluje, aby biosenzory byly velmi přesné a miniaturní. Celá oblast senzorů se rychle přesouvá z akademické oblasti do aplikační a už dnes trh představuje více než 9 miliard dolarů ročně. Není to překvapivé, protože tyto senzory jsou vysoce selektivní, analýza je rychlá s nízkými náklady a obsluha je snadná. Tato skupina senzorů representuje specifickou a speciální skupinu chemických senzorů založených na biologickém rozpoznání systému spojeného s vhodným fyzikálním převodníkem. Specifické rozpoznání, které jak bylo uvedeno dříve, je základem života, je zde využíváno pro získání signálu závislého na koncentraci sledovaného analytu. Biologická část senzoru je obvykle makromolekula – aktivní biosenzorový element (např. enzym, protilátka, hormon), který často podléhá konformačním změnám (indukované přizpůsobení) při vazbě substrátu. Afinitní senzory používají lektiny, protilátky a receptory jako rozpoznávací element, a ty pak přenášejí změnu vlastností danou vazbou substrátu (optoelektronické, potenciometrické). Jistou nevýhodou je zde citlivost proteinů, které jsou nejčastěji aktivní složkou biosenzoru, k tepelným a chemickým vlivům. Nové trendy jsou zaměřeny na vyhledávání vysoce specifických senzorových elementů (náš zájem je uplatnění expandovaných porfyrinů v této oblasti), miniaturizaci senzorů, rychlost analýzy, hledání nových, stabilních biokompatibilních ligandů, kde převládající biospecifickou složkou jsou doposud enzymy. Přírodní i modifikované oligonukleotidy představují velice perspektivní oblast výzkumu, pro vývoj senzorů zejména representovanou použitím substituovaných oligonukleotidů ukotvených na elektrodě. Pro elektropolymeraci je využita pyrrolová, thiofenová či aminofenylová funkce vázaná kovalentně na daný oligonukleotid. Cílem je zde monitorovat sekvence lidského genomu odpovědné za vrozené poruchy. Molekulární rozpoznání zde spočívá v hybridizaci imobilizované sondy s komplementární sekvencí analytu (DNA/RNA fragment) v roztoku. Vytvoření dvojité šroubovice se projeví na voltametrických křivkách DNA a chronopotenciometrické detekci. Pokud se jako rozpoznávací element použije dvojvláknová DNA, pak lze stanovovat toxické látky, interagující s její strukturou, a to elektrochemickou detekcí. Velký pokrok byl zaznamenán na poli imunosenzorů. Protilátky jsou jako rozpoznávací element velmi universální. Potenciálně lze připravit monoklonální protilátku proti jakékoliv chemické struktuře. Obecným problémem je zatím vysoká cena přípravy.

132

Uměle připravené rozpoznávací elementy se těší velké pozornosti. Vedle syntézy navržené na základě molekulárního modelování komplexu existuje alternativní přístup založený na tvorbě molekulárních otisků. Spočívá v polymeraci vhodných monomerů v přítomnosti ligandu (analytu), který má být rozeznán. Ve struktuře polymeru se vytvoří kolem ligandu vazebné místo držené pohromadě strukturou polymeru. Po jeho uvolnění je připraveno vazebné místo pro specifické rozpoznání analytu (zapamatování). Takto získané “syntetické protilátky” jsou dnes uplatňovány na poli biosenzorů. Ostatní senzorové techniky Dostupnost vláknové optiky je hlavní komerční důvod pro vývoj kolorimetrických a fluorometrických senzorů. Kolorimetrická analýza může být řešena několika možnými způsoby: v jednom přístupu je použit neutrální chromoionofor, kde se barva receptoru mění jako výsledek komplexace substrátu. V jiném případě je barevný protiion použit k extrakci např. kovových iontů do jiné fáze. Piezoelektrické senzory jsou často používány pro jednokomponentovou analýzu, protože odpověď je obvykle nespecifická. Multikomponentní analýza je vytvořena souborem senzorů různých selektivit. Vhodně modifikované obecné receptory, např. cyklodextríny, byly využity pro povrchové pokrytí, aby bylo dosaženo selektivity u piezoelektrických přístrojů. Základním požadavkem pro další vývoj nejenom tohoto typu senzoru, ale zcela obecný požadavek pro vývoj moderních analytických nástrojů je detailní porozumění interakcím, které probíhají na povrchu senzoru mezi ligandem a analytem. Z tohoto hlediska je velice přínosné vyhledávání specifických ligandů založené na kombinatorických knihovnách, které umožní rychlou přípravu a efektivní testování nových receptorů. To zahrnuje spojení nového receptoru s vhodně zvolenou molekulou barviva, která změní svoji barvu při vazbě substrátu. Testování se obvykle provádí na Merrifieldových pryskyřicích, které slouží pro syntézu knihoven. Toto uspořádání umožňuje velice účinné vyhledávání specifických ligandů. Z hlediska vývoje senzoru je ovšem zatím vyřešen jen první krok a to příprava specifického receptoru pro daný substrát. Další krok – vývoj metodik transdukce pro obecnou aplikaci jako senzor je teprve v počátcích. Dosavadní přístup je založen například na chemicky indukované změně odporu chemicky vodivých polymerů. Jiným praktickým přístupem je sledování konformačních změn receptoru po komplexaci, které vedou k ionochromické odpovědi (ke změnám v UV-vis nebo fluorescenčních spektrech). Charakter senzorových materiálů Receptory pro kationty použité pro vývoj senzorů byly často biologické nosiče jako valinomycin a monensin a dále celá řada syntetických ligandů typu cyklických etherů a polyamidů. Od původně používaných pouze kyslíkových cyklických etherů a kryptandů se vývoj ubíral směrem, kdy byla udělána celá řada syntetických modifikací umožňujících zavedení specifických rozpoznávacích center, např. atomů dusíku síry a navržení kalixarenových a dalších makrocyklických struktur s mnohonásobným donorovým uspořádáním. Tyto struktury jsou základem mnoha současných senzorů a nosičů. Cyklické ethery jsou velice populární ligandy pro konstrukci receptorů, protože jejich benzoderiváty mohou být snadno derivatizovány a poskytují další funkční skupiny pro připojení či zlepšení vazebných vlastností, zvýšení selektivity či transdukčních vlastností. Tyto našly použití jako kolorimetrické senzory. Pro použití jako ISE optody musí mít několik základních charakteristik, a to lipofilní skupiny zajišťující kompatibilitu v membráně a zabraňující unikání ligandu do vodného roztoku, vhodné funkční skupiny musí zajistit trvalé kovalentní spojení k polymeru nebo umožnit kopolymeraci, dále musí obsahovat jednotky, které poskytují možnost detekce absorpční spektroskopií nebo pomocí fluorescence, a to rozdílnou ve volné a komplexované formě receptoru. 133

K všeobecnému zklamání, 30 let po úspěšném vykročení valinomycinových elektrod (první komerční elektroda, selektivní pro draselné ionty) existuje jen několik syntetických receptorů, kde je znám detailní mechanismus molekulárního rozpoznání a možnost stejně rozsáhlé aplikace. Z toho vyplývá nutnost jak racionálního designu nových selektivních receptorů, a to zejména pro anionty, tak studium nekovalentních komplexů. Z uvedeného je zřejmé, že vývoj nových receptorů pro použití jako senzorů má před sebou ohromné možnosti rozvoje. Důležitým požadavkem je vývoj senzorů pro analýzu organických analytů ve směsi. Hlavním problémem je zde obtížnost dosažení selektivity. Dva hlavní typy senzorů, které jsou předmětem intenzivního výzkumu, jsou senzory pro enantioselektivní diskriminaci a senzory selektivní pro určitou skupinu organických látek, např. sacharidy či nukleotidy. Toto jsou dva hlavní cíle senzorové technologie. Dosažené výsledky jsou doposud velmi dílčí. Byly navrženy optody a elektrochemické senzory pro chirální rozpoznání důležitých substrátů. Bylo také popsáno užití chirálních piezoelektrických senzorů. Kolorimetrické enantioselektivní senzory Požadavkem na přípravu enantioselektivních optod je enantioselektivní kolorimetrická odpověď, která byla dosažena pro některé chirální ligandy. Jinou velice atraktivní oblastí chirálních senzorů je určování absolutní konfigurace sacharidů změnou barvy kapalných krystalů cholesterolových esterů s připojenou skupinou fenylboronové kyseliny. Sacharid musí být pro dosažení barevné změny extrahován do organické fáze. Existuje rozdíl v kinetice pro 1,2a 1,3-dioly, který umožňuje rozlišení různých skupin sacharidů. Jiný visuální optický senzor byl popsán Yugi Kubem na základě receptoru, který kombinuje kalixaren s chirálním binaftylovým blokem a chromoforem. Tento systém umožňuje snadné monitorování jednoho z enantiomerů. Rozdíl ve fluorescenci pro sacharidy ve vodném prostředí byl zaznamenán se senzorem založeným na antracenu s připojenou fenylboronovou kyselinou. Enantioselektivní ISE V případě elektrochemické enantiomerní detekce ISE elektroda odpovídá selektivně na jeden enantiomer. První elektrody tohoto typu byly navrženy Prelogem a Simonem pro detekci chirálních forem fenylethylaminu, kde chirálním ligandem byl spirobifluoren-22crown-5. Lipofilní deriváty cyklodextrinu (oktyl) jsou enantiomerně čisté a dostatečně lipofilní, aby mohly být použity pro potenciometrické chirální senzory v PVC membránách s popsanou vysokou enantioselektivitou pro chirální aminy efedrinové serie. Peroktylované α-, β- a γ-cyklodextriny byly použity pro ISE založené na principu monitorování sledovaného analytu na základě jeho velikosti dané velikostí kavity receptoru. Úspěšně byl tento postup použit pro konstrukci ISE selektivních elektrod pro stanovení kationtů různých velikostí. Rozlišení alkoholů různých velikostí bylo dosaženo pomocí stejného principu. Jiným ligandem, který se osvědčil pro ISE, jsou deriváty kalixarenu, často s připojenou fluorescenční signální skupinou. Nedávno byly popsány ISE založené na modifikovaném monensimu. Rozpoznání biologicky významných molekul, jako jsou nukleotidy a aminokyseliny, bylo dosaženo za využití safyrinových derivátů a dalších expandovaných porfyrinů. Rozpoznání složitých organických látek, jako jsou nukleotidy (planární heteroaromatická purinová či pyrimidinová báze, cukr a fosfát), vyžaduje několik prvků uspořádaných ve vhodné orientaci a vzdálenosti v navržené molekule receptoru. Jednou ze skupin je komplementární nukleobáze, připojená ke skupině či makrocyklu schopného selektivně rozpoznávat fosfát. Takový sytém pak dovoluje rozpoznání partnera na základě vodíkových vazeb – 134

partner komplementární nukleobáze a terciární amin či safyrin umožnuje selektivní vazbu fosfátu. Další významnou oblastí pokroku moderní analytické chemie je přechod od jednokomponentní k multikomponentní analýze. V současné době již nestačí přesně a správně stanovit jednu složku systému, obvykle po náročné a nákladné separaci. Moderní trend vede k současné analýze mnoha složek systému, multikomponentní analýze. V této oblasti, kdy preferujeme rychlou informaci (např. on-line monitorování výrobního procesu), se často spokojíme s kvalitativní, případně semikvantitativní analýzou, která dává dostatečnou informaci pro řízení procesu. Jedním z pilířů rozvoje a řešení těchto problémů je senzorová analýza, která pronikla do všech oborů lidské činnosti a v hlavních odvětvích, jako je klinická biochemie nebo analýza např. výfukových plynů, je naprosto převažující metodikou. V současnosti lze obecně říci, že většina analýz, pravděpodobně přes 95 %, se provádí senzorovou analýzou, a pouze několik procent z celkového množství vzorků se analyzuje klasickými metodikami. To jistě naznačuje význam tohoto oboru a především pro pracoviště základního výzkumu by měla představovat jedno z vedoucích zacílení výzkumu. Multikomponentní analýza Je zřejmé, že moderní analytická chemie jako vědecká disciplína se stává multidisciplinárním oborem, kde se spojuje pro vývoj nových metodik biochemie, organické chemie, fyzikální chemie, matematické zpracování dat, chemometrika a supramolekulární chemie, která je klíčová pro návrh nových receptorů pro konstrukci nových senzorových systémů. Zatímco klasická chemická analýza využívá nejvíce selektivních metod, „chemické“ smysly živých organismů (nos a jazyk) pracují poněkud jinak. Jazyk samotný rozeznává pouze 5 elementárních chutí: slanou, kyselou, hořkou, sladkou a „umami“, pojem zavedený Japonci pro chuťovou lahodnost. Výsledná chuť je vnímána jako proporcionální kombinace těchto elementů a uložena do paměti, což víceméně znamená, že je tato kombinace biologickou neuronovou sítí tříděna (příp. kvantifikována) a asociována – přiřazena dalším vjemům. Pokud toto schéma někomu připomene analýzu multivariantních dat popsanou v předešlých dvou dílech tohoto seriálu, nejedná se o žádnou náhodu; analogie mezi biologickou a umělou senzorikou a inteligencí je zde patrná. Podobně jako jazyk funguje i nos a k rozpoznávání např. potravy nejlépe slouží mozkem zpracovaný signál od obou smyslů, doplněný případně analýzou obrazu. Tak zvané elektronické nosy a jazyky dnes patří mezi nejperspektivnější kybernetické měřicí automaty, které nejenom že znásobují přirozené senzorické schopnosti lidí a zvířat, ale rozšiřují je i o jiné, doposud netušené možnosti. Zatímco pro jednosložkovou analýzu je vysoce selektivní (specifický) receptor klíčový pro úspěch stanovení, u multikomponentní kvantitativní a kvalitativní analýzy lze použít poněkud jinou koncepci. Při ní se aplikuje celá řada senzorů s částečnou, ale odlišnou selektivitou vzhledem k různým analytům multikomponentního analyzovaného systému (vzorku). Podobně mohou být použity i analytické metodiky s dvoj- a vícerozměrným signálem odezvy na chemické složení vzorku. Tento signál musí mít různou selektivitu pro různé analyty pro měření při odlišných vstupních parametrech (na různých „kanálech“), např. při různých vlnových délkách elektromagnetického záření (spektrofotometrické metody), různých potenciálech elektrod (voltametrické metody), různých retenčních dobách (chromatografické metody) apod. Z naměřených dat se požadovaná analytická informace extrahuje pomocí matematických metod rozpoznání vzoru (pattern recognition); v případech lineární odezvy senzorů obvykle pomocí analýzy principiálních komponent (PCA), při

135

nelineárních odezvách aplikací vhodného algoritmu neuronové sítě. Pole senzorů různé selektivity (senzor arrays) jsou podstatou tzv. elektronických nosů a jazyků. Metoda rozpoznání vzoru v souboru chemicko-analytických dat je ovšem použitelná jen v případě, že se nevyžadují podrobné údaje o kvantitativním obsahu všech složek v roztoku, ale postačí informace o identitě vzorku (jeho přiřazení určitému vzorovému vzorku), časových změnách v jeho kvalitě (např. kažení mléka), případně nanejvýše jeho hrubé semikvantitativní ohodnocení. Výhodou je nepoměrně rychlejší a lacinější získání požadované informace než v případě klasické analýzy, která vyžaduje u biologických, ale i u jiných materiálů kvalitativní i kvantitativní stanovení desítek různých analytů. To platí již dnes, kdy je tento obor teprve na počátku vývoje. Perspektivně lze očekávat, že se stoupajícím množstvím dostupných senzorů vysoké selektivity bude ekonomická a rychlá senzorová analýza multikomponentních vzorků postupně nahrazovat nákladné laboratorní analýzy ve stále větším množství případů. Nezbytnou podmínkou pro automatizované řízení je dostupnost informací o řízeném systému. Informace, respektive veličina, fyzikální, fyzikálně-chemické nebo čistě chemické povahy je pomocí vhodného senzoru převedena na veličinu, která je lépe zpracovatelná, většinou napětí, a se kterou je schopen pracovat rozhodovací člen automatu. Především na vlastnostech samotného senzoru záleží, jak kvalitní informace budou a jak kvalitní pak bude i vlastní řízení. V těhcto přednáškách se pokoušíme přiblížit dynamicky se rozvíjející svět chemických senzorů a nastínit širokou paletu jejich využití v různých oborech lidské činnosti. Chemická analýza je obecně doménou analytické chemie oboru, na který jsou kladeny veliké nároky co do přesnosti a správnosti poskytovaných údajů. Podle výsledků chemických analýz se určuje prodejní cena mnohých surovin a materiálů či se rozhoduje například o způsobu léčby pacienta. Chyba nebo ne zcela přesný výsledek mohou vést ke značným finančním ztrátám či fatálnímu selhání léčby, které může skončit i pacientovou smrtí. Dalším kritériem je rychlost analýzy. Lékař na operačním sále nemůže čekat hodiny na výsledek rozboru. Skloubit tyto a další požadavky, jakými jsou například nízká cena analýzy, vede k vývoji stále nových analytických technik. Analytické techniky lze rozdělit podle mnoha kritérií. Pro účely tohoto článku použijeme rozdělení na „off-line“ a „on-line“ analýzu. Prvním případem jsou techniky, kdy je odebírán vzorek, který je v laboratoři analyzován a výsledek je předán zadavateli analýzy. Výhodou těchto metod je možnost použití i velice drahé a citlivé instrumentace, která však vyžaduje speciální zacházení a značnou kvalifikaci obsluhujícího personálu. Těmito technikami je možné realizovat i stopové analýzy (ng/kg). Jejich nevýhodou je dlouhá doba potřebná na provedení analýzy, tj. doba od odběru vzorku až k použitelnému výsledku. To činí tyto metody obtížně použitelné pro zařazení do funkce řídícího členu, např. chemického reaktoru apod. Toto použití je doménou „on-line“ technik, která však zpravidla nemají tak nízké detekční limity, zato výsledek je k dispozici takřka okamžitě. Všechny techniky využívající senzory jsou „on-line“ technikami. Historický vývoj vedoucí k elektronickým nosům a jazykům Během posledních přibližně deseti let se velmi moderní analytickou metodikou stávají elektronické nosy a jazyky. Tato zařízení jsou typicky pole senzorů a jsou využívána pro charakterizaci složitých vzorků, zejména pro jejich identifikaci či kategorizaci. Pole senzorů na plyny se pak nazývá elektronický nos a pole senzorů pro kapalnou fázi elektronický jazyk. Zatímco první z nich, elektrické nosy, již nalezly uplatnění při kontrole a řízení průmyslových

136

výrob (především potravinářských), elektronické jazyky se uplatňují především při studiích rozpoznávání chutí. Prvním senzorem, jak je chápeme dnes, byla roku 1906 skleněná pH elektroda. Pohříchu tento nejstarší senzor patří doposud k těm nejlepším. Dalším významným mezníkem byl roku 1956 objev Clarkova čidla na kyslík, které se stalo základem biosenzorů. O tři roky později jsou objeveny piezoelektrické mikrováhy (QCM) a „Taguchi“ senzor (založený na polovodiči z oxidu kovu). Dále roku 1964 bulk acoustic wave pro detekci plyných par. V roce 1966 byl popsán první senzor na glukosu a fluoridová iontově-selektivní elektroda. Sedmdesátá a osmdesátá léta dvacátého století byla svědky rozmachu senzorové techniky, byly objeveny iontově selektivní polem řízené tranzistory (1970), vláknové optické senzory (1970) a senzory typu MOSFET (1975), enzymové FET (1977) a povrchová akustická vlna (SAW, 1979). V roce 1980 byla popsána aplikace BAW v kapalině a v roce 1982 si odbyl svůj debut SPR senzor. Vláknový optický senzor využívající evanescentní vlnu byl publikován roku 1984 a o dva roky později byla BAW aplikována jako imunosenzor pro kapalnou fázi. Vlastnosti senzorů se stále vyvíjí a zároveň jsou aplikovány pro reálné případy, protože nelze zaměňovat demonstraci principu za praktickou aplikaci. Dalším směrem je sdružování senzorů do senzorových polí a následně jejich miniaturizace. Demonstrací je tzv. laboratoř na chipu („lab-on-a-chip“), systém nazvaný micro-Total Analytical System (µTAS). Senzorová pole Vývoj elektronických nosů lze roztřídit do čtyř následně popsaných kategorií. První z nich jsou katalytické senzory a senzory založené na oxidech cínu. Komerčně dostupné Taguchi senzory (TGS) mohou být a jsou široce využívány jako základní prvek v senzorových polích pro rozpoznávání vůní/zápachů. Ta bývají složena z elektricky vyhřívané keramické pelety na které je deponován tenký film oxidu cínatého dopovaný vzácnými kovy. Oxid cínatý je polovodič typu „n“ a absorbuje-li na svůj povrch kyslík, pak z něho vytvoří záporně nabitou částici, jejíž typ závisí na teplotě. To vede ke snížení povrchového potenciálu a donory elektronů v materiálu se stanou kladně nabitými. Pokud přijde do kontaktu s povrchem senzoru oxidovatelná látka, pak se absorbovaný kyslík spotřebuje následnou chemickou reakcí, která zredukuje povrchový potenciál a zvýší vodivost filmu. Poslední vývoj detektorů na bázi oxidu cínatého ukazuje některé jejich výhody oproti starším TGS senzorům, které obecně vyžadují vysokou teplotu a mají velkou spotřebu energie. Tenké vrstvičky SnO lze připravovat technologiemi analogickými k technologiím používaným v elektronice, což vede ke snížení jejich velikosti i snížení spotřeby energie. Další kategorií jsou senzory založené na vodivých polymerech. Vodivé polymery jsou velmi polární materiály pro použití v senzorech pro plyny i kapalnou fázi, polypyrrol a polyanilin jsou nejoblíbenější volbou. Látky pro tvorbu vodivých polymerů mají některé společné vlastnosti zahrnující schopnost tvořit polymer chemickou a elektrochemickou polymerací a schopnost měnit vodivost vlivem oxidace a redukce. Vodivé polymery jsou široce používány pro rozpoznávání vůní/zápachů, protože i) senzory vykazují relativně rychlou adsorbci a desorpci už při pokojové teplotě, ii) senzory mají nízkou spotřebu energie, iii) jejich selektivitu lze ovlivnit modifikací struktury polymeru, iv) jsou relativně odolné vůči kontaminaci a v) jsou velmi citlivé na vlhkost. Senzory založené na akustické vlně jsou třetí skupinou používanou v senzorových polích elektronických jazyků. Jsou realizovány jako výbrus křemenného krystalu (35°15’ vůči rovině krystalu). Typ akustické vlny generovaný v piezoelektrickém materiálu je určen výbrusem krystalu, tloušťkou použitého materiálu a geometrií a konfigurací kovových elektrod pro snímání elektrického pole. Jedním z prvních publikovaných senzorů byl „thickness-shear 137

mode“ senzor (TSM senzor), který, je-li substrátem oxid křemičitý, bývá nazýván QCM či BAW senzor. Typický TSM senzor je na obrázku 4.12. Senzor obsahuje překrývající se kovové elektrody zespoda a zvrchu a běžná tloušťka je 1,56 mm a průměr 12,5 mm. Tento typ může být použit do základní rezonanční frekvence 10 MHz, kdy frekvence je úměrná tloušťce vrstvy. Se vzrůstající tloušťkou deponované vrstvy (například sorpcí na povrchu) rezonanční frekvence klesá, takže signál TSM je závislý na hmotnosti sorbované specie. Kvalitativní změnou v konstrukci TSM senzorů bylo zavedení prokládaných (interdigitated) elektrod pro měření povrchové akustické vlny SAW. Je-li na vysílací straně aplikováno na elektrody střídavé napětí, pak je tento střídavý signál transportován po povrchu senzoru jako Rayleighova vlna. Adsorpce plynů na povrch senzoru vede ke změně hmotnosti a dochází k fázovému posunu střídavého signálu. SAW senzory mohou pracovat na vyšších frekvencích než QMB, což vede k lepší citlivosti.

~ Obrázek 4.12: Typický TSM senzor se zapojením elektrod V průběhu sedmdesátých let vedlo zlepšení polovodičové technologie k vývoji tranzistorů řízených polem typu MOSFET. Jedná se o tranzistory s vysokým vstupním odporem, které umožňují měřit napětí s extrémně malými proudy. V případě FET proud protéká proudovým kanálem a vystupuje z něj na konci, který se nazývá „source“. Na opačném konci je elektroda „drain“. Efektivní elektrický průměr kanálu může být ovlivňován vložením napětí na elektrodu „gate“. Protékající proud je pak úměrný velikosti tohoto vloženého napětí a jeho malá změna vede k velké změně proudu protékajícího mezi „source“ a „drain“. V případě MOSFETů se termální oxidací vytvoří na „gate“ vrstvička SiO2, která izoluje „gate“ od proudového kanálu. FET mohou pracovat s i bez referenční elektrody. Kromě výše jmenovaných principů se v senzorových polích méně často využívají i další techniky. Ion mobility spectrometry je schopna separovat ionty za atmosférického tlaku. Identifikace organických par ve vzduchu zahrnuje nejprve ionizaci molekul a následně jejich pohyb v elektrickém poli. Vlastní analýza je založena na separaci iontů a nikoli na rozdílu jejich hmotností, jak je tomu u hmotnostní spektrometrie. Největší výhoda práce za atmosférického tlaku je možnost zmenšit celé zařízení, nižší požadavky na napájení, nižší hmotnost a v neposlední řadě i jednodušší obsluha. Další techniky hmotnostní spektrometrie se stále vyvíjejí. Dva poslední příspěvky jsou ionizace za atmosferického tlaku (API, atomic presure ionization) a „proton transfer reaction“ (PTR). Obě techniky jsou rychlé, citlivé a specifické a umožňují měření v reálném čase. Navíc nevykazují problémy běžných elektronických nosů, kterými jsou drift a obtížná kalibrace. V případě API-MS probíhá ionizace za atmosférického tlaku, což umožňuje rozdělit rozprašování a ionizaci do dvou separátních kroků. Vzorek je dávkován z kapiláry,

138

která je obklopena zmlžovacím plynem, typicky dusíkem. Kapilára i plyn mohou být ohřáty až na 700 °C. Kombinace zmlžovacího plynu a teploty způsobí přechod vzorku do aerosolu, který je rychle vypařen. Uvnitř je umístěna vybíjecí jehla, která ionizuje molekuly rozpouštědla. Za atmosférického tlaku nastávají v jejím okolí kolize molekul spojené s přenosem náboje a dochází k chemické ionizaci za vzniku plazmatu. Molekuly vzorku mohou být ionizovány přenosem protonu za vzniku (M+H)+ či (M-H). Vliv těkavých organických látek na životní prostředí vede ke vzrůstající potřebě zařízení schopných je detekovat. Jeden z nejslibnějších přístupů využívá hmotnostní detekci spojenou s ionizací přenosem protonu (PTR-MS). Limitem této techniky je použití kvadrupólového separátoru iontů. Zkoumána je možnost jeho nahrazení detektorem „Time-of-Flight“. Rovněž se uplatňují optické a spektroskopické techniky. Nejčastěji jde o aplikaci optických vláken a fluorescenčních měření. V případě elektronických jazyků se uplatňují klasické elektrochemické principy, jako je potenciometrie, amperometrie a voltametrie. Při designu potenciometrických zařízení jsou běžně používány iontově-selektivní a redoxní elektrody, nicméně už byla aplikována i ISFET čidla. Iontově selektivní elektrody byly poprvé použity pro multikomponentní analýzu v roce 1985. Osm senzorů bylo použito pro simultánní stanovení sodných, draselných, vápenatých a hořečnatých kationtů v koncentracích typických pro biologické vzorky, avšak pole nedosahovalo dostatečné odezvy pro sodíkové a hořečnaté ionty. Koncept elektronického nosu a jazyku Elektronický nos je v literatuře definován jako „zařízení zahrnující pole elektrochemických senzorů, které jsou částečně selektivní na složky analytu, a systému pro rozpoznávání vzorů schopného rozpoznávat jednoduché či složené zápachy“. Elektronický jazyk je „multisenzorový systém pro analýzu kapalných vzorků založený na poli senzorů a systému rozpoznávání vzorů“. Nabízí se otázka, jaká je funkce systému pro rozpoznávání vzorů v elektronickém nosu či jazyku. Použije-li se srovnání s lidským čichem, pak lidský nos obsahuje tři hlavní části: receptory čichu, čichové cibulky a mozek, respektive tu jeho část, která je zodpovědná za vyhodnocování čichových vjemů. Jejich ekvivalenty v elektronických nosech jsou senzorové pole, zpracování primárního signálu senzorů a právě systém pro rozpoznávání vzorů. Zpracování dat Rozpoznávání vzorů je rozhodovací vektor použitý ke klasifikaci vzorku založený na sérii jeho měření (vzor). Obecně - matice je tvořena ze vzorů pro různé vzorky a rozhodovacího vektoru, který přiřazuje vzor odpovídající vzorku vzorům z kalibračního experimentu. Úspěch rozpoznávání vzorů je závislý i na předúpravě naměřených dat. Metody rozpoznávání vzorů se dělí na metody se supervizí a bez supervize, ačkoli může být použita i jejich kombinace. Nejdůležitější metodou bez supervize je analýza principiálních komponent (PCA), zatímco nejtypičtějším představitelem metod se supervizí jsou umělé neuronové sítě (AAN). PCA je lineární technika, která redukuje multidimenzionální částečně korelovaná data nejčastěji do dvou či tří dimenzí. Vychází z předpokladu, že velké množství proměnných získané z více měření lze zredukovat do výrazně menšího počtu nových proměnných bez výrazné ztráty informace. Vlastní PCA analýza je pak hledáním setu těchto nových proměnných. Neuronové sítě jsou programy používané k simulování biologických nervových systémů a jsou založeny na simulovaných neuronech, které spojeny dohromady tvoří síť. 139

Analýza dat zahrnuje kalibraci, modelování a vlastní rozpoznávání vzorů. Předzpracování dat zahrnuje i) redukci množství dat a eliminaci dat, která jsou irelevantní pro finální analýzu, ii) potlačení množství dat, která nenesou informaci, a tím zvýšení relativní množství informace v setu dat a iii) transformování dat do formy vhodné pro analýzu. Nejčastější technikou předzpracování dat je normalizace. Ta se nejjednodušeji provádí tak, že nejintenzivnější signál či součet všech signálů se nastavuje na konstantní hodnotu, zpravidla 1 či 100. Komplexnější přístup zahrnuje výpočet kovarianční matice proměnných a extrakci vlastních vektorů a čísel. Výpočet vlastních vektorů a čísel kovarianční matice poskytuje set proměnných, který je lineární kombinací původních proměnných. Aplikace elektronických jazyků Elektronické jazyky se začínají jevit nejen jako užitečná zařízení pro kontrolu kvality v potravinářském průmyslu, ale rýsují se i další aplikace, jako je procesní monitorování či klinická analýza. Avšak stále zůstávají některé nedostatky, které brání jejich snadnému komerčnímu využití. Modelové analýzy Modelové experimenty jsou takové, které nejsou prováděny přímo na vzorcích potravin či nápojů, ale místo toho na jednotlivých složkách, které jsou v nich obsaženy. Popsáno bylo testování organických látek, jako jsou alkoholy, karboxylové kyseliny, aldehydy a terpeny s přídavkem chininu, močoviny a glutamátu. Prezentovaný elektronický jazyk byl schopen rozlišovat chuti jak v roztocích samotných látek tak i v binárních roztocích jejich směsí. Dále bylo na tomto jednoduchém systému odhadnout intenzitu chuti každé z přítomných látek. Zařízení bylo porovnáváno s lidskou chutí pro rozpoznání kávy a nealkoholických nápojů, kdy byla demonstrována korelace. V literatuře je popsán i příruční systém se čtyřmi elektrodami pokrytými tenkým filmem, který byl schopen rozlišit čtyři základní chutě (bez umami). Některé ze vzorků (např. 5mM NaCl a sacharosa) byly dokonce detekovány pod mezí postřehu lidských smyslů a bylo demonstrováno potlačení hořké odezvy chininu přídavkem sacharasy, což koreluje s obecnou zkušeností. Jako metodu rozpoznání vzorů autoři použili PCA. V Japonsku byl zkonstruován elektronický jazyk pro zkoumání potlačení slanosti přídavkem glutamátu a jemu podobných látek a potlačení hořkosti přídavkem cukru. Převodníkem byly lipid/polymerové membrány. Jako metoda rozpoznávání vzorů byla opět použita PCA. Pro rychlou charakterizaci vícesložkových směsí ve vodném prostředí bylo vytvořeno senzorové pole pomocí mikrotechnologie. Umělé chuťové buňky seskupené do chuťových pohárků byly použity pro ukotvení receptorů. Pohárky byly umístěny v poli malých důlků v plátku křemíku. Snímána byla změna barvy jednotlivých důlků. Pro analýzu dat byly použity hodnoty RGB kanálů. Výše uvedené příklady demonstrují schopnost elektronických jazyků rozlišovat. Nicméně je třeba zdůraznit, že tato měření nebyla prováděna na reálných vzorcích, nýbrž na modelových směsích. Senzory použité v těchto aplikacích neměří specificky látky zodpovědné za chuť, především protože nejsou dostatečně citlivé a selektivní. Místo toho mají tendenci poskytovat odezvu na majoritní analyt v kapalné fázi a vedlejší složky ignorovat.

140

Nápoje a potraviny Pomocí elektronických jazyků byly analyzovány nápoje, jako jsou ovocné šťávy, džusy, mléko, minerální vody, káva, čaj a víno z potravin a pak masné výrobky a zelenina. Prezentován byl jazyk založený na voltametrickém principu k analýze ovocných šťáv, nešumivých nápojů a mléka. Voltametrie nabízí výhody, jako jsou vysoká citlivost, univerzálnost, robustnost a schopnost pracovat v různých módech, jako jsou cyklická, nabohacovací či pulzní voltametrie. Potenciometrická měření jsou na druhou stranu založena na přenosu náboje přes fázové rozhraní membrány, což omezuje rozsah detekovatelných specií na nabité částice. Na druhou stranu je voltametrie omezena na specie podléhající redoxní přeměně. Jako rozhodovací metodika byla použita analýza principiálních komponent. Systém byl schopen odlišit pomerančový džus a mléko, pokud džus neobsahoval vlákna dužiny, která se nalepovala na elektrody a měnila výsledky. Sledováno bylo rovněž stárnutí těchto látek. Elektronický jazyk složený z 30 potenciometrických senzorů byl použit pro analýzu minerálních vod, kávy a nealkoholických nápojů. Zařízení bylo schopno rozlišovat mezi přírodní a umělou minerální vodou, mezi jednotlivými druhy kávy a různými nealkoholickými nápoji. Hybridní elektronický jazyk založený na kombinaci potenciometrie, voltametrie a vodivostních senzorů byl použit pro rozlišení šesti druhů kyselých mlék. Potenciometricky měřenými parametry bylo pH, obsah CO2 a chloridových iontů. Voltametrická část zahrnovala šest pracovních elektrod z odlišných kovů (Au, Ir, Pt, Pd, Re a Rh) s chloridostříbrnou elektrodou. Pro rozpoznání vzorů byla aplikována analýza principiálních komponent a analýza neuronovou sítí. Závěr byl, že uvedená mléka se od sebe odlišují. Pole pro analýzu minerálních vod a vín pochází z roku 1999 a skládalo se z 29 senzorů, nicméně pro vlastní analýzu byla použita pouze jeho část. Potencimetrická část zahrnovala různé skleněné elektrody a PVC membránové iontově-selektivní elektrody. Měření bylo provedeno na šesti druzích minerálních vod, pitné vodě z vodovodního řadu a dvaceti druzích vín.

Analýza vody Kvalita pitné vody závisí na původu (povrchová, podzemní) a kvalitě zdroje surové vody a na způsobu jejího zpracování. Rozdíly v kvalitě vody mohou být monitorovány elektronickými jazyky. Multielektrodový systém založený na voltametrické analýze vzorků je schopen celkového odhadu kvality vody založeného na zadaných omezeních. Monitorován byl celý proces počínaje surovou vodou z řeky a konče pitnou vodou odebranou z kohoutku. Jiný elektronický jazyk založený na iontově selektivních elektrodách byl použit na analýzu odpadních vod. Z techniky rozpoznávání vzorů byla aplikována PCA, ANN a „molecular model“, který zahrnoval jak kvalitativní tak kvantitativní parametry znečištění. Odlišným přístupem je aplikace dvou mikrobiálních kmenů na různé substráty. Takto vytvořený biosenzor byl použit pro měření spotřeby kyslíku v přítomnosti potravy pro mikroby. Jako příklady lze uvést použití elektronického nosu v medicíně při diagnostice, kde na základě dechu pacientů je možno rozpoznat choroby způsobující selhání ledvin (urémie). Bylo použito 6 křemenných krystalů (metoda QCM, viz Automatizace 9/03, str. 625) pokrytých aktivní vrstvou obsahující peptidy. Takto byly detekovány deriváty aminu (mono-, dia trimethylamin) a amoniak. Analýzy výsledků klinických testů byly provedeny na základě diskriminační analýzy pomocí programu Statgraphics plus. Elektronické nosy byly použity i při diagnostice cukrovky a plicní rakoviny. 141

4.4. LITERATURA M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král, K. Hlávka: Automatizace 46 (2003), 826. M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král, K. Hlávka: Automatizace 46 (2003), 758. M. Šťastný, M. Hub, M.Kronďák, R. Volf, V. Král, K. Hlávka: Automatizace 46 (2003), 690. M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král, K. Hlávka: Automatizace 46 (2003), 624. M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král, K. Hlávka: Automatizace 46 (2003), 533. M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král: Automatizace 46 (2003), 464. M. Šťastný, M.Kronďák, R. Volf, V. Král: Automatizace 46 (2003), 405.

142