3. METODOLOGI UMUM
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong, dan Laboratorium Pengujian, VEDCA, Cianjur. Penelitian berlangsung dari bulan Desember 2007 sampai dengan April 2009.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan sebagai substrat fermentasi Monascus purpureus adalah beras jenis IR 42 yang diperoleh di sekitar pasar Bogor, Jawa Barat. Kultur mikroba untuk produksi angkak menggunakan enam strain M. purpureus (koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor) yang terdiri dari TOS, AID, JmbA, JmbA5K, JmbA3M, dan dan AS3K. Khamir indigenus yang digunakan adalah 16 strain yaitu lima strain koleksi
Lab.
Ilmu
Hayati
ITB
:
Saccharomyces
cerevisiae,
Schizosaccharomyces, Endomycopsis burtonii, Candida utilis dan
Pichia, 11 strain
koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor: S. cerevisiae Mka, Mkb, Unb, Mk, Imb, Gl, D5a, Mgb, Hm, Dmga, dan Kd. Bahan-bahan kimia yang digunakan meliputi etanol 70%, media Malt Ekstrak Agar (MEA), bacto agar, pati 2%, NaCl 5gr/l, NaOH 1M, HCL 1M, buffer Tris HCl 20 mM (pH 7,0) , akuades, metanol, standar lovastatin, standar sitrinin. 0,1 mol/l NaOH, asetonitril, H 3 PO 4 , etil asetat, bahan-bahan kimia untuk isolasi m. RNA meliputi : TRIzol, kloroform, isopropil alkohol, etanol 75% (perlakuan
DEPC-treated
water)
RNase
free
water
(water
add
diethylpyrocarbonate /DEPC), Stock buffer (200 mM NaCl ; 200 mM Tris-Cl pH 7,5 ; 1,5 mM MgCl ; 2% SDS, buffer TAE, gel agarosa. Alat-alat yang digunakan meliputi autoklaf, High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), laminar air flow, perangkat gel elektroforesis, inkubator shaker, inkubator, pipet mikro, bunsen, ose, oven, neraca analitik, pH meter, vorteks, spektrofotometer, perangkat program densitometer (CS analyzer) sentrifuse, tabung eppendorf, , alat- alat gelas, serta alat-alat lainnya.
35
Metode Penelitian
Penelitian
ini dilaksanakan
dalam 4
tahap seperti terlihat pada
Gambar 3.1, meliputi: 1). Seleksi 16 isolat khamir indigenus untuk mendapatkan khamir amilolitik dan pengamatan kurva pertumbuhan enam strain M. purpureus 2). Produksi angkak oleh M. purpureus ko-kultur dengan khamir indigenus terpilih (khamir amilolitik). Angkak yang dihasilkan kemudian dilakukan analisis intensitas warna, kadar lovastatin dan kadar sitrinin. 3). Analisis intensitas ekspresi gen yang bertanggung jawab pada biosintesis lovastatin dari M. purpureus penghasil lovastatin tertinggi setelah di ko-kultur dengan khamir amilolitik. Tahap ini dilakukan dengan melalui serangkaian analisis meliputi : isolasi total RNA, transkripsi balik menggunakan PCR ( Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction), elektroforesis, dan pengukuran densitas. 4). Mempelajari stabilitas pigmen dan lovastatin angkak oleh pengaruh suhu dan pH.
Seleksi khamir amilolitik indigenus (Naiola, 2008) Seleksi terhadap 16 isolat khamir indigenus untuk mendapatkan khamir yang memiliki aktivitas amilolitik, dilakukan pengujian secara kualitatif. Strain khamir (16 isolat) ditumbuhkan pada cawan petri yang berisi media agar berpati (bacto agar, pati 2%, NaCl 5gr/l), kemudian diinkubasi ± 36 jam pada suhu 30ºC. Cawan petri yang sudah ditumbuhi khamir ditetesi lugol. Isolat yang menunjukkan zona bening, mengindikasikan sebagai isolat khamir amilolitik. Khamir amilolitik terpilih akan digunakan sebagai ko-kultur pada tahap prod uksi angkak oleh M. purpureus.
36
Seleksi khamir amilolitik
16 strain khamir indigenus
Khamir amilolitik terpilih
Fermentasi angkak oleh 6 strain M. purpureus indigenus (Mp) ko-kultur dengan khamir amilolitik • •
Konsentrasi khamir : 103, 104, 105cfu/ml Waktu penambahan khamir : hari ke 2, 4, 6 fermentasi
• • •
Analisis intensitas pigmen merah, kuning, jingga Analisis kadar lovastatin Analisis kadar sitrinin
Produksi angkak
Analisis intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin
Analisis stabilitas pigmen dan lovastatin oleh pengaruh suhu dan pH
(Isolasi total RNA, RTPCR, elektroforesis)
Gambar 3.1 Diagram alir penelitian
37
Produksi Angkak oleh M. purpureus Ko-kultur dengan Khamir Amilolitik Persiapan Starter Monascus purpureus Tahap awal persiapan starter Monascus purpureus adalah pembuatan suspensi M. purpureus dari 6 strain yang digunakan yaitu TOS, JMBA 5K, AID dan JMBA 3M, JmbA dan AS3K. Akuades steril sebanyak 2,5 mL dimasukkan ke dalam masing-masing biakan agar miring M. purpureus yang berumur 14 hari, kemudian dilakukan penggoresan sampai biakan terlepas sehingga diperoleh suspensi biakan M. purpureus . Untuk membuat starter, sebanyak 25 g beras dalam cawan petri disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah disterilisasi, beras didinginkan sampai suhu ± 36 °C. Beras kemudian diinokulasi dengan suspensi M. purpureus sebanyak 2,5 mL dan diaduk merata menggunakan pengaduk steril. Selanjutnya diinkubasi pada suhu (27-32) °C selama 14 hari. Setelah berumur 14 hari atau lebih, siap digunakan sebagai starter untuk produksi angkak. Angkak kemudian dikeringkan sampai kadar air 5%. Persiapan Inokulum Khamir Amilolitik
Biakan agar miring khamir amilolitik terseleksi berumur 48 jam, ditambahkan 2,5 ml akuades steril, kemudian dilakukan penggoresan sampai biakan terlepas sehingga diperoleh suspensi biakan khamir amilolitik. Tahap berikutnya dilakukan penghitungan total koloni khamir (umumnya sekitar 106 cfu/ml), kemudian untuk membuat inokulum 105 cfu/ml, diencerkan dengan menambahkan 10 ml akuades steril. Pembuatan 104 cfu/ml inokulum dengan menambahkan 100 ml akuades steril, dan untuk 103 cfu/ml dengan menambahkan 1000 ml akuades steril.
Produksi Angkak Ko-kultur M. purpureus dengan Khamir Amilolitik Beras suhu 121°C
sebanyak
100 gr
selama 15 menit,
dalam erlemeyer 500 ml, disterilisasi pada kemudian
didinginkan.
Enam starter
M. purpureus (107cfu/g) masing-masing ditambahkan ke dalam beras sebanyak
38
±10% b/b, kemudian diaduk sampai merata dan diinkubasi selama 14 hari. Pada hari ke 2, 4 dan 6 ditambahkan kultur khamir indigenus yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan konsentrasi yang divariasikan : 103, 104, 105 cfu/ml sebanyak 1 ml. Setelah 14 hari, angkak dipanen dan dikeringkan pada suhu ± 60˚C sampai mencapai kadar air ± 5%. Angkak yang sudah kering disimpan sebagai stok sampel untuk kebutuhan analisis.
Analisis Analisis yang dilakukan pada angkak hasil ko-kultur meliput i : intensitas pigmen merah, kuning dan jingga, kadar lovastatin, kadar sitrinin, intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin, stabilitas pigmen dan lovastatin oleh pengaruh suhu dan pH
39
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2001. Lovastatin. Wikipedia, the free encyclopedia Astuti, S., (2004), Seleksi Isolat Monascus purpureus Penghasil Lovastatin dan Analisis Kadarnya, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), IPB, Bogor
Blanc P.J. et al. 1994. Pigment of Monascus. J. Food Sci 59:862-865
Carels, M. dan D. sherpherd. 1977. The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation of Monascus species in submerged shaken culture. Can. J. Microbiol. 23: 1360-1372 Chul S. Shin *, Hyung J. Kim, Moon J. Kim, Jae Y. Ju .1998. Morphological change and enhanced pigment production of Monascus when cocultured with Saccharomyces
cerevisiae
or
Aspergillus
oryzae.
Department
of
Biotechnology, College of Engineering and Bioproducts Research Center, Yonsei University, Sodaemun-ku, Seoul 120-749, Korea Couch, R.D. and Gaucher, G.M., Rational elimination of Aspergillus terreus sulochrin production. J Biotechnol 2004, 108(2):171-178. Deanne, 1994, Produksi Pigmen Angkak oleh Monascus purpureus Pada Campuran Limbah cair tahu, Ampas Tahu dan Dedak, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor Dieter Wild, Gabor Toth, and Hans-Ulrich Humpf, 2002, New Monascus Metabolite Isolated from Red Yeast Rice (Angkak, Red Koji), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50, (3999-4002)
34
Dieter Wild, Gabor Toth, and Hans-Ulrich Humpf, 2003, New Monascus Metabolite with a Pyridine Structure in Red Fermented Rice, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, (5493-5496)
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. Bogor
Fauzi D. B., 1995, Toksisitas dan Imunogenitas Pigmen Angkak Yang Diproduksi Dari Kapang Monascus purpureus Pada Substrat Limbah Cair Tapioka Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor Hassan Hajjaj, Alain Klaebe, Gerard Goma, Philippe J. Blanc, Estelle Barbier, and Jean Francois. 1999. Biosynthetic
Pathway
Fungus Monascus ruber as Revealed by
13
of Citrinin in Filamentous
C Nuclear Magnetic Resonance.
Journal of Applied and Environmental Microbiology, January 1999, Vol.65, No.1, p.311-314 Hassan Hajjaj, Alain Klaebe, Gerard Goma, Philippe J. Blanc, Estelle Barbier, and Jean Francois. 2000. Medium-Chain Fatty Acids Effect Citrinin Production in the Filamentous Fungus Monascus ruber. Journal of Applied and Environmental Microbiology March 2000, Vol.66, No.3, p.1120-1125
Hau Yin Chung, Wing Chi Joyce Ma, Joo-Shin Kim, and Feng Chen, Odor-Active Headspace Components in Fermented Red Rice in the Presence of a Monascus Species, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, (6557-6563)
Heeyong Jung, Chulyoung Kim, Kun Kim, and Chul Soo Shin, Color Characteristics of Monascus Pigment with Various Amino Acids, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, (1302-1306)
35
Hesseltine, C.W. 1965. A millennium of fungi, food and fermentation. Mycologia. 57: 149-159
Ing-Kae Wang, Shoei- Yn Lin-Shiau, Ping-Chung Chen, and Jen-Kun Lin, 2000, Hypotriglyceridmic Effect of Anka ( a Fermented Rice Product of Monascus sp) in Rats, Journal Agric. Food , 2000, 48 (3183-3189)
Jiyuan Ma, Yongguo Li, Qing Ye, Jing Li, Yanjun Hua, Dajun Ju, Decheng Zhang, Raymond Cooper, and Michael Chang, 2000, Constituents of Red Yeast Rice, a Traditional Chinese Food and Medicine, Journal Agric. Food , 2000, 48 (5220-5225)
Jonathan Kennedy, Karine Auclair, Steven G. Kendrew, Cheonseok Park, John C. Vederas, C. Richard Hutchinson .1999. Modulation of Polyketide Synthase Activity
by
Accessory
Proteins
During
Lovastatin
Biosynthesis.
Science21May1999:Vol.284.no.5418,pp.1368-1372
Judoamidjojo M, Abdul AD, Endang GS. 1992. Teknologi Fermentasi, Jakarta, Rajawali Pers
Juzlova, P.T. Rezanka, L. Martinkova, and V. Kren, 1996, Long-Chain Fatty Acids From Monascus purpureus, Phytochemistry, vol. 43, No. 1, pp. 151-153 Jyh-Jye Wang and Tsu-Ming Pan,2003, Effect of Red Mold Rice Supplements on Serum and Egg Yolk Cholesterol Levels of Laying Hens, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, (4824-4829) Ma, J., Y. Li, Q.Y. Ye, J. Li, Y. Hua, D. Ju, D. Zhang, R. Cooper and M. hang. 2000. Constituents of Red Yeast Rice, A Traditional Chinese Food and Medicine. J. Agric. Food. Chem. 48: 5220-5225.
36
Mauliany, T, 2004, Analisis pigmen dan lovastatin Monascus purpureus Jmba pada fermentasi padat beras merah (Bah Butong dan BP 1804_1F_9), Program Studi Biokimia, Departemen Kimia FMIPA, IPB, Bogor
Mitrajanty K. D., 1994, Pengaruh Faktor Fisik dan Kimia Terhadap Mutu Pigmen Angkak Serta Stabilitasnya Selama penyimpanan Dalam Beberapa Jenis Kemasan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor Miyake, T., Ohno, S. Sakai, S. 1984. Process for the Production of Monascus pigment. US.Pat.4442 209
Omotainse S.O., Anosa V.O. , 1995, Leucocyte and Thrombocyte Responses in Dogs Experimentally Infected with Trypanosoma brucei, Revue Elev.Med. Vet. Pays trop., 1995, 48(3): 254-258
Po-Shiuan Hsieh and Yueh-Hua Tai, 2003, Aquaeous Extract of Monascus purpureus M9011 Prevents and Reverses Fructose-Induced Hypertension in Rats, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, (3945-3950)
Prabawati E. K., 2005, Potensi Sari Buah Jambu Biji Untuk Meningkatkan Jumlah Trombosit Darah, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, institut Pertanian Bogor
Rachman, A. !989. Teknologi Fermentasi. Pusat Antar Universitas Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. Bogor
Ridawati, (1993), Produksi Pigmen oleh Monascus purpureus BC 88202 Pada Media Campuran Limbah Cair Tapioka Ampas Tapioka dan Ampas Tahu, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor
37
Rombe, A., (2005), Kemampuan Angkak Dalam Meningkatkan Jumlah Trombosit Tikus Putih Sprague Dawley, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), IPB, Bogor
Russell J. Cox, 2000, Biosynthesis, Annu.Rep. Prog. Chem., Sect. B, 2000, 96, ( 231-258 )
San-Lang Wang, Wei-Jen Hsiao, and Wen-Teish Chang, 2002, Purification and Characterization of an Antimicrobial Chitinase Extracellularly Produced by Monascus purpureus CCRC31499 in a Shrimp and Crab Shell Powder Medium, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50, (2249-2255) Schmitt M., and Blanc P. 2001. Microbial Biotechnology Part 2. Innovative Aspects in Biotechnology of Eukaryotes. Investpress Co., Sofia
Soedarmo, S.S.P., 1988, Demam Berdarah (Dengue) Pada Anak, Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press)
Steinkraus K.H., 1983. Handbook of Indigenous Fermented Foods. Marcel Dekker, Inc
Yuan, C.S. 1980. Fermentative Production of Anka Pigments. Di dalam: Proceeding of the Oriental Fermented Foods. Bangkok. Thailand.
38
