16
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Agustus 2011, bertempat di PT Z, Jakarta Utara, Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan (BPMPHPK) DKI Jakarta, dan Laboratorium Mikrobiologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia.
3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging ikan tuna segar (Thunnus sp) pada bagian ekor dan perut, yang ditangani sesuai dengan penanganan bahan baku perusahaan terkait (Lampiran 1). Bahan untuk membawa ikan tuna dari PT Z ke laboratorium adalah sterofoam, selotip putih, dan plastik polypropylene steril. Bahan untuk pengujian kadar histamin meliputi metanol,
glass wool, HCl 1 N, NaOH 1 N, HCl 0,1 N, orto-ptalatdikarbosildehid (OPT) 0,1%, H3PO4 3,57 N, resin penukar ion, dan histamin dihidroklorida. Pengujian total volatile base (TVB) membutuhkan bahan berupa asam perklorat 6%, NaOH 20%, H3BO4 3%, HCl 0,02 N. Pengujian angka lempeng total (ALT) membutuhkan plate count agar dan larutan butterfield’s phosphate buffered. Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin membutuhkan larutan butterfield’s phosphate buffered dan larutan agar Niven yang terdiri dari: 0,1% trypton, 0,2% yeast exstract, 1,8% L-histidin, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 2,5% agar, dan 0,003% phenol red. Isolasi bakteri membutuhkan bahan berupa media Niven, Trypticase Soy Agar (TSA) dan Trypticase Soy Broth Histidine (TSBH). Karakterisasi bakteri, yakni pewarnaan Gram membutuhkan kristal violet, iodin, safranin, minyak imersi, alkohol 95%; Uji motilitas membutuhkan agar semi solid; Uji oksidase membutuhkan kertas oxidase test strip; Uji katalase membutuhkan 3% H2O2. Identifikasi bakteri membutuhkan API kit 20 E dan API kit 20 NE beserta reagen. Alat penyimpanan sampel pada suhu 4-5 ºC berupa lemari pendingin dengan temperature display bermerk Vwr Refrigerator Chrom 45.5CF VCR445D dengan rentang suhu 1 ºC - 8 ºC, dengan setting suhu 4 ºC - 5 ºC, sedangkan alat
17
penyimpanan sampel pada suhu -2-1 ºC
berupa lemari pendingin dengan
temperature display bermerk Vwr/ Shel lab 5216 dengan rentang suhu -60 ºC - 8 ºC, dengan setting suhu -2 ºC - 1 ºC. Alat yang dibutuhkan untuk pengujian kadar histamin adalah kolom resin dan instrumen spektroflorometer Cary Eclipse FLO811M007 detektor floresens dan waterbath. Alat yang dibutuhkan untuk pengujian TVB adalah alat destilasi uap dan timbangan analitik dengan ketelitian 10-4 gram. Alat pengujian ALT dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin yang dibutuhkan adalah timbangan analitik, homogenizer, cawan petri, inkubator, alat penghitung koloni (acolyte) serta pH meter. Isolasi bakteri membutuhkan pipet 0,1 ml, cawan petri, dan inkubator. Alat yang dibutuhkan untuk karakterisasi bakteri adalah kaca objek dan mikroskop cahaya merek Olympus untuk pengamatan morfologi koloni dan bentuk sel; pewarnaan Gram membutuhkan mikroskop cahaya; uji motilitas membutuhkan inkubator; uji oksidase membutuhkan ose dan stopwatch; uji katalase membutuhkan ose dan pipet tetes. Identifikasi bakteri membutuhkan alat berupa inkubator, nephelometer, dan apiwebTM identification software (Ref. 40 011).
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, yaitu: (1) preparasi sampel; (2) penyimpanan sampel; (3) analisis kimia dan mikrobiologi, yakni analisis kadar histamin, analisis kadar Total Volatile Base (TVB), analisis Angka Lempeng Total (ALT), dan bakteri pembentuk histamin (BPH); serta (4) isolasi, karakterisasi, dan identifikasi bakteri. 3.3.1 Preparasi sampel Sampel merupakan daging ikan tuna (Thunnus sp) segar yang diperoleh dari PT Z. Daging tuna yang digunakan meliputi daging bagian ekor dan perut (Frank et al. 1981). Pengkodean sampel dilakukan dengan memberikan tanda sesuai dengan ketentuan yang ditunjukkan pada Gambar 3. Teknik preparasi yang dilakukan meliputi penerimaan, pencucian, penyimpanan sementara, pemotongan kepala dan sirip, serta pembentukan loin (Lampiran 1). Teknik tersebut mengacu pada SNI 01-4104.3-2006 tentang tuna loin beku (BSN 2006b). Daging tuna yang digunakan meliputi daging bagian ekor
18
dan perut dari produk tuna loin, dengan daging pada bagian perut yang tidak dilakukan proses pemotongan (Frank et al. 1981). Hal tersebut dilakukan karena PT Z melakukan proses pemisahan pada penjualan loin dan daging perut. Proses preparasi sampel dilakukan dengan memperhatikan sanitasi peralatan dan higienitas manusia (BSN 2006a), yang dilakukan oleh pihak PT Z.
Perut
Ekor
Gambar 3 Lokasi bagian daging yang digunakan dalam penelitian. Seluruh sampel selanjutnya dibawa dengan segera dari PT Z ke laboratorium menggunakan sterofoam dengan lama perjalanan 10 menit. Selama transportasi, sampel dalam sterofoam diberikan es curai mengacu kepada Widiastuti (2008). 3.3.2 Penyimpanan sampel Sampel yang diperoleh dari perusahaan, ditimbang dan dicacah hingga halus. Namun, sampel analisis mikrobiologi tidak dicacah. Proses tersebut dilakukan dengan memperhatikan higienitas dan sanitasi, yakni selalu menggunakan api bunsen, alkohol, masker, dan sarung tangan. Sampel kemudian dibungkus dengan plastik polypropylene steril. Sampel selanjutnya disimpan dalam ruang pendingin (BSN 2006a). Suhu ruang penyimpanan yang digunakan adalah -2-1 ºC untuk penyimpanan suhu -2-1 ºC , mengacu ketentuan EC (2004) dan Dalgaard (2008) serta 4-5 ºC untuk penyimpanan suhu 4-5 ºC , mengacu ketentuan FDA (2001). Lama penyimpanan sampel dilakukan selama 0, 2, dan 7 hari berdasarkan FDA (2009) dan ketentuan PT Z. 3.3.3 Analisis kimia dan mikrobiologi Tingkat kemunduran mutu sampel diketahui dengan melakukan analisis kimia
dan mikrobiologi, yang meliputi
analisis kadar histamin
(SNI
2354.10:2009), analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009),
19
analisis Angka Lempeng Total (ALT) (SNI 01-2332.3-2006) dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (BPH) (modifikasi Niven et al. 1981). Analisis tersebut dilakukan dengan pengulangan sebanyak tiga kali dan duplo. Model tabel analisis penelitian dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Model tabel data analisis Lama penyimpanan
Lokasi daging Perut 4-5
Ekor Suhu penyimpanan (°C) -2-1 4-5
-2-1
0 hari 2 hari 7 hari
3.3.4 Isolasi, karakterisasi, dan identifikasi bakteri Jenis bakteri yang berperan dalam memproduksi histamin diketahui dengan isolasi bakteri (Hwang et al. 2010), karakterisasi bakteri yang terdiri dari uji morfologi koloni, morfologi sel, yakni bentuk sel, pewarnaan Gram, uji motilitas, uji oksidase, uji katalase (Tiwari et al. 2009), dan identifikasi bakteri (bioMérieux 2006a; bioMérieux 2006b). 3.4 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok (RAK) faktorial. Penggunaan RAK faktorial disebabkan karena sampel yang digunakan pada setiap ulangan berasal dari ikan tuna dari hasil tangkapan yang berbeda. RAK faktorial sangat baik digunakan jika keheterogenan unit percobaan berasal dari satu sumber keragaman (Mattjik & Sumertajaya 2002), dalam hal ini adalah tuna pada masing-masing ulangan. Faktor yang digunakan meliputi lokasi daging, suhu penyimpanan dan lama penyimpanan. Lokasi daging terdiri dari ekor dan perut. Suhu penyimpanan adalah -2-1 ºC dan 4-5 ºC, serta lama penyimpanan adalah 0, 2, dan 7 hari. Pengujian dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali. Model untuk RAK faktorial adalah (Steel & Torrie 1983)
20
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + þk + εijk Keterangan: Y jk : hasil pengamatan untuk faktor A taraf ke- i, faktor B taraf ke- j pada kelompok ke- k μ : nilai tengah populasi αi : pengaruh faktor A pada taraf ke- i βj : pengaruh faktor B pada taraf ke- j (αβ)ij : pengaruh interaksi AB pada taraf ke-i (dari faktor A), dan taraf ke-j (dari faktor B ) þk : pengaruh taraf ke k dari faktor kelompok εijk : pengaruh acak (galat percobaan) pada taraf ke-i (faktor A), taraf ke-j (faktor B), interaksi AB yang ke- i dan ke- j
Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis ragam dengan bantuan program SAS 9.1. Bila hasil perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilakukan uji lanjut Duncan untuk mengetahui perlakuan yang memberikan perbedaan yang nyata terhadap respon yang dianalisis. Model uji Duncan adalah sebagai berikut. Se = √(KTG/n) Keterangan: Se : uji Duncan KTG : KT galat : jumlah sampel n
3.5 Prosedur Pengujian Sampel Prosedur kerja analisis dalam pengujian sampel pada penelitian ini, terdiri dari analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Angka Lempeng Total (ALT), analisis jumlah bakteri pembentuk histamin, isolasi, karakterisasi, dan identifikasi bakteri. 3.5.1 Analisis kadar histamin (SNI 2354.10:2009) Analisis
kadar
histamin
dilakukan
dengan
menggunakan
spektroflorometri, yang didasarkan pada pengukuran fluorosensi. Prinsip metode tersebut adalah histamin diekstrak dari jaringan daging sampel (BSN 2009 a). Prosedur analisis kadar histamin, yakni sampel diblender hingga homogen, kemudian ditimbang sebanyak 10±0,1 gram dalam beaker glass 250 ml dan ditambahkan 50 ml metanol. Sampel dalam keadaan tertutup dipanaskan di dalam waterbath selama 15 menit pada suhu 60 ºC dan didinginkan dalam suhu kamar. Sampel tersebut dituang ke dalam labu takar 100 ml dan tepatkan hingga tanda tera dengan metanol. Setelah itu dilakukan penyaringan menggunakan kertas
21
saring dan filtrat ditampung dalam botol contoh. Filtrat dapat disimpan dalam refrigerator. Glass wool yang telah diberi aquades dimasukkan ke dalam kolom resin setinggi 1,5 cm. Resin netral dalam medium air dimasukkan ke kolom resin setinggi 8 cm dengan volume air di atas resin setinggi 1 cm. Labu takar 50 ml yang berisi 5 ml HCl 1 N diletakkan di bawah kolom resin untuk menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin. Filtrat contoh sebanyak 1 ml dipipet ke dalam kolom resin, kran kolom resin dalam posisi terbuka dan hasil elusi dibiarkan menetes lalu ditampung dalam labu takar 50 ml. Aquades ditambahkan pada saat tinggi cairan 1 cm di atas resin dan cairan dibiarkan terelusi. Prosedur tersebut diulangi hingga hasil elusi dalam labu takar tepat 50 ml. Hasil elusi dapat disimpan dalam refrigerator. Tiga tabung reaksi 50 ml disiapkan untuk sampel, standar, dan blanko. Filtrat sampel, larutan standar kerja, dan blanko (HCl 0,1 N) dipipet masingmasing sebanyak 5 ml. Ke dalam tabung reaksi tersebut berturut-turut ditambahkan 10 ml HCl 0,1 N dan diaduk; 3 ml NaOH 1 N dan diaduk, kemudian didiamkan selama 5 menit; 1 ml OPT 0,1% lalu diaduk dan didiamkan selama 4 menit; 3 ml H3PO4 3,57 N dan diaduk. Pengukuran flourescene dilakukan terhadap sampel, standar, dan blanko sesegera
mungkin dengan
alat
spektroflorometri pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan emisi 444 nm dalam waktu 90 menit. y = a + bx Keterangan: : fluoresensi contoh y a : intersep b : kemiringan x : konsentrasi contoh
Konsentrasi histamin (µg/g) = x . (volume akhir (ml). faktor pengenceran) gram sampel 3.5.2 Analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009) Total volatile base (TVB) merupakan jumlah basa nitrogen yang mudah menguap. Analisis ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prinsip analisis TVB adalah
22
sampel diekstraksi menggunakan larutan asam perklorat (HClO4) 6%. Ekstrak dibasakan dengan penambahan larutan NaOH 20% kemudian didestilasi uap, destilat ditampung dalam larutan H3BO3 3%. Konsentrasi TVB-N dalam destilat ditentukan dengan cara titrasi menggunakan larutan HCl 0,02 N (BSN 2009b). Analisis kadar TVB dilakukan dengan tahapan ekstraksi, destilasi, titrasi, dan perhitungan kadar TVB. Sampel ditimbang sebanyak 10 gram ± 0,1 gram dengan menggunakan beaker glass. Ke dalam sampel ditambahkan 90 ml asam perklorat (PCA) 6%, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer selama 2 menit dan disaring dengan kertas saring kasar. Ekstrak dapat disimpan paling lama satu minggu pada suhu 2 ºC – 6 ºC. Ekstrak sebanyak 50 ml dimasukkan ke dalam tabung destilasi dan ditambahkan dengan 3 tetes indikator fenolftalein. Tabung destilasi dipasang pada peralatan destilasi uap dan ditambahkan 10 ml NaOH 20% (pada tahap ini campuran berwarna merah). Penampung erlenmeyer berisi 100 ml H3BO4 3% dan 3-5 tetes indikator tashiro disiapkan (larutan berwarna ungu). Destilasi uap dilakukan selama 10 menit hingga mempeoleh destilat 100 ml, sehingga terdapat volume akhir sebanyak 200 ml larutan berwarna hijau. Destilasi larutan blanko sama dengan sampel, tetapi mengganti ekstrak contoh dengan 50 ml PCA 6%. Titrasi destilat contoh dan blanko dilakukan dengan menggunakan larutan HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan terbentuknya kembali warna ungu pada cairan yang sama dengan warna blanko yang telah didestilasi. Kadar TVB-N (mg/100g) =
Keterangan: Ar N
: 14.007
Faktor pengenceran : 2
3.5.3 Analisis Angka Lempeng Total (ALT) (SNI 01-2332.3-2006) Angka lempeng total merupakan jumlah mikroorganisme hidup yang membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah total bakteri aerob pada sampel. Prinsip kerja analisis ALT adalah pertumbuhan mikroorganisme setelah contoh diinkubasi
23
dalam media agar pada suhu 35 ºC selama 48 jam, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung (BSN 2006c). Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan 225 ml larutan butterfield’s phospate buffered, kemudian dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dengan menggunakan pipet steril, diambil 1 ml homogenat dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan butterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali, kemudian dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-3, 10-4, 10-5, dan seterusnya sesuai kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan tuang (pour plate method), dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Ke dalam masingmasing cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate Count Agar (PCA) yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 ºC. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 ºC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang ada di dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni. Jumlah koloni yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 25-250 koloni. 3.5.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (modifikasi Niven et al. 1981) Analisis bakteri pembentuk histamin dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri yang berperan dalam pembentukan histamin. Prinsip dari analisis bakteri pembentuk histamin adalah Enterobactericeae akan mengubah histidin menjadi histamin melalui proses dekarboksilasi yang akan menaikkan pH dan mengubah warna pada media (Niven et al. 1981). Media modifikasi Niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan 0,1% trypton, 0,2% yeast extract, 1,8% L-histidin, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 2,5% agar, dan 0,003% phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diencerkan menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan
24
hingga mendidih dan diatur pH 6 kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml larutan butterfield’s phospate buffered steril, kemudian diblender hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dari campuran tersebut kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan butterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2, kemudian dikocok hingga homogen. Pengenceran dilakukan hingga 10-4. Satu ml larutan sampel di setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media Niven bersuhu 45 ºC dituangkan ke dalam cawan berisi sampel. Setelah media Niven memadat, cawan petri dimasukkan dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 ºC. Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah koloni dengan pink halo hingga purpe halo yang merupakan koloni bakteri pembentuk histamin. 3.5.5 Isolasi bakteri (modifikasi Niven et al. 1981; Kung et al. 2009; Hwang et al. 2010) Isolasi dan pemurnian bakteri bertujuan memperoleh isolat bakteri murni dari sampel, sehingga dapat dilakukan karakterisasi dan identifikasi bakteri yang diperoleh. Isolasi bakteri yang dilakukan menggunakan metode gores kuadran, yaitu menggoreskan larutan sampel beberapa kali menggunakan lup inokulasi di permukaan media kultur. Larutan sampel dari setiap pengenceran untuk analisis jumlah bakteri pembentuk histamin atau ALT dipipet sebanyak 0,1 ml dan dituang ke media Niven lalu diinkubasi selama 4 hari pada suhu 35 ºC. Koloni berwarna biru atau ungu digoreskan pada media trypticase soy agar (TSA) untuk memperoleh kultur murni. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Isolat bakteri dikatakan murni jika diperoleh bentuk sel dan morfologi koloni yang seragam. 3.5.6 Karakterisasi bakteri (Tiwari et al. 2009) Karakterisasi bakteri meliputi pengujian terhadap morfologi koloni dan sel bakteri serta sifat fisiologis isolat murni yang diperoleh. Sebelum karakterisasi bakteri dilakukan, penting dilakukan pengujian kemampuan bakteri menghasilkan
25
histamin. Pengujian tersebut bertujuan untuk meyakinkan bahwa isolat bakteri yang dimiliki merupakan BPH. Kultur murni ditumbuhkan dalam 10 ml trypticase soy broth (TSB) yang ditambahkan 1% L-histidin atau disebut sebagai media trypticase soy broth histidine (TSBH), kemudian diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 24 jam. Biakan tersebut digunakan untuk pengujian kadar histamin yang dihasilkan bakteri sesuai BSN (2009a). 3.5.6.1 Morfologi koloni Pengamatan morfologi koloni bertujuan mengetahui bentuk koloni dari atas, bentuk tepi, bentuk elevasi, dan warna koloni secara visual (Lampiran 2). 3.5.6.2 Morfologi sel (Tiwari et al. 2009) Pengamatan morfologi sel meliputi pewarnaan gram dan uji motilitas. Pewarnaan
gram
merupakan
metode
yang
sangat
bermanfaat
untuk
mengidentifikasi bakteri berdasarkan perbedaan warna karena perbedaan komposisi kimia dan fisika dinding sel bakteri. Pewarnaan gram diawali dengan mengolesi inokulum yang berumur 24 jam pada kaca objek dan difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek ditetesi larutan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Larutan kristal violet dibuang dengan memiringkan kaca objek dan dibilas dengan aquades lalu dikeringkan dengan tisu. Selanjutnya kaca objek digenangi dengan larutan iodin selama 1 menit dan dibilas dengan alkohol 95% selama 15 detik, kemudian ditetesi dengan safranin selama 45 detik dan dibilas dengan aquades serta dikeringkan dengan tisu. Saat pengamatan dengan mikroskop, kaca objek ditetesi minyak imersi. Mikroskop di-setting memiliki perbesaran lensa objek 100 kali dan perbesaran lensa okuler 10 kali. Bila terbentuk warna merah muda, menandakan bakteri Gram negatif, sedangkan bila terbentuk warna ungu, menandakan bakteri Gram positif. Bentuk sel dari preparat bakteri juga dapat diamati melalui pewarnaan gram. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Sel bakteri yang berbentuk silindris atau batang dinamakan basilus. Bakteri berbentuk spiral atau spirilum terurtama dijumpai sebagai individu sel yang tidak saling melekat (Pelczar dan Chan 1986) (Lampiran 3).
26
Uji motilitas dilakukan dengan cara menusukkan isolat bakteri ke dalam media semisolid agar dengan jarum ose tusuk steril, kemudian diinkubasi selama semalam pada suhu 37 ºC. Bila pertumbuhan bakteri menyebar, maka bakteri tersebut motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar atau hanya berupa segaris mengikuti arah tusukan, maka bakteri non motil. 3.5.6.3 Uji sifat fisiologis (Tiwari et al. 2009) Uji sifat fisiologis meliputi uji oksidase dan uji katalase. Sebanyak satu ose koloni bakteri digoreskan pada kertas Oxidase Test Strip untuk pengujian oksidase. Perubahan warna yang terjadi pada tes strip diamati setelah 10-15 detik. Bila terjadi perubahan warna menjadi biru violet menandakan oksidase positif dan bakteri termasuk bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna menandakan oksidase negatif dan bakteri termasuk bakteri enterik. Uji katalase dilakukan dengan cara satu ose koloni bakteri dioleskan pada kaca objek kering dan diteteskan 2-3 tetes 3% H2O2. Bila terbentuk gelembung udara, maka bakteri dinyatakan katalase positif. Bakteri aerob memberikan reaksi positif, sebaliknya pada bakteri anaerob. 3.5.7 Identifikasi bakteri (bioMérieux 2006) Identifikasi bakteri dilakukan dengan menggunakan analytical profile index (API). API terdiri dari beberapa jenis dan bersifat spesifik terhadap karakteristik bakteri yang akan diidentifikasi. Skema pemilihan API untuk bakteri Gram negatif, berbentuk batang dan tidak rewel (non fastidious) dapat dilihat pada Gambar 4. Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase positif dilakukan menggunakan API kit 20 NE dengan tahapan sebagai berikut (bioMérieux 2006a). 1. Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu selama 18-24 jam. 2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85%) sebanyak 6
ml
dan dihomogenisasi, kemudian kekeruhan larutan diukur
menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland.
27
3. Sebanyak 0,2 ml larutan bakteri murni dihomogenkan dengan media API AUX. 4. Larutan media tersebut dipipet ke dalam cupules (sumur) API 20 NE menggunakan jarum suntik. 5. Cupules yangbertanda
dipipet hingga penuh, yakni cupules GLU, ARA,
MNE, MAN, NAG, MAL,GNT, CAP, ADI, MLT, CIT, dan PAC. 6. Cupules NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, dan PNPG dipipet hanya sampai setengah bagian cupules. 7. Cupules GLU, ADH, dan URE ditambahkan dengan minyak mineral. 8. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 24±2 jam pada suhu 29±2 ºC. 9. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada cupules TRP dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen Nit 1 dan Nit 2 ditambahkan pada cupules NO3. 10. Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam software API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil. Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase negatif dilakukan menggunakan API kit 20 E dengan tahapan sebagai berikut (bioMérieux 2006b). 1. Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu selama 18-24 jam. 2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85%) sebanyak 6
ml
dan dihomogenisasi,
kemudian kekeruhan larutan diukur
menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland. 3. Suspensi bakteri tersebut kemudian dipipet ke dalam cupules API 20 E menggunakan pipet sekali pakai. 4. Cupules yang bertanda
dipipet hingga penuh, yakni cupules Cit, VP,
dan Gel. 5. Cupules lainnya dipipet hanya sampai setengah bagian cupules. 6. Cupules ADH, LDC, ODC, H2S, dan URE ditambahkan dengan minyak mineral. 7. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 36±2 ºC.
28
8. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada cupules IND dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen VP 1 dan VP 2 ditambahkan pada cupules VP, tunggu selama 10 menit untuk melihat perubahan warna. Reagen TDA ditambahkan pada cupules TDA. 9. Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam software API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.
Bakteri Gram negatif bentuk batang
Oksidase positif Oksidase positif Fermenter negatif
Oksidase positif Fermenter positif
Non fermenter: API 20 NE
Oksidase negatif Oksidase positif Fermenter negatif
Fermenter: API 10 S API 20 E Rapid 20 E
Gambar 4 Skema pemilihan API (bioMérieux 2006ab).
Oksidase negatif Fermenter positif
