15
3. METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan selama 8 bulan (Agustus 2012 – April 2013) di Laboratorium Somatokinetika Fakultas Ilmu Keolahragaan Universitas Negeri Jakarta (FIK UNJ), Institut Pertanian Bogor (IPB), dan Klinik dr. Katili, Bogor. Pengujian performa berolahraga dan kadar saturasi oksigen (SpO2) baik jangka pendek maupun setelah jangka panjang dilakukan di Laboratorium Somatokinetika FIK UNJ. Pelaksanaan kegiatan terkait intervensi minuman beroksigen dilakukan di IPB, adapun pengambilan sampel darah serta analisis profil lipid, glukosa darah dan SGOT/SGPT dilakukan di Klinik dr. Katili, Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah manusia dan reagen untuk analisis biokimia (profil lipid, glukosa darah dan SGOT/SGPT). Reagen-reagen yang digunakan untuk analisis tersebut adalah Triglycerides– Liquizyme GPO-PAP (Spectrum), Cholesterol–Liquizyme CHOD-PAP (Spectrum), HDL-Cholestero (Spectrum), AST/GOT (Spectrum), ALT/GPT (Spectrum), Glucose–Liquizyme GOD-PAP (Spectrum). Alat yang digunakan untuk analisis biokimia adalah RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) dan Microlab 300 (Vital Scientific). Adapun pengujian performa berolahraga yang meliputi uji VO2 max, waktu untuk mencapai ambang anaerobik (Anaerobic Threshold/AT) dan waktu untuk mencapai kelelahan, menggunakan treadmill yang dihubungkan dengan alat uji kebugaran kardiorespiratori (cardiorespiratory fitness test) “Fitmate” (Cosmed). Kadar SpO2 diukur menggunakan alat pulse oxymeter “ri-fox Pulsoximeter” (Riester). Tahapan Penelitian 3.1 Managemen Responden Pengajuan Ethical Clearance (EC) sebagai wujud perlindungan terhadap responden dilakukan pada bulan Agustus – Oktober 2012 dan mendapatkan EC No: KE.01.10/EC/650/2012 (Lampiran 1). EC adalah persetujuan studi klinis dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Kementerian Kesehatan. Rekrutmen calon responden dilakukan pada bulan September – Desember 2012. Responden penelitian adalah mahasiswa Institut Pertanian Bogor (IPB) yang gemar berolahraga dengan jumlah 12 orang untuk uji performa saat berolahraga dan pengukuran SpO2 baik pada jangka pendek dengan berbagai konsentrasi (50, 80 dan 130 ppm) maupun setelah intervensi jangka panjang (100 ppm, 21 hari, 2 botol/hari). Adapun pada uji parameter yang terkait dengan metabolisme energi (profil lipid dan glukosa darah) dan kesehatan hati (SGOT/SGPT) berjumlah 17 orang. Penentuan jumlah panelis mengacu pada regulasi BPOM (2005) dan penelitian Willmert et al (2002) dan Gruber et al (2004) yang menggunakan minimal 12 orang sebagai subyek penelitian.
16
Responden pada uji performa berolahraga dan SpO2 menggunakan jumlah minimal (12 orang) karena mempertimbangkan lokasi dan intensitas pengujian. Satu orang responden wajib mengikuti minimal 5 kali pengujian tersebut di FIK UNJ, Jakarta. Rekrutmen dilakukan pada mahasiswa yang mengikuti organisasi olahraga maupun yang secara rutin berolahraga di luar organisasi minimal 60 menit setiap minggu. Olahraga yang dilakukan adalah olahraga yang aktif menggunakan aktivitas fisik dan kaki. Olahraga seperti mendayung ataupun catur yang hanya dominan menggunakan aktivitas otak tidak termasuk kriteria olahraga untuk menjadi responden. Responden diambil berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi. Kriteria inklusi mencakup: (a) usia 17 – 30 tahun, (b) kebiasaan olahraga rutin minimal 1 jam dalam seminggu olahraga yang sering dilakukan dapat berupa jogging rutin, basket, berenang, futsal, sepak bola, badminton atau lainnya, (c) dinyatakan sehat secara medis (fisik, jantung, darah dan paru-paru) dan tidak memiliki riwayat penyakit kardiovaskular, penyakit kardiorespirasi dan ginjal, (d) tidak memiliki kebiasaan merokok, minum alkohol, dan begadang, (e) bersedia tidak mengkonsumsi minuman bersoda dan tidak menggunakan oksigen tambahan selama penelitian berlangsung. Adapun kriteria eksklusinya adalah tidak bersedia mengikuti penelitian dan menolak minuman yang diberikan Pada tahap rekrutmen dilakukan pula pemeriksaan kesehatan di Klinik dr. Katili, Bogor. Pemeriksaan klinis yang dilakukan meliputi pemeriksaan kesehatan fisik organ luar, seperti mata, hidung, mulut, telinga, berat dan tinggi badan. Selain itu juga dilakukan pemeriksaan fungsi jantung dengan elektrokardiografi, pemeriksaan fungsi paru-paru dengan spirometri, yang didukung dengan rontgen. Pengukuran denyut nadi, tekanan darah dan pengambilan sampel darah untuk analisis hematologi juga dilakukan. Analisis hematologi terutama mengukur kadar hemoglobin. Calon responden juga diseleksi dari riwayat kesehatannya yaitu tidak memiliki riwayat penyakit kardiovaskular, penyakit kardiorespirasi dan ginjal. Calon responden yang dinyatakan sehat oleh dokter berdasarkan parameterparameter tersebut yang dapat mengikuti penelitian. Sebelum penelitian dimulai, calon responden yang memenuhi kriteria dan telah lolos tes kesehatan mengikuti kegiatan sosialisasi. Kegiatan ini dilakukan pada tanggal 28 Desember 2012 dengan jumlah calon responden yang hadir sebanyak 15 orang. Ketidakhadiran beberapa orang karena kegiatan lain dan urusan keluarga, namun penjelasan dan penandatanganan inform concent tetap dilakukan dengan mendatangi tempat tinggalnya. Sosialisasi mencakup pemberian materi terkait air minum beroksigen, rencana penelitian dan teknis pelaksanaan penelitian. Pada saat sosialisasi tersebut juga diberikan materi dan praktik cara meminum sampel yang tepat, seperti (a) menekan badan botol sebelum diminum (sampel yang baik, keras ketika ditekan botolnya), (b) membalikkan badan botol sebelum diminum (pada sampel yang baik, akan tampak gelembung-gelembung udara), dan (c) menghabiskan sampel dalam satu kali minum, dan menutupnya jika masih ada sisa.
17
Calon responden yang telah mendapat informasi yang jelas dan bersedia mengikuti kegiatan penelitian, selanjutnya diminta untuk menandatangani “surat persetujuan” (informed consent). Surat tersebut sebagai tanda keikutsertaan secara sukarela dan bukti bahwa responden memiliki kewajiban untuk memenuhi dan mengikuti prosedur yang ditetapkan selama penelitian berlangsung. Form informed consent terdapat pada Lampiran 2. 3.2 Percobaan Jangka Pendek Percobaan jangka pendek dilakukan pada 12 responden untuk mengukur Saturasi O2 (SpO2) dan uji performa saat berolahraga (VO2 max, waktu mencapai anaerobic threshold (AT) dan waktu mencapai kelelahan). Uji ini menggunakan sampel sebanyak 1 botol (385 mL) air minum beroksigen pada konsentrasi 50, 80 dan 130 ppm dan AMDK sebagai kontrol. Uji performa saat berolahraga dilakukan 11 kali pada bulan Januari – Februari 2013 menggunakan treadmill yang dihubungkan dengan alat cardiorespiratory fitness test “Fitmate” (Cosmed).Setiap responden melakukan 4 kali uji dan hanya diperbolehkan melakukan sekali uji performa dalam sehari. Waktu istirahat 2-3 hari diberikan kepada responden untuk memulihkan kembali kondisi tubuh sebelum melakukan uji performa pada konsentrasi yang berbeda. Pemberian sampel minuman beroksigen dengan berbagai konsentrasi dilakukan secara acak pada setiap responden. Sebelum melakukan uji performa, responden diperiksa kondisi kesehatannya terlebih dahulu oleh dokter dari klinik Laboratorium Somatokinetika FIK UNJ. Responden yang tekanan darah sesaatnya tidak normal, diminta istirahat terlebih dahulu sampai kondisinya normal. Jenis pengujian yang digunakan adalah tes maksimal (100% denyut nadi) dengan protokol lari 10 km/jam (Run 10 kmh) di atas treadmill hingga mencapai kelelahan maksimum. Responden berlari diatas treadmill (tanpa kemiringan) sampai kecepatan 10 km/jam, kemudian mulai menit ke-7 secara bertahap kemiringan treadmill dinaikkan sebesar 1% per menit sampai kemiringan 14%. Adapun kecepatan awal (7 km/jam) dinaikkan secara bertahap sampai 10 km/jam pada menit ke-6 dan selanjutnya konstan (Gambar 4). Pada pengujian pengaruh jangka pendek minuman beroksigen, responden diminta meminum satu botol sampel atau air biasa (AMDK), 15 menit sebelum pengujian. Selanjutnya responden berlari di atas treadmill sampai benar-benar mengalami kelelahan. Selama pengujian berlangsung dilakukan pemantauan kondisi responden yang dilihat dari layar monitor baik irama jantung (EKG), VO2 max dan denyut nadi (heart rate/HR). EKG sangat penting dilakukan dalam pengujian ini untuk keselamatan responden. Pada akhir pengujian diperoleh hasil pengukuran VO2 max, waktu untuk mencapai Anaerobic threshold (AT) maupun waktu untuk mencapai kelelahan yang dihitung secara otomatis oleh alat cardiorespiratory fitness test Fitmate (Gambar 5). Kriteria VO2 max yang dicapai juga ditampilkan pada gambar tesebut, yang terdiri dari sangat kurang (very poor), kurang (poor), cukup (fair), baik (good), sangat baik (excellent) maupun super
18
(superior). Pengaruh suhu lingkungan terhadap performa dapat diminimalisir karena pengujian ini dilakukan di dalam ruangan berpendingin (air conditioner).
Gambar 4 Perubahan kecepatan dan kemiringan treadmill pada uji lari 10 km/jam
VO2 max
.
Waktu mencapai AT
Waktu mencapaikelelahan
Gambar 5 Contoh hasil pengukuran cardiorespiratory fitness test Fitmate Pada jangka pendek dilakukan juga pengukuran saturasi oksigen (SpO2). Kadar saturasi oksigen (SpO2) diukur sebelum (s1) dan setelah (s2) treadmill serta setelah meminum sampel air beroksigen atau air biasa dengan konsentrasi yang sama pasca treadmill (sampel kedua) yang dimonitor selama 0, 5, 10, dan 15 menit. Pengukuran sebelum treadmill (s1) dilakukan sebelum responden meminum sampel yang pertama dengan maksud mengukur SpO2 responden sebelum diberikan perlakuan. Pengukuran SpO2 dilakukan secara non-invasif
19
menggunakan pulse oximetry yang terdiri atas 2 sensor yaitu sinar infrared yang dapat diabsorbsi oleh oxyhaemoglobin dan sinar red yang dapat diabsorbsi oleh hemoglobin. Sensor tersebut ditepatkan pada jari telunjuk kanan responden yang sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu menggunakan tissue. Kuku responden yang panjang dapat mengganggu alat saat pembacaan kadar SpO2. Oleh karena itu responden diminta untuk memotong kukunya sebelum dilakukan pengukuran. 3.3 Percobaan Jangka Panjang Intervensi minuman beroksigen untuk mengkaji pengaruh jangka panjang dimulai tanggal 18 Februari – 10 Maret 2013, yang meliputi pengambilan darah, intervensi sampel, analisis parameter dan pengujian performa saat berolah raga dan pengukuran SpO2 setelah intervensi. 3.3.1 Pengambilan Darah Pengambilan darah dilakukan pada responden, sebelum (H-0) dan sesudah intervensi air minum beroksigen (H-21). Sebelum hari H pengambilan darah, responden diinformasikan agar istirahat cukup, 10-12 jam sebelumnya berpuasa, namun tetap konsumsi air putih yang cukup. Pada hari H pengambilan darah dilakukan pula wawancara (form pada Lampiran 2). Pengambilan darah dilakukan oleh petugas medis dari klinik dr Katili dengan mengikuti prosedur standar klinik. Darah diambil dari pembuluh vena sebanyak 30 mL dan dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi EDTA (5,4 µg/3 ml sampel darah). Di laboratorium klinik dr Katili, diambil bagian plasma darahnya dengan menggunakan sentrifuse (1000 rpm, 5 menit). Plasma darah kemudian digunakan pada analisis profil lipid (trigliserida, kolesterol, LDL, HDL), SGOT/SGPT, dan Gula Darah Puasa (GDP). 3.3.2 Intervensi Minuman Beroksigen Pada tahap intervensi, responden diberikan 2 botol air minum beroksigen pada konsentrasi 100 ppm untuk diminum setiap hari (pagi dan sore) selama 21 hari. Selama intervensi tersebut, juga dilakukan: -
Pemberian makan malam selama intervensi (H-1 sampai H-21)
-
Wawancara (form pada lampiran 3), pada H-1,4, 7, 14, dan 21
-
Food recall (form pada lampiran 4), pada H-1,2,3,18,19 dan 20
-
Memonitor kegiatan harian responden, seperti olahraga dan kondisi responden setelah meminum sampel(form pada lampiran 5)
3.3.3 Analisis Profil Lipid, SGOT/SGPT dan Gula Darah Puasa (GDP) Analisis profil lipid (trigliserida, kolesterol, LDL, HDL), SGOT/SGPT, dan Gula Darah Puasa (GDP) dilakukan oleh Laboratorium Klinik Katili pada hari-H pengambilan darah intervensi (H-0 dan H-21). Instrumen yang digunakan adalah RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) untuk menganalisis SGOT/SGPT dan Microlab 300 (Vital Scientific) untuk menganalisis profil lipid
20
dan Gula Darah Puasa (GDP). Prosedur analisis dari setiap parameter adalah, sebagai berikut : 3.3.3.1 Trigliserida Metode analisis trigliserida yang digunakan adalah kolorimetri GPO-PAPenzimatis. Reagen Triglycerides–Liquizyme GPO-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC, lalu diinjeksikan pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut: -
Trigliserida dihemolisis oleh Lipoprotein Lipase (LPL) menjadi gliserol. Trigliserid
-
GK
Gliserol-3-fosfat + ADP
Oksidasi gliserol-3-fosfat dikatalisis oleh gliserol fosfat oksidase membentuk dihidroksi aseton fosfat dan hidrogen peroksida (H2O2). Gliserol-3-fosfat + O2
-
Gliserol + AsamLemak
Gliserol yang bereaksi dengan ATP mengalami fosforilasi menjadi gliserol-3fosfat pada reaksi katalisis oleh enzim gliserol kinase (GK). Gliserol + ATP
-
LPL
GPO
dihidroksi aseton fosfat + H2O2
Adanya peroksidase (POD) mengkatalisis reaksi oksidasi berpasangan Hidrogen Peroksidase dari 4-klorofenol dan 4-aminoantifirin (4 APP) untuk membentuk warna merah quinoneimine dye yang terukur pada panjang gelombang 546 nm. 2 H2O2 + 4 APP + 4 klorofenol
POD
Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil trigliserida dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut: Konsentrasi trigliserida (mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 200 3.3.3.2 Kolesterol Metode analisis kolesterol yang digunakan adalah kolorimetri CHODPAP-enzimatis. Reagen Cholesterol–Liquizyme CHOD-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut: -
Ester kolesterol dihidrolisis secara enzimatis oleh kolesterol esterase (KE) menjadi kolesterol dan asam lemak Ester kolesterol
-
Kolesterol + Asam lemak
Kolesterol bebas kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase (KO) menjadi cholestenone dan hidrogen peroksida Kolesterol bebas + O2
-
KE
KO
Cholestenone + H2O2
Hidrogen peroksida, fenol dan 4 amino antifirin (APP) direaksikan dengan peroksida (POD) membentuk kromofor quinoneimine dye yang dapat terbaca pada panjang gelombang 500-550 nm.
21
2H2O2 + fenol + 4 AAP
POD
Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil kolesterol dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut: Konsentrasi kolesterol (mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 200 3.3.3.3 High Density Lipoprotein (HDL) Metode analisis HDL yang digunakan adalah berdasarkan prinsip pengendapan. Reagen HDL-Cholestero (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 20-25oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah LDL dan VLDL pada sampel diendapkan dengan ion phosphotungstate dan magnesium. Setelah disentrifugasi selama 10 menit (4000 rpm), supernatan yang mengandung fraksi HDL ditentukan berdasarkan prinsip sebagai berikut: -
Ester kolesterol dihidrolisis secara enzimatis oleh kolesterol esterase (KE) menjadi kolesterol dan asam lemak Ester kolesterol
-
KE
Kolesterol + Asam lemak
Kolesterol bebas kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase (KO) menjadi cholestenone dan hidrogen peroksida Kolesterol bebas + ½ O2 + H2O
-
KO
Cholestenone + H2O2
Air, fenol dan 4 amino antifirin direaksikan dengan peroksida (POD) membentuk kromofor quinoneimine dye yang dapat terbaca pada panjang gelombang 500-550 nm. 2H2O + fenol + 4 AAP
POD
Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil HDL dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut: Konsentrasi HDL (mg/dL) = Asampel x 570 3.3.3.4 Low Density Lipoprotein(LDL) Penghitungan konsentrasi LDL menggunakan persamaan Friedewald (1972) sebagai berikut: Konsentrasi LDL (mg/dL) = Total kolesterol (mg/dL) – HDL (mg/dL) – (Trigliserida (mg/dL)/5)
3.3.3.5 SGOT Metode analisis SGOT yang digunakan adalah metode kinetik berdasarkan International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Reagen yang digunakan adalah AST/GOT (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah, lalu diinjeksi pada alat RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) dan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut: -
Grup amino secara enzimatis ditransfer oleh AST dalam sampel dari Laspartat menjadi 2-oksaloglutarat menghasilkan oksaloasetat dan L-glutamat L-aspartat + 2-oksoglutarat
AST
oksaloasetat + L-glutamat
22
-
Oksaloasetat, NADH direduksi dengan malat dehidrogenase (MDH) menjadi L-malat. Pada reaksi ini NADH dioksidasi menjadi NAD. Oksaloasetat + NADH + H+
-
MDH
L-malat + NAD+
Penambahan laktat dehidrogenase (LDH) pada reagen ditujukan untuk mempercepat reaksi reduksi dari pirufat, agar tidak mempengaruhi analisis. Sampel pirufat+ NADH + H+
LDH
L-laktat + NAD+
Penentuan hasil analisis dilakukan otomatis oleh alat tersebut. Hasil Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 90 detik (initial absorbance) dan dibaca lagi setelah 30, 60, dan 90 detik setelah initial absorbance. Hasil analisis akhir adalah rata-rata perubahan absorbansi tersebut per menit, yang dihitung dengan rumus, sebagai berikut: SGOT (U/L) = 1746 x delta A340 nm/menit 3.3.3.6 SGPT Metode analisis SGPT yang digunakan adalah metode kinetik berdasarkan International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Reagen yang digunakan adalah ALT/GPT (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah, lalu diinjeksi pada alat RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) dan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut: -
Grup amino secara enzimatis ditransfer oleh ALT dalam sampel dari L-alanin menjadi 2-oksoglutarat menghasilkan pirufat dan L-glutamat L-aspartat + 2-oksaloglutarat
-
pirufat dan + L-glutamat
Pirufat direduksi dengan Laktat dehidrogenase (LDH) menjadi NAD. Pada reaksi ini NADH dioksidasi menjadi NAD. Pirufat + NADH + H+
-
ALT
MDH
L-malat + NAD+
Penambahan laktat dehidrogenase (LDH) pada reagen ditujukan untuk mempercepat reaksi reduksi dari pirufat, agar tidak mempengaruhi analisis. Sampel pirufat+ NADH + H+
LDH
L-laktat + NAD+
Penentuan hasil analisis dilakukan otomatis oleh alat tersebut. Hasil Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 90 detik (initial absorbance) dan dibaca lagi setelah 30, 60, dan 90 detik setelah initial absorbance. Hasil analisis akhir adalah rata-rata perubahan absorbansi tersebut per menit, yang dihitung dengan rumus, sebagai berikut: SGPT (U/L) = 1746 x delta A340 nm/menit 3.3.3.7 Glukosa Darah Puasa Metode analisis Gula Darah Puasa (GDP) yang digunakan adalah kolorimetri GOD-PAP-enzimatis. Reagen Glucose–Liquizyme GOD-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 15-25oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah kadar glukosa ditentukan setelah oksidasi enzimatis oleh enzim glukosa oksidase (GOD). Hidrogen peroksida (H2O2) yang terbentuk kemudian dikatalisis oleh peroksidase
23
(PAP) dengan fenol dan 4-aminoantifirin (AAP) untuk membentuk warna merah ungu quinoneimine, dengan reaksi sebagai berikut: Glukosa + 2H2O +O2 2H2O2 + fenol + 4 AAP
GOD PAP
Asam glukonat + H2O2 Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil glukosa darah puasa dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut: Konsentrasi glukosa(mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 100 3.3.4 Uji Performa Saat Berolahraga dan Pengukuran SpO2 Uji performa saat berolahraga dan pengukuran SpO2 pasca intervensi dilakukan seperti pada jangka pendek, namun sebelum pengujian performa, responden tidak diberikan sampel minuman beroksigen. 3.4 Analisis Penerimaan Produk Analisis penerimaan produk meliputi parameter organoleptik (rasa, aroma dan warna), manfaat dari sisi kesehatan yang dirasakan secara psikologis serta kesediaan untuk mengkonsumsi kembali setelah intervensi berakhir. Data parameter-parameter tersebut direkapitulasi dari wawancara melalui kuesioner. 3.5 Analisis Data Analisis data dilakukan dengan menggunakan software Minitab 16. Jenis analisis statistik yang digunakan adalah: -
uji ANOVA satu arah (one way ANOVA), digunakan untuk menguji taraf signifikansi pengaruh perlakuan sampel terhadap performa saat berolahraga (VO2 max, waktu mencapai ambang anaerobik dan waktu mencapai kelelahan).
-
uji ANOVA General Linier Model, dilakukan untuk mengukur taraf signifikansi pengaruh perlakuan sampel dan waktu pengukuran terhadap kadar SpO2.
-
uji t berpasangan (t paired test), digunakan untuk menguji taraf signifikansi pengaruh intervensi sampel pada jangka panjang terhadap profil lipid, kadar glukosa darah dan SGOT/SGPT sebelum dan sesudah intervensi.
