abstrakta boru pacientů po aHSCT, jejich dárců a skupiny zdravých kontrolních jedinců. Grantová podpora: IGA MZ ČR NT/12454, IGA_PU_ LF_2012_007, CZ.1.05/2.1.00/01.0030.
15/77 Sérokonverzia QuantiFERON – TB Gold testu počas biologickej liečby Kozáková D., Záňová E., Rybár I., Solovič I., Rovenský J. Národný ústav reumatických chorôb, Piešťany, Slovenská republika Úvod: Pozitivita QuantiFERON-TB Gold testu (QFT, in vitro test na detekciu infekcie M. tuberculosis) môže znamenať diagnózu latentnej formy tuberkolózy, môže pretrvávať po chemoprofylaxii, alebo sa môže vyskytovať ako falošná pozitivita. Pri biologickej liečbe sa na diagnostiku latentnej formy tuberkulózy (LTBI), najmä u BCG vakcinovanej populácie, využívajú tzv. Interferon Gamma Release Assay (IGRA - QFT, T-spot). Výsledky QFT sa interpretujú ako pozitívne, negatívne alebo neurčité. Cieľ: Pomocou QFT stanoviť počet sérokonverzií pôvodne negatívneho výsledku na pozitívny výsledok u pacientov liečených anti-TNF liečbou v roku 2011. Súbor chorých a metódy: 924 pacientov s reumatoidnou artritídou (RA), ankylozujúcou spondylitídou (AS) a psoriatickou artritídou (PsA). Všetci spĺňali základné diagnostické kritériá
a krtiériá zahájenia biologickej liečby anti-TNF preparátmi (etanercept, infliximab, adalimumab, certolizumab). LTBI sa v krvi stanovovala QFT (ELISA, Cellestis). Výsledky: V roku 2011 sme QFT vyšetrili 924 pacientov liečených biologickou liečbou. Negatívne výsledky sme zistili u 807 pacientov (87,34%), pozitívne u 117 pacientov (12,66%). Zo skupiny 117 pozitívnych výsledkov QFT bolo 76 pozitivít u prvovyšetrených pacientov a 41 u pacientov sledovaných od r. 2008 (35,00 %). 18/41 pacientov (43,90 %) malo opakovane pozitívny výsledok QFT od roku 2008. 23/41 QFT pozitívnych pacientov vyšetrených v roku 2011 malo počas anti-TNF liečby v rokoch 2008– 2010 negatívny výsledok (23/117 pozitívnych – 20,00 %, 23/924 z celkového počtu vyšetrení – 2,50 %). Prevažovali ženy – 87,00 % (20/23) ku 60 % žien v celkovej anti-TNF liečbe, podľa dekád veku - maximun 60–69 roční (10/23). Najviac sérokonverzií QFT počas anti-TNF liečby sme zistili u etanerceptu (9/23) a adalimumabu (8/23), čo je v súlade s celkovým pomerom podávanej antiTNF liečby. Najväčší rozdiel pomeru zistených sérokonverzií QFT sa dokázal u certolizumabu – 13,04 % ku celkovému zastúpeniu v anti-TNF liečbe (5,00 %). Záver: Sérokonverzia QFT počas biologickej liečby bola zistená u 23/924 pacientov (2,49 %) s predchádzajúcou negativitou počas anti-TNF liečby v rokoch 2008–2010. Príčinou mohol byť nový kontakt s mykobaktériami počas liečby (novozistená LTBI), účinok predchádzajúcej chemoprofylaxie (po pol roku až do 2 rokov prechodná negativita) alebo falošná pozitivita spôsobená chybou v preanalytickej fáze.
16. Sekce laborantů
16/78 Stanovení senzibilizace na rekombinantní alergeny Janů V., Kopelentová Š., P. Kučera OAKI Laboratoř klinické imunologie, FN Královské Vinohrady, Praha Prezentace se bude zabývat tématem vyšetřování senzitivity na rekombinantní alergeny a jejich významem pro současnou medicínu. Ten spočívá především v umožnění přesnějšího stanovení alergenové senzibilizace. Na jejich základě lze pak také stanovit tvz. Individuální profil IgE reaktivity pacienta, jehož cílem je identifikace molekul, které jsou v přímé souvislosti s alergickými onemocněními. V návaznosti na tuto alergenovou senzibilizaci lze pak stanovit optimální léčbu pro každého pacienta.
56
16/79 Imunomodulační vliv mezenchymálních kmenových buněk na nespecificky indukovanou proliferaci lymfocytů Vlas T.1, Merglová L.2, Panzner P.1, Hanzlíková J.1, Koza V.2, Lysák D.2 1 Ústav imunologie a alergologie, FN, Plzeň 2 Hematologicko-onkologické oddělení, FN, Plzeň Mesenchymální kmenové buňky (MSC) se staly předmětem zájmu mnoha medicínských oborů. Naše studie se zaměřila na sledování imunomodulačních vlastností MSC. Testovali jsme vliv přítomnosti těchto buněk na nespecifickou aktivaci lymfocytů phytohemagglutininem (PHA) v rámci lymfocytárního transformačního testu. Přidání MSC do kultivačního testu výrazně snižovalo míru aktivace lymfocytů, která byla měřena pomocí analýzy buněčného cyklu průtokovou cytometrií. Počet aktivovaných buněk v G2/M fázi se snížil o cca 17 % (medián, p < 0,01). Při kultivaci nestimulovaných lymfocytů byla zjištěna nevýznamná proliferace vyvolaná samotnými MSC – 0,8% nárůst proliferujících lymfocytů (ns). Při sledování změn probíhajících v kultivovaných vzorcích jsme pozorovali vyšší viabilitu u kultur s přídavkem MSC. Obsah fragmentované DNA byl v těchto vzorcích o 2,3 % (p = 0,029) nižší v porovnání se vzorky bez kokultivace s MSC. Déle jsme potvrdili
Alergie, Supplementum 2/2012
abstrakta vliv MSC na expresi aktivačních znaků CD25 a CD69. Zde dochází k výraznému snížení produkce daných znaků. Je prodloužena i doba nutná k dosažení stejných hodnot mezi vzorky s přídavkem MSC a vzorky bez MSC. Výsledky potvrzují nízkou imunogenicitu MSC, jejich schopnost snižovat aktivaci lymfocytů a podporovat navozování imunotolerance. MSC se mohou stát východiskem nových léčebných přístupů některých imunitně podmíněných patologických stavů (autoimunitní onemocnění, GVHD atd.).
16/80 Cytotoxický test a test degranulace NK buněk v diagnostice FLH Dudková E., Netopilíková R. Ústav imunologie 2. LF UK a FN Motol, Praha Familiární hemofagocytující lymfohistiocytόza (FHL) je závažné autozomálně recesivně dědičné onemocnění. Rychlé stanovení diagnózy má zásadní význam pro volbu léčebné strategie. Mezi funkční testy k diagnostice onemocnění patří cytotoxický test a test degranulace NK buněk. Vhodnost použití těchto metod se liší podle typu onemocnění. V tomto příspěvku popisujeme princip obou metod a jejich aplikaci v diagnostice FLH.
16/81 Imunogenetická vyšetření při transplantaci ledvin Valhová Š. Oddělení imunogenetiky PLM IKEM, Praha Nezbytnou součástí úspěšného průběhu transplantace ledvin jsou imunogenetická vyšetření. Na Oddělení imunogenetiky IKEM provádíme ještě před zařazením pacienta na čekací listinu typizaci jeho HLA antigenů technikou DNA. Před každou transplantací ledviny typizujeme i HLA antigeny dárce. Shoda HLA antigenů dárce a příjemce hraje při transplantaci ledvin značnou roli pro dlouhodobé přežívání štěpu. Rovněž vyšetřujeme panel reaktivních protilátek, kdy zjišťujeme u čekatele možnou přítomnost protilátek proti HLA antigenům. Protilátky proti HLA antigenům dárce by zhoršovaly přijetí štěpu. Přímo před transplantací od kadaverózního dárce provádíme Komplement-dependentní cytotoxický (CDC) test. Pozitivní CDC test znamená přítomnost preformovaných cytotoxických protilátek proti dárcovým antigenům. Tyto cytotoxické protilátky by zapříčinily vznik akutní rejekce štěpu, proto pozitivita CDC testu je absolutní kontraindikací pro transplantaci. Před příbuzenskou transplantací ledviny od živého dárce provádíme CDC test a navíc ještě Flow cytometry crossmatch (FCXM). U čekatelů na opakovanou transplantaci ledviny provádíme vyšetření metodou Luminex, kdy zjišťujeme přítomnost donor specifických HLA protilátek proti předchozímu dárci pomocí mikrokuliček obsahujících fluorescein, s navázanými HLA antigeny na povrchu. Určíme tak HLA antigeny, které jsou u potenciálního dárce zakázány. Na žádost kliniky nefrologie monitorujeme u příjemců hladiny protilátek proti HLA i po transplantaci – pomocí vyšetření Luminex, FCXM a CDC. Tato vyšetření slouží k volbě další léčby pacienta. Imunogenetická vyšetření jsou nedílnou součástí úspěšného průběhu potransplantačního vývoje štěpu.
16/82 Naše zkušenosti s vyšetřováním Calprotectinu ve stolici Tolarová L., Mičínová J. Oddělení imunologie Praha, ZÚ se sídlem v Ústí nad Labem Úvod: Calprotectin je kalcium vazebný protein uvolňovaný z neutrofilů. Jedná se o vysoce specifický a citlivý marker přítomnosti zánětu ve střevě, je vhodným ukazatelem při diagnostice i monitorování léčby střevních zánětlivých onemocnění – ulcerózní kolitidy a Crohnovy choroby nebo nekrotizující enterokolitidy u dětí. Metoda: Stanovení Calprotectinu ve stolici provádíme laterální průtokovou analýzou s použitím readeru Quantum Blue. Jedná se o rychlý neinvazivní test, výsledky jsou kvantitativní. Množství stolice potřebné k analýze je cca velikosti lískového oříšku. Stolici je možné uchovávat až 5 dní v lednici, šestý den je nutné ji zpracovat v laboratoři. Výsledky jsou k dispozici týž den. Koncentrace Calprotectinu ve stolici je uváděna v µg/g, kdy hodnoty pod 40 jsou negativní, 40–60 hraniční a nad 60 pozitivní. Výsledky: Hodnotili jsme období 04/2011–03/2012. Během tohoto období jsme vyšetřili 180 pacientů. Z toho bylo 82 dospělých, 46 žen a 36 mužů a 98 dětí, 47 dívek a 51 chlapců. 28 dospělých pacientů bylo negativních, 11 mělo hraniční hodnoty a u 43 bylo vyšetření pozitivní. Ze 43 pozitivních byly u 27 pacientů naměřeny hodnoty Calprotectinu vyšší než 200 µg/g. Dětí bylo 48 negativních, 8 mělo hraniční hodnoty a u 42 bylo vyšetření pozitivní. Ze 42 pozitivních byly u 21 dětí naměřeny hodnoty Calprotectinu vyšší než 200 µg/g. Vedle vyšetření Calprotectinu ve stolici přispívá k diagnostice i stanovení ASCA a ANCA protilátek, které na našem pracovišti rovněž provádíme. Z 27 dospělých pacientů s hodnotami Calprotectinu ve stolici > 200 µg/g mělo 20 pacientů indikováno ASCA i ANCA vyšetření. 5 pacientů mělo pozitivní IgA i IgG ASCA a 4 pouze IgG ASCA. Pouze jeden pacient měl pozitivní protilátky proti myeloperoxidáze. Z 21 dětských pacientů s hodnotami Calprotectinu ve stolici > 200 µg/g jich mělo 18 vyšetřeno ASCA i ANCA protilátky, u 6 byly pozitivní IgA i IgG ASCA, u 1 byly pozitivní IgG ASCA a 1 pacient měl pozitivní protilátky proti myeloperoxidáze. Závěr: U pacientů s hodnotami Calprotectinu ve stolici vyšší než 200 µg/g lze vážně uvažovat o diagnóze Crohnova nemoc nebo ulcerativní kolitida (IBD) a potvrdit ji následnou kolonoskopií. Stanovení Calprotectinu ve stolici umožňuje rovněž monitorovat terapii pacientů s IBD. Získané výsledky umožňují lékaři rozhodnout se, zda na základě laboratorních vyšetření provést kolonoskopii nebo zahájit terapii symptomů IBS (Irritable bowel syndrome). Zvyšující se zájem o toto vyšetření především z řad gastroenterologů a pediatrů vypovídá o tom, že vyšetření Calprotectinu ve stolici je pro klinika přínosem.
16/83 Autovakcíny jako imunomodulační přípravky Podlahová P., Farkasová R., Cenková M., H. Trnková Nemocnice České Budějovice a. s Smyslem podání imunomodulátorů je zlepšit imunitní odpověď proti bakteriálním a kvasinkovým infekcím. Jedná se většinou
Alergie, Supplementum 2/2012
57
abstrakta o nespecifickou stimulaci imunitního systému mrtvými bakteriemi či jejich časti, které nebyly získány od pacienta, na rozdíl od autovakcín, očkovacích látek, které jsou připraveny z bakterií pocházejících z infikovaného ložiska nebo orgánu pacienta. Bakterie se vyizolují, pomnoží a po usmrcení se podávají zpět nemocnému. Tohoto postupu se někdy využívá k léčbě chronických infekcí, např. v dýchacích cestách, ve vedlejších nosních dutinách apod. Při tomto léčebném postupu se očekává zvýšení imunity.
16/84 ANTI-PLA2R PROTILÁTKY U PACIENTŮ S MEMBRANÓZNÍ NEFROPATIÍ Musilová R.¹, Janatková I.¹, Svobodová B.², Hrušková Z.² ¹Klinická imunologie a alergologie – laboratoř ÚLBLD VFN a 1. LF UK, Praha ²Klinika nefrologie VFN a 1. LF UK, Praha Membranózní nefropatie (MN) je onemocnění ledvin, histologicky definováno ztluštěním glomerulární bazální membrány a depozicí imunokomplexů mezi glomerulární bazální membránu a podocyty. Je hlavní příčinou vzniku nefrotického syndromu u dospělých. Nefrotický syndrom je soubor klinických a laboratorních příznaků, které vznikají v důsledku výrazné ztráty bílkovin močí (proteinurie). Etiologicky rozlišujeme idiopatickou (častější) a sekundární formu MN (20–25 %). Idiopatická forma je považována za autoimunitně navozené onemocnění. Autoimunitní mechaniszmus idiopatické MN, který byl poprvé objeven a popsán v roce 2009, je výsledkem reakce autoprotilátek s receptorem pro fosfolipázu A2 (PLA2R) exprimovaným na povrchu podocytů. V laboratoři KIA ÚLBLD VFN a 1. LF UK v Praze rutinně stanovujeme anti-PLA2R metodou nepřímé imunofluorescence od roku 2011. Používáme diagnostické soupravy Anti-Phospholipase A2 receptor IIFT firmy EUROIMMUN. Antigenním substrátem pro toto stanovení jsou transfekované buňky (EU 90). Práce prezentuje výsledky vyšetření 103 sér od 91 pacientů nefrologické kliniky s biopticky potvrzenou MN (85 pacientů s idiopatickou MN, 6 pacientů se sekundární MN). U většiny pacientů s idiopatickou MN byla potvrzena vysoká prevalence antiPLA2R protilátek. Stanovení anti-PLA2R protilátek v séru by mohlo být významným parametrem nejen pro neinvazivní diagnostiku idiopatické MN, ale i pro sledování terapie a aktivity onemocnění.
16/85 BeeLine 220s – Naše volba v automatizaci IFA Bystrianská J., Kuhejdová J., Krpcová L. Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě IFA (indirect immunofluorescence assay, nepřímá fluorescence) je stále používána jako metoda první volby (zlatý standard) při diagnostice většiny autoimunitních onemocnění pomocí autoprotilátek. V posledních 10 letech můžeme pozorovat v klinických laboratořích, imunologické laboratoře nevyjímaje, značnou automatizaci vyšetřovacích postupů. V České republice uvedla jako jedna z prvních procesory vedoucí k automatizaci metody IFA firma BioRad, v roce 2004.
58
V dnešní době tyto přístroje, které vychází z koncepce ELISA automatů, vyrábí mnoho firem zaměřených na laboratorní instrumentaci. Na našem pracovišti používáme systém firmy HTZ (Hook&Tucker&Zeny, GB) BeeLine 220s dodávaný a servisovaný českým dodavatelem firmou Dynex. Standardní varianta tohoto přístroje je určena maximálně pro 16 standardních mikroskopických skel, přičemž můžeme zpracovávat najednou až 4 různé testy, které mají odlišné výchozí ředění. Počet vzorků je dán počtem polí na jednotlivých sklech. Přístroj BeeLine 220s má jedno rameno zakončené pipetovací a promývací dvoujehlou. Je také vybaven automatickým sledováním hladiny kapaliny, díky které se minimalizuje ponoření jehly. Minimálním objemem vzorku (tzv. mrtvý objem + množství vzorků potřebné k analýze) je 100 μl (50 μl v „microtube“). Ovládání přístroje je jednoduché a intuitivní. Programování probíhá formou „doplňování“ políček v MS Excel. Lze naprogramovat (nastavit) jakékoliv typy a formáty skel a reagencií. Rutinně provádíme procesoru BeeLine 220s tyto metody: IFA stanovení/detekci ANCA, EMA; HEp-2, anti-dsDNA, APCA a anti-spermatozoálních protilátek na substrátech různých firem. Při vyhodnocování zpracovaných skel jsme zjistili, že fluorescence procesorem zpracovaných vzorků jsou „zřetelnější“ – nižší pozadí – než při manuálním zpracovávání. Můžeme konstatovat, že procesor BeeLine 220s zvládá spolehlivě zpracování vzorků od naředění až po montování.
16/86 Užití tkáně opičího jícnu v NIF Dudková I., Heřmanová Z., Špidlová A. Imunologie, Fakultní nemocnice, Olomouc Imunofluorescence patří mezi běžné laboratorní metody. Slouží k detekci různých antigenů ve tkáních i buňkách, umožňuje však také kvalitativní i kvantitativní průkaz protilátek. Přímá imunofluorescence používá značenou protilátku proti specifickým antigenům přítomným ve tkáni pacienta. Protilátky bývají značeny fluorochromem. Nejčastěji se používá fluores ceinisothiocyanát (FITC). Pro průkaz je nutný mikroskop se zařízením pro fluorescenci. Fluorescenční mikroskop je vybaven zdrojem světla (nejčastěji to je rtuťová nebo xenonová výbojka, v nouzi i halogenová lampa) a vhodnou kombinací excitačních a bariérových filtrů. Kombinace filtrů musí odpovídat použitému fluorochromu. Excitační světlo o nižší vlnové délce (světlo jiných vlnových délek je odfiltrováno excitačním filtrem) vede k emisi světla o vyšší vlnové délce. Emitované světlo lze pozorovat nebo fotografovat. Nepřímou imunofluorescencí se prokazují autoprotilátky v séru pacienta. Sérum pacienta se nechá reagovat s příslušnou tkání (např. opičí jícen, opičí ledvina, opičí kosterní sval, krysí žaludek) nebo buněčnou suspenzí (lidské neutrofilní leukocyty). Pokud jsou v séru přítomny protilátky proti některému z antigenů, které se v buněčném substrátu vyskytují, naváží se na místa výskytu antigenů. V další fázi se preparát promyje, aby se odstranily všechny imunoglobuliny, které se nenavázaly. Poté se na preparát navrství antisérum proti lidským imunoglobulinům konjugované s fluorochromem (tzv. konjugát). Toto antisérum se naváže všude tam, kde byly přítomny navázané lidské imunoglobuliny. Po promytí, kdy se
Alergie, Supplementum 2/2012
abstrakta odstraní veškerý konjugát, který se nenavázal na imunoglobuliny, prohlížíme preparát ve fluorescenčním mikroskopu. Jak již bylo řečeno, k vyšetření autoprotilátek se využívají také opičí tkáně. Opičí tkáně jsou antigenně a strukturálně velmi podobné lidským tkáním. Mezi nejpoužívanější patří opičí jícen. Substrát opičího jícnu se používá k stanovení: – endomysiálních protilátek v diagnostice celiakie, – stanovení protilátek proti intercelulární substanci epidermis u onemocnění pemfigus, – stanovení protilátek proti bazální membráně epidermis u onemocnění pemfigoid. Celiakie (glutenová enteropatie, celiakální sprue) je zánětlivé postižení tenkého střeva, které je způsobeno přecitlivělostí na složku obilného lepku – glutenu. Předpokládá se genetická predispozice ke vzniku tohoto onemocnění. Onemocnění se projevuje průjmy, hubnutím, malabsorpcí, u dětí neprospíváním. Při dietním režimu s vyloučením glutenu z potravy lze onemocnění udržet pod kontrolou. Bulózní pemfigoid charakterizují napjaté, často svědivé puchýře lokalizované v flexorových oblastech končetin, v axile, v třísle a na podbříšku. Pemfigus vulgaris charakterizuje tvorba puchýřů a denudace kůže i sliznic. Příznačným histologickým obrazem je akantolýza (ztráta soudržnosti) epidermálních buněk.
16/87 Časná diagnostika infekční mononukleózy – výsledek spolupráce průtokové cytometrie, hematologie a sérologie Ouvínová H., Havranová M., Potměšilová A., Lehovcová A. Immunia spol. s r. o., Praha Laboratorní nález pacienta (obzvlášť dospělého) s primoinfekcí EBV (virus Epsteina a Barrové) může v počátku vyvolávat podezření na hematologickou malignitu. Již výsledky z průtokové cytometrie mohou ukazovat na toto onemocnění. Typickým nálezem pro tyto pacienty je: a) vyšší počet T-lymfocytů exprimujících aktivační znak HLA-Dr, b) výrazně snížený imunoregulační index (IRI), což je poměr CD4+/CD8+ pozitivních T-lymfocytů. Na základě suspektních výsledků z cytometru je nutno zhotovit mikroskopický diferenciál, a to i tehdy, když nález z hematologického analyzátoru nevykazuje výraznou patologii. V krevním obraze může být normální počet leukocytů přecházející v leukocytózu, nízký počet neutrofilů, zvýšený počet lymfocytů, normální až vyšší počet monocytů a přítomnost buněk typických pro infekční mononukleózu – atypické lymfocyty. Po zjištění těchto výsledků je třeba sérum pacienta odeslat k vyšetření specifických protilátek proti EBV. Spolupráce průtokové cytometrie, hematologie a sérologie může diagnózu výrazně urychlit a ušetřit tak pacienta od možného vyšetření kostní dřeně a umístit jej na příslušné oddělení nebo zahájit včas dietní a režimová opatření.
Alergie, Supplementum 2/2012
16/88 Naše skúsenosti s využitím IGRA testov v diagnostike infekcie M. tuberculosis vo výpotkoch a bronchoalveolárnych lavážach Ondrejková A., Ondrejka G., Špačková I. Laboratórium imunológie a sérologie, PR LAB a. s., Nový Jičín Úvod: Komerčne dostupné IGRA testy (Interferon-Gamma Release Assay) – QuantiFERON.TB test a T-SPOT.TB test – sú dnes už rutinne využívanou nepriamou metódou diagnostiky infekcie M. tuberculosis v mnohých laboratóriách. Princíp metódy vychádza zo základných obranných imunitných mechanizmov sprevádzajúcich infekcie intracelulárnymi patogénami a spočíva v stanovovaní hladiny interferónu gamma (INF gamma) produkovaného pamäťovými CD4+T-lymfocytami infikovaného človeka po inkubácii špecifickými tuberkulóznymi antigénami. Vzhľadom k tomu, že diagnostika mimopľúcnej a aj niektorých foriem pľúcnej tuberkulózy je problematická a priame diagnostické metódy (kultivácia, PCR) často nemajú diagnostický prínos, rozhodli sme sa aplikovať IGRA testy na biologický materiál získaný priamo z miesta zápalu. V práci prezentujeme naše praktické skúsenosti s využitím IGRA testov v exudátoch (pleurálnych výpotkoch a ascite) a bronchoalveolárnych lavážach (BAL). Súbor a metodika: Náš súbor tvorí 32 pacientov s podozrením na infekciu M. tuberculosis. Jednalo sa o 29 pacientov s lymfocytárnym pleurálnym výpotkom (PV), 1 pacientku s ascitom a 2 pacientov so zväčšenými uzlinami v mediastine, u ktorých bola prevedená bronchoalveolárna laváž (BAL). V exudátoch a BAL sme stanovovali celkový počet leukocytov ako základnú mieru intenzity zápalovej odpovede v postihnutom tkanive. Fenotypizáciou pomocou prietokovej cytometrie sme sledovali zastúpenie efektorových CD4+T-lymfocytov a HLA DR+ aktivovaných T-lymfocytov. IGRA test k stanoveniu špecifického INF gamma po inkubácii tuberkulóznymi antigénami bol prevedený súčasne v exudátoch resp. BAL a v periférnej krvi u každého pacienta v súbore. Výsledky dávame do korelácie s klasickým kultivačným vyšetrením (v exudátoch, BAL a v spúte) a tuberkulínovým kožným testom (Mantoux II). Výsledky: Z 30 vyšetrovaných exudátov (29 PV a 1 ascites) bol IGRA test pozitívny v 4 prípadoch (3 PV a 1 ascites, tj. 13,3 %). Títo pacienti mali lymfocytárny exudát s vyšším počtom buniek, so zvýšeným zastúpením aktivovaných CD3+T-lymfocytov s predominanciou fenotypu CD4+, so zvýšeným pomerom CD4/ CD8. Kultivačné vyšetrenie bolo negatívne v spúte aj vo výpotku s výnimkou jedného pacienta s pozitívnym nálezom M. tuberculosis v spúte. Tuberkulínový kožný test bol viac ako 15 mm u všetkých 4 pacientov. Diagnózu aktívnej formy tuberkulózy u týchto pacientov potvrdila úspěšnosť antituberkulóznej terapie. Využitie IGRA testov v prípade bronchoalveolárnej laváže (BAL) je podľa našich skúseností zložitejšie a zatiaľ v našom prípade bez valídneho výsledku. Efektorové bunky sa totiž nachádzajú vo výplachu fyziologickým roztokom, teda v prostredí chudobnejšom na podporné cytokínové prostredie, čím je ich schopnosť reagovať in vitro na konkrétne antigénne stimuly do istej miery obmedzená. Na príklade kazuistiky prezentujeme naše zatiaľ negatívne skúsenosti s využitím QuantiFERON.TB testu v BAL. Sľubnou sa ale zdá byť kultivácia buniek BAL vo vhodnom kultivačnom médiu a následné prevedenie T-SPOT.TB testu.
59
abstrakta Záver: Naše výsledky potvrdzujú možnosť a význam rutinnej aplikácie funkčných komerčne dostupných IGRA testov predovšetkým v CD4+T-lymfocytárnych exudátoch k diagnostike špecifickej tuberkulóznej etiológie zápalu. Využitie IGRA testov v BAL je zatiaľ, žiaľ, v našom súbore bez valídneho a diagnostického efektu. Celkovo hodnotíme prácu aj ako dȏkaz efektívnej spolupráce klinického oddelenia a imunologického laboratória.
16/89 REGULAČNÍ T-LYMFOCYTY – OD EXPERIMENTU K PRAXI Pohořská J., Král V., Richter J. ZÚ, Centrum imunologie a mikrobiologie, Ústí nad Labem V 90. letech 20. století, kdy imunologickou teorii ovládalo paradigma Th1/Th2 polarizace, byla velmi aktuální podrobnější charakterizace CD4+ buněčné populace. „Supresivní“ role v buněčném substrátu imunitní reakce (z hlediska „klinické aplikace“) byla připisována subpopulaci CD8+CD28- T-lymfocytů (experimentálně prokazovaná ovšem pouze v oblasti alogenní suprese). Průlomem byl průkaz supresivní aktivity populace CD4+CD25++ T-buněk v myším systému (především funkční studie). Identifikace regulačních T-lymfocytů jako CD4+CD25++ lymfocytů se v lidském systému brzy ukazovala jako nedostatečná. Hledány byly další diferenciační/aktivační znaky pro přesnější identifikaci Treg. Např. v experimentech s průkazem Treg in situ v nádorové tkáni byla zaměřena pozornost na molekuly ICOS (inducibilní kostimulátor indukující syntézu IL10) a GITR (receptor pro TNF indukovaný glukokortikoidy, jehož exprese se zvyšuje u aktivovaných T-lymfocytů). Rozvoj poznatků o úloze transkripčních faktorů a výsledky experimentů v myším systému znamenaly zásadní posun pro identifikaci Treg. Byl objeven „výlučný“ diferenciační znak Treg – exprese transkripčního faktoru FoxP3 v populaci CD4+CD25hi. Ukázalo se, že počáteční optimizmus spojovaný s FoxP3 jako „specifickým“ diferenciačním znakem, se v lidském systému nepotvrdil. Exprese FoxP3 není u lidí omezena pouze na Treg. Důležitým krokem k identifikaci Treg bylo poznání fyziologické funkce receptoru pro IL7 (CD127, alfa řetězec IL-7R). Byla prokázána nepřímá závislost exprese CD127 a FoxP3 u aktivovaných a regulačních T-lymfocytů (CD127+/hi znak „aktivace“ oproti FoxP3+/++ jako znaku „tlumivé kapacity“). Dalšími slibnými markery pro specifikaci a další rozlišení Treg subpopulací by mohly být GARP (exprimovaný na aktivovaných Treg, vysoká exprese GARP u naivních T-lymfocytů indukuje expresi FoxP3 a podílí se na supresivní funkci), Helios (intracelulární molekula, specifická pro přirozené Treg (nTreg, nezávislá na FoxP3), CD152 (indukce CTLA-4 u revmatoidní artritidy obnovuje supresivní kapacitu Treg). V současnosti nachází využití v klinické praxi sledování exprese CTLA4/CD152 v diagnostice imunologicky podmíněných neplodností. Budou zmíněny základní metodické přístupy stanovení Treg v myším a lidském systému, modifikace vhodné pro detekci Treg v rutinním provozu klinické laboratoře, doplněno o ukázky dat ze sledování pacientů s některými imunopatologickými stavy. Komplikace v metodických přístupech mohou do značné míry souviset s aktuálně uznávaným konceptem „diferenciační plasticity“ populace CD4+ T-lymfocytů v lidském systému, která předpokládá určitou reversibilitu diferenciačních stupňů (změny fenotypu) v závislosti na cytokinovém prostředí a expresi transkripčních faktorů.
60
16/90 PŘÍNOS STANOVENÍ HLADIN PROTILÁTEK PROTI C1Q SLOŽCE KOMPLEMENTU U PACIENTŮ SE SLE Stiborová I.1,2, Král V.1, Blažíčková S.2,3 1 Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, Centrum imunologie a mikrobiologie, Ústí nad Labem 2 Trnavská univerzita, Fakulta zdravotníctva a sociálnej práce, Trnava, Slovenská republika 3 Laboratória Piešťany, Piešťany, Slovenská republika Glomerulonefritida je častým a obvykle závažným rysem SLE, její výskyt je jedním z hlavních markerů špatné prognózy onemocnění. S výskytem a aktivitou lupus nefritidy (LN) u SLE korelují podle některých studií hladiny protilátek proti C1q složce komplementového systému. Hladiny anti-C1q u pacientů se SLE jsou významně vyšší ve srovnání se zdravými kontrolami nebo s pacienty s dalšími autoimunitními chorobami (systémová skleróza, Sjögrenův syndrom, antifosfolipidový syndrom apod.). Byla prokázána pozitivní korelace reaktivity anti-C1q s hladinami protilátek proti dsDNA, hodnotou ECLAM skóre, zvýšením hematurie a proteinurie a sedimentací erytrocytů. Zároveň byla prokázána negativní korelace anti-C1q s hladinami C3 a C4. Výskyt renálních vzplanutí koreloval s hladinami ani-C1q a pak s hladinami anti-dsDNA. Kombinací obou testů lze dosáhnout vyšší prediktivní hodnoty stanovení (specifita 90 % , senzitivita 90 %). Specifita i senzitivita protilátek proti C1q pro sledování aktivity renálního onemocnění či predikci renálních vzplanutí je vyšší než stanovení protilátek proti dsDNA či sérové hladiny C3 a C4. Séra pacientů se SLE obsahují monomérní IgG s protilátkovou aktivitou proti oblasti C1q podobné kolagenu. Aby bylo možné rozlišit v testovacím systému protilátky proti C1q od imunitních komplexů obsahujících C1q, byla vyvinuta modifikace ELISA testu stanovující protilátky s vysokou aviditou. V naší studii byly hladiny protilátek proti C1q stanoveny u 30 pacientů se SLE s uvedenou lupus nefritidou v anamnéze. Dále byly stanoveny hladiny protilátek proti dsDNA, protilátky proti dsDNA s vysokou aviditou a protilátky proti nukleozómům. Pacienti byli rozděleni rozděleni do 5 skupin podle hodnot proteinurie (PU) v době odběru (A: PU < 0,3 g/l za 24 h, B: PU 0,3–1,0 g/l za 24 h, C: PU 1,0–1,5 g/l za 24 h, D: PU > 1,5 g/l za 24 h a E: bez PU). U skupiny pacientů s nejvyššími hodnotami PU byly stanoveny nejvyšší hladiny protilátek proti C1q. Nižší stupeň korelace byl zřejmý u protilátek proti dsDNA, protilátky proti nukleozómům nevykazovaly žádnou souvislost s hodnotami PU. Uvedené výsledky jsou v souladu s dosud publikovanými literárními údaji. Průkaz protilátek proti C1q složce komplementu dosud není součástí spektra rutinně stanovovaných protilátek u pacientů se SLE. Přestože jejich specifita pro SLE není vysoká, zařazení detekce protilátek proti C1q do vyšetřovacího schématu pacientů se systémovým lupusem by svou vysokou prediktivní hodnotou pro lupus nefritidu umožnilo předvídat možný výskyt renálního postižení, které je jedním z častých a závažných projevů tohoto onemocnění.
Alergie, Supplementum 2/2012
