Fragmentocyten betekenis en standaardisatie ASO Annelies Fraeyman 02/03/2010
Overzicht • Aanleiding CAT • Fragmentatie hemolyse • Definitie fragmentocyt & bruikbaarheid – Studie OLV
• Detectieprincipes (celteller/flagging, microscopie, …) • Telling – Studie OLV
• Betekenis fragmentocyten: casussen • Rondvraag Vlaamse labo’s • Conclusie
Aanleiding CAT onderzoek 1. Geen consensus over de definitie voor schistocyten- Geen standaardisatie v/d identificatie 2. Geen consensus over telling & rapportering intra- en interindividuele variatie 3. FRC vaak in kleine aantallen aanwezig belangrijke statistische variatie i/d telling
4. Moeilijke standaardisatie v/h beoordelingsgebied in het uitstrijkje 5. Betekenis schistocyten?
Fragmentatie hemolyse Hemolytische anemie, Microangiopathische vorm
Fragmentatie van RBC - mechanismen • Hitte – 49°C in vitro, soms 46°C bij erfelijke vormen van hemolytische anemie – brandwonden
• Mechanisch – Mars hemoglobinurie, trombectomie, cardiopulmonaire bypass, extra-corporele hemodialyse, kunstkleppen, DIC, TTP-HUS, …
• Osmotisch
Mechanische destructie van RBC 1. Vaatwandruptuur → schuifspanning ↑ 2. Inflammatie vaatwand → fibrinevorming
Mechanisme fragmentatie Hoofdzakelijk via “afsnijden” door fibrinedraden (TMA)
Micro-sfero-schistocyten aan uiteinden vh uitstrijkje
Fragmentatie hemolyse
= vorm van intravasculaire hemolyse • Toename vrij Hb in plasma • Vrij Hb in urine (hemoglobinurie) • Hemosiderine in urine (hemosiderinurie)
Micro/Macroangiopathische hemolytische anemie • Mechanische beschadiging van RBC i/d circulatie → intravasculaire hemolyse & fragmentocyten – – – – – – – –
TTP HUS DIC → urgenties Fu BM-Tx TTP (Pre)eclampsie maligne hypertensie scleroderma renal crisis intravasculaire voorwerpen (bv. kunstkleppen,…)
Definitie fragmentocyt Not “clear cut”!
Definitie? • Schistocyt “shistos” (Gr.) = “verdeeld, deelbaar, afgescheiden" “schizein” (Gr.) = “knippen, klieven, scheiden“ gefragmenteerde RBC
• Vaak samen met andere poikylocyten zoals acantocyten, keratocyten, sferocyten en echinocyten (ook geassocieerd met fragmentatie)
Definities • Dacie & Lewis –
Fragmentatie = “conditie” met 3 typen cellen 1. 2. 3.
• B.Bain –
Kleine fragmenten in verschillende vormen soms met scherpe uiteinden of hoeken, soms met ronde contour, meestal diep gekleurd, maar soms bleek (tgv Hb verlies) Grotere cellen: onregelmatige of ronde contour waarvan fragmenten afgesplitst zijn. Hieronder vallen “helmcellen”. Normale ongefragmenteerde volw RBC en reticulocyten
Fragmenten van RBC gevormd door fragmentatie van abnormale cellen. Bij mechanische schade vaak coëxistentie met keratocyten. Veel schistocyten zijn puntig.
• Wintrobe –
RBC in de vorm van een sikkel, helm, driehoek en/of microsferocyten
• Hoffbrand –
Geen definitie!
Definitie? • Consensus? • Vaak discrepantie tss theorie en praktijk • intra- en interlabo variatie
Consensus report French Group of Cellular Haematology
(= ref. orgaan v/d French Society of Haematology)
• fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm • met een recht snijvlak (dus kleinere RBC dan initieel) • minstens 2 hoeken
= gevolg van in vivo fragmentatie door fibrine draden
Referentiebeelden
Voorbeelden schistocyten
driehoek
kattekop
helm
sikkel
chapeau de gendarme
Géén schistocyten - vbn
RBC met stekels
RBC met gat
Twijfelachtige schistocyten - vbn
Bite cell
staafvormig
Bruikbaarheid definitie? Korte enquête
Definitie schistocyt
(French Group of Cellular Hematology)
= RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak
Welke afgebeelde RBC afwijkingen voldoen volgens u aan de definitie? 1
2
11
21
31
12
3
4
13
14
5
15
22
23
24
25
32
33
34
35
6
7
16
17
26
27
36
37
8
18
28
38
9
19
10
20
29
30
39
40
Oplossing: consensus >75% Biologen (n=24) Groupe français d’hématologie cellulaire (Delphi methode) 1
2
11
21
31
12
3
4
13
14
5
15
22
23
24
25
32
33
34
35
6
7
16
17
26
27
36
37
8
18
28
38
9
19
10
20
29
30
39
40
Rondvraag definitie • Aantal deelnemers n=18 – Experts: 4 hematologen – Assistenten: 4 – MLT’s: 10
• Resultaten – – – – – –
Totaal: gemidd 17 op 38; range 6-29 Experts: gemidd 21 ; range 10-29 Assistenten: gemidd 20.7 ; range 10-28 MLT’s: gemidd 14.3 ; range 6-27 14 van de 38 FRC door >50% deelnemers herkend (37%) 12 van de 38 FRC door 1/3 niet herkend (31.6%)
• Veel gemaakte opmerking: volgens “buikgevoel” zou men meer FRC tellen dan obv definitie
Oplossing: score +/- antwoorden
• Door meer dan 50% herkend • Door 1/3 niet herkend 1
2
11
21
31
12
3
4
13
14
5
15
22
23
24
25
32
33
34
35
6
7
16
17
26
27
36
37
8
18
28
38
9
19
10
20
29
30
39
40
Detectie fragmentocyt
Detectiemogelijkheden • Microscopie • Sysmex – RET channel
• ADVIA 120 – Grootte ≥ BPL – Brekingsindex ≠ BPL
Celtellers: review nodig owv veel VP
Sysmex Roche XE-2100 • Kleine RBC zonder RNA in RET kanaal
MVR
MVR
Discriminator celteller: 100
Relatie tss FRC% (Celteller) en andere parameters
Advia 120 analyser - Bayer • Partikels met grootte ≥ BPL – Kleiner dan 30fL, laserhoek 2-3°
• Andere brekingsindex dan BPL, nl. > 1,4 – ≠ densiteit, laser 5-15°
• Treshold: 10 000/µL
• Bevat niet alleen FRC: VP 0,2-0,3%
Speciale software voor digitale beelden • Daling inter-morfologist variatie • Criteria: opp, circulariteit, verhouding l/b, diameter equivalent • Correctie achteraf
Detectie - besluit • Blijft gelinkt aan de morfologie! – Dus microscopie = noodzakelijk
• Klinische context = gewenst – Neonati, prematuren: FRC = fysiologisch
Telling FRC
Telling • Stabiliteit FRC% op Tk – toename van 14% /24h
Enquête FGH: vb. van rondgestuurd beeld • Aantal FRC?
Antwoorden enquête FGH: #getelde schistocyten
Studie fragmentocyten
Studie opzet • 165 stalen
– Controlegroep: 20 NL – Pathologische groep
• 8 TTP-HUS • 29 kunstkleppen, waarbinnen 24 metalen kleppen & 5 bioprothesen • 22 dialyse • 10 neonati • 29 IZ • 47 “ziek” – (patiënten van oncologie, algemene heelkunde, nefrologie, patiënten met ferriprive anemie, myelofibrose, myelodysplasie, HbS trait, VKF, MVP, …)
Studie opzet • Celteller Sysmex
– CBC + RET channel – Flag? – FRC 10*6/µL, FRC%, RBC fragm
• Automatische microscoop Cellavision DM96 – 9 velden omzetten in een volume
• Correlatie met bloedplaatjestelling
– Visuele telling schistocyten op 9 velden door 1 persoon (daling variatie): echte FRC (recht snijvlak) en TW FRC
• Cut-off? Wanneer rapporteren? – oa rondvraag
• Betekenis schistocyten – Significant verschil tss groepen?
BPL telling • Lineair verband tss #BPL in 9 velden (Cellavision) met #BPL 10*3/µL (Celteller) correlatie plaatjestelling Celteller - Cellavision 700 Lineair (BPL celteller vs # in 9 velden Cellavision)
600
aantal plaatjes Celteller (x10*3/µL)
y = 1.1005x + 4.9175 R2 = 0.871 500
400
300
200
100
0 0
100
200
300
aantal plaatjes 9 velden Cellavision
400
500
600
Histogram - som alle FRC controlegroep
Box Whisker plot - som alle FRC rr Neo Neo 0 Zi 0 Kl 0 TTP 1 Di 0 IZ 0 NL 0
50.5
Z 0 0 1 1 1 0 1
Kl TTP D 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1
IZ 0 0 1 0 1 0 1
NL 0 1 1 1 1 1 0
Significantieniveau 0,05/7= 0,007
14.5
17
13
9
7
2
Histogram - som alle FRC
Cut-off = 7 FRC
ROC curve - som alle FRC
Cut-off = 7 FRC
Cut-off • Hoeveel schistocyten zijn aanwezig bij fragmentatie hemolyse? Literatuur
Studie OLV
NL (n=20)
Mean 0,05% PV 58%, cut off < 0,5%
Mean 2.4 10*3/µL (=0,053%); SD 2 (range 0-7, median 2)
TTP-HUS (n=6)
Mean 8,4% (range 1- 18%)
Mean 117 10*3/µL (= 2,6%); SD 112 (range 29-265, median 50)
Dialyse (n=22)
Mean 0,05%, PV 80-100%
Mean 9 10*3/µL (= 0,2%); SD 6 (range 124, median 7)
Kleppt (n=9)
Mean 0,18% (range 0,20,3%), PV 80-100%,
Mean 12 10*3/µL (= 0,26%); SD 19 (range 1-105, median 9)
IZ (n=29)
Mean 30 10*3/µL (= 0,66%); SD 32.5 (range 3-146, median 17)
“ziek” (n=47)
Mean 27 10*3/µL (= 0,6%); SD 34 (range 2-189, median 13)
Neonati (n=10)
Mean 24 10*3/µL (= 0,53%); SD 40.8 (range 1-137, median 14.5)
Controle populatie • Literatuur – bovengrens = 0,2% = 9.10*3/µL
• OLV studie – 7 FRC in 9 velden = 7.10*3/µL
“TTP” populatie • TTP – Literatuur: > 1% of ≥ 2 schistocyten/veld (100x) is suggestief voor TTP-HUS = 45 .10*3/µL – OLV studie: mediaan = 50,5 .10*3/µL
Histogram - som echte FRC controlegroep
Box Whisker plot - som echte FRC per groep rr Neo Z Kl TTP D Neo Zi Kle TTP Di IZ NL
0 0 0 1 0 0 0
0 0 0 1 0 0 1
0 0 0 1 0 1 1
1 1 1 0 1 1 1
0 0 0 1 0 0 1
IZ 0 0 1 1 0 0 1
NL 0 1 1 1 1 1 0
Significantieniveau 0,05/7= 0,007
Histogram - som echte FRC
Cut-off = 4.5 FRC
ROC curve - som echte FRC
Cut-off = 4.5 FRC
Histogram - ratio FRC/BPL controlegroep
TTP-HUS groep
Box Whisker plot - Ratio FRC/BPL
160
14 6.4
7.7
4.8
4.2 0.7
Correlatie microscopie – waarden celteller? DM96 vs SYS %FRC 6 5
DM96 vs SYS #FRC 10*6/µL
DM96 vs SYS…
% FRC Celteller
4
0,25
#FRC Celteller (10*6/µL)
3
0,2
2
DM96 vs SYS #FRC…
0,15
1
0,1
0 0
20
40 60 80 100 aantal FRC in 9 velden (DM96)
120
0,05
DM96 vs SYS Frag 0 20
40 60 80 aantal FRC in 9 velden (DM96)
100
120
160 140 120 Frag Celteller
0
DM96 vs SYS …
100 80 60 40 20 0 0
20
40 60 80 100 aantal FRC in 9 velden (DM96)
120
Flagging? FRC>7
FRC =of<7
totaal
flag
28
5
33,0
geen flag
52
41
93,0
totaal
80
46
126,0
Sensitiviteit flagging Specificiteit flagging PPV NPV
35% 89% 85% 44%
False positive rate False negative rate LR LR +
11% 65% 1 3
FRC op rapport in Glims? FRC>7 FRC =of<7
totaal
FRC op rapport
35
1
36
geen FRC op rapport
24
19
43
totaal
59
20
79
Sensitiviteit rapportering Specificiteit rapportering PPV NPV
59% 95% 97% 44%
False positive rate
5%
False negative rate LR LR + Power
41% 0 12 1
Betekenis Fragmentocyt
Casus 1 • • •
Dame, °1961 VG: ethylproblematiek + levercirrose Bij opname:
•
IZ: sepsis met E. coli, koorts, neurologische symptomen, verdere plaatjesdaling
• • • • • • • • • • • • • •
RDW-CV *14.2 % Wbc *12730 /µl Rbc *2.76 10e6/µl HGB *9.1 g/dl Hct *25.5 % MCV *92.4 fl Trombocyt *75 10e3/µl Kr 5.06 mg/dl MDRD *9 ml/min/1.73m2 Haptogl 2.91 g/l Bilto 1.1 mg/dl Bildi 0.5 mg/dl LDH 603 U/l CRP 333.02 mg/l
– – –
algemene achteruitgang, BWZ daling, respiratoire achteruitgang Trombopenie met diffuse bloedingen ovv epistaxis, melena, … Ac. nierinsufficiëntie
Vermoeden TTP-HUS dag 3
Vermoeden TTP-HUS dag 3
# FRC in 9 velden = 50
Casus 2 • •
Dame, °1962 Spoedopname wegens – – – –
• • • • • • • • • •
Algemene achteruitgang Laatste 2 weken meer vermoeid, dysnpee d’effort, malaise, … Icterisch, witte sclera Geen medicatie, geen VG
Wbc *5420 /µl Trombocyt *70 10e3/µl Rbc *1.45 10e6/µl RDW-CV *21.6 % SIS_DM_Anis {<++} SIS_DM_Poik {<++} HGB *5.8 g/dl Hct *16.4 % MCV *113.1 fl Retic 29.6 /1000_RBC
• • • • • • • •
D-Dimeren >5000 µg/l Bilto 2.5 mg/dl Bildi 0.5 mg/dl LDH 11290 U/l Haptogl <0.20 g/l CRP 8.94 mg/l Foliumz 1.4 µg/l VIT B12 197 ng/l
• BM: Celrijk beenmerg met zeer celrijke mergbrokjes. Goed vertegenwoordigde myeloïde reeks met reuzenvormen, hypersegmentatie, ... Zeer sterke, megaloblastische rode reeks (uitgesproken megaloblastisch, kernbudding, bijkernen, abnormale kernaflijning). Relatief veel mitosefiguren. Enkele hypersegmentaire megakaryocyten. Meerdere gelyseerde cellen.
Megaloblastische anemie
Megaloblastische anemie
# FRC in 9 velden = 55
Betekenis FRC op IZ?
Correlatie #dagen op IZ en #FRC?
#FRC in 9 velden
Correlatie #d op IZ en #FRC in 9 velden 160
correlatie #d op IZ en #FRC
140
Lineair (correlatie #d op IZ en #FRC)
120 100 80 60 y = -1.5372x + 34.489 R2 = 0.0492
40 20 0 0
5
10
15 #d op IZ
20
25
Betekenis • FRC = belangrijk → urgente therapie – Bij micro- en macro-angiopathie – Ikv verspreide trombosen tijdens trombotische micro-angiopathie (TMA) – Oorzaak van hemolytische anemie tijdens TMA bevestigen diagnose TMA – Scoringssysteem voor BMT-TMA gebaseerd op aantal FRC (prognostisch belang)
Rondvraag FRC
Inhoud rondvraag • 38 rondvragen verstuurd -18 antwoorden ontvangen (=47%) • Definitie • Detectie – Manuele microscopie – aantal velden – Automatische microscopie – aantal velden – Andere methode?
• Manier van rapporteren: kwalitatief, (semi-) kwantitatief
Gebruikte definitie & rapportering in Vlaamse labo’s • Defnitie – Geen consensus – Vaak verwijzing naar handboeken – Vaak opm dat standaardisatie moeilijk is
• 7 op 18 labo’s (=38%)hanteren een duidelijke definitie die analoog is aan die van FGH
• Rapportering ook niet gestandaardiseerd – Vaak rapportering obv “buikgevoel”
Wijze van opsporen & rapporteren FRC in Vlaamse labo’s AANTAL RONDVRAGEN
38
aantal antwoorden
18
duidelijke definitie analoog aan FGH
7
aantal manuele microscopie
18
aantal velden
9.474
min aantal velden
5
max aantal velden
25
aantal automatische microscoop
1
aantal andere methode (flagging)
11
aantal kwalitatieve rapportering
6+2
aantal (semi)kwantitatieve rapportering
10+2
Kwantitatieve rapportering indien veel FRC of op aanvraag (anders enkel kwalitatief)
Besluit FRC
Besluit CAT • Definitie = RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak (dus kleiner dan oorspronkelijke RBC) & minstens 2 hoeken – Training in herkennen FRC
• Telling op aanvraag (aparte analyse): 9 velden automatische microscopie (= # per ± 2000 RBC, # .10*3/µL) • Cut-off: 7 FRC .10*3/µL • Rapportering: # 10*3/µL • Rekening houden met klinische context
Bedankt voor uw aandacht! Suggesties, opmerkingen, vragen?
