Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
2. Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Základní informace o struktuře proteinů a procesu translace jsou uvedeny ve skriptech BartošBartošová (2012): Základy molekulární biologie pro farmaceuty, vydala Farmaceutická fakulta VFU v Brně. Proto se v této části zaměříme pouze na některé aspekty vzniku vyšších proteinových struktur, které jsou pro farmaceutického biotechnologa významné z hlediska jednak vlastní produkce rekombinantních proteinů v heterologních expresních systémech a jednak z pohledu purifikace, stabilizace a přípravy proteinu do formy léčiva. Rovněž se nebudeme výrazně zbývat chaperony, které byly podrobně popsány ve výše zmíněném učebním textu.
2.1. Tvorba vyšších proteinových struktur Vyššími proteinovými strukturami máme na mysli především terciární strukturu, která je rozhodující pro vytvoření funkčních proteinových molekul. Následující odstavce se proto věnují právě této problematice.
2.1.1. Některé proteiny se sbalují už v okamžiku, kdy jsou teprve syntetizovány na ribozómu Proces genové exprese nekončí vyjádřením sekvence nukleotidů v posloupnosti aminokyselin v polypeptidovém řetězci. Nově vzniklý řetězec se musí ještě sbalit do jedinečné trojrozměrné konformace; někdy se k němu ještě připojí malé molekuly kofaktor nebo je vhodně modifikován kinázami nebo jinými protein-modifikujícími enzymy. Řada polypeptidových řetězců interaguje s dalšími proteiny a vytváří funkční kvartérní strukturu. Procesy spojené s tvorbou trojrozměrné struktury proteinu (Obr. 2.1) jsou řízeny především nekovalentními interakcemi. Jsou ale popsány i případy kovalentních modifikací ve specifických aminokyselinách. Nejčastější takovou modifikací je glykosylace nebo fosforylace. Celkem bylo doposud popsáno více než 100 typů kovalentních modifikací polypeptidových řetězců. Informace nezbytná k uskutečnění zmiňovaných procesů je obsažena již v sekvenci aminokyselin polypeptidového řetězce. Sbalování (folding) proteinu do kompaktní struktury je spojeno s „ukrytím“ většiny hydrofobních zbytků aminokyselin do vnitřního jádra proteinu. I ostatní části molekuly interagují velkým množstvím nekovalentních interakcí. Součet všech energeticky výhodných uspořádání pak určuje konečný tvar polypeptidového řetězce, konformaci s nejnižší volnou energií.
1
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Obr. 2.1: Přehled kroků při tvorbě funkčního polypeptidu
nascentní polypeptidový řetězec
sbalování a vazba kofaktoru (nekovalentní interakce)
kovalentní modifikace glykosylací, fosforylací, acetylací, atd.
P
P
vazba k dalším proteinovým podjednotkám maturovaný funkční protein
Po miliony let evoluce byla sekvence aminokyselin každého proteinu selektována nejen na základě konformace, kterou tento protein přijme, ale také na základě rychlosti sbalování. U některých proteinů toto sbalování začíná ihned poté, co polypeptidový řetězec začne vystupovat z ribozómu. U těchto proteinů začíná sbalování jednotlivých domén od N-konce, během několika sekund se vytvoří kompaktní struktura sestávající z α-šroubovic a β-skládaných listů zhruba uspořádaných do konečné konformace (Obr. 2.2). U většiny proteinů je toto neobvykle dynamické a flexibilní nestabilní stadium nazýváno skoro nativní konformace (molten globule) je výchozím strukturou pro relativně pomalý proces, při kterém dochází k řadě postranních interakcí, jež nakonec, pokud celý proces proběhne správně, vytvoří funkční terciární strukturu. Tento proces probíhá u proteinů průměrné velikosti několik minut. U některých proteinů je proces sbalování dokončen současně s tím, jak se z ribozómu uvolní C-konec polypeptidového řetězce (obr. 2.3).
2
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Obr. 2.2: Struktura skoro nativní konformace proteinu Skoro nativní konformace (A) je více otevřená a méně kondenzovaná než finálně sbalený protein (B); obsahuje většinu sekundárních struktur, konce α-šroubovic jsou ale nespletené a jeden z helixů je vytvořen pouze částečně A)
B)
Obr. 2.3: Sbalování proteinu jako kotranslační proces (převzato z Alberts et al.: Molecular biology of the cell, Garland Science, fifth edition, 2008)
rostoucí polypeptidový řetězec
mRNA
balící se Csbalená N- koncová doména koncová doména
ribozóm
3
sbalení proteinu je dokončeno po jeho uvolnění z ribozómu
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
2.2. Na sbalování většiny proteinů se podílejí chaperony Informace o terciární struktuře proteinu je obsažena už v jeho sekvenci aminokyselin, tedy ve struktuře primární. Potažmo se dá říci, že zprostředkovaně je tato informace zakódována již na úrovni sekvence nukleotidů v DNA. Nicméně jsou to nekovalentní interakce typu vodíkových vazeb, iontových interakcí, Van der Waalsových sil a v neposlední řadě hydrofobní interakce, které zajišťují sbalení proteinu do prostorového funkčního uspořádání. Ve vodném prostředí, v podmínkách in vitro lze doložit, že sbalení proteinu je spontánní proces nevyžadující žádnou dodatečnou energii. Za tento objev obdržel v roce 1972 Christian Anfinsen Nobelovu cenu za chemii. Nicméně toto platí pro protein, který se nachází v prostředí v nízké koncentraci, někdy hovoříme, že je protein ukryt v Anfinsenově kleci, kde neinteraguje s jinými proteiny. Tato situace je ovšem v buňce vzácná. Buňka je plná proteinů, které mají přirozeně tendenci reagovat s jinými proteiny a molekulami, které se nacházejí v jejich okolí. Takové reakce ovšem vedou zpravidla k tvorbě agregovaných struktur, které jsou nefunkční. V buňce existuje účinný aparát, který se podílí na sbalování proteinů a zajišťuje jejich funkční stav proteinů za podmínek, ve kterých by byly jinak nesbaleny, ale agregovány. Tento aparát tvoří proteiny, které se označují jako „chaperony“ (z angl. „garde, ochranný průvodce“). Chaperony se vážou k částečně složeným řetězcům polypeptidů a udržují je v rozvinuté formě při pohybu cytoplasmou a přes jednotlivé buněčné membrány. V podmínkách přeplněné cytoplasmy jsou chaperony životně nezbytné, protože chrání nově syntetizované proteinové řetězce před asociací s nesprávnými partnery. Termín chaperony byl zvolen proto, že podobně jako jejich protějšky v lidské společnosti zabraňují nechtěným kontaktům (interakcím) mezi nevyzrálými jedinci (dosud nesbalenými proteiny). Mechanismy působení chaperonů byly popsány ve výše zmíněném učebním textu, který doporučujeme prostudovat. Zde přidáváme jen několik detailů.
2.2.1. Odkryté hydrofobní oblasti jsou kritickými signály pro mechanismy kontroly správného sbalení proteinů Jak rozpozná buňka, že je nově syntetizovaný protein správně sbalený a může být tedy použitelný pro vykonání specifické funkce? Jednou z možností je rozpoznání hydrofobních aminokyselin na povrchu již sbaleného proteinu. Jak vyplývá ze zákonů termodynamiky, mají hydrofobní části molekul tendenci se „ukrýt“ před molekulami vody do vnitřních struktur proteinu. Existence hydrofobních aminokyselin na povrchu proteinu je tedy varovným signálem, že s proteinem není něco v pořádku. Mohlo dojít k nesprávnému sbalení polypeptidového řetězce nebo, v případě proteinový komplexů, i třeba správně sbalená struktura nenašla jinou molekulu, která s ní tvoří funkční celek. Nesprávně strukturovaný protein nejenže nemusí být v buňce funkční, ale jeho přítomnost může i škodit. Proteiny s abnormálně odkrytými hydrofobními oblastmi vytvářejí v buňce rozsáhlé agregované struktury. Byly popsány případy, kdy jsou tyto agregované struktury příčinou vážných onemocnění člověka.
Buňka předchází vytváření agregovaných struktur vlastními kontrolními mechanismy. Některé jsou přímo řízeny již zmíněnými chaperony, které dávají nesprávně sbaleným proteinům novou šanci
4
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie se správně sbalit v opakovaných cyklech sbalování. Současně s tím ochraňují odkryté hydrofobní části před promiskuitními interakcemi s jinými proteiny. Proteiny, které se sbalují rychle ale kontrolním mechanismům chaperonů unikají. Na obr. 2.4 jsou schematicky znázorněny mechanismy, které zajišťují správné sbalení proteinů.
Obr. 2.4: Procesy kontroly správného sbalení proteinů
nově syntetizovaný protein
vytvoření agregovaných struktur
správně sbalený protein – bez pomoci správně sbalený protein s pomocí chaperonů nesprávně sbalený protein rozložený proteazómem
2.2.2. Proteozóm - kompartmentalizovaná proteáza se zablokovanými aktivními místy Ty proteiny, které nejsou opraveny s pomocí chaperonů, mohou být kompletně destruovány proteolýzou. Poté, co je na proteinu rozpoznána přítomnost abnormálních hydrofobních struktur, jsou transportovány do tzv. proteozómu, komplexu, který obsahuje ATP dependentní proteázy. Tyto proteázy tvoří 1% všech buněčných proteinů a jsou rozmístěny v jádře a cytosolu. Nesprávně sbalené proteiny, které proniknou až do endoplasmatického retikula, jsou z něj translokovány ven do cytosolu, kde jsou prostřednictvím proteozómů degradovány. Každý proteozóm sestává z centrálního dutého válce tvořeného multimerními proteinovými jednotkami, které se skládají do 4 vrstev heptamerních kruhů (Obr. 2.5). Proteázy jsou umístěny na vnitřní straně dutého válce. Proteolýza vyžaduje ATP a na rozdíl od standardního proteolytického štěpení při ní nedochází k pouhému přestřižení polypeptidového řetězce na dvě části, ale v důsledku přítomnosti většího počtu různých proteáz, vede k degradaci proteinů až na malé peptidy.
5
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Obr. 2.5: Proteozóm (převzato z Alberts et al.: Molecular biology of the cell, Garland Science, fifth edition, 2008). Centrální válec je vyznačen žlutě, regulační částice modře, aktivní místa červenými body
Na obou koncích válce jsou umístěny velké proteinové komplexy, které obsahují kruhy o 6 podjednotkách. Tyto komplexy jsou označovány jako regulační částice. Jsou na nich uchycovány proteiny, které mají být degradovány, předtím, než jsou transportovány dovnitř válce k proteolytickým enzymům. Až na pár výjimek musí být proteiny určené k degradaci v proteozómu označeny specifickým signálem, malým proteinem označovaným jako ubiquitin. Ubiquitinace proteinu je signálem pro degradaci proteinu, to ale neplatí vždy (obr. 2.6). Důležitou složkou proteozómu jsou tzv. „defoldázy“, které mají za úkol rozbalovat proteinový řetězec tak, aby mohl prostupovat skrz válcovitou strukturu proteozómu. Proces rozbalování proteinu vyžaduje energii ATP. Proces štěpení proteinu v proteozómu je zachycen na obr. 2. 7. Obr. 2.6: Ubiquitinace (převzato z Alberts et al.: Molecular biology of the cell, Garland Science, fifth edition, 2008). V závislosti na typu ubiquitinace získává modifikovaný protein specifickou funkci. V případě polyubiquitinace dochází k proteozomální degradaci proteinu, je-li modifikován v pozici Lys48; pokud je modifikován v pozici Lys63, pak se účastní reparace DNA. Typ modifikace rozpoznávají specifické proteiny.
monoubiquitinace
multiubiquitinace
poly-ubiquitinace
regulace reparace endocytóza degradace histonů DNA Obr. 2.7: Štěpení proteinu v proteozómu (převzato z Alberts et al.: Molecular biology of the cell, Garland Science, fifth edition, 2008). V závislosti na typu ubiquitinace získává modifikovaný protein
6
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
cílový protein s polyubiquitinovaným řetězcem
centrální válec (proteázy)
aktivní místa
regulační částice
2.2.3. Mnoho proteinů je kontrolováno regulovanou destrukcí Jednou z funkcí molekulárních proteolytických mechanismů je rozpoznat a odstranit nesprávně sbalené nebo jinak abnormální proteiny. Další funkcí proteolytických drah je zajistit krátký poločas života specifických normálních proteinů, jejichž koncentrace se musí rychle měnit v závislosti na změnách buněčného cyklu. Některé z těchto krátkodobě „žijících“ proteinů jsou degradovány rychle, jiné jsou tzv. podmíněně krátkodobé, tzn., že jsou metabolicky stabilní za určitých podmínek, ale za jiných jsou nestabilní. Tato regulovaná degradace proteinů je kontrolována mnoha mechanismy. Jedním z nich je aktivace ubiquitin ligázy fosforylací nebo alostericky, ubiquitin ligáza připojuje ubiquitin na zbytky lysinu degradovatelného proteinu. Jiné mechanismy spočívají ve vytvoření signálů pro degradaci přímo ve struktuře molekuly proteinu, např. fosforylací, disociací proteinových jednotek nebo štěpením jedné peptidové vazby spojeným s vytvořením nového, degradovatelného N-konce. Např. u S. cerevisiae existuje 12 aminokyselin, které jsou specifické pro degradovatelné N-konce (Arg, Lys, His, Phe, Leu, Tyr, Trp, Ile, Asp, Glu, Asn, Gln).
Podjednotka kohesinu, proteinového komplexu, který drží pohromadě sesterské chromatidy, je na přechodu metafáze-anafáze štěpena vysoce specifickou proteázou. Toto štěpení je regulováno v závislosti na fázi buněčného cyklu a umožňuje rozchod sesterských chromatid, což vede k dokončení mitózy. C-koncový fragment štěpené podjednotky nese N-koncový argininu, což je aminokyselina, která N-konec destabilizuje. Mutanty, které ztratily schopnost odstraňovat degradovatelné N-konce, se vyznačují vysokou četností ztráty chromozómů, protože neschopnost degradovat tento fragment kohezinu interferuje s tvorbou nových komplexů chromatida-kohezin v dalším buněčném cyklu.
7
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie 2.2.4. Nesprávně sbalené proteiny mohou agregovat, což vede k destruktivním onemocněním u lidí Mnoho dědičných lidských onemocnění (např. srpkovitá anémie, deficience α-1-antitrypsinu, která vyúsťuje k onemocněním jater a rozedmě plic) má původ v mutantních formách proteinů, které se vymkly vnitrobuněčným kontrolním mechanismům, sbalují se abnormálně a tvoří agregované struktury. Agregované struktury absorbují makromolekuly, vážně poškozují buňky a dokonce vyvolávají smrt buňky. Často může onemocnění vyvolat jediná mutantní alela, protože normální kopie genu nemůže buňku před destruktivními vlastnostmi agregovaných struktur ochránit. U normálně zdravých lidí může vyvolat onemocnění také postupný pokles aktivity buněčných proteinů zodpovědných za kontrolní mechanismy. To vede k situaci, že i normální proteiny vytvářejí agregáty. V některých případech se agregované struktury uvolňují z odumřelých buněk a akumulují se v extracelulární matrix. A v extrémních případech mohou také poškodit celou tkáň. Např. mozek, který je tvořen vysoce organizovaným souborem nervových buněk, je tedy zvláště zranitelný. Není tedy překvapující, že proteinové agregáty primárně vyvolávají neurogenerativní onemocnění. Některé agregované struktury proteinů jsou vysoce rezistentní k proteolytickým enzymům. Je to dáno tím, že vytvářejí fibrily sestavené ze série polypeptidových vláken navrstvených na sebe jako nepřetržitá vrstva β-struktur. Mnoho neurogenerativních onemocnění je typické přítomností takových struktur, které se označují jako amyloidní plaky. Příklady onemocnění, při kterých se vyskytují agregované proteinové struktury, jsou Huntingtonova chorea, Alzheimerova nemoc a onemocnění vyvolaná priony – scrapie u ovcí, Creutzfeld-Jakobova choroba u lidí, bovinní spongioformní encephalopathie (BSE) u dobytka. Prionová onemocnění jsou vyvolána nesprávně sbalenými, agregovanými, formami proteinu, který se označuje jako PrP (prion protein). PrP je normálně lokalizován na vnějším povrchu plasmatické membrány, zvláště v neuronech. Jeho normální funkce není známa. Tento protein snadno vytváří speciální abnormální konformaci, která je kromě své rezistence k proteázám také „infekční“ protože může konvertovat normálně sbalené molekuly do patologické formy. Vytvoření patologické struktury PrP* má pozitivní vliv na tvorbu dalších patologických struktur a tak se množství nesprávných struktur rychle zvyšuje a šíří se z buňky do buňky.
2.3. Tvorba disulfidických můstků v buňce Proces sbalování proteinů je doprovázen tvorbou disulfidických můstků. V prokaryotické buňce tento proces probíhá v periplasmatickém prostoru. V buňce eukaryotické je hlavním kompartmentem endoplasmatické retikulum a rovněž prostor mezi dvěma membránami obalujícími mitochondrie. Mechanismus oxidace v endoplasmatické retikulu a mezi membránami mitochondrií je odlišný a nemá společný evoluční původ. Vlastní prostředí cytoplasmy, kde dochází k syntéze proteinů na ribozómech, je redukující kvůli vysoké koncentraci redukovaného glutathionu a řadě redukujících enzymů. To tvorbu disulfidických můstků a vytvoření správné terciární struktury znemožňuje. Teprve po transportu nově vzniklého polypeptidového řetězce do oxidativního prostředí jiného kompartmentu, např. endoplasmatického retikula, může dojít k vytvoření disulfidických můstků. Tím je také zajištěno, že protein získá svou aktivní konformaci a zahájí svou činnost teprve poté, co je zacílen do místa konečné destinace.
8
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Tvorba disulfidických můstků je reverzibilní proces, při kterém jsou thiolové skupiny dvou cysteinových zbytků oxidovány do formy kovalentně propojeného disulfidu. Toho lze dosáhnout výměnou thiol-disulfid, při které je disulfidová vazba, jako akceptor elektronů, redukována. Alternativně vede přenos elektronů na kyslík k tvorbě disulfidu de novo (Obr. 2.8). K této reakci je zapotřebí katalyzátorů jako jsou přechodné kovy nebo kofaktor FAD. Obr. 2.8.: Tvorba disulfidického můstku. Protein je oxidován oxidoreduktázami, které pouze přesunují disulfidové vazby původně vytvořené sulfhydryl oxidázami. Síla procesu oxidace je poskytována kyslíkem.
SH SH SS
kyslík
oxidoreduktáza výměna thiol-disulfid
sulfhydryl oxidáza tvorba disulfidu de novo
V mitochondriích se na procesu tvorby disulfidických můstků ve struktuře proteinů podílejí dva hlavní proteiny, označované Mia40 a Erv1. Mia40 ve své oxidované formě oxiduje cysteinové zbytky polypeptidového řetězce, který do mitochondrie vstupuje z cytoplasmy. Oxidovaný protein pak už není schopen překročit vnější membránu zpět a dostává se do mezimembránového prostoru. Reoxidace Mia40 zabezpečuje Erv1, protein patřící do rodiny sulfhydryl oxidáz obsahujících FAD. Erv1 je oxidován cytochromem c, který pak přenáší elektrony přes cytochromoxidázu na kyslík, za vzniku vody. Proces je napojen na respirační řetězec, čímž se zvyšuje jeho efektivita; současně je zabráněno tvorbě H2O2 v mezi membránovém prostoru (Obr. 2.9). V endoplasmatickém retikulu dochází k vytvoření disulfidických můstků současně s translokací proteinu. V první reakci jsou elektrony přeneseny z redukovaného substrátu na oxidovanou formu enzymu z rodiny bisulfid isomeráz, který je následně reoxidizován flavonenzymem Ero1, který přenáší elektrony přes FAD na kyslík (Obr. 2.9).
9
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Obr. 2.9: Spojení tvorby disulfidických můstků s translokací.
Jaké jsou odlišnosti spalovacích systémů v ER a mitochondriích? 1) V eukaryotické buňce se většina proteinů sbaluje v endoplasmatické retikulu, podíl mitochondriových proteinů tvoří jen minoritní část. V mitochondriové membráně se upravují jen malé proteiny o molekulové hmotnosti M = 7 000 až 15 000. Všechny tyto proteiny mají uniformní strukturu „helix-otáčka-helix“, při které jsou oba helixy vzájemně propojeny disulfidickými můstky. Naproti tomu proteiny sbalované v endoplasmatické retikulu tvoří pestré spektrum různých velikostí a forem. 2) Endoplasmatické retikulum obsahuje širokou škálu disulfid isomeráz, které své substráty oxidují, izomerizují nebo redukují. V mitochondriích se vyskytuje pouze Mia40, který substrát přímo oxiduje. 3) Sulfhydryloxidázy Erv1 (v mitochondriích) a Ero1 (v endoplasmatické retikulu) vytvářejí disulfidické můstky de novo. Ačkoli jsou tyto enzymy evolučně nepříbuzné, obsahují stejnou vnitřní strukturu: 4 svazky šroubovic, které koordinují umístění kofaktoru FAD do blízkosti
10
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie dvou cysteinů. Ačkoli mají oba enzymy odlišné sekvence aminokyselin, jsou jejich trojrozměrné struktury velmi podobné. Jedná se o pěkný příklad konvergence. 4) Prostorová organizace tvorby disulfidických můstků byla podrobně popsána pro mitochondrie, jak je tomu u endoplasmatického retikula není jasné. 5) V mitochondriích nevzniká H2O2. Ero1 v endoplasmatické retikulu přenáší elektrony přímo na molekulární kyslík. Jak je tato látka deaktivována, není jasné. V mitochondriích je Erv1 napojen přímo na respirační řetězec a výsledným produktem je voda. 6) Díky pronikání malých molekul jako je glutathion do mezimembránového prostoru mitochondrií poriny, je podíl redukovaného glutathionu k oxidovanému vyšší. Endoplasmatické retikulum tvoří více oxidativní prostředí než mezimembránový prostor mitochondrií, ačkoli ten je pořád více oxidativní než cytoplasma nebo vnitřní matrix mitochondrie. 7) Protože v endoplasmatické retikulu vzniká jedna molekula peroxidu vodíku na jednu nově vytvořenou disulfidickou vazbu, je zde nebezpečí vzniku hyperoxidativního prostředí. Aby k tomu nedošlo, je oxidační aktivita Ero1 regulována následujícím způsobem: ve struktuře Ero1 jsou cysteinové zbytky, které tvoří intramolekulární disulfidické vazby, po jejich vytvoření je aktivita enzymu zablokována.
Více si můžete přečíst zde: Riemer J. et al. (2009): Disulfide formation in the ER and mitochondria: two solutions to a common process. Science 324, 1284-1287.
11
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
2.4. Posttranslační modifikace proteinů Mnoho proteinů je kotranslačně nebo posttranslačně modifikováno připojením dalších struktur kovalentními vazbami. Přehled modifikací je uveden v Tabulce 2.1. Tyto modifikace mění strukturu a biologickou aktivitu proteinů. Nejběžnější modifikací je glykosylace. Co se terapeuticky významných proteinů týče, jsou většinou posttranslačně modifikovány jak glykosylací, tak karboxylací, hydroxylací, sulfatací a amidací.
Tabulka 2.1: Typy kotranslačních a posttranslačních modifikací proteinů (podle Walsh, Pharmaceutical biotechnology, 2007) Modifikace
Příklad
Proteolytické štěpení
Řada proteinů se stane biologicky aktivních až po jejich proteolytickém štěpení (např. některé krevní faktory)
Glykosylace
Glykosylace zvyšuje solubilitu, ovlivňuje biologický poločas nebo biologickou aktivitu některých proteinů
Fosforylace
Ovlivňuje biologickou aktivitu různých polypeptidových hormonů
Acetylace
Funkce nejasná
Acylace
Napomáhá některým polypeptidům interagovat a začleňovat se do biologických membrán
Amidace
Ovlivňuje biologickou aktivitu a stabilitu některých polypeptidů
Sulfatace
Ovlivňuje biologickou aktivitu některých neuropeptidů a proteolytické úpravy některých polypeptidů
Hydroxylace
Důležitá pro strukturální uspořádání určitých proteinů
Tvorba γ-karboxyglutamátu
Důležitá pro vazbu některých krevních proteinů k Ca2+
ADP-ribosylace
Reguluje biologickou aktivitu různých proteinů
Tvorba disulfidových vazeb
Pomáhá stabilizovat konformaci některých proteinů
2.4.1. Glykosylace Glykosylace, tedy připojení cukerného zbytku k polypeptidovému řetězci, je jednou z nejčastějších modifikací eukaryotických proteinů obecně, vyskytuje se ale hlavně u extracelulárních proteinů a proteinů vyskytujících se na povrchu buněk. Glykosylací vznikají glykoproteiny. U některých glykoproteinů nemá odstranění cukerné části vliv na biologické vlastnosti.
12
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Deglykosylované formy glykoproteinů lze připravit účinkem inhibitorů glykosylace, např. antibiotikem tunicamycinem v růstovém médiu nebo enzymatickou degradací glycidické části preformovaného glykoproteinu glykosidázou. U jiných proteinů má cukerná složka naopak přímý biologický účinek. Přehled takových aktivit je uveden v Tabulce 2.2.
Tabulka 2.2: Potenciální účinky glycidické části glykoproteinů (podle Walsh, Pharmaceutical biotechnology, 2007) Účinek Sbalování proteinů
Transport/zacílení proteinů
Rozpoznání/vazba ligandů
Biologická aktivita
Stabilita
Reguluje biologický poločas proteinu
Imunogenicita
Komentář Glykosylace může ovlivnit lokální sekundární strukturu proteinu a napomoci přímému sbalení polypeptidového řetězce.
Glycidická část se může účastnit na sestřiďování/usměrnění proteinu do finální destinace.
Glycidická část protilátek se např. účastní vazby k Fc receptoru monocytů a interaguje s komponentou C1q komplementu.
Glycidická část gonádotrofinů je nezbytná k aktivaci signální transkripce gonádotrofinů. Cukerná část stabilizuje glykoproteiny mnoha způsoby, např. zvýšením jejich rozpustnosti, zastíněním hydrofobních částí na jejich povrchu, ochranou před proteolýzou a přímou účastí na stabilizačních interakcích v rámci téhož polypeptidového řetězce. Vysoké hladiny kyseliny sialové mohou prodloužit biologický poločas plasmatických glykoproteinů. Zbytky galaktózy zkracují biologický poločas. U kvasinek jsou proteiny často glykosylovány manózou, což biologický poločas také zkracuje kvůli vychytávání glykoproteinů receptory pro manózu na buněčném povrchu. Některé glykosylační motivy charakteristické pro rostlinné glykoproteiny (často obsahují zbytky fukózy a xylózy) jsou vysoce imunogenní pro savce.
Příkladem vysoce glykosylovaného proteinu je gonádotropní hormon lidský choriový gonádotropin (hCG). Odstranění glycidické části má za následek ztrátu biologické aktivity, ačkoli se hormon stále váže na svůj receptor, někdy dokonce s vyšší aktivitou. Glykosidická část je syntetizována rodinou enzymů označovaných jako glykosyltransferázy. Tyto enzymy jsou lokalizovány většinou v endoplasmatické retikulu. Jsou známy dva typy glykosylace:
13
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie N-glykosylace a O-glykosylace. V případě N-glykosylace je glykosid připojen k proteinu přes atom dusíku na asparaginu, u O-glykosylace přes kyslík hydroxylových skupin, zpravidla serinu a threoninu (Obr. 2.10). Obr. 2.10: Glykosylace N-glykosidace asparaginu
O
HN
CH
O
C
HN
CH2 C
CH
C
CH2 O
C
H2O
NH2
O
NH
+ OH
cukr
cukr
O-glykosidace serinu
O
HN
CH
O
C
HN
CH2 OH
CH
CH2 H2O
+ OH
O
cukr
cukr 14
C
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie V glykosidické části se většinou nachází monosacharidy manosa, galaktosa, glukosa, fukosa, Nacetylgalaktosamin, xylosa a kyselina sialová. Monosacharidy pak tvoří rozmanité polymerní struktury, proto jsou glykosidické struktury glykoproteinů velmi složité. Příklady dvou oligosacharidových řetězců v glykoproteidech jsou uvedeny na obr. 2.11.
Obr. 2.11: Příklady postranních řetězců oligosacharidů u glykoproteinů, Man = manóza, Gal = galaktóza, SA = sialová kyselina, GlcNAc = N-acetylglukosamin, GalNAc = N-acetyl galaktosamin
SA
Gal
GlcNAc
Man Man
SA
Gal
GlcNAc
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Ser
Man
Gal
SA
N-glykosylace je sekvenčně specifická. Dochází při ní k přenosu presyntetizovaného oligosacharidového řetězce na asparagin, který se vyskytuje v sekvenčním motivu Asn-X-Ser nebo Asn-XThr nebo Asn-X-Cys, kde X je jakákoli aminokyselina s výjimkou prolinu. Ne všechny uvedené motivy jsou ale glykosylovány. Znamená to, že o glykosylaci rozhodují i jiné faktory. Po tomto prvním kroku je oligosacharidový řetězec dále modifikován glykosyltransferázou. Faktory ovlivňující O-glykosylaci jsou prozkoumány méně. Není znám jednoznačný sekvenční motiv, o O-glykosylaci pravděpodobně rozhoduje trojrozměrná struktura polypeptidové domény. Některé glykoproteiny obsahují pouze N-glykosylované zbytky, jiné pouze O-glykosylaci a jiné oba typy glykosylací. Například EPO má tři N-glykosylované a jeden O-glykosylovaný zbytek. Přesné složení a struktura glykosidů se můžou u jednoho typu glykoproteinu mírně lišit. Tomuto jevu se říká mikroheterogenita glykosidovaných proteinů. Mikroheterogenitu lze zkoumat isoelektrickou fokusací. Téměř všechny terapeuticky významné glykoproteiny vykazují mikroheterogenitu. Příkladem je lidský interferon γ, který se vyskytuje ve dvou formách o molekulové hmotnosti 20 000 a 25 000. Obě formy se liší pouze stupněm a polohou N-glykosylačních míst. Glykosylace komplikuje produkci rekombinantních proteinů v heterologních expresních systémech. Lidské rekombinantní proteiny produkované v jiných než lidských buněčných kulturách jsou glykosylovány odlišným způsobem, takové glykoproteiny jsou pak zpravidla nepoužitelné pro terapii.
15
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie Přehled glykosylovaných terapeutických proteinů, které se aktuálně používají v medicíně je uveden v Tabulce 2.3. Tabulka 2.3: Glykosylované terapeutické proteiny v tržní síti (podle Walsh, Pharmaceutical biotechnology, 2007) Kategorie produktu
Obchodní název
Krevní faktory, antikoagulanty, trombolytika
Activase, Advate, Benefit, Bioclate, Helixate/Kogenate, Metalyse/TNKase, Novoseven, Recombinate, Refacto, Xigiris
Protilátky
Avastin, Bexxar, Erbitux, Herceptin, Humaspect, Humira, Mabcampath/Campath-H1, Mabthera/Rituxan, Mylotarg, Neutrospec, Oncoscint, Orthoclone OKT-3, Prostascint, Raptiva, Remicade, Simulect, Synagis, Xolair, Zenapax, Zevalin
Hormony
Gonal F, Luveris, Ovitrelle/Ovidrel, Puregon/Follistim, Thyrogen
EPO a CSF
Epogen/Procrit, Leukine, Neorecormon, Nespo/Aranesp
Interferon
Avonex, Rebif
Ostatní
Aldurazyme, Amevive, Cerezyme, Enbrel, Fabrazyme, Inductos, Infuse, Osigraft/OP-1 implant, Pulmozyme, Regranex, Replagal
2.4.2. Karboxylace a hydroxylace Omezený počet proteinů je modifikován γ-karboxylací nebo β-hydroxylací. Většinou se jedná o proteiny, které se podílejí na hemostáze. γ-karboxylace spočívá v enzymatické konverzi specifických zbytků kyseliny glutamové za vzniku γ-karboxyglutamátu. Při β-hydroxylaci dochází k hydroxylaci kyseliny asparagové za vzniku β-hydroxyaspartátu (Obr. 2.12). Obě modifikace umožňují vazbu iontů vápníku, což zabezpečuje efektivní funkci krevních faktorů VII, IX a X a taky aktivaci proteinu C a proteinu S antikoagulačního systému.
2.4.3. Sulfatace a amidace Malý počet biofarmak je sulfatován nebo amidován. Sulfatace je připojení skupiny SO42k cílovému polypeptidu v místě tyrozinu. Sulfatace má význam pro interakce protein-protein, ztráta sulfatace snižuje aktivitu polypeptidu. Významným terapeuticky významným proteinem, který je sulfatován, je antikoagulant hirudin a krevní faktory VIII a IX. Rekombinantní proteiny zpravidla nejsou sulfatovány, ale vykazují ještě terapeutický účinek. Amidace je náhrada karboxylové skupiny na C-konci polypeptidu aminoskupinou (COOH CONH2). K této modifikaci dochází u krátkých peptidů. Amidace je málo prozkoumaná, ale je nezbytná pro funkci výsledného produktu.
16
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
Obr. 2.12: Karboxylace a hydroxylace, Glu = kyselina glutamová, Gla = kyselina γ-karboxyglutamová, Asp = kyselina asparagová, Hya = kyselina β-hydroxyasparagová, Asn = asparagin, Hyn = β-hydroxyasparagin
O HN
CH
O HN
C
CH
CH2
C
CH2 γ-karboxylace (Glu Gla)
CH2
CH COO-
COO-
COO-
O
HN
CH
O
C
CH2
HN
CH
HO
CH
β-hydroxylace (Asp Hya)
COO-
COO-
O HN
CH
O
C
CH2 CONH2
C
β-hydroxylace (Asn Hyn)
17
HN
CH
HO
CH
CONH2
C
Proteiny – hlavní produkty farmaceutické biotechnologie
2.5. Shrnutí kapitoly Proces genové exprese nekončí vyjádřením sekvence nukleotidů v posloupnosti aminokyselin v polypeptidovém řetězci. Nově vzniklý řetězec se musí ještě sbalit do jedinečné trojrozměrné konformace. Informace nezbytná k uskutečnění sbalení je obsažena již v sekvenci aminokyselin polypeptidového řetězce. Při sbalování je většina hydrofobních postranních skupin aminokyselin ukryta do vnitřního jádra proteinu. Existence hydrofobních aminokyselin na povrchu proteinu je tedy varovným signálem, že s proteinem není něco v pořádku. Při sbalování vznikají konečný tvar polypeptidového řetězce, který odpovídá konformaci s nejnižší volnou energií. V buňce existuje účinný aparát, který se podílí na sbalování proteinů a zajišťuje jejich funkční stav proteinů. Tento aparát tvoří proteiny, které se označují jako „chaperony“. Ty proteiny, které nejsou správně sbaleny, mohou být kompletně destruovány proteolýzou. Poté, co je na proteinu rozpoznána přítomnost abnormálních hydrofobních struktur, jsou transportovány do tzv. proteazómu, komplexu, který obsahuje ATP dependentní proteázy podílející se na degradaci nesprávně sbalených proteinů. Degradace je regulovaný proces, který je kontrolován mnoha mechanismy – ubiquitinací, fosforylací, apod. Nesprávně sbalené proteiny mohou agregovat, což vede k destruktivním onemocněním (např. srpkovitá anémie, deficience α-1-antitrypsinu, která vyúsťuje k onemocněním jater a rozedmě plic). Původ takových procesů může být v mutantních formách proteinů, které se vymkly vnitrobuněčným kontrolním mechanismům. Onemocnění může vyvolat také postupný pokles aktivity buněčných proteinů zodpovědných za kontrolní mechanismy. Proces sbalování proteinů je doprovázen tvorbou disulfidických můstků. V prokaryotické buňce tento proces probíhá v periplasmatickém prostoru. V buňce eukaryotické je hlavním kompartmentem endoplasmatické retikulum a rovněž prostor mezi dvěma membránami obalujícími mitochondrie. Mechanismus oxidace v endoplasmatické retikulu a mezi membránami mitochondrií je odlišný a nemá společný evoluční původ. Mnoho proteinů je kotranslačně nebo posttranslačně modifikováno připojením dalších struktur kovalentními vazbami. Tyto modifikace mění strukturu a biologickou aktivitu proteinů. Nejběžnější modifikací je glykosylace. Co se terapeuticky významných proteinů týče, jsou většinou posttranslačně modifikovány jak glykosylací, tak karboxylací, hydroxylací, sulfatací a amidací.
2.6. Příklady a úlohy k zamyšlení 1) Může v bakteriální buňce E. coli vznikat kvartérní struktura proteinů? 2) Popište vznik inzulínu v rámci posttranslačních úprav pre-proinzulínu, kolik disulfidických můstků obsahuje inzulín? 3) Jakou látkou lze in vitro provést tzv. redukční štěpení, tj. vytvoření dvou samostatných skupin -SH namísto jednoho disulfidického můstku? 4) Uveďte příklad glykosylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 5) Uveďte příklad fosforylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 6) Uveďte příklad ubiquitinovaného proteinu a jeho funkci v buňce
18
