2. PROTEINOVÉ TECHNIKY

O OB BSSA AH H 1. DNA TECHNIKY (P. Kotrba, Z. Knejzlík)

1

1.1 Polymerasová řetězová reakce - klonování DNA in vitro

1

1.2 Polymorfismus DNA a jeho analýza

3

1.3 VNTR sekvence, jejich význam v kriminalistice a diagnostice některých onemocnění

4

1.4 Lokus D1S80

7

1.5 Praktické úlohy

8

1.5.1 Analýza polymorfismu lokusu D1S80

8

1.5.1.1 Izolace genomové DNA z buněk ústní sliznice

9

1.5.1.2 Amplifikace lokusu D1S80 pomocí PCR

11

1.5.1.3 Analýza výsledku PCR a anticipované výsledky

13

1.5.2 Izolace DNA z buněk

15

1.5.2.1 Izolace většího množství DNA z epiteliálních buněk

15

1.5.2.2 Příprava genomové DNA z cibule kuchyňské

17

1.5.3 Analýza DNA a proteinů pomocí elektroforesy v agarosovém gelu

18

1.5.3.1 Standardní badatelská elektroforesa DNA v agarosovém gelu

19

1.5.3.2 Agarosová elektroforesa DNA v krabičce

21

1.5.3.3 Proteinová nativní elektroforesa v krabičce

24

1.5.4 Papírový model DNA

25

2. PROTEINOVÉ TECHNIKY (J. Lipov, P. Ulbrich)

26

2.1 Enzymy

26

2.2 Sacharidy

28

2.3 α-amylasa, stanovení její aktivity ve slinách a vliv reakčních podmínek na enzymovou aktivitu

29

2.4 Tajemné chování strukturních virových proteinů - jak přinutit stovky molekul proteinu aby se poskládaly do sférické částice?

33

2.4.1 Retrovirové strukturní proteiny

33

2.4.2 Praktická úloha aneb složte si částice podobné virům ve zkumavce a podívejte se na ně

35

3. BAREVNÁ OBRAZOVÁ PŘÍLOHA

39

-1-

11.. D DN NA AT TE EC CH HN NIIK KY Y 11.. 11.. PPOOLLYYM MEER RA ASSO OV VÁ ÁŘ ŘEETTĚĚZZO OV VÁ ÁR REEA AK KC CEE -- K KLLO ON NO OV VÁ ÁN NÍÍ D DN NA A IINN VVIITTRROO PCR (z angl. Polymerase chain reaction) umožňuje rychlé, velice citlivé a specifické pomnožení (amplifikaci) konkrétní nukleotidové sekvence obsažené v jakékoliv molekule deoxyribonukleové kyseliny (DNA) a případně i ribonukleové kyseliny (RNA). Jak bude popsáno v následujícím textu, tato technika je prováděna zcela v podmínkách in vitro. Vedle využití v molekulárně biologickém výzkumu nalezla PCR řadu praktických aplikací - je dnes široce využívána v genovém inženýrství pro namnožení (klonování) genu z malého vzorku nukleové kyseliny a jeho případné pozměnění (mutaci), pro detekci geneticky modifikovaných organismů (např. plodin pro výrobu potravin), v diagnostice při analýze genetických chorob, detekci virových infekcí, při určování genetického polymorfismu (např. při cíleném šlechtěných rostlin) nebo v soudním lékařství k identifikaci osob. V molekule DNA se deoxyribonukleotidy spojují prostřednictvím kovalentní fosfodiesterové vazby mezi fosfátem na hydroxylu uhlíku C5 (5’) deoxyribosy jednoho nukleotidu a hydroxylem na C3 (3’) následujícího nukleotidu do dlouhých polynukleotidových řetězců vlákna DNA. Tímto uspořádáním je také určena polarita lineární molekuly, která má na jednom konci volný fosfát na C5 deoxyribosy (označován jako 5’ konec) a na druhém hydroxyl na C3 deoxyribosy (označován jako 3’ konec). Protože oba řetězce dvojřetězcové DNA obsahují sekvence nukleotidů, které jsou navzájem přesně komplementární, mohou obě vlákna sloužit jako templát (matrice, předloha) pro syntézu nového komplementárního vlákna za vzniku dvou identických dvojřetězcových DNA – kopírování (klonování) DNA. Jinými slovy, pokud si jeden řetězec označíme jako plus a druhý minus, může plus řetězec sloužit jako templát pro syntézu nového minus vlákna, zatímco původní minus vlákno je předlohou pro nové vlákno plus (Obr. 1.1 A, viz příloha). Tvorba nového vlákna je katalyzována enzymem DNA polymerasou. Tento enzym katalyzuje syntézu vlákna DNA z monomerních deoxyribonukleotidů (C, T, G, A) ve formě trifosfátů, z nichž odštěpuje dvě fosfátové skupiny a fosfodiesterovou vazbou spojuje vzniklé nukleotidové monofosfáty do polynukleotidového řetězce. Polymerasa připojuje jednotlivé nukleotidy komplementární k matrici tak, že napojuje nový deoxyribonukleotid prostřednictvím jeho fosfátu na hydroxylové skupině uhlíku 5’ ribosy na volný hydroxyl na uhlíku 3’z koncového deoxyribonukleotidu rostoucího řetězce DNA. Důležitou vlastností DNA polymeras je, že neumí iniciovat polymeraci vlákna DNA de novo, ale vyžadují přítomnost jednořetězcového úseku DNA (primeru) již připojeného vodíkovými můstky na templátový řetězec DNA. Tento primer, který poskytuje koncový 3’ hydroxyl ribosy, pak prodlužují (Obr. 1.1 A, viz příloha). Z uvedeného je patrné, že před tím, než dojde k syntéze nového řetězce musí být přerušeny vodíkové vazby mezi komplementárními bazemi dvojřetězcové templátové DNA a jednotlivé řetězce odseparovány. Za podmínek in vitro lze přerušit vodíkové můstky (denaturovat dvojřetězcovou DNA) dodáním tepelné energie. Jinými slovy, při zvyšování teploty roztoku DNA dvojšroubovice postupně taje až do úplného oddělení obou řetězců (Obr. 1.1 B, viz příloha). Křivka tání dvojšroubovice DNA má sigmoidní charakter a teplotu při níž došlo k přerušení 50% vodíkových můstků (inflexní bod) označujeme jako bod tání, Tm (z angl. melting). Při zpětném ochlazování se komplementární řetězce DNA opět spojují vodíkovými vazbami – hybridizují – za vzniku dvojřetězcové molekuly.

-2-

Představme si nyní situaci, kdy jsou ve vhodném reakčním roztoku dvojřetězcová templátová DNA, směs deoxyribonukleotidů, pár primerů a DNA polymerasa. Primer je krátkým jednořetězcovým oligonukleotidem, nejčastěji o délce 15 – 30 nukleotidů. Každý primer je komplementární k sekvenci jednoho řetězce templátové DNA na opačných koncích úseku, jehož amplifikace pomocí PCR má být provedena (Obr. 1.1 A a Obr. 1.2, viz příloha). Sekvenci množeného úseku DNA tedy nemusíme nutně znát, ale musí ležet mezi dvěmi krátkými úseky známé sekvence. Po tepelné denaturaci templátové DNA je reakční směs ochlazena na teplotu při níž se mohou tvořit vodíkové můstky mezi komplementárními úseky řetězců DNA (hybridizace). Může tak dojít jednak k rekonstituci původní dvojřetězcové molekuly, ale především dochází k hybridizaci primerů (angl. také annealing), které jsou ve významném molárním přebytku oproti templátové DNA, na cílové sekvence na jednotlivých řetězcích templátu k nimž jsou komplementární. Následně je teplota reakční směsi upravena na teplotu vhodnou pro enzymovou reakci a DNA polymerasa prodlužuje jednotlivé primery napojováním odpovídajících deoxyribonukleotidů (extenze primerů). Vzniká tak nová molekula dvojřetězcové DNA (Obr. 1.2, viz příloha). Každé opakování denaturace, hybridizace primerů a syntézy nového řetězce DNA (extenze primerů) označujeme jako amplifikační cyklus. Každý nově syntetizovaný řetězec se stává templátem pro amplifikaci v následujících cyklech a dochází tak k selektivnímu pomnožení úseku DNA definovaného na koncích jednotlivými primery. Jak je patrné z Obr. 1.2, dvojřetězcová DNA vznikající v prvním a druhém cyklu nemá přesně definovanou délku, protože DNA polymerasa může v prvním cyklu pokračovat v polymeraci na kontinuálním řetězci templátové DNA do doby než dojde k teplotní denaturaci v následujícím amplifikačním cyklu. Od třetího cyklu se však vznikají molekuly DNA (ampliony v rámečku) definované délky, jejichž počet roste od čtvrtého cyklu exponenciálně. Počet amplikonů m vzniklých z x templátových molekul bude po n proběhlých cyklech teoreticky m = (2n – 2n)x kdy člen 2n odpovídá produktům nedefinované délky vznikajím v 1. a 2. cyklu. Např. po 30 cyklech by měl být teoretický výtěžek z 1 templátové molekuly při 100%-ní účinnosti ve všech cyklech prakticky 230. Znamená to tedy že z jediné templátové dvojřetězcové DNA o délce 1000 párů nukleotidů, jejíž hmotnost je 1 ag (10-18 g) bychom po 30 cyklech mohli získat 1 ng (10-9 g) amplionů stejné délky, což je množství dostatečné pro většinu dalších aplikací. Ačkoliv je PCR extrémně efektivní metodou, akumulace produktů exponenciální řadou není neomezený proces a v praxi je po 30 cyklech standardně dosahováno výtěžku asi 106 amplikonů což odpovídá asi 220. Pro dosažení potřebného výtěžku je tedy nutno úměrně volit počet cyklů nebo templátových molekul DNA. Snížení efektivity amplifikace je výrazné především v pozdějších cyklech, kdy se snižuje koncentrace volných primerů i volných nukleotidů a po denaturaci hybridizují stále častěji jednotlivé řetězce amplikonů mezi sebou a brání tak hybridizaci primerů. Limitujícím faktorem se stává i množství aktivní DNA polymerasy. Princip PCR byl objeven v roce 1985 Kary Mulinsem, který pracoval pro firmu Cetus Corporation (Kalifornie) a byla mu za něj v roce 1993 udělena Nobelova cena. Původní technika PCR využívala pro polymeraci nukleotidů enzymu DNA polymerasy I z bakterie Escherichia coli, která je běžnou součástí střevní mikroflóry a žije při teplotách okolo 37º C. Vzhledem k tomu, že i enzymová výbava této bakterie je uzpůsobena těmto teplotám, dochází při teplotách používaných pro denaturaci DNA (okolo 95º C, Obr. 1.1 B, viz příloha) k teplotní inaktivaci jejích enzymů včetně DNA polymeras. Proto bylo nutno po každé denaturaci templátu přidat do reakce nový podíl DNA polymerasy I, což výrazně komplikovalo celý proces. Podíl manuální práce navíc zvyšovala skutečnost, že změny teploty byly realizovány přenášením zkumavek s reakční směsí do lázní s odpovídající teplotou. Obrat nastal s objevem termostabilních DNA polymeras a vývojem automatických zařízení,

-3-

v nichž lze realizovat kroky denaturace, hybridizace a enzymové polymerace, tzv. termocyklérů. První termostabilní DNA polymeráza, Taq polymerasa, byla získána z bakterie Thermus aquaticus a její teplotní optimum je 72 º C. Termostabilní DNA polymerasy si zachovávají aktivitu i po několika desítkách až stovkách minut inkubace při 95º C a postačí tak jejich přídavek do reakční směsi na počátku PCR. V současné době jsou nejpoužívanější termocykléry vybaveny jedním temperovaným blokem, který umožňuje měnit teplotu rychlostí 1º C.s-1. Termocyléry jsou dále vybaveny mikroprocesorem a jednoduchý software umožňuje nastavit jednotlivé kroky teplotního profilu PCR.

11..22 PPOOLLYYM MO OR RFFIISSM MU USS D DN NA A AA JJEEHHOO AANNAALLÝÝZZAA Polymorfními úseky DNA nazýváme takové oblasti (regiony) v genomu, které vykazují významnou sekvenční variabilitu mezi jedinci uvnitř populace. V případě analýzy několika těchto regionů v genomu jedince dostáváme unikátní „otisk palce“ DNA (dále jen DNA fingerprint). DNA fingerprint je rutinně využíván mimo jiné k identifikaci osob v důkazních řízeních při soudních procesech, při určovaní rodičovství nebo příbuzenských vztahů. Polymorfismus DNA je také využíván v lékařské praxi při diagnostice chorob s genetickým základem. Nejčastěji používaným DNA fingerprintem je analýza polymorfismu fragmentů DNA lišící se v délce, tato metoda je známa pod označením FLP (z angl. Fragment Length Polymorphism). Takový polymorfismus DNA lze určovat více způsoby. Všem metodám je společná analytická koncovka spočívající v určení délky fragmentů, nejčastěji pomocí elektroforézy v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Jednou z poměrně specifických metod je AFLP (z angl. Amplified Fragment Length Polymorphism). Při této metodě je vzorek DNA nejprve štěpen restrikční endonukleasou, která rozpoznává specifickou sekvenci 4 až 8 nukleotidů na molekule DNA, kde štěpí. Společným rysem těchto sekvencí je, že je můžeme číst u dvouřetězcové molekuly zprava doleva na jednom řetězci stejně jako zleva doprava na řetězci druhém, hovoříme o palindromních sekvencích (Obr. 1.3 A, viz příloha). Na konce těchto fragmentů jsou připojeny krátké adaptorové fragmenty DNA známé sekvence (Obr. 1.3 B, viz příloha). Směs takto upravených fragmentů pak slouží jako templát v PCR v níž je použit primer, jehož sekvence plně komplementární k adaptoru (specifické PCR) je 3’ konci zakončena jedním ze 4 nukleotidů, který již neodpovídají sekvenci adaptoru (Obr. 1.3 C, viz příloha). Takový primer bude v PCR extendován pouze za předpokladu, že 5’ konec úseku DNA vyštěpeného v 1. kroku obsahuje komplementární nukleotid(y). V zásadě je tímto přístupem detekován i) odlišnosti v sekvenci DNA jako rozdílu v rozložení cílových míst pro restrikční endonukleasy – při záměně jedné báze cílového místa restrikční endonukleasy nedochází ke štěpení ii) odlišnosti v sekvenci následující po cílovém místu pro restrikční endonukleasu vznikem nebo absencí amplikonu. iii) inzerce nebo delece v oblastech mezi dvěmi konzervovanými regiony obsahujícími cílové místo pro danou restrikční endonukleasu. Často je primer navržen tak, že je na 3’ konci zakončen ne jedním nukleotidem, ale kombinací více (obvykle 3) nukleotidů, čímž je omezen počet vznikajících produktů a výsledná analýza je přehlednější. Adaptory a primery s různými extenzemi kombinací nukleotidů na 3’ koncích jsou dostupné jako součást komerčních souprav pro analýzu polymorfismu.

-4-

Další metodou je ARFLP (z angl. Amplified Restriction Fragment Length Polymorphism). Principem této metody je amplifikace požadovaného úseku DNA z kompletní (tedy neštěpené) genomové DNA pomocí PCR a vzniklý amplikon je podroben restrikční analýze a je tak detekována přítomnost a rozmístnění palindromních sekvencí rozpoznávaných vybranou restrikční endonukleasou. Jinou metodou, která na rozdíl od předchozích nevyužívá PCR technologii, je RFLP (z angl. Restriction Fragment Length Polymorphisms). Analyzovaná genomová DNA je nejprve štěpena vybranými restrikčními enzymy a vzniká směs fragmentů různých délek. Fragmenty DNA se poté elektroforeticky rozdělí podle velikosti v agarosovém gelu a po denaturaci dvojřetězcové DNA při vysokém pH se oddělená vlákna přenesou na vhodnou membránu, kde jsou vlákna DNA zafixována (tzv. Southernův přenos). Následně se přidá tzv. značená sonda komplementární k jednomu vláknu hledané sekvence a dochází k hybridizaci. Sondou bývá jednořetězcová DNA o délce 10 až 1000 bazí, která je modifikovaná radioaktivním prvkem nebo chemickou molekulou, jež umožní její detekci. Po odmytí přebytku sondy se detekuje velikost fragmentu, na kterém došlo k jejímu navázání, tj. kde se nalézá hledaná sekvence. Přestože tato technika vyžaduje relativně vysoké množství DNA (mikrogramy) a časově náročné techniky, její použití je stále velmi rozšířeno v medicíně pro průkaz geneticky podmíněných chorob.

11..33 V VN NT TR R SSEEKKVVEENNCCEE,, JJEEJJIICCHH VVÝÝZZNNAAM MV VK KR RIIM MIIN NA ALLIISSTTIIC CEE A A D RÝ ÝC CH HO ON NEEM MO OC CN NĚĚN NÍÍ DIIA AG GN NO OSSTTIIC CEE N NĚĚK KTTEER Velmi častým DNA fingerprintem je průkaz tzv. VNTR sekvencí (Variable Number of Tandem Repeats). Nachází se v různých místech lidského genomu (tzv. lokusy) obsahující krátká opakování shodných motivů, jako např …GAATGAATGAAT… (tzv. repetitivní sekvence). Počet opakování těchto repeticí se u různých jedinců v populaci liší (obvykle 4 – 40). Díky variabilitě těchto sekvencí v populaci získá každý jedinec s vysokou pravděpodobností různé VNTR-sekvence od matky a od otce a tak dvě nepříbuzné osoby obvykle nemají tyto lokusy stejné. Tyto oblasti mají proto využití v kriminalistice při identifikaci osob. Na Obr. 1.4 (viz příloha) je demonstrován zjednodušený modelový příklad, kdy jsou zatčeny tři osoby (A,B,C) podezřelé ze spáchání trestného činu. Genetický materiál těchto osob byl použit pro amplifikaci lokusů VNTR-sekvencí pomocí PCR. Analýza délek amplikonů a porovnání se soudním vzorkem z místa činu prokázala, že osoba B má shodnou délku testovaných lokusů, a je tedy pravděpodobné, že biologický materiál z místa činu patří právě jí. VNTR sekvence se mohou v genomu nacházet v kódujících genových oblastech tak i v oblastech nekódujících. V současné době jsou popsány některé geneticky podmíněné choroby, které jsou způsobeny přítomností nadměrného množství trinukleotidových repeticí (také se jedná o VNTR) v některých genech. Příkladem těchto chorob mohou být syndrom Fra-X (Fragile X syndrome), Kennedyho choroba, myotonická dystrofie a Huntingtonova choroba (Obr. 1.5) Syndrom Fra-X je po Downově syndromu druhou nejčastější příčinou mentální retardace. Onemocnění je způsobeno nadměrným počtem trinukleotidových repeticí CGG v genu FMR-1, které jsou lokalizovány před kódující sekvencí. Počet těchto repeticí se u zdravé populace pohybuje v rozmezí 6 – 53 a k onemocnění dochází vzroste-li počet těchto repeticí nad 200. Toto nadměrné množství repeticí způsobí methylaci DNA což následně vede k potlačení exprese genu FMR-1. Podobným případem je i Kennedyho choroba -5-

(spinobulbární svalová atrofie). Jedná se o neléčitelnou nervo-svalovou chorobu, která je způsobena mutacemi v genu pro androgenový receptor (AR receptor). Tento gen je lokalizován pouze na chromosomu X (pozice Xq11-q12), takže nejčastěji jsou postiženi muži, kdežto ženy jsou pouze přenašečky. Má-li žena mutantní obě alely genu pro androgenový recptor (dva X chromosomy) je u nich onemocnění mnohem méně závažné než u mužů. Podstatou tohoto onemocnění je inzerce nadměrného počtu repeticí CAG ve čtecím rámci AR receptoru. Ve vzniklé molekule AR receptoru je výsledně vysoký počet glutaminových zbytků (angl. tzv. polyglutamine tract), takže tento receptor není plně funkční. Se zvyšujícím počtem repeticí CAG roste i závažnost onemocnění. Choroba propuká v adolescenci až do pozdního věku, nejčastěji však ve středním věku, a projevuje se ochabnutím jazyka a obličejových svalů. Někdy je také patrný úbytek svalstva na končetinách. Pro syndrom jsou také charakteristické endokrinní změny, které mohou vést k nedokonalému vývinu vnitřních nebo vnějších genitálií (gynekomastie). Mnoho postižených mužů má mírně zvýšené hladiny testosteronu a estradiolu, což je charakteristické pro syndrom necitlivosti k androgenům. Shodnou inzercí repetice (tj. CAG), ale v jiném genu (gen huntington) je způsobena Huntingtonova choroba. Jedná se o onemocnění provázené poruchou mozkové činnosti způsobené odumíráním mozkových buněk. Většinou se tato choroba projevuje mezi 35 a 45 rokem života (existuje však i juvenilní forma) s četností 5 – 10 případů na 100 000 obyvatel. Manifestací choroby je výskyt mimovolních pohybů, zhoršování intelektu a změny chování s následnými problémy jako je polykání a žvýkání (ztráta kontroly nad krčními a ústními svaly). Molekulární podstatou choroby je produkce defektního proteinu Huntingtin v mozkových buňkách právě v důsledku vysokého množství inzercí sekvencí CAG v jeho genu. Tento defektní protein potom způsobuje odumírání mozkových buněk ve kterých se vyskytuje. Příčinou myotonické dystrofie (typ DM1) je přítomnost vysokého počtu repetic CTG v 3´ netranslatovaném regionu genu pro myotonin kinasu. Choroba může propuknout kdykoli v průběhu života jedince.V tabulce I je srovnána korelace mezi počtem repeticí a závažností syndromu. Charakteristické pro tuto chorobu je, že její průběh je těžší u potomků. Důvodem je, že v průběhu gametogeneze dochází ke zvyšování počtu těchto CTG repeticí (tzv. dynamické mutace). Dispozice k výše zmíněným a dalším podobně způsobeným chorobám lze u osob diagnostikovat pomocí PCR s použitím specifických primerů hybridizujících v okolí repeticí. Délka produktu PCR (amplikonu) je úměrná počtu repeticí.

-6-

Tabulka I: Korelace mezi počtem repeticí CTG v genu pro myotonin kinasu. Zdroj: Zdeněk Ambler, Neurologie pro praxi, 3, 142-145 (2004) Tabulka 1. Korelace fenotypu a velikosti CTG repetic u myotonické dystrofie (DM1) fenotyp klinické CTG repetice věk začátku průměrný věk úmrtí příznaky (roky) (roky) premutace žádné 38 až ~49 normální stav normální mírný katarakta 50 až ~150 20–70 60 – normální mírná myotonie klasický slabost ~100 až ~100010–30 48–55 myotonie 1500 katarakta čelní pleš srdeční arytmie ostatní kongenitální infantilní ~1000 až >2000 narození až 10 45 hypotonie respirační poruchy mentální retardace

Obr. 1.5: Schematické znázornění inzercí trinukleotidových repeticí v některých genech (zde znázorněné jako mRNA). Uveden je počet repeticí, který nezpůsobuje uvedené onemocnění. Podrobněji viz text. Tlustá čára – kodující region genu (cds; překládá se do sekvence proteinu); tenká čára – netranslatovaná část genu (UTR; může mít vliv na průběh translace, transkripce nebo lokalizaci mRNA); (AAA)n – polyadenylace (zvyšuje stabilitu mRNA).

-7-

11..44 L LOOKKUUSS D D11SS8800 Klasickým typem VNTR je lokus D1S80 nacházející se na chromosomu 1 (největší lidský chromosom), jedná se o nekodující oblast DNA, která není spojována s žádným lidským onemocněním. Tento lokus obsahuje repetitivní sekvence o délce 16 pb (Obr. 1.6) a je společně s dalšími typy VNTR hojně využíván v kriminalistice k identifikaci osob. Do dnešní doby bylo zjištěno 29 různých alel D1S80 v rozsahu délek 200 až 700 pb lišící se množstvím repeticí (14 – 40). Lidský genom je diploidní a každá z kopií je děděna po jednom z rodičů Mendelovským způsobem. Z pohledu kombinatoriky tedy existuje 435 možných alelických kombinací. Bylo zjištěno, že 86 % populace jsou heterozygoti. Jestliže si zvolíme více typů VNTR je vysoce nepravděpodobné, že na světě nalezneme dva jedince se shodnými alelami ve všech lokusech VNTR. Cílem následující praktické úlohy je amplifikace lokusů D1S80 z DNA izolované z buněk ústní sliznice a určení jeho délky.

Obr. 1.6: Nukleotidová sekvence p lokusu D1S80 obsahující 19 repeticí o délce 16 pb, které jsou seřazeny pod sebou. Podtržené sekvence znázorňují oblasti se kterými hybridizují specifické primery použité pro analýzu délky různých alel D1S80 pomocí PCR v následující úloze.

-8-

11..55 PPRRAAKKTTIICCKKÉÉ ÚÚLLOOHHYY 11..55..11 A ANNAALLÝÝZZAA PPOOLLYYM MO OR RFFIISSM MU U LLO OK KU USSU UD D11SS8800 Následující protokoly popisují postup izolace DNA z buněk ústní sliznice, amplifikaci vybrané VNTR a její analýzu. První krok představuje izolaci suspenze stovek až tisíců buněk obsahujících vaši genomovou DNA prostým opláchnutím bukání sliznice isotonickým roztokem NaCl. Z malého množství suspenze bude následně ostředěním izolována část buněk, které budou resuspendovány v malém množství isotonického roztoku NaCl (dojde tak k jejich zkoncentrování). K této suspenzi bude přidán komerční produkt Chelex® (kyselina iminodioctová imobilizovaná na částečky polystyrenu) vyvazující kovovové ionty (především Mg2+), které by mohly napomáhat degradaci DNA. Mg2+ a ostatní kovové ionty totiž mohou sloužit jako kofaktory enzymů DNas obsažených ve slinách, které štěpí molekuly DNA na krátké fragmenty. Vzorek poté bude zahřát na 99 °C, čímž dojde jednak k rozpadu buněk a uvolnění DNA do roztoku, a dále k tepelné dentaturaci a precipitaci většiny buněčných proteinů. Precipitát a Chelex budou následně odděleny od buněčného lyzátu obsahujícího DNA odstředěním. Takto získaná DNA bude použita jako templát pro PCR se specifickými primery pomocí nichž budou amplifikovány lokusy D1S80. Jejichž délka bude analyzována elektroforézou v agarosovém gelu. Cílem následujících úloh je: 1. izolace genomové DNA popsaná v tomto protokolu (protokol 1.5.1.1) 2. amplifikace D1S80 VNTR pomocí PCR (protokol 1.5.1.2) 3. analýza produktů PCR pomocí 1,5% agarosové elektroforesy a vyhodnocení Elektroforeogramu (protokol 1.5.1.3) Materiál a chemikálie pro následující úlohy: kelímek 1,5 ml centrifugační mikrozkumavky („eppendorfky“) 0,2 ml mikrozkumavky pro PCR automatické pipety (P-20, P-200, P-1000) termocykér centrifuga elektroforetická aparatura 10 ml sterilního 0,9% roztoku NaCl Chelex® (Sigma) komponenty pro PCR směs deoxyribonukleotidů Taq DNA polyemrasa primery (specifické pro lokusy D1S80) pufr pro Taq polyemerasu DMSO voda bez nukleas agarosa TBE pufr ethidium bromid vzorkový pufr pro elektroforézu

-9-

Provedení:

11..55..11..11 IIZZOOLLAACCEE GGEENNOOM MO OV VÉÉ D DN NA A ZZ BBUUNNĚĚKK ÚÚSSTTNNÍÍ SSLLIIZZNNIICCEE

1. Převeďte z kelímku 10 ml 0,9% vodného roztoku NaCl do vašich úst. Solný roztok v ústech intenzivně převracejte a pomocí zubů seškrabujte bukání sliznici po dobu 1- 2 min.

2. Převeďte výplach z úst zpět do kelímku a zamíchejte jej.

3. Pipetujte 1 ml ústního výplachu do předem označené 1,5 ml centrifugační mikrozkumavky.

4. Odstřeďte vzorek při 3 500 x g po dobu 2 min (vzorky musí být v rotoru centrifugy uspořádány symetricky, aby byl rotor vyvážený).

- 10 -

5. Vyjměte mikrozkumavku z rotoru a přesvědčte se, zda-li se na dně vytvořila buněčná peleta. Opatrně

odstraňte

supernatant

(zpět

do

kelímku). Poznámka: ve zkumavce může zůstat malé množství kapaliny

6. Resuspendujte buněčnou peletu ve 30 µL 0,9% roztoku NaCl. Intenzivně peletu resuspendujte pomocí

propipetování

(způsobem

„nasát-

vytlačit“) nebo uzavřenou mikrozkumavkou přejíždějte po stojánku na mikrozkumavky.

7. Přepipetujte 30 µL suspenze do 0,2 ml mikrozkumavky pro PCR obsahující 200 µL 5%ního Chelexu. Mikrozkumavka musí být na víčku označena.

8. Vložte 0,2 ml mikrozkumavku do termocykléru a inkubujte ji při teplotě 99°C po dobu 10 minut. Poznámka: Zapamatujte si vaše umístění vzorku

9.

Přepipetujte

obsah

do

nové

1,5

ml

mikrozkumavky a centrifugujte ji při 10 000 x g po dobu 2 min.

- 11 -

10. Odpipetujte 60 µl supernatantu (nesmí obsahovat částice Chelexu!) do nové 1,5 ml mikrozkumavky označené vaším kódem. Poznámka: tento vzorek představuje vaši DNA.

11. Vložte mikrozkumavku do stojánku a vyčkejte na další instrukce

11..55..11..22 A AM MPPLLIIFFIIK KA AC CEE LLO OK KU USSU UD D11SS8800 PPOOM MO OC CÍÍ PPC CR R

1. Označte si vlastní 200 µL mikrozkumavku pro PCR jejím víčku.

2. Do této mikrozkumavky napipetujte čistou špičkou 20 µL tzv. Master mixu (složení viz poznámka pod protokolem).

3. Vyměnte špičku, a dále napipetujte 20 µL tzv. Primer Mixu (složení viz poznámka pod protokolem).

- 12 -

4. Pomocí pipety P-20 přidejte ke směsi v mikrozkumavce 10 µl DNA připravené podle předchozího protokolu (1.5.1.1) Poznámka: homogenizujte směs několikerým pomalým pipetováním pipetou P-200 s objemem nastaveným na 30 µL. Vhodné: pro snížení nespecifických interakcí primerů s templátovou DNA lze do reakční směsi přidat navíc 2,5 µL DMSO 5. Vložte vaši mikrozkumavku se směsí pro PCR reakci do termocykléru a zapamatujte si její pozici. 6. Spustťe následující teplotní program optimalizovaný pro VNTR D1S80: 95°C,

10 minut

95°C, 65°C, 72°C, 72°C,

15 sekund; 30 sekund; 40 sekund; 10 minut

1cyklus 32 cyklů 1cyklus

PCR reakce lze běžně připravit smícháním jednotlivých komponent (viz následující tabulka), ale pipetované objemy jsou příliš malé (desetiny až jednotky µl), což klade větší nároky na laboratorní praxi. Z toho důvodu se v této úloze používají Master a Primer mix obsahující předmíchané komponenty pro PCR. Tuto strategii je vhodné použít i v případech, kdy se jednotlivé PCR liší pouze v jedné komponentě (nejčastěji v templátu nebo primerech), která je pipetována samostatně a ostatní složky jsou přidány ve společném roztoku master mixu. V našem případě: Master mix obsahuje Taq DNA polymerasu, pufr pro Taq polymerasu, směs deoxynukleotidů Primer mix obsahuje ekvimolární směs primeru +D1S80 (dopředný primer) a -D1S80 (zpětný primer). Po vzájemném smísení těchto mixů, chromozomální DNA a DMSO vznikne PCR směs o následujícím složení: Složka PCR

Finální koncentrace (množství)

Genomová DNA

50 – 200 ng

Primer +D1S80 Primer -D1S80 Směs deoxynukleotidů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

0,2 µM 0,2 µM 200 µM (každý)

- 13 -

poznámka Slouží jako templátová DNA a její množství závisí na úspěšnosti izolace. Dopředný primer Zpětný primer Složky důležité pro polymeraci DNA. Je nutné aby všechny

DMSO

5%

Pufr pro Taq polymerasu

1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,4

Taq polymerasa

1 jednotka

deoxynukleotidy byly ve stejném molárním poměru. Potlačuje nespecifické interakce primerů s templátem (chromozomální DNA) Mg2+ ionty jsou nutné pro aktivitu (funkci) Taq polymerasy. KCl vytváří vhodné iontové prostředí. Složka Tris-HCl pufruje PCR směs v průběhu reakce na hodnotě pH 8.4 (pH optimum Taq pol.) Enzym katalyzující elongaci řetězce DNA.

Sekvence použitých primerů: Primer +D1S80 -D1S80

sekvence 5´-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3´ 5´-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3´

_

11..55..11..33 A ANNAALLÝÝZZAA VVÝÝSSLLEEDDKKUU PPC CR R AA AANNTTIICCIIPPOOVVAANNÉÉ VVÝÝSSLLEEDDKKYY Po skončení teplotního programu přidejte do reakční směsi obsahující produkty 10 µl vzorkového pufru a celou směs dobře promíchejte pomocí pipety. Pomocí elektroforesy v 1,5%ní agarosovém gelu analyzujte 6-8 µl směsi a fragmenty DNA (ampliony) vizualizujte pomocí ethidium bromidu (kap. 1.5.3.1). Pořiďte snímek výsledku elektroforézy (elektroforeogram). Na Obr. 1.7 je záznam elektroforeogramu z analýzy D1S80 VNTR tří nepříbuzných osob (A, B, C). V dráze C se nachází dva proužky o rozdílné délce. Tato osoba je tedy prokazatelně heterozygot. Každý proužek představuje amplikon (PCR produkt) vzniklý z rozdílných alel ležících na homologních chromozomech. V drahách A a B se nachází jeden silný proužek. Tento výsledek znamená, že dané osoby jsou buď homozygoti nebo heterozygoti jejichž alely se liší v obsahu 1 repetice (rozdíl 16 pb). K jejich rozlišení však za použitých podmínek nedošlo. Vyššího rozlišení lze dosáhnout např. volbou jiné koncentrace agarosy, použitím jiného molekulárního síta (polyakrylamid) nebo je možno analyzovat menší množství vzorku.

- 14 -

Obr. 1.7: Elektroforeogram PCR analýzy lokusů D1S80 u tří osob (A, B, C). M- DNA marker, 1,5% agarosová elektroforesa. Počet repeticí v příslušné alele lze určit odečtem z kalibrační křivky závislosti mobility fragmentů DNA v agarosovém gelu na jejich délce. Pro sestrojení kalibrační křivky je třeba odečíst vzdálenosti jednotlivých proužků markeru od startu (nanášecího místa, jamek) a tyto hodnoty vynést do grafu proti známým délkám příslušných proužků (Obr. 1.8).

Obr. 1.8: Závislost mezi vzdáleností pružku na agarosové elektroforese od nanášecího místa a délkou DNA. Pro sestrojení této křivky byl použit DNA marker na Obr. 1.7.

- 15 -

Výsledná závislost je logaritmická a rovnici kalibrační křivky lze získat např. pomocí programu MS Excel s proložením bodů logaritmickou funkcí. Z této rovnice lze vypočíst neznámou délku fragmentu na základě jeho mobility v gelu. Vzorek A B C

vzdálenost proužku od startu [mm] 32 31,5 35,4; 32,8

vypočtená délka AMPLIKONU [pb] 523 540 410; 495

Použité primery ovšem nehybridizují bezprostředně před první respektive poslední repeticí, ale dále v oblastech s konzervovanou sekvencí (Obr 1.6). Tyto vzdálenosti je tedy nutné odečíst od vypočtené délky amplikonu. 5´ konec dopředného primeru (+D1S80) je vzdálen 115 pb a zpětného primeru (–D1S80) 31 pb od VNTR celkem tedy 146 pb. Počet repeticí lze pak určit vydělením vypočtené délky VNTR sekvence v pb číslem 16 (repetice je 16 pb dlouhá). Vzorek A B C

vypočtená délka AMPLIKONU [pb] 523 540 410; 495

vypočtená délka REPETICÍ [pb] 377 394 264; 349

Počet REPETICÍ 24 25 17; 22

11..55..22 IIZZOOLLAACCEE D DN NA A ZZ BBUUNNĚĚKK Příprava DNA je prvním krokem mnoha diagnostických metod a pro celou řadu biotechnologických aplikací. Metody pro izolaci DNA z mikroorganizmů, tkání a pletiv se liší především podle charakteru buněčných stěn, velikosti izolované DNA a její požadované kvality (čistota, intaktnost). Obecný sled kroků je: 1. desintegrace a lyze buněk, tj. rozrušení biologických membrán a případně buněčných stěn mechanicky, enzymovou hydrolýzou, alkalickou hydrolýzou, detergenty, osmotickým šokem nebo kombinací uvedených (u eukaryotních buněk případně i izolaci jader např. gradientovou centrifugací a jejich následnou lyzi). 2. odstranění kontaminujících biomolekul (především proteinů, polysacharidů a RNA), které lze realizovat enzymaticky proteasami a RNasami, gradientovou centrifugací, iontoměničovou chromatografií nebo precipitací. 3. separace DNA, kterou lze provést precipitací (ethanolem), iontoměničovou chromatografií, případně elektroforeticky.

11..55..22..11 IIZZOOLLAACCEE VVĚĚTTŠŠÍÍHHOO M MN NO OŽŽSSTTV VÍÍ D DN NA A ZZ EEPPIITTEELLIIÁÁLLNNÍÍCCHH BBUUNNĚĚKK V následující úloze si má každý možnost připravit vlastní genomovou DNA z epiteliálních buněk bukální sliznice. Tyto buňky se dělí 1-2krát denně, lze je získat velice jednoduchým a bezbolestným způsobem a DNA izolovat během 45 minut.

- 16 -

Materiál a chemikálie: • 15ml zkumavka s 3 ml pitné nebo destilované vody • Lyzovací pufr (50 mM Tris.Cl, 1% SDS, pH 8,0) • Roztok „SE“: 4M NaCl, 0,1M EDTA • Roztok proteinasy K o koncentraci 10 mg/ml • 96% velejemný ethanol nebo 91% isopropanol • TE pufr (10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0 v destilované vodě) • Vodní lázeň nebo inkubátor nastavené na 50º C • Ledová tříšť • Pipeta (nastavitelná 1000µl automatická, nebo kalibrovaná Pasteurova pipeta) Provedení: Pro náš experiment s výhodou použijeme suspenzi epiteliálních buněk připravenou pro analýzu VNTR (kap. 1.5.1.1), proto „přeskakujeme“ kroky 1 – 3. 1. Připravte si 15 ml zkumavku obsahující 3 ml vody a označte ji vhodným způsobem lihovým fixem. V našem případě použijeme 2. Jemně „žvýkejte“ bukální sliznici po dobu 30 sekund Dochází ke stírání buněk epitelu podobně jako při žvýkání potravy.

3. Vypláchujte ústa 3 ml vody ze zkumavky po dobu 30 sekund (nepolkněte) a poté opatrně vraťte výplach do zkumavky. Získali jste suspenzi několik tisíc epiteliálních buněk.

4. Pomocí pipety přidejte k suspenzi buněk 2 ml lyzovacího pufru, zkumavku uzavřete a jemně promíchejte obsah překlápěním zkumavky (asi 5krát). V této fázi začíná docházet k rozpouštění membránových struktur jako jsou cytoplazmatická a jaderná membrána účinkem detergentu (dodecylsíran sodný; SDS). Pufrující složka (Tris.Cl, pH 8,0), udržuje hodnotu pH v oblasti fyziologických hodnot mezi pH 6-8. To je důležité, protože v kyselých roztocích DNA hydrolyzuje, může být depurinována, zatímco v zásaditém prostředí dochází k denaturaci molekuly DNA, tj. k oddělení jednotlivých rětězců a vzniku jednořetězcových molekul.

5. K suspenzi lyzujících buněk přidejte pomocí pipety 500 µl roztoku SE a 100 µl roztoku proteinasy K. Uzavřete zkumavku a obsah jemně promíchejte překlápěním zkumavky (asi 5krát). Přídavek proteinasy K není pro získání DNA nutný, ale snižuje množství proteinů kontaminujících výsledný preparát.

6. Umístěte zkumavku do vodní lázně vyhřáté na 50 ºC a inkubujte po dobu 10 min. V tomto kroku dochází k hydrolýze kontaminujících proteinů přidanou Proteinasou K (enzym je aktivní při 50 ºC a není denaturován při použité koncentraci SDS). Zvýšená teplota urychluje proces „rozpouštění“ membrán. NaCl a EDTA, vytváří v tomto kroku vhodné reakční prostředí pro proteinasu (iontová síla) a chrání molekulu DNA před DNasami (všudypřítomnými enzymy, které štěpí DNA na krátké fragmenty. Aktivita DNas je závislá na přítomnosti dvoumocných kationtů kovů, především Mg2+. Tyto kovy jsou z roztoku vyvazovány chelatačními činidly jako je EDTA a dochází tak k inaktivaci DNas.

7. Ponechte obsah zkumavky po předchozí inkubaci zchladnout na pokojovou teplotu. Otevřete zkumavku, držte ji nakloněnou pod úhlem 45º a opatrně po stěně zkumavky - 17 -

přidejte 10 ml 95% ethanolu nebo 91% isopropanolu vychlazeného v ledové tříšti na 0 ºC. Alkohol, přidávejte několikrát pomocí pipety. NEMÍCHEJTE. 8. Pečlivě uzavřete zkumavku a ponechte ji ve stojánku při pokojové teplotě po dobu 5 min. Na vytvořené mezifázi pozorujte precipitující genomovou DNA.

NaCl napomáhá při precipitaci DNA třemi způsoby. Jednak Na+ neutralizuje negativní náboj, který DNA díky fosfátovým skupinám nese a umožňuje tak blízký kontakt molekul DNA. Zánik záporného náboje molekuly také znesnadňuje její solvataci molekulami vody, které jsou vlastně dipólem. Dále díky tomu, že NaCl je v roztoku takřka 100 %-ně disociován, se sám velmi silně solvatuje a tím odnímá DNA další molekuly vody (tzv. vysolovací efekt). Ethanol váže další molekuly vody a konečně způsobí precipitaci DNA, jež ztratila svůj hydratační obal.

9. Opatrně promíchejte obsah zkumavky překlápěním (asi 5krát). Pozorujte bílá nebo transparentní vlákna precipitované DNA. 10. Pomocí pipety skleněné tyčinky nebo špejle ze zkumavky vyjměte precipitovanou DNA do mikrozkumavky, kde ji lze po přídavku malého množství ethanolu nebo isopropanolu uchovávat. Pokud chcete precipitát převést do roztoku, obraťte mikrozkumavku dnem vzhůru, tak aby roztok alkoholu přenesený spolu s precipitátem mohl vytéct (DNA musí být přilepena ke stěně!) a nechte DNA vyschnout při pokojové teplotě. Dehydratovaná vysušená DNA je většinou transparentní (nahnědlá barva indikuje přítomnost RNA), avšak preparát získaný touto metodou bude díky proteinům, které se nepodařilo zcela odstranit, bílý. Vysušenou DNA rozpouštějte alespoň 1 hod v 0,1 – 0,5 ml destilované vody nebo lépe TE pufru Rozpouštění lze podpořit zvýšenou telotou (60º C). DNA se může hydratovat obtížně a nemusí dojít k úplnému rozpuštění precipitátu. Po přiměřeně dlouhé době však do formy koloidního roztoku přechází dostatečné množství DNA, které lze analyzovat elektroforesou v agarosovém gelu.

11..55..22..22 PPŘŘÍÍPPRRAAVVAA GGEENNOOM MO OV VÉÉ D DN NA A ZZ CCIIBBUULLEE KKUUCCHHYYŇŇSSKKÉÉ Pomocí této metody lze připravit surovou chromozomální DNA, která může být znečištěna proteiny a RNA, další nukleovou kyselinou přítomnou v buňce. Materiál a chemikálie: • Asi 6 g cibule kuchyňské (Allium cepa) • Třecí miska s tloučkem • Gáza na přípravu filtru • Vhodná nádoba na jímání filtrátů ze skla nebo polypropylenu • 15 ml extrakčního roztoku (50 mM Tris.Cl, 250 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8,0 v destilované vodě) • 1 ml TE pufru (10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0 v destilované vodě) • 1 ml 10% roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) • 8 ml 96% velejemného ethanolu • Vodní lázeň nebo inkubátor nastavené na 55-65º C • Ledová tříšť Provedení: 1. Pokrojte asi 6 g cibule na co možná nejmenší kousky. Lepších výsledků bývá dosaženo pokud je pokrojená cibule zmražena, neboť dojde k potrhání buněčných stěn.

- 18 -

2. Přeneste pokrojenou cibuli do třecí misky, přidejte 15 ml extrakčního pufru a tloučkem roztírejte vzorek cibule asi 5 minut. Dojde tak k dezintegraci buněčných stěn. Role složek extrakčního pufru (Tris.Cl, EDTA a NaCl) při purifikaci DNA je popsána v předchozím protokolu.

3. Přefiltrujte vzniklou suspenzi přes filtr z gázy do vhodné nádoby a jemně např. lžící vytlačte zadrženou kapalinu. 4. K filtrátu přidejte 1 ml 10% dodecyl sulfátu sodného (SDS). Jemně promíchejte obsah kroužením nebo převracením a inkubujte jej s občasným promícháním při 55º65 ºC po 20 minut. 5. Poté roztok opět přefiltrujte do nové nádoby. Odpipetujte 4 ml filtrátu do 15 ml zkumavky a chlaďte obsah na ledové tříšti 2-5 minut. 6. Pomalu převrstvujte obsah 8 ml 96% ledového ethanolu nebo 91% isopropanolu. Na mezifázi pozorujte precipitující genomovou DNA. DNA lze pomocí pipety, skleněné tyčinky nebo špejle vyjmout a přenést do (mikro)zkumavky.

7. Pokud jste odseparovali precipitovanou DNA ponechte ji vyschnout při pokojové teplotě. Dehydratovaná DNA je bezbarvá, avšak DNA izolovaná touto metodou obsahuje proteiny, které zbarvují peletu bíle.

8. Vysušenou DNA rozpouštějte alespoň 1 hod v 0,5 – 1 ml TE pufru. Rozpouštění lze podpořit zvýšenou telotou (60 ºC). DNA se může hydratovat obtížně a nemusí dojít k rozpuštění celé pelety. Po přiměřeně dlouhé době však do formy koloidního roztoku přechází dostatečné množství DNA, které lze analyzovat elektroforesou v agarosovém gelu.

11..55..33 A ANNAALLÝÝZZAA D DN NA A AA PPRROOTTEEIINNŮŮ PPOOM MO OC CÍÍ EELLEEK KTTR RO OFFO OR REESSY Y V AG GA AR RO OSSO OV VÉÉM MG GEELLU U VA Elektroforesa v agarosovém gelu se používá k identifikaci, separaci a purifikaci molekul DNA a v některých případech i proteinů. Tyto molekuly jsou v gelu děleny podle jejich náboje (migrace k anodě nebo katodě, přičemž velikost náboje určuje rychlost) a velikosti (gel vlastně působí jako síto). Komerční agarosa je lineární polysacharid v podstatě tvořený z asi 800 galaktosových jednotek. Zgelovatěním agarosy vzniká v závislosti na její koncentraci trojrozměrná síť s póry o velikosti 50 až > 200 nm. Při elektroforéze DNA se využívá skutečnosti, že DNA je díky fosfátovým skupinám nabita záporně a ve stejnosměrném elektrickém poli se při pH 8 bude pohybovat ke kladné elektrodě. Vzhledem k tomu, že jsou fosfátové skupiny spojující jednotlivé nukleosidy distribuovány rovnoměrně, mají molekuly DNA konstantní „hodnotu náboje na jednotku délky“ a budou se v gelu dělit podle jejich velikosti – delší molekuly se budou proplétat gelovou matricí obtížněji než molekuly menší. Rychlost migrace dvouřetězcové DNA agarosovým gelem je nepřímo úměrná logaritmu jejich délky (počtu párů bází; bp). Velikost pórů samozřejmě určuje použitelný frakcionační rozsah gelu pro lineární molekuly dvouřetězcové DNA, získané např. štěpením DNA restrikčními endonukleasami nebo jako výsledek PCR. Tak v gelu s 0,5 % agarosy lze účinně rozdělit fragmenty velikosti 700 až 25 0000 bp, v 1% gelu fragmenty o 250 až 12 000 bp, v 3% gelu fragmenty dlouhé 100 až 3 000 bp a ve speciálních 6% gelech i fragmenty o 10 až 100 bp. Jednotlivé fragmenty putují

- 19 -

v gelu ve jako zóny (proužky). Velikost fragmentu lze určit po elektroforese na základě porovnání jeho polohy na gelu s migrací směsi fragmentů známých délek (tzv. standardů velikostí neboli markerů). DNA v gelu je třeba nejprve vizualizovat, k čemuž se nejčastěji používá fluorescenčních barviv. Nejběžnějším je ethidiumbromid (EtBr), který viditelně fluoreskuje po ozáření ultrafialovým světlem o vlnové délce okolo 300 nm. Využívá se toho, že po vazbě EtBr mezi dva řetězce dvoušroubovice fluoreskuje komplex DNA/ EtBr 20 – 30× více než samotný EtBr a tímto způsobem lze na gelu „rozsvítit“ proužky obsahující alespoň 0,5 ng DNA. V současné době jsou dostupná fluorescenční barviva dosahující citlivosti až <20 pg (např. SYBR Gold). Na základě intenzity fluorescence proužku lze semikvantitativně vyhodnotit množství DNA porovnáním se standardy obsahující známá množství DNA. V následujícím textu uvádíme dva postupy pro provedení elektroforesy v agarosovém gelu. První popisuje profesionální elektroforesu, která bude použita pro analýzu výsledků PCR. Druhý protokol popisuje jednoduchou aparaturu a provedení elektroforesy v amatérských podmínkách s minimálními náklady a tuto sestavu lze použít jak pro analýzu DNA tak proteinů.

11..55..33..11 SSTTAANNDDAARRDDNNÍÍ BBAADDAATTEELLSSKKÁÁ EELLEEKKTTRROOFFOORREESSAA D DN NA A V AG GA AR RO OSSO OV VÉÉM MG GEELLU U VA Materiál a chemikálie: • elektroforetická aparatura a zdroj stejnosměrného proudu • UV transluminátor s dokumentačním zařízením • latexové ochrané rukavice • elektroforetický pufr (10× koncentrovaný TBE pufr o složení na 1 litr: 54 g Tris, 27,5 g kyseliny borité, 20 ml 0,5M EDTA a pH upraveným na hodnotu pH 8, 0) • destilovaná voda • agarosa pro molekulární biologii • ethidiumbromid - EtBr (10 mg/ml ve vodě) • marker ve vzorkovém pufru (1 µg/5 µl) • vzorky DNA ve vzorkovém pufru. Provedení: (!) Pracujte v ochranných rukavicích! Použité plastové pomůcky vyhazujte do určených odpadních nádob. 1. Podle instrukcí výrobce elektroforetické aparatury připravte podnos pro nalití agarosového gelu tak, aby vznikla těsnící nádoba. Aparatury jsou vyrobeny nejčastěji z akrylátu a sestávají z elektroforetické vany opatřené na koncích platinovými elektrodami, podnosu pro gel a víka pevně zamčeného po připojení kabelů. Některé podnosy jsou propustné pro UV záření. To umožňuje osvítit gel na transluminátoru přímo na podnosu a usnadňuje tak manipulaci s gelem.

2. Připravte 1× TBE pufr naředěním 10× koncentrovaného zásobního roztoku destilovanou vodou v množství dostatečném pro přípravu gelu a použití jako elektrolyt při elektroforese. EDTA přítomná v pufru vyvazuje ionty Mg2+ z molekuly DNA, což přispívá k uniformitě náboje.

- 20 -

3. Podle velikosti očekávaných fragmentů DNA připravte v Erlenmeyerově baňce suspenzi obsahující 1 % hmotn. nebo 2 % hmotn. agarosy v TBE pufru. Uvažujeme, že 1 ml pufru má hmotnost 1 g a vážená a měřená množství nemusí být „analyticky“ přesná.

4. Agarovou suspenzi přiveďte do krátkého varu (5-10s) v mikrovlné troubě. POZOR: vroucí agar pění a může překypět. Krátké záhřevy k varu opakujte po zamíchání obsahu baňky krouživým pohybem do rozpuštění agaru. Případně rozpusťte agar zahřátím a povařením na plynovém kahanu. Výhodné je vsadit do hrdla baňky malou nálevku, která zabrání překypění gelu.

5. Roztok agaru ponechte ochladit na cca 60 ºC (udržíte v holé ruce) a přidejte takové množství EtBr pro vizualizaci, aby výsledná koncentrace byla 0,5 µg/ml. POZOR: EtBr je toxický karcinogen. 6. Nalejte gel do utěsněného podnosu a ihned do agaru ponořte hřeben ve vyznačeném místě. Baňku předejte lektorovi k dekontaminaci. Gel musí být stále dobře tekutý. Případné vzduchové bubliny můžete před zatuhnutím přesunout ke stěně kolmé na hřeben pomocí pipetovací špičky. Hřeben vytvoří v gelu jamky, do kterých se nanáší vzorek.

7. Ponechte gel ztuhnout při pokojové teplotě. Ztuhlý gel je lehce matný.

8. Přelijte gel správně umístěný ve vaně aparatury takovým množstvím elektroforetického TBE pufru, aby byla jeho hladina několik mm nad povrchem gelu (3 – 5 mm) a opatrně vyjměte z gelu hřeben (nesmí dojít k protržení dna jamek). Správně umístěný gel v aparatuře má hřeben blíže k záporné elektrodě.

9. Napipetujte do TBE pufru v prostoru kladné elektrody takové množství zásobního roztoku EtBr, aby byla výsledná koncentrace asi 0,5 µg/ml a špičkou obsah prostoru promíchejte. Kladně nabité ethidium bude v průběhu elektroforesy putovat proti směru migrace DNA a takto přidaný EtBr bude doplňovat EtBr v gelu. Jinou možností je použít gel a pufr bez EtBr a obarvit gel po elektroforese 30 – 45 min inkubací v TBE s 0,5 µg EtBr / ml nebo vyšší.

10. Do krajních jamek naneste mikropipetou 5 µl markeru a do dalších vhodný objem (10 – 20 µl) vzorků ve vzorkovém pufru. Pořadí nanášení markeru a vzorků zapište. Vzorkový pufr obsahuje Ficoll, který má vyšší hustotu než voda a udrží tak roztok DNA v jamce.

11. Uzavřete aparaturu, připojte ji ke zdroji (DNA putuje ke kladné elektrodě) stejnosměrného proudu a nastavte napětí na hodnotu U = [1 až 5 V] × [vzdálenosti mezi elektrodami v cm]. Zapněte proud a sledujte průběh elektroforesy podle migrace barviv přítomných ve vzorkovém pufru. Elektroforesa trvá podle aplikovaného napětí a požadovaného rozdělení asi 20 – 60 min. V použitém vzorkovém pufru jsou tři barviva: xylene cyanol, bromfenolová modř a OrangeG, která migrují v 1% gelu stejně rychle jako fragmenty DNA o délce asi 4000 bp, 300 bp a 50 bp, v uvedeném pořadí.

12. Po skončení elektroforesy vypněte zdroj napětí a gel přeneste bezpečně (stále obsahuje EtBr) na plochu transluminátoru a vizualizujte DNA v UV světle. Pořiďte elektronický (pomocí CCD kamery) nebo fotografický záznam gelu a ten vyhodnoťte. POZOR: Pokud budete pozorovat gel pod UV pouhým okem používejte speciální - 21 -

ochraný štít s vysoce účinným UV filtrem a minimalizujte dobu pozorování. Dioptrické nebo sluneční brýle s UV filtrem nejsou dostatečnou ochranou! 13. Použitý gel a elektrodový pufr předejte lektorovi k dekontaminaci.

11..55..33..22 A AGGAARROOSSOOVVÁÁ EELLEEKKTTRROOFFOORREESSAA D DN NA A VV KKRRAABBIIČČCCEE Materiál a chemikálie: • nevodivá nádobka na gel nejlépe bílá nebo bezbarvá (např. plastová krabička na mýdlo, krabička na potraviny) • materiál, který poslouží na vystřižení hřebene (např. polystyrenový tácek, cca 2mm silný kus plastu) • materiál na elektrody: silný alobal, svazek uhlíkových vláken nebo ocelový drát • 2 kabely různých barev s „krokosvorkami“ • baterie R9 (9 V) – na 1 gel 4 baterie spojené do serie • něco co poslouží jako pipeta (tenká slámka, dutá tyčka od lízátka, kapátko, inzulínová stříkačka) • mikrovlnná trouba nebo plynový kahan + síťka • agarosa (nebo potravinářský agar-agar) • elektroforetický pufr (10× koncentrovaný TBE pufr o složení na 1 litr: 54 g Tris, 27,5 g kyseliny borité, 20 ml 0,5M EDTA a pH upraveným na hodnotu pH 8, 0) nebo jedlá soda • destilovaná voda • sacharosa • vzorky DNA z cibule, epiteliálních buněk nebo z jiného zdroje, případně vzorky potravinářských barviv • methylenová modř Provedení: A) Elektroforesa 1. Připravte 1× TBE pufr naředěním 10× koncentrovaného zásobního roztoku destilovanou vodou v množství dostatečném pro přípravu gelu a použití jako elektrolyt při elektroforese. Případně použijte jako elektroforetický pufr 1g jedlé sody rozpuštěný v 1,2 litrech vody.

2. Z polystyrenového tácku nebo plastu vystřihněte hřeben, který bude rozměrem odpovídat nádobce na gel. Délku zubů hřebenu je třeba upravit tak, aby končily asi 2 až 5 mm nad dnem nádobky. Hřeben bude použit na vytvoření jamek v gelu, do kterých bude nanesen analyzovaný vzorek.

3. V (Erlenmeyerově) baňce připravte suspenzi obsahující přibližně 1 % hmotn. agarosy v TBE pufru. Objem závisí na velikosti nádobky na gel a výška gelu by měla být asi 1,5 cm. Uvažujeme, že 1 ml pufru má hmotnost 1 g a vážená a měřená množství nemusí být „analyticky“ přesná. Místo agarosy lze použít i agar-agar z něhož se agarosa vyrábí. Agar-agar je potravinářská surovina používaná pro zahušťování, podobně jako karageenan nebo želatina. Jeho chemické složení i vlastnosti jsou podobné jako u agarosy avšak polysacharid agaru-agaru je modifikován sulfátovými skupinami a znečištěn i pektinovými látkami a solemi což negativně ovlivní rozlišení.

- 22 -

4. Agarovou suspenzi přiveďte do krátkého varu (5-10s) v mikrovlné troubě. POZOR: vroucí agar pění a může překypět. Krátké záhřevy k varu opakujte po zamíchání obsahu baňky krouživým pohybem do rozpuštění agaru. Případně rozpusťte agar zahřátím a povařením na plynovém kahanu. Výhodné je vsadit do hrdla baňky malou nálevku, která zabrání překypění gelu.

5. Roztok agaru nalejte do nádobky na gel na vodorovné ploše. Ihned do agaru ponořte hřeben 2-3 cm od kraje nádobky (konce zubů hřebenu musí být 2-3 mm nad dnem nádobky – jamky nesmí být skrz gel!). V případě, že neznáme směr migrace analyzované látky (barviva, proteiny) umístíme hřeben v polovině nádobky. Případné vzduchové bubliny můžete před zatuhnutím gelu přesunout ke stěně kolmé na hřeben např. pomocí párátka.

6. Zatímco gel tuhne (ztuhlý gel je lehce matný), připravte 50-70% roztok cukru v elektroforetickém pufru nebo ve vodě, který bude sloužit jako nanášecí medium (vzorkový pufr). Nanášecí medium má hustotu, která postačuje k „zatížení“ vzorku v jamce v gelu před jeho vputování do gelu a usnadňuje vnášení vzorků do jamek. Rozpouštění cukru lze podpořit zahřátím vznikajícího roztoku.

7. Připravte aparaturu pro elektroforesu: odřízněte a odstraňte konce gelu (1-2 cm od okraje nádobky) aby se vytvořily elektrodové prostory (viz Obr. 1.9). 8. Zalijte gel pufrem pro elektroforesu tak, aby byla hladina 2-5 mm nad povrchem gelu. Opatrně vyjměte hřeben (nesmí dojít k protržení dna jamek!). 9. Na okrajích nádobky umístěte elektrody tak, aby byly částečně ponořené v pufru po celé šířce nádobky. Ke spojeným bateriím připojte kabely (viz Obr. 1.9). 10. Připravte vzorky DNA (např. část DNA izolované z cibule) nebo např. potravinářská barviva smísením kapky roztoku DNA s kapkou nanášecího media a naneste vzorky do jamek. Vzorky je možno nanášet slámkou, kapátkem nebo inzulinovou stříkačkou.

11. Vytvořte elektrický obvod podle Obr. 1.9 připojením soustavy baterií na elektrody elektroforetické aparatury (upozornění: za daných podmínek migruje DNA a většina barviv ke kladně nabité elektrodě). V případě, že by se gel přehříval, lze snížit protékající proud snížením napětí, tj. vyřazením jedné baterie. Průběh dělení lze vyhodnocovat podle rychlosti migrace jednotlivých barviv. Při použití 4 baterií lze první výsledky dělení pozorovat po 20 minutách. Rozdělení velkých fragmentů DNA vyžaduje minimálně 90 minut.

12. Pokud byla při elektroforese analyzována barviva, lze náboj (směr migrace) a složení barviva vyhodnotit ihned pouhým okem z gelu položeného na bílé podložce. Pokud byla analyzována DNA, je ji třeba vizualizovat vybarvením v gelu. B) Vizualizace DNA v gelu Pro obarvení DNA v agarosovém gelu lze použít dvou jednoduchých metod: Pomalejší způsob: 1. Připravte takové množství barvícího roztoku 0,002% methylenové modři ve vodě, které postačí k zalití celého gelu.

- 23 -

Methylenová modř se váže na DNA. Po inkubaci gelu by se měla DNA vybarvit intenzivně modře. Citlivost takové detekce je podstatně menší než u ethidiumbromidu, ale menší je i toxicita methylenové modři a vybarvení je patrné ve viditelném světle.

2. Zalijte gel připraveným roztokem a ponechte přes noc v lednici. Poté barvící roztok odlijte a vymývejte barvivo z gelu vodou z vodovodu až se na bleděmodrém pozadí objeví tmavomodré proužky obarvené DNA. Agar-agarové gely jsou bohužel často velmi znečištěné, což způsobuje, že se nedaří vybarvit DNA jako pěkné proužky. Daleko lepších výsledků se dosáhne při použití skutečné agarosy. Barvící roztok lze používat vícekrát.

Rychlejší způsob: 1. Připravte takové množství barvícího roztoku 0,02% methylenové modři ve vodě, které postačí k zalití celého gelu. 2. Ponechte gel v připraveném roztoku 20 minut a poté vymývejte barvivo z gelu vodou z vodovodu až se na bleděmodrém pozadí objeví tmavomodré proužky obarvené DNA.

Obrázek 1.9: Uspořádání elektroforetické aparatury. Za podmínek popsaných v textu bude DNA putovat ke kladné elektrodě.

- 24 -

11..55..33..33 PPRROOTTEEIINNOOVVÁÁ NNAATTIIVVNNÍÍ EELLEEKKTTRROOFFOORREESSAA VV KKRRAABBIIČČCCEE Protokol je navržen tak, aby byla zřejmá vazba mezi nábojem proteinu a pH roztoku a byl proveditelný v středoškolských podmínkách. Pomůcky a reagencie: • něco co poslouží jako pipeta (tenká slámka, dutá tyčka od lízátka, kapátko, inzulínová stříkačka) • voskovaný papír • pomůcky na agarosovou elektroforesu (viz předchozí protokol) • roztok hovězího sérového albuminu (BSA) – 5 mg/ml • roztok lysozymu - 5 mg/ml • Vaječný bílek • 5% roztok sušeného odtučněného mléka ve vodě. • agarosa • elektroforetický pufr TBE • vzorkový pufr 1: (10 % sacharosa rozpuštěná v pufru TBE (pH 8), 0,1% bromfenolová modř) • vzorkový pufr 2: (10 % sacharosa rozpuštěná v 50mM acetátovém pufru (pH 4,5) , 0,1% bromfenolová modř) Provedení: 1. Na voskovaný papír nakápněte např. pomocí inzulínky malé množství vzorkového pufru 1 nebo 2, v závislosti na tom, v jakém prostředí bude prováděna elektroforesa (budou určeny jednotlivé pracovní skupiny). Ke kapce přidejte přibližně shodné množství roztoku proteinu (BSA, lysozym, mléko, vaječný bílek). Smíchání vzorkového pufru s roztokem proteinu v přibližně shodném poměru je nezbytné pro jeho nanesení do jamek na agarosovou elektroforesu. Sacharosa výrazně zvýší hustotu proteinového vzorku, takže ho lze bez problému nanést. Bromfenolová modř (barva modrá nebo červená v závislosti na pH) slouží jednak k orientaci nanášení (lze pozorovat jak vzorek klesá do dna jamky) a také k orientaci průběhu elektroforesy.

2. Sestavte elektroforetickou aparaturu podle předcházejícího protokolu (1.5.3.2) s následujícími rozdíly: krok 1: bude použit pufr, dle požadovaného pH (TBE nebo acetátový). krok 5: vložte hřeben do středu vaničky krok 8: použít shodný pufr za kterého je připraven 1% agarosový gel. 3. Po sestavení elektroforetické aparatury naneste do jamek pomocí inzulínky směs proteinů se vzorkovým pufrem. 4. Po provedení elektroforesy vyjměte gel do krabičky s 0,02% methylenovou modří a inkubujte 20 minut při pokojové teplotě za občasného míchání. Po 20 minutách proplachujte gel pod tekoucí vodou až do doby, kdy budou patrné obarvené proteinové proužky.

- 25 -

11..55..44 PPAAPPÍÍRROOVVÝÝ M MO OD DEELL D DN NA A Molekuly DNA všech biologických druhů jsou tvořené různými kombinacemi dvou pyrimidinových a dvou purinových deoxyribonukleotidů – dCMP, dTMP, dGMP a dAMP. Deoxynukleotidy jsou spojeny do dlouhých polynukleotidových řetězců kovalentními fosfodiesterovými vazbami mezi hydroxyly na C5 deoxyribosy jednoho nukleosidu a na C3 následujícího nukleosidu. Vzniká tak hydrofilní kostra cukr-fosfát-cukr-fosfát... společná všem molekulám DNA. Tímto uspořádáním je také určena polarita lineární molekuly, která má na jednom konci volný fosfát na C5 deoxyribosy (označován jako 5’ konec) a na druhém hydroxyl na C3 deoxyribosy (označován jako 3’ konec). V buňkách se DNA vyskytuje nejčastěji ve formě pravotočivé dvojšroubovice vznikající svinutím dvou řetězců DNA kolem pomyslné podélné osy. Na jeden závit vysoký 3,54 nm připadá 10,4 nukleotidů. Na povrchu dvojšroubovice se vytváří dva žlábky různé velikosti – velký a malý, které jsou místy interakce DNA s proteiny. Oba polynukleotidové řetězce jsou v dvojšroubovici propojeny vodíkovými můstky, přičemž tyto vazby nevznikají náhodně, ale tvoří se vždy mezi páry dvou určitých bází, které se označují jako komplementární. Tak cytosin se páruje s guaninem prostřednictvím třech vodíkových můstků a thymin s adeninem pomocí dvou vodíkových můstků. V obou případech se monocyklická pyrimidinová báze páruje s bicyklickou purinovou, což vede k udržení stabilní vzdálenosti (2 nm) mezi cukr-fosfátovými kostrami obou řetězců podél celé délky dvojšroubovice. Obě báze se mohou stabilně párovat ve dvojšroubovici pouze za předpokladu, že jsou oba řetězce vůči sobě antiparalelní, tzn. že orientace jednoho řetězce je 5’→3’a druhého 3’→5’. Z párování bází vyplývá, že první řetězec obsahuje sekvenci nukleotidů, která je přesně komplementární k nukleotidové sekvenci partnerského řetězce.

Materiál: • Vystřižené páry nukleotidů • Dřevěná špejle • Lepidlo na papír a lepící páska Postup: 1. Použijte připravené vystřižené páry bází nebo kopie oxeroxované na tvrdém papíře nebo bezbarvé folii. 2. Ohýbejte konce nukleotidů jako harmoniku tak, jak je vyznačeno prolisy. POZOR: Pro vytvoření pravotočivé dvojšroubovice je třeba ohýbat fosforibosylovou páteř tak, aby směřovala na pravé straně nahoru a na levé dolů. Stejně tak je třeba vyklopit rovinu furanosového kruhu ribosylu (prostřih). 3. Navlékněte dva takto připravené páry nukleotidů na špejli tak, aby byla čitelná označení bází. Na každé straně přilepte kyslík hydroxylu vycházející z ribosy jedné báze prodlužovaného vlákna DNA s fosfátem vycházejícím z fosforibosylu následujícího páru nukleotidů. 4. Postupně prodlužujte dvojšroubovici DNA přidáváním dalších párů bází. 5. Rovnoměrně roztáhněte jednotlivé páry nukleotidů na špejli a zafixujte jejich polohu oblepením špejle lepící páskou nad a pod rovinou bází. K vytvoření jednoho závitu je třeba 10 nebo 11 párů bází. V modelu sestaveném z 8 párů bází již začíná být patrný malý a velký žlábek.

- 26 -

22.. PPR RO OT TE EIIN NO OV VÉ ÉT TE EC CH HN NIIK KY Y 22..11 E ENNZZYYM MY Y Jednou z klíčových podmínek pro život je schopnost organismu katalyzovat specificky a efektivně chemické reakce. K tomu slouží enzymy. Název enzym pochází z řeckého slovního spojení EN ZYME (v kvasinkách), a jedná se o biologický katalyzátor proteinového původu. Enzym se liší se od chemických katalyzátorů v několika důležitých bodech - vyšší reakční rychlost - mírnější podmínky reakce - vyšší specifita reakce - schopnost regulace Enzymy ovlivňují RYCHLOST reakce, nikoli výslednou ROVNOVÁHU. Katalyzátory (enzymy) zvyšují reakční rychlost snížením aktivační energie reakce – zvýšení řádově 105 až 1017 v porovnání s nekatalyzovanou reakcí. Historie poznávání enzymové aktivity • 1700 studium rozkladu masa sekrety žaludku • 1800 rozklad škrobu slinami • 1850 Louis Pasteur – fermentace cukru na ethanol - „fermenty“ • 1926 James Sumner – enzymy jsou proteiny (krystal ureasy) Názvosloví enzymů Názvy enzymů se tvoří přidáním přípony „asa“ ke jménu příslušného substrátu (sacharasa) nebo k označení katalytické reakce (alkoholdehydrogenasa). Klasifikace je založena na povaze chem. reakce, kterou enzymy katalyzují: - 6 hlavních tříd, označení 2 názvy a 4 čísly - doporučený název – výhodný pro běžné použití, často je to dříve používaný triviální název - systematický název – pro přesné označení - 4 čísla: 1.číslo – hlavní třída enzymu 2. číslo – podtřída 3 číslo – další podskupina 4 číslo – pořadové číslo E v této podskupině - 6 hlavních tříd: 1. OXIDOREDUKTASY – oxidačně-redukční děje donor + akceptor → oxidovaný donor + redukovaný akceptor Systematický název: donor : akceptor-oxidoreduktasa 2. TRANSFERASY – přenos funkčních skupin donor_SK + akceptor → donor + akceptor_SK Systematický název : donor : akceptor_skupinatransferasa 3. HYDROLASY – hydrolýza A _ B + H2O → AOH + HB Systematický název: substrát (skupina) hydrolasa - 27 -

4. LYASY – eliminace skupin za vzniku dvojných vazeb substrát 1 (+ substrát2) → produkt1 + produkt2 (malý) Systematický název: substrát1 ( :substrát 2)_ produkt2lyasa 5. ISOMERASY – izomerace Systematický název: substráttyp 6. LIGASY – tvorba vazeb spojená s hydrolýzou ATP substrát1 + substrát2 + A( G ) TP → substrát1_substrát2 + ADP + Pi nebo substrát1 + substrát2 + ATP → substrát1_substrát2 + AMP + PPi Systematický název: substrát1 :substrát2_ligasa (tvořící ADP/AMP ) Substrátová specifita - teorie zámku a klíče o místo, kam se váže substrát je otiskem substrátu v povrchu enzymu, aminokyselinové zbytky vazebného místa enzymu účinně interagují s molekulami substrátu o vazebné místo je z větší části vytvořeno předem, ale vazba substrátu navozuje určité strukturní změny - enzymy jsou absolutně stereospecifické (enzymy tvoří díky své přirozené chiralitě (L-AK) asymetrická vazebná místa) („pravá ruka se nehodí do levé rukavice“) - enzymy jsou více či méně geometricky specifické („různý tvar a velikost levé rukavice“), některé absolutně specifické pro jednu sloučeninu, většinou je substrátem skupina příbuzných sloučenin Regulace enzymové aktivity Regulace enzymových aktivit je pro život organismu klíčová. Existuje mnoho způsobů regulace na několika úrovních. - regulace množství přítomného enzymu (rychlost syntézy, rychlost odbourávání) - regulace aktivity (mnoho způsobů) Stanovení enzymové aktivity v zásadě dvě možnosti - stanovení úbytku substrátu nevýhoda – maximální spotřeba 5%, rozdíl dvou velkých čísel, nepřesné - stanovení přírůstku produktu

- 28 -

22..22 SSAACCHHAARRIIDDYY Sacharidy mají své pojmenování odvozené od latinského slova saccharum (cukr)a představují základní složky všech živých organismů a představují nejrozsáhlejší skupinu biologicky aktivních molekul. Sacharidy dělíme na následující skupiny: Monosacharidy – nejjednodušší cukry, většinou produkty fotosyntézy, jsou složkou nukleových kyselin i složitých lipidů. Rozklad monosacharidů poskytuje většinu energie potřebné pro průběh biochemických pochodů Oligosacharidy – skládají se z několika kovalentně vázaných monosacharidových jednotek. Jsou často sloučeny s proteiny (glykoproteiny) a lipidy (glykolipidy), v těchto sloučeninách mají jak stavební, tak regulační funkci Polysacharidy – jsou tvořeny velkým počtem kovalentně vázaných monosacharidových jednotek a jejich molekulová hmotnost dosahuje až několika milionů g/mol (Obr. 2.1). Jejich strukturní role je nepostradatelná pro všechny organismy, zejména však pro rostliny vzhledem k tomu, že celulosa, základní stavební materiál rostlin, představuje až 80% jejich sušiny. Polysacharidy jako škrob u rostlin a glykogen u živočichů slouží jako důležité zásobní látky. Polysacharidy vytvářejí jak lineární, tak větvené polymery, protože glykosidová vazba může vycházet z kterékoliv hydroxylové skupiny. ŠKROB: - zásobní polysacharid rostlin, hlavní sacharidická složka živočišné potravy - směs glukanů, v cytoplazmě rostlinných buněk je uložen v nerozpustných granulích, které se skládají z α-amylosy a amylopektinu o α-amylosa je lineární polymer, obsahující několik tisíc glukosových zbytků, vázaných vazbami α 1,4. Je isomerem celulosy (v celulose β 1,4 vazby) o amylopektin se skládá převážně z glukosových zbytků spojených vazbami α 1,4, má ale větvenou strukturu s vazbami α 1,6 cca po každých 30 glukosových zbytcích

Celulosa Obr. 2.1: Strukturní odlišnost mezi celulosou a škrobem

- 29 -

Škrob

Trávení škrobu – probíhá ve stupních - začátek v ústech, sliny obsahují α-amylasu, která náhodně hydrolyzuje α 1,4 glykosidové vazby škrobu s vyjímkou vnějších vazeb a vazeb následujících po větvení - v žaludku je účinkem nízkého pH inaktivována α-amylasa, v té době je již délka škrobového řetězce snížena z několika tisíc glukosových jednotek na méně než osm - v tenkém střevě účinkuje pankreatická α-amylasa, která je podobná slinné; Rozkládá škrob na směs disacharidu (maltosa), trisacharidu (maltotriosa) a dextrinů (směs obsahující α 1,6 větvení) - tyto oligosacharidy jsou rozkládány účinkem střevních enzymů α-glukosidasou, α-dextrinasou, sacharasou a laktasou - vznikající monosacharidy jsou absorbovány střevní stěnou a převáděny do krevního oběhu

22..33 α--AAM MY YLLA ASSA A,, SSTTA AN NO OV VEEN NÍÍ JJEEJJÍÍ A AK KTTIIV VIITTY YV VEE SSLLIIN NÁ ÁC CH HA AV VLLIIV V R YM MO OV VO OU UA AK KTTIIV VIITTU U REEA AK KČ ČN NÍÍC CH H PPO OD DM MÍÍN NEEK KN NA A EEN NZZY Vliv reakčních podmínek na enzymovou aktivitu Enzymová aktivita je ovlivněna mnoha různými faktory. Mezi fyzikálně-chemické řadíme teplotu, pH, iontovou sílu, mezi chemické potom dostupnost substrátu, přítomnost inhibitorů reakce apod. Za předpokladu nadbytku substrátu a vyloučení inhibitorů bude hrát v praktické úloze roli prakticky jen teplota reakce. Vliv teploty na rychlost enzymové reakce Teplota systému je do určité míry kinetickou energií molekul v systému. Zvýšíme-li tedy teplotu systému, zvýší se i kinetická energie jeho molekul, což se několika způsoby projeví na rychlosti reakcí, probíhajících v systému: 1) Více energetických kolizí Jestliže se srazí dvě molekuly, jejich kinetická energie může být přeměněna na chemický potenciál. Jestliže je chemický potenciál dostatečně velký, může být dosaženo aktivační energie exergonické reakce a může dojít ke změně chemického stavu molekuly (reakce). Je-li tedy zvýšená teplota systému, je zvýšen i počet molekul, které pravděpodobně dosáhnou aktivační energie. Celková rychlost reakce je tedy zvýšena. 2) Větší počet kolizí Pro úspěšnou konverzi substrátu na produkt je nutné, aby se molekula enzymu srazila s molekulou substrátu a navázala ho do svého aktivního místa. Zvýšení teploty zvýší počet kolizí mezi molekulami a reakční rychlost se zvýší. 3) Zvýšení vnitřní energie molekul v systému Se zvýšením teploty systému se zvyšuje i vnitřní energie molekul v systému. Tato vnitřní energie je tvořena translační, vibrační a rotační složkou, jako i energií chemických vazeb a energií nevazebných interakcí. Je-li tedy teplota příliš velká, může dojít k přerušení některých vazeb, které se podílejí na prostorové struktuře aktivních proteinů. To vede k teplotní denaturaci aktivního proteinu a tím k jeho inaktivaci. Výše zmíněné faktory dávají ve výsledku křivku závislosti reakční rychlosti enzymové reakce na teplotě (Obr. 2.2, viz příloha). Se vzrůstající teplotou roste za konstantních podmínek rychlost reakce. V určitém bodě dochází k rovnováze mezi vzrůstem rychlosti - 30 -

způsobeným zvýšením počtu srážek molekul a zvýšení počtu molekul s aktivační energií a mezi snížením rychlosti způsobeným teplotní denaturací enzymu. Tato oblast maximální reakční rychlosti se nazývá teplotní optimum enzymu. Při teplotě nad teplotním optimem převládá vliv teplotní denaturace enzymu a reakční rychlost klesá. Základní obecné údaje o enzymu - triviální název: α-amylasa - klasifikace: E.C. 3.2.1.1 - systematický název: 1,4-alfa-D-glukan glukanohydrolasa - katalyzovaná reakce: endohydrolýza 1,4-alfa-D-glukosidových vazeb v polysacharidech, obsahujících tři a více D-glukosových jednotek spojených vazbou alfa 1,4 Enzym použitý v úloze: - zdrojový organismus: Homo sapiens - počet aminokyselin, tvořících strukturu proteinu: 511 - molekulová hmotnost: 57768 g/mol - 3D struktura: PDB soubor 1SMD (Obr. 2.3 – viz příloha) Kromě již zmiňované lokalizace ve slinách a pankreatických tekutinách lze α-amylasu nalézt též v krvi, potu a slzách, pravděpodobně pro svou antibakteriální aktivitu. Stanovení α-amylasové aktivity je důležitým diagnostickým nástrojem již mnoho let, zvýšené hladiny tohoto enzymu jsou indikátorem poruchy funkce jater a pankreatu. Stanovení enzymové aktivity α-amylasy 1) stanovení reakcí s jódem (Somogyi, 1960) Historicky první metoda, založená na měření času, za který v citlivě standardizovaném roztoku škrobu proběhne hydrolýza. Využívá různě zbarvených produktů, vznikajících reakcí sacharidů s jódem v závislosti na stupni degradace škrobu: α-amylasa α-amylasa škrob (polysacharid) -> oligosacharidy -> glukosa+směs oligosacharidů s jódem modrý s jódem červený s jódem žlutý Po promíchání vzorků obsahujících amylasu se standardizovaným roztokem škrobu je reakce monitorována odebíráním reakční směsi v časových intervalech a přidávání těchto alikvotů k roztoku jódu. Dokud je přítomen škrob, vytváří se namodralý produkt. Po určitém čase se barva produktu změní na modro-fialovou, červeno-fialovou a poté na červeno-hnědou. Pokud je produkt žlutý, došlo ke kompletní hydrolýze škrobu a stanovení musí být opakováno. 2) stanovení reakcí s kyselinou dinitrosalicylovou Přesné stanovení vznikajících redukujících cukrů při hydrolýze škrobu reakcí s kyselinou dinitrosalicylovou a měřením absorbance při 530 nm. Vzorek je zředěn a smíchán s 1% roztokem škrobu. Reakce probíhá 40 minut při 37 °C. Reakce je zastavena přídavkem dinitrosalicylátu a zavařením vzorku po dobu 5 minut. Jedna jednotka (kat) α-amylasové aktivity je definován jako množství enzymu, které uvolní 1 mol redukujících cukrů za jednu sekundu za definovaných podmínek.

- 31 -

Praktická úloha: Použité roztoky a chemikálie: 1% (w/w) škrobový roztok: škrob (Zulkowski grade) rozpuštěn v deionizované vodě. Roztok je slabě opalescentní a při stání se může objevit sediment. Skladujte při laboratorní teplotě. roztok dinitrosalicylové kyseliny: 1 g dinitrosalicylové kyseliny rozpustit ve 20 ml 2M NaOH a 50 ml deionizované vody, přidat 30 g vinanu sodno-draselného a doplnit do 100 ml deionizovanou vodou. Při rozpouštění zahřívat na míchadle. Postup (viz obr. 2.4.): 1) připravte si a označte mikrozkumavku a odeberte vzorek vlastních slin 2) vzorek slin zřeďte dle pokynů vyučujícího 3) do tří nově označených mikrozkumavek pipetujte roztok zředěných slin, do čtvrté zkumavky pouze stejný objem vody (slepý pokus) 4) zkumavku A zavařte po dobu 5 minut, další mikrozkumavky ponechte při laboratorní teplotě 5) po schlazení na laboratorní teplotu (A) přidejte jednotlivým mikrozkumavkám s roztokem zředěných slin roztok škrobu v poměru 1:2 (2 objemy škrobu na jeden objem slin) 6) mikrozkumavky A a B inkubujte při 37 °C po dobu 40 minut, mikrozkumavky C a D inkubujte při 10°C po dobu 40 minut 7) po 40 minutách zastavte enzymovou reakci přídavkem stejného objemu roztoku kyseliny dinitrosalicylové 8) všechny zkumavky zavařte 5 minut 9) do 3 jamek mikrotitrační destičky pečlivě pipetujte 200 mikrolitrů z každé mikrozkumavky 10) změřte absorbanci při 530 nm 11) vyhodnoťte výsledky Očekávané výsledky: Největší hodnota absorbance by měla být změřena ve zkumavce B. Aktivní enzym byl inkubován při optimální teplotě. Zkumavka A obsahuje teplotně inaktivovanou α-amylasu (povařeno v kroku 4) a žádné redukující cukry by tak neměly být detekovány. Zkumavka C obsahovala aktivní enzym, reakce však probíhala za chladu a enzym byl tudíž méně aktivní. Množství redukujících cukrů vzniklých amylolytickou aktivitou by mělo být tudíž menší.

- 32 -

Obr. 2.4: Postup praktické úlohy - schéma

- 33 -

22..44 T CH H PPR RO OTTEEIIN NŮ Ů -- JJA TAAJJEEM MN NÉÉ C CH HO OV VÁ ÁN NÍÍ SSTTR RU UK KTTU UR RN NÍÍC CH HV VIIR RO OV VÝ ÝC AK K PPŘ ŘIIN NU UTTIITT SSTTO OV VK KY YM MO OLLEEK KU ULL PPR RO OTTEEIIN NU UA ABBY Y SSEE PPO OSSK KLLÁ ÁD DA ALLY YD DO O SSFFÉÉR ČÁ ÁSSTTIIC CEE?? RIIC CK KÉÉ Č V této laboratorní úloze se budeme zabývat schopností strukturních proteinů opičího retroviru M-PMV (Mason-Pfizerův opičí retrovirus) utvořit za přesně definovaných podmínek sférické částice složené z přibližně 1500 molekul fúzního proteinu. To, zda se skutečně částice vytvořily, ověříme pomocí elektronové mikroskopie, technikou negativního barvení. Budeme studovat i vliv přidané nukleové kyseliny na skládání a tvar částic.

22..44..11 R REETTRROOVVIIRROOVVÉÉ SSTTRRUUKKTTUURRNNÍÍ PPRROOTTEEIINNYY Retroviry tvoří početnou skupinu RNA virů, které způsobují mnoho závažných onemocnění živočichů včetně člověka. Výsledky získané výzkumem retrovirů mohou pomoci k léčbě onemocnění jako je syndrom lidské imunodeficience (AIDS) či rakovina. Retroviry jsou v posledních letech předmětem intenzivního studia, které se zaměřuje na poznání jejich životního cyklu a pochopení jeho jednotlivých kroků. Porozumění jednomu z těchto kroků, procesu skládání virových částic v hostitelské buňce nebo v systému in vitro, může pomoci při vývoji nových antivirových léků (například nalezením inhibitorů skládání) či při využití retrovirových částic jako vektorů pro genové terapie. Při skládání retrovirových částic hrají významnou roli nukleové kyseliny. Proto je důležité studovat i jejich funkci v tomto kroku. Mason-Pfizerův opičí virus Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) byl poprvé izolován z prsního karcinomu opice Makak rhesus v roce 1970. Tento virus, který není infekční pro lidi, se s výhodou používá jako model pro studium skládání virů, neboť skládání tzv. nezralé částice, její transport, pučení a následné zrání, kdy dochází ke štěpení polyproteinových prekursorů tohoto viru, jsou oddělené procesy. Genom M-PMV tvoří čtyři geny v samostatných otevřených čtecích rámcích, a to gag, pro, pol a env. Při genové expresi jsou syntetizovány tři polyproteinové prekurzory, polyproteinový prekurzor Gag a díky posunu čtecího rámce ještě polyproteinové prekurzory Gag-Pro a Gag-Pro-Pol. Tyto prekurzory se syntetizují v poměru Gag: Gag-Pro: Gag-Pro-Pol 100:10:1. Takto je regulována exprese pro resp. pol, ze kterých vnikají virové enzymy proteasa resp. integrasa a reverzní transkriptasa. Expresí genu env také vzniká polyproteinový prekurzor, jenž je štěpen v endoplazmatickém retikulu na membránové podjednotky TM a SU. Z prekurzoru Gag o velikosti 78 kDa vzniká po štěpení šest proteinů: MA (matrixový protein), pp (fosfoprotein), p12 (protein p12), CA (kapsidový protein), NC (nukleokapsidový protein) a p4 (protein p4). Již přítomnost samotného polyproteinového prekurzoru Gag je postačující pro vznik virům podobných částic a jejich pučení z hostitelské buňky.

Obr. 2.5 : Organizace proteinů v rámci strukturního polyproteinu Gag dvou retrovirů. M-PMV a HIV.

- 34 -

Kapsidový protein Největším strukturním proteinem retrovirů je kapsidový protein (CA). Ten tvoří ve zralém virionu hydrofobní schránku zvanou „core“, která obklopuje komplex nukleokapsidového proteinu (NC) s RNA. Tvar core se u jednotlivých retrovirů liší. Může být tubulární, sférické či kónické, u viru M-PMV je tubulárního tvaru. N-koncová doména kapsidového proteinu má významný vliv na tvar vznikajících částic, neboť vytváří smyčku, která se stabilizuje iontovou interakcí Pro1 a Asp 50-57. Pozice Asp se u jednotlivých retrovirů liší. Hlavní doména, určující tvar a velikost vznikající částice, je z prekurzoru Gag právě CA. V C-koncové části kapsidového proteinu se nachází doména, která je konzervovaná mezi mnoha retroviry, tzv. "major homology region, MHR". Funkcí MHR je podpora protein-proteinových interakcí v Gag, neboť vytváří spletitou síť vodíkových můstků, která stabilizuje celkovou strukturu CA. Navíc tato doména vykazuje strukturní homologii se SCAN doménou. SCAN domény jsou přítomny v mnoha proteinech živočišné říše, které spolu interagují, např v transkripčních faktorech. Nukleokapsidový protein Nukleokapsidový protein tvoří ve zralém virionu komplex s virovou RNA. Jedná se o poměrně malý protein o velikosti 60-100 aminokyselin. Nukleokapsidová doména polyproteinových prekurzorů Gag, Gag-Pro či Gag-Pro-Pol je zodpovědná za dimerizaci genomové RNA a její specifické rozpoznání a vbalení do vznikající částice. Nukleokapsidové proteiny retrovirů obsahují jeden nebo dva motivy zinkových prstů. Tyto domény vážou zinečnaté ionty pomocí třech cysteinových a jednoho histidinového zbytku. Sekvence zinkových prstů retrovirů se dá obecně zapsat jako Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys, kde X značí jakoukoliv aminokyselinu. Tato oblast NC je odpovědná za specifickou inkorporaci virové RNA do vznikající částice, což je důležitý krok při tvorbě funkční virové částice. Vazba virové RNA je upřednostněna před vazbou buněčných nukleových kyselin díky tomu, že virová genomová RNA obsahuje tzv. „cis-aktivní sekvenci“ zvanou též Ψ sekvence. Zinkové prsty jsou spojeny flexibilní oblastí kladně nabitých aminokyselin, které mohou nespecificky vázat jak virovou tak i buněčné RNA. Bylo zjištěno, že dimerizace NC-NC je iniciační silou pro skládání polyproteinových prekurzorů Gag ve virovou částici. Kromě interakcí NC-NC jsou během skládání důležité i interakce ostatních domén polyproteinového prekurzoru Gag, např. CA-CA. Skládání částic Jak již bylo řečeno dříve, bylo potvrzeno, že polyproteinový prekurzor Gag je sám o sobě schopný tvořit částice podobné nezralým částicím, a to v systému in vitro, in vivo a také v bakteriálních buňkách. U většiny retrovirů vznikají v těchto systémech sférické částice, které jsou si podobné strukturou i velikostí. K pochopení procesu skládání částic a studia vlivu nukleové kyseliny na tento proces se s výhodou používá systém in vitro, neboť je zde omezen vliv dalších buněčných faktorů. Při expresi genů kódujících strukturní proteiny v bakteriálních buňkách (Escherichia coli) se využívá vysoké hladiny exprese těchto genů pod silným promotorem bakteriofága T7. Díky mnoha studiím bylo zjištěno, že k vytvoření částic podobným nezralým virionům in vitro, in vivo a v bakteriích není zapotřebí celý polyprotein Gag. K tvorbě virům podobných částic („VLP“ z anglického „virus-like particle“) jsou postačující zkrácené mutanty Gag. Mutační studie pomohly objasnit jaké domény Gag jsou schopné tvořit částice a určit funkci těchto domén během procesu tvorby částic nebo i v celém životním cyklu retrovirů. Jako modely pro tato studia slouží velmi často virus M-PMV. Byla potvrzena tvorba kapsid M-PMV z fúzního proteinu CA-NC. Důležitou roli zde hraje CA protein, zvláště při tvorbě vyšších struktur in vitro, kdy je CA určující pro tvar vznikající částice. Na tvar vznikající částice má největší vliv NTD CA, jmenovitě první aminokyselina v NTD, kterou je prolin. Po štěpení polyproteinu Gag virovou proteasou vzniká v CA smyčka stabilizovaná solným můstkem, který tvoří právě Pro1 a Asp, umístěný na pozici

- 35 -

50 či 57. Toto uspořádání odpovídá situaci ve zralém virionu, kde zralý CA vytváří smyčku a formuje se tubulární core. Pokud je N-konec CA-NC prodloužen o 1 a více AK nebo je Pro1 odstraněn či nahrazen alaninem, vznikají sférické částice. Role RNA při procesu skládání částic Genomová RNA je inkorporována do virové částice během její tvorby. Tato virová RNA je upřednostněna při vbalování do vznikající částice před ostatními buněčnými RNA i DNA, a to díky její specifické Ψ sekvenci, která je rozpoznávána doménou zinkových prstů v nukleokapsidovém proteinu. Studiemi in vitro a in vivo bylo potvrzeno, že retroviry jsou schopné do svých částic vbalit např. dvouvláknovou DNA, jednovláknové i dvouvláknové RNA, oligonukleotidy a jiné látky substituující nukleové kyseliny. Stále není jasné, zda při sbalování retrovirových částic je, či není nutná přítomnost RNA. Některé studie poukazují na nutnou přítomnost RNA při sbalování virových částic. Toto tvrzení podporují pokusy, kdy po ošetření retrovirových částic RNAsou došlo k jejich rozpadu. Druhá teorie tvrdí, že vazba RNA polyproteinem Gag není během sbalování částice nutná. Pro tuto teorii svědčí pokusy, kdy byla nukleokapsidová doména nahrazena doménou leucinového zipu, která neváže RNA, a stále docházelo k tvobě částic. Z většiny pokusů, i našich, vyplývá, že interakce mezi nukleokapsidovým proteinem a nukleovou kyselinou není nutná pro sbalení částic, ale je důležitá pro jejich strukturu a stabilitu. Navíc vždy po přídavku libovolné RNA docházelo k mnohem účinnější tvorbě částic pravidelného tvaru. Existují dva hlavní modely vysvětlující funkci nukleové kyseliny při sbalování retrovirových částic. První model tvrdí, že nukleová kyselina slouží jako lešení, které drží částici pohromadě. Na nukleovou kyselinu se tedy postupně navazují jednotlivé polyproteiny Gag a vzniká tak virová částice. Druhý model předpokládá, že interakce nukleokapsidového proteinu a nukleové kyseliny iniciuje multimerizaci Gag. Základní jednotkou této multimerizace je dimer Gag-Gag, který vzniká po navázání dvou polyproteinů Gag na nukleovou kyselinu. Prvek od kterého začíná tvorba částice je tedy dimer Gag-Gag.

22..44..22 PPRRAAKKTTIICCKKÁÁ ÚÚLLOOHHAA AANNEEBB SSLLOOŽŽTTEE SSII ČČÁÁSSTTIICCEE PPOODDOOBBNNÉÉ VVIIRRŮŮM MV VEE ZZK DÍÍV VEEJJTTEE SSEE N NA AN NĚĚ KU UM MA AV VC CEE A A PPO OD V naší laboratorní práci se pokusíme získat sférické částice vytvořené z purifikovaného fúzního proteinu CA-NC Mason-Pfizerova opičího viru. Budeme studovat úlohu přídavku různých nukleových kyselin na proces skládání částic. Výsledný materiál budeme analyzovat pomocí transmisního elektronového mikroskopu. Příprava materiálu pro skládání M-PMV částic Nejprve byly pomocí roztoku chloridu vápenatého připraveny kompetentní buňky Escherichia coli kmene BL21 (DE 3), tedy buňky schopné přijmout plasmidovou DNA. K buněčné suspenzi kompetentních buněk byla přidána plasmidová DNA, nesoucí geny kódující strukturní fúzní CA-NC protein, kde byl deletován N-koncový prolin. Buňky byly transformovány a poté z nich bylo připraveno inokulum pro zaočkování většího množství média. Po dostatečném nárůstu buněk nesoucích expresní plasmid byla exprese genů indukována přídavkem IPTG. Po čtyřech hodinách exprese byly buňky centrifugovány a buněčná peleta byla lyzována. Protein CA-NC z lyzátu byl purifikován pomocí afinitní chromatografie na koloně „HiTrapTM Chelating HP Column“. Při této chromatografii se využilo přítomnosti dvou zinkových domén v nukleokapsidovém proteinu, které mají afinitu k iontům zinku, navázaných na nosiči. Abychom mohli studovat vliv nukleových kyselin na tvorbu částic z námi purifikovaných proteinů bylo nutné ještě protein přečistit od

- 36 -

kontaminujících nukleových kyselin, pomocí fosfocelulosové kolony. Tento protein je Vám k dispozici pro Vaši práci v dostatečném množství. Ke tvorbě částic in vitro dochází během dialýzy purifikovaného fúzního CA-NC proteinu z pufru 50mM fosfát, 500mM NaCl, 0,05% ME, 1µM ZnSO4, pH 7,5 do pufru 50mM Tris base, 100mM NaCl, 1µM ZnSO4, pH8,0. Pokud reakční směs obsahuje cca 60 µg příslušného proteinu a 6 µg RNA z bakteriofága MS2 (MS2 RNA) (hmotnostní poměr protein : RNA 10:1) v celkovém objemu směsi 100 µl a dialýza probíhá 2 hod při laboratorní teplotě, dochází k velmi účinnému skládání částic. Pro potvrzení toho, že částice o velikosti okolo 75 nm skutečně vznikají, lze použít transmisní elektronový mikroskop (viz. obr. 2.6.). Vzniklé částice je nutné předem barvit technikami negativního barvení.

Obr. 2.6: Transmisní elektronový mikroskop JEOL JEM 1010, max. napětí 100 kV, max. zvětšení 500 000x. Vybaven kamerou SIS MegaView III, program AnalySIS. Všechny potřebné materiály a pufry Vám budou poskytnuty a nebude tedy nutné ztrácet čas jejich přípravou. Postup: 1. Připravte si z plastové mikrozkumavky dialyzační celu tak, že opatrně odříznete její vrchní část. Takto v podstatě vznikne víčko od mikrozkumavky s okrajem její spodní části, který bude sloužit jako těsnící kroužek. Víčko dobře popište nesmazatelnou fixou na vrchní straně. 2. Napipetujte do dialyzační cely (víčka od mikrozkumavky) 60 µg purifikovaného strukturního proteinu CA-NC. Tento protein je po purifikaci v roztoku C, který obsahuje 50mM fosfát, 500mM NaCl, 0,05% ME, 1µM ZnSO4, pH 7,5. V tomto prostředí se CA-NC proteiny chovají jako monomery, nedochází k jejich vzájemným interakcím a tedy nevznikají žádné složitější struktury (částice).

- 37 -

3. Napipetujte do víčka k roztoku proteinu 6 µg ribonukleové kyseliny. Postupujte dle pokynů vyučujícího, část z Vás bude pipetovat ribonukleovou kyselinu isolovanou z kvasinky Saccharomyces cerevisiae, část z Vás použije bakteriofágovou RNA z fága MS2. 4. Do víčka napipetujte takový objem roztoku C, aby výsledný objem kapaliny ve víčku byl 100 µl. 5. Obsah víčka jemně promíchejte opětovným pipetováním. 6. Opatrně překryjte víčko 1 kDa dialyzační membránkou a uzavřete ho. Touto membránou by neměly procházet molekuly větší než 1000 Da. 7. Položte víčko membránkou na roztok skládacího pufru (50mM Tris base, 100mM NaCl, 1µM ZnSO4, pH8,0). V průběhu dialýzy by mělo docházet ke skládání sférických částic. Nechte dialyzovat alespoň 1 hodinu. 8. Opatrně otevřete víčko a roztok přeneste pipetou do prázdné mikrozkumavky. 9. Nyní pracujte na voskové destičce. Naneste 6 µl roztoku vzorku na mikroskopickou síťku, která byla předem pokryta vrstvou uhlíku. Vzorek na síťce ponechte adherovat 6 – 10 min. 10. Síťku jemně opláchněte v destilované vodě tak, že ji pinzetou otočíte vzorkem dolů na kapku destilované vody. Síťka by se neměla potopit, měla by plavat na hladině. 11. Síťku přeneste kličkou na kapku 4% roztoku křemičitowolframátu sodného (STA) na dobu 20 sekund. (STA se váže na proteiny a poté umožní jejich vizualizaci na TEM). Po osušení nadbytečného barviva filtračním papírem (síťku kličkou otočíte na filtrační papír) vzorek ponechte při laboratorní teplotě, aby dostatečně oschnul. 12. Takto připravený vzorek vložte do transmisního elektronového mikroskopu (TEM) a pozorujte při napětí 80 kV a zvětšení 20 000 – 250 000krát. Obraz analyzujte pomocí digitální kamery MegaView III a programu AnalySIS. Porovnejte výsledky získané s použitím MS2 RNA a kvasinkové RNA. Porovnejte Váš výsledek i s tzv. slepým pokusem, tedy původním nedialyzovaným proteinem po purifikaci, kde by nemělo docházet ke skládání částic.

- 38 -

Obr. 2.7.:. Částice složené po dialýze CA-NC proteinu do skládacího pufru v přítomnosti různých RNA. A - MS2 RNA, B -RNA z E. coli, C - bez RNA. Úsečka představuje 100 nm.

- 39 -

33.. B BA AR RE EV VN NÁ ÁO OB BR RA AZ ZO OV VÁ Á PPŘ ŘÍÍL LO OH HA A

Obr.

1.1:

(A) DNA polymerasa katalyzuje vznik fosfodiesterové vazby mezi komplementárním deoxyribonukleosidfosfátem a 3’ hydroxylem ribosy prodlužovaného vlákna DNA. (B) Teplotní denaturace dvojřetězcové molekuly DNA.

- 40 -

Obr. 1.2: Princip amplifikace specifického fragmentu DNA pomocí PCR. Použitými primery přesně vymezujeme oblast, která má být amplifikována

- 41 -

Obr. 1.3: Princip AFLP. Štěpení chromosomální DNA (A), připojení adaptoru (B) a selektivní PCR (C)

Obrázek 1.4: Využití VNTR sekvencí v kriminalistice. - 42 -

Obr. 2.2: Vliv reakční rychlosti na teplotě. Modrá křivka představuje závislost reakční rychlosti na teplotě pro enzym z chladově adaptovaného organismu. Červená křivka je nejblíže podobná pravděpodobnému profilu lidské slinné α-amylasy. Zelená křivka bude naměřena při měření závislosti reakční rychlosti na teplotě u enzymu thermofilní bakterie. Křivky se nemusí lišit jen hodnotou teplotního optima, ale též svým tvarem.

Obr. 2.3: 3D struktura lidské slinné α-amylasy 1SMD

- 43 -