CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Princip: Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid) při různých počátečních koncentracích substrátu. Množství vzniklého produktu (p-nitroanilin žluté barvy) je úměrné rychlosti hydrolýzy. Po přidání inhibitoru (aprotininu) k reakční směsi se určí míra inhibice enzymové aktivity. Intenzita zbarvení reakčního roztoku se měří při 405 nm. Roztoky: 30% kyselina octová 0.05 M Tris-HCl pufr, pH 8.2 (obsahuje 0.02 M CaCl2) 4.10-2 M BAPNA v dimethylsulfoxidu trypsin (1 mg/ml) aprotinin (vodný roztok 1:1000) Postup: 1) Připravte řadu roztoků BAPNA o různé koncentraci ředěním základního roztoku podle následující tabulky: č. zkumavky BAPNA (ml) Dimethylsulfoxid (ml)
1 0.1 0.9
2 0.2 0.8
3 0.4 0.6
4 0.6 0.4
5 0.8 0.2
6 1.0 0.0
2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. 3) Do 1. řady zkumavek pro slepé stanovení přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, 0.3 ml roztoku kys. octové a 0.2 ml roztoku trypsinu v uvedeném pořadí. 4) Do 2. řady zkumavek přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, vložte do termostatu nastaveného na 35 °C a nechte cca 5 min vytemperovat. Potom pipetujte postupně v minutových intervalech 0.2 ml roztoku trypsinu, čímž zahájíte enzymovou reakci. Přesně po 10 minutách od zahájení reakce v první zkumavce začněte opět v minutových intervalech přidávat do zkumavek ve stejném pořadí 0.3 ml 30% kys. octové, čímž reakci ukončíte. Upozornění: Doba reakce musí být v každé jednotlivé zkumavce přesně 10 min. 5) Do 3. řady zkumavek přidejte 1.6 ml 0.05 M Tris-HCl pufru a 0.2 ml roztoku inhibitoru (aprotininu). Dále postupujte stejně jako v bodu 4. 6) Po ukončení enzymové reakce přidejte do všech zkumavek 4 ml destilované vody, abyste naředili intenzivní žluté zbarvení. Změřte absorbanci výsledného roztoku při vlnové délce 405 nm vždy proti slepému pokusu o téže koncentraci substrátu.. Vyhodnocení výsledků: Do grafu vyneste naměřené hodnoty absorbance (veličina úměrná reakční rychlosti) proti hodnotám počátečních koncentrací substrátu v reakčním roztoku pro inhibovanou i
1
neinhibovanou reakci. Graficky dvojnásobným reciprokým vynesením absorbance proti počáteční koncentraci substrátu určete hodnotu Km. Určete „maximální reakční rychlost Vmax“ (∆A/10 min) u obou reakcí, vypočítejte procento inhibice a určete její typ. 2) Stanovení glukosy setem BIO-LA-TEST Princip: Glukosa se oxiduje kyslíkem za katalýzy glukosaoxidasou na peroxid vodíku a glukonát. Vzniklý H2O2 se stanovuje reakcí katalyzovanou peroxidasou v přítomnosti chromogenu. Vzniklý barevný produkt se měří spektrofotometricky při vlnové délce 500 nm. Glukosa + ½ O2 + H2O
glukosaoxidasa
½ H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol
>
glukonát + H2O2
peroxidasa
>
chinonimin + 4 H2O
BIO-LA-TEST je komerční set určený pro stanovení hladiny glukosy v krevním séru nebo plasmě v klinických laboratořích. Roztoky: Pracovní roztok se připraví smícháním obsahu 2 lahviček podle přiloženého návodu. č. 1 – enzymy, 4-aminoantipyrin č. 2 – pufr, chromogen Postup: 1) Do 3 označených zkumavek pipetujte roztoky podle tabulky: Roztok Glukosa standard Vzorek Dest. voda Pracovní roztok
Blank 10 µl 1.0 ml
Standard 10 µl 1.0 ml
Vzorek 10 µl 1.0 ml
2) Obsah zkumavek promíchejte a 30 min inkubujte bez míchání při laboratorní teplotě nebo 15 min při 37 °C. Inkubační roztok musí být chráněn před přímým světlem. 3) Do 40 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorku a standardu proti slepému pokusu (blank) při vlnové délce 500 nm. Vyhodnocení výsledků: Vypočítejte koncentraci glukosy ve vzorku podle vztahu: Avzorku -----------------------
Astandardu
. cstandardu = cglukosy (mmol/l)
koncentrace standardu glukosy je 5 mmol/l
2
3) Stanovení proteolytické aktivity pomocí rozpustného a nerozpustného chromolytického substrátu 3a) Stanovení aktivity trypsinu nerozpustným chromolytickým substrátem Princip: Černá želatina jako nerozpustný chromolytický substrát byla připravena zesítěním želatiny glutaraldehydem v přítomnosti černé tuše. Působením trypsinu se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby želatiny a dochází k uvolňování černé tuše do reakční směsi. Výhodou tohoto substrátu je, že je možné měřit aktivitu proteas i v barevných vzorcích, protože černé zbarvení roztoku umožňuje měřit absorbanci v širokém rozsahu vlnových délek 350 – 900 nm. Roztoky: 0.05 M Tris-HCl pufr, pH 8.2 trypsin (100 µg/ml) černá želatina (10 mg/ml) Postup: 1) Připravte si nerozpustný substrát – k 0.2 g černé želatiny přidejte 20 ml pufru a na magnetické míchačce nechte nabobtnat cca půl hodiny. 2) Připravte si dvě sady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 3) Do druhé sady napipetujte za stálého míchání 2 ml suspenze černé želatiny a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek nechejte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 °C. Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. č. zkumavky pufr (µl) trypsin (µl)
1 1000 -
2 950 50
3 800 200
4 650 350
5 500 500
6 350 650
7 200 800
4) Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu přesně 30 min při 37 °C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech inkubační směs krátce protřepejte a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 5) Změřte absorbanci roztoků č. 2 – 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 600 nm. 6) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Za stálého míchání pipetujte do 3 zkumavek druhé řady 2 ml suspenze substrátu. Do 1. zkumavky pipetujte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 °C. 7) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 4 a 5.
3
Vyhodnocení výsledků: Z naměřených hodnot podle bodu 5 sestrojte kalibrační křivku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml, závislost není lineární v celém rozsahu). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 3b) Stanovení aktivity trypsinu rozpustným chromolytickým substrátem Princip: Azokasein je chemicky modifikovaný mléčný protein kasein s navázanou oranžovou sulfanilamidovou skupinou. Hydrolýzou se uvolňují barevné peptidy rozpustné v trichloroctové kyselině. Kyselina trichloroctová také zastaví proteolýzu a precipituje makromolekuly (enzymy a nezhydrolyzovaný azokasein). Roztoky: 0.05 M Tris-HCl pufr, pH 8.2 trypsin (2 mg/ml) rozpustný chromolytický substrát: 1% azokasein v 0.05 M Tris-HCl pufr, pH 8.2 5% trichloroctová kyselina Postup: 1) Připravte si dvě sady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 2) Do druhé sady pipetujte 1 ml 1% azokaseinu a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 °C. č. zkumavky pufr (µl) trypsin (µl)
1 1000 -
2 900 100
3 800 200
4 700 300
5 600 400
6 400 600
3) Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu 30 min při 37 °C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech zastavte reakci přidáním 1.5 ml 5% trichloroctové kyseliny a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 4) Změřte absorbanci roztoků č. 2 – 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 366 nm. 5) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Do všech tří zkumavek druhé sady napipetujte 1 ml 1% azokaseinu a do 1. zkumavky přidejte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 °C. 6) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 3 a 4. Vyhodnocení výsledků: Z naměřených hodnot podle bodu 4 sestrojte kalibrační přímku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 4
4) Detekce proteolytické aktivity na tenké vrstvě chromolytického substrátu Princip: Jednoduchá detekce proteas je založená na hydrolýze velmi tenké vrstvy nerozpustného chromolytického substrátu, konkrétně želatiny zesítěné glutaraldehydem v přítomnosti vhodného barviva. Metoda může být dobře použita k rychlé detekci proteolytické aktivity v různých vzorcích. Roztoky: vzorky enzymů desky s nanesenou vrstvou barevné želatiny Postup: Kápněte na destičku 10 µl jednotlivých vzorků enzymatických preparátů. Nechejte inkubovat 20 min po poslední aplikaci vzorku při laboratorní teplotě. Potom destičku krátce a důkladně opláchněte pod tekoucí vodou a odstraňte zhydrolyzované fragmenty. Bezbarvá místa indikují přítomnost proteasy ve vzorku. Vyhodnocení výsledků: Určete vzorky, ve kterých jste nalezli proteolytickou aktivitu.
5
