1
2
1 Tartalomjegyzék 1 2 3 4 5
Tartalomjegyzék ..................................................................................................... 3 A diplomatervező nyilatkozata: .............................................................................. 4 A feladat rövid összefoglalása: ............................................................................... 5 Abstract: ................................................................................................................. 6 Kísérlet előkészítés: ................................................................................................ 7 5.1 Műtéti technikák: .......................................................................................... 12 5.1.1 A Dorzális műtét: ................................................................................. 12 5.1.2 A Ventrális műtét: ................................................................................ 14 5.2 Elektróda Típusok: ....................................................................................... 16 5.2.1 Krónikus elektróda: .............................................................................. 17 5.2.2 Szenzoros kéreg vizsgálatához használt elektródák ............................. 18 5.3 Használt eszközök (Mérőrendszer): ............................................................. 20 6 Szomato-szenzoros kéreg (S1): ............................................................................ 21 6.1 Agykérgi rétegek: ......................................................................................... 21 6.2 Szenzoros Kéreg (S1): .................................................................................. 22 7 Elektrofiziológiai Jelek:........................................................................................ 24 7.1 Akciós potenciál: .......................................................................................... 25 7.2 A neokortikális neuron típustok: .................................................................. 26 7.3 Alvási Fázisok: ............................................................................................. 27 7.4 Alvási lassú oszcilláció: ............................................................................... 29 8 Mérések, Eredmények: ......................................................................................... 31 8.1 Mélyagyi MUA: ........................................................................................... 31 8.2 Current Source Density (CSD) ..................................................................... 34 8.2.1 Adatfeldolgozás .................................................................................... 34 8.3 Sejt-válogatás: .............................................................................................. 40 8.4 Küszöb detekció, és nehézségei. .................................................................. 41 8.4.1 Tüzelések megkülönböztetése: ............................................................. 43 8.5 Klaszterezési algoritmusok:.......................................................................... 43 8.5.1 K-means alapú klaszterezés:................................................................. 44 8.5.2 EM klaszterezés: ................................................................................... 45 8.5.3 Bayes-i klaszterezés: ............................................................................ 46 8.6 Eredmények rövid összefoglalása: ............................................................... 50 9 Távlati lehetőségek ............................................................................................... 53 10 Köszönetnyilvánítás ......................................................................................... 53 11 Irodalomjegyzék: .............................................................................................. 54
3
2 A diplomatervező nyilatkozata: Alulírott Kerekes Bálint Péter a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a diplomatervet meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a diplomamunkában csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a Diplomamunkát más szakon még nem nyújtottam be.
aláírás
4
3 A feladat rövid összefoglalása: A dolgozat témája az elektrofiziológiai jelek mérési eljárásai, feldolgozása, és az ehhez szükséges algoritmusok illetve a kísérleti előkészítés részét képző műtéti technikák bemutatása. A dolgozatban három kísérletsorozat kapcsán mutatom be az egyes az extracelluláris mérési technikákat: - GnRH szekrécióhoz kapcsolódó multiunit aktivitás elvezetése a preoptikus / hypothalamikus régióból, - A szenzoros kéreg current source density (CSD) analízise, - A szenzoros kéreg sejt válogatás vizsgálata. Az elvezetéseket altatott patkányokon végeztem, a mérésekhez szükséges műtéti technikák menetét megfigyeltem. A kísérlethez kapcsolódó irodalmat áttekintettem. A műtéti technikát mélyagyi elektrofiziológiai mérések során sajátítottam el, a rögzített adatokat megfigyeltem, elemeztem. A szenzoros kéreg vizsgálata kapcsán irodalmi áttekintés után megtanultam a rendelkezésemre álló rendszer használatát. Altatott patkányokon in vivo extracelluláris méréseket végeztem. A szenzoros kéreg CSD vizsgálatát konzulensem által humán kísérletekben detektált jelenség –a szupragranuláris rétegben jelentkező forrás (source)- alátámasztása végett kezdtem meg. Megismerkedtem számos jelfeldolgozási technikával. A mérésekhez többféle elektróda típust is kipróbáltam. Megtanultam a CSD analízis menetét, a detektált jeleken a szükséges transzformációkat alkalmaztam, és CSD térképeket készítettem. Az általam produkált eredmények alátámasztani látszanak a kísérletek kiindulópontjaként említett jelenséget. A szenzoros kéreget továbbiakban az idegsejtek tüzelésének sejt válogatás, klaszterezés, és az agykéreg különböző mélységeiben frekvencia átlag keresése kapcsán vizsgáltam. Áttekintettem a használható eljárásokat, algoritmusokat. Tetróddal in vivo extracelluláris méréseket végeztem, a vett jeleket többféle programmal elemeztem, teszteltem az algoritmusok közti eltéréseket.
5
4 Abstract: In this thesis I am going to look through the methods of electrophysiological measurements, processing, the algorithms used in it, and the surgery to prepare the experiments. In this extended essay I would like to present the electrophysiological measuring techniques on three series of experiments: - The recording of the multi unit activity related to the GnRH secretion from the preoptical / hypothalamical region, The current source density (CSD) analysis of the sensory cortex, - The spike-sorting examination of the sensory cortex. I made the experiments on anaestethized rats, and observed the surgery techniques for the expariments. I looked through the related literature, bibliography. I learned the surgery techniques in deep brain experiments, and analysed the results. In the section of the sensory cortex experiments I read the related sources, and learned to use the available system. I made in vivo extracellular experiments on anaestethized rats. The CSD analysis of the sensory cortex was started to confirm the statement, what my colsultant detected in human –a source is rise in the supragranular region-. In this part I got aquainted with many tipes of signal processing techniques. I made measurements with many types of electrodes. I learned how to CSD analyse the signals, and made the necessary transformations on them, to make CSD maps. My results seem to confirm the starting statements above. Henceforth, I examined the sensory cortex for neuronal firing, spike-sorting, clustering, and to find the frequency rate of the cortex’s regions. I looked through the useable methods, and the algorithms. I made in vivo electrophysiological measurements with tetrodes, tested the difference between the algorithms, and analysed the signals withvarious programs.
6
5 Kísérlet előkészítés: A kísérletek elvégzéséhez szükséges az állaton (patkány) végzendő műtéti technika elsajátítása, a mérőrendszer ismerete, és a mérőrendszer pontos előkészítése. A műtéti technika ismerete megkönnyítette a munkámat, mert nem kellett plusz embertől függeni, a mérések előkészítésében, de fontos volt a műtét kivitelezésének pontos és biztos begyakorlása, hogy a méréseket ne zavarja meg a műtéti hiba (altatási hiba, vérzés a célterületen, elektróda bevezetési hiba). A műtéteket Dr. Kalló Imre felügyelete alatt tanultam meg, Önálló labor (I-II) és Mérnöki tervezés tárgyak keretein belül a „GnRH szekrécióhoz kapcsolódó multiunit aktivitás elvezetése a preoptikus /hypothalamikus régióból” című kísérletsorozat kapcsán. A kísérlet tudományos háttere: A petefészek és a here működését szabályozó neuroendokrin sejtek a preoptikus/hypothalamikus régióban helyezkednek el és a gonadotropin releasing hormon (GnRH) idegsejtek hálózatán, mint végső közös idegpályán keresztül fejtik ki hatásukat. A GnRH pulzatilis módon ürül a hypophysis portális keringésébe, mellyel szinkron multiunit aktivitás fokozódás mérhető a hypothalamus mediális bazális részében. A mérés célja volt, hogy feltárjam a Multunit Aktivitás (MUA) periodikus fokozódását kiváltó és befolyásoló faktorokat. Azonosítsam a MUA-t létrehozó idegsejteket, és vizsgáljam ezek kapcsolatát a GnRH surge kiváltásában szerepet játszó preoptikus Kisspeptin sejtekkel. A kapcsolódó szakirodalomban már többen is feljegyezték, hogy a GNRH szekréciót esetleg nem csak az LHRH neuronok, hanem az ezekkel szinaptizáló más sejtcsoportok/magok is befolyásolhatják. Eme állítást többféleképpen is bizonyították, például KEI-ICHIRO MAEDA és munkatársai 1995-ben cikkükben1 egyrészt ismertetik az LHRH release-t, összeköttetési megfigyelésüket az LHRH release és a mediobazális hypothalamusz (MBH) multiunit aktivitás közt. Ismertetik milyen rendszerességgel, hogyan változik a LHRH release. Megfigyelésük, hogy kell lennie egy úgynevezett „LHRH pulse generator”-nak (LPG). Leírják, hogy ők milyen következtetésre jutottak a LPG hollétét illetően. Mégpedig a környéki régiók többféle deafferentációja következtében, ha a MBH összeköttetését nem vágták át, akkor megmaradt az LHRH release. Ellenkező esetben nem, tehát valószínűsítették, hogy a LPG-nek ebben a régióban kell lennie, sőt további metszésekkel és vizsgálatokkal megfigyelték, hogy vannak nonLHRH típusú neuronok a MBH anterior részén melyek
7
terminálisai szintén az eminencia mediana felé nyúlnak és ezek is közre játszhatnak a LPG-ben. Továbbá Yue-Xian Li, Anmar Khadra cikkükben2, a „GnRH pulses” kapcsán egy pár matematikai modell leírás található. Eleinte egy single cell modell2,
, ,
, ,
majd egy populáció alapú modell2,
mely az előző modell kiterjesztése már heterogén sejtpopulációra. Ez alapján egy szinkron oszcillációra figyeltek fel a GnRH pulzusok kapcsán, és az is kiderült, hogy e modellben van olyan paraméter, mely összefüggést mutat a környező sejtekben levő ugyanilyen paramétertő, így ezen sejtek szinkron aktivációja esetén jön létre az oszcilláció, aszinkron esetben az oszcilláció abba marad. Rájöttek, hogy egy heterogén populációban nem minden sejt viselkedik aktív oszcillátorként (AO), egyesek csak úgynevezett toborzott oszcillátorok (TO), vagy szolga oszcillátorok (SO). Ezek igazából non oszcillátorok (NO), de közel esnek az aktivációs rátához és megfelelő mennyiségű AO magával rántja őket, míg a maradék az oszcillációs ráta alatt, de szintén hasonlóan változik.
8
1. ábra Pulzus generálás heterogén idegsejt populációban. AO zöld, TO kék, SO piros, az AO átlaga fekete színnel jelölve. Mindkét esetben 50 neuron van vizsgálva, (a) a kappa paraméter az oszcillációs sávban van meghatározva, (b) esetben az oszcillációs sávon kívül
Kiderítették, hogy egészen kevés AO is elég, hogy a TO-kat bevonva létrehozzák a GnRH pulzatilis mintázatát. A kísérlet sorozatot az MTA-KOKI, a King’s College London és a Dyball intézet kutatóinak kollaborációjában készült cikkből3,4 kiindulva indítottuk, a cikkben a Kisspeptin sejtek GnRH szekréció szabályozásában játszott szerepét vizsgálták. A Kisspeptin sejteknek két nagyobb csoportja van, az egyik a rostrális periventriculáris preoptikus magban (RP3V) a másik nagyobb sejtcsoport pedig a mediobasal hypothalamusban (MBH) helyezkedik el, és nagyban befolyásolhatják a GnRH sejtek neuronális aktivitását. Patch clamp elektrofiziológiai módszerrel kimérték a Kisspeptin MBH-ban kifejtett depolarizációs hatását.
9
2. ábra Extracelluláris szimultán mérés 2 arcuate nucleuss-beli sejtről. (a) A felvett jelek, jól láthatóan a
Kisspeptin jelenlétében a sejtek burst aktivitása, előtte, utána (Kisspeptin eltávolítva) látványosan gyengébb az aktivitás. (b,c) A két sejt aktivitásának rátája . 3. ábra Teljes sejtes intracelluláris mérés jelei. A Kisspeptin jelenléte megnüvelte a bemeneti ellenállást. Hiperpolarizáló250ms ideig tartó áram injekciókat adtak (15pA) minden 4s-ban. Az alsó ábrákon a hiperpolarizáció körüli 1s-ban a membránpotenciál megváltozását figyelhetjük meg, (a) esetben a Kisspeptin adása előtti állapot, (b) esetben jól látszik, hogy a Kisspeptin hatásakor a a mmbránpotenciál kitérítése nagyobb mértéketmutatott ugyanazt az impulzust alkalmazva, (c) esetben a depolarizáció hatására tüzelési válasz jelentkezik, (d) a visszaállt álapotot mutatja.
A preoptikus Kisspeptin sejtek GnRH szekréció alatti aktivitása még nem ismert. A kísérletben erre próbáltunk adatokat gyűjteni. További a kísérletsorozatot befolyásoló cikkben James S. Kinsey-Jones és Xiao Feng5 perifériásan adott Kisspeptin hatására az LH szekréció változását írták le (4. ábra). A méréseik során az állatnak kontrollként fiziológiás sóoldatot-t, majd Kisspeptin-10-et adtak be vénásan és figyelték a választ. Azt detektálták (5. ábra), hogy a Kisspeptin-10 hatással van az LH szekrécióra, a MUA aktivitás periodikus fokozódására (pulzus generátorra) azonban nincs, ellentétben naloxonnal, ami az utóbbit is megváltoztatja. Arra vonatkozólag viszont még nincs adat, hogy Kisspeptin-10 a vér-agy gáton belül, az agyi extracelluláris téren keresztül befolyásolná-e a pulzus generátor működését. Ezért olyan elektródával is terveztünk mérni, mely stimulációs anyagok centrális (intracerebroventrikuláris) bevitelére is alkalmas lehet.
10
4.ábra: (A-E) A különböző véráramba juttatott anyagok hatása az LH kiválasztásra. (F) A stimuláló anyagok aránya5. 5.ábra: Kisspeptin-10, Naloxon és kontrollként Saline hatása az LH szekrécióra, és közben a MUA változásai5.
Tervünk a periodikus multiunit aktivitás-fokozódás megfigyelése volt a MBH-ban a GnRH surge (GnRH neuronok időnkénti hosszantartó burst aktivitása), illetve a surgek közötti időszakban. A mérés kivitelezéséhez többféle eljárást is el kellett sajátítani (sztereotaxikus műtéti technika dorzális és ventrális feltárással, pályajelölés üvegelektróda
és
négyszög
impulzus
használatával,
single-multi
elektródok
alkalmazása, zajszűrés, jelanalízis). A krónikus méréshez egy újfajta kereskedelmi forgalomban nem kapható elektródának a tervezését, készítését, és tesztelését is meg kellett oldanunk.
11
5.1 Műtéti technikák: Tanulmányaim során többféle mérési megközelítést is kipróbáltam. Először a dorzális irányból, mely során többféle multiunit elvezetésre alkalmas gyári elektródát használtam
(single
mérőponttávolságú
wire
elektróda,
Rétegelektróda,
6,24
csatornás
mikropipetta
50um,100um,150um-es
juxtracelluláris
mérésekhez,
krónikusan beépíthető 4 csatornás elektróda). A dorzális megközelítés esetén az akkori célterület (helyét lásd alább) felszíntől való távolsága sok nehézséget tud okozni; az elektródák hajlékonysága, illetve az elektródák befogásánál előforduló kis pontatlanságok jelentős eltérést okozhatnak a célterület tervezett koordinátáihoz képest. A célterület elérését kétféleképpen teszteltem. Kolchicint adtam be Hamilton fecskendővel a 2. agykamrába, ennek következtében az állaton tapasztalható változások, és a későbbi perfúziós műtétet követően az agy hisztológiai vizsgálata során megállapítható volt a műtét, és a fecskendő leeresztésének pontossága. Néhány sikeres műtét után ténylegesen a célterületre koncentrálva biotinilált dextránamint (BDA) adtam be az állatoknak, amit később (egy hetes túléltetés után) a célterületen a BDA-t peroxidáz reakcióval ki tudtuk mutatni. A műtéti technika, célzás elsajátítása után következhettek az elektródával történő mérések.
5.1.1 A Dorzális műtét: Az állatot ketamin xilazin injekcióval altatjuk el, súlyához arányos mennyiségű altató anyaggal (0.2ml altató 100g-onkét), majd fejbőrének borotválása után fixáljuk a fejét a sztereotaxikus készülékbe, és felvágjuk a fejbőrt a célterület felett. A bregma pontot bemérve, majd ahhoz viszonyítva a bemeneti koordináták környékén felnyitjuk a koponyát fúróval. Mivel a fecskendő, avagy későbbiekben az elektróda nem minden típus esetén döfi át könnyedén a dura mater-t, ezért azt a célterület felett megkarcoljuk. Félrehúzva a sinus eret (ezt egy hajlított tűvel félre tudjuk kampózni) már hozzáférünk a szükséges helyhez. Ezek után az előre felmért ponton lebocsátjuk a fecskendőt/elektródát.
12
Az elvezetést a Bregma (7. Ábra) ponttól 0.26mm-el posterior (hátrafelé), laterálisan (oldal irányban) 0.2mm-re, és dorso/ventrálisan (koponya tetejétől mérve) -8.9mm koordinátákon végeztem (6. Ábra).
6. ábra: Célterület sematikus metszete
7. ábra: Patkány koponya, rajta a viszonyítási pontok
Beadva a jelölő anyagot, a tűt kihúztam és bevarrtam a fejbőrt a terület felett. Egy hetes túléltetést követően az állatokon perfúziós műtétet végeztem, melynek során a kis vérkör keringésébe 200ml 4%-os PFA oldatot juttattam. Ettől az állat és az agya is fixálódott. Ezek után ki lehetett venni az állat agyát, melyet későbbi vizsgálódásra elraktam. A kiszedett agyakat kétféle módon szeleteltem fel, vagy vibratómmal, vagy fagyasztó mikrotómmal. 30 mikronos szeleteket készítetve. Egy célcsoportot kiszedve a szeletekből festésre előkészítettem. A festéshez előkészítendő PBS-ben, peroxidban, tritonban megkezeltem, majd TRIS és ABC 1/1000 oldatában áztattuk. Később az előkészített agyszeleteket hívó folyadékba átrakva azokon megjelent a beadott festékanyag. Látható volt, hogy az egy hét során a BDA átdiffundált a beadási góctól a környező területekre is (8. ábra). A hívó folyadékot TRIS, peroxid, nikkelaminoszulfát és diaminobenzidin alkotta. Ebben 5-10 percig áztattuk, majd elvanol-ból kellett felvinni az agyszeleteket tároló üveglapokra, melyeket későbbi előkezelés után lefedve, mikroszkóp alatt megfigyelhettük mennyire sikerült pontosan a beadás (9. ábra). Hiba lehetett esetleg, hogy a közeli agykamrába jutott a fecskendő beadáskor, és a festékünk így nem a megfelelő helyre került.
13
8. ábra: A megfestett agyszelet.9. ábra: Az MBH beli kisspeptin sejtek (piros), a szúrt csatorna (zöld)
5.1.2 A Ventrális műtét: Későbbiekben az arcuatus mag illetve a mediális bazális hypothalamus vizsgálatához megtanultam a ventrális feltárás műtéti technikáját. A nucleus arcuatus célparaméterei felső megközelítésnél: Anterior-Posterior irányban: Bregma -2.8mm, Medial-Lateral irányban: 0.5mm, Dorsal-Ventral irányban: 9.7mm. A ventrális megközelítést azért alkalmaztuk, mert közelebb van a célterület, így a pontatlanságok egy része kiküszöbölhető, illetve méréseket akartunk végezni az nucleus arcuatusban a multi unit aktivitásról. A GnRH sejtek ugyanis ide nyújtják kollaterálisaikat, és feltételezéseink szerint itt is befolyásolják a Kisspeptin sejtek a GnRH sejtek aktivitását. A sejtek iontoforézissel történő feltöltésével akár meg is jelölhetjük (mikropipettás mérés esetén) az elvezetett sejtet, így megfigyelhetjük annak alakját. Méréseinket altatott, gonád-intakt hím és nőstény patkányokon végeztük. Később áttértünk a gonadektomizált állatok vizsgálatára, mivel ezekben az állatokban a multiunit aktivitásfokozódás az intakt állatokban megfigyelt óránkéntihoz képest gyakrabban, 15-20 percenként jelentkezik. A ventrális műtét technika esetén többféle altatót is használtunk a mérésekhez. Uretánt, illetve a már dorzális technikánál is alkalmazott ketamin-xilazin koktélt súlyarányosan
(első
alkalommal:
0.2ml/100g
IP
(intra
peritoneum),
majd
0.1ml/100g/1h IM (intra muscular) update jelleggel). Mivel a ketamin-xilazin befolyásolhatja az alvási oszcillációt, ezért használtunk egyes esetekben uretánt. A 14
műtétet egy kanül tracheába beültetésével kezdtük, hisz ventrális megközelítés esetén az állat száját szinte teljesen befogjuk (plusz a vérzés, sebváladék csorgása), és biztosítani kell a légzést a mérés alatt. A trachea felett felvágjuk a bőrt, majd a fedő izmokat szétnyitva már hozzáférünk a légcsőhöz, ezt megvágjuk, és a kanült becsúsztatjuk a tracheába, vigyázva, hogy fel ne szakítsuk azt. Amint a kanült betoltuk, majd cérnával körbekötjük, és így rögzítjük a tracheához, hogy ne mozduljon ki, és ne kerülhessen folyadék a légző rendszerbe. Az állatot fejjel lefelé helyezzük be a sztereotaxikus készülékbe. Felvágjuk a bőrt a szájtól kezdve a középvonal mentén, hogy hozzáférjünk az állkapocshoz. Az állkapcsot összekötő porc elvágása után egyegy drótot akasztunk az állat két első fogára, és széthúzzuk az alsó fogsor két felét, de csak annyira, hogy majd le tudjuk ereszteni az aktuális mérő eszközt. A nyelvet felhajtva egy lapoccal elfogjuk és fixáljuk végleges állapotában az állat száját. A szájpadlás bőrének eltávolítása és a koponya alsó felének kifúrása után már hozzáférünk az agy alsó feléhez. Felkarcolva a ventrális részen vastag durát az eminencia mediana környékét láthatjuk, e mellett kell majd a mérőeszközünket levezetni. Ventrális megközelítésre nincs agytérkép, ezért tapasztalati úton határoztuk meg, hogy adott fejállás mellett, hol kell beszúrni az elektródot, hogy az RP3V-be, vagy a nucleus arcuatusba jusson. Dorzális
megközelítést
alkalmaztunk
konzulensemmel
folytatott
kísérleteinkben, melyben a szenzoros kérget (S1) vizsgáltuk. Ebben az esetben kifejezetten fontos a műtéti technika pontos kivitelezése. A kraniotómia elvégzésekor fontos, hogy a koponya felnyitása minél kevesebb sérülést okozzon, mivel a vizsgált területünk elég közel helyezkedik a koponyához, és bármilyen vérzés, agyi struktúra megsértése, túl nagy dura nyitás (ilyenkor az agy pulzálása is szignifikánsan megnő, és képes az elektróda mozgatására mérés közben), elektród leeresztése közben az útban levő erek megsértése nagyban befolyásolja a kísérlet sikerességét illetve a vett jelek minőségét.
15
5.2 Elektróda Típusok: A mérések során többféle elektróda típust is használtam, attól függően, hogy teszt, vagy tényleges mérést végeztem, a kísérlet típus megkövetelései, illetve a célterületektől függően is változott a használt elektróda típusa. A Kisspeptin sejtek vizsgálatához dorzális megközelítésnél egy sejt aktivitás elvezetésre alkalmas tűelektródát alkalmaztam. Hátrányai, hogy nagyon pontos rögzítést igényel a sztereotaxikus készülék lebocsátó rúdjához. Kis eltérés esetén az elektróda nem a kívánt helyre fog leeresztődni, és vékonysága miatt képes deformálódni a hibás felillesztést követően a leeresztéskor. A ferdén felrakott elektróda képes elnyírni az agyi struktúrákat lebocsátás közben, mely esetben a mérésünk értékelhetetlen lesz a sejtek sérülése miatt. További nehézség, hogy az elektróda elég zajérzékeny, ezért szükséges a Faraday kalitka használata, illetve ezen belül
a
lehetséges
antenna
források
leföldelése,
mindezen
óvintézkedések
beiktatásával végeztem az egy sejt aktivitás vizsgálatát. Single wire elektródával extracelluláris jelelvezetéseket végeztem az agykéregből ellenőrzés céljából, továbbhaladva a célterületre mező potenciált vezettem el, majd abból szűréssel az egy sejt elvezetéseket vizsgáltam.
10. ábra: A feltárt terület. Látszik a felnyitott fejbőr, a kraniotómia helye, a sinus sagitalis ér elkampózva, a single wire elektróda bevezetve az agyba, a sztereotaxiás készülékbe rögzített állat. A műtétet, és az elektróda beültetését magam végeztem. 11.ábra: Az ábrán a single wire elektródával mért, NeuroScan programmal rögzített jeleimet lehet látni. Alul látható az időskála, a jeleken látható lefelé irányuló kiugrások az akciós potenciálok, a köztes időben az elektróda saját termikus zaja, és a külső zajok láthatóak.
16
A multiunit elvezetésekhez platina-irídium (10%) multielektródokat használtam (50um, 100um, 150um mérőpont távolsággal, és 20um-es átmérőjű mérőfelülettel, 6, 24 elvezető csatornával). A Kisspeptin sejtek ventrális megközelítésénél mikropiettát, single wire-t, és 50um mérőponttávolságú 24 csatornás multielektródát is alkalmaztam. A Krónikusan beültetett elektródás mérésekhez egy saját készítésű 4 kontaktusú elektródát használtam (platina-irídium 10% 20um átmérőjű kontaktusfelület).
5.2.1 Krónikus elektróda: Főbb tartozékai: -
Platina-irídium (10%) 20um átmérőjű szálak
-
Orvosi 25G fecskendőtű
-
Tízkontaktusú csatlakozó
-
Fogorvosi cement
Az elektródának meg kellett felelnie annak, hogy lebocsátáskor ne térjen/hajoljon el a különböző sűrűségű agyi struktúrákban, pontosan a kellő mélységbe legyen képes lehatolni, krónikusan beépíthető legyen, csatlakoztatható legyen a már meglévő rendszerhez, olcsó és egyszerű legyen elkészíteni. A készítési folyamat: a platina-irídium szálakat hozzáforrasztottam a csatlakozó megfelelő lábaihoz, 4 csatornának, egy pedig krónikus bőr alatti föld kontaktusnak. A négy mérő szálat a csatlakozó középpontja felé, a földet kifelé forrasztottam fel a későbbi funkcionális irányok szerint. Az orvosi acél fecskendőtűt méretre vágtam (végállapotban 9.7-9.8 mm-re lóghat ki, plusz bele lehet számítani a koponya akadályát és akkor még pár millimétert rá kell számolni) és megpróbáltam koncentrikusan kihegyezni, hogy a féloldalas kihegyezés se térítse el az elektródát. A négy mérőszálat összecsavartam. Egyrészt, hogy könnyebben behelyezhessem a levágott fecskendőtűbe, másrészt pedig kiküszöbölendő a távoli vég áthallás (FEXT) jelenséget, mely a detektált jelekben egy másik csatornáról történő áthallást jelenthetne. A mérőszálaknak ki kell lógni a fecskendőtű végén kb. 0.5-1 mm-el, de ezt méretre csak akkor vágom, amikor véglegesen rögzítettem a tűt. A tű rögzítését úgy oldottam meg, hogy a csatlakozót a megfelelő magasságig körbetekertem ragasztószalaggal. A megfelelő állagúra kevert orvosi cement, és kötésgyorsítója elegyével feltöltöttem a keletkezett üreget, eközben a föld szál az üreg szélére van kivonva, hogy a koponya felszínén el tudjam vezetni később a bőr alá. A tűt a cement 17
megkötéséig függőleges állapotban és a talapzatra nyomva fixálom. Az elektróda mérőszálait méretre vágom, és kész is a krónikusan beültethető elektródánk.
12. ábra: A krónikus elektróda sematikus terve. 13. ábra: Az általam elkészített krónikus elektróda beültetés előtti előkészítés előtt.
5.2.2 Szenzoros kéreg vizsgálatához használt elektródák A szenzoros kéreg (S1) vizsgálatához tetródot, októdot, 24 csatornás rétegelektródot, 24 csatornás Karbon Nano Csöves (Carbon Nano Tube-CNT) elektródát és 24 csatornás szilícium elektródát használtam.
13. ábra: 24csatornás rétegelektród, a CNT elektród is hasonlóan néz ki, csak a kontaktusai be vannak vonva Karbon nano csővel
18
A Current Source Density méréseihez két elektróda típust használtam. - 24 csatornás Karbon Nano Csöves elektróda: - méret: 420um átmérő, 10cm hosszú - mérőfelület:20um átmérő - mérőpontok távolsága:100um - mérőfelület anyaga: platina/irídium (rozsdamentes acél tűbe helyezve) -24 csatornás szilícium elektróda (Grand László által tervezett): - méret: 280um széles, 80um vastag, 12mm hosszú - mérőfelület: 30um átmérő - mérőpontok távolsága:100um - mérőfelület anyaga: platina A sejt-válogatás méréseket tetróddal végeztem, szenzoros kéregből, ketaminxylazin anesztéziával, a jeleket csatornánként dolgoztam fel. Az elektróda a Thomas Recording - Tetrode (4 metal cores, Quartz-Platinum/Tungsten) gyártmánya. Melyből négy állt rendelkezésemre a mérések elvégzéséhez. A tetród használata azért jobb a sejt-válogatás kísérletekhez, mint a single wire, mert egy sejt aktivitása így több csatornán is detektálható. Az azonos sejtez tartozó akciós potenciálok alakja a csatornákon csak amplitúdóban tér el, így több sejt válogatható ki a jelekből, és pontosabb eredményeket kaphatunk. A különböző sejtek aktivitásának átlapolódása pedig kiküszöbölhető, ha figyeljük a többi csatornákon az adott időpillanatban a jeleket, mert ott már megkülönböztethetőek lehetnek, a mérőpontok elrendezése, és távolsága miatt.
14.ábra: A használt tetród keresztmetszeti képe
19
5.3 Használt eszközök (Mérőrendszer): A mezőpotenciálok megfelelő minőségű regisztrálásához szükséges a jelek előerősítése (tízszeres). Az előerősítőt az elektródon helyezzük el, a jeleket ezután tovább erősítjük és szűrjük, majd A/D kártyával (PCI 6259) és egy LabView alapú mintavevő programmal digitalizáljuk. Az AD átalakítás előtt a jelet a 0.05-5000Hz-es tartományban analóg módon megszűrjük (NI Patch panelek 4db(SCC68NI connector box 4*16 csatorna)),. Az így kapott jel tartalmazza mind a lokális mezőpotenciálokat, mind a sok sejt illetve egy sejt aktivitást. A bemenő analóg jelet 20kHz-es mintavételi frekvenciával mintavételezzük; 16 bites pontossággal. A mérés megzavarását elkerülendő Faraday kalitkában végeztem az elvezetéseket. A vett jeleket az elemzőprogrammal (Neuroscan 4.3, Spike 2, Spiker, Wave Solution,DataWiev) dolgoztam fel.
20
6 Szomato-szenzoros kéreg (S1):
15.ábra: Az agykérgi rétegek, és a bennük lévő sejtek, összeköttetéseik.
6.1
Agykérgi rétegek: A továbbiakban először egy áttekintést adnék az agykérgi rétegekről, azokon
belüli sejtekről, hogy az agykéregben lévő összeköttetéseket, hogy a neuronális aktivitások összekötöttségét, egymásrautaltságát megérthessük. Az agykéreg 6 rétegre bontható6,7,8: I.
MOLEKULÁRIS RÉTEG elszórt kis neuronokból, és főleg apikális dendritek nyúlványaiból, illetve horizontálisan orientálódott axonokból áll.
II.
KÜLSŐ GRANULÁRIS RÉTEG kis piramis sejtek, és sok kosársejtből áll.
21
III.
KÜLSŐ PIRAMIS RÉTEG főleg kicsi ék közepes méretű piramis sejtekből, és vertikálisan orientált intrakortikális axonnal rendelkező kandeláber neuronokból áll. Az I réteg a III rétegből a fő céljai a hemiszfériumok kortikokortikális afferenseinek, és a III réteg a fő forrása a kortikokortikális efferenseknek.
IV.
BELSŐ GRANULÁRIS RÉTEG szatelit-, és piramis sejtekből áll, ez a fő célja a thalamokortikális afferenseknek és intrahemiszférikus kortikokortikális afferenseknek.
V.
BELSŐ PIRAMIS RÉTEG a nagy piramis sejtek és interneuronok rétege. Ez az elsődleges efferens forrása a motoros szubkortikális struktúráknak.
VI.
MULTIFORM RÉTEG kevés nagy piramis sejt és sok kicsi piramis sejt, multiform neuronok.
6.2 Szenzoros Kéreg (S1): A vizsgált területem a primer szenzoros kéregben8, az agyban a girus postcentralis területén helyezkedik el, bemenetei a thalamus specifikus érző magvai. A testi érzetek felfogása, hideg-meleg, tapintás, fájdalom, test mozgásainak érzékelése (a bőrben, izmokban levő receptoroknál keltődő információk végső feldolgozó területe). Minél jobb a beidegzés, annál nagyobb területe van az agyban. A szomatoszenzórium két részre osztható: - specifikus: a legtágabb értelemben vett tapintás és tudatosuló propriocepció ingerületeit szállítja, ez a gerincvelő hátsó köteg lemnincus medialis összeköttetés, - fájdalomérző: a nociceptív ingerületek, hőérzet, durva taktilis ingerületek, ezeket a spinothalamikus rendszer szállítja. A primer szomatoszenzoros kéreg feltérképezését a bőrfelület ingerlésével végezték és figyelték a kéregben a kiváltott potenciálokat, ezek alapján a test felszíne leképezhető volt az agykéreg felszínén (szomatotópia).
22
16. ábra: A vizsgált terület patkány agyi metszet sémája (S1Tr a célrégió pirossal jelölve) 9
Észlelni, ha taktilis inger érte a testet, mekkora volt az intenzitása, mennyi ideig tartott az egyszerű feladat. Nem igényel komplexebb kérgi szerveződést. Ellenben az anyagok felületi textúrájának felismerése, a kézbe vett tárgy alakjának meghatározása, a tárgy mérete, mozgási iránya és sebessége a bőrfelületen, az már sokkal összetettebb probléma8. Ehhez a felületes és mély bőr receptorok, az izmok proprioceptoraiból jövő ingerek összessége kell. A komplex ingerek analízisét a szenzoros kéreg 1-es, 2-es területe végzi, míg az egyszerűbb információk feldolgozását a 3a, 3b terület oldja meg. Valamennyi Brodman–area kap közvetlen thalamikus bemenetet, de az 1-es és 2-es area zömmel a 3a, 3b mezőkből kapja az információt. Az 1-esés 2-es area neuronjain különböző szubmodalitások konvergálnak, komplexebb inger szükséges a terület idegsejtjeinek aktivációjához. A Brodman area-kat emberi agy esetében használják, patkányban a legismertebb szenzoros terület a barrel kortex, melyben számos fent említett szenzoros funkció megtalálható, de mi az S1Tr (16. Ábra) területet vizsgáltuk, mert könnyebben megközelíthető, mint a barrel kéreg. A S1Tr régió az agy legfelső területén található, míg a barrel kéreg jóval laterálisabban, ami megnehezíti a műtétet, és a mérési eszközök beállítását is. Az S1Tr a törzsi szenzoros régió.
23
7 Elektrofiziológiai Jelek: Továbbiakban az neuron működés alapjainak rövid áttekintése következik. Az idegrendszer működése neuronok interakcióiból áll össze, ennek három módja létezik8. „Első az elektrotónusos potenciálváltozás, a második egy fakultatív jellegű elektromos jel, ha létrejön, mindig azonos nagyságú, digitális jellegű, nem marad lokalizált, hanem akciós potenciál formájában a neuron másik pólusához vezeti az üzenetet, a harmadik, amikor az akciós potenciál kémiai anyagot neurotranszmittert szabadít fel a neuron axonterminális végén.” Megemlíteném
még
a
hiperpolarizáció,
illetve
depolarizáció
fogalmát.
Hiperpolarizációnak nevezzük a jelenséget, mely a nyugalmi membrán potenciál (70mV) negatív irányban eltérül valamely behatás következtében, a depolarizáció pedig a pozitív irányú módosulást jelenti (ez előidézhető a megfelelő jellegű áram szövetbe injektálásával). Az injektált áram nagyságának függvényében a kiváltott válasz is változik. Szükséges ismernünk továbbá a témában a szinapszist, ami két neuron, neuron-sejt közti ingerület átadási pontja, az Excitatórikus Postszinaptikus Potenciál (EPSP), illetve az Inhibitoros Postszinaptikus Potenciál (IPSP) fogalmát, mindkettőnél létezik a térbeli és időbeli szummáció. EPSP: Hatására a sejt aktiválhatóbbá válik. Pl. a receptorhoz ligandkötés után a postszinaptikus oldalon depolarizáció következik be (lehetséges ligand: glutamát, acetilkolin). IPSP: Hatására a sejt aktivációja gátolódik. Pl. a receptorhoz ligandkötés után a postszinaptikus oldalon hiperpolarizáció következik be (lehetséges ligand: glicin, gamma-aminovajsav). A mezőpotenciált látjuk mikor elektrofiziológiai jeleket vezetünk el az agyból, ez a vizsgált régióbeli depolarizációs, és hiperpolarizációs hatások összessége, továbbá megfigyelhetőek benne az akciós potenciálok.
24
7.1 Akciós potenciál: Az akciós potenciál keletkezési mechanizmusát először a tintahal, és a kalmár óriásaxonjain 1935-1952 között végzett kísérletek tisztázták. A neuron ingerületvezető funkcióját a helyi depolarizáló inger (receptorpotenciál, EPSP) hatására bekövetkező, tovaterjedő akciós potenciál valósítja meg8. akciós potenciál csak akkor jön létre, ha a nyugalmi membránpotenciál megváltozik, és elér egy küszöbértéket, ha ez bekövetkezik, akkor mindenképpen akciós potenciál keletkezik, amennyiben a potenciálváltozás
nem
éri
el
ezt
a
küszöbértéket,
akkor
nem
jön létre akciós potenciál (ez a mindent vagy semmit elve), illetve ha épp refrakter periódusban van a sejt, akkor sem
következhet
potenciál.
be
Akciós
újabb
potenciál
akciós a
sejt
membránjában elhelyezkedő különböző ingerületátvivő
(neurotranszmitter)
anyag specifikus csatornákon (Na+, Ka+, Cl-)
végbemenő
ionáramok
következtében jön létre. Az ábra az akciós potenciál alatt lezajló, Na+, és Ka+ permeabilitás
(/kunduktancia)
változásokat szuperponálva mutatja be. Az
akciós
elektródokkal regisztrálás
potenciálok is
extrcelluláris
regisztrálhatók.
alapja,
hogy
„A
azon
a
rostfelszínen, ahol az akciós potenciál éppen jelentkezik, a kis ellenállású extracelluláris
folyadékon
keresztül
17. ábra: Akciós potenciál, és az ion permeabilitás változása
záródó, lokális áramkörök alakulnak ki. Az extracellulárisan mért feszültségkülönbségek jelentős mértékben függnek az extracelluláris vezetés következtében fellépő áramveszteségektől, az extracelulárisan mérhető feszültségkülönbségek sokkal kisebbek az intracellulárisan regisztrálhatónál.”
25
A több axonból álló idegekről való elvezetéseknél összetett akciós potenciál jelenik meg, amely az akciós potenciálok összeadódott feszültségingadozása.
7.2 A neokortikális neuron típustok: A neokortikális neuronok megkülönböztethetőek elektro-fiziológiailag a depolarizációs pulzusra adott válaszuk alapján. M. Steriade a következő négy típust említi könyvében10: Regular-spiking (RS), Fast-Rhytmic-bursting (FRB), Fast-spiking (FS), Intrinsic Bursting (IB) (18. ábra). Az RS neuronok képezik a többségét a kortikális idegsejteknek, egyes tüzelésekkel válaszolnak, melyek gyorsan vagy lassan adaptálódnak a stimulus fenntartottságához. Az FRB neuronok ismétlődő (30-50 Hz)
mintázatok az átalakulhatnak másik
magas frekvenciás burst-okat (300-600
típusúvá (pl: RS->FRB->FS).
Hz) keltenek. Az IB neuronok akciós potenciálok
klasztereit
generálják,
tüzelés-inaktivációkkal,
hiper-
polarizációval és idegsejt „hallgatással” követve. A FS neuronok pedig nagyon vékony akciós potenciálokat tüzelnek, nagyon magas tüzelési rátát fenntartva, frekvencia adaptáció nélkül. Általánosan elmondható, hogy a RS, FRB és IB neuronok piramis sejtek, míg a FS típusuak
hagyományosan
GABAerg
sejteknek tekintendők. Továbbá FRB kategóriába
tartozhatnak
az
interneuronok lokális köre. Pár lokális inhibitoros interneuron RS-ként, vagy burstként sül ki. erősségétől
Az injektált áram
növelésével
a
tüzelési
18. ábra: A négy tüzelési mintázat10.
26
7.3 Alvási Fázisok: Az alvás közben nagyon sokféle fiziológiás változás megy végbe az emberben, ami kihathat a perifériás, és központi idegrendszerre. A tudósok a mai napig is kutatják a különböző alvás közben végbemenő változásokat, de még mindig nincs teljes kép az alvás funkcióiról. Ilyen funkciók például: védelem a kimerülés ellen, szöveti helyreállítás, memória feldolgozás, memória beégetés7. Az alvás nem az idegrendszer működésének felfüggesztése, hanem egy adott ébrenléti mintázat felváltása egy másik, alvási működési mintázattal. Mielőtt az alvási fázisokra (19. ábra) rátérnék, felsorolom a közben jellemző elektrofiziológiailag
mérhető
jeltípusokat.
Öt
felé
szokták
osztani
átlagos
frekvenciájuk alapján, sorrendben: delta, theta, alfa, béta, gamma (19. ábra). - Delta: 4Hz-nél kisebb frekvenciájú jelek, általában az alvás 3., 4. fázisában jelentkezik. - Theta: 4Hz-8Hz frekvenciájú jelek, összefüggésbe szokták hozni az álmossággal.
Tapasztalható
gyenge
alvásban,
ébredés
előtt,
hipnózisban, transz állapotban, azaz még épp a tudatosság előtt. - Alfa: 8Hz-12Hz frekvenciájú jelek. Nyugodt ébrenléti állapotot tükröz, legjobban csukott szemmű alanyokon detektálható, legszebben az occipitális lebeny fölött mutatkozik. - Béta: 12Hz feletti frekvencia tartományban. Összefüggésben áll az aktív,
elfoglalt,
nyugtalan
gondolkodással
és
koncentrációval.
Ritmikusan jelentkezik drogos befolyásoltság esetén. - Gamma: 26Hz-100Hz frekvenciás jelek. A magas szintű mentális aktivitás közben tapasztalható, például észlelés, probléma megoldás. Az alvás ciklusukra osztható, mégpedig annak mélysége alapján. Az alany ébersége, reakcióképessége, izmon tónusa változik az alvás fázisaiban. Az alvás mélysége váltakozó képet mutat, azaz nem minden fázisban ugyanannyit tölt el az alany. Két alap típusa a gyors szemmozgásos alvás (Rapid Eye Movement-REM) és a nyugodt alvás (NREM) alvás, utóbbi a 75-80%-át teszi ki az alvás idejének. Az ember REM, NREM ciklusai kb. 90 percenként váltakoznak.
27
-
Első Fázis: (szendergés) átmenet az ébrenlét és az alvás közt, ekkor jelennek meg a theta hullámok. Az alvás kezdetén jelentkezik, sokszor nem tudatos rángások jelentkeznek ebben a fázisban. Az izom tónusa csökken, szemmozgások lassulnak, pislogás nincs. Alvás idő 5-10 %-át teszi ki.
-
Második Fázis: (felületes alvás) alvási orsók (12-16Hz) és bifázisos lassú
hullámok
„K-komplexek”11,12,13,14,15
jellemzik.
Az
alvás
mélyülésével nagy amplitúdójú theta- és delta-aktivitás regisztrálható. Az izomtónus tovább gyengül, szemmozgások megszűnnek. Az alvás 45-55%-át kiteszi. -
Harmadik Fázis: (középmély alvás) megjelennek a delta hullámok (0.55Hz). Ez is része a lassú hullámú alvásnak, átmenet a negyedik fázis előtt, a teljes alvás idő 3-8%-a.
-
Negyedik Fázis: (mélyalvás) itt detektálható igazán az alvási lassú oszcilláció (0.1-1Hz). 10-15%-a a teljes alvási időnek, az alvás első harmadát jellemzi. Ezt az állapotot tekintik a legmélyebb alvásnak, mert ebből a legnehezebb felébreszteni valakit. Ekkor jelentkeznek a rémálmok, és az alvajárás. Az eddig említett négy alvás fázis összefoglaló neve a NREM alvás. A lassú oszcillációt ebben az alvási stádiumban próbálom vizsgálni.
-
Ötödik Fázis (REM alvás): összekötik az álommal, az alvás utolsó harmadában jelentkezik, összefüggésben áll a testhőmérséklettel. A kérgi
neuronok
hasonlóképpen
viselkednek,
mint
ébrenlétkor.
Hasonlóak a jelek az első fázishoz, illetve beta hullámok is jelentkeznek, a hippocampusban theta hullámok detektálhatók. A REM alvás hiánya depressziót okozhat.
28
19. ábra: Agyi jelek osztályozása.
7.4 Alvási lassú oszcilláció: Az alvási lassú oszcilláció a fent említett NREM alvásban detektálható legszebben a mélyalvás fázisban. Micrea Steriade és társai leírtak egy (<1Hz) lassú oszcillációt14,16,17, melyet intarcellulárisan mértek ki neokortikális és thalamikus idegsejtekből természetesen alvó és altatott macskákból. Méréseikben mind ketaminxilazin altatásban, mind normál alvásban jelentkezett a lassú oszcilláció, a kérgi neuronok ritmikus hiperpolarizációs és depolarizációs viselkedést mutattak (20. ábra). Míg a hiperpolarizáció (down-state) alatt az idegsejtek pár száz ms-ig nem tüzelnek, addig a a depolarizációs fázisban (up-state) a membránpotenciál eléri a küszöbértéket és létrejönnek az akciós potenciálok. A lassú oszcilláció létrejöttében az intrinsic membrán áramok és a szinaptikus hálózatok vesznek részt. A lassú oszcilláció az agykéregben generálódik, és marad fenn, a thalamikus lézió nem befolyásolja, de az intrakortikális léziók nagyban befolyásolják. Ezt alátámasztja, hogy a down-state, és az up-state is előbb jelentkezik a kéregben, mint a thalamuszban. Up-state közben úgymond megnyílik egy ablak a thalamikus bemeneteknek, így az arról jövő információk elérhetik a kérget. Ez magyarázza, hogy alvás közben is a hang, taktilis és
29
szag információk a külvilágból elérhetik a kérget SWS alatt, de el kell érniük egy határt, hogy az ébresztést váltsanak ki. A down-statebeli hiperpolarizáció nem segíti elő az információ feldolgozást, mivel ekkor a neuronok nehezebben aktiválhatóak, ez az alvás fenntartásáért felelős. Újabban kiderült, hogy a NREM alvás alatt, különösen az SWS nagy szerepet játszhat a deklaratív memória bevésődésében. Alapja a theta/ gamma interakciók, a „spindlik” (21. ábra), és még a gamma frekvenciájú oszcillációk a lassú oszcilláció up-statehoz csatolódva. A szinaptikus plaszticitás a lassú és delta oszcilláció segítségével hozzájárul az ébrenlét alatt tanultak feldolgozásához.
20. ábra: Kérgi lassú oszcilláció. A jeleket tetróddal magam vezettem el, de a tetród minden csatornája már az előerősítőhöz két csatlakozóra van kivezetve. Az ábrákon alul látható a másodpercenkénti időosztás, illetve a jelek között látható jelölés a uV-os arányt mutatja (1024uV a jelenlegi). Az ábrán (bal) mezőpotenciál látható, észrevehető, hogy a depolarizációs fázisokban a mezőpotenciálon látható a MUA-ból származó akciós potenciálok, míg hiperpolarizációs fázisban a sejtek hallgatnak. 21. ábra: Az ábrán (jobb) a lassú oszcillációban felfedezhető spindli aktivitás látható (piros keret közt).
22. ábra: A lassú oszcilláció alatti MUA az általam tetróddal mért mezőpotenciálból 500Hz-es felül áteresztő szűréssel kaptam. Látható, hogy a depolarizációs fázis közben MUA-t detektáltunk (piros keretben).
30
8 Mérések, Eredmények: 8.1 Mélyagyi MUA: „GnRH szekrécióhoz kapcsolódó multiunit aktivitás elvezetése a preoptikus/ hipothalamikus régióból” kísérletek kapcsán eleinte single wire és multi unit elvezetésre alkalmas elektródákkal mértem ventrális feltárást alkalmazva. Mivel a megközelítendő terület sokkal közelebb volt ebből az irányból. A méréseket az nucleus arcuatusban végeztem, tervezett terület helye az agy alapjától DV: 0.4mm -> 1.0mm-ig, ML: 0.2mm -> 1.2mm-ig terjed AP: Bregma-2.8mm-nél. Sikerült detektálnom sejteket (23. ábra), illetve erősebb aktivitást is megfigyelhettem (23-25. ábra). Sok esetben viszont sajnos elég zajos, „50Hz-es” volt a felvétel.
23. ábra: Általam végzett ventrális megközelítéssel single wire elektródával (az előerősítő csatlakozójára két pontra van kivezetve) mért aktivitás kezdete a nucleus arcuatus-ban (Neuroscan programmal megjelenítve, 0.25uV-os függőleges beosztással). Az ábra már az 500Hz-es felül áteresztő szűrés utáni jeleket mutatja 24. ábra: a 23-as ábrán kezdődő aktivitás jeleinek folytatása. Jól láthatóak az akciós potenciálok.
A továbbiakban 24 csatornás 50um mérőpont távolsággal rendelkező multi elektróddal mértem, mely mérések során szintén tapasztaltam aktivitást, viszont továbbra is sok 50Hz-es zaj zavarta a mérést. Sokféle lehetőséget kipróbáltam, hogy az zajt lecsökkentsem/ megszüntessem: föld és indifferens pontok sztereotaxikus készülékről a bőr alá helyezett tűre csatlakoztatva, sztereotaxikus készülék külön leföldelése, mikroszkóp rúdjának leföldelése, de ezek csak keveset javítottak a rendszeren. Mikor
31
kipróbáltam, hogy leföldelem az állat nyelvét félrehúzó fémlapocot, az már erőteljesen lecsökkentette a zajt, de teljesen nem tudta kioltani.
25. ábra: Rátegelekrtódával (24 csatornás) elvezetett mérésem a nucleus arcuatus-ból, az ábrán (bal) a MUA látható NeuroScan programmal megjelenítve, szűrve. A 17-19, 21-23-as csatornákon látható az aktivitásfokozódás, a 14-es csatornán az aktivitásban az erősítő kihagyása figyelhető meg, az 1,2,15,16,20 csatornák rosszak, a 24-es csatorna referencia, a többi cstornán valószínűsíthetően agyi ér vérzés tompítja a jeleket. (függőleges osztás 0.5uV) 26. ábra: a 25. ábrán látható jelek folytatása (jobb), látszik az aktivitás fokozódás lecsengése.
A rétegelektródos mérés fenti ábráján (25,26. ábra) látható, hogy egyes csatornákon erős aktivitásfokozódás történik a mérés alatt, majd lecseng. Az is látható, hogy 5 csatorna valószínűleg sérült, illetve az elektróda levezetési sávjában egy ér, vagy folyadéktér helyezkedik el, amin áthaladva a bennük levő folyadék képes az elektróda falán felkúszni és a többi szomszédos kontaktust is vételképtelenné teszi. Alkalmanként sajnos az erősítők telítődéséből/kihagyásaiból következő műtermékek zavarhatják a mért jeleket. Az
elkészített
krónikus
elektródával
tesztméréseket
végeztem.
A
KOKI
elektrofiziológiai laborjában levő mérőrendszer használatával, egyesével vizsgáltam a krónikusan beépített elektróda kontaktusain detektálható jeleket. A tesztmérések során kiderült, hogy van olyan kontaktus, ami sajnos az készítési eljárás során megsérült, viszont több kontaktuson is lehetett jelet detektálni. A vett jel kicsit zajos volt, de a sejtek akciós potenciáljait így is jól meg lehetett különböztetni. A jó kontaktusokon több hosszú idejű mérést is végezve (a szükséges 50Hz kiküszöbölési tevékenységek, és az erősítő beállítása után), detektálni lehetett a gonadektomizált állatokra jellemző aktivitás fokozódását 15-20 perces időközönként, egy órás intervallumban kétszerháromszor is felfedezhető volt a vizsgálni kívánt aktivitás-fokozódás. A mért jeleket a rendelkezésre álló programba (Spike 2) beépített eszközzel szűrtem. Mivel nagy volt
32
az 50Hz a vett jelben, ezért egy 300Hz-es felül áteresztő szűrést alkalmaztam és így a jelen sokkal tisztábban látszott a gonadektomizált patkányokra jellemző 15-20 percenként arcuate nucleus területén detektálható LH szekrécióhoz kapcsolódó aktivitásfokozódás. Akciós potenciál
1500sec alatti aktivitás fokozódások
27. ábra: (bal) Az általam elkészített krónikus elektródával detektált akciós potenciál az arcuate nucleus-ban. 28. ábra: (jobb) Krónikus elektródás mérésem eredménye Spike2 programmal megjelenítve. Alul látható az időskála (2400s->3900s-ig), oldalt a feszültég skála, a két jelsorozat ugyanazon jel vételi (alsó), és szűrt verziója (felül). A vett jelek kicsit zajosak voltak, de még így is látható a gonadektomizált állatokra jellemző GnRH release-kor detektálható aktivitás fokozódás 15-20 percenkénti felbukkanása.
Ezek után több ilyen elektródát készítve, azokat beültetve 4-6 esetben volt alkalmam méréseket
végezni,
gonadektomizált
állatokon.
A
kísérletsorozat
kapcsán
megismerkedtem a műtéti technikákkal, az elektrofiziológiai jelek mérési technikáival, a különböző elektróda típusok előnyeivel és hátrányaival, a mérőrendszerek beállítási módjaival (pl. kapacitás kompenzáció), a jelfeldolgozás alapjaival (pl. szűrések, küszöbölés).
33
8.2 Current Source Density (CSD) CSD: egy bizonyos területen a neuronok transzmembrán áramainak az összege. Különböző idegsejtek más mértékű és polaritású áramokat generálhatnak. Az extracelluláris térben a pozitív és negatív membránáramok kiolthatják egymást, tehát a CSD terület szintű, nem pedig egy sejt szintű leírást ad. A CSD lokális membránáramokat ír le. Az extracelluláris tér irányából nézve – az áram folyási iránya szerint - megkülönböztetünk forrásokat (source) és nyelőket (sink). A CSD a mezőpotenciál második térbeli deriváltjával közelíthető. A kísérletek alatt azt az állítást próbáltam alátámasztani, amit humán kíséretekben mértek ki. Az agykéreg szupragranuláris rétegében forrás jelentkezését tapasztalták a lassú hullámú alvás down-state kezdetén. A kísérletekből felvett jeleket CSD analízisnek vetettem alá. Fiziológiailag a depolarizációkor a sejt nyelő, míg hiperpolarizációkor forrásnak feleltethetőek meg. Az eljárás megmutatja a sokcsatornás agyi jelek különböző mélységeiben lévő mérőpontok környezetében a terület viselkedését a szomszédos mérőpontokhoz képest. A sejtek vagy nyelőként (pozitív töltések jutnak a membránon át a sejtbe), vagy forrásként (kifolyó áram az extracelluláris térbe) viselkednek. A vett jelekből készíthetünk egy ábrát, amely a lassú hullámú alvás alatt megjelenő multi unit aktivitás kezdetekor a sink-source területek időbeli alakulását ábrázolja. A lassú hullámú alvás alatti CSD alakulását CNT, és szilícium elektródákkal mértem. A jeleket a NeuroScan4.0, illetve a Matlab 2009b alatt Csercsa Richárd által írott Wave Solution program segítségével elemeztem. A jelek feldolgozását programokba beépített lehetőségeket alkalmazva szűréssel, küszöböléssel, lineáris transzformációs mátrixokkal (.ldr kiterjesztésű fájlok) végeztem.
8.2.1 Adatfeldolgozás Az EEG jeleket NeuroScan4.0 és Wave Solution programok segítségével elemeztem. A számítások gyorsabb elvégezhetőségének érdekében decimáltam a felvett mezőpotenciált (csak minden tízedik mérési pontot emeltem ki), mivel a jelek 20000 Hz-es mintavételezéssel lettek felvéve, a CSD analízist ez szignifikánsan meggyorsítja (a mezőpotenciált .cnt kiterjesztésű fájlokban tároljuk). Amennyiben túl
34
sok volt a műtermék 1 Hz alatti hullám, akkor ezt egy felül áteresztő szűrővel korrigáltam a NeuroScan program beépített elemzési lehetőségeit alkalmazva: Transzformáció ezen belül Szűrés, majd a szükséges beállítások megadása következik, 1Hz-es felül áteresztő szűrő alkalmazása zero phase shift-el, 24dB/oct erősítéssel. A szilícium elektróda esetében a jelek a mérési eszköz csatlakoztatása miatt fordított csatorna
sorrendben
lettek
felvéve,
ezért
egy
HSI_rearange.ldr
mátrixszal
transzformáltam a megfelelő sorrendbe Transzformáció ezen belül Linear derivation művelet végzése a HSI_rearange.ldr alkalmazása az aktuális.cnt file-on.
29. ábra: HSI_rearange.ldr
A .ldr kiterjesztésű fájlok felépítése: első sorban a mátrix sor illetve oszlop mérete, majd az első sorban az oszlopcímek, illetve az első oszlopban a sorcímek, majd értelemszerűen a transzformációs mátrix elemei. A következő lépés volt a CSD alkalmazása Transzformáció, Linear derivation, CSD23x3.ldr alkalmazása az aktuális.cnt file-on.
30. ábra: CSD23x3.ldr
A CSD az aktuális csatorna jelét a szomszédos csatornák jeleinek függvényében értelmezi. A CSD után kapott jelen a látvány javítása érdekében simítást végeztem, Hamming simítást alkalmazva. Ehhez a csdh21.ldr transzformációs fájlt használtam 35
kétszer egymás után Transzformáció, Linear derivation, csdh21.ldr alkalmazása az aktuális.cnt file-on.
31. ábra: CSDh21.ldr
A kapott jeleken láthatóak (32. ábra) az adott területen lévő sink-source párok. A szupragranuláris rétegben megfigyelhető (32. ábra: 1,2 csatorna) a kezdő állításban említett forrás jelenség.
32. ábra: ARat20100419_07_dr_1Hz_chh.cnt. A jeleken a műtermékek kiszűrése után CSD linear derivation, és kétszeres Hamming simítás volt alkalmazva. (piros keretben) látható, hogy az első két csatorna forrás, a 3-11-ig csatornák nyelő, 11-19-ig forrás viselkedést mutat.
További feldolgozást végeztem a jeleken az alvási lassú oszcilláció up-state kezdeti időpillanatának környékén. Kiemelve a fájlokból az ilyen időintervallumokat egy átlagot lehet készíteni az adott fájlban levő CSD sink-source megfigyelésére. Ehhez az aktuális fájl decimált verzióját átnéztem, hogy melyik csatorna elég megbízható,
36
illetve melyiken van igazán jól megfigyelhető lassú oszcilláció. Ezt a csatornát használom referenciaként további műveletekhez. A csatornát először is külön megszűröm egy sáváteresztő szűrővel Transzformáció, sáv áteresztő Szűrés, zero phase shift alkalmazásával, 0.3Hz-3Hz tartományon 24dB erősítássel (33. ábra). A kapott jelet Wave Solution programmal analizáltam tovább, Hilbert Phase Difference (HPD) algoritmusát alkalmazva a kiválasztott csatorna jelén, majd az eredményt egy másik csatornára rámentve. A HPD-vel egy lépésfüggvényt kapunk a különbségről az eredeti függvény fázisa és a frekvenciája közt. Ez fűrészjelet eredményez a kimenő csatornán (33. ábra).
33. ábra: ARat20100419_07_dr_f033Hz_hil.cnt. Az ábrán látható mezőpotenciál, a 8. csatornán látható a 0.3Hz-3Hz-ig szűrt jel, a 21. csatornán a HPD eredménye látható. Észlelhető, hogy az elektróda 1Hz alatti műterméket is felvesz, ezért a mért jeleim kicsit deformáltak.
E fájlt a NeuroScann4.0-ban további szűrésnek és küszöbölésnek vetettem alá. A HPD után a jeleimen a 24 csatornából a referencia 0.3Hz-3Hz-ig szűrve látszik (az ábrán a 8. csatorna), illetve egy csatornán a Hilbert transzformáltja (az ábrán a 21. csatorna). A jeleket 500Hz- es felül áteresztő szűrésnek vetem alá, amivel megjeleníthetővé válik a mezőpotenciálban rejtőző MUA. Megfigyelve a MUA melyik csatornán jelentkezik először, adott időpillanatban lévő csatornaértékeket vizsgálva megmondható, hogy a HPD jel milyen átlagértéket vesz fel az up-state kezdetén. Ezt használva a feszültség küszöbértéknek megjelölhetőek az up-state kezdetek. Transzformáció, Feszültség
37
küszöbölés alkalmazása a Hilbert jel csatornáján, ahol a küszöbérték nagyobb, mint az előbb megfigyelt átlagérték, akkor tegyen megjelölést a program. Az így megtalált upstate kezdetek jelzéseit elmentve egy esemény (event) file-ba, kiemelhetőek a hozzájuk tartozó mintavételezési időpillanatok (sampling time). A CSD-t tartalmazó file-on, az event fájl alapján kiemelhetem egy epoch file-ba az upstate kezdetek meghatározott időkörnyezeteit. Transzformáció, Epoch készítése az eseményfile alapján, adott időkörnyezet -100ms-tól +500ms-ig, az aktuális.eeg file-on. Végignézve az epochokat lehetőségem van kizárni a hibás elemeket, majd ha ezzel végeztem átlagot veszek minden csatornára külön-külön (kb. 600-1000 elemet átlagoltam ki egy 10 perces felvételből a hibás elemek kivétele után).
34. ábra: ARat20100419_07.avg, az ábrán a NeuroScan CSD jelek up-state kezdeteihez tett megjelölés alapján kiemelt epoch-ok csatornánkénti átlaga látható Wave Solution programmal megjelenítve.
Az így kapott átlagot a Wave Solution programba betöltöm (33. ábra), majd abból megjelenítem a CSD térképet (34. ábra). Az eredményen jól látszanak a lassú hullámú alvás alatt történő us-state kezdeteinél megjelenő sink-source párok, illetve a felső két csatornán megfigyelhető a kiindulási feltevésben említett forrás a szupragranuláris rétegben.
38
34. ábra: 20100419_07CSD(az ábrán piros szín jelzi a source, a kék szín a sink régiókat)
39
8.3 Sejt-válogatás: Továbbiakban a szenzoros kéreg sejt-válogatás vizsgálatáról írnék. Mi az a sejt-válogatás, milyen problémák merülnek fel, milyen eljárások léteznek hozzá, klaszterező algoritmusok áttekintése. Mint említettem a neuronok akciós potenciálokkal kommunikálnak egymással, amit képesek vagyunk elektródával rögzíteni, de ilyenkor általában nem csak egy neuronról vezetünk el, hanem a környező területekről is (extracelluláris mérések esetén). Sok esetben a mérés lényegét képezi, hogy a mért tüzelést megfelelő megbízhatósággal egy neuronhoz kapcsoljuk. Sokszor még egy sejt elvezetésekkor is nehézkes a tüzelések megkülönböztetése18, főleg ha számításba vesszük, hogy akár a zaj, akár a külső hatások, akár a környező neuronok hasonló tüzelési mintázatának befolyását. Még sokszor az egészen egyszerű megoldások, mint a küszöbölés is megváltoztathatja a végeredményt (eltolhatja egy nagy amplitúdójú neuron irányába). A sejt-válogatás algoritmus segíthet a túl közeli neuron populációk szétválasztásában, még azon esetben is, amikor a közeli idegsejtek szimultán tüzelnek.
35. ábra: A sejt-válogatás menete vázlatosan19
40
A mérő elektróda felveszi a környékén feszültséget, ezek legnagyobb komponense a mezőpotenciál, up-state-ben láthatóak az akciós potenciálok. Más zavaró tényezők az idegkötegekről jövő jelek, zajok, lokális összegződéseiből adódó akciós potenciálhoz hasonló jelek, de ezek többségét szűréssel kiküszöbölhetjük. Befolyásolhatja a mérést továbbá az elektróda mérőfelületének, hegyének (sigle wire esetén) nagysága, ugyanis, minél nagyobb az elektróda mérőfelülete annál több szignál detektálható, de annál nehezebb is a tüzelések megkülönböztetése, szétválasztása. Amennyiben túl kicsi az elektróda mérőfelülete, úgy az elektróda termikus zaja megnő, így a lényegi jeleket sokkal nehezebb kiemelni a zajból. Egy mérésen belül is megváltozhat egy adott neuron aktivitásának jellege, akár az akciós potenciálok amplitúdójának csökkenése során. Hasonló jelenség, illetve aműtermék forrás az agyszövet elmozdulása az elektróda felületén (az elektróda beültetésekor az agyszövet benyomódhat, később az elektróda mentén visszaállhat eredeti helyzetébe). A jeleinken több különböző alakú akciós potenciál is jelentkezhet, ezek tényleg külön idegsejthez tartoznak-e? Hogyan különböztetjük meg a zaj összegződéséből adódó jeleket, a lokális területen lévő, de távolabbi neuronoktól, és ez utóbbit hogyan hasonlítanánk a tényleges akciós potenciálhoz? Hogyan válasszuk külön az átlapolódó akciós potenciálokat? A továbbiakban az egyszerűbb megoldásokat tekintem át, melyek mégis sok problémát képesek megoldani, majd rátérek a bonyolultabb algoritmusokra, nehezebb problémák megoldásához.
8.4 Küszöb detekció, és nehézségei. Ideális esetben a mért jeleinken az akciós potenciálok egy jól karakterizálható alakot mutatnak. Sajnos sok esetben ez nem igaz, mert egy neuron tüzelésének akár egy mérés belül is változhat az alakja. A legtöbbször alkalmazott küszöb detekció a feszültség küszöb beállítása. Lényege, hogy olyan értéket állítsunk be, ami már biztosan elszeparálja a zajt az akciós potenciáloktól. A legtöbb tüzelés alakjának egyik fő jellemzője az amplitúdója, így a megfelelő értékkel küszöbölve kiemelhetőek az értéket átlépő akciós potenciálok. E lehetőség azért is jó, mert minimális a hardver és szoftverigénye, ellenben nem mindig adható meg megfelelő minőségű izoláció. Ellenőrzésképp használhatunk tüzelések 41
közti korrelációs diagramot, amely megmutatja az egyes tüzelések összefüggését, ha van tüzelés a refrakter perióduson belül, akkor a szeparáció nem megfelelő. Sokszor nem lehet megadni olyan küszöböt, ami képes megkülönböztetni a háttér aktivitást (lokális környezeten belüli neuronok tüzelései), és a zajt. Érdemes tehát a küszöbértéket úgy megadni, hogy az így talált fals pozitív, és fals negatív tüzeléseket optimalizálja. További problémákat okozhat, ha a háttérbeli tüzelést a zaj ellentétes azonos időbeli komponense pont kioltja, ekkor sajnos nem éri el a küszöb értéket, nem detektáljuk. Ez akkor nagy probléma, ha egy neuron ritkán tüzel, és így sok információt veszthetünk. Másik eshetőség, hogy két háttérbeli neuron azonos időben tüzel, így azok amplitúdója összegzetten detektálódik, így más aktivitás alakot kapunk, mely már átlépheti a küszöbértéket.
42
8.4.1 Tüzelések megkülönböztetése: Az akciós potenciálok megkülönböztetésére sokféle lehetőség adódik, például a tüzelés „szélessége, magassága” vagy a csúcstól csúcsig amplitúdó alapján. E megoldások alkalmazásával a tüzelési mintázatok klaszterezhetőek (csoportokba oszthatóak) a megfelelő tulajdonságok alapján. Még egy lehetőség a Főkomponens Analízis. Sok mintázat felismerésre tett kísérlet a nem megfelelően kiválasztott lényeges elemek miatt rossz eredményt adhat. A principal component analízis automatikusan keresi meg a szükséges alakzatokat, mégpedig úgy, hogy azok otogonális bázist alkossanak. Minden tüzelést a maximumpontjához képest rendezve a tüzelések alakja minimális variabilitást fog mutatni, így érhető el a legjobb megkülönböztetés. Az algoritmus minden egyes tüzeléshez egy arányszámot rendel, ami a tüzelés és principal componentjei pontszámából adódik. A principal componentek pontszáma attól függ, hogy milyen nagy variabilitást reprezentálnak. A principal component vektorokat a kovariancia mátrix egységvektorainak kiszámításából kapjuk meg. A két legmagasabb pontszámú komponens elegendő a tüzelések alakjának meghatározására, mert a későbbiek már elenyésző értékűek ezekhez képest.
36. ábra: Wave Solution programban a jelek általam végzett főkomponens analízise, balra a küszöböléssel megtalált jelalakok, középen a főkomponensek, jobbra a főkomponensek varianciája.
8.5 Klaszterezési algoritmusok:
43
A legegyszerűbb lehetőség a klaszterezésre az amplitúdó alapú megközelítés, de ez sajnos nem képes a hosszútávon csökkenő amplitúdójú tüzelések kezelésére. Ezt az algoritmust használja a Spiker program, amivel először próbáltam a sejt-válogatást, de hamar elvetettem a használatát, mert bár a klasztereket kézzel határozhattam meg, így alkalmanként egész jó csoportosítás volt lehetséges, de a küszöbölés nincs jól megoldva, az interspike interval diagramok minden esetben mutattak átfedéseket a tüzelések közt, és az amplitúdó alapú klaszterezés miatt.
37. ábra: A Spiker program kézi klasztercsoport alkotási lehetősége, a tüzelések Hadamand megjelenítésű formájában láthatóak, az általam kézzel meghatározott klaszterekre bontás 5 klasztert mutat. 38. ábra: A 37. ábrán látható klaszterek által meghatározott jelcsoportok. Látható, hogy a klaszterezéssel a különböző jeltípusok különböző csoportot alkotnak.
8.5.1 K-means alapú klaszterezés: Az előzőekben tárgyalt sejtválogatási lehetőségek megmutathatják, hogyan kéne klaszterekre osztani kézzel a tüzeléseket, de erre léteznek automatizált eljárások is. Az egyszerűbb verziók a legközelebbi szomszéd alapu vagy K-means algoritmusok, melyek a klasztereket a középértékük alapján alakítja ki, a középértékektől számított euklideszi távolság alapján osztja be a pontokat a klaszterekbe. Minden iterációban az aktuális középértékekhez hasonlítja a többi pontot, majd az iteráció végén módosítja a középértékek helyét a hozzájuk aktuálisan tartozó pontok alapján. Az algoritmus akkor áll meg, ha egymást követő iterációkban nem változott a középértékek helye. Az algoritmus nem veszi figyelembe a klasztereken belüli eloszlást, csak a középértéket, 44
így ezen algoritmusok problémába ütköznek, ha a pontok nem szépen elhatárolható csoportokat alkotnak, hanem átlapolódnak. A K-means kalszterezési algoritmust teszteltem a Wave Solution program segítségével.
39. ábra: Wave Solution programban végzetem K-means alapú klaszterezést a jeleimen, 4 megkülönböztethető klasztert találtam a program segítségével. 40. ábra: Wave Solution program klaszetrező felülete, a 39. ábrán látható csoportosítás beállításai, eredménye.
8.5.2 EM klaszterezés: Az expectation maximization klaszterező algoritmus esetében adott egy valószínűségi függvény L(θ,x,Z), ahol θ a paraméterek vektora, x a megfigyelt adat, Z pedig a hiányzó adatokat reprezentálja (nem megfigyelt adatok). A maximum likelihood becslést a megfigyelt adatok marginális valószínűsége L(θ,x) határozza meg. A EM algoritmus a maximum likelihood becslését keresi a marginális valószínűségnek a következő két lépés iterálásával. Várhatósági lépés: kiszámolni a log likelihood függvény várható értékét, Z feltételes valószínűsége alapján, adott x megfigyelésre θ(t) aktuális becsült paraméterekre.
Maximalizációs lépés: megtalálni azt a paramétert, ami maximalizálja a következő kifejezést.
45
41. ábra: Wave Solution programban végzetem kompetitív EM alapú klaszterezést a jeleimen, 3 megkülönböztethető klasztert találtam a program segítségével. 42. ábra: Wave Solution program klaszetrező felülete, a 41. ábrán látható csoportosítás beállításai, eredménye.
8.5.3 Bayes-i klaszterezés: A Bayes-i klaszterezés a csoportokat statisztikai eloszlás szerint figyeli. A klasztereket többváltozós Gauss eloszlásúnak tételezi fel. Egy adott csoport valószínűségének adatai: . Ahol x a tüzelés adatainak vektora, μk a középérték és Σk a csoport kovariancia mátrixa. A Bayes szabály alapján az adat klaszterhez tartozási valószínűségének kiszámítása adja meg a klasszifikációt.
Ez definiálja a Bayes-i dötési határokat a modellhez, mert a klaszterhez tartozás a valószínűségeken alapul, és a klaszterhatárok a megbízhatóság függvényében vannak megadva. A csoportok paraméterei optimalizáltak, ha maximalizáljuk az adat valószínűségét.
Ezt az algoritmust használja a DataWiev program KlustaWin alkalmazása, melyet szintén teszteltem a sejt-válogatás során, és megbízhatóságban ez tűnt a legjobbnak.
46
DataWiev küszöbölés, klaszterezett tüzelések
43. ábra: DataWiev programban általam végzett küszöbölés. 44. ábra: A DataWiev programban a 43. ábra szerinti küszöbölés alapján KlutaWin programmal főkomponensek alapján végzett Bayesi klaszterezés eredménye.
A klaszterezési eljárásokat a tetróddal mért kísérleteimből származó EEG jeleken végeztem. Megvizsgáltam a tetród kontaktusainak impedanciáját, az alábbi értékek jöttek ki (45,46. ábra), minél kisebb az érték annál kevesebb a zaj, amit a környezetből vesz fel az elektróda. Általánosan 300-400 kOhm körüli érték már optimálisnak tekinthető.
Tetrodes 987
1000
Impedance (kOhm @1kHz)
900 800 700 600 500
537
523 530 460
593
570
640
639
697
689
618 490
405
461
389
400 300 200 100 0 1
2
3
4
Channels 15575
15576
15577
15578
45. ábra: A tetródokon végzett csatornánkénti impedancia mérésem eredménye. Az ábrán a különböző színek a különböző elektródákat jelőlik, alul látható az elektródák sorszáma, és a hozzájuk tartozó színkód.
47
No.: channel 1 2 3 4 AVG STDEV
00015575 kOhm 523 570 639 490
00015576 kOhm 530 405 689 618
00015577 kOhm 460 593 389 461
00015578 kOhm 537 640 697 987
555,5 560,5 475,75 715,25 64,62455674 122,3778302 85,12490822 192,8874888
46. ábra: A 45. ábra értékei táblázatba szedve, és azok összehasonlításai: - elektródánkénti csatorna impedancia átlag, -standard deviation.
Végeredményben csak a jobb impedancia értékekkel rendelkező tetródokkal mértem, a sejt-válogatás kísérletek kapcsán, mert némelyik megbízhatatlannak bizonyult. A sejtválogatás nem csak a tüzelések csoportosítására jó, hanem ebből kiszámíthatóvá válhat a csoportok tüzelési rátája, e segítségével pedig fel lehetne térképezni az agykéreg különböző rétegeinek, és az ott helyet foglaló sejteknek az átlagos tüzelési frekvenciáját, mely akár sok agyi sejt kommunikációs modell alapját képezhetné a későbbiekben.
47. ábra: A tetróddal mért jeleim MUA ábrázolása. A MUA-ból kiugranak a jól elkülöníthető sejtek akciós potenciáljai. (függőleges osztás 128uV)
48
A frekvencia rátát úgy tudnánk megadni, hogy a küszöb detekció, és a klaszterezés után a küszöbértéket elérő pontokon megjelölt időpillanatokat egy file-ba mentjük (NeuroScan programban ezt event file-nak nevezik, a file tartalmazza, hogy hányadik tüzelés, melyik klaszterhez tartozik, és milyen mintavételezési időpillanatkor éri el a küszöbértéket). Ezért is nagyon fontos a megbízható, és pontos küszöbölés, és a megfelelő klaszterezési algoritmus használata. Mivel a méréseket 20kHz-es mintavételezéssel végeztem, így a detektált tüzelési pontokhoz a programok az akkori mintavételi pillanat értékét teszik hozzá, így feldolgozáskor figyelni kell, hogy nem másodperces bontásban van a file-ban az időérték. A frekvencia rátát meg tudom adni, úgy, hogy megszámolom, minden másodpercben hány tüzelés detektálható, és ezeket az értékeket kiátlagolom, így megkapom az átlagos másodpercenkénti frekvenciát, vagy minden másodpercre vehetem a mintavételezési időpontokból képezhető tüzelések közti egy másodpercen belüli átlagot, és azokat az értékeket átlagolom (a második lehetőség kicsit pontosabb értéket adna a frekvencia rátára).
49
8.6 Eredmények rövid összefoglalása: A GnRH szekrécióhoz kapcsolódó multiunit aktivitás elvezetése a preoptikus/ hypothalamikus régióból kísérletsorozat kapcsán a krónikus elektródával mért eredmények (48-50. ábra). Egyes méréseken jól látható a vizsgálni kívánt aktivitás (49. ábra) jelentkezése 15-20 perces időközönként (50. ábra).
48. ábra: Az arcuate nucleus-ban az elkészített krónikus elektródával mért jeleim. 49. ábra: Az arcuate nucleus-ban az elkészített krónikus elektródával mért jeleim. Látható, hogy 450s és 750s között aktivitásfokozódás figyelhető meg.
50. ábra: A készített krónikus elektródával nucleus arcuatus-ban mért jelem (alább), 300 Hz felül áteresztő szűréssel (felül). Megfigyelhető az ábrán a gonadektomizált állatokra jellemző GnRH neuronok 15-20 percenkénti aktivitására hasonlító MUA fokozódás jelentkezése 2650s körül egyszer, 3300s-3550s-ig kétszer is.
50
A CSD analízis kapcsán a kétféle elektróda típussal mért jelek analízisének egy-egy eredménye alább látható. Kipróbáltam, hogy hat-e a mérésre, ha az agyfelszín száraz, illetve ha fiziológiás sóoldatot juttatunk rá az elektróda környékén. Az ábrákon (51-54. ábra) a piros szín felé tolódva láthatóak a source régiók, kék színel a sink. Látszik a képeken továbbá, hogy a szupragranuláris rétegben source jelenség van, illetve a CNT elektródás esetben megjegyzendő, hogy a felső 3 elektróda kívül van az agyfelszínen.
51. ábra: A Grand László által tervezett szilícium elektródával általam mért és feldolgozott CSD térkép száraz agyfelszín esetén (bal oldali ábra). A CSD ábrákon alul a 0 időpillanat az up-state kezdetét jelöli, ez előtt -100ms-tól +500ms-ig látható a vizsgált jelenség időbeli lefolyása, a függőleges tengelyen a csatornaszámok láthatóak. Az 1,2, 12-19-ig csatornákon source, a 3-11-ig sink mutatkozik az up-state kezdet idején. 52. ábra: A Grand László által tervezett szilícium elektródával általam mért és feldolgozott CSD térkép nedves (fiziológiás sóoldat az agyfelszínen) agyfelszín esetén (jobb oldali ábra). Az 1,2, 12-19-ig csatornákon source, a 3-11-ig sink mutatkozik az up-state kezdet idején.
53. ábra: A CNT elektródával általam mért és feldolgozott CSD térkép száraz agyfelszín esetén (bal oldali ábra). Az 1-5, 12-19-ig csatornákon source, a 6-11-ig sink mutatkozik az up-state kezdet idején. Az ábrán az első három elektróda kint van az agyból, az up-state kezdet nem a 0 időjelzésnél, hanem 20ms-nál látható. 54. ábra: A CNT elektródával általam mért és feldolgozott CSD térkép nedves (fiziológiás sóoldat az agyfelszínen) agyfelszín esetén (jobb oldali ábra). Az 1-5, 12-19-ig csatornákon source, a 6-11-ig sink mutatkozik az up-state kezdet idején. Az ábrán az első három elektróda kint van az agyból, az up-state kezdet nem a 0 időjelzésnél, hanem 10ms-nál látható.
51
A
sejt-válogatás
kísérletekből
származó
jelek
feldolgozását
megkezdtem.
Klaszeterezési algoritmusokat próbáltam ki a vett jeleken, és megfigyeltem azok végeredményeiként kapott klasztercsoportosítások, jelalakok közti különbségeket. Elkezdtem kidolgozni egy eljárást a klaszterezett jelcsoportok frekvencia átlag kiszámítására.
55.ábra: (bal), 56. ábra: (jobb) Azonos fileon, és csatornán a Wave Solution (k-means) és a Datawiew (KlustaWin-Bayes-i) klaszerezése közti különbség.
57. ábra: DataWiev programmal a klaszterezéssel megkülönböztetett csoportok alapján a tüzelési mintázatok csoportjai.
58. ábra: Wave Solution programmal a K-means klaszterezéssel (bal), CEM klaszterezéssel (jobb) megkülönböztetett csoportok alapján a tüzelési mintázatok csoportjai.
52
9 Távlati lehetőségek A Kisspeptin sejtek vizsgálatához tervezett és elkészített krónikus elektróda továbbfejlesztése. Például a fejlesztés részét képezi egy drogadagoló tű beépítése, mely a harmadik agykamrát célozná, ezzel lehetővé téve a centrális ingerlő anyagok beadását, kikerülve a vér- agy gátat. A sejt-válogatás kísérletekhez a feldolgozást megkönnyítő, gyorsító programok továbbfejlesztése, azok beépítése a már meglevő megfelelő rendszerekbe. A jelanalízist segítő algoritmusok hatékonyabbá tétele. A tüzelési frekvencia vizsgálatot külön up- és down-state esetben megvizsgálni.
10 Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani Ulbert Isvánnak, Fiáth Richárdnak, Grand Lászlónak a CSD és sejt-válogatás kísérletsorozatokban nyújtott segítségükért. Dr. Kalló Imrének, László Barnának és Hajdú Péternek a Kisspeptin sejtek vizsgálatát képező kísérletsorozatban nyújtott segítségért.
53
11 Irodalomjegyzék: 1
K.-I. MAEDA, et al., "The LHRH Pulse Generator: A Mediobasal Hypothalamic Location.," Neuroscience and Biobehavioral Reviews vol. 19, pp. 427-437, 1995. 2
Y.-X. Li and A. Khadra, "Robust Synchrony and Rhythmogenesis in Endocrine Neurons via Autocrine Regulations In Vitro and In Vivo," Bulletin of Mathematical Biology, 2008. 3
A. Inyushkin, et al., "Kisspeptin modulates spike coding within the hypothalamic arcuate nucleus of rats," Journal of Neuroendocrinology, 2007.
4
A. N. Inyushkin, et al., "KISSPEPTIN IS PRESENT PRESYNAPTICALLY IN THE RAT ARCUATE NUCLEUS AND MODULATES NEURONAL ACTIVITY AT THAT SITE.," ed, 2004. 5
J. S. Kinsey-Jones, et al., "Effects of Kisspeptin-10 on the Electrophysiological Manifestation of Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator Activity in the Female Rat," Endocrinology, vol. 149, pp. 1004-1008, 2008. 6
http://en.wikipedia.org/
7
Szirmai Imre: Neurológia 2005 kiadás
8
Fonyó Attila: Az Orvosi Élettan tankönyve (1999) második kiadás
9
George Paxinos and Charles Watson: The Rat Brain in stereotaxic coordinates Academic Press 1998 fourth edition 10
Micrea Steriade: Neuronal Substrates of Sleep and Epilepsy 2003
11
F. Amzica and M. Steriade, "The functional significance of K-complexes," Sleep Medicine, vol. 6, pp. 139-149, 2002. 12
F. AMZICA and M. STERIADE, "CELLULAR SUBSTRATES AND LAMINAR PROFILE OF SLEEP K-COMPLEX," Neuroscience, vol. 82, pp. 671-686, 1998. 13
V. Crunelli and S. W. Hughes, "The slow (<1 Hz) rhythm of non-REM sleep: a dialogue between three cardinal oscillators," Nature neuroscience, vol. 13, 2010. 14
F. Amzica and M. Steriade, "The K-complex: Its slow (
C.-y. T. Li, et al., "Burst Spiking of a Single Cortical Neuron Modifies Global Brain State," Science, vol. 324, 2009. 16
S. Chauvette, et al., "Origin of Active States in Local Neocortical Networks during Slow Sleep Oscillation," Cerebral Cortex, 2010. 17
L. Gao, et al., "Entrainment of Slow Oscillations of Auditory Thalamic Neurons by Repetitive Sound Stimuli," The Journal of Neuroscience, vol. 29, pp. 6013– 6021, 2009. 18
M. S. Lewickiy, "A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials," Comput. Neural Syst., vol. 9, pp. R53–R78, 1998. 19
http://www.scholarpedia.org/article/Spike_sorting
54
