Ritkán elıforduló, klinikai szempontból releváns sarjadzó gombafajok azonosítása és érzékenységének vizsgálata a legújabb antifungális szerek jelenlétében Doktori (Ph.D.)értekezés Szabó Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola 2/16 program: Bırgyógyászat és venerológia
Programvezetı: Prof. Dr. Kárpáti Sarolta, egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Témavezetık: Prof. Dr. Rozgonyi Ferenc, egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Dr. Majoros László, egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Hajdú Edit, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Csukás Zsuzsanna, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Pajor Attila, egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Szabó Béla fıiskolai tanár, Ph.D. Dr. Urbán Edit, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Szabó Dóra, egyetemi adjunktus, Ph.D.
Budapest 2010
TARTALOMJEGYZÉK I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ÉS MAGYARÁZATA.........................................................................4 II. BEVEZETÉS .........................................................................................................................................7 III. IRODALMI ÁTTEKINTÉS .............................................................................................................10 III. 1. A SARJADZÓ GOMBÁK FELÉPÍTÉSE, VIRULENCIA FAKTOROK .........................................................10 III. 1. 1. A sejtfal ...............................................................................................................................10 III. 1. 2. Adhézió és adhéziós gének ..................................................................................................11 III. 1. 3. Dimorfizmus és csíratömlıképzés .......................................................................................12 III. 1. 4. Enzimatikus virulencia fakorok...........................................................................................12 III. 1. 4. a. Candida albicans- ban........................................................................................... 12 III. 1. 4. b. Egyes nem-albicans típusú Candida fajokban....................................................... 13
III. 2. A CANDIDA FAJOK EPIDEMIOLÓGIÁJA ÉS AZ ARTEMIS VIZSGÁLATOKBÓL SZÁRMAZÓ EGYES EPIDEMIOLÓGIAI ADATOK .......................................................................................................................13 III. 2. 1. Az ARTEMIS vizsgálatok értékelése...................................................................................13 III. 2. 1. a. Candida glabrata .................................................................................................. 15 III. 2. 1. b. Candida krusei ...................................................................................................... 16 III. 2. 1. c. Candida guilliermondii.......................................................................................... 17 III. 2. 1. d. Candida rugosa .................................................................................................... 17 III. 2. 1. e. Candida inconspicua ........................................................................................... 18 III. 2. 1. f. C. dubliniensis....................................................................................................... 18 III. 2. 1. g. A „psilosis”- csoportba tartozó fajok.................................................................. 20
III. 3. A SARJADZÓ GOMBÁK AZONOSÍTÁSA ............................................................................................22 III. 3. 1. A sarjadzó gombák izolálása és azonosítása a mai rutin diagnosztikában.........................23 III. 3. 1. a. Tenyésztés.............................................................................................................. 23 III. 3. 1. b. Csíratömlıképzés.................................................................................................. 23 III. 3. 1. c. CHROMagar szerepe néhány Candida faj azonosításában .................................. 23
III. 3. 2. Manuális és automatizált kiértékeléső kereskedelmi kitek alkalmazása az azonosításban .24 III. 3. 2. a. Manuális kiértékeléső kereskedelmi kitek.............................................................. 24 III. 3. 2. b. Automatizált kiértékeléső kereskedelmi kitek......................................................... 25 III. 3. 2. c. A MICRONAUT- Candida System használata az azonosításban................................................................ 26
III. 3. 3. Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása az azonosításban .......................................27 III 3. 3. a. rDNS gén amplifikáción alapuló azonosítás........................................................... 27 III. 3. 3. b. Egyéb PCR-alapú és más molekuláris biológiai módszerek.................................. 27
III. 4. ANTIFUNGÁLIS SZEREK ÉS AZ ANTIMIKOTIKUS KEZELÉS FARMAKOLÓGIÁJA ................................29 III. 4. 1. Antifungális szerek fungicid és fungisztatikus hatása .........................................................30 III. 4. 2. Sejtmembránt károsító poliének ........................................................................................30 III. 4. 3. A DNS szintézist gátló 5-fluorocitozin ................................................................................31 III. 4. 4. Echinocandinok ...................................................................................................................32 III. 4. 5. Sejtmembránt károsító azol típusú gombaellenes szerek .....................................................33 III. 4. 5. a. Flukonazol ............................................................................................................ 33 III. 4. 5. b. Itrakonazol ........................................................................................................... 35 III. 4. 5 c. Vorikonazol ........................................................................................................... 35 III. 4. 5. d. Posakonazol ......................................................................................................... 36 III. 4. 5. e. Ravukonazol, albakonazol ..................................................................................... 37
III. 5. IN VITRO ÉRZÉKENYSÉGI VIZSGÁLATOK ........................................................................................38 III. 5. 1. Standard mikrodilúciós módszer.........................................................................................38 III. 5. 1. a. A módszer leírása és kivitelezésének feltételei....................................................... 38 III. 5. 1. b. A módszerrel kapott eredmények interpretálása.................................................... 39 III. 5. 1. c. A MIC eredményeket befolyásoló körülmények ..................................................... 41
III. 5. 2. E-teszt.................................................................................................................................41 III. 5. 3. Az érzékenység meghatározására szolgáló egyéb kereskedelmi kitek.................................42 III. 5. 4. Az antifungális szerek fungicid és fungisztatikus hatását vizsgáló módszerek ....................42 III. 5. 4. a. Az MFC meghatározását szolgáló módszer................................................................................... 42 III. 5. 4. b. Antifungális szerek fungicid és fungisztatikus hatásának vizsgálata idı-ölés görbék segítségével. 42 III. 5. 4. c. Az idı-ölés görbék alkalmazásának speciális esete ......................................................................... 43
1
IV. CÉLKITŐZÉSEK..............................................................................................................................45 V. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK..........................................................................................................46 V. 1. A SARJADZÓ GOMBÁK EREDETE .....................................................................................................46 V. 1. a. A MICRONAUT- Candida és API ID 32 C vizsgálatokhoz használt izolátumok..................46 V. 1. b. Az Idı-ölés görbék felvételéhez használt izolátumok............................................................46 V. 2. SARJADZÓ GOMBÁK IZOLÁLÁSA ÉS AZONOSÍTÁSA ........................................................................47 V. 2. 1. Tenyésztés .............................................................................................................................47 V. 2. 2. Kereskedelmi forgalomban használt kitek segítségével ........................................................47 V. 2. 2. a. Azonosítás API ID 32C automatizált kiértékeléső kit segítségével.......................... 47 V. 2. 2. b. Azonosítás MICRONAUT- Candida azonosító rendszer segítségével..................... 48 V. 2. 2. c. Statisztikai elemzés.................................................................................................. 48 V. 2. 2. d. A rendszer minıség-ellenırzése .............................................................................. 50 V. 2. 2. e. Azonosítás molekuláris biológiai módszerekkel ...................................................... 50
V. 3. ÉRZÉKENYSÉG MEGHATÁROZÁSÁT SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK ..........................................................51 V. 3. 1. Leveshígításos módszer az érzékenység meghatározására...................................................51 V. 3. 2. Idı-ölés görbék felvétele (time-kill kísérletek)......................................................................52 V. 3. 2. 1. Az antifungális carry-over vizsgálata ..................................................................... 52 V. 3. 2. 2. Idı-ölés görbék felvételéhez beállított paraméterek................................................ 53 V. 3. 2. 3. Az antifungális szerek koncentrációinak megválasztása az idı-ölés görbék felvétele során ....................................................................................................................................... 54 V. 3. 2. 4. Mintavételezési idıpontok megválasztása az idı-ölés görbék felvétele során......... 55
V. 3. 3. Eredmények interpretálása...................................................................................................55 V. 3. 3. a. Az eredmények interpretálása leveshigításos módszer esetén ......................................... 55 V. 3. 3. b. Az eredmények interpretálása idı-ölés görbék felvételével történt vizsgálatok esetén..... 56
VI. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉS..................................................................................................57 VI. 1. AZ AZONOSÍTÁSI VIZSGÁLATOK ÉRTÉKELÉSE ...................................................................................57 VI. 1. 1. MICRONAUT-Candida Sytem azonosító rendszerrel és az ID 32C-vel kapott eredmények összevetése ............................................................................................................................................57 VI. 1. 1. a. Jól korreláló és egyértelmően azonosított izolátumok ................................................................................ 58 VI. 1. 1. b. Nem egyértelmően azonosított izolátumok.................................................................................................. 58 VI. 1. 1. c. Az azonosítási vizsgálatok statisztikai értékelése........................................................................................ 59
VI. 2. A C. INCONSPICUA IZOLÁTUMOKKAL VÉGZETT VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI ....................................61 VI. 2. 1. A C.inconspicua FLU-lal és AMB-vel végzett mikrodilúciós vizsgálatai során kapott MIC értékek ……………………………………………………………………………………………………….. 61 VI. 2. 2. Az idı-ölés görbe vizsgálatok során kapott eredmények.....................................................62 VI. 3. A CASPOFUNGIN IN VITRO AKTIVITÁSA A C. PARAPSILOSIS, C. ORTHOPSILOSIS, C. METAPSILOSIS IZOLÁTUMOKKAL SZEMBEN ........................................................................................................................65 VI. 3. 1. Caspofungin MIC értékek meghatározása RPMI-1640 és AM3 táptalajokban ............................65 VI. 3. 2. A „psilosis”- csoportba tartozó fajok CAS jelenlétében felvett idı-ölés görbék eredményei ......67 VI. 3. 2. a. Az RPMI-1640 táptalaj hatása ................................................................................................................... 67 VI. 3. 2. b. Az AM3 táptalaj hatása .............................................................................................................................. 68
VI. 4. VIZSGÁLATOK C. DUBLINIENSIS IZOLÁTUMOKKAL.............................................................................74 VI. 4. 1. A C. dubliniensis izolátumokkal végzett mikrodilúciós vizsgálatok MIC értékei ................74 VI. 4. 2. A C. dubliniensis izolátumokkal felvett idı-ölés görbék eredményei ..................................74 VII. MEGBESZÉLÉS ..............................................................................................................................79 VII. 1. A MICRONAUT-CANDIDA SYSTEM ÉS AZ API ID 32 C AZONOSÍTÓ RENDSZERREL VÉGZETT ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLATOK ............................................................................................................79 VII. 2. A C. INCONSPICUA IZOLÁTUMOKKAL VÉGZETT VIZSGÁLATOK ....................................................82 VII. 3. A C. PARAPSILOSIS, C. ORTHOPSILOSIS ÉS A C. METAPSILOSIS IZOLÁTUMOKKAL CAS JELENLÉTÉBEN VÉGZETT VIZSGÁLATOK .................................................................................................84 VII. 4. A C. DUBLINIENSIS IZOLÁTUMOKKAL VÉGZETT VIZSGÁLATOK ....................................................87 VIII. KÖVETKEZTETÉSEK .................................................................................................................90 IX. ÖSSZEFOGLALÁS...........................................................................................................................92
2
X. SUMMARY..........................................................................................................................................93 XI. IRODALOMJEGYZÉK....................................................................................................................94 XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .....................................................................................117 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK ...........................................................117 EGYÉB KÖZLEMÉNYEK......................................................................................................................117 FONTOSABB POSZTEREK, ELİADÁSOK ........................................................................................118 XIV. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS ......................................................................................................119 XV.MELLÉKLETEK ............................................................................................................................120
3
I. Rövidítések jegyzéke Rövidítés AFLP
Magyarázat amplifikált fragmenthossz polimorfizmus (amplified fragment length polymorphism)
Als
agglutinin-szerő fehérjéket kódoló gének (gene encoding agglutinin-like proteins)
ALS1 és ALS5
agglutinin-szerő fehérjék (agglutinin-like proteins)
AM3
Antibiotikum Médium 3 táptalaj (Antibiotic Medium 3)
AMB
Amphotericin B
ATCC
American Type Culture Collection
AUC/MIC
görbe alatti terület/minimális gátlási koncentráció (area under the curve/ minimum inhibitory concentration)
BMD
leveshígításos mikrodilúciós módszer (broth microdilution method)
CaChs1p,CaChs2p,
C. albicans kitin szintetáz -1, -2, -3, -8.
CaChs3p, CaChs8p
(C. albicans chitin synthase -1,-2,-3,-8)
CAS
Caspofungin
CdCDR1/ CdCDR2
Candida Drug Resistance genes in C. dubliniensis
CdERG3
az ergoszterol szintézisében résztvevı szterol-C-5,6-deszaturázt kódoló gén a C. dubliniensis-ben (gene encoding sterol-C-5, 6-desaturase involved in ergosterol biosynthesis in C. dubliniensis)
CdMDR1
multidrug transzporter fehérje C. dubliniensis-ben (multidrug transporter protein in C. dubliniensis)
CFU
kolóniaképzı egység (colony forming unit)
CgCDR1 és CgCDR2
Candida Drug Resistance genes in C. glabrata
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
Crz1
Calcineurin-responsive zinc finger transcription factor 1
CYP 51
Citokróm P 51 (Cytochrome P 51)
DÉ
dózisfüggıen érzékeny
DMSO
dimetil-szulfoxid
EUCAST
European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing
É
érzékeny
ELISA
enzim-kötött immunszorbens esszé (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ERG11
a citokróm P450 lanoszterol-14-α-demetilázt kódoló gén (gene encoding cytochrome P450 lanosterol-14-alpha–demethylase)
FDA
Food and Drug Administration
Fks1
az 1,3-D-glükán-szintetáz Fks1 katalitikus alegységét kódoló gén (gene encoding Fks1 catalytic subunit of 1,3-beta-D-glucan synthase)
4
Rövidítés
Magyarázat
5-FC
5-fluorocitozin
HIV
Human Immundeficiencia Virus (Human Immunodeficiency Virus)
Hsp 90
hısokk fehérje (heat sock protein 90)
Hwp1
hifa specifikus sejtfal fehérjét kódoló gén (hyphal-specific cell wall protein)
IGS
intergenic spacer régió a gombák rDNS-ében
Int1
integrin szerő fehérjét kódoló gén (gene encoded integrin-like protein)
ITR
Itrakonazol
ITS1 és ITS2
internal transcribed spacer régió 1 és 2
Km
az enzimreakció sebességi állandója
KETO
Ketokonazol
MÉ
mérsékelten érzékeny
MFC
minimális fungicid koncentráció (minimum fungicidal concentration)
MIC
minimális gátlási koncentráció (minimum inhibitory concentration)
Mnt1 és Mnt2
α-1,2-mannoziltranszferázt kódoló gének (alpha-1,2-mannosyltransferase genes MNT1 and MNT2 )
MOPS
3-(N-morpholin)-propánszulfonsav (3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid)
Mrr1p
multidrug rezisztencia regulátor (a zinc cluster transcription factor, multidrug resistance regulator)
MIC90 és MIC 50
90%-os és 50%-os növekedés gátlásnál leolvasott MIC értékek
NASBA
nukleinsav szekvencián alapuló amplifikáció (nucleic acid sequence based amplification)
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
PCR
polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)
PEG
polietilén-glikol
PG
paradox növekedés (paradoxical growth)
Pmt1 és Pmt2
dolichyl-P-mannóz protein manoziltranszferázt kódoló gének (genes encoded dolichyl-P-mannose protein mannosyltransferase)
POS
Posakonazol
R
Rezisztens
RFLP
restrikciós
fragmenthossz-polimorfizmus
polymorphism) r RNS
riboszómális RNS
5
(restriction
fragment
length
Rövidítés rDns
Magyarázat riboszómális DNS a rho alcsaládba tartozó Ras-szerő GTP kötı fehérje, mely az 1,3-glükán-
Rho
szintetáz szabályozásában vesz részt (GTP-binding protein of the rho subfamily of Ras-like proteins, regulates cell wall synthesizing enzyme 1,3-beta-glucansynthase)
SAP
szekretorikus aszpartil-proteáz (secreted aspartyl protease)
SADH
szekunder alkohol dehidrogenáz (secondary alcoholdehydrogenase)
Tup1
a gombák fonalas növekedésének transzkripciós represszor génje (transcriptional repressor of filamentous growth)
vmax
maximális reakciósebesség
VOR
Vorikonazol
WSc1 és Mid2
a stresszválasz szabályozásában résztvevı sejtfelszíni receptorok
6
II. Bevezetés Az 1980-as évek óta a gombák egyre gyakrabban tünnek fel a humán megbetegedést okozó tényezık között, az általuk okozta kórképek pedig fontos népegészségügyi problémává váltak világszerte (Pfaller és Diekema 2007). Irodalmi adatok szerint az USA-ban csupán az 1979-2000-es idıszakot felmérve, a gombák okozta évenkénti szepszisek száma több mint kétszeresére emelkedett (Nucci és Marr 2005). Noha az életet veszélyeztetı gombák között egyre gyakrabban fordulnak elı az Aspergillus és a Cryptococcus fajok, mégis elmondható, hogy világszerte az elsıdleges fontosságú opportunista kórokozók a Candida gombák. Epidemiológiai felmérések szerint a Candida fajok 33,9%-ban, az Aspergillus fajok 23,3%-ban, a Cryptococcus fajok pedig 12,7%-ban tehetık felelıssé az opportunista gombák okozta halálozásért (Pfaller és Diekema 2007). A legújabb irodalmi adatok szerint a candidémiák kialakulásáért továbbra is a C. albicans, C. glabrata, C. parapilosis, C. tropicalis és a C. krusei fajok tehetık felelıssé. Egyre gyakrabban fordulnak azonban elı olyan nehezen azonosítható gombafajok, mint a C. guilliermondii, a C. lusitaniae, a C. kefyr, a C. rugosa, a C. famata, a C. inconspicua, a C. norvegensis a C. dubliniensis is, melyeknek rezisztencia viszonyai az egyes antifungális szerekkel szemben igen eltérık lehetnek a leggyakrabban elıforduló C. albicans-hoz képest. A Candida fajok epidemiológiájában bekövetkezı változás szükségessé tette a klinikai izolátumok fajszintő, pontos és gyors azonosítását, ami az elsı lépés az adekvát terápia elkezdéséhez (Pappas és mtsai 2004, Pfaller és Diekema 2007, Pfaller és mtsai 2007). A korábban ritkán, de manapság egyre gyakrabban elıforduló sarjadzó gombák okozta fertızésekre jó példa a fenotípusosan hasonló megjelenéső, csökkent FLUérzékenységgel rendelkezı C. inconspicua és C. norvegensis izolátumok által okozott fertızések, melyeknek pontos azonosítását a rutin laboratóriumokban alkalmazott tesztek mindmáig nem teszik lehetıvé (Majoros és mtsai 2003, Sugita és mtsai 2004, Spellberg és mtsai 2006). Hasonló problémát jelentett hosszú idın át a C. dubliniensis és a C. albicans egymástól való megkülönböztetése. Egyedi DNS-ujjlenyomat mintázata és a kariotípus analízis igazolta, hogy a C. dubliniensis a C. albicans A szerotípusát képezi, és az API ID 32Ckittel kapott asszimilációs profilja alapján nem téveszhetı össze más ismert fajokkal.
7
Mindezek ellenére pontos azonosítása gyakori nehézséget jelent a rutin mikrobiológiai laboratóriumokban (Sullivan és Coleman 1997, Sullivan és mtsai 1997, Kirkpatrick és mtsai 1998, Pinjon és mtsai 1998, Salkin és mtsai 1998, Tintelnot és mtsai 2000). Legújabban a C. orthopsilosis és a C. metapsilosis (korábban C. parapsilosis II, III. csoport) fajokat különítették el molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával a szoros értelemben vett C. parapsilosis-tól (Tavanti és mtsai 2005). Az eddigi epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy a két új faj 1-2%-ban izolálható candidémiás betegekbıl, így pontos azonosításuk mindenképpen fontos a jövıben (Lockhart és mtsai 2008). Az antibakteriális és az antifungális terápia célja az, hogy a kórokozó eliminálása olyan gyorsan megtörténjen a szervezetbıl, amilyen gyorsan csak lehetséges. Amíg a nemneutropéniás betegek esetében egy fungisztatikus hatású szer hatékony lehet a gomba eliminálására, addig neutropéniás betegek invazív fertızéseinek kezelésében a fungicid hatású szerek alkalmazása javasolt (Pfaller és mtsai 2004/d, Pappas és mtsai 2009). Az idı-ölés görbék felvételekor végzett vizsgálatok hasznos információt nyújthatnak egy antifungális szer fungicid, illetve fungisztatikus hatásának megítélését illetıen (Pfaller és mtsai 2004/d). A ritkábban izolálható Candida fajok in vitro farmakodinámiája jelenleg nem minden esetben ismert sem a régebbi, sem pedig az újabb antifungális szerek iránt. Bár a leggyakrabban alkalmazott flukonazol (FLU) in vitro és in vivo is hatékony a klinikailag jelentıs Candida fajok döntı többsége ellen, a C. inconspicua a FLU iránt csökkent érzékenységet mutat az irodalomból ismert MIC értékek alapján is (Spellberg és mtsai 2006). Másrészt, a FLU iránt kezdetben érzékeny C. dubliniensis izolátumok is könnyen rezisztenssé válhatnak hosszan tartó kezelés során, ami a részleges vagy teljes keresztrezisztencia miatt a többi triazol típusú antifungális szer hatástalanságát eredményezheti (Moran és mtsai 1997). Az elsı echinocandin, a caspofungin (CAS) 2002-ben került bevezetésre az antifungális terápiába. Az echinocandinok in vivo legalább olyan hatékonyak, mint az amphotericin B(AMB), és sokkal kevesebb a mellékhatásuk. Jelentıségüket az is mutatja, hogy az echinocandinok jelenleg elsıként választandó antifungális szerek a neutropéniás, invazív candidiázisban szenvedı betegek kezelése esetén (Pappas és mtsai 2009). Figyelemre méltó, hogy az újonnan elkülönített C. orthopsilosis és C. metapsilosis
8
izolátumok echinocandinokkal szemben mutatott MIC értékei jelentısen alacsonyabbak a C. parapsilosis-szal összehasonlítva (Gomez-Lopez és mtsai 2008, Lockhart és mtsai 2008). Az említettek alapján érthetı, hogy a sarjadzó gombák epidemiológiájában bekövetkezett változás szükségessé teszi új diagnosztikai módszerek beállítását a rutin diagnosztikai módszerek közé, illetve a ritkábban elıforduló fajok érzékenységirezisztencia viszonyainak a pontosabb megismerését is. Ezen gondolatokat szem elıtt tartva fogalmazom meg késıbbiekben a célkitőzéseimet.
9
III. Irodalmi áttekintés III. 1. A sarjadzó gombák felépítése, virulencia faktorok A különbözı Candida fajoknak, mint opportunista humán patogéneknek, a test anatómiailag különbözı helyein (bırfelület, szájüreg, gasztrointesztinális traktus, hüvely) való megtapadásában, majd a szöveti invázióban számos virulencia faktor játszik szerepet (Casadevall és Pirofski 2001). Egyes enzimek termelése és a fonalas alak kialakulása a fertızés invazívvá válásáért és a szövetek károsodásáért felelıs (Calderone és Fonzi 2001). A fontosabb virulencia faktorok közül kiemelendı a sejtfal, az adhéziós fehérjék, a biofilm képzés, és a proteázok termelése (Haynes 2001, Yang 2003). III. 1. 1. A sejtfal A gombák sejtfala összetételét tekintve 80-90%-ban szénhidrátból, 6-25%-ban fehérjébıl, valamint 1-7%-ban lipidbıl áll (1. ábra). A szénhidrátok többségét a glükóz elágazó polimerje (β-glükán), az N-acetil-D-glükózamin nem elágazó polimerje (kitin), illetve mannóz-polimerek alkotják. Ezek az N-glikozidil kötésen keresztül kötıdnek a fehérjékhez.
Gyakran
nevezik
foszfopeptidomannán-komplexnek,
ıket
emiatt
melyeknek
foszfomannoproteineknek, a
Candida
fajok
vagy
szerológiai
specificitásához hozzájárulva szerepe van a latex agglutinációs teszteken alapuló gyors diagnosztikában (Chaffin és mtsai 1998). A gombák sejtfalszintézise dinamikus folyamat, mely szoros összefüggésben áll a sejtek növekedésével és fejlıdésével, szerepe van az antifungális szerek hatására megjelenı stressz-válaszban is (Perlin 2007).
10
Mannoproteinek
1,3 β-glükán kötés 1,3 β-glükán Kitin váz
1. ábra A gombák sejtfalszerkezete (http://www.abdn.ac.uk/ims/staff/details.php?id=n.gow) III. 1. 2. Adhézió és adhéziós gének Az Als-csoportba tartozó gének expressziós termékei az ALS1 és ALS5 agglutinin fehérjék, melyek adhéziós funkciót töltenek be a szájüregi hámsejtekhez való tapadásban a fertızés korai fázisában (Hoyer 2001, Yang 2003). Az α-1,2-mannozil-transzferázt kódoló Mnt1, és az O-glikolizációért felelıs mannoziltranszferáz Pmt1 és Pmt6 gének termékei szintén a hámsejtekhez való tapadást és a gazdaszervezet felismerését segítik (Buurman és mtsai 1998, Timpel és mtsai 2000, Calderone és Fonzi 2001).
11
III. 1. 3. Dimorfizmus és csíratömlıképzés Az Int1 gén termékek jelátviteli útvonalakon keresztül morfológiai változásokat indítanak el a sejtben, így a gombák sarjadzó alakból fonalassá való alakulásáért felelısek. Károsodásuk 40%-ban csökkenti a hámsejtekhez való tapadást és csökkent virulenciájú törzsek megjelenéséhez vezet (Calderone 1998, Kinneberg és mtsai 1999). A Tup1 gén jelenléte a C. albicans-ban a fonalas szerkezet kialakulásának negatív szabályozója, amit az is bizonyít, hogy dupla mutációja csökkent virulenciájú hiperfonalas szerkezető törzseket produkál (Braun és Johnson 1997). C. albicans esetén virulencia faktornak tekinthetı a csíratömlıképzés is, melynek révén a gombasejtek stabil kapcsolatba kerülnek a gazdasejttel. Megjelenéséért a Hwp1 gén a felelıs (Staab és mtsai 1999, Casadevall és Pirofski 2001). A csíratömlıképzéssel járó hidrolitikus enzimaktivitás felelıs a gombák okozta szöveti invázióért (Kretschmar és mtsai 1999). Ez nagyban hozzájárul a bır- és felszíni nyálkahártya-fertızések, vagy a disszeminált, mély szöveti vagy szisztémás fertızések kialakításához (Wellmer és Bernhardt 1997). III. 1. 4. Enzimatikus virulencia faktorok III. 1. 4. a. Candida albicans-ban A
gombák
bıségesen
termelnek
olyan
extracelluláris
enzimeket,
melyek
patogenitásukat fokozzák. Ide sorolhatók a SAP-fehérjék (szekretált aszpartil proteáz), foszfolipázok, észterázok, glüko-amiláz, hemolizin, foszfatáz, lipáz, hialuronidáz, kondroitin-szulfatáz, metallopeptidáz, trehaláz (Chaffin és mtsai1998, Yang 2003). Az aszpartil-proteáz szekrécióért a C. albicans-ban 9 sap (szekretált aszpartil proteázt kódoló gének) gén tehetı felelıssé, melyek a fertızés különbözı helyein a humán albumin,
hemoglobin,
keratin,
szekretorikus
immunglobulin-A
degradációjáért
felelısek. Proteolitikus aktivitásuk szorosan összefügg a szöveti invázióval (Hube és mtsai 1998, Yang 2003). A C. albicans-ban termelıdı foszfolipáz enzimmel kapcsolatban megfigyelték, hogy aktivitása magasabb a gomba hifa alakjaiban, mint a sarjadzó gomba sejtekben. A kevesebb foszfolipázt termelı C. albicans törzsek pedig kevésbé virulensek, mint a több foszfolipázt termelık. A véráram fertızésbıl származó C. albicans izolátumok
12
foszfolipáz aktivitása sokkal magasabb volt, mint az egyéb kommenzalista C. albicans törzseké (Pugh és Cawson 1977, Yang 2003). III. 1. 4. b. Egyes nem - albicans típusú Candida fajokban Több irodalmi adat igazolja egyes virulencia faktorok jelenlétét más, nem-albicans típusú Candida fajokban is. Így például a C. parapsilosis pszeudohifa virulensebb alakjában, bizonyított az aszpartil-proteáz termelıdése, melynek köszönhetıen csökkent pH és ösztrogén kezelés mellett a hámsejtekhez való tapadással igen erıs hüvelyi nyálkahártyát károsító hatást váltanak ki (De Bernardis és mtsai1999). A C. dubliniensis-ben egyidejőleg 7 proteázt kódoló enzimet azonosítottak (Gilfillan és mtsai 1998). A gomba C. albicans-hoz hasonlóan rendelkezik hemolitikus aktivitással is. Egyéb exoenzim jellegő virulencia faktorai azonban gyengébben fejezıdnek ki és kevésbé tanulmányozottak (Linares és mtsai 2007). III. 2. A Candida fajok epidemiológiája és az ARTEMIS vizsgálatokból származó egyes epidemiológiai adatok Európában az invazív candidiázisért 95%-ban a C. albicans, a C. glabrata, a C. parapsilosis, a C. tropicalis és a C. krusei törzsek felelısek. A maradék 5%-ban a többi, ritkábban izolálható, körülbelül 12-14 féle különbözı Candida faj (C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. dubliniensis, C. rugosa, stb.) okoz candidémiát, melyek között egyre gyakrabban figyelhetı meg természetes és szerzett rezisztencia a leggyakrabban használt antifungális szerekkel szemben (Marr és mtsai 2000, Pfaller és Diekema 2007). III. 2. 1. Az ARTEMIS vizsgálatok értékelése Az ARTEMIS rendszer 1997 óta folyamatosan monitorozza a Candida és egyéb sarjadzó gombák elıfordulását, epidemiológiáját. Több mint 40 ország különbözı vizsgálóhelyeirıl és különbözı testtájakról származó izolátumokkal végzik el a korongdiffúziós vizsgálatot FLU- és VOR-lal a CLSI M44-A (2004) útmutató szerint. A vizsgálatok eredményei a BIOMIC analizáló rendszer és szoftver segítségével kerülnek kiértékelésre (Pfaller és mtsai 2007).
13
Míg a C. albicans-t a vizsgált idıszakokban viszonylag stabil elıfordulási gyakoriság jellemezte, addig a ritkábban izolálható C. krusei, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. kefyr, C. rugosa és C. famata izolátumok számában emelkedés volt megfigyelhetı. A vizsgálati periódusban izolálásra kerültek olyan fajok is, mint a C. inconspicua, C. norvegensis, C. lipolytica, C. pelliculosa, C. zeylanoides (Pfaller és mtsai 2007). A vizsgált Candida izolátumok 90%-ban érzékenynek mutatkoztak FLU iránt. A C. glabrata és C. krusei jól ismert FLU-rezisztenciája mellett a vizsgált kb. 22 faj közül legalább 10 csökkent érzékenységet mutatott a FLU iránt (Pfaller és mtsai 2007, 1. táblázat). Az egyes törzseknél fellépı FLU-VOR keresztrezisztencia azt bizonyítja, hogy mindkét azol-származékkal szemben fontos az érzékenységi vizsgálatok elvégzése (Magill és mtsai 2006, Spellberg és mtsai 2006).
14
1. táblázat. Candida fajok flukonazollal és vorikonazollal szemben mutatott in vitro érzékenységének %-os megoszlása az ARTEMIS vizsgálatok alapján (Pfaller és mtsai 2007) FLU Vizsgált faj
Izolátumok
VOR
É, %
R ,%
száma C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. parapsilosis C. krusei C. guilliermondii C. lusitaniae C. kefyr C. rugosa C. famata C. inconspicua C. norvegensis C. dubliniensis C. lipolytica C. pelliculosa C. zeylanoides C. sake C. pulcherrima C. valida C. intermedia C. haemulonii C. humicola Egyéb Candida
89750 16152 10647 9371 3518 1088 835 698 502 462 354 171 169 97 62 57 33 16 15 9 8 2 7367
Izolátumok
É, %
(R), %
98,4 82,2 88,5 96,8 82,9 91,3 96,6 98,3 64,1 89,5 90,9 94,1 99,4 75,0 96,7 81,8 97,0 100,00 75,0 100,0 87,5 50,0 92,9
1,2 10,1 5,8 1,9 7,7 5,2 2,1 1,3 25,1 5,4 4,8 1,8 0,6 14,6 3,3 7,3 3,0 0,0 18,8 0,0 12,5 50,0 4,7
száma 97,9 68,9 90,4 93,3 9,2 73,9 92,6 95,6 43,8 80,1 23,4 48,5 97,6 64,9 90,3 66,7 84,8 93,8 20,0 100,0 87,5 50,0 86,8
1,5 15,8 4,4 3,6 77,8 10,7 4,7 3,4 47,8 10,6 53,4 36,8 2,4 30,9 4,8 24,6 9,1 6,3 66,7 0,0 12,5 50,0 8,2
87191 15824 10306 9041 3448 1056 818 686 479 446 351 170 168 96 61 55 33 17 16 9 8 2 7205
FLU: flukonazol, VOR: vorikonazol, É: érzékeny, R: rezisztens
III. 2. 1. a. Candida glabrata A C. glabrata fontos, potenciális rezisztens opportunista kórokozó, a C. albicans után a második leggyakoribb vérbıl izolálható patogén (Pfaller és Diekema 2007). A C. glabrata csökkent érzékenységet mutat a FLU iránt (MIC90 = 32 mg/L) (Pfaller és mtsai 2004/c). Szubterápiás koncentrációban, FLU profilaxisban részesülı betegek körében a FLU-rezisztens C. glabrata elıfordulási gyakorisága emelkedik (Fisher-Hoch és Hutwagner 1995, Gauzit és mtsai 2003). Ugyanakkor a széles spektrumú antibakteriális szerek, fıleg a piperacillin-tazobaktám kombináció használata, beültetett
15
eszköszök, parenterális táplálás, valamint az idıs kor már önmagában véve rizikótényezıje a C. glabrata okozta fungémiának és az ebbıl adódó halálozásnak (Malani és mtsai 2005). A faj érzékenységi viszonyait figyelembevéve, az ARTEMIS vizsgálatok szerint az új triazol-származékok közül a VOR tőnt a leghatékonyabbnak a FLU-rezisztens izolátumokkal szemben (MIC90 ≤ 1 mg/L). A CAS és 5-FC antifungális szerekkel szemben mutatott érzékenysége pedig feltétlenül jó alapot ad a jövıben a FLUrezisztens C. glabrata izolátumokkal szembeni harcban (Pfaller és mtsai 2004/c). III. 2. 1. b. Candida krusei A C. krusei elıfordulását tekintve az 5. leggyakoribb patogén sarjadzó gomba (Pfaller és Diekema 2007). Az ARTEMIS vizsgálati periódus alatt 3,5%-os elıfordulási gyakoriság jellemezte az USA-ban, 3,3%-os pedig Európában. Véráram kórokozóként körülbelül 2-4%-os gyakorisággal volt izolálható (Pfaller és Diekema 2007). Leggyakrabban hematológiai betegségben szenvedık és szervtranszplantáltak klinikai mintáiban fordult elı. Megtalálható sebészeti vagy egyéb orvosi eszközökön, intenzív osztályok nozokomiális kórokozójaként, bırgyógyászati és urológiai mintákban (Nguyen és mtsai 1996, Abi-Said és mtsai 1997). A C. krusei izolátumok a jól ismert intrinzik FLU-rezisztencia mellett, csökkent érzékenységet mutatnak az 5-FC és az AMB iránt is, csökkentve a választható antifungális szerek számát invazív fertızések esetén (Berrouane és mtsai 1996, Pfaller és mtsai 2008/a). A neutropéniás betegek körében, a terápiás nehézségekbıl is adódóan a C. krusei okozta halálozás 49%-ra tehetı a C. albicans okozta 28%-os halálozási gyakorisággal szemben (Abbas és mtsai 2000). Az intrinzik FLU-rezisztencia ellenére a C. krusei in vitro érzékeny maradt a VOR-lal szemben, jelezve ezáltal, hogy a vizsgált izolátumoknál keresztrezisztencia nem fordult elı (Ostrosky-Zeichner és mtsai 2003, Pfaller és mtsai 2008/a). Leukémiás betegekbıl izolált egyes C. krusei törzseknél figyeltek meg csökkent érzékenységet a caspofunginnal, anidulafunginnal és micafunginnal szemben (Pelletier és mtsai 2005, Hakki és mtsai 2006). A jelenséget az fks1 génben fellépı heterozigóta mutációval magyarázzák (Kahn és mtsai 2007).
16
III. 2. 1. c. Candida guilliermondii A Candida guilliermondii az ARTEMIS felmérésbıl származó izolátumoknak mindössze 1,4%-át képezik. A latin-amerikai országokban a negyedik leggyakoribb kórokozó sarjadzó gomba, a véráram fertızésekben 3-5%-os gyakorisággal izolálták a vizsgálati periódusban (Colombo és mtsai 1999, Pfaller és mtsai 2006/d). Leggyakrabban hemokultúrából és bırgyógyászati mintákból tenyészett ki (Pfaller és mtsai 2006/d, Girmenia és mtsai 2006). Az ARTEMIS felmérés során vizsgált C. guilliermondii izolátumok többsége érzékenynek mutatkozott FLU (91%), VOR (95%) és AMB (100%) iránt. Földrajzi helytıl
függetlenül
elıforduló
csökkent
FLU-érzékenységő
törzsek
gyakran
kolonizálják a bırt, illetve a beültetetett orvosi eszközöket (Pfaller és mtsai 2006/d). III. 2. 1. d.Candida rugosa Elsıként 1985-ben izolálták katéter-asszociált candidémiás és nozokomiális esetekbıl az USA-ban (Reinhardt és mtsai 1985). Dubé és mtsai (1994) 15 olyan égési sérült beteg esetét írták le, amelyekben a C. rugosa volt a kórokozó. Nemrég Brazíliában is beszámoltak a faj által okozott candidémiás esetekrıl (Colombo és mtsai 2003). Az ARTEMIS vizsgálatok szerint a felmért periódusra a C. rugosa gyakorisága 0,4% ra tehetı, ami az elızı évekhez képest többszörös emelkedést jelent (Pfaller és mtsai 2006/c). A VOR igen hatékony terápiás szernek mutatkozik a C. rugosa-val szemben. Az európai izolátumok érzékenyebbek a szerre, mint az észak-amerikai és a latinamerikai izolátumok (Ostrosky-Zeichner és mtsai, 2003, Nucci és Marr 2005, Pfaller és mtsai 2006/c). A leginkább FLU- és a VOR-rezisztens izolátumok hemokultúrákból származtak, ami még inkább indokolttá teszi a vérbıl származó kórokozók faj szintig történı azonosítását (Pfaller és mtsai 2004/a, Pappas és mtsai 2004). Földrajzi helytıl függetlenül idınként felbukkannak a nystatinnal szemben rezisztens, az AMB és 5-FC iránt pedig csökkent érzékenységet hordozó C. rugosa törzsek is (Dubé és mtsai 1994, Colombo és mtsai 1999, Nucci és Marr 2005, Pfaller és mtsai 2006/c). Az echinocandinokkal végzett érzékenységi vizsgálatok során a C. rugosa izolátumok < 2 mg/L echinocandin koncentráció értéken érzékenynek bizonyultak (Pfaller és mtsai 2006/c).
17
Az ARTEMIS vizsgálatok eredményei is igazolják, hogy a C. rugosa, a C. glabrata és C. krusei törzsekhez hasonlóan fontos nozokomiális patogén. III. 2. 1. e. Candida inconspicua A C. inconspicua-t elıször 1952-ben írták le (Meyer és mtsai 1998). CHROMagar táptalajon
a
C.
norvegensis-hez
hasonló
fenotípusos
tulajdonságokat
mutat.
Elkülönítésüket egyes cukrok asszimilációja és mikroszkópos tulajdonságaik teszik lehetıvé. A C. inconspicua nem asszimilálja a cellobiózt, nem hidrolizálja az eszkulint, ami megkülönbözteti ıt a C. norvegensis-tıl. Nem képeznek pszeudohifát, klamidospórát és csíratömlıt (Kurtzman 1998, Meyer és mtsai 1998). A kereskedelmi forgalomban kapható gyári kitek nem alkalmasak a C. inconspicua és a C. norvegensis elkülönítésére. A fajok pontos azonosítása molekuláris biológiai módszerekkel lehetséges (Baily és mtsai 1997, D’Antonio és mtsai 1998, Majoros és mtsai 2003). Ahogyan a C. krusei, úgy a C. inconspicua is intrinzik rezisztenciát mutat a FLU-lal szemben (White és mtsai 1998, Pfaller és mtsai 2007). Immunkompromittált betegekben, HIV-fertızöttekben és hematológiai betegekben gyakran okoz fungémiát (Baily és mtsai 1997, D’Antonio és mtsai 1998). Légzıszervi mintákból, sebbıl, vérbıl és a genitáliákból is tenyésztettek ki C. inconspicua izolátumokat. Hosszú idejő hospitalizációt követıen nozokomiális patogénként bukkan fel kórházi osztályokon (Baily és mtsai 1997, D’Antonio és mtsai 1998). A DEOEC Orvosi Mikrobiológia Intézetében 2002-ben a 6. leggyakoribb kórokozó volt (Majoros és mtsai 2003). Az ARTEMIS vizsgálatok azt mutatták, hogy elıfordulnak csökkent AMB érzékenységgel rendelkezı izolátumok is (Pfaller és mtsai 2007). A CAS és a POS in vitro hatékonysága bizonyított a FLU-rezisztens C. inconspicua izolátumokkal szemben (Majoros és mtsai 2005/b, Sóczó és mtsai 2007/a). III. 2. 1. f. C. dubliniensis A C. dubliniensis-t sokáig azonosnak hitték a C. albicans-szal. Elıször, mint új fajt Sullivan és mtsai 1995-ben írták le Írországban, Dublinban. Az egészséges ír populációnál gyakran volt kimutatható a szájüregben, HIV-fertızöttekben pedig a C.
18
dubliniensis okozta szájüregi candidiázisok elıfordulását 15%-os gyakoriság jellemzi (Sullivan és Coleman 1997, Moran és mtsai 1997, Paugam és mtsai 2008). Noha a szakirodalomból még nem ismert, milyen gyakorisággal izolálható hemokultúrákból, általa okozott fungémiát Észak-Amerikában, Európában és Ausztráliában is észleltek (Meis és mtsai 1999, Brandt és mtsai 2000, Mariott és mtsai 2001). Az irodalmi adatok szerint a C. dubliniensis törzsek könnyen fejlesztenek ki FLUrezisztenciát, melynek molekuláris mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, mindenesetre az kiderült, hogy egy összetett, multifaktoriális jelenség, mely FLU-lal indukálható (Moran és mtsai 1997, Pinjon és mtsai 2005). Korábbi tanulmányok szerint úgy tőnik, ezért elsısorban az efflux-pumpa transzporterek felülszabályozása a felelıs, melyet a multidrug rezisztens specifikus CdMDR1 gén túlmőködése von maga után, ami egy transz-regulatorikus szabályozó faktor mutációjának (Mrr1p) köszönhetı. Ezzel egyidejőleg a CdCDR1 túlmőködése, illetve az azolok célenzimét (lanoszterol-14-αdemetiláz) kódoló ERG11 (CdERG11) gén pontmutáció eredményeként megjelenı rezisztencia az esetek 40-60%-nál volt megfigyelhetı (Perea és mtsai 2002). Míg a CdMDR1 gén túlmőködése nem járul hozzá a ketokonazollal szemben jelentkezı keresztrezisztenciához, addig a CdCDR1 és az ERG11 mutációja egyes izolátumokban a ketokonazol és itrakonazol keresztrezisztencia megjelenéséhez kötött, jelenlétük ilyenkor a FLU-rezisztenciához nem feltétlenül szükséges. A C. dublininens-ben az ergoszterol bioszintézisének útvonalában szerepet játszó szterol-C-5,6-deszaturáz inaktiválása is bekövetkezik a CdERG3 mutációja révén, mely leginkább az itrakonazol rezisztenciát eredményezi. Ilyen izolátumok esetében az ITR MIC magasnak mutatkozott, s ezzel együtt a FLU-KETO keresztrezisztencia jelenléte is kimutatható volt, míg AMB rezisztenciát ritkábban észleltek (Pinjon és mtsai 2003). A DNS ujjlenyomat mintázat és az rRNS operon ITS régió szekvenciaanalízise alapján a C. dubliniensis fajon belül 4 különbözı genotípust (1, 2, 3, 4-es genotípusok) különböztetnek meg, melyek megjelenése összefüggésben van az azol-rezisztencia jellegével (Gee és mtsai 2002, Pinjon és mtsai 2005). Megfigyelték, hogy az 1-es genotípushoz tartozó izolátumok fordulnak leginkább elı olyan HIV-fertızötteknél, akik már elızıleg FLU-terápiában részesültek, ezáltal csökkent FLU érzékenységő izolátumok megjelenését elıidézve (Gee és mtsai 2002). Az ebbe a genotípusba tartozó izolátumok nonsense mutációt hordoznak a CdCDR1 génben. A 3-as genotípusú
19
izolátumoknál a csökkent FLU-rezisztencia jelenléte mellett más azolokkal szemben mutatott csökkent érzékenységét is leírták a C. dubliniensis izolátumoknak. Ez a típusú rezisztencia valószínőleg a CdCDR1 és CdCDR2 felülszabályozásával hozható összefüggésbe (Pinjon és mtsai 2005). Az ARTEMIS felmérésben vizsgált izolátumoknak mindössze 2,4%-a mutatott FLUrezisztenciát, míg a többi érzékenynek mutatkozott a szerre, valamint az új széles spektrumú triazolokra is (Pfaller és mtsai 2007). Az összes vizsgált izolátum érzékenynek mutatkozott az AMB (MIC
90
< 1 mg/L) és CAS (MIC
90
< 1 mg/L ) iránt
(Pfaller és mtsai 1999). A Fotedar és Al-Hedaithy (2003) által vizsgált C. dubliniensis izolátumok 65,6%-a mutatott in vitro rezisztenciát az 5-FC-nal szemben. III. 2. 1. g. A „psilosis”- csoportba tartozó fajok C. parapsilosis A C. parapsilosis a 2. vagy 3. leggyakoribb nozokomiális kórokozó a véráramfertızést okozó Candida fajok körében, úgy az USA-ban, mint Európában (Messer és mtsai 2006).
A
véráramfertızések
több
mint
20%-ának
okozója
Olaszországban,
Spanyolországban, és a dél-amerikai országokban (Rodero és mtsai 2005, Bassetti és mtsai 2006, Bedini és mtsai 2006, Almirante és mtsai 2006, Pfaller és mtsai 2008/b). Ritkábban tőnik fel Törökoszágban (12,5%) és Norvégiában (6%) (Yapar és mtsai 2006, Sandven és mtsai 2006). Kocsubé és mtsai (2007) 9,6%-os gyakorisággal izoláltak C. parapsilosis-t magyarországi hemokultúrákból (209 izolátumból 26-ot azonosítottak C. parapsilosisnak az API 20C-vel, ebbıl 10 izolátum Debrecenbıl, 16 pedig Pécsrıl származott). Ez alacsonyabb %-os elıfordulást jelent az európai viszonyokhoz mérten, de hazai vonatkozásban mindenképpen figyelemre méltó a Dóczi és mtsai (2002) által korábban közölt 4,9%-os véráramfertızéshez képest. Gyakrabban kolonizálja a bırt, mint nyálkahártyákat, elıszeretettel tapad meg biofilmet képezve a katétereken és más, beültetett orvosi eszközökön endokarditiszt, endoftalmitiszt, szeptikus artritiszt és peritonitiszt okozva (Weems 1992). A kórokozó nozokomiálisan is terjed kórházi környezetben, a candidémia második leggyakoribb okozója újszülöttekben (Levy és mtsai 1998, Almirante és mtsai 2006). A faj által
20
okozott, candidémiából származó halálozás ritkább, mint más Candida fajok esetében, ami valószínőleg csökkent virulenciájának köszönhetı (Pfaller és Diekema 2007, Pfaller és mtsai 2008/b). C. orthopsilosis és C. metapsilosis 1980-ban a San Antonióban különös epidemiológiai esetbıl elsıként izolált C. parapsilosis törzseknek RFLP módszerrel elvégzett DNS polimorfizmus és az ITS1 szakasz szekvenciaanalízise alapján a fenotípusosan azonos fajt genetikailag heterogénnek találták, miszerint 3 különbözı csoportba (I. II., III., vagy A, B és C) sorolták. Az API 20 C AUX kereskedelmi kit által végzett vizsgálatokból kiderült, hogy biokémiai profiljuk sem teljesen azonos a C. parapsilosis izolátuméval. A C. metapsilosis és C. orthopsilosis izolátumok képesek növekedni D-xylitolt tartalmazó táptalajon, a C. parapsilosis-ra ez egyáltalán nem jellemzı. Legújabb vizsgálatok szerint biofilm képzıdést viszont mindhárom fajnál megfigyeltek (Tavanti és mtsai 2005, Lattif és mtsai 2009). A nemzetközi nevezéktanba a II. biotípushoz sorolt izolátumok a C. orthopsilosis, a III. biotípusba tartozó izolátumok pedig a C. metapsilosis néven kerültek besorolásra. Genetikailag a C. metapsilosis bizonyult a legheterogénebbnek (Tavanti és mtsai 2005). Ezek az új fajok leginkább a dél-amerikai országokban figyelhetık meg (Lockhart és mtsai 2008). Spanyolországban viszont a C. metapsilosis az 5., a C. orthopsilosis pedig a 6. leggyakoribb kórokozó (Gomez-Lopez és mtsai 2008).
A „psilosis”- csoportba tartozó fajok érzékenysége
Ami az érzékenységi viszonyokat illeti, az ARTEMIS felmérés eredményei elsıként jellemzik globális szinten a „psilosis”- csoportba tartozó fajok antifungális szerekkel szemben mutatott érzékenyégét. Noha az ARTEMIS vizsgálatok szerint elıfordulnak csökkent FLU érzékenységet mutató C. parapsilosis izolátumok, az izolátumok döntı része érzékeny a FLU iránt (MIC
90
= 0,5 mg/L)(Gomez-Lopez és mtsai 2008, Pfaller és Diekema 2007, Pfaller és
mtsai 2008/b).
21
Lockhart és mtsai (2008) közleménye szerint a vizsgált C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumok között nem fordultak elı FLU-rezisztensek. A csoporton belül a C. metapsilosis izolátumok voltak a legkevésbé érzékenyek a FLU-lal szemben (MIC90 = 1 mg/L) (Gomez-Lopez és mtsai 2008, van Asbeck és mtsai 2008). Ami a „psilosis”- csoportba tartozó fajok echinocandin (caspofungin, anidulafungin) MIC értékeit illeti, a C. parapsilosis izolátumok esetében emelkedett értéket (CAS MIC90 = 0,5 mg/L) mutattak a C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumokhoz képest (CAS MIC90 = 0,12 mg/L és CAS MIC90 = 0,25 mg/L). Ez a fajok közötti eltérés valószínőleg a sejtfalalkotók különbözıségével, illetve a glükán-szintetáz enzimmel szemben mutatott csökkent affinitással hozható összefüggésbe (Lockhart és mtsai 2008, Gomez-Lopez és mtsai 2008, van Asbeck és mtsai 2008). Bizonyított, hogy a C. parapsilosis, a C. orthopsilosis és a C. metapsilosis esetén a glükán-szintetáz enzim Fks1 alegységét kódoló fks1 gén „elsı forró területein” (hot-spot régiók) a 660-adik aminosav az echinocandin-érzékeny fajokban elıforduló prolin helyett alanin. C. orthopsilosis esetén egy másik, valin-izoleucin csere is megfigyelhetı a „második forró területen”. E cserék vizsgálatát az echinocandinok iránti csökkent érzékenység bizonyítására Garcia-Effron és munkatársai (2008) végezték el. Kimutatták, hogy a glükán-szintetáz enzim érzékenysége a „psilosis”- csoportba tartozó fajoknál 40500-ad részére csökken az echinocandinok iránt az érzékeny C. albicans-hoz képest. Ezzel jól magyarázhatók a „psilosis”- csoport esetén tapasztalható magasabb MIC értékek. Bár a glükán-szintetáz enzim Km értéke nem változik az aminosav-csere következtében, a „psilosis”- csoport minden tagja esetén a vmax értéke csökken (2,4-18,8ad részére) a vad-típusú izolátumokéhoz képest. Azaz, az echinocandinok iránti csökkent érzékenység, együtt jár a glükán-szintetáz enzim katalitikus aktivitásának a csökkenésével is. III. 3. A sarjadzó gombák azonosítása A kóroki szerep igazolása vagy kizárása, a leghatékonyabb terápia idıben történı megválasztása vagy akár epidemiológiai adatok nyerése érdekében a sarjadzó gombák korai izolálása, gyors és pontos, faj szintig történı azonosítása továbbra is a rutin mikrobiológiai laboratóriumok egyik legfontosabb feladata (Szalka és Simon 2000).
22
III. 3. 1. Sarjadzó gombák izolálása és azonosítása a mai rutin diagnosztikában III. 3. 1. a. Tenyésztés A rutin diagnosztikában a sarjadzó gombák tenyésztésére sokféle táptalajt használnak. Világszerte legismertebb ezek közül is a kloramfenikolt tartalmazó Sabouraud-féle glükóz agar táptalaj, amely szénforrásként glükózt, nitrogénforrásként peptont tartalmaz és savas kémhatású (Pincus és mtsai 2007). III. 3. 1. b. Csíratömlıképzés Csíratömlıképzés detektálására a Sabouraud agaron nıtt tenyészeteket fötális borjúszérumban szükséges inkubálni 1-2 órán át. Tenyésztés után a gombasejtek jellegzetes nyúlványokat, csíratömlıt képeznek (2. ábra). Ez a jelenség megfigyelhetı a C. albicans és Candida dubliniensis izolátumok esetében (Bikandi és mtsai 1998, Szabó és mtsai 2000).
2. ábra Csíratömlıképzés
III. 3. 1. c. CHROMagar szerepe néhány Candida faj azonosításában A Sabouraud agaron kitenyészett törzsek CHROMagar-Candida táptalajra (Becton Dickinson, New Jersey, USA) való átoltása leggyakrabban további azonosítás céljából történik. A gyárilag elkészített CHROMagar-Candida táptalajon az egyes gombafajok
23
különbözı színő telepeket képeznek 370C -on 24-48 órás inkubációs idı elteltével. A táptalajban lévı kromogén szubsztrátokat (a β-N-acetil-hexózaminidáz és a foszfatáz enzimek szubsztrátjai) a fajok különbözı színnel inkorporálják, aminek eredményeként a C. albicans kékeszöld színő, a C. krusei rózsaszín, míg a Candida tropicalis szürkéskék telepeket képeznek a táptalajon (Odds és Bernaerts 1994, Sóczó 2009). A C. albicans és C. dubliniensis fajok CHROMagaron való megjelenésük és mikroszkópos bélyegeik alapján gyakran összetéveszthetık. Így például egyes esetekben a C. dubliniensis 48 órára megjelenı sötétzöld színő telepei összetéveszthetık a szintén zöld színő telepeket képezı C. albicans-szal, míg más szerzık szerint a két faj jól elkülöníthetı egymástól (Odds és Bernaerts 1994, Kirkpatrick és mtsai 1998). Egyes nem-albicans Candida fajok (C. famata, C. guilliermondii, C. inconspicua, C. kefyr, C. lipolytica, C. lusitaniae, C. norvegensis és C. parapsilosis) igen változatos megjelenéső és színő telepeket képeznek CHROMagar táptalajon (Odds és Bernaerts 1994). Hospenthal és mtsai (2006) úgy találták, hogy a C. lipolytica, C. norvegensis és C. inconspicua nehezen különíthetı el a C. krusei fajtól, ilyen esetekben szükség lehet más azonosítási eljárásra is. III. 3. 2. Manuális és automatizált kiértékeléső kereskedelmi kitek alkalmazása az azonosításban Mivel a CHROMagar Candida csupán elızetes azonosításra szolgál, ezért pontos azonosítás céljából további vizsgálatokra van szükség. Ilyenkor jönnek szóba a biokémiai reakciókon alapuló manuális és automatizált kiértékeléső kereskedelmi kitek, melyek kiválasztásánál figyelembe kell venni a kivitelezhetıséget, az inkubációs idıt, a költségeket és a földrajzi elhelyezkedést is (Pincus és mtsai 2007).
III. 3. 2. a. Manuális kiértékeléső kereskedelmi kitek A forgalomban levı manuális tesztek között megemlítendı az API 20C AUX és az API Candida (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France), Auxacolor (Bio-Rad, Hercules, California), a Fungichrom és a Fungifast (International Microbio, Signes, France), illetve a RapID Yeast Plus system és Uni-Yeast-Tek (Remel, Incorporated, Lenexa, Kansas, USA) azonosító rendszerek (Pincus és mtsai 2007, 1. A. melléklet).
24
Magyarországon és az USA-ban is leggyakrabban használt az API 20C AUX és Auxacolor tesztek. Ezekkel kapott eredmények megfelelı értékeléséhez gyakran kiegészítı vizsgálatok (csíratömlıképzés, micéliumképzıdés vizsgálata, artrospórák vagy blasztokonídiumok vizsgálata, a telepek pigmentáltságának vizsgálata, tokfestés, eszkulin-teszt, hımérséklet-tolerancia vizsgálat) beállítása szükséges. A hagyományos módszerekkel összevetve a korrekt azonosítási arány 93,0-100 %-ra tehetı (Gutierrez és mtsai 1994, Ramani és mtsai 1998, 1. A. melléklet). Az API 20C AUX teszttel viszonylag megbízhatóan azonosíthatók a következı fajok: C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon fajok (FrickerHidalgo és mtsai 1996). A C. dubliniensis pontos azonosítása viszont ezzel a rendszerrel sem megoldott (Xu és mtsai 2002). III. 3. 2. b. Automatizált kiértékeléső kereskedelmi kitek A Magyarországon és Európában a máshol is elterjedt automatizált rendszerek közül leginkább ismert az API ID 32C (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) mikrotiter panel. Az USA-ban elterjedtek a VITEK (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Missouri, USA) változatai is: VITEK Yeast Biochemical Card, VITEK 2 ID-YST és a VITEK 2 YST tesztek (Oblack és mtsai 1981, Gutierrez és mtsai 1994, Riddle és mtsai 1994, Ramani és mtsai 1998, Pincus és mtsai 2007, 1. B. melléklet). Az automatizált azonosító rendszerek elınyére szolgál, hogy segítségükkel a klinikumban leggyakrabban elıforduló Candida fajok (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis és C. krusei) megbízhatóan és viszonylag gyorsan azonosíthatók (Graf és mtsai 2000, Sanguinetti és mtsai 2007). A VITEK kereskedelmi tesztek hiányossága, hogy az adatbázisukban nem találhatók meg olyan ritkán elıforduló fajok, mint a C. norvegensis, C. catenulata, C. haemulonii vagy a C. maltosa. A C. dubliniensis azonosítására az említett tesztek egyike sem alkalmas, és a C. inconspicua azonosítása úgyszintén nehézséget okoz (Verwij és mtsai 1999). Említésre méltó az API ID 32C kereskedelmi kit, mely 63 különbözı sarjadzó gomba faj azonosítására képes, s az azonosítási spektrum kiegészítı tesztekkel (növekedés 37 0
C-on, tokképzés, tusfestés, mikroszkópos bélyegek) még tovább bıvíthetı.
Adatbázisában megtalálhatóak a C. catenulata és a Geotrichum fajok is. A tesztet
25
gyakran referencia módszerként használják egyéb módszerekkel történı összehasonlító vizsgálatoknál (Pincus és mtsai 2007). Egyik hátránya, hogy a C. maltosa-t könnyen összetéveszti a C. dubliniensis-szel. A C. inconspicua és C. norvegensis azonosítását pedig még kiegészítı tesztek segítségével sem tudja megoldani a rendszer (Verwij és mtsai 1999, Majoros és mtsai 2003). Mindezen hiányosságok ellenére ez a teszt került bevezetésre a legtöbb hazai rutin laboratóriumban. III. 3. 2. c. A MICRONAUT-Candida System használata az azonosításban A teszt az élesztıgombák in vitro automata identifikálására szolgáló mikrotiter lemez. Az azonosító rendszer 96 üregő ELISA-lemezt használva egyidejőleg 4 különbözı izolátum azonosítását teszi lehetıvé. Adatbázisával 6 különbözı genusba tartozó 31 faj azonosítása lehetséges. Név szerinti felsorolásukat a 2. A mellékletben található lista tartalmazza, mely az adott gombafajnak megfelelı anamorf alakját mutatja. Amint a mellékletbıl is látható, a rendszer képes megkülönböztetni a C. famata 4 féle biotípusát, de adatbázisa nem tartalmazza a fontosabb sarjadzó gombák közül a C. parapsilosis korábbi II. és III. biotípusait (C. orthopsilosis és C. metapsilosis), a C. pulcherrima-t és a C. sake-t. A teszt 21 biokémiai reakció és 3 kontroll révén teszi lehetıvé a sarjadzó gomba fajok azonosítását ( 2. B és 2. C melléklet). Bár a teszt néhány klinikailag releváns sarjadzó gombát nem képes a gyártó szerint azonosítani, mindennek ellenére hasznosnak tőnik a rutin laboratóriumi munka számára. Fı elınye lehet, hogy már 24 óra alatt eredményt tud adni. Mindezek ellenére a tesztrendszerrıl a szakirodalomban egyedül a Haase és Schulze (2006) által közölt absztrakt tesz említést. İk az azonosító rendszerrel való vizsgálatok során 25 különbözı fajhoz tartozó 91 sarjadzó gomba izolátumot vizsgáltak, melyek fıleg referencia törzsek vagy molekuláris biológiai módszerrel (szekvenciaanalízissel) azonosított izolátumok voltak. A vizsgálatuk arra irányult, hogy milyen táptalajról (Sabouraud vagy CHROMagar-Candida) származó gombákkal elınyös a Micronaut-Candida táplemez inokulálása. A MICRONAUT-Candida tesztrendszert használva téves azonosítást tapasztaltak a C. dubliniensis, a C. guilliermondii, a C. lusitaniae, a C. tropicalis és a C. neoformans izolátumok esetében.
26
III. 3. 3. Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása az azonosításban III. 3. 3. a. rDNS gén amplifikáción alapuló azonosítás A gombák riboszómális RNS (rRNS) génjei az rDNS-ben tandem módon ismétlıdnek. Ezek az ismétlıdı szakaszok tartalmazzák a riboszóma 18S, az 5,8S kis- és a 26S nagy alegységeit kódoló rRNS génjeit. Ezeket a szakaszokat az ITS és IGS régiók fogják közre. Míg az rRNS-t kódoló régiók konzervatívak, addig az ITS szekvenciák igen változékonyak. A leginkább ismert szekvenciájú (18S, 5,8S és a 26S alegységeket kódoló) szakaszok konzervatív bázissorrendjük révén alkalmas helyet biztosítanak univerzális primerek kapcsolódásához, melyek segítségével a magas variábilitást mutató ITS szakaszok amplifikálása lehetséges. Az így kapott DNS-ek változékonyak, melyek endonukleázzal történı hasítást követı elektroforézis során a fajra jellemzı mintázatot adnak. Ezáltal a klinikailag fontos Candida fajok pontos azonosítása néhány órán belül faj szintig is megoldható. A módszerrel adott helyes azonosítás egyes irodalmi adatok szerint 96-99,7%-ra becsülhetı (3. ábra, Leaw és mtsai 2006, Pincus és mtsai 2007). Az ITS2 PCR termék hossza alapján történt azonosítás megbízhatóan megkülönbözteti a C. albicans és C. dubliniensis törzseket is (Fell 1993, Trost és mtsai 2004). 5’
18 S rDNS
ITS1
5,8 rDNS
ITS2
25/28S r DNS
3. ábra A gombák riboszóma alegységeit kódoló rDNS szakaszok (Pincus és mtsai 2007) III. 3. 3. b. Egyéb PCR-alapú és más molekuláris biológiai módszerek Új PCR-elven mőködı technikához sorolható a real-time PCR, mely fajspecifikus primerek segítségével lehetıvé teszi a sarjadzó gombák faj szintig történı azonosítását. Multiplex PCR segítségével pedig ugyanabból a mintából többféle faj azonosítása is lehetséges (Chang és mtsai 2001, Mackay 2004, Pincus és mtsai 2007). A helyes azonosítási képessége a módszernek hagyományos módszerekkel összevetve 99%-ra tehetı (Ahmad és mtsai 2002).
27
3’
A PCR termékek restrikciós endonukleázzal történı hasításán alapul a PCR-RFLP módszer, mely egyszerő, gyors és szintén hasznosnak bizonyult a fajszintő azonosításban (Trost és mtsai 2004). Említésre méltó az AFLP, NASBA, FISH és az áramlási citometria is (Page és mtsai 2005, Pincus és mtsai 2007).
28
III. 4. Antifungális szerek és az antimikotikus kezelés farmakológiája Noha az utóbbi 20 évben messzemenı fejlıdés figyelhetı meg a gombainfekciók kezelésében, mégsem mondhatjuk, hogy ezen a területén a terápia 100%-os biztonsággal megoldott. Az újabb antifungális szerek megjelenése valóban hatékony elırelépést jelent a terápiában (Szalka és Simon 2000). A régebbi és az újabb gombaellenes szereknek alapvetıen három támadáspontja lehetséges (4. ábra): 1. az ergoszterol bioszintézisének a gátlása és a már kialakult sejtmembrán permeabilitásának fokozása, 2. a gombasejt DNS-szintézisének gátlása, 3. a sejtosztódás gátlása (Szalka és Simon 2000)
Gombasejt
Sejtmembrán és sejtfal
Protein β-glükán Kitin
Kettısrétegő lipidmembrán 5-Flucitozin β-glükánszintetáz Poliének
Ergoszterol
Azolok
Echinocandinok
Lanoszterol
Mannoprotein
lanoszterol-14-α-demetiláz
4. ábra Egyes antifungális szerek lehetséges támadáspontjai a gombasejtben (Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. 2007. Basic and Clinical Pharmacology, http://www. accessmedicine. com)
29
III. 4. 1. Antifungális szerek fungicid és fungisztatikus hatása A terápiában használt antifungális szerek fungisztatikus vagy fungicid hatása faj- és izolátum-függı (Pfaller és mtsai 2004/d). Funigcidnek tekinthetı egy szer, amikor in vitro a kezdeti csíraszámhoz viszonyítva ≥ 99,9%-os CFU/mL csökkenés következik be, ez 3log10 egységnek megfelelı csíraszám csökkenést jelent. Fungisztatikus hatás esetén in vitro < 99,9%, azaz < 3log10 csökkenés tapasztalható a sejtszámban (Pfaller és mtsai 2004/d, Klepser és mtsai 1998). A továbbiakban a jelenleg elérhetı, szisztémás kezelésre alkalmazható fontosabb antifungális szerek ismertetésére kerül sor, az újabb triazol típusú antifungális szereket is beleértve (FLU, VOR, POS). III. 4. 2. Sejtmembránt károsító poliének A poliének egy 26-28 tagú, észter vagy laktonkötéssel kapcsolódó, 7 konjugált kettıs kötést hordozó makrolid győrőbıl állnak (3. melléklet). A molekula egyik oldala a számos hidroxil csoportnak köszönhetıen hidrofil, míg a másik, hidroxil csoportot nem tartalmazó oldala hidrofób. Hidrofób oldala által a membánt alkotó szterolokhoz kötıdhet, ami a molekulának a membrán lipid rétegeibe való beágyazódását eredményezi, ezáltal lehetıvé téve a molekula hidrofil részének, hogy vizes pórust képezzen, ami az elektrolitok és a sejtplazma alkotóinak átszivárgását vonja maga után (Ghannoum és Rice 1999, 2004). Az AMB az egyetlen alkalmazható polién, ami szóba jöhet szisztémás mikózisok kezelése esetén is (Cantón és mtsai 2003, 2004, Pappas és mtsai 2004). Korábban úgy vélték, hogy a poliének fungicid hatással rendelkeznek, ma már bizonyított, hogy fungicid hatása koncentráció- és fajfüggı, in vivo körülmények között döntıen csak fungisztatikus hatás érhetı el a szerrel (Ghannoum és Rice 1999, 2004, Lewis és mtsai 2006). Az AMB a C. albicans, C. dubliniensis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans és a C. inconspicua fajokkal szemben in vitro már 2 mg/L-es koncentrációban fungicid hatású 1-6 órás inkubáció elteltével (Keele és mtsai 2001, Cantón és mtsai 2004). A C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis esetében hasonló koncentrációban használva a szert csak
30
hosszabb inkubációs periódus (36-48 óra) után jelentkezett annak fungicid hatása (Cantón és mtsai 2004, Majoros és mtsai 2006). A C. tropicalis törzsek még a 48 órás kezelést is túlélhetik (fungisztatikus hatás), ahogyan azt in vitro végzett vizsgálatok is alátámasztják (Cantón és mtsai 2004). Az AMB univerzális szerként való használata nem javasolt, mivel a maximális szérum koncentráció (1mg/L) legtöbb esetben csak magas dózis adagolásával érhetı el (Lewis és Wiederhold 2003). A toxikus hatások csökkentése érdekében az AMB újabb alkalmazási formáit dolgozták ki. Ilyenek a lipid-asszociált AMB készítmények, az AmBisome (Fujisawa Healthcare, Deerfield, IL., USA) és az Abelcet (Liposome, Princeton, NJ., USA). Ugyancsak mellékhatásmentes dózisemelést tesz lehetıvé a nátrium-koleszteril-szulfát és az AMB stabil komplexének kialakítása, az Amphocil (Sequus Pharmaceutical, Menlo Park, USA) (Wingard és Leather 2004). III. 4. 3. A DNS szintézist gátló 5-fluorocitozin Az 5-FC nukleinsavszintézist gátló pirimidin-származék (3. melléklet). Önmagában az 5-FC molekulának nincs gombaölı hatása. A gomba sejtfalba kerülve 5-fluorouracillá alakul, melynek további átalakulásával olyan anyagcsere termékek keletkeznek, melyek a gomba DNS szintézisét gátolják (Vermes és mtsai 2000/a,b). Régi gombaellenes szer, de gombaellenes hatását leginkább a Candida fajokra és a Cryptococcus neoformans-ra írták le. A monoterápia során esetlegesen fellépı másodlagos rezisztencia miatt önmagában nem, de más gombaellenes szerekkel kombinálva jól használható a sarjadzó gombák okozta szisztémás fertızések kezelésében (Vermes és mtsai 2000/a, b). Legtöbb Candida fajjal szemben fungisztatikus hatást fejt ki, fungicid hatása pedig izolátum- és fajfüggı. A C. lusitaniae-val és C. inconspicua-val szemben mutatott fungicid viselkedését több közlemény is leírja (Ernst és mtsai 2002/b, Majoros és mtsai 2005/a). Korábbi közlemények szerint az 5-FC gyorsan szívódik fel, az orális adagolást 76-89 %-os biohasznosulás jellemzi. Ép vese funkcióval rendelkezı személyeknél a szérumban és más tesfolyadékokban csúcskoncenrációját 1-2 óra alatt éri el (Cutler és mtsai 1978, Vermes és mtsai 2000/a,b). Felnıtteknél a javasolt napi adag 6 óránként
31
37,5 mg/kg lehet, míg veseelégtelenségben szenvedık esetén napi egyszeri 37,5 mg/kg dózis javasolt (Daneshmend és Warnock 1983, Vermes és mtsai 2000/a,b). III. 4. 4. Echinocandinok Az echinocandinok a gombaellenes szerek viszonylag új csoportját alkotják. Győrős lipopeptidek N-acil alifás vagy aril-zsírsav oldallánccal (3. melléklet). A sejtfal szintézisében
fıszerepet
játszó
β-1,3-glükán-szintetáz
enzimet
gátolva
hatnak,
csökkentve a glükán polimer sejtfalkomponensek szintézisét, ezáltal instabillá téve a gomba sejtfalát (Denning 2003, Deresinski és Stevens 2003, Stevens és mtsai 2006). Jelenleg az FDA által is engedélyezett és forgalomban levı echinocandinok a caspofungin, micafungin és az anidulafungin (Stone és mtsai 2002, Denning 2003, Pfaller és mtsai 2005, 2006/b, Kauffman és Carver 2008). Pfaller és a munkatársai (2006/a) által végzett felmérések szerint a vizsgált Candida izolátumok a CAS MIC értékek szerint két csoportra bonthatók. A legérzékenyebbnek a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és C. kefyr bizonyult (MIC90: 0,03-0,06 mg/L). A C. parapsilosis és C. krusei izolátumok kevésbé voltak érzékenyek a CAS iránt (MIC90 = 0,5 mg/L). A C. guilliermondii esetében pedig a CAS MIC leggyakrabban ≤ 1 mg/Lnek mutatkozott. Leginkább csökkent CAS-érzékenységet mutató izolátumok a C. parapsilosis és C. guilliermondii fajok esetén fordultak elı (MIC ≥ 2 mg/L), ami valószínüleg az fks1 génben jelen lévı aminosav polimorfizmusnak az eredménye (Pfaller és mtsai 2004/b, 2006/a). A relatíve magasabb MIC értékek ellenére, a C. parapsilosis esetében a CAS sikeres terápiás hatásáról számoltak be (Mora-Duarte és mtsai 2002). Idı-ölés görbék felvétele során a caspofungin és a micafungin a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei és a C. kefyr gombákkal szemben 24 órán belül, ≤ 1 mg/L-es koncentrációban fungicid hatást mutatott (Ernst és mtsai 2002/a, Di Bonaventura és mtsai 2004). A C. parapsilosis és C. guilliermondii fajokkal szemben viszont a szernek csak gyenge fungisztatikus hatását figyelték meg (Barchiesi és mtsai 2006, 2007). A CAS in vivo dózisfüggı fungicid hatását mutatták ki állatkísérletekben a C. albicans, C. krusei és a C. glabrata törzsekkel szemben is (Graybill és mtsai 1997, Barchiesi és mtsai 2005).
32
Mivel a fonalas gombákkal szemben inkább fungisztatikus hatásuk igazolódott, ezen a téren nem tudják átvenni az AMB szerepét. Terápiás szempontból elınyüknek tekinthetı, hogy esetükben nem alakul ki keresztrezisztencia más antifungális szerekkel szemben (Denning 2003, Majoros és Kardos 2008). A CAS-t magas fehérjekötıdés és nem-lineáris farmakokinetika jellemzi. Terápia során 77 kg-os átlagos testsúly esetén elsı nap 70 mg az adagolása, majd napi 50 mg adagolása javasolt. Alkalmazása súlyosabb gombafertızések esetén egyelıre korlátozott (Bal 2010). III. 4. 5. Sejtmembránt károsító azol típusú gombaellenes szerek Az azolokat az 1960-as évek végén fedezték fel. Mai napig ez a csoport alkotja a leggyorsabban fejlıdı és legszélesebb spekrumát az antifungális gyógyszereknek (Szalka és Simon 2000). Az azolok két nagy csoportra oszthatók (Szalka-Simon 2000, Ostrosky-Zeichner és mtsai 2003, MacCallum és Odds 2004, Pappas és mtsai 2004): - az imidazolok: ketokonazol, mikonazol, klotrimazol, stb. -és a triazolok: flukonazol, itrakonazol és a harmadik generációs azolok a vorikonazol, ravukonazol, posakonazol és albakonazol. Hatásmódjuk a citokróm P450 függı lanoszterol-14-α-demetiláz gátlásán alapul. Mivel a lanoszterol ergoszterollá való alakulása akadályozott, így az elıbbi akkumulálódik, az utóbbi mennyisége pedig a sejtmembránban csökken, aminek eredményeként a gombák növekedése gátolt (Ghannoum és Rice 1999, Sheehan és mtsai 1999, Szalka-Simon 2000, Wingard és Leather 2004). Az új triazolok affinitása az emlıs citokróm enzimekhez lényegesen kisebb, mint az imidazoloké, ezért ezeknek a gyógyszereknek kevesebb a mellékhatása, emiatt használatuk kedvezıbb a szisztémás gombaellenes terápiában (Szalka-Simon 2000, Pappas és mtsai 2004). III. 4. 5. a. Flukonazol A triazolok terjedése az 1990-as évek elején a FLU (3. melléklet) felfedezésével kezdıdött. Alkalmazása egyre jobban terjed, mivel igen hatásosnak tőnik a legtöbb Candida fajjal és a Crytococcus neoformans-szal szemben is. Lokálisan és szisztémás
33
kezelésekben is alkalmazható. Úgy a célzott, mint a profilaktikus kezelésben is egyaránt hatékony antifungális szernek bizonyult (Sheehan és mtsai 1999, Pappas és mtsai 2004). A FLU-t a csupán 11-12%-os protein kötıdése és kiváló szöveti megoszlása, beleértve a központi idegrendszert is, szinte egyedülállóvá teszi a többi antifungális szerhez képest. Jól mutatja ezt az a tény, hogy a liquorban mérhetı FLU koncentráció eléri a vérben mérhetı FLU koncentrációnak a 70-80%-át. A jelenlegi dozírozás napi 50 mg-tól akár 2000 mg-ig is terjedhet, bár a standard dózis felnıttek esetén napi 400 mg, míg gyerekeknél napi 6-12 mg/kg (Pfaller és mtsai 2006/e). Felnıtteknél, napi 100 mg, 400 mg és 800 mg dózisok esetén a szérumban mérhetı csúcskoncentrációk 6,7 mg/L, 20-30 mg/L, illeteve 40-60 mg/L lesznek. A szérumban mérhetı
átlagos
FLU-koncentrációk
az
egyes
dózisok
esetén
tapasztalható
csúcskoncentráció értékek felének felelnek meg. Így, napi 400 mg-os FLU dózis esetén ≥ 10 mg/L-es szérumkoncentráció könnyen biztosítható (Pfaller és mtsai 2006/e). In vitro és in vivo farmakodinámiai vizsgálatok alapján a FLU idı-függı és koncentrációtól független fungisztatikus hatással rendelkezik a Candida fajok ellen (Andes 2003, Andes és mtsai 2004). Mivel in vivo jelentıs a posztantifungális hatása is, ezért az adagolt FLU összdózisának kiemelt szerepe van a klinikai kimenetel szempontjából. Klinikai szempontból FLU esetén az AUC/MIC farmakodinámiai paramétert tartják a legjobb terápiás sikert jósló paraméternek, ahol a szérumban mért görbe alatti terület (AUC) reprezentálja a gyógyszer összdózisát. Pfaller és mtsai a 2006-ig összegyőlt klinikai adatokból azt a következtetést vonták le, hogy ha az AUC/MIC értéke ≥ 25, akkor 91-99%-os valószínőséggel terápiás siker várható (Pfaller és mtsai 2006/e). Bár a FLU-t fungisztatikus hatású antifungális szernek tartják, enyhe fungicid hatását in vitro és in vivo kísérletekben is igazolták. Mikamo és mtsai (2000) már igen kis koncentráción (0,125-4 mg/L) alkalmazva fungicid hatásúnak találta C. parapsilosisszal szemben. Az idı-ölés görbe vizsgálatokban néhány C. lusitaniae törzzsel szemben is fungicid hatást mutatott 24 órás inkubációt követıen (Ernst és mtsai 2002/b). A C. krusei természetes FLU-rezisztenciával rendelkezik, a C. glabrata FLUérzékenysége dózisfüggı, in vitro gátláshoz magas koncentrációban kell alkalmazni, egyes C. glabrata izolátumok pedig kifejezetten rezisztensek, ami leginkább a CgCDR1
34
és CgCDR2 transzporterek jelenlétével van összefüggésben (Diekema és mtsai 2002, Pfaller és mtsai 2004/a, Kanafani és Perfect 2008). Az invazív gombafertızést okozó C. dubliniensis törzseknél leírt FLU-rezisztencia az érzékeny törzsekkel szemben gyakran szubterápiás dózisban adagolt FLU használattal hozható összefüggésbe (Moran és mtsai 1998, Martinez és mtsai 2002). Nem elhanyagolható elınye, hogy az összes többi, újabban felfedezett azolokkal szemben enyhébb toxicitással rendelkezik és szájon keresztül adagolva is jól hasznosul (Sheehan és mtsai 1999, Wingard és Leather 2004). III. 4. 5. b. Itrakonazol Az azolok újabb generációját képezi (3. melléklet). Nemcsak Candida és Cryptococcus izolátumokkal szemben mutat jó in vitro aktivitást, de coccidiomycosis és histoplasmosis okozta fertızésekben is jól alkalmazható (Maertens és Boogaerts 2005). Idı-ölés görbék felvételével 5 mg/L-es koncentrációban korlátozott fungicid aktivitását (87-97,7%-os ölési aktivitás) igazolták A. fumigatus, A. niger, A. flavus izolátumokkal szemben (Manavathu és mtsai 1998). Per os nehezen abszorbeálódik, adagolása intravénásan a legkedvezıbb és leginkább tolerált. Nem-lineáris farmakokinetika jellemzi, így kissé megemelt dózisa jelentısen megnöveli a szérum koncentrációját (Espinel-Ingroff 2001). Más azolokhoz hasonlóan, az itrakonazol is a P450 izoenzimen keresztül metabolizálódik,
így
más
gyógyszerekkel
való
egyidejő
adagolása
során
gyógyszerkölcsönhatások léphetnek fel. Minthogy intravénás formája a vesén keresztül távozik, így vesebetegségben szenvedık esetén inkább per os alkalmazása a javasolt (Wingard és Leather 2004). III. 4. 5. c. Vorikonazol A VOR egy FLU-származék, a három azol-csoport egyikét egy fluor-pirimidin csoporttal helyettesítették és a propil vázhoz egy extra metil-csoportot kapcsoltak (3. melléklet, Ghannoum és Rice 1999, 2004; Sheehan és mtsai 1999, Majoros és Kardos 2008). Szélesebb hatásspektrummal rendelkezik a penész- és élesztıgombákkal szemben, mint a korábban említett azolok.
35
A szérumban nagyobb mértékő (58%-os) a fehérjékhez való kötıdése, mint a FLU-nak, a liquorban a szérumszint 60%-a, míg az üvegtestben 38%-a mérhetı. Javasolt, hogy a VOR szérumszintje 2-6 mg/L között legyen a terápia során (Goodwin és Drew 2008). A legújabb vizsgálatok viszont azt mutatják, hogy betegtıl függıen eltérés van a klinikailag hatékony és a már toxikus szérumszintek között. Amennyiben a VOR átlagos
szérumkoncentrációja
1
mg/L,
akkor
gyakori
terápiás
sikertelenség
tapasztalható. Ha viszont, a VOR szérumkoncentrációja elérte a ≥ 5,5 mg/L-t, akkor súlyos mellékhatások jelentkezhetnek, beleértve az enkefalopátiát is (Pascual és mtsai 2008). Ezek az adatok mindenképpen azt jelzik, hogy a VOR koncentrációját a szérumban ellenırizni kell a terápia során (Lewis 2008). Egyes szerzık idı-ölés görbe vizsgálatai szerint a VOR fungisztatikus hatást fejt ki a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. kefyr és Cryptococcus neoformans fajokkal szemben (Klepser és mtsai 2000, Di Bonaventura és mtsai 2004). A C. lusitaniae-val végzett vizsgálatokban csak néhány izolátummal szemben volt kimutatható fungicid hatás (Morace és mtsai 2005). Immunszupprimált állatokkal végzett kísérletekben 10 mg/kg dózisban adagolva hatásosnak bizonyult invazív aspergillosis és trichosporonosis fertızésekben is (Kirkpatrick és mtsai 2000, Serena és mtsai 2006). Invazív aspergillosis és fusariosis terápiában elsıként választandó szer, mivel sokkal hatékonyabbnak bizonyult az AMBnél. Elınyére vall még, hogy kevésbé toxikus és jól tolerálható (Wingard és Leather 2004). III. 4. 5. d. Posakonazol A triazolok legújabb, kereskedelmi forgalomban levı tagja. Alapvázát egy furán győrő képezi, hosszú oldallánca van, mely több kötıdési helyet biztosít a targetként szolgáló CYP51 molekula számára (3. melléklet, Bennett és mtsai 2006). A jelenleg forgalomban levı orális formulációja lipofil tulajdonságú, jól tolerálható. Biohasznosulásban felülmúlja az AMB-t, így alkalmazása elınyösnek tekinthetı invazív aspergillosis fertızésekben (Cornley és mtsai 2007). Dózisfüggı kinetikájából adódóan 400 mg orális szuszpenzió adagolása napi kétszer sokkal elınyösebb terápiás szempontból, mint a magasabb napi egyszeri 600 vagy 800 mg-os dózisok (Cornley és mtsai 2007).
36
A POS hatásspektruma hasonló a VOR hatásspektrumához. Enyhe fungicid hatását (≤ 95% ölési ráta) igazolták olyan penészgomba fajokkal szemben is, mint a Mucor, Penicillium és a Paecilomyces (Cuenca-Estrella és mtsai 2006, Sóczó 2009). A POS MFC értékek a C. krusei, C. lusitaniae és a C. neoformans esetében közel állnak a megfelelı MIC értékekhez (Espinel-Ingroff és mtsai 1998, Sóczó 2009). A C. krusei, C. inconspicua, C. lusitaniae és C. kefyr fajokkal való idı-ölés görbék felvétele során 24 órára a fungicid hatás nem volt mindig elérhetı, míg 48 órán belül 1 mg/L koncentrácónál az összes vizsgált 99,9%-os csíraszám csökkenést mutatott (Sóczó és mtsai 2007/a). A C. albicans, a C. glabrata, a C. tropicalis, a C. parapsilosis és a C. guilliermondii ellen a POS fungisztatikus hatásúnak bizonyult. Ezek az eredmények a C. parapsilosis kivételével összhangban voltak a megfelelı MFC értékekkel (Sóczó és mtsai 2007/a). Figyelembe véve azt a tényt, hogy a FLU széleskörő használata (profilaxis és empirikus terápia is) már jelenleg is jelentısen megváltoztatta a sarjadzó gombák epidemiológiáját (nıtt a C. glabrata és C. krusei által okozott fertızések száma) megfontolandó, hogy a FLU helyett a POS-t használják profilaxisra. A POS profilaxis hatékonyabb az invazív fertızések megelızésében, illetve a candidiasis okozta halálozási arány csökkentésében neutropéniás betegek esetén akár a FLU, akár az ITR profilaxissal hasonlítjuk össze (Cornely és mtsai 2007). Összességében, jelenleg a posakonazol tőnik a leghatékonyabb antifungális szernek a legtöbb fonalas-, sarjadzó gomba, de egyes dimorf gombák okozta fertızésekben is (Majoros és Kardos 2008, Wingard és Leather 2004). Fı hátránya, hogy jelenleg csupán per os formája érhetı el. A hosszú alkil-oldalláncának köszönhetıen a keresztrezisztencia megjelenésének valószínősége is jelentısen kisebb a többi azolokhoz (Xiao és mtsai 2004, Munayyer és mtsai 2004). III. 4. 5. e. Ravukonazol, albakonazol Ezeket az antifungális szereket a klinikai gyakorlatban nem használják, így terápiás hatásukra vonatkozó szakirodalmi adatok is hiányosak, valamint e gyógyszerek fejlesztése, tanulmányozása is szünetel (Girmenia 2009).
37
III. 5. In vitro érzékenységi vizsgálatok A gombák antimikotikumok iránti aktivitásának megállapítása bonyolultabb feladat, mint az antibakteriális szerekkel történı érzékenységi vizsgálatok. Ennek ellenére az in vitro tesztelés nagyon fontos a klinikai anyagból származó törzsek rezisztenciájának vizsgálatában (Szalka és Simon 2000). A vizsgálatok során az eredményt több tényezı befolyásolja: a tenyésztıközeg minısége, az inokulum nagysága, az inkubációs idı és hımérséklet, valamint az értékelési idıpontok kiválasztása (Rex és mtsai 2001). III. 5. 1. Standard mikrodilúciós módszer III. 5. 1. a. A módszer leírása és kivitelezésének feltételei A kezdetben makrodilúciósként definiált módszert mikrodilúciós formává adaptálták. Többéves munka eredményeként 1997-ben készült az NCCLS által leírt útmutató, melynek 2002-ben készült el módosított változata, az M27-A2 (2002) dokumentum. Jelenleg, a legújabb változat, az M27-A3 (2008) is elérhetı. Az útmutató tartalmazza a módszer beállítását igénylı standard körülményeket és az interpretálás kritériumait (NCCLS M27-A2 2002). A leírás szerint a mikrodilúciós vizsgálatokra vonatkozó paraméterek (inokulum mennyisége, tápfolyadék, inkubációs idı, hımérséklet) jellemzıit a 2. táblázat foglalja össze.
38
2. táblázat. A mikrodilúciós vizsgálat NCCLS M27-A2 módszertani útmutató szerint standardizált paraméterei A mikrodilúciós vizsgálat Sor-
standardizált paraméterek és
szám
feltételek
Paraméterek jellemzıi
0,5 x 103-2,5 x 103 CFU/ml, mely 0,5 McFarland denzitású
1.
Csíraszám
2.
Tesztközeg
3.
Kivitelezés
Mikrodilúciós módszerrel 96 üregő lemezen.
4.
Hımérséklet
350C
5.
Inkubálás idıtartama
24-48 óra (Candida fajok), 72 óra (Cryptococcus fajok).
oldatnak felel meg. RPMI-1640, 7-es pH-jú 0,165 M-os MOPS pufferrel beállítva.
Spektrofotometriás leolvasásnál mindenképpen követelmény, 6.
Rázatás
de vizuális leolvasásnál is megkönnyíti az eredmények interpretálását.
A módszer tartalmazza a minıségi kontroll törzsek (C. krusei ATCC 6258 és C. parapsilosis ATCC 22019) 48 órás inkubációs idı után várható MIC értékeit az egyes antifungális szerekre vonatkozóan. Ez a dokumentum alternatív lehetıségeket is ajánl egyes paramétereket illetıen a pontosabb érzékenységi eredmények reprodukálása érdekében (rövidebb inkubációs idı, nagyobb kezdı csíraszám, pH változtatása, a táptalaj glükóz koncentrációjának emelése, stb.) (NCCLS M27-A2 2002).
III. 5. 1. b. A módszerrel kapott eredmények interpretálása
A MIC értékek leolvasása Candida fajok esetében 48, Cryptococcus fajokkal végzett vizsgálatoknál pedig 72 órára történik. Különös figyelmet igényelnek azonban a trailing növekedést mutató izolátumok. Ilyenkor a gomba a MIC értékig erıteljes, majd a MIC érték feletti üregekben csökkent növekedést mutat, azaz az izolátumok növekedésének csak parciális gátlása figyelhetı meg. A MIC érték leolvasása az üregek tartalmának pipettával történı homogenizálása után szabad szemmel vagy ELISA-leolvasó segítségével történhet (Rex és mtsai 2001, Lee és mtsai 2007, Agrawal és mtsai 2007, Coenye és mtsai 2008). A trailing növekedést mutató izolátumok esetében mindenképpen a 48 órára történı leolvasás a javasolt, mivel a trailing növekedés miatt a
39
valójában rezisztens faj 24 órára tévesen érzékenynek ítélhetı meg (Rex és mtsai 2001, Espinel-Ingroff és mtsai 2009). Nehezen határozhatók meg a MIC végpontértékek a paradox növekedést mutató izolátumoknál is, mely az alkalmazott antifungális szer alacsony és magasabb koncentráció értékén jelentkezik. Ez azt jelenti, hogy a MIC érték felett még legalább két üregben teljes növekedésgátlás van, de a még magasabb (pl. 8-16 mg/L) koncentráció értékeken ismét szabad szemmel is látható növekedés figyelhetı meg a lemez üregeiben (Arthington-Skaggs és mtsai 2000, Rex és mtsai 2001, Fleischhacker és mtsai 2008). Azoloknál és az 5-FC-nál 48 órára MIC értéknek azt a végpontot fogadják el, ahol a növekedésben prominens gátlás tapasztalható, ami spektrofotometriás leolvasásnál 80%-os, vizuális értékelésnél pedig 50%-os csökkenést jelent a növekedési kontrollhoz képest. AMB esetében az üregek teljes optikai feltisztuláshoz tartozó végpont jelenti a MIC határértéket (Rex és mtsai 2001). A módszer által interpretálható érzékenységi kategóriákat a Candida fajokra vonatkozóan a 3. táblázat foglalja össze. 3. táblázat. Candida fajok antifungális szerekkel szemben mutatott in vitro érzékenységének interpretálása az NCCLS M27-A2 útmutató alapján Az izolátumok MIC értékek szerinti elkülönítése Dózisfüggıen-
Mérsékelten
Érzékeny (É)
érzékeny (DÉ)
érzékeny (MÉ)
mg/L
mg/L
mg/L
FLU
≤8
16-32
-
≥ 64
ITR
≤ 0,125
0,25-0,5
-
≥1
5-FC
≤4
-
8-16
≥ 32
Antifungális szer
Rezisztens (R) mg/L
A CAS MIC leolvasás végpontja korábban a 24 órás részleges, illetve a 48 órás teljes gátláson alapult. Jelenleg a 24 órás részleges gátlást tartják a leginkább elfogadhatónak. Pfaller és mtsai (2008/c) által végzett vizsgálatok alapján CAS és más echinocandinok esetében is ≤ 2 mg/L-es MIC értékkel a Candida izolátumok az érzékeny (É) kategóriába sorolhatók. Rezisztensnek (R) azokat az izolátumokat tartják, amelyeknek a MIC értéke ≥ 4 mg/L. Ilyen izolátumokat egyelıre keveset találtak, fıleg immunszupprimált daganatos betegeknél írták le azokat. Állatkísérletek során viszont
40
gyakrabban bizonyították jelenlétüket (Pfaller és mtsai 2008/c, Kofteridis és mtsai 2009, Diekema és mtsai 2009). Újabban a CLSI M27-A3-as dokumentumban (2008) az echinocandinokra és a VOR-ra vonatkozó MIC határértékek is megtalálhatók. III. 5. 1. c. A MIC eredményeket befolyásoló körülmények Oldószer hatása a vizsgálatra
Egyes antifungális szerek (CAS és FLU) feloldása desztillált vízzel, a többi antifungális szer esetében, pedig dimetil-szulfoxiddal (DMSO) lehetséges (NCCLS 2002). Az irodalmi adatok szerint a DMSO helyett polietilén-glikol (PEG) is alkalmazható. Ilyenkor a MIC értékek 1-2 hígítási fokkal alacsonyabbak lehetnek a vizsgált törzsek többségénél (Ostrosky-Zeichner és mtsai 2003, Sóczó és mtsai 2007/a).
Táptalaj hatása a vizsgálatra
A mikrodilúciós vizsgálatok során kapott MIC értékeket az alkalmazott táptközeg is befolyásolhatja. Több esetben tapasztalták, hogy az „antibiotikum medium 3” (AM3) táptalajban a sarjadzó gombáknak jobb a növekedése, mint az RPMI-1640-es tápközegben,
valamint
határozottabb
végpontokat
is
kaptak.
Leginkább
az
echinocandinok esetén csökkent a MIC érték az AM3 táptalajban és az antifungális szer ölı hatása is ebben a tesztközegben korábban jelentkezett (Bartizal és Odds 2003, Fleischhacker és mtsai 2008, Varga és mtsai 2008, Sóczó 2009). III. 5. 2. E-teszt A kereskedelemben hozzáférhetı tesztcsík, melyet az in vitro érzékenységi vizsgálatra használnak. A klinikai gyakorlatban is megbízhatóan alkalmazhazó számos antifungális szer in vitro vizsgálatára. Megbízható eredményeket ad az AMB rezisztens izolátumok vizsgálatánál is (Rex és mtsai 2001, Sóczó 2009).
41
III. 5. 3. Az érzékenység meghatározására szolgáló egyéb kereskedelmi kitek A kereskedelmi forgalomban kapható számos kit közül a Fungitest (Sanofi Diagnostics Pasteur, Paris, France) 6 különbözı, 2 féle koncentrációban beállított antifungális szer MIC értékeinek meghatározását végzi el. A rutin diagnosztikában való alkalmazása kevésbé megbízható (Swinne és mtsai 1999). Jól bevált kit és a klinikai rutinban is használható az ATB Fungus panel (bioMérieux, Marcy-l'Etoile, France) (Druetta és mtsai 1993). III. 5. 4. Az antifungális szerek fungicid és fungisztatikus hatását vizsgáló módszerek III. 5. 4. a. Az MFC meghatározását szolgáló módszer Az MFC érték meghatározásához emelt, 104 CFU/ml kezdı csíraszámot kell alkalmazni. A módszer szerint az antifungális szer akkor tekinthetı fungicid hatásúnak, ha a MIC értékek leolvasása után a 96 üregő lemez, növekedést nem mutató üregeinek a teljes tartalmát (200 µl) Sabouraud táptalajra kioltva 48 órára (inkubálás 350C-on) 3-4 telepnél nem nı ki több (Cantón és mtsai 2003). Egyes szerzık sikeresen alkalmazták ezt a módszert a sarjadzó gombák AMB iránti MFC értékének a meghatározására (Canton és mtsai 2003). A módszerrel kapott eredmények jól korreláltak az idı-ölés görbék felvételekor nyert eredményekkel (Pfaller és mtsai 2004/d, Sóczó 2009). III. 5. 4. b. Antifungális szerek fungicid és fungiszatikus hatásának vizsgálata idı-ölés görbék segítségével Az idı-ölés görbék felvétele standardizált módszer a Candida és Cryptococcus neoformans fajok antifungális szerekkel való tesztelésére (Pfaller és mtsai 2004/d). A vizsgálatot RPMI-1640 vagy AM3 tápközegben szükséges elvégezni 5 ×105 CFU/mL kezdı csíraszám mellett. A vizsgált antifungális szer koncentrációja 0,5-16 x MIC értéken belül változhat, a tenyészet végtérfogatát pedig 10 ml-re kell beállítani (Klepser és mtsai 1998, Pfaller és mtsai 2004/d). A csíraszámváltozás meghatározáshoz a folyamatosan rázatott tenyészetekbıl különbözı idıpontokban (0, 2, 4, 8, 12, 24, 48 óra) 35 0C-on történı inkubálást
42
követıen mintát kell venni. Tízes léptékő hígítások után, 4 x 30 µl mintát kell kicseppenteni 2-2 darab Sabouraud agar táptalajra (Pfaller és mtsai 2004/d). A mikrodilúciós módszerhez hasonlóan az idı-ölés görbék felvételekor kapott eredményeket nagyban befolyásolja a tápközeg. Ezt igazolja az is, hogy az echinocandinok fungicid hatása RPMI táptalajban koncentráció- és fajfüggı, az AM3 táptalajban pedig általában fungicidek a Candida fajok esetén (Ernst és mtsai 1999, 2000, Espinel-Ingroff 2001). A módszer idıigényessége és költsége miatt a rutin diagnosztikában nem használható. A fonalas gombák idı-ölés görbék felvételeit illetıen még kevés irodalmi adat áll rendelkezésre (Manavathu és mtsai 1998). III. 5. 4. c. Az idı-ölés görbék alkalmazásának speciális esete Paradox növekedés (Eagle-effektus)
Ez a jelenség az echinocandinok csökkent in vitro aktivitását jelenti a szer magas koncentráció értékén, de nem közvetlen a MIC feletti koncentráció értéken (Stevens és mtsai 2004). Említést érdemel, hogy a különbözı sarjadzó gombák esetében észlelt paradox növekedés sem az fks1-ben bekövetkezı mutációval, sem a glükán-szintetáz echinocandionkkal szemben mutatott szenzitivitásának a módosulásával nem mutat összefüggést.
Paradox
növekedés
esetén
valószínőleg
egy
alkalmazkodási
mechanizmusról van szó a környezeti stresszhatások iránt, ami által a gomba képes túlélni a kompenzatorikus kitinszintézis eredményeként (Stevens és mtsai 2004, 2005, 2006). A stresszválasz során a Wsc1 és a Mid2 receptorok közvetítik az echinocandinokra, mint stresszhatásra beinduló választ a glükán-szintetáz szabályozó alegysége, a Rho1 felé. Az Rho1 aktiválja a protein-kináz-1 enzimet, ezáltal a protein-kináz-C sejtintegritásért felelıs reakcióútvonalát is (Perlin 2007). A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy a hısokk protein 90 (Hsp90) az egyik fı szabályozó szerepet tölti be az antifungális szerekre adott válaszban sarjadzó és penészgombák esetén is. A Hsp90 ugyanis a Ca2+calcineurin katalitikus alegységével kapcsolatba lépve aktiválja azt, majd az aktivált Ca2+-calcineurin a Crz1 transzkripciós faktoron keresztül aktiválja az Fks1-et (Cannon és msai 2007, Cowen 2009, Singh és mtsai 2009). A glükán-szintetáz enzim aktiválódása
43
mellett beindul a kompenzatórikus kitinszintézis is (Stevens és mtsai 2004, 2006). A C. albicans esetén megfigyelt négyféle kitin-szintetáz (CaChs1p, CaChs2p, CaChs3p és CaChs8p) közül echinocandin hatására a Ca2+-calcineurin-komplex által fıleg a CaChs2p-, és CaChs8p-enzimek aktivitása növekszik. Ez azt jelzi, hogy ez a két enzim a fı
felelıs
az
echinocandinokra
adott
stresszválasz
eredményeként
jelentkezı
kompenzatórikus kitinszintézis fokozódásáért (Walker és mtsai 2008). A paradox növekedést eredetileg a C. albicans izolátumoknál észlelték a CAS jelenlétében (Stevens és mtsai 2004). Az in vitro jelentkezı paradox hatást észleltek a C. tropicalis-szal felvett idı-ölés görbék esetében is (Sóczó és mtsai 2007/b). Ez azt jelentette, hogy a MIC feletti értékek valamelyikén fungicid hatás kezdıdött, amely legalább két vizsgált koncentráción kimutatható volt. A legmagasabb (6,25-12,5 mg/L) vizsgált CAS koncentrációkon azonban ismét csak fungisztatikus hatás volt észlelhetı (Sóczó és mtsai 2007/b). A C. dubliniensis izolátumok 63%-nál írtak le az Eagleeffektust micafungin jelenlétében, míg a caspofungint használva az izolátumok 91%-a adta a jelenséget. Anidulafungin jelenlétében a hatás nem volt tapasztalható (Eagle 1948, Jacobsen és mtsai 2007, Fleischhacker és mtsai 2008). Varga és mtsai (2008) a C. dubliniensis izolátumokkal felvett idı-ölés görbék esetében is tapasztalták a paradox növekedést. Irodalmi adatok az echinokandinok C. parapsilosis-szal tapasztalt paradox hatásáról is beszámolnak (van Asbeck és mtsai 2008). Az eddigi közlemények szerint az echinocandinok paradox hatása nagyban függ a táptalaj jellegétıl és a kezdeti csíraszámtól. Varga és mtsai (2008) szerint C. dubliniensis esetében valódi paradox jelenség AM3 táptalajt alkalmazva volt elérhetı, míg az RPMI-1640 jelenlétében a trailing jelenséget írták le. Az általuk végzett vizsgálatokban az MFC módszerrel és az idı-ölés görbék felvételével kapott eredmények is igazolták a paradox jelenséget.
44
IV. Célkitőzések 1. Munkánkban célul tőztük ki a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézetében izolált, klinikai szempontból jelentısebb 264 Candida izolátum és több ATCC kontroll törzs összehasonlító vizsgálatát a Micronaut-Candida System azonosító rendszer és az API ID 32C segítségével. Rutint szerezve az új azonosító rendszer használatában, arra törekedtünk, hogy a rendszert a mindennapi gyakorlatba is bevezessük. 2. További
célunk
volt
a
flukonazol
és
az
amphotericin
B
in
vitro
farmakodinámiájának a tanulmányozása csökkent flukonazol-érzékenységő C. inconspicua izolátumokkal szemben idı-ölés görbék felvétele segítségével. 3. Célul tőztük ki a „psilosis”- csoporton belül elkülönített C. metapsilosis és C. orthopsilosis törzsek viselkedésének tanulmányozását caspofungin jelenlétében az idı-ölés görbék felvétele segítségével RPMI-1640 és AM3 tápközegben. 4. Megvizsgáltuk a terápiában legrégebben használt amphotericin B és 5fluorocitozin, illetve három triazol, a flukonazol, a vorikonazol és a posakonazol in vitro aktivitását C. dubliniensis izolátumokkal szemben az idı-ölés görbék segítségével.
45
V. Anyagok és módszerek V. 1. A sarjadzó gombák eredete V. 1. a. A MICRONAUT-Candida és API ID 32 C vizsgálatokhoz használt izolátumok Kísérleteinkben a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézetében, a 2005-2006-ig terjedı idıszakban izolált Candida fajok győjteményét használtuk fel a MICRONAUTCandida és az API ID 32 azonosítást igénylı vizsgálatokhoz. Kettıszázötvenöt izolált sarjadzó gomba (2005. november − 2006. áprilisi idıszakból) és 13 ATCC törzs vizsgálatára (C. albicans 14053, C. albicans 10231, C. parapsilosis 22019, C. tropicalis 750, C. krusei 6258, C. inconspicua 16783, C. norvegensis 22977, C. lusitaniae 38533, C. guilliermondii 6260, C. dubliniensis CD 36, C. pulcherrima 18406, C. famata 36239, C. rugosa 2142) került sor. Az izolátumok különbözı mintákból származtak (torok, köpet, vér, seb, vizelet, hüvely). Kilenc C. dubliniensis törzset a Szegedi Orvostudományi Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézetében izoláltak. A C. parapsilosis izolátumok esetében a szőkebb értelemben C. parapsilosis-nak azonosított törzseket használtuk fel a vizsgálatainkhoz (Tavanti és mtsai 2005). A kevésbé gyakori fajokat, mint a Trichosporon, Rhodotorula és a Geotrichum szintén a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézetében izolálták. V. 1. b. Idı-ölés görbék felvételéhez használt izolátumok Nyolc C. inconspicua törzset használtunk az idı-ölés görbék felvételéhez, melyek a DEOEC Orvosi Mikrobiológia Intézetébe érkezett betegek mintáiból tenyésztek ki (Majoros és mtsai 2003). Referencia törzsként az ATCC 16783 C. inconspicua törzset használtuk. Az idı-ölés görbék felvételéhez használt hat C. dubliniensis törzset a Szegedi Orvostudományi Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézete biztosította számunkra. Ezeket a C. dubliniensis izolátumokat már korábban, a magas variábilitású ITS2 régó amplifikációján és az ezt követı ovadáspont görbe analízisén alapuló valós idejő PCR módszerrel azonosították (Somogyvári és mtsai 2007, Varga és mtsai 2008).
46
A CAS-nal történı vizsgálatokhoz használt tizenhárom izolátumból két C. parapsilosis, három C. orthopsilosis és három C. metapsilosis törzs Arianna Tavanti olaszországi kollekciójából származott (Tavanti és mtsai 2005). Négy C. parapsilosis és egy C. metapsilosis izolátumot pedig a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet Diagnosztikai Laboratóriumában izoláltak. V. 2. A sarjadzó gombák izolálása és azonosítása V. 2. 1. Tenyésztés A sarjadzó gombák tenyésztésére Sabouraud agar táptalajt használtunk. V. 2. 2. Kereskedelmi forgalomban használt kitek segítségével A klinikai mintákból származó sarjadzó gomba izolátumok azonosítása érdekében az új MICRONAUT-Candida azonosító rendszert (Merlin Diagnostika, Gmbh, Borhneim, Germany) használtuk. Összehasonlítás céljából az izolátumok egyidejő azonosítása az asszimilációs teszteken alapuló API ID 32C (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) rendszerrel is megtörtént. A Sabouraud agar táptalajon frissen nıtt tenyészetek közvetlen vizsgálatára került sor úgy a MICRONAUT- Candida System azonosító-, mint az ID 32C rendszerrel. Ha az eredmények között nem volt eltérés, akkor a kapott eredményt véglegesnek tekintettük. Amennyiben a két módszerrel kapott eredmények között eltérés mutatkozott, akkor mindkét módszerrel a vizsgálatot az adott törzsre megismételtük és kiegészítı teszteket (csíratömlıképzés, klamidospóra-képzés, nitrát-asszimiláció, eszkulin-hidrolízis, 450Con való növekedés vizsgálata, mikroszkópos vizsgálaton alapuló morfológiai bélyegek vizsgálata) állítottunk be. V. 2. 2. a. Azonosítás API ID 32C automatizált kiértékeléső kit segítségével Az ID 32 C a sarjadzó gombák in vitro identifikálására szolgáló speciális adatbázissal ellátott miniatürizált rendszer. A tesztcsík 32 lyukat hordoz, melyek kémiailag jól definiált, minimál táptalajba oldott dehidratált szénhidrát szubsztrátot (2. D. melléklet) tartalmaznak.
47
A táptalajok beoltásához desztillált vízben vagy fiziológiás sóoldatban 2 McFarland denzitásnak megfelelı sőrőségő gombaszuszpenziót készítettünk, melybıl 250 µl szuszpenziót vittünk át a gyárilag elkészített 2 ml-es tápfolyadékba. A higított gombaszuszpenzióból 135 µl-t mértünk be a tesztcsík üregeibe az ATB elektronikus automata pipetta segítségével. A fedıvel ellátott tesztcsíkot a dehidrálástól védve, hermetikusan zárt, humid közegben, 350C-on inkubáltuk 24-48 órán át. A leolvasáshoz egy számítógéphez csatlakoztatott, szoftverrel ellátott készüléket használtunk (a kithez tartozó gyári leírás alapján). Bizonytalan azonosítás esetén a tesztben megtalálható kiegészítı reakciókat is elvégeztük. V. 2. 2. b. Azonosítás MICRONAUT-Candida azonosító rendszer segítségével A 18-24 órás sarjadzó gomba színtenyészetekbıl néhány telepet homogenizáltunk 0,9%-os NaCl oldatban, a turbiditást 4 McFarland-nak megfelelıre állítottuk be. Ebbıl 700 µl-t átmértünk a gyárilag készített 6 ml-es Candida–Susmed oldatba. Az elkészített szuszpenzióból a MICRONAUT-Candida lemez üregeit 100 µl térfogatokkal oltottuk be 4 csatornás pipetta segítségével a lemezpozícióknak megfelelıen. A beoltás után a lemezeket „MICRONAUT”-lemezfedıkkel fedtük le, majd 24 órára 25-300C-os termosztátban inkubáltuk (5. ábra, 49. oldal). A lemezeket MICRONAUT Skan berendezés segítségével olvastuk le és a MICRONAUT-szoftverrel értékeltük ki. A vizsgálat eredménye megjeleníthetı a képernyın vagy kinyomtatható az abszolút és relatív valószínőséget is megadva, amely szerint eldönthetı az identifikálás megbízhatósága.
A képernyın
megjelenı
eredmény alatt
esetleg megjelenı
megjegyzések kiegészítı vizsgálatok szükségességére hívják fel a figyelmet (a módszer leírása alapján). V. 2. 2. c. Statisztikai elemzés Az azonosítási vizsgálataink során kapott binomiális adatainkat (két vizsgálómódszer, két kimeneti lehetıség) Fisher-féle egzakt teszttel hasonlítottuk össze (a Fisher-féle egzakt teszt két csoport összehasonlításakor kis mintaszám esetén megbízhatóbb, mint a χ 2 teszt). A véletlen oki szerepét p < 0,05 esetén vetettük el. A statisztikai elemzéshez GraphPad Prism 4.03 for Windows programot használtuk.
48
I. A minták elıkészítése Gomba tenyészetése Sabouraudglükóz (2%) agaron
II. Inokulum készítése: 0, 5 McFarland sőrőségő
4 McFarland sőrőségő
gombaszuszpenzió készítése
gombaszuszpenzió készítése
6 ml Candida-Susmed-ben
2 ml 0, 9% NaCl-ban
0,7 ml gombaszuszpenzió átvitele 6 ml CandidaSusmed-be
III. Beoltás:
A szuszpenzó átmérése 4 csatornás tartályba
100 µl bemérés a gombaszuszpenzióból a lemez minden mélyedésébe
IV. Lefedés és inkubálás:
„MICRONAUT”-lemezfedı
24 óra 25-300C -on
V. Leolvasás Leolvasás
A MICRONAUT-Candida teszt beállításának folyamatábrája a gyártó ajánlása alapján (Merlin Diagnostika Gmbh, Bornheim, Germany, 2004) 5. ábra
49
V. 2. 2. d. A rendszer minıség-ellenırzése A MICRONAUT-Candida tesztrendszer minıség-ellenırzése referencia törzsek segítségével történt. A vizsgálataink során 13 ATCC referencia törzzsel végeztük el a vizsgálatot. Az ATCC törzsek a következık voltak: C. albicans 14053, C. albicans 10231, C. parapsilosis 22019, C. tropicalis 750, C. krusei 6258, C. inconspicua 16783, C. norvegensis 22977, C. lusitaniae 38533, C. guilliermondii 6260, C. dubliniensis CD36, C. pulcherrima 18406, C. famata 36239, C. rugosa 2142. V. 2. 2. e. Azonosítás molekuláris biológiai módszerekkel Az ID 32C-vel és a MICRONAUT-Candida rendszerrel kapott nem egyértelmő eredmények esetén megismételtük a vizsgálatot mindkét tesztrendszerrel. Amennyiben az eredmények továbbra sem voltak egyértelmőek, vagy a két rendszer által kapott eredmények különböztek, akkor a ribotipizálási vizsgálatok elvégzésére került sor az eredmények megerısítése céljából (Majoros és mtsai 2003).
50
V. 3. Érzékenység meghatározását szolgáló módszerek V. 3. 1. Leveshígításos módszer az érzékenység meghatározására A MIC meghatározásokat a standard mikrodilúciós módszert alkalmazva végeztük el a CLSI M27-A2 dokumentum ajánlása szerint (NCCLS 2002). Vizsgálatainkat az AMB, 5-FC, FLU, VOR, POS és CAS antifungális szerekkel állítottuk be. Minıségi kontrollként a C. parapsilosis ATCC 22019, illetve a C. krusei ATCC 6258 törzseket használtuk. Minden vizsgálatot legalább két alkalommal végeztünk el. A vizsgálatainkban használt antifungális szerekre vonatkozó további adatok a 4. táblázatban találhatók. 4. táblázat. A mikrodilúciós vizsgálatokban használt antifungális szerekre vonatkozó adatok Az antifungális szernek a
Antifungális szer
Származása
Oldószer
lemezen beállított koncentrációja
FLU
Pfizer, Groton, CT, USA
Desztillált víz
0,25-128 mg/L; 0,12-64 mg/L*
VOR
Pfizer, Groton, CT, USA
100%-os DMSO
0,015-8 mg/L
100%-os DMSO
0,015-8 mg/L
100%-os DMSO
0,015-8 mg/L; 0,03-8 mg/L**
Desztillált víz
0,12-64 mg/L
Desztillált víz
0,015-8 mg/L
Schering-Plough POS
Research Institute, Kenilworth, NJ, USA
AMB
5-FC
CAS
Sigma, Budapest, Hungary Sigma, Budapest, Hungary Merck-Research
Laboratories
Rahway, NJ, USA
Megjegyzés: *-a FLU koncentrációi a C. inconspicua izolátumokkal végzett vizsgálatokban **- az AMB koncentrációi a C. inconspicua izolátumokkal végzett vizsgálatokban
A vizsgálatok végzésénél az egyes törzsek gombaszuszpenzióinak elkészítése során a 24 órás Sabouraud agaron nıtt tenyészetekbıl 0,85%-os fiziológiás sóoldat segítségével a sőrőséget 0,5 McFarland-ra állítottuk be.
51
A végleges csíraszám (103 sejt/mL) beállításához RPMI-1640 (Sigma, Budapest, Hungary), illetve szükség esetén AM3 (Fluka, Budapest, Hungary) táptalajt használtunk fel. A mikrodilúciós vizsgálatokhoz használt táplemezeket házilag készítettük el, melyeket felhasználásukig -200C-on tároltunk (max.1 hónapig). Minden 96 üregő ELISA lemezen beállítottunk egy antifungális szert (gombakontroll), illetve egy sarjadzó gombát (táptalajkontroll) nem tartalmazó kontroll üreget is. A mikrodilúciós lemezek 48 órás inkubálása (AMB, 5-FC, FLU, VOR, POS) után az egyes üregek tartalmát pipettával homogenizáltuk. Mindezek után a leolvasás vizuálisan történt a prominens és a teljes gátlás kritériumai alapján (NCCLS 2002). CAS esetében a MIC érték a 24 óra utáni részleges gátlás alapján leolvasott érték volt (Pfaller és mtsai 2004/b, 2008/c). V. 3. 2. Idı-ölés görbék felvétele (time-kill kísérletek) A kísérleteket a Klepser és mtsai (1998) által leírt módon végeztük el. A kísérleti paramétereket az általuk leírt módon állítottuk be és minden vizsgált izolátummal legalább kétszer végeztük el. V. 3. 2. 1. Az antifungális carry-over vizsgálata A kísérletek elvégzése elıtt megvizsgáltuk, hogy az antifungális szer különbözı koncentrációinak (0,5-16 x MIC) a jelenléte, hogyan befolyásolja a kezdı csíraszámot a kontroll csıhöz képest. Ezért, az antifungális szereket különbözı koncentrációkban tartalmazó RPMI-1640-es oldat 9 ml-éhez 1 ml 103 CFU/mL sejtet tartalmazó gombaszuszpenziót adtunk, melybıl 4 x 30 µl-t azonnal (a 0. órában ) Sabouraud agarra oltottunk, majd 48 órás inkubálás után a kinıtt telepeket megszámoltuk (Klepser és mtsai 1998). Antifungális carryover-rıl akkor beszélünk, ha a kinıtt gombatelepek száma a különbözı gyógyszerkoncentrációk esetén a táptalajra átvitt antifungális szer hatása miatt több, mint 25%-kal kisebb a kontroll csıbıl kinıtt gombák számához képest. A mi esetünkben antifungális carry-overt nem tapasztaltunk.
52
V. 3. 2. 2. Az idı-ölés görbék felvételéhez beállított paraméterek Az idı-ölés görbék felvétele esetén a kezdı csíraszám 105 CFU/mL volt (Klepser és mtsai 1998, Pfaller és mtsai 2004/d). Az antifungális szer koncentrációja a fajtól és a MIC értéktıl függıen változott (0,5-16 x MIC). A csöveket folyamatos rázatás mellett 350C-os termosztátban inkubáltuk, majd 100-100 µl-eket vettünk ki elıre meghatározott idıpontokban. Az idıpontok a vizsgált fajtól és az alkalmazott antifungális szertıl függıen alakultak. A 100 µl-nek megfelelı mennyiségő mintákat, tízes léptékő sorozathígítással steril fiziológiás sóoldatban hígítottuk, majd ezt követıen 4 ×30 µl-t cseppentettünk pipettával a Sabouraud agarok felszínére. Amikor azt feltételeztük, hogy a kitenyészett csíraszám < 1000 CFU/mL lesz, akkor direkt kioltásokat is végeztünk, azaz közvetlenül a csövekbıl oltottunk ki 4 × 30 µl-eket Sabouraud agarra. A cseppek megszáradásáig a lemezeket szobahımérsékleten állni hagytuk, majd 48 órán át 350C-on inkubáltuk. Leolvasáskor megszámoltuk a telepeket az egyes lemezeken és a hígitást is figyelembe véve meghatároztuk az élı gombasejtek számát (Pfaller és mtsai 2004/d). A vizsgálatokra vonatkozó feltételeket az 5. táblázat foglalja össze.
5. táblázat. Az idı-ölés görbék felvételéhez szükséges feltételek Feltételek
A feltételekre vonatkozó adatok
Makrodilúciós eljárás (10ml-es csövekben kivitelezve) Folyékony RPMI-1640, 7-es pH-jú MOPS pufferrel beállítva, de lehet AM3 táptalaj is 5 x 105 CFU/mL Kezdeti csíraszám Inkubálási feltételek mintavételezésekig (folyékony táptalaj) 350C Inkubálási hımérséklet Folyamatos rázatás Rázatás Kísérletfüggı, min. 24 óra, max. 48 óra Rázatás idıtartama Mintavételezési feltételek Kísérletfüggı (leggyakrabban a 0., 2., 4., 6., 8., 12., 24., 48. Mintavételezési idıpontok órákban) 4 x 30 µl a megfelelı higításokból Kioltott minta mennyisége Sabouraud agar táptalaj Tenyésztéshez használt táptalaj Inkubálási feltételek kioltást követıen (a tenyésztés Sabouraud agar táptalajon történik) 350C Inkubálási hımérséklet 48 óra Inkubálás idıtartama 50 CFU/mL Kvantitálási határérték Vizsgálati módszer elve Táptalaj
53
V. 3. 2. 3. Az antifungális szerek koncentrációinak megválasztása az idı-ölés görbék felvétele során
a./ Amphotericin B
A C. inconspicua izolátumokkal végzett vizsgálatokban az AMB koncentrációja a 0,516 x MIC értéknek megfelelı koncentráció tartományban változott. Mivel az AMB szérumban elérhetı koncentrációja 1 mg/L, ezért a szer alkalmazott legmagasabb koncentrációja a C. dubliniensis izolátumokkal végzett kísérleteink során ≤ 2 mg/L volt. b./ Flukonazol, vorikonazol, posakonazol
A triazolok koncentrációja a C. inconspicua és C. dubliniensis-szel végzett vizsgálatokban a 0,5-16 x MIC értéknek megfelelı koncentrációkon használtuk. Legmagasabb alkalmazott koncentrációjuk a C. dubliniensis-szel végzett vizsgálatokban a fenti sorrendnek megfelelıen a következı volt: 8 mg/L, 4 mg/L és 4 mg/L. c./ Caspofungin
A CAS-nal az idı-ölés görbék felvételéhez szükséges kísérleteinket kétféle táptalajban, az RPMI-1640 és az AM3 táptalajban végeztük el. Mindkét táptalajt alkalmazva a CAS koncentrációja a C. parapsilosis, C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumokkal végzett vizsgálatokban a (0,06-16) mg/L koncentráció tartományban használtuk.
d./ 5-Fluorocitozin
A szer koncentrációja 0,5-16 x MIC értéknek megfelelı koncentráció tartományban használtuk, vizsgálatainkban a legmagasabb koncentrációja az antifungális szernek 8 mg/L volt.
54
V. 3. 2. 4. Mintavételezési idıpontok megválasztása az idı-ölés görbék felvétele során A C. dubliniensis izolátumokkal az AMB, 5-FC, FLU, VOR és POS-lal végzett vizsgálatok esetén a mintavételezéseket a 0., 2., 4., 12., 24. és 48. órás idıpontokban végeztük. A C. inconspicua esetében a mintavételek a 0., 4., 8., 12., 24. és 48. órás idıpontokban történtek a FLU-lal végzett idı-ölés görbék felvételekor, míg az AMB-vel történt vizsgálatoknál a minták kioltását a Sabouraud agar táptalajra a 0., 2., 4., 6., 12., 24. és a 48. órákban végeztük el. A „psilosis”- csoport esetében a CAS–nal végzett vizsgálatokban a mintavételezéseket a 0., 4., 8., 12., 24. és 48. órás idıpontokban végeztük el. V. 3. 3. Eredmények interpretálása V. 3. 3. a. Az eredmények interpretálása leveshigításos módszer esetén Az AMB esetében a MIC érték az a legkisebb koncentráció volt, amelynél a lemez üregeiben már nem volt tapasztalható szemmel látható növekedés. Triazoloknál és az 5FC-nál pedig azt az értéket tekintettük MIC értéknek, amelyen prominens csökkenés volt tapasztalható a gomba sejtek növekedését illetıen a kontroll üregekhez képest (NCCLS 2002). A különbözı antifungális szerekre vonatkozó NCCLS által elıírt interpretátálási követelményeket a 3. táblázat (40. oldal) tartalmazza (Rex és mtsai 2001, NCCLS 2002). A VOR esetében a ≤ 1 mg/L-es MIC értékkel rendelkezı izolátumok az érzékeny (É), az 1-2 mg/L-es a dózisfüggıen érzékeny (DÉ), míg a ≥ 4 mg/L-es MIC értéket jelzık a rezisztens (R) kategóriákba sorolhatók (CLSI 2008). A CAS MIC meghatározásánál a Pfaller és mtsai (2006/a, 2008/c) által javasolt ≤ 2 mg/L-es érzékenységi határt alkalmaztuk. A POS MIC értékei még nincsenek bejegyezve a CLSI útmutatóban, irodalmi adatok szerint viszont a ≤ 1 mg/L-es MIC értékkel rendelkezı izolátumok érzékenynek (É), a ≥ 8 mg/L-es MIC értékkel rendelkezı izolátumok pedig rezisztensnek (R) tekinthetık
55
(Ostrosky-Zeichner és mtsai 2003, Espinel-Ingroff és mtsai 2005, Sóczó és mtsai
2007/a). Az AMB esetében a legjobban elfogadott >1mg/L MIC értéket adtuk meg a rezisztencia határértéknek (NCCLS 2002). V. 3. 3. b. Az eredmények interpretálása idı-ölés görbék felvételével történt vizsgálatok esetén Az idı-ölés görbéket a Microsoft Excel 2003 program segítségével ábrázoltuk. Fungicid hatásúnak akkor tekintettünk egy antifungális szert, amikor a csíraszám változásban a kezdeti csíraszámhoz képest ≥ 99,9 %-os (vagy ezzel egyenértékő 3log10 egységnek megfelelı) sejtszámcsökkenést tapasztaltunk. Ezzel ellentétben a < 99,9%-os (vagy < 3log10 egység alatti) csíraszám változás a kezdeti csíraszámhoz képest a szer fungisztatikus hatását jelentette (Pfaller és mtsai 2004/d). Paradox növekedés jelenlétét akkor igazoltuk, amikor az antifungális szer a MIC értéknél alacsonyabb és magasabb koncentráció értékein növekedést (fungisztatikus hatás) észleltünk, de a köztes koncentráció értéken nem volt észlelhetı az izolátum növekedése (fungicid hatás) (Varga és mtsai 2008). A jelenség megfigyelését a C. parapsilosis izolátumokkal felvett idı-ölés görbék esetében fontosnak tartottuk 24 és 48 órás inkubációt követıen is úgy az RPMI-1640, mint az AM3 táptalajban (Chamilos és mtsai 2007, Varga és mtsai 2008).
56
VI. Eredmények és értékelés VI. 1. Az azonosítási vizsgálatok értékelése VI. 1. 1. MICRONAUT-Candida Sytem azonosító rendszerrel és az ID 32C-vel kapott eredmények összevetése Az API ID 32C rendszer az összes ATCC referencia törzset 48 órára helyesen azonosította. A MICRONAUT-Candida tesztrendszer már 24 órán belül helyesen azonosította az ATCC törzsek többségét. A C. norvegensis és C. rugosa ATCC törzseket tévesen C. valida-ként ismerte fel. Mivel a C. pulcherrima nem található meg az utóbbi adatbázisában, így a rendszer a C. pulcherrima ATCC törzs azonosítására nem volt képes, azaz semmilyen fajt nem jelzett ki a tesztrendszer (6. táblázat).
6. táblázat. Az API ID 32C és a MICRONAUT-Candida azonosító rendszerekkel azonosított referencia törzsek Sorszám
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. *
Referencia törzsként használt ATCC törzsek C. albicans 14053 C. albicans 10231 C. parapsilosis 22019 C. tropicalis 750 C. krusei 6258 C. inconspicua 16783 C. norvegensis 22977 C. lusitaniae 38533 C. guilliermondii 6260 C. dubliniensis CD 36 C. famata 36239 C. rugosa 2142 C. pulcherrima 18406
Az API ID 32C-vel azonosított fajok C. albicans C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. krusei C. inconspicua C. norvegensis C. lusitaniae C. guilliermondii C. dubliniensis C. famata C. rugosa C. pulcherrima
Ezekkel a fajokkal kiegészítı vizsgálatokat is végeztünk
* * Ez a faj nem található meg a tesztrendszer adatbázisában
57
A Micronaut-Candida rendszerrel azonosított fajok C. albicans C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. krusei C. valida/ C. inconspicua* C. valida/ C. inconspicua* C. lusitaniae C. guilliermondii C. dubliniensis C. famata C. valida/ C. inconspicua* **
VI. 1. 1. a. Jól korreláló és egyértelmően azonosított izolátumok
A MICRONAUT-Candida rendszer már 24 órán belül helyesen azonosította a klinikai rutinban leggyakrabban elıforduló fajokat: a C. albicans-t, C. parapsilosis-t és a C. tropicalis-t. Az elsıdleges, illetve másodlagos FLU-rezisztenciát hordozó C. krusei és C. glabrata törzsek azonosítását is egy munkanapon belül elvégezte a rendszer. Mindkét módszer kiegészítı vizsgálatok alkalmazása nélkül 24 órára helyesen azonosította a C. dubliniensis törzseket is. A két tesztrendszerrel kiegészítı tesztek alkalmazása nélkül kapott eredmények a következı izolátumoknál összhangban voltak:
C. albicans (n=40)
C. glabrata (n=40)
C. parapsilosis (n=35)
C. tropicalis (n=35)
C. krusei (n=35)
C. kefyr (n=10)
C. dubliniensis (n=9
C. guilliermondii (n=7)
C. lusitaniae (n=7)
C. lipolytica (n=4)
S. cerevisiae (n=8)
C. famata (n=2)
C. catenulata (n=2)
C. rugosa (n=1)
C. neoformans (n=2)
Geotrichum fajok (n=2)
Trichosporon fajok (n=2)
n: az izolátumok száma
Két C. rugosa izolátumból egy esetben, illetve két Rhodotorula glutinis izolátum helyes azonosításához a MICRONAUT-Candida rendszert használva kiegészítı tesztek (mikroszkópos vizsgálat, nitrát-asszimiláció) elvégzésére volt szükség. Ezt követıen az eredmény tökéletesen összhangban volt az API ID 32C-vel kapott eredménnyel. A két módszerrel és a ribotipizálással kapott eredmények összevetését a 7. táblázat tartalmazza. VI. 1. 1. b. Nem egyértelmően azonosított izolátumok Az API ID 32C rendszer egy kiegészítı teszt, az eszkulin-hidrolízist használva az összes vizsgált C. inconspicua izolátumot (n=12) tévesen C. norvegensis-nek azonosította, ahogyan azt a ribotipizálási vizsgálatok is megerısítették (Majoros és mtsai 2003). Ezeket az izolátumokat a MICRONAUT-Candida azonosító rendszer
58
mikroszkópos vizsgálatok kiegészítésével helyesen C. inconspicua-nak azonosította (7. táblázat). Az API ID 32C öt C. lusitaniae törzset (12 izolátumból) C. famata-ként azonosította. A MICRONAUT-Candida azonosító rendszer helyesen végezte el az azonosítást (7. táblázat). Az API ID 32C egy C. tropicalis törzset tévesen C. humicolus-nak azonosított, míg a MICRONAUT-Candida azonosító rendszer helyesen C. tropicalis-nak ismerte fel az izolátumot (7. táblázat). Mivel a C. pulcherrima nem található meg a tesztrendszer adatbázisában, ezért ennek a fajnak az azonosítása a MICRONAUT-Candida azonosító rendszerrel nem sikerült. Az API ID 32C segítségével egyértelmően azonosíthatók voltak ezek az izolátumok. Az eredmények a PCR-ribotipizálással is megerısítésre kerültek (7. táblázat). VI. 1. 1. c. Az azonosítási vizsgálatok statisztikai értékelése A 7. táblázatból kitőnik, hogy a vizsgált 264 izolátumból kiegészítı tesztek nélkül, 241 (91,3%) izolátum esetében a MICRONAUT-Candida rendszer összhangban lévı eredményeket adott az API ID 32C teszt segítségével kapott eredményekkel. Az újonnan alkalmazott módszer mindössze 2 (2/264, 0,76%) izolátum azonosítását nem tudta elvégezni, míg az API ID 32C azonosító rendszer 18 (18/264, 6,82%) izolátumot azonosított tévesen (0,76% vs. 6,82%, p < 0,001). A Fisher-féle egzakt teszten alapuló statisztikai értékelés szerint tehát a MICRONAUTCandida rendszer szignifikánsan pontosabban azonosította a 264 sarjadzó gombát, mint az API ID 32C.
59
7. táblázat. Az API ID 32C és a MICRONAUT-Candida azonosító rendszerekkel végzett vizsgálatok eredményeinek összefoglalása és összehasonlítása a ribotipizálással kapott eredményekkel
MICRONAUT-Candida tesztrendszerrel végzett azonosítási vizsgálatok API ID 32 teszttel azonosított izolátumok
Vizsgált izolátumok C. albicans C. glabrata C. parapsilosis C. tropicalis
40 40 35 36
C. krusei C. inconspicua C. lipolytica C. kefyr C. lusitaniae
35 12 4 10 12
C. guilliermondii C. dubliniensis C. famata C. catenulata C. rugosa C. pulcherrima S. cerevisiae C. neoformans R. glutinis Geotrichum fajok Trichosporon fajok Összesen
7 9 2 2 2 2 8 2 2 2 2 264
C. albicans C. glabrata C. parapsilosis C. tropicalis C. humicolus C. krusei C. norvegensis C. lipolytica C. kefyr C. lusitaniae C. famata C. guilliermondii C. dubliniensis C. famata C. catenulata C. rugosa C. pulcherrima S. cerevisiae C. neoformans R. glutinis Geotrichum fajok Trichosporon fajok
40 40 35 35 1 35 12 4 10 7 5 7 9 2 2 2 2 8 2 2 2 2 264
Azonosított és nem Azonosított izolátumok
Kiegészítı tesztek nélkül
Kiegészítı tesztekkel
40 40 35 36 35 C. krusei 12 C. valida/C.inconspicua 4 C. lipolytica 10 C. kefyr 12 C. lusitaniae 7 C. guilliermondii 9 C. dubliniensis 2 C. famata 2 C. catenulata 2 C. rugosa/Geotrichum candidum 2 Nem azonosította** 8 S. cerevisiae 2 C. neoformans 2 R. glutinis 2 Geotrichum fajok 2 Trichosporon fajok 264
40 40 35 36 34 4 10 12 7 9 2 2 1 8 2 2 2 246
-
C. albicans C. glabrata C. parapsilosis C. tropicalis
A ribotipizálással azonosított izolátumok
1 12 -
NV NV * NV C. tropicalis NV C. inconspicua NV NV C. lusitaniae
1 12 12
1 2 16
C. guilliermondii C. dubliniensis C. famata NV NV C. pulcherrima NV NV NV NV NV -
7 9 2 2 -45
*: a SADH gén azonosítása alapján már korábban azonosítva lettek az izolátumok (Tavanti és mtsai 2005), **: nem található meg a tesztrendszer adatbázisában, ezért nem azonosította az izolátumot a tesztrendszer,
60
NV: nem végeztük el a vizsgálatot.
VI. 2. A C. inconspicua izolátumokkal végzett vizsgálatok eredményei VI. 2. 1. A C. inconspicua FLU-lal és AMB-vel végzett mikrodilúciós vizsgálatai során kapott MIC értékek A vizsgálatokhoz használt izolátumok jelölése, származása, a FLU-lal és az AMB-vel kapott MIC értékek adatai a 8. táblázatban találhatók.
8. táblázat. A C. inconspicua izolátumok FLU és AMB MIC értékei MIC (mg/L) értékek C. inconspicua fajok FLU
AMB
ATCC 16783
16
1
1. (seb)
16
1
2.(vér)
32
0, 5
3.(hörgıváladék)
32
0, 5
4.(hasüregi váladék)
32
0, 5
5.(hörgıváladék)
32
1
6.(torok)
128
1
7.(köpet)
64
1
8.(torok)
128
1
jelölése és származásuk
Ahogyan a 8. táblázat adataiból látszik, úgy az ATCC 16783 referencia törzs, mint a klinikai izolátumok FLU MIC értékei az DÉ (dózisfüggıen érzékeny, MIC:16-32 mg/L), illetve a R (rezisztens, MIC ≥ 64 mg/L) kategóriákba kerültek.
61
VI. 2. 2. Az idı-ölés görbe vizsgálatok során kapott eredmények Fluconazollal
A vizsgálatok azt mutatták, hogy a FLU 24 óra inkubációs idı elteltével fungisztatikus hatást fejtett ki az összes vizsgált izolátummal szemben. Az ATCC 16783 -as referencia törzzsel szemben 1-16 x MIC koncentráció értékeken mutatkozott a fungisztatikus hatás. A 0,5 x MIC értéknél felvett idı-ölés görbe hasonló volt a növekedési kontroll görbéhez. Az összes vizsgált izolátum esetében, ≥ 4 x MIC értéken, 48 óra múlva a hatás fungicid volt. A vizsgálat reprezentatív idı-ölés görbéit a 6. A., 6. B. ábrák szemléltetik.
Amphotericin B-vel
Az AMB 24 óra elteltével széles koncentráció tartományon belül az összes vizsgált izolátummal, így az ATCC 16783 izolátummal szemben is fungicid hatást mutatott. A legjobb fungicid hatás az 1-es jelzéső izolátummal és az ATTC 16783 referencia törzzsel volt elérhetı. Az ATTC 16783-as törzsnél 1-16 x MIC (1-16 mg/L) AMB koncentráció értéken jelentkezett fungicid hatás 6 óra elteltével. Az 1-es izolátum esetében ugyanezen a koncentráció értéken az AMB már 2 óra elteltével kifejtette fungicid hatását (7. A. ábra). A többi izolátum esetében az AMB ölı hatása lassabban következett be. A 8 izolátumból 5 izolátum esetében 12 óra inkubálást követıen, 1 mg/L-es AMB koncentráció mellett volt elérhetı a fungicid feltételeket kielégítı csíraszám változás ( > 3log 10). Megjegyzendı, hogy 0,5 mg/L koncenrációértéken (0,5 x MIC) az AMB csupán fungisztatikus hatást fejtett ki az összes vizsgált izolátummal szemben (a reprezentatív idı-ölés görbék a 7. B. ábrán láthatók).
62
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 1xMIC 0,5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
FLU MIC = 16 mg/L 4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
6. A. ábra. Flukonazol hatása az 1-es C. inconspicua izolátumra idı-ölés görbék felvételekor
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 1xMIC 0,5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
FLU MIC = 64 mg/L 4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
6. B. ábra. Flukonazol hatása a 7-es C. inconspicua izolátumra idı-ölés görbék felvételekor
63
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 1xMIC 0.5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
AMB MIC = 1 mg/L 2
4
6
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
7. A. ábra. Amphotericin B hatása az 1-es C. inconspicua izolátumra az idı-ölés görbék felvételekor
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 1xMIC 0.5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
AMB MIC = 1 mg/L 2
4
6
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
7. B. ábra. Amphotericin B hatása a 7-es C. inconspicua izolátumra az idı-ölés görbék felvételekor
64
VI. 3. A caspofungin in vitro aktivitása a C. parapsilosis, C. orthopsilosis, C. metapsilosis izolátumokkal szemben VI. 3. 1. Caspofungin MIC értékek meghatározása RPMI-1640 és AM3 táptalajokban A 24 óra után leolvasott, parciális gátláson alapuló MIC értékeket az oldószerek hatásának függvényében a 9. táblázat foglalja össze. Paradox növekedés nem volt tapasztalható sem az RPMI-1640, sem az AM3 táptalajban. A C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumok CAS MIC értékei alacsonyabbnak adódtak, mint a C. parapsilosis törzsek MIC értékei. Az is egyértelmően látható, hogy az AM3 táptalaj használata 1-2 hígítási fokkal csökkenti a MIC értékeket az RPMI-1640 tápközegben kapott MIC értékekhez képest. A C. parapsilosis esetében az RPMI-1640 táptalajt használva, a MIC értékek a 0,5-2,0 mg/L-es, az AM3 közegben pedig a 0,25-0,5 mg/L-es koncentráció tartományban mozogtak. A C. orthopsilosis izolátumoknál ez az érték RPMI-1640-es táptalajban 0,120,25 mg/L-nek, AM3 jelenlétében pedig minden vizsgált törzsnél 0,06 mg/L-nek mutatkozott. A C. metapsilosis izolátumok esetében az AM3 táptalajban a CAS MIC értékei a 0,03-0,06 mg/L koncentráció tartományba kerültek, az RPMI-1640 táptalajban pedig a 0,12-0,25 mg/L koncentráció tartományba esı MIC értékek jelentkeztek.
65
9. táblázat. A C. parapsilosis, C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumokkal kapott CAS MIC értékek az RPMI -1640 és az AM3 táptalajokban RPMI-1640
AM3
MICa (mg/L)
MICa (mg/L)
Az izolátumok jelölése és származása
C. parapsilosis ATCC 22019
0,5
0,25
9150 (Magyarország, vér)
1-2
0,5
509 (Magyarország, vér)
0,5
0,25-0,5
2845 (Magyarország, vér)
0,5-1
0,25
896/1 (Magyarország, seb)
1-2
0,25-0,5
CP120 (Olaszország, széklet)
0,5
0,25
CP117 (Olaszország, köröm)
0,5-1
0,25 C. orthopsilosis
CP 85 (Olaszország, katéter)
0,12
0,06
CP25 (Olaszország, köröm)
0,12-0,25
0,06
CP125 (Olaszország, köröm)
0,12
0,06 C. metapsilosis
CP5 (Olaszország, köpet)
0,25
0,06
CP92 (Olaszország, széklet)
0,5
0, 03-0,06
CP86 (Olaszország, hüvely)
0,25
0, 03-0,06
12821 (Magyarország, vér)
0,12-0,25
0, 03-0,06
a
− a MIC értékek két egymástól független kísérlet eredményeibıl származnak
66
VI. 3. 2. A „psilosis”- csoportba tartozó fajok CAS jelenlétében felvett idı-ölés görbék eredményei Az idı-ölés görbék felvételéhez a CAS-t az AM3 és az RPMI-1640 táptalajban is a 0,06-6 mg/L koncentráció tartományban vizsgáltuk. Az eredményeket a 10.a-b. táblázat foglalja össze. A vizsgált izolátumokkal felvett idı-ölés görbék reprezentatív görbéi a 8. A-B, 9. A-B. és a 10. A-B. ábrákon láthatók. VI. 3. 2. a. Az RPMI-1640 táptalaj hatása Az RPMI táptalaj jelenlétében a C. parapsilosis- és C. orthopsilosis izolátumokkal végzett vizsgálatokban a CAS 24 órás inkubálást követıen egyöntetően fungisztatikus hatást eredményezett (10. a-b. táblázat). A CP85-ös C. orthopsilosis izolátum 2 mg/L (16 x MIC) koncentrációjú CAS jelenlétében elpusztult (fungicid hatás), míg más koncentráció értékeken a CAS csak fungisztatikus hatást mutatott (10. b. táblázat). 48 órás inkubálást követıen a CAS az 509-es jelzéső C. parapsilosis izolátum ellen 16 mg/L (32 x MIC) koncentráción fungicidnek bizonyult (10.a.táblázat). Jelentıs csökkenés volt tapasztalható az életképes sejtek számában 1-16 mg/L-es CAS koncentráció értékeken a többi C. parapsilosis izolátum esetében is, ami 1,07-2,95 log10 CFU/mL-nek felelt meg. A C. orthopsilosis izolátumoknál pedig 1,18-2,97 log10 CFU/mL-nek megfelelı csíraszám csökkenést tapasztaltunk. A CP125-ös C. orthopsilosis izolátummal szemben a CAS-t 16 mg/L (128 x MIC) koncentráció értéken alkalmazva fungicid hatást váltott ki 48 óra múlva (10.b. táblázat). A C. parapsilosis és C. orthopsilosis izolátumokkal az RPMI-1640-es táptalajban végzett vizsgálatok reprezentatív idı-ölés görbéit a 8.A. és a 9.A. ábrák szemléltetik. Negyvennyolc órás inkubálást követıen a CP92-es izolátum kivételével az összes C. metapsilosis-ra nézve a CAS 1 mg/L, 4 mg/L és 8 mg/L koncentráció értéken (16-128 x MIC) fungicid hatásúnak bizonyult. A reprezentatív idı-ölés görbék a 10.A. ábrán láthatók.
67
VI. 3. 2. b. Az AM3 táptalaj hatása Az AM3 táptalajban a hét C. parapsilosis izolátumból öt izolátummal szemben a CAS 24 órára fungisztatikus hatást fejtett ki. Negyvennyolc órára ugyanebbıl a hét C. parapsilosis izolátumból négy törzzsel szemben a CAS ≥ 0,12 mg/L, ≥ 0,25 mg/L, illetve ≥ 0,5 mg/L koncentráció értékeken (≥ 1-2 x MIC) fungicid hatást mutatott (10.a. táblázat). A C. parapsilosis izolátumoknál 24 órás inkubálást követıen a hét izolátumból két izolátum esetében volt tapasztalható a paradox növekedés CAS jelenlétében. Negyvennyolc órára pedig három izolátumnál (9150, 896/1, CP 117) volt megfigyelhetı a paradox növekedés (10.a. táblázat). A reprezentatív idı-ölés görbék a 8. B. ábrán láthatók. Negyvennyolc órára az összes vizsgált C. orthopsilosis izolátummal szemben ≥ 0,12 mg/L és ≥ 1 mg/L koncentráció értékeken a CAS-nak fungicid hatása volt megfigyelhetı. Az összes C. orthopsilosis izolátum 24 órára 8 mg/L és 16 mg/L koncentrációjú CAS jelenlétében paradox növekedést mutatott. Ezek az izolátumok 48 órára ≥ 0,12 mg/L és ≥1 mg/L vagy ennél magasabb CAS koncentráció értékeken elpusztultak, azaz már nem mutatták a paradox növekedést (10.b. táblázat). A reprezentatív idı-ölés görbék a 9.B. ábrán láthatók. A C. metapsilosis izolátumoknál a CAS 0,06-16 mg/L koncentráció értékeken már 24 órára fungicid hatást eredményezett. Ugyanakkor 48 óra után a CAS ≥ 0,06 mg/L koncentráció értéken ( ≥ 1 x MIC) az összes C. metapsilosis izolátum ellen fungicidnak bizonyult (10.b. táblázat). A reprezentatív idı-ölés görbék a 10. B. ábrán láthatók. A C. metapsilosis izolátumokkal a paradox növekedés sem 24, sem pedig 48 órás inkubációs idı után nem volt megfigyelhetı.
68
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 16 mg/l 8 mg/l 4 mg/l 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
MIC CP117RPMI = 0,5 mg/L 4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
8. A. ábra. Caspofungin hatása a C. parapsilosis izolátumokra az RPMI-1640 táptalajban idı-ölés görbék felvételekor
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 16 mg/L 8 mg/L 4 mg/L 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
MIC CP117AM3 = 0,25 mg/L 4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
8. B. ábra. Caspofungin hatása a C. parapsilosis izolátumokra az AM3 táptalajban idı-ölés görbék felvételekor
69
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 16 mg/l 8 mg/l 4 mg/l 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
MIC CP 25RPMI = 0,25 mg/L 4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
9. A. ábra. Caspofungin hatása C. orthopsilosis izolátumokra az RPMI-1640 táptalajban idı-ölés görbék felvételekor
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03
16 mg/L 8 mg/L 4 mg/L 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
4
MIC CP 25AM3 = 0,06 mg/L 8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
9. B. ábra. Caspofungin hatása a C. orthopsilosis izolátumokra az AM3 táptalajban idö-ölés görbék felvételekor
70
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03
16 mg/l 8 mg/l 4 mg/l 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
MIC CP 5RPMI = 0,25 mg/L
4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
10. A. ábra. Caspofungin hatása a C. metapsilosis izolátumokra az RPMI-1640 táptalajban idı-ölés görbék felvételekor
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 16 mg/L 8 mg/L 4 mg/L 1 mg/L 0.25 mg/L 0.06 mg/L kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
MIC CP 5AM3 = 0,06 mg/L
4
8
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
10. B. ábra. Caspofungin hatása a C. metapsilosis izolátumokra az AM3 táptalajban idı-ölés görbék felvételekor
71
10.a. táblázat. Az RPMI -1640 és az AM3 tápközegek hatása a C. parapsilosis izolátumokkal a CAS jelenlétében felvett idı-ölés görbék eredményeire RPMI-1640
AM 3
Az izolátumok jelölése és származása 24 óra után
48 óra után
24 óra után
48 óra után
C. parapsilosis
ATCC 22019
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
9150 (Magyarország, vér)
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
fungicid
PG hatás 1 mg/L
16mg/L
koncentrációtól
fungisztatikus 509 (Magyarország, vér)
fungicid ≥ 0,5 mg/L koncentráción PG hatás 8 mg/L koncentrációtól fungicid ≥ 0,12 mg/L koncentráción
koncentrációnál PG hatás 16 mg/L
2845 (Magyarország, vér)
fungisztatikus
fungisztatikus
896/1 (Magyarország, seb)
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
CP120 (Olaszország, széklet)
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
CP117 (Olaszország, köröm)
fungisztatikus
fungisztatikus
fungisztatikus
PG: paradox növekedés (paradoxical growth)
72
koncentrációtól
fungicid ≥ 0,25 mg/L koncentráción PG hatás 16 mg/L koncentrációtól fungicid ≥ 0,25 mg/L koncentráción PG hatás 16 mg/L koncentrációtól
10. b. táblázat. Az RPMI -1640 és AM3 tápközegek hatása a C. orthopsilosis és C. metapsilosis izolátumokkal a CAS jelenlétében felvett idı-ölés görbék eredményeire RPMI-1640 Az izolátumok jelölése és származása
24 óra után
AM3
48 óra után
24 óra után
48 óra után
C. orthopsilosis CP85 (Olaszország, katéter) CP25 (Olaszország, köröm) CP125
fungisztatikus a
fungisztatikus a
PG hatás 16 mg/L koncentrációtól
fungisztatikus
fungisztatikus
PG hatás 16 mg/L koncentrációtól
fungicid fungisztatikus
(Olaszország, köröm)
16 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,12 mg/L koncentráción fungicid ≥ 0,12 mg/L koncentráción
PG hatás 8 mg/L koncentrációtól
fungicid ≥ 1 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,06 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,06 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 16 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,06 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,5 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,06 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,5 mg/L koncentráción
fungicid ≥ 0,06 mg/L koncentráción
C. metapsilosis
CP5 (Olaszország, köpet) CP92 (Olaszország, széklet) CP86 (Olaszország, hüvely)
12821 (Magyarország, vér)
fungicid ≥ 4
fungicid ≥ 1
mg/L
mg/L
koncentráción
koncentráción
fungisztatikus
fungisztatikus
fungicid ≥ 8
fungicid ≥ 8
mg/L
mg/L
koncentráción
koncentráción
fungicid ≥ 4
fungicid ≥ 1
mg/L
mg/L
koncentráción
koncentráción
Magyarázat: PG: paradox növekedés (paradoxical growth) a-2 mg/L-es CAS koncentráción ez az izolátum elpusztult.
73
VI. 4. Vizsgálatok C. dubliniensis izolátumokkal VI. 4. 1. A C. dubliniensis izolátumokkal végzett mikrodilúciós vizsgálatok MIC értékei Az AMB, 5-FC, FLU, VOR és POS antifungális szerekkel elvégzett mikrodilúciós vizsgálatok során kapott MIC értékeket a 11. táblázat tartalmazza.
11. táblázat. A vizsgált Candida dubliniensis izolátumok amphotericin B-, 5fluorocitozinnal, vorikonazol- és posakonazol - lal szemben mutatott MIC értékei A vizsgált izolátumok
MIC (mg/L) AMB
5-FC
FLU
POS
VOR
1.
1
≤ 0,12
0,12
0,06
0,015
2.
0,5
≤ 0,12
0,12
0,03
0,015
3.
0,5
≤ 0,12
0,12
0,06
0,015
4.
0,5
≤ 0,12
0,12
0,06
0,015
5.
0,5
≤ 0,12
0,12
0,015
0,015
6.
1
≤ 0,12
0,12
0,12
0,015
CD 36
0,25
≤ 0,12
0,25
0,03
0,03
jelölése
VI. 4. 2. A C. dubliniensis izolátumokkal felvett idı-ölés görbék eredményei
A./Az AMB hatása
Mivel a szérumban az AMB-nek a maximálisan elérhetı koncentrációja nem több, mint 1 mg/L, ezért a szer tesztelt koncentrációját a vizsgálatainkban csupán 2 mg/L-ig emeltük (Lewis és Wiederhold 2003, Lewis és mtsai 2006, Goodwin és Drew 2008). Az idı-ölés görbék azt mutatták (11. ábra), hogy az AMB 48 órára az összes vizsgált izolátummal szemben fungicid hatású. A 2, 3, 4 és 5- ös izolátumok esetében, pedig már 8 óra elteltével tapasztalható volt a fungicid hatása az AMB-nek 1 mg/L koncentráció esetén. A 2-es és a CD36-os izolátumoknál az AMB már 0,25 mg/L koncentráción fungicid hatást váltott ki. Az AMB 1 mg/L-es koncentráció értéken felvett idı-ölés görbéit a hat klinikai izolátum és a CD 36-os törzs esetén a 11. ábra mutatja.
74
C s íra szá m vá ltozás Log(C FU /m L)
1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1 2 3 4 5 6 CD36
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
2
4 8 12 Mintavételezési idıpontok (óra)
24
48
11. ábra. Az 1-6 és CD 36 jelzéső C. dubliniensis izolátumok AMB (1 mg/L) jelenlétében felvett idı-ölés görbéi B./ Az 5-FC hatása
Negyvennyolc óra elteltével 0,5-16 x MIC (0,06-2 mg/L) koncentráció értékeken az 5FC fungisztatikus hatást mutatott a vizsgált izolátumokkal szemben. Fungicid hatása ( ≥ 3log10 egységnyi sejtszámcsökkenés) csak akkor volt tapasztalható, amikor 32-64 x MIC (4-8 mg/L) koncentrációban alkalmaztuk. A vizsgálatok reprezentatív idı-ölés görbéit a 12.A. ábra szemlélteti.
C./ A triazolok (FLU, VOR, POS) hatása
Az összes triazol fungisztatikus hatással bírt a C. dubliniensis izolátumokkal szemben. Figyelemre méltó, hogy a FLU ≥ 8 x MIC koncentráció értéken ( ≥ 1 mg/L) gátolta csak az izolátumok növekedést, ennél alacsonyabb FLU koncentrációnál a görbék a kontroll görbéhez voltak hasonlóak. A CD36 izolátummal szemben mutatott fungisztatikus hatás ≥ 2 x MIC (≥ 0,5 mg/L) koncentráció értéken volt elérhetı. Az összes vizsgált izolátum esetében 8 mg/L (64 x MIC) FLU koncentrációnál a kontroll mintához képest az életképes sejtek száma
75
kevesebb, mint 1log10 egységgel csökkent. A vizsgálatok során felvett idı-ölés görbék reprezentatív görbéje a 12. B. ábrán látható. A VOR szintén fungisztatikus aktivitást mutatott ≥ 2 x MIC koncentráció értékeknél az összes vizsgált izolátummal szemben (12. C. ábra). A CD36 izolátum növekedése a MIC-nek megfelelı koncentráció értéken már gátolható volt. A csíraszám csökkenése csak 4 mg/L (256 x MIC) koncentráció értéken következett be. A POS ≥ 1 x MIC-nek megfelelı koncentráció értéken gátolta az összes izolátum növekedését. Négy mg/L (32-256 x MIC) koncentráción alkalmazva pedig a POS 1-2 log10 csökkenést váltott ki az életképes sejtek számában. A vizsgálatok reprezentatív idı-ölés görbéje a 12. D. ábrán látható.
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 64xMIC 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 0.5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
5-FC MIC ≤ 0,12 mg/L 2
4
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
12. A. ábra. Az 5-ös jelzéső C. dubliniensis izolátum 5-FC jelenlétében felvett idıölés görbéi
76
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 64xMIC 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 0,5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
FLU MIC ≤ 0,12 mg/L 2
4 12 24 Mintavételezési idıpontok (óra)
48
12. B. ábra. A 4-es jelzéső C. dubliniensis izolátum FLU jelenlétében felvett idı-ölés görbéi
Csíraszám változás Log(CFU/m L)
1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 64xMIC 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 0,5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
VOR MIC ≤ 0,015 mg/L 2
4
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
12. C. ábra. A 4-es jelzéső C. dubliniensis izolátum VOR jelenlétében felvett idıölés görbéi
77
Csíraszám változás Log(CFU/mL)
1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 64xMIC 16xMIC 8xMIC 4xMIC 2xMIC 0,5xMIC kontroll
1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0
POS MIC ≤ 0,015 mg/L 2
4
12
24
48
Mintavételezési idıpontok (óra)
12. D. ábra. A CD 36 jelzéső C. dubliniensis törzs POS jelenlétében felvett idı-ölés görbéi
78
VII. Megbeszélés VII. 1. A MICRONAUT-Candida System és az API ID 32C azonosító rendszerrel végzett összehasonlító vizsgálatok
Ahogyan már az irodalmi adatokból is nyilvánvalóvá vált, a jól ismert rizikófaktorok (daganatos betegségek, szerv- és ıssejttranszplantáció, alacsony vagy magas életkor, sebészi beavatkozások, stb.) következtében az utóbbi három évtizedben jelentıs mértékben növekedett a sarjadzó- és a penészgombák által okozott invazív fertızések száma (Pfaller és Diekema 2007). A megfelelı és idıben elkezdett antifungális terápia egyik alapfeltétele, hogy a kórokozó azonosítása minél elıbb, és minél pontosabb módszerrel történjen meg. Mivel a molekuláris biológiai módszerek rutinszerő használata még nem terjedt el, ezért a különbözı asszimilációs teszteken alapuló kereskedelmi kitek jelentik egyelıre a legjobban elfogadható megoldást (Pincus és mtsai 2007). Vizsgálatainkban olyan, a rutin diagnosztikában is alkalmazható módszer tesztelését tőztük ki célul, mely kiküszöbölheti a ritkán elıforduló sarjadzó gombák azonosítása során felmerülı nehézségeket is. Az új módszer a MICRONAUT-Candida System (Merlin Diagnostika Gmbh, Bornheim, Germany) identifikáló rendszer volt. A fajok azonosítására párhuzamosan az ID 32C rendszerrel is sor került. Az általunk újonnan használt azonosító rendszer a különbözı Candida fajokon belül elıforduló biocsoportokat is beleszámítva 40 különbözı sarjadzó gomba faj azonosítását képes elvégezni, kiegészítı tesztekkel vagy azok nélkül, már 24 óra múlva. A MICRONAUT-Candida azonosító rendszer a C. norvegensis és C. rugosa ATCC törzseket tévesen C. valida-ként azonosította, míg a C. pulcherrima ATCC referencia törzs nem szerepel az adatbázisában (6. táblázat, 57. oldal). Az ID32C rendszer az összes referencia törzset helyesen azonosította. A két azonosító rendszerrel kapott eredményeket összevetve látható, hogy a MICRONAUT-Candida azonosító rendszer 241 (91,3%) beteganyagból származó izolátum egyértelmő azonosítását tette lehetıvé, s az eredmények jól korreláltak az API ID 32C-vel, 48 órás inkubációs idı után kapott eredményekkel (7. táblázat, 60. oldal). Az újonnan alkalmazott teszt mindössze 2 izolátum azonosítását nem végezte el, míg az
79
API ID 32C azonosító rendszer 18 izolátumot azonosított tévesen (0,76% vs. 6,82%, p < 0,001). Megjegyzendı, hogy ezek döntı része C. inconspicua izolátumok voltak (7. táblázat, 60. oldal). A mikrotiter lemezt hordozó rendszer üregeiben megtalálható 14 különbözı szénhidrát lehetıséget biztosított a klinikai rutinban leggyakrabban elıforduló C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, a C. glabrata és C. krusei azonosítására. Ez különösen fontos a C. glabrata és a C. krusei esetén, mivel mindkét faj esetén az echinocandinok számítanak az elsıként választandó gyógyszerek közé, nem pedig a FLU és az AMB, amelyekkel szemben mindkét fajnak a primer- és szekunder rezisztenciák elıfordulása miatt magas a MIC értéke (Pfaller és mtsai 2004/c, 2008/a). Kiegészítı tesztek nélkül pontosan azonosította a rendszer a C. albicans-szal gyakran összetéveszhetı C. dubliniensis-t, melynek azonosításban sokat fejlıdtek mostanában a hagyományos és molekuláris biológiai technikák is, de a rutin klinikai mikrobiológiai laboratóriumokban egyidejőleg több azonosítási módszer alkalmazása javasolt (Pincus és mtsai 2007). A C. famata, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. kefyr és a C. lypolitica klinikai izolátumokat kiegészítı tesztek nélkül is helyesen azonosította az új tesztrendszer (7. táblázat, 60. oldal). Igen örvendetes, hogy a C. famata pontosan elkülöníthetı volt a C. lusitaniae és a C. guilliermondii fajoktól, hiszen úgy a környezeti, mint klinikai mintákból származó izolátumoknál komoly feladatot jelentett eddig is a mikológusok számára az azonosításuk (Desnos-Ollivier és mtsai 2008). A klinikai izolátumok esetében pedig különösen jelentısek a kapott eredmények, mivel ez a három faj változó mértékben mutat érzékenységet a FLU, az AMB, az echinocandinok vagy akár az 5-FC iránt (Pfaller és Diekema 2007). Kiegészítı tesztek segítségével az új rendszer a C. rugosa és a Rhodotorula glutinis fajok azonosítását is összhangban végezte el az ID 32C azonosító rendszerrel (7. táblázat, 60. oldal), ami szintén fontos, mivel a véráramból C. rugosa izolátumoknál is leírtak AMB-, nystatin- és FLU-rezisztenciát (Pfaller és mtsai 2003). A MICRONAUTCandida rendszer kiegészítı tesztekkel helyesen azonosította a C. inconspicua fajokat, melyeket az ID 32C rendszer tévesen C. norvegensis-nek azonosít (7. táblázat, 60. oldal). Így a C. inconspicua azonosítása továbbra sem megoldott egyik tesztrendszerrel sem. Míg az ID 32C esetén két, a FLU iránt csökkent érzékenységet mutató faj szerepel a lehetséges választási lehetıségek között, addig a MICRONAUT-Candida esetén egy
80
másik faj, a C. valida jelenik meg a C. inconspicua mellett. Az irodalmi adatok szerint a C.
krusei
és
a
C.
valida
egymással
könnyen
összetéveszthetı
fajok
a
szénhidrátasszimilációs tesztek eredményei alapján (Valenza és mtsai 2008). Véleményünk szerint az ID 32C alapján nyert C. inconspicua illetve C. norvegensis azonosítási lehetıségek klinikai és terápiás szempontból hasznosabbak, akár sikerül a pontos azonosítás, akár nem, hiszen a két faj FLU iránti csökkent érzékenysége klinikai esettanulmányokból, nagymértékben valószínősíthetı, míg a C. valida humán kóroki szerepérıl, illetve antifungális szerek iránti in vitro érzékenységérıl az irodalmi adatok szinte semmit sem említenek (García-Martos és mtsai 2001). Így az elıbb említett három faj pontos azonosítása továbbra is csak molekuláris biológiai módszerrel lehetséges (Sugita és mtsai 2004, Pincus és mtsai 2007, Valenza és mtsai 2008). Az újonnan használt tesztrendszer hátránya az ID 32C azonosító rendszerrel szemben a C.
pulcherrima
fajok
azonosításában
mutatkozott,
melynek
azonosítását
a
MICRONAUT-Candida rendszer hiányos adatbázisa miatt nem tette lehetıvé (7. táblázat). Ugyancsak nem szerepel az új rendszernek az adatbázisában a C. sake sem, ami vulvovaginitis, endocarditis és peritonitis kórokozójaként szokott ritkán elıfordulni (Anuradha és mtsai 2008, Aggarwal és mtsai 2008, Farina és mtsai 2009). A MICRONAUT-Candida azonosító rendszer hátrányként kell még megemlíteni, hogy csak azokban a laboratóriumokban érdemes bevezetni, ahol naponta elegendı számú nem-albicans típusú Candida izolátum fordul elı, hiszen a felbontott lemezt csak 2 napig szabad felhasználni. A MICRONAUT-Candida azonosító rendszert jelenleg is használják a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet Diagnosztikai Laboratóriumában. Az ottani jelenlegi gyakorlat a következı: ha az azonosítás nem egyértelmő a valószínőségek alapján, akkor a módszerben leírtak szerint egyidıben elvégzik a vizsgálatot a MICRONAUT-Candida és az ID 32C rendszerekkel is. Ezzel a módszerrel lehetıség van a 24 óra alatti pontos azonosításra, illetve a kérdéses esetekben az ID 32C segítheti a laboratórium munkáját.
81
VII. 2. A C. inconspicua izolátumokkal végzett vizsgálatok A C. inconspicua gyakran szerepel invazív kórokozóként immunkompromittált, fıleg leukémiában szenvedı betegekben (Pfaller és mtsai 2007). A faj csökkent FLU-érzékenységét már korábbi mikrodilúciós vizsgálatok és E-teszt vizsgálatok eredményei is igazolták (D’ Antonio és mtsai 1998, Majoros és mtsai 2003, 2005/c). A DEOEC klinikáin az utóbbi idıszakban a C. inconspicua egyre gyakoribb megjelenése volt megfigyelhetı, beleértve a steril testtájakat is (Majoros és mtsai 2003). Mikrodilúciós
vizsgálataink
eredményeként
megállapítottuk,
hogy
úgy
a
beteganyagokból nyert izolátumok, mint a referencia faj AMB- és FLU MIC értékei összhangban vannak a szakirodalomban megtalálható MIC értékekkel (Pfaller 2004/a, Majoros és mtsai 2005/a,c). Az izolátumok többsége a DÉ (dózisfüggıen érzékeny MIC:16-32 mg/L), illetve R (rezisztens, MIC > 32 mg/L) kategóriába kerültek (8. táblázat, 61. oldal). Számszerőleg az AMB MIC értékei igen szők tartományon belül 0,5-1 mg/L változtak, a FLU MIC értékei a 16-128 mg/L koncentráció tartományon belül fordultak elı, ami valóban igazolja ezeknek a fajoknak a csökkent-FLU érzékenységét és visszatükrözi az irodalomban megtalálható eredményeket is. Baily és mtsai (1997) által vizsgált izolátumok FLU MIC értékei > 12,5 mg/L koncentráció értéket mutattak, míg a Majoros és mtsai (2003, 2005/c) által már korábban vizsgált izolátumok FLU MIC értékei a 16-64 mg/L-es koncentráció tartományba kerültek. A C. inconspicua izolátumokkal felvett idı-ölés görbék eredményei (6. A-B. ábrák, 63. oldal) szerint a FLU már 1-2 x MIC értéken is jól gátolja az izolátumok növekedést, sıt ≥ 4 x MIC koncentrációkon a hatás akár fungicid is lehet. Ennek az eredménynek valószínőleg csak korlátozott lehet a jelentısége. Farmakodinámiai szempontok alapján, ha napi 800 mg FLU dózissal számolunk, akkor az AUC/MIC 16 mg/L, 32 mg/L, illetve 64 mg/L-es MIC értékek esetén 50; 25 illetve 12,5 lesz (Pfaller és mtsai 2006/e). Tehát, FLU-rezisztens ( MIC ≥ 64 mg/L) izolátum esetén a Pfaller és munkatársai (2006/e) által meghatározott AUC/MIC arány semmiképpen nem teljesülhet. Ráadásul, munkacsoportunk korábbi eredményeibıl az is ismert, hogy az alternatív érzékenység meghatározási módszerek nem helyettesítik a standard mikrodilúciós módszert, azaz elıfordulhat 1-2 hígítási fokkal a FLU MIC értékének az alulbecslése, így a rezisztens
82
izolátumot, akár dózisfüggıen érzékenynek is diagnosztizálhatjuk (Majoros és mtsai 2005/c). Így, tévesen azt gondolhatjuk, hogy a megfelelı farmakodinámiai pararaméterek teljesülnek, pedig nagy valószínőséggel sikertelen lenne a terápia. Valószínőleg kisebb a lehetısége a tévedésnek, ha a Rodríguez-Tudela és munkatársai (2007) javaslata alapján próbáljuk megjósolni a terápiás sikert vagy sikertelenséget. İk az AUC/MIC számításánál a szérumban mérhetı szabad FLU mennyiségét vették figyelembe 121 candidémiás és 110 szájüregi candidiázisban szenvedı beteg terápiája során. Eredményeik alapján terápiás siker akkor valószínő, ha az AUC/MIC értéke ≥100, ilyenkor 92-100 %-ban volt elérhetı terápiás siker. Amennyiben az AUC/MIC értéke ≤ 100 volt, akkor csupán 4,7-50 %-os terápiás sikerrel lehetett számolni. Ezeknek az adatoknak az ismeretében, véleményünk szerint, C. inconspicua ellen a FLU empirikus, illetve célzott terápiában való alkalmazásra nem javasolható. Az AMB-vel felvett idı-ölés görbék eredményei szerint az izolátumok többségénél (62,5%) a gyógyszer 1 mg/L koncentráció mellett, már 2-24 óra elteltével kiváló fungicid hatásúnak mutatkozott (7. A-B. ábrák, 64. oldal). Eredményeink összhangban vannak a D’Antonio és mtsai (1998) által kapott eredményekkel, miszerint nozokomiális járvány okozta véráramfertrızésekbıl izolált C. inconspicua izolátumok gyorsan reagáltak az intravénásan adagolt AMB (0,7-0,8 mg/kg/nap) kezelésre, ez által jelezve a gyógyszer in vivo kifejtett eredményes hatását. Majoros és mtsai (2005/a) az AMB fungicid hatását vizsgálva MFC módszer segítségével, a C. inconspicua izolátumok esetében azt tapasztalták, hogy az izolátumok viszonylag magas AMB koncentráció jelenlétében (2 mg/L) pusztulnak el. Minthogy az idı-ölés görbék felvételekor kapott eredmények az antifungális szer fungicid hatásának értékelése szempontjából megbízhatóbbak, eredményeinket összegezve az AMB jó terápiás szernek mutatkozik (Pfaller és mtsai 2004/d). Összességében az eredményeink megerısítik, hogy a gyakorlatban a FLU-t igen magas koncentrációban lenne szükséges alkalmazni C. inconspicua okozta candidiázis esetén, így terápiás szempontból a FLU nem javasolható. Az AMB-vel végzett in vitro vizsgálataink, illetve a korábbi in vivo tapasztalatok alapján az AMB hatásosnak tőnik. Súlyos veseelégtelenség vagy AMB terápiára nem javuló esetekben az CAS hatékony alternatíva lehet, mivel kitőnı in vitro hatást mutat a C. inconspicua törzsek ellen mind a MIC, mind pedig az MFC értékeket figyelembe véve (Majoros és mtsai 2005/b). A
83
CAS in vivo hatékonyságát munkacsoportunk jelenleg is teszteli neutropéniás állatmodellen. VII. 3. A C. parapsilosis, C. orthopsilosis és a C. metapsilosis izolátumokkal CAS jelenlétében végzett vizsgálatok A szisztémásan alkalmazható antifungális szerek limitált száma, illetve az invazív gombafertızésben szenvedı betegek között tapasztalható magas mortalitás miatt a sejtfal szintézist gátló echinocandinok klinikai gyakorlatba történı bevezetése különösen örvendetes volt az utóbbi években. A sejtfal szintézisében fıszerepet játszó β-1,3-glükánszintetáz enzimet gátolva hatnak, csökkentve a glükán polimer sejtfal-komponensek szintézisét, ezáltal instabillá téve a gombasejt sejtfalát (Deresinski és Stevens 2003, Stevens és mtsai 2006). Az echinocandinokat fungicidnek tartják a sarjadzó gombák jó része ellen, míg az Aspergillus fajok ellen fungisztatikusnak (Denning és Stevens 2003, Sucher és mtsai 2009). A Candida fajok MIC értéke az echinocandinok iránt általában alacsony (0,03-0,06 mg/L), de néhány faj, mint például a C. parapsilosis és a C. guilliermondii esetén a MIC érték akár a 100-szorosa is lehet a C. albicans esetén tapasztalt alacsonyabb MIC értékeknek. Magas MIC ( > 2 mg/L) értékkel rendelkezı C. albicans, C. glabrata, C. krusei és C. tropicalis klinikai izolátumokat és társuló terápiás sikertelenséget egyaránt leírt az irodalom. Ezekben az esetekben jól dokumentálhatóan a glükán-szintetáz enzim Fks1 alegységének az 1. és a 2. ún. „forró területein” (hot-spot régiók) volt kimutatható aminosav változás (Mora-Duarte és mtsai 2002, Park és mtsai 2005, Balashov és mtsai 2006, Perlin 2007). Így az echinocandin rezisztens C. albicans izolátumokban az Fks1 alegység „elsı forró területein” a 645-ös számú szerin cseréje fenilalaninra, tirozinra vagy prolinra, 8-100-szorosára növeli a MIC értékeket, illetve a 1,3-β-glükán-szintetáz enzim gátlásához legalább 50-szer több echinocandin kell. Az Fks1 alegység „második forró területein” csak egy esetben figyeltek meg mutációt. Hasonló mutációkat figyeltek meg C. glabrata, C. tropicalis és C. krusei esetén is (Katiyar és mtsai 2006, Cowen és Steinbach 2008). Az elıbb említett, aminosav változásban is megnyilvánuló rezisztenciát általában elkülönítik a magas echinocandin koncentráció jelenlétében történı, a sokszor jóval a
84
MIC érték felett történı növekedéstıl, a paradox növekedéstıl (Stevens és mtsai 2004, 2005, 2006). Az echinocandin rezisztencia felismerése a klinikai gyakorlatban fontos, annak ellenére, hogy jelentıs klinikai rezisztenciát mutató izolátumot eddig keveset találtak. Bár több szerzı szerint a rezisztencia kimutatását emelt kezdı csíraszám, AM3 alkalmazása RPMI-1640 helyett, vagy E-teszt alkalmazása segítheti, biztos diagnosztikai módszer jelenleg nincs az aminosav változást eredményezı mutáció kimutatásán kívül (Pai és mtsai 2007). A jobb, a rutin diagnosztikában is alkalmazható diagnosztikus módszerek utáni igény, különösen azoknak az eredményeknek a birtokában mutatkozik meg, amelyeket Arendrup és munkatársai (2010) nemrégiben közöltek. Munkacsoportjuk 29 Fks „hot spot mutáns” és 94 „vad ” Candida izolátum MIC értékét határozta meg 9, különbözı érzékenységi módszerrel, beleértve a CLSI M27-A3-at, az EUCAST Edef 7.1-et és az E-tesztet is caspofungin, anidulafungin és micafungin iránt. Nagyon súlyos tévedést (very major error), azaz amikor rezisztens izolátumot érzékenynek mutatták, 1071%-ban tapasztaltak az alkalmazott módszerekkel micafungin esetén. CAS esetén legjobbnak az agar-dilúciós módszer mutatkozott. A CLSI, az EUCAST és az E-teszt 710 %-ban adott rezisztens izolátumra érzékeny eredményt a CAS esetén. Legjobbak az anidulafunginnal kapott eredmények voltak, ahol a CLSI, az EUCAST és az E-tesztet csak 3-4 %-ban adott rezisztens izolátumra érzékeny eredményt. Eredményeik hasonlóak Desnos-Ollivier és munkatársainak (2008) az eredményeivel, akik 24 Fks1 Candida mutáns esetén az EUCAST módszerrel RPMI-1640-t alkalmazva nem, de az AM3 táptalajban pontosabban el tudták egymástól különíteni a CAS iránt rezisztens izolátumokat az érzékenyektıl. Mindkét szerzı egyetért abban, hogy a CLSI által alkalmazott ≤ 2 mg/L-es határérték magas, a 0,5 mg/L talán sokkal alkalmasabb lenne a rezisztens echinocandin izolátumok kiszőrésére. Munkánkban az echinocandinok iránt csökkent érzékenységet mutató, klinikailag releváns „psilosis”- csoport CAS iránti érzékenységét vizsgáltuk RPMI-1640 és az AM3 közegben az idı-ölés görbék segítségével. AM3 közegben a MIC értékek alacsonyabbak voltak mindhárom faj esetén, mint RPMI-1640-ben. A C. orthopsilosis és a C. metapsilosis MIC értékei 2-3 hígítási fokkal (kettes léptékő hígításnak megfelelıen) alacsonyabbak voltak, mint a C. parapsilosis izolátumok esetén, jelezve, hogy a két új faj kevésbé rezisztens a CAS iránt, mint a C. parapsilosis. Mindkét tesztközegben a CAS a
85
C. metapsilosis izolátumok ellen bizonyult a leghatásosabbnak. Bár a C. orthopsilosis izolátumok MIC értékei alacsonyabbak voltak a C. parapsilosis izolátumok MIC értékeinél, a 48 óra után kapott ölési görbék alapján a két faj hasonlóan viselkedett az RPMI-1640-es tesztközegben (fungisztatikus, esetleg 16 mg/L koncentráción 1-1 esetben fungicid hatás, 9. és 10.a-b. táblázat, 66., 72., 73. oldal). Ugyancsak hasonlóan viselkedett a két faj abban, hogy egy-egy izolátum 2 mg/L CAS koncentrációnál 99,9%os csíraszám csökkenést mutatott. AM3 esetén, 24 órás inkubációs idı után a két faj szintén hasonlóan viselkedett, bár 48 óra után a C. orthopsilosis izolátumok mindegyike 99,9%-os csíraszám csökkenést mutatott. Összevetve a felvett ölési görbék eredményeit mindkét tesztközegben, úgy tőnik, hogy mind az Fks1 polimorfizmusa (az erısen konzervatív prolin cseréje alaninra), mind pedig maga a CAS által kiváltott akut stresszhatás szerepet játszhat az in vitro észlelt csökkent ölésben a C. parapsilosis és C. orthopsilosis esetén. Az RPMI-1640-ben inkább a csökkent ölés, mint fungisztatikus hatás jelentkezett, valószínőleg az Fks1-ben levı mutáció miatt. Huszonnégy óra múlva az AM3-ban, C. orthopsilosis esetén a megfigyelhetı paradox növekedés inkább a magas CAS koncentráció miatti stresszhatásnak, mint a genetikusan meglevı csökkent érzékenységnek tudható be. Említést érdemel, azonban, hogy 48 óra után, mind a C. orthopsilosis, mind pedig a C. metapsilosis izolátumok a ≤ 1 mg/L CAS koncentráción elpusztultak. Bár a C. parapsilosis okozta, invazív candidiázisban szenvedı betegek a hagyományos dózisú (napi 1 mg/kg) CAS terápiára jól reagálnak, egyértelmően nem jelenthetjük ki, hogy a CAS elsıdlegesen választandó szer, különösen neutropéniás betegek kezelése esetén (Mora-Duarte és mtsai 2002, Kuse és mtsai 2007). A C. parapsilosis okozta invazív candidiázisban szenvedı betegek alacsony halálozása echinocandin kezelés esetén valószínőleg inkább a faj alacsonyabb virulenciájának köszönhetı, mint az echinocandinok nagyon jó terápiás hatásának. Jól jelzi ezt a tényt, hogy az echinocandinok dózisának a normál dózisnál kétszer vagy háromszor nagyobb adagban történı adagolása számszerőleg, bár statisztikailag nem kimutathatóan, de növeli a terápiás sikert C. parapsilosis okozta invazív candidiázis esetén (Betts és mtsai 2009). Összefoglalva elmondható, hogy in vitro, az alkalmazott tesztközegtıl függetlenül, a MIC és az ölési görbék eredményei alapján a CAS hatékonyabbnak bizonyult mind a C.
86
orthopsilosis, mind pedig a C. metapsilosis izolátumok ellen, mint a C. parapsilosis ellen. A két tesztközegben kapott ölési görbék közötti hasonlóságok, erısebbek a C. orthopsilosis és a C. parapsilosis között, ezért a C. orthopsilosis okozta invazív candidiázisok echinocandinokkal történı kezelése jelenleg nem tőnik biztonságosnak. Bár a C. metapsilosis izolátumok ellen a CAS jó aktivitást mutatott, nem szabad elfelejteni, hogy ez a faj is tartalmazza az Fks1-ben lévı prolin-alanin cserét, így további, in vivo vizsgálatok dönthetik el csak a két újonnan leírt faj esetén az echinocandin terápia létjogosultságát (Garcia-Effron és mtsai 2008). VII. 4. A C. dubliniensis izolátumokkal végzett vizsgálatok Amint már a bevezetıben és az irodalmi áttekintés során is említésre került, a C. dubliniensis továbbra is leginkább az immundeficiens HIV−fertızött betegek szájüregébıl izolálható. Újabban szinte a világ minden táján elıfordul. Kóroki szerepét azonban számtalan más eset is bizonyítja. Több alkalommal véráramfertızések invazív kórokozójaként is szerepelt, szervtranszplantációt követı neutropéniás esetekben, sıt meningitises betegbıl is izolálták (Moran és mtsai 1997, Sullivan és Coleman 1997, Sullivan és mtsai 1997, Meis és mtsai 1999). Az azol-származékok (FLU, KETO és ITR) gyakori alkalmazása pedig pozitív szelekció eredményeként segíti a kórokozó FLU-rezisztens változatainak az elterjedését (Pfaller és mtsai 2003). Moran és mtsai (1997) HIV−fertızıttekbıl származó C. dubliniensis izolátumoknál elsıként írta le a FLU-rezisztenciát, bizonyítva azt is, hogy a FLU-érzékeny izolátumoknál is generálható a jelenség in vitro (Moran és mtsai 1997, Pfaller és mtsai 1999). FLU-rezisztencia fıleg az elızıleg FLU profilaxisban részesülı betegek (leginkább HIV−fertızöttek) körében figyelhetı meg. Bizonyított, hogy szubterápiás dózisban történı FLU adagolás prediszponál a FLU-rezisztencia kialakulására (Pfaller és mtsai 2003). Külön problémát jelenthet, hogy keresztrezisztencia miatt a többi azol, illetve triazol iránti MIC értékek is emelkedhetnek, csökkentve ezzel a terápiásan alkalmazható antifungális szerek számát. Szerencsére, az AMB, az 5-FC és az echinocandinok iránti MIC értékek nem emelkednek ezekben az esetekben (Moran és mtsai 1997, Pfaller és mtsai 1999, Perea és mtsai 2002).
87
A faj antifungális szerek iránti in vitro érzékenységérıl relatíve kevés tanulmány számol be. Ennek valószínőleg az is oka, hogy a szisztémás kórképekben való elıfordulása a vele genetikai rokonságban levı C. albicans-hoz képest korábban valóban elenyészı volt, s a kutatók is fıleg az utóbbi idıben kezdték a C. dubliniensis-t „keresni” a C. albicans izolátumok között (Pincus és mtsai 2007). Saját munkánkban, az in vitro mikodilúciós vizsgálatok során mindhárom triazol esetében a MIC értékek alacsonynak mutatkoztak, tehát az összes vizsgált izolátum érzékenynek bizonyult. Leghatékonyabbnak a VOR tőnt (VOR MIC = 0,015 mg/L) (11. táblázat, 74. oldal). A triazolokkal felvett idı-ölés görbék eredményei azt mutatták, hogy a POS, a FLU és a VOR a szérumban még könnyen elérhetı koncentráció értéken gátolta a C. dubliniensis törzsek növekedését. Fungicid hatást még magas koncentráció értékeken (4 mg/L, 8 mg/L, 4 mg/L) sem tapasztaltunk (a reprezentatív idı-ölés görbék a 12. B-D. ábrákon láthatók, 77., 78. oldal). Információink szerint egyik beteg sem részesült a C. dubliniensis törzsek izolálása elıtt antifungális terápiában. Mivel ezeknek, a törzseknek a FLU iránti MIC értéke alacsony, ezért a terápia tervezése során relatíve könnyen elérhetjük, hogy az AUC/MIC értéke ≥ 100 legyen, azaz megfelelı dozírozással megelızhetı lehet a FLU terápia alatt kialakuló rezisztencia (RodríguezTudela és mtsai 2007). Az AMB-vel kapott MIC eredményeink a szérumban még biztonságosan elérhetı koncentráció tartományba kerültek (AMB MIC = 0,25-1 mg/L, 11. táblázat, 74. oldal) (Lewis és Wiederhold mtsai 2003, Lewis és mtsai 2006). Az AMB-vel felvett idı-ölés görbékbıl látható, hogy fungicid válasz ≥ 0,5 mg/L-es koncentrációnál következett be, 8 órás inkubációs idı után (a reprezentatív idı-ölés görbe a 11. ábrán látható, 75. oldal). Ez az ölés gyengébb, mint amit az irodalomból C. albicans esetén ismerünk, ahol hasonló koncentrációkon a fungicid hatás akár 2 óra alatt is bekövetkezik (Cantón és mtsai 2004). Alacsony koncentráció értéken (0,25 mg/L) az AMB csupán a 2-es jelzéső, illetve a CD36-os izolátumokkal szemben mutatott fungicid hatást. Eredményeink hasonlóak a Cantón és mtsai (2004) által kapott eredményekhez, akik az AMB-t 0,25 mg/L-es koncentráció értéken alkalmazva C. dubliniensis klinikai izolátumok ellen, már 2 óra elteltével megfigyelték az AMB fungicid hatását. Megjegyzendı, hogy magasabb MFC-vel rendelkezı C. dubliniensis izolátum esetén nem vették fel az idı-ölés görbéket. Mindazonáltal, a saját illetve a Cantón és munkatársainak (2004) in vitro
88
eredményei alapján az AMB biztonságos választásnak tőnik C. dubliniensis okozta fertızések kezelésére. Az 5-FC-nal felvett az idı-ölés görbék felvétele során az antifungális szert a 0,06-2 mg/L koncentráció értéken alkalmazva fungisztatikus hatást váltott ki. Fungicid hatása magasabb koncentráció értéken volt elérhetı 4-8 mg/L (a reprezentatív idı-ölés görbe a 12.A.ábrán látható, 76. oldal), összhangban a fellelhetı irodalomi adatokkal (Goodwin és Drew 2008). Bár az irodalmi adatok beszámolnak 5-FC iránti rezisztens C. dubliniensis izolátumokról, az 5-FC bizonyos esetekben terápiás alternatíva lehet FLU iránt rezisztens C. dubliniensis izolátumok ellen (Fotedar és Al-Hedaithy 2003). Összefoglalva megállapítható, hogy in vitro mindegyik általunk vizsgált antifungális szer a még klinikailag könnyen elérhetı koncentrációkon jó fungisztatikus vagy fungicid aktivitást mutatott a C. dubliniensis klinikai izolátumok ellen. Az esetleges triazol (kereszt)rezisztencia, terápia során való kialakulását ismételt mintavételekkel és érzékenység meghatározással idıben fel kell ismerni, és ha szükséges a fungicid hatású AMB-t lehet alkalmazni.
89
VIII. Következtetések 1. a./ A Micronaut-Candida System azonosító rendszer és API ID 32C segítségével végzett összehasonlító azonosító vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a rendszer 24 órára megbízhatóan azonosítja a klinikai gyakorlatban leggyakrabban elıforduló izolátumok közül a C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata és C. krusei fajokat. A rendszer számára a C. dubliniensis azonosítása sem jelent problémát. b./ Jól használható a teszt-rendszer a rutin gyakorlatban ritkábban elıforduló, de igen változatos antifungális-érzékenységi profillal rendelkezı fajok azonosítására is. Ilyenek a C. famata, C. guilliermondii, C. lusitaniae. c./ Míg egyes FLU-rezisztenciára hajlamos fajok (C. rugosa) azonosításában kiegészítı tesztek jelenlétében teljes megbízhatósággal mőködik a rendszer, addig más (C. inconspicua és C. norvegensis) fajok elkülönítésére legalább célravezetı útmutatót ad, ami a további vizsgálatok szempontjából nagy segítséget jelent a mikrobiológusoknak. d./ Munkánk eredményeként a MICRONAUT-tesztrendszer bevezetésére sor került a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet Diagnosztikai Laboratóriumában, ahol a nagyszámú nem C. albicans izolátumok pontos, 24 óra alatti azonosítását teszi lehetıvé, illetve a kérdéses esetekben segíti a laboratórium munkáját.
2. a./ A C. inconspicua esetén, az idı-ölés görbék felvétele által megállapítható, hogy a flukonazolt igen magas koncentrációban lenne szükséges alkalmazni, így C. inconspicua okozta invazív candidiázis esetén a flukonazol terápiás célra nem javasolható. b./ Az amphotericin B-vel végzett in vitro vizsgálataink megerısítik a korábbi in vitro vizsgálatokkal szerzett tapasztalatokat, miszerint az amphotericin B hatásosnak tőnik.
3. a./ A genetikailag heterogén „psilosis”- csoporton belül elkülönített C. metapsilosis és C. orthopsilosis törzsek viselkedésének tanulmányozásával caspofungin jelenlétében az
90
idı-ölés görbék eredményei alapján megállapítottuk, hogy a caspofungin hatékonyabb a C. orthopsilosis és a C. metapsilosis, mint a C. parapsilosis ellen. b./ Az AM3 és az RPMI-1640 tesztközegben a C. parapsilosis és C. orthopsilosis fajok ölési görbéinek hasonlósága alapján, az echinocandinokkal történı terápia C. orthopsilosis okozta candidiázisok esetén nem tőnik biztonságosnak. Noha a C. metapsilosis izolátumokkal szemben a caspofungin jó in vitro aktivitást mutat, az Fks1 ben levı prolin-alanin csere miatt további in vivo vizsgálatok dönthetik el a két újonnan leírt faj esetében az echinocandin terápia létjogosultságát C. metapsilosis esetén.
4. a./ A terápiában legrégebben használt amphotericin B és 5-fluorocitozin, illetve három triazol, a flukonazol, a vorikonazol és a posakonazol a klinikailag még könnyen elérhetı koncentrációkon jó fungisztatikus vagy fungicid aktivitást mutatott a C. dubliniensis klinikai izolátumok ellen az idı-ölés görbék alapján. Az esetleges triazol (kereszt)rezisztencia, terápia során való kialakulását ismételt mintavételekkel és érzékenység meghatározással idıben fel kell ismerni, és ha szükséges a fungicid hatású amphotericin B-t lehet alkalmazni.
91
IX. Összefoglalás Az utóbbi 3 évtizedben az invazív gombafertızések száma jelentısen megemelkedett. A sarjadzó gombák azonosítását szolgáló kereskedelmi tesztek (API ID 32C, API 20C AUX, API Candida), gyakran nem egyértelmő vagy téves eredményt nyújtanak. A primer és szekunder rezisztenciával rendelkezı nem-albicans Candida fajok gyakoribb elıfordulása szükségessé teszi a fajok pontos azonosítását, illetve antifungális profiljának ismeretét. Az API ID 32C és a MICRONAUT-Candida rendszerrel 264 sarjadzó gomba azonosítását végeztük el. A MICRONAUT-Candida rendszer 24 órás inkubációs idı után teljes megbízhatósággal és kiegészítı tesztek alkalmazása nélkül végezte el a fajszintő azonosítást a leggyakrabban elıforduló C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei és C. parapsilosis izolátumok esetén. Sikeresen használható az új módszer a klinikailag releváns, de ritkábban elıforduló fajok azonosításában is. A C. inconspicua esetén felvett idı-ölés görbék segítségével megállapítottuk, hogy a szérumban még biztonságosan alkalmazható koncentrációban (1 mg/L) az amphotericin B fungicid hatású a C. inconspicua izolátumok ellen, így hatékony terápiás alternatíva lehet bizonyos klinikai helyzetekben. Bebizonyítottuk, hogy a „psilosis”- csoportba tartozó három faj közül in vitro, a C. metapsilosis a legérzékenyebb a caspofungin iránt, akár RPMI-1640, akár AM3 az alkalmazott tesztközeg. Bár a C. orthopsilosis MIC értékei alacsonyabbak a caspofungin iránt, mint a C. parapsilosis sensu stricto izolátumok MIC értékei, az idıölés görbék a két fajnál hasonlóak voltak. A C. dubliniensis izolátumokkal felvett idı-ölés görbék szerint a triazolok gátló hatása már relatíve alacsony koncentrációértéken (2-4 x MIC) is elérhetı. Invazív, C. dubliniensis által okozott fertızések kezelésére leginkább az amphotericin B javasolható a vizsgált antifungális szerek közül jó fungicid hatása miatt.
92
X. Summary The frequency of invasive fungal infections has been increased dramatically during the past three decades. Some commercially available tests used for identification of yeasts (API ID 32C, API 20C AUX, API Candida) often provide uncertain or false results. The frequent emergence of non-albicans Candida species having primary and secondary resistance requires a correct identification of the species as well as knowledge of their antifungal profile. Using the API ID 32C and the MICRONAUT-Candida systems we made an identification of 264 yeasts. The MICRONAUT-Candida system can be used for identification at species level after a 24-hour-long incubation time without using extra tests in the case of C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, which occur very frequently. The new method can be used succesfully in the identification of infrequent but clinically relevant species as well. Our studies with time-kill curves in the case of Candida inconspicua confirmed that Amphotericin B at clinical attainable concentration (1 mg/L) showed fungicidal effect against C. inconspicua isolates, thus it can be an effective in certain clinical situations. We proved that from among the three species belonging to the „psilosis”- group, in vitro the C. metapsilosis was the most susceptible to the caspofungin either the RPMI1640 or the AM3 is the applied medium. Alhough the MIC values of C. orthopsilosis are lower to caspofungin than MIC values of C. parapsilosis sensu stricto isolates, the time-kill curves were similar in both species. In the studies with C. dubliniensis the time-kill curves showed that all triazoles inhibited the growth of C. dubliniensis easily even at relatively low concentrations (2-4 x MIC). Since the amphotericin B showed a good fungicidal effect even at low concentrations, in some invasive infection caused by C. dubliniensis amphotericin B can be proposed from the examined antifungal agents.
93
XI. Irodalomjegyzék Abbas J, Bodey GP, Hanna HA, Mardani M, Girgawy E, Abi-Said D, Whimbey E, Hachem R, Raad I. 2000. Candida krusei fungemia. An escalating serious infection in immunocompromised patients. Arch. Intern. Med.160 (17): 2659-64. Abi-Said D, Anaissie E, Uzun O, Raad I, Pinzcowski H, Vartivarian S. 1997. The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species. Clin. Infect. Dis. 24 (6): 1122-8. Aggarwal N, Pannu HS, Verma P, Saini DM. 2008. Native aortic valve endocarditis caused by Candida sake. J. Heart Valve Dis. 17 (2): 194-6. Agrawal D, Patterson TF, Rinaldi MG, Revankar SG. 2007. Trailing end-point phenotype of Candida spp. in antifungal susceptibility testing to fluconazole is eliminated by altering incubation temperature. J. Med. Microbiol. 56 (Pt 7): 1003-4. Ahmad S, Khan Z, Mustafa AS, Khan ZU. 2002. Seminested PCR for diagnosis of candidemia: comparison with culture, antigen detection, and biochemical methods for species identification. J. Clin. Microbiol. 40 (7): 2483-9. Almirante B, Rodríguez D, Cuenca-Estrella M, Almela M, Sanchez F, Ayats J, Alonso-Tarres C, Rodriguez-Tudela JL, Pahissa A. 2006. Epidemiology, risk factors, and prognosis of Candida parapsilosis bloodstream infections: case-control populationbased surveillance study of patients in Barcelona, Spain, from 2002 to 2003. J. Clin. Microbiol. 44 (5): 1681-5. Andes D. 2003. Clinical pharmacodynamics of antifungals. Infect. Dis. Clin. North. Am. (3): 635-49. Andes D, Marchillo K, Conklin R, Krishna G, Ezzet F, Cacciapuoti A, Loebenberg D. 2004. Pharmacodynamics of a new triazole, posaconazole, in a murine model of disseminated candidiasis. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1): 137-42. Anuradha S, Agarwal SK, Prakash A, Singh NP, Kaur R. 2008. Candida sake− a rare cause of fungal endocarditis. Med. J. Malaysia. 63 (1): 75-6. Arendrup MC, Garcia-Effron G, Lass-Flörl C, Lopez AG, Rodriguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M, Perlin DS. 2010. Echinocandin susceptibility testing of Candida species: comparison of EUCAST EDef 7. 1, CLSI M27-A3, Etest, disk diffusion, and
94
agar dilution methods with RPMI and isosensitest media. Antimicrob. Agents Chemother. 54 (1): 426-39. Arthington-Skaggs BA, Motley M, Warnock DW, Morrison CJ. 2000. Comparative evaluation of PASCO and national committee for clinical laboratory standards M27-A broth microdilution methods for antifungal drug susceptibility testing of yeasts. J. Clin. Microbiol. 38 (6): 2254-60. Baily GG, Moore CB, Essayag SM, de Wit S, Burnie JP, Denning DW. Clin. Infect. Dis. 1997. 25 (1): 161-3. Candida inconspicua, a fluconazole-resistant pathogen in patients infected with human immunodeficiency virus. Clin. Infect. Dis. 25 (1): 161-3. Balashov SV, Park S, Perlin DS. 2006. Assessing resistance to the echinocandin antifungal drug caspofungin in Candida albicans by profiling mutations in FKS1. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (6): 2058-63. Bal AM. 2010. The echinocandins: three useful choices or three too many? Int J Antimicrob Agents. 35(1):13-8. Barchiesi F, Spreghini E, Tomassetti S, Arzeni D, Giannini D, Scalise G. 2005. Comparison of the fungicidal activities of caspofungin and amphotericin B against Candida glabrata. Antimicrob. Agents. Chemother. 49 (12): 4989-92. Barchiesi F, Spreghini E, Tomassetti S, Della Vittoria A, Arzeni D, Manso E, Scalise G. 2006. Effects of caspofungin against Candida guilliermondii and Candida parapsilosis. Antimicrob. Agents. Chemother. 50 (8): 2719-27. Barchiesi F, Spreghini E, Tomassetti S, Giannini D, Scalise G. 2007. Caspofungin in combination with amphotericin B against Candida parapsilosis. Antimicrob. Agents. Chemother. 51 (3): 941-5. Bartizal C, Odds FC. 2003. Influences of methodological variables on susceptibility testing of caspofungin against Candida species and Aspergillus fumigatus. Antimicrob. Agents. Chemother. 47 (7): 2100-7. Bassetti M, Righi E, Costa A, Fasce R, Molinari MP, Rosso R, Pallavicini FB, Viscoli C. 2006. Epidemiological trends in nosocomial candidemia in intensive care. BMC. Infect. Dis. 6: 21. Bedini A, Venturelli C, Mussini C, Guaraldi G, Codeluppi M, Borghi V, Rumpianesi F, Barchiesi F, Esposito R. 2006. Epidemiology of candidaemia and antifungal
95
susceptibility patterns in an Italian tertiary-care hospital.Clin. Microbiol. Infect. 12 (1): 75-80. Bennett F, Saksena AK, Lovey RG, Liu YT, Patel NM, Pinto P, Pike R, Jao E, Girijavallabhan VM, Ganguly AK, Loebenberg D, Wang H, Cacciapuoti A, Moss E, Menzel F, Hare RS, Nomeir A. 2006. Hydroxylated analogues of the orally active broad spectrum antifungal, Sch 51048 (1), and the discovery of posaconazole [Sch 56592; 2 or (S, S)-5]. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (1): 186-90. Berrouane YF, Hollis RJ, Pfaller MA. 1996. Strain variation among and antifungal susceptibilities of isolates of Candida krusei. J. Clin. Microbiol. 34 (7): 1856-8. Betts RF, Nucci M, Talwar D, Gareca M, Queiroz-Telles F, Bedimo RJ, Herbrecht R, Ruiz-Palacios G, Young JA, Baddley JW, Strohmaier KM, Tucker KA, Taylor AF, Kartsonis NA; Caspofungin High-Dose Study Group. 2009. A Multicenter, doubleblind trial of a high-dose caspofungin treatment regimen versus a standard caspofungin treatment regimen for adult patients with invasive candidiasis. Clin. Infect. Dis. 48 (12): 1676-84. Bikandi J, Millán RS, Moragues MD, Cebas G, Clarke M, Coleman DC, Sullivan DJ, Quindós G, Pontón J. 1998. Rapid identification of Candida dubliniensis by indirect immunofluorescence based on differential localization of antigens on C. dubliniensis blastospores and Candida albicans germ tubes. J. Clin. Microbiol. 36 (9): 2428-33. Brandt ME, Harrison LH, Pass M, Sofair AN, Huie S, Li RK, Morrison CJ, Warnock DW, Hajjeh RA. 2000. Candida dubliniensis fungemia: the first four cases in North America.Emerg. Infect. Dis. 6 (1): 46-9. Braun BR, Johnson AD. 1997. Control of filament formation in Candida albicans by the transcriptional repressor TUP1. Science. 277 (5322): 105-9. Buurman ET, Westwater C, Hube B, Brown AJ, Odds FC, Gow NA. 1998. Molecular analysis of CaMnt1p, a mannosyl transferase important for adhesion and virulence of Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95 (13): 7670-5. Calderone R. 1998. The INT1 of Candida albicans.Trends Microbiol. 6 (8): 300-1 Calderone RA, Fonzi WA. 2001. Virulence factors of Candida albicans.Trends Microbiol. 9 (7): 327-35.
96
Cannon RD, Lamping E, Holmes AR, Niimi K, Tanabe K, Niimi M, Monk BC. 2007. Candida albicans drug resistance another way to cope with stress. Microbiology. (Pt 10): 3211-7. Cantón E, Pemán J, Viudes A, Quindós G, Gobernado M, Espinel-Ingroff A. 2003. Minimum fungicidal concentrations of amphotericin B for bloodstream Candida species.Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 45 (3): 203-6. Cantón E, Pemán J, Gobernado M, Viudes A, Espinel-Ingroff A. 2004. Patterns of amphotericin B killing kinetics against seven Candida species.Antimicrob. Agents Chemother. 48 (7): 2477-82. Casadevall A, Pirofski L. 2001. Host-pathogen interactions: the attributes of virulence. J. Infect. Dis. 184 (3): 337-44. Chaffin WL, López-Ribot JL, Casanova M, Gozalbo D, Martínez JP. 1998. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: identification, function, and expression. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1): 130-80. Chamilos G, Lewis RE, Albert N, Kontoyiannis DP. 2007. Paradoxical effect of Echinocandins across Candida species in vitro: evidence for echinocandin-specific and candida species-related differences. Antimicrob. Agents Chemother. 51 (6): 2257-9. Chang HC, Leaw SN, Huang AH, Wu TL, Chang TC. 2001. Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method. J. Clin. Microbiol. 39 (10): 3466-71. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard-third edition. CLSI document M27-A3 (28). Clinical and Laboratory Standards Institute, Pennsylvania, USA. Coenye T, De Vos M, Vandenbosch D, Nelis H. 2008. Factors influencing the trailing endpoint observed in Candida albicans susceptibility testing using the CLSI procedure.Clin. Microbiol. Infect. 14 (5): 495-7. Colombo AL, Nucci M, Salomão R, Branchini ML, Richtmann R, Derossi A, Wey SB. 1999. High rate of non-albicans candidemia in Brazilian tertiary care hospitals. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 34 (4): 281-6.
97
Colombo AL, Nakagawa Z, Valdetaro F, Branchini ML, Kussano EJ, Nucci M. 2003. Susceptibility profile of 200 bloodstream isolates of Candida spp. collected from Brazilian tertiary care hospitals. Med. Mycol. 41 (3): 235-9. Cornely OA, Maertens J, Winston DJ, Perfect J, Ullmann AJ, Walsh TJ, Helfgott D, Holowiecki J, Stockelberg D, Goh YT, Petrini M, Hardalo C, Suresh R, AnguloGonzalez D. 2007. Posaconazole vs. fluconazole or itraconazole prophylaxis in patients with neutropenia. N. Engl. J. Med. 356 (4): 348-59. Cowen LE, Steinbach WJ. 2008. Stress, drugs, and evolution: the role of cellular signaling in fungal drug resistance. Eukaryot Cell. 7 (5): 747-64. Cowen LE. 2009. Hsp90 orchestrates stress response signaling governing fungal drug resistance. PLoS Pathog. 5 (8): e1000471. Cuenca-Estrella M, Gomez-Lopez A, Mellado E, Buitrago MJ, Monzon A, RodriguezTudela JL. 2006. Head-to-head comparison of the activities of currently available antifungal agents against 3, 378 Spanish clinical isolates of yeasts and filamentous fungi. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (3): 917-21. Cutler RE, Blair AD, Kelly MR. 1978. Flucytosine kinetics in subjects with normal and impaired renal function. Clin. Pharmacol. Ther. 24(3):333-42. D'Antonio D, Violante B, Mazzoni A, Bonfini T, Capuani MA, D'Aloia F, Iacone A, Schioppa F, Romano F. 1998. A nosocomial cluster of Candida inconspicua infections in patients with hematological malignancies. J. Clin. Microbiol. 36 (3): 792-5. Daneshmend TK, Warnock DW. 1983. Clinical pharmacokinetics of systemic antifungal drugs. Clin Pharmacokinet. 8 (1):17-42. De Bernardis F, Arancia S, Morelli L, Hube B, Sanglard D, Schäfer W, Cassone A. 1999. Evidence that members of the secretory aspartyl proteinase gene family, in particular SAP2, are virulence factors for Candida vaginitis. J. Infect. Dis. 179 (1): 2018. Denning DW. 2003. Echinocandin antifungal drugs. Lancet. 362 (9390): 1142-51. Deresinski SC, Stevens DA. 2003. Caspofungin. Clin. Infect. Dis. 36 (11): 1445-57.
98
Desnos-Ollivier M, Ragon M, Robert V, Raoux D, Gantier JC, Dromer F. 2008. Debaryomyces hansenii (Candida famata), a rare human fungal pathogen often misidentified as Pichia guilliermondii (Candida guilliermondii). J. Clin. Microbiol. 46 (10): 3237-42. Di Bonaventura G, Spedicato I, Picciani C, D'Antonio D, Piccolomini R. 2004. In vitro pharmacodynamic characteristics of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, and voriconazole against bloodstream isolates of infrequent Candida species from patients with hematologic malignancies. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (11): 44536. Diekema DJ, Pfaller MA, Jones RN; SENTRY Participants Group. 2002. Age-related trends in pathogen frequency and antimicrobial susceptibility of bloodstream isolates in North America: SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-2000. Int. J. Antimicrob. Agents. 20 (6): 412-8. Diekema DJ, Messer SA, Boyken LB, Hollis RJ, Kroeger J, Tendolkar S, Pfaller MA. 2009. In vitro activity of seven systemically active antifungal agents against a large global collection of rare Candida species as determined by CLSI broth microdilution methods. J. Clin. Microbiol. 47 (10): 3170-7. Dóczi I, Dósa E, Hajdú E, Nagy E. 2002. Aetiology and antifungal susceptibility of yeast bloodstream infections in a Hungarian university hospital between 1996 and 2000. J. Med. Microbiol. 51 (8): 677-81. Druetta A, Freydiere A, Guinet R, Gille Y. 1993. Evaluation of five commercial antifungal susceptibility testing systems. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (5): 336-42. Dubé MP, Heseltine PN, Rinaldi MG, Evans S, Zawacki B.1994. Fungemia and colonization with nystatin-resistant Candida rugosa in a burn unit. Clin. Infect. Dis. 18 (1): 77-82. Eagle H. 1948. The paradoxically retarded bactericidal activity of penicillin at high concentrations in vitro and in vivo. J. Clin. Invest. 27 (4): 531. Ernst EJ, Klepser ME, Ernst ME, Messer SA, Pfaller MA. 1999.
In vitro
pharmacodynamic properties of MK-0991 determined by time-kill methods. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 33 (2): 75-80.
99
Ernst EJ, Klepser ME, Pfaller MA. 2000. Postantifungal effects of echinocandin, azole, and polyene antifungal agents against Candida albicans and Cryptococcus neoformans. Antimicrob. Agents. Chemother. 44 (4): 1108-11. Ernst EJ, Roling EE, Petzold CR, Keele DJ, Klepser ME. 2002/a. In vitro activity of micafungin (FK-463) against Candida spp.: microdilution, time-kill, and postantifungaleffect studies. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (12): 3846-53. Ernst EJ, Yodoi K, Roling EE, Klepser ME. 2002/b. Rates and extents of antifungal activities of amphotericin B, flucytosine, fluconazole, and voriconazole against Candida lusitaniae determined by microdilution, E-test, and time-kill methods. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (2): 578-81. Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Hazen KC, Martinez-Suarez JV, Scalise G. 1998. Standardization of antifungal susceptibility testing and clinical relevance. Espinel-Ingroff A. 2001. In vitro fungicidal activities of voriconazole, itraconazole, and amphotericin B against opportunistic moniliaceous and dematiaceous fungi. J. Clin. Microbiol. 39 (3): 954-8. Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Cuenca-Estrella M, Pfaller MA, Rinaldi M, RodriguezTudela JL, Verweij PE. 2005. International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp. to fluconazole, itraconazole, posaconazole, and voriconazole. J. Clin. Microbiol. 43 (8): 3884-9. Espinel-Ingroff A, Cantón E, Peman J, Rinaldi MG, Fothergill AW. 2009. Comparison of 24-hour and 48-hour voriconazole MICs as determined by the Clinical and Laboratory Standards Institute broth microdilution method (M27-A3 document) in three laboratories: results obtained with 2,162 clinical isolates of Candida spp. and other yeasts. J. Clin. Microbiol. 47 (9): 2766-71. Farina C, Saleri N, Lombart JP, Toyb M, Youssouf Z, Caligaris S, Matteelli A. 2009. Epidemiological phenotypic characteristics of vaginal yeasts at the Comoros. Mycoses. 52 (5): 458-61. Fell JW. 1993. Rapid identification of yeast species using three primers in a polymerase chain reaction. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 2 (3): 174-80. Fisher-Hoch SP, Hutwagner L. 1995. Opportunistic candidiasis: an epidemic of the 1980s. Clin. Infect. Dis. 21 (4): 897-904.
100
Fleischhacker M, Radecke C, Schulz B, Ruhnke M. 2008. Paradoxical growth effects of the echinocandins caspofungin and micafungin, but not of anidulafungin, on clinical isolates of Candida albicans and C. dubliniensis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. 27 (2): 127-31. Fotedar R, Al-Hedaithy SS. 2003. Candida dubliniensis at a university hospital in Saudi Arabia. J. Clin. Microbiol. 41 (5): 1907-11. Fricker-Hidalgo H, Vandapel O, Duchesne MA, Mazoyer MA, Monget D, Lardy B, Lebeau B, Freney J, Ambroise-Thomas P, Grillot R. 1996. Comparison of the new API Candida system to the ID 32C system for identification of clinically important yeast species. J. Clin. Microbiol. 34 (7): 1846-8. Garcia-Effron G, Katiyar SK, Park S, Edlind TD, Perlin DS. 2008. A naturally occurring proline-to-alanine amino acid change in Fks1p in Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis accounts for reduced echinocandin susceptibility.Antimicrob. Agents Chemother. 52 (7): 2305-12. García-Martos P, Domínguez I, Marín P, García-Agudo R, Aoufi S, Mira J. 2001. [Antifungal susceptibility of emerging yeast pathogens]. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 19 (6): 249-56. Gauzit R, Cohen Y, Dupont H, Hennequin C, Montravers P, Timsit JF, Veber B, Chevalier E, Blin P, Palestro B. 2003. Infections by Candida sp. in intensive care. Survey of French practices. Presse Med. 32 (10): 440-9. Gee SF, Joly S, Soll DR, Meis JF, Verweij PE, Polacheck I, Sullivan DJ, Coleman DC. 2002. Identification of four distinct genotypes of Candida dubliniensis and detection of microevolution in vitro and in vivo. J. Clin. Microbiol. 40 (2): 556-74. Ghannoum MA, Rice LB. 1999. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol Rev. 12 (4): 501-17. Ghannoum MA, Rice LB. 2004. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. J. Clin. Microbiol. 42 (1): 490. Gilfillan GD, Sullivan DJ, Haynes K, Parkinson T, Coleman DC, Gow NA. 1998. Candida dubliniensis: phylogeny and putative virulence factors. Microbiology.144 (Pt 4): 829-38.
101
Girmenia C, Pizzarelli G, Cristini F, Barchiesi F, Spreghini E, Scalise G, Martino P. 2006. Candida guilliermondii fungemia in patients with hematologic malignancies. J. Clin. Microbiol. 44 (7): 2458-64. Girmenia C. 2009. New generation azole antifungals in clinical investigation. Expert Opin. Investig. Drugs. (9): 1279-95. Gomez-Lopez A, Alastruey-Izquierdo A, Rodriguez D, Almirante B, Pahissa A, Rodriguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M; Barcelona Candidemia Project Study Group. 2008. Prevalence and susceptibility profile of Candida metapsilosis and Candida orthopsilosis: results from population-based surveillance of candidemia in Spain. Antimicrob. Agents Chemother. 52 (4): 1506-9. Goodwin ML, Drew RH. 2008. Antifungal serum concentration monitoring: an update. J. Antimicrob. Chemother. 61 (1): 17-25. Graf B, Adam T, Zill E, Göbel UB. 2000. Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of yeasts and yeast-like organisms. J. Clin. Microbiol. 38 (5): 1782-5. Graybill JR, Najvar LK, Luther MF, Fothergill AW. 1997. Treatment of murine disseminated candidiasis with L-743, 872. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (8): 1775-7. Gutierrez J, Martin E, Lozano C, Coronilla J, Nogales C. 1994. Evaluation of the ATB 32C, automicrobic system and API 20C using clinical yeast isolates. Ann. Biol. Clin. (Paris). 52 (6): 443-6. Haase G, Schulze H. 2006. Influence of culture medium on performance of yeast identification system (MICRONAUT Candida). Abstract: P862, Aachen, Bornheim, DE. Hakki M, Staab JF, Marr KA. 2006. Emergence of a Candida krusei isolate with reduced susceptibility to caspofungin during therapy. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (7): 2522-4. Haynes K. 2001. Virulence in Candida species.Trends Microbiol. 9 (12): 591-6. Hospenthal DR, Beckius ML, Floyd KL, Horvath LL, Murray CK. 2006. Presumptive identification of Candida species other than C. albicans, C. krusei, and C. tropicalis with the chromogenic medium CHROMagar Candida. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 5: 1.
102
Hoyer LL. 2001. The ALS gene family of Candida albicans.Trends Microbiol. 9 (4): 176-80. Hube B, Rüchel R, Monod M, Sanglard D, Odds FC. 1998. Functional aspects of secreted Candida proteinases. Adv. Exp. Med. Biol. 436: 339-44. Jacobsen MD, Whyte JA, Odds FC. 2007. Candida albicans and Candida dubliniensis respond differently to echinocandin antifungal agents in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 51 (5): 1882-4. Kahn JN, Garcia-Effron G, Hsu MJ, Park S, Marr KA, Perlin DS. 2007. Acquired echinocandin resistance in a Candida krusei isolate due to modification of glucan synthase. Antimicrob. Agents Chemother. 51 (5): 1876-8. Kanafani ZA, Perfect JR. 2008. Antimicrobial resistance: resistance to antifungal agents: mechanisms and clinical impact. Clin. Infect. Dis. 46 (1): 120-8. Katiyar S, Pfaller M, Edlind T. 2006. Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates exhibiting reduced echinocandin susceptibility. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (8): 2892-4. Kauffman CA, Carver PL. 2008. Update on echinocandin antifungals. Semin. Respir. Crit. Care Med. 29 (2): 211-9. Keele DJ, DeLallo VC, Lewis RE, Ernst EJ, Klepser ME. 2001. Evaluation of amphotericin B and flucytosine in combination against Candida albicans and Cryptococcus neoformans using time-kill methodology. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 41 (3): 121-6. Kinneberg KM, Bendel CM, Jechorek RP, Cebelinski EA, Gale CA, Berman JG, Erlandsen SL, Hostetter MK, Wells CL. 1999. Effect of INT1 gene on Candida albicans murine intestinal colonization.J. Surg. Res. 87 (2): 245-51. Kirkpatrick WR, Revankar SG, Mcatee RK, Lopez-Ribot JL, Fothergill AW, McCarthy DI, Sanche SE, Cantu RA, Rinaldi MG, Patterson TF. 1998. Detection of Candida dubliniensis in oropharyngeal samples from human immunodeficiency virusinfected patients in North America by primary CHROMagar candida screening and susceptibility testing of isolates. J. Clin. Microbiol. 36 (10): 3007-12. Kirkpatrick WR, McAtee RK, Fothergill AW, Rinaldi MG, Patterson TF. 2000. Efficacy of voriconazole in a guinea pig model of disseminated invasive aspergillosis. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (10): 2865-8.
103
Klepser ME, Ernst EJ, Lewis RE, Ernst ME, Pfaller MA. 1998. Influence of test conditions on antifungal time-kill curve results: proposal for standardized methods. Antimicrob. Agents Chemother. 42 (5): 1207-12. Klepser ME, Malone D, Lewis RE, Ernst EJ, Pfaller MA. 2000. Evaluation of voriconazole pharmacodynamics using time-kill methodology. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (7): 1917-20. Kocsubé S, Tóth M, Vágvölgyi C, Dóczi I, Pesti M, Pócsi I, Szabó J, Varga J. 2007. Occurrence and genetic variability of Candida parapsilosis sensu lato in Hungary. J. Med. Microbiol. 56 (Pt 2): 190-5. Kofteridis DP, Lewis RE, Kontoyiannis DP. 2009. Caspofungin-non-susceptible Candida isolates in cancer patients. J. Antimicrob. Chemother. Dec 16. Kretschmar M, Hube B, Bertsch T, Sanglard D, Merker R, Schröder M, Hof H, Nichterlein T. 1999. Germ tubes and proteinase activity contribute to virulence of Candida albicans in murine peritonitis. Infect. Immun. 67 (12): 6637-42. Kurtzman, C. P. 1998. Pichia E. C. Hansen emend. Kurtzman, p. 273-352. In C. P. Kurtzmann and J. W. Fell (ed.). The yeasts, a taxonomic study. Elsevier, Emsterdam, The Netherlands. Kuse ER, Chetchotisakd P, da Cunha CA, Ruhnke M, Barrios C, Raghunadharao D, Sekhon JS, Freire A, Ramasubramanian V, Demeyer I, Nucci M, Leelarasamee A, Jacobs F, Decruyenaere J, Pittet D, Ullmann AJ, Ostrosky-Zeichner L, Lortholary O, Koblinger S, Diekmann-Berndt H, Cornely OA; Micafungin Invasive Candidiasis Working Group. 2007. Micafungin versus liposomal amphotericin B for candidaemia and invasive candidosis: a phase III randomised double-blind trial.Lancet. 369 (9572): 1519-27. Lattif AA, K Mukherjee P, Chandra J, Swindell K, Lockhart SR, Diekema DJ, Pfaller MA, Ghannoum MA. 2009. Characterization of biofilms formed by Candida parapsilosis, C. metapsilosis, and C. orthopsilosis. Int. J. Med. Microbiol. Nov 19. Leaw SN, Chang HC, Sun HF, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. 2006. Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions. J. Clin. Microbiol. 44 (3): 693-9. Lee MK, Kim HR, Kang JO, Kim MN, Kim EC, Kim JS, Kim JJ, Park YJ, Song W, Shin JH, Lee KM, Lee NY, Lee M, Lee WG, Lee CK, Lee HJ, Chang CL, Choi TY.
104
2007. Susceptibility and trailing growth of Candida albicans to fluconazole: results of a Korean multicentre study. Mycoses. 50 (2): 148-9. Levy I, Rubin LG, Vasishtha S, Tucci V, Sood SK. 1998. Emergence of Candida parapsilosis as the predominant species causing candidemia in children.Clin. Infect. Dis. 26 (5): 1086-8. Lewis RE, Wiederhold NP. 2003. The solubility ceiling: a rationale for continuous infusion amphotericin B therapy? Clin. Infect. Dis. 37 (6): 871-2. Lewis RE, Wiederhold NP, Prince RA, Kontoyiannis DP. 2006. In vitro pharmacodynamics of rapid versus continuous infusion of amphotericin B deoxycholate against Candida species in the presence of human serum albumin. J. Antimicrob. Chemother. 57 (2): 288-93. Lewis RE. 2008. What is the "therapeutic range" for voriconazole? Clin. Infect. Dis. 46 (2): 212-4. Linares CE, de Loreto ES, Silveira CP, Pozzatti P, Scheid LA, Santurio JM, Alves SH. 2007. Enzymatic and hemolytic activities of Candida dubliniensis strains. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 49 (4): 203-6. Lockhart SR, Messer SA, Pfaller MA, Diekema DJ. 2008. Geographic distribution and antifungal susceptibility of the newly described species Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis in comparison to the closely related species Candida parapsilosis. J. Clin. Microbiol. 46 (8): 2659-64. MacCallum DM, Odds FC. 2004. Need for early antifungal treatment confirmed in experimental disseminated Candida albicans infection. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (12): 4911-4. Mackay IM. 2004. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol Infect. 10 (3): 190-212. Maertens J, Boogaerts M. 2005. The place for itraconazole in treatment. J. Antimicrob. Chemother. 56 Suppl 1: i33-i38. Magill SS, Shields C, Sears CL, Choti M, Merz WG. 2006. Triazole cross-resistance among Candida spp.: case report, occurrence among bloodstream isolates, and implications for antifungal therapy. J. Clin. Microbiol. 44 (2): 529-35. Majoros L, Kardos G, Belák A, Maráz A, Asztalos L, Csánky E, Barta Z, Szabó B. 2003. Restriction enzyme analysis of ribosomal DNA shows that Candida inconspicua
105
clinical isolates can be misidentified as Candida norvegensis with traditional diagnostic procedures. J. Clin. Microbiol. 41 (11): 5250-3. Majoros L, Kardos G, Feiszt P, Szabó B. 2005/a. Efficacy of amphotericin B and flucytosine against fluconazole-resistant Candida inconspicua clinical isolates. J. Antimicrob. Chemother. 56 (1): 253-4. Majoros L, Kardos G, Szabó B, Sipiczki M. 2005/b. Caspofungin susceptibility testing of Candida inconspicua: correlation of different methods with the minimal fungicidal concentration. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (8): 3486-8. Majoros L, Kardos G, Szabó B, Kovács M, Maráz A. 2005/c. Fluconazole susceptibility testing of Candida inconspicua clinical isolates: comparison of four methods. J. Antimicrob. Chemother. 55 (2): 275-6. Majoros L, Szegedi I, Kardos G, Erdész C, Kónya J, Kiss C. 2006. Slow response of invasive Candida krusei infection to amphotericin B in a clinical time-kill study. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25 (12): 803-6. Majoros L, Kardos G. 2008. Fungicidal activity of azole antifungal agents. AntiInfective Agents in Medicinal Chemistry. 7, 000-000. Malani A, Hmoud J, Chiu L, Carver PL, Bielaczyc A, Kauffman CA. 2005. Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care center. Clin. Infect. Dis. 41 (7): 975-81. Manavathu EK, Cutright JL, Chandrasekar PH. 1998. Organism-dependent fungicidal activities of azoles. Antimicrob.Agents Chemother. 42 (11): 3018-21. Marr KA, Seidel K, White TC, Bowden RA. 2000. Candidemia in allogeneic blood and marrow transplant recipients: evolution of risk factors after the adoption of prophylactic fluconazole. J. Infect. Dis. 181 (1): 309-16. Marriott D, Laxton M, Harkness J. 2001. Candida dubliniensis candidemia in Australia. Emerg. Infect. Dis. 7(3):479. Martinez M, López-Ribot JL, Kirkpatrick WR, Coco BJ, Bachmann SP, Patterson TF. 2002.
Replacement
of
Candida
albicans
with
C.
dubliniensis
in
human
immunodeficiency virus-infected patients with oropharyngeal candidiasis treated with fluconazole. J. Clin. Microbiol. 40 (9): 3135-9. Meis JF, Ruhnke M, De Pauw BE, Odds FC, Siegert W. 1999. Candida dubliniensis candidemia in patients with chemotherapy-induced neutropenia and bone marrow transplantation. Emerg. Infect Dis. 5 (1): 150-3.
106
Messer SA, Jones RN, Fritsche TR. 2006. International surveillance of Candida spp. and Aspergillus spp.: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2003). J. Clin. Microbiol. 44 (5): 1782-7. Meyer SA., R. W. Payne, D. Yarrow. 1998. Candida Berkhout, p.: 454-573. In C. P. Kurtzmann and J. W. Fell (ed.), The yeats, a taxonomic study. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. Mikamo H, Hua YX, Hayasaki Y, Sato Y, Tamaya T. 2000. Effects of fluconazole on viable cell count in experimental intraperitoneal Candida abscesses. J. Infect. Chemother. 6 (3): 144-7. Morace G, Polonelli L; GISIA Group. 2005. Voriconazole activity against clinical yeast isolates: a multicentre Italian study. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (3): 247-53. Mora-Duarte J, Betts R, Rotstein C, Colombo AL, Thompson-Moya L, Smietana J, Lupinacci R, Sable C, Kartsonis N, Perfect J; Caspofungin Invasive Candidiasis Study Group. 2002. Comparison of caspofungin and amphotericin B for invasive candidiasis. N. Engl. J. Med. 347 (25): 2020-9. Moran GP, Sullivan DJ, Henman MC, McCreary CE, Harrington BJ, Shanley DB, Coleman DC. 1997. Antifungal drug susceptibilities of oral Candida dubliniensis isolates from human immunodeficiency virus (HIV)-infected and non-HIV-infected subjects and generation of stable fluconazole-resistant derivatives in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (3): 617-23. Moran GP, Sanglard D, Donnelly SM, Shanley DB, Sullivan DJ. 1998. Identification and expression of multidrug transporters responsible for fluconazole resistance in Candida dubliniensis. Antimicrob. Agents Chemother. 42 (7): 1819-30. Munayyer HK, Mann PA, Chau AS, Yarosh-Tomaine T, Greene JR, Hare RS, Heimark L, Palermo RE, Loebenberg D. 2004. Posaconazole is a potent inhibitor of sterol 14-alpha-demethylation in yeasts and molds. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (10): 3690-6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibility testing: conceptual framework and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, itraconazole, and Candida infections. Clin. Infect. Dis. 24: 235-247.
107
National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standard M27-A2. National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne, Pa. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2004. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts. Approved guideline M44-A. NCCLS, Wayne (USA). Nguyen MH, Peacock JE Jr, Morris AJ, Tanner DC, Nguyen ML, Snydman DR, Wagener MM, Rinaldi MG, Yu VL. 1996. 10. The changing face of candidemia: emergence of non-Candida albicans species and antifungal resistance. Am. J. Med. 100 (6): 617-23. Nucci M, Marr KA. 2005. Emerging fungal diseases. Clin. Infect. Dis. 2005. 41 (4): 521-6. Oblack DL, Rhodes JC, Martin WJ. 1981. Clinical evaluation of the AutoMicrobic system Yeast Biochemical Card for rapid identification of medically important yeasts. J. Clin. Microbiol. 13 (2): 351-5. Odds FC, Bernaerts R. 1994. CHROMagar Candida, a new differential isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J. Clin. Microbiol. 32 (8): 1923-9. Ostrosky-Zeichner L, Rex JH, Pappas PG, Hamill RJ, Larsen RA, Horowitz HW, Powderly WG, Hyslop N, Kauffman CA, Cleary J, Mangino JE, Lee J. 2003. Antifungal susceptibility survey of 2, 000 bloodstream Candida isolates in the United States. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (10): 3149-54. Pai MP, Jones AL, Mullen CK. 2007. Micafungin activity against Candida bloodstream isolates: effect of growth medium and susceptibility testing method. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 58 (1): 129-32. Page BT, Kurtzman CP. 2005. Rapid identification of Candida species and other clinically important yeast species by flow cytometry. J. Clin. Microbiol 2005, 43: 45174514. Pappas PG, Rex JH, Sobel JD, Filler SG, Dismukes WE, Walsh TJ, Edwards JE; Infectious Diseases Society of America. 2004. Guidelines for treatment of candidiasis. Clin. Infect. Dis. 38 (2): 161-89.
108
Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr, Calandra TF, Edwards JE Jr, Filler SG, Fisher JF, Kullberg BJ, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Rex JH, Walsh TJ, Sobel JD; Infectious Diseases Society of America. 2009.Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America.Clin. Infect. Dis. 48 (5): 503-35. Park S, Kelly R, Kahn JN, Robles J, Hsu MJ, Register E, Li W, Vyas V, Fan H, Abruzzo G, Flattery A, Gill C, Chrebet G, Parent SA, Kurtz M, Teppler H, Douglas CM, Perlin DS. 2005. Specific substitutions in the echinocandin target Fks1p account for reduced susceptibility of rare laboratory and clinical Candida sp. isolates. Antimicro. Agents Chemother. 49 (8): 3264-73. Pascual A, Calandra T, Bolay S, Buclin T, Bille J, Marchetti O. 2008. Voriconazole therapeutic drug monitoring in patients with invasive mycoses improves efficacy and safety outcomes.Clin. Infect. Dis. 46 (2):201-11. Paugam A, Baixench MT, Viguié C. 2008. An update on Candida dubliniensis. Med. Mal. Infect. 38 (1): 1-7. Pelletier R, Alarie I, Lagacé R, Walsh TJ. 2005. Emergence of disseminated candidiasis caused by Candida krusei during treatment with caspofungin: case report and review of literature. Med. Mycol.43 (6): 559-64. Perea S, López-Ribot JL, Wickes BL, Kirkpatrick WR, Dib OP, Bachmann SP, Keller SM, Martinez M, Patterson TF. 2002. Molecular mechanisms of fluconazole resistance in Candida dubliniensis isolates from human immunodeficiency virus-infected patients with oropharyngeal candidiasis. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (6): 1695-703. Perlin DS. 2007. Resistance to echinocandin-class antifungal drugs. Drug Resist. Updat. 10 (3): 121-30. Pfaller MA, Messer SA, Gee S, Joly S, Pujol C., Sullivan DJ., Coleman DC., Soll DR. 1999. In vitro susceptibilities of Candida dubliniensis isolates tested against the triazole and echinocandin antifungal agents. J. Clin. Microbiol. 437 (3): 870-872. Pfaller MA, Diekema DJ, Messer SA, Boyken L, Hollis RJ, Jones RN; International Fungal Surveillance Participant Group. 2003. In vitro activities of voriconazole, posaconazole, and four licensed systemic antifungal agents against Candida species infrequently isolated from blood. J. Clin. Microbiol. 41 (1): 78-83.
109
Pfaller MA, Messer SA, Boyken L, Hollis RJ, Rice C, Tendolkar S, Diekema DJ. 2004/a. In vitro activities of voriconazole, posaconazole, and fluconazole against 4, 169 clinical isolates of Candida spp. and Cryptococcus neoformans collected during 2001 and 2002 in the ARTEMIS global antifungal surveillance program. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48 (3): 201-5. Pfaller MA, Messer SA, Boyken L, Rice C, Tendolkar S, Hollis RJ, Diekema DJ. 2004/b. Further standardization of broth microdilution methodology for in vitro susceptibility testing of caspofungin against Candida species by use of an international collection of more than 3, 000 clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 42 (7): 3117-9. Pfaller MA, Messer SA, Boyken L, Tendolkar S, Hollis RJ, Diekema DJ. 2004/c. Geographic variation in the susceptibilities of invasive isolates of Candida glabrata to seven systemically active antifungal agents: a global assessment from the ARTEMIS Antifungal Surveillance Program conducted in 2001 and 2002.Clin. Microbiol. 42 (7): 3142-6. Pfaller MA, Sheehan DJ, Rex JH. 2004/d. Determination of fungicidal activities against yeasts and molds: lessons learned from bactericidal testing and the need for standardization. Clin. Microbiol. Rev. 17 (2): 268-80. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. 2005. In vitro activities of anidulafungin against more than 2, 500 clinical isolates of Candida spp., including 315 isolates resistant to fluconazole. J. Clin. Microbiol. 43 (11): 5425-7. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. 2006/a. In vitro susceptibilities of Candida spp. to caspofungin: four years of global surveillance. J. Clin. Microbiol. 44 (3): 760-3. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. 2006/b. Global surveillance of in vitro activity of micafungin against Candida: a comparison with caspofungin by CLSI-recommended methods. J. Clin. Microbiol. 44 (10): 3533-8. Pfaller MA, Diekema DJ, Colombo AL, Kibbler C, Ng KP, Gibbs DL, Newell VA. 2006/c. Candida rugosa, an emerging fungal pathogen with resistance to azoles: geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK antifungal surveillance program. J. Clin. Microbiol. 44 (10): 3578-82. Pfaller MA, Diekema DJ, Mendez M, Kibbler C, Erzsebet P, Chang SC, Gibbs DL, Newell VA. 2006/d. Candida guilliermondii, an opportunistic fungal pathogen with
110
decreased susceptibility to fluconazole: geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK antifungal surveillance program. J. Clin. Microbiol. 44 (10): 3551-6. Pfaller MA, Diekema DJ, Sheehan DJ. 2006/e. Interpretive breakpoints for fluconazole and Candida revisited: a blueprint for the future of antifungal susceptibility testing. Clin. Microbiol. Rev. 19 (2): 435-47. Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem.Clin. Microbiol. Rev. 20 (1): 133-63. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Meis JF, Gould IM, Fu W, Colombo AL, Rodriguez-Noriega E; Global Antifungal Surveillance Study. 2007. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance study, 1997 to 2005: an 8. 5-year analysis of susceptibilities of Candida species and other yeast species to fluconazole and voriconazole determined by CLSI standardized disk diffusion testing. J. Clin. Microbiol. 45 (6): 1735-45. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Nagy E, Dobiasova S, Rinaldi M, Barton R, Veselov, A Global Antifungal Surveillance Group. 2008/a. Candida krusei, a multidrug-resistant opportunistic fungal pathogen: geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program, 2001 to 2005. J. Clin. Microbiol. 46 (2): 515-21. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Ng KP, Colombo A, Finquelievich J, Barnes R, Wadula J; Global Antifungal Surveillance Group. 2008/b. Geographic and temporal trends in isolation and antifungal susceptibility of Candida parapsilosis: a global assessment from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program, 2001 to 2005. J. Clin. Microbiol. 46 (3): 842-9. Pfaller MA, Diekema DJ, Ostrosky-Zeichner L, Rex JH, Alexander BD, Andes D, Brown SD, Chaturvedi V, Ghannoum MA, Knapp CC, Sheehan DJ, Walsh TJ. 2008/c. Correlation of MIC with outcome for Candida species tested against caspofungin, anidulafungin, and micafungin: analysis and proposal for interpretive MIC breakpoints. J. Clin. Microbiol. 46 (8): 2620-9. Pincus DH, Orenga S, Chatellier S. 2007. Yeast identification- past, present, and future methods. Med. Mycol. 45 (2): 97-121.
111
Pinjon E, Sullivan D, Salkin I, Shanley D, Coleman D. 1998. Simple, inexpensive, reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans. J. Clin. Microbiol.36 (7): 2093-5. Pinjon E, Moran GP, Jackson CJ, Kelly SL, Sanglard D, Coleman DC, Sullivan DJ. 2003. Molecular mechanisms of itraconazole resistance in Candida dubliniensis. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (8): 2424-37. Pinjon E, Moran GP, Coleman DC, Sullivan DJ. 2005. Azole susceptibility and resistance in Candida dubliniensis. Biochem. Soc. Trans. 33 (Pt 5): 1210-4. Pugh D, Cawson RA. 1977.The cytochemical localization of phospholipase in Candida albicans infecting the chick chorio-allantoic membrane. Sabouraudia. 15 (1): 29-35. Ramani R, Gromadzki S, Pincus DH, Salkin IF, Chaturvedi V. 1998. Efficacy of API 20C and ID 32C systems for identification of common and rare clinical yeast isolates. J. Clin. Microbiol. 36 (11): 3396-8. Reinhardt JF, Ruane PJ, Walker LJ, George WL. 1985. Intravenous catheterassociated fungemia due to Candida rugosa. J. Clin. Microbiol. 22 (6): 1056-7. Rex JH, Pfaller MA, Walsh TJ, Chaturvedi V, Espinel-Ingroff A, Ghannoum MA, Gosey LL, Odds FC, Rinaldi MG, Sheehan DJ, Warnock DW. 2001. Antifungal susceptibility testing: practical aspects and current challenges. Clin. Microbiol Rev. 14 (4): 643-58. Riddle DL, Giger O, Miller L, Hall GS, Woods GL. 1994. Clinical comparison of the Baxter MicroScan Yeast Identification Panel and the Vitek Yeast Biochemical Card. Am. J. Clin. Pathol. 101 (4): 438-42. Rodero L, Davel G, Soria M, Vivot W, Córdoba S, Canteros CE, Saporiti A; EMIFN. 2005. Multicenter study of fungemia due to yeasts in Argentina. Rev. Argent. Microbiol. 37 (4): 189-95. Rodríguez-Tudela JL, Almirante B, Rodríguez-Pardo D, Laguna F, Donnelly JP, Mouton JW, Pahissa A, Cuenca-Estrella M. 2007. Correlation of the MIC and dose/MIC ratio of fluconazole to the therapeutic response of patients with mucosal candidiasis and candidemia. Antimicrob. Agents Chemother. 51 (10): 3599-604. Szabó B, Miszti C, Majoros L, Nábrádi Z, Gomba S. 2000. Isolation of rare opportunistic pathogens in Hungary: case report and short review of the literature. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 47 (1): 9-14.
112
Szalka A, Simon Gy. Az orvosi mikológia gyakorlati kérdései. Golden Book, Budapest, 2000. 59, 73-75, 95. Salkin IF, Pruitt WR, Padhye AA, Sullivan D, Coleman D, Pincus D H. 1998. Distinctive carbohydrate assimilation profiles used to identify the first clinical isolates of Candida dubliniensis recovered in the United States. J. Clin. Microbiol. 36: 1467. Sandven P, Bevanger L, Digranes A, Haukland HH, Mannsåker T, Gaustad P; Norwegian Yeast Study Group. 2006. Candidemia in Norway (1991 to 2003): results from a nationwide study. J. Clin. Microbiol. 44 (6): 1977-81. Sanguinetti M, Porta R, Sali M, La Sorda M, Pecorini G, Fadda G, Posteraro B. 2007. Evaluation of VITEK 2 and RapID yeast plus systems for yeast species identification: experience at a large clinical microbiology laboratory. J. Clin. Microbiol. 45 (4): 13436. Serena C, Gilgado F, Mariné M, Pastor FJ, Guarro J. 2006. Efficacy of voriconazole in a guinea pig model of invasive trichosporonosis. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (6): 2240-3. Sheehan DJ, Hitchcock CA, Sibley CM. 1999. Current and emerging azole antifungal agents. Clin. Microbiol. Rev. 12 (1): 40-79. Singh SD, Robbins N, Zaas AK, Schell WA, Perfect JR, Cowen LE. 2009. Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeast Candida albicans via calcineurin. PLoS Pathog. 5 (7): e1000532. Sóczó G, Kardos G, McNicholas PM, Falusi E, Gergely L, Majoros L. 2007/a. Posaconazole susceptibility testing against Candida species: comparison of broth microdilution and E-test methods. Mycoses. 50 (3): 178-82. Sóczó G, Kardos G, Varga I, Kelentey B, Gesztelyi R, Majoros L. 2007/b. In vitro study of Candida tropicalis isolates exhibiting paradoxical growth in the presence of high concentrations of caspofungin. Antimicrob. Agents Chemother. 51 (12): 4474-6. Sóczó G. 2009. Doktori értekezés. Posakonazol in vitro hatékonyságának vizsgálata különbözı módszerekkel, beleértve az idı-ölés görbék felvételét is, a klinikailag jelentıs Candida fajok ellen. 8-9, 14-15, 16-18. Somogyvari F, Doczi I, Serly J, Ahmad S, Nagy E. 2007. Rapid discrimination between Candida albicans and Candida dubliniensis by using real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect Dis. 58 (3): 367-9.
113
Spellberg BJ, Filler SG, Edwards JE. 2006. Current treatment strategies for disseminated candidiasis. Clin. Infect. Dis. 42 (2): 244-51. Staab JF, Bradway SD, Fidel PL, Sundstrom P. 1999. Adhesive and mammalian transglutaminase substrate properties of Candida albicans Hwp1. Science. 283 (5407): 1535-8. Stevens DA, Espiritu M, Parmar R. 2004. Paradoxical effect of caspofungin: reduced activity against Candida albicans at high drug concentrations. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (9): 3407-11. Stevens DA, White TC, Perlin DS, Selitrennikoff CP. 2005. Studies of the paradoxical effect of caspofungin at high drug concentrations. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: 173-178. Stevens DA, Ichinomiya M, Koshi Y, Horiuchi H. 2006. Escape of Candida from caspofungin inhibition at concentrations above the MIC (paradoxical effect) accomplished by increased cell wall chitin; evidence for beta-1, 6-glucan synthesis inhibition by caspofungin. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (9): 3160-1. Stone EA, Fung HB, Kirschenbaum HL. 2002. Caspofungin: an echinocandin antifungal agent. Clin. Ther. 24 (3): 351-77; Sugita T, Takeo K, Ohkusu M, Virtudazo E, Takashima M, Asako E, Ohshima F, Harada S, Yanaka C, Nishikawa A, Majoros L, Sipiczki M. 2004. Fluconazole-resistant pathogens Candida inconspicua and C. norvegensis: DNA sequence diversity of the rRNA intergenic spacer region, antifungal drug susceptibility, and extracellular enzyme production. Microbiol. Immunol. 48 (10): 761-6 Sucher AJ, Chahine EB, Balcer HE. 2009. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann. Pharmacother. 43 (10): 1647-57. Sullivan D, Coleman D. 1997. Candida dubliniensis: an emerging opportunistic pathogen. Curr. Top. Med. Mycol. 8 (1-2): 15-25. Sullivan D, Haynes K, Bille J, Boerlin P, Rodero L, Lloyd S, Henman M, Coleman D. 1997. Widespread geographic distribution of oral Candida dubliniensis strains in human immunodeficiency virus-infected individuals. J. Clin. Microbiol. 35 (4): 960-4. Swinne D, Raes-Wuytack C, Van Looveren K, Desmet P. 1999. Comparative evaluation of Fungitest-, Neo-Sensitabs- and M27T-NCCLS broth microdilution
114
methods for antifungal drug susceptibility testing of Candida species and Cryptococcus neoformans. Mycoses. 42 (4): 231-7. Tavanti A, Davidson AD, Gow NA, Maiden MC, Odds FC. 2005. Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis spp. nov. to replace Candida parapsilosis groups II and III. J. Clin. Microbiol. 43 (1): 284-92. Timpel C, Zink S, Strahl-Bolsinger S, Schröppel K, Ernst J. 2000. Morphogenesis, adhesive properties, and antifungal resistance depend on the Pmt6 protein mannosyltransferase in the fungal pathogen Candida albicans. J. Bacteriol. 182 (11): 3063-71. Tintelnot K, Haase G, Seibold M, Bergmann F, Staemmler M, Franz T, Naumann D. 2000. Evaluation of phenotypic markers for selection and identification of Candida dubliniensis. J. Clin. Microbiol. 38 (4): 1599-608. Trost A, Graf B, Eucker J, Sezer O, Possinger K, Göbel UB, Adam T. 2004. Identification of clinically relevant yeasts by PCR/RFLP. J. Microbiol. Methods. 56 (2): 201-11. Valenza G, Strasen J, Schäfer F, Frosch M, Kurzai O, Abele-Horn M. 2008. Evaluation of new colorimetric vitek 2 yeast identification card by use of different source media. J. Clin. Microbiol. 46 (11): 3784-7. van Asbeck E, Clemons KV, Martinez M, Tong AJ, Stevens DA. 2008. Significant differences in drug susceptibility among species in the Candida parapsilosis group. Diagn. Microbiol. Infect Dis. 62 (1): 106-9. Varga I, Sóczó G, Kardos G, Majoros L. 2008. Time-kill studies investigating the killing activity of caspofungin against Candida dubliniensis: comparing RPMI-1640 and antibiotic medium 3. J. Antimicrob. Chemother. 62 (1): 149-52. Vermes A, Guchelaar HJ, Dankert J. 2000/a. Flucytosine: a review of its pharmacology, clinical indications, pharmacokinetics, toxicity and drug interactions. J. Antimicrob. Chemother. 46 (2): 171-9. Vermes A, Guchelaar HJ, Dankert J. 2000/b. Prediction of flucytosine-induced thrombocytopenia using creatinine clearance.Chemotherapy. 46 (5): 335-41. Verweij PE, Breuker IM, Rijs AJ, Meis JF.1999. Comparative study of seven commercial yeast identification systems. J. Clin. Pathol. 52 (4): 271-3.
115
Walker LA, Munro CA, de Bruijn I, Lenardon MD, McKinnon A, Gow NA. 2008. Stimulation of chitin synthesis rescues Candida albicans from echinocandins. PLoS Pathog. 4 (4): e1000040. Weems JJ Jr. 1992. Candida parapsilosis: epidemiology, pathogenicity, clinical manifestations, and antimicrobial susceptibility.Clin. Infect. Dis. 14 (3): 756-66. Wellmer A, Bernhardt H. 1997. Adherence on buccal epithelial cells and germ tube formation in the continuous flow culture of clinical Candida albicans isolates. Mycoses. 40 (9-10): 363-8. Wingard JR, Leather H. 2004. A new era of antifungal therapy. Biol. Blood. Marrow Transplant. 10 (2): 73-90. White TC, Marr KA, Bowden RA. 1998. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.Clin. Microbiol. Rev. 11 (2): 382-402. Xiao L, Madison V, Chau AS, Loebenberg D, Palermo RE. 2004. Three-dimensional models of wild-type and mutated forms of cytochrome P450 14-alpha-sterol demethylases from Aspergillus fumigatus and Candida albicans provide insights into posaconazole binding. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (2): 568-74. Xu J, Millar BC, Moore JE, McClurg R, Walker MJ, Evans J, Hedderwick S, McMullan R. 2002. Comparison of API20C with molecular identification of Candida spp. isolated from bloodstream infections. J. Clin. Pathol. 55 (10): 774-7. Yang YL. 2003. Virulence factors of Candida species. J. Microbiol. Immunol. Infect. 36 (4): 223-8. Yapar N, Uysal U, Yucesoy M, Cakir N, Yuce A. 2006. Nosocomial bloodstream infections associated with Candida species in a Turkish University Hospital. Mycoses. 49 (2): 134-8. Internetes címek az ábrákhoz: http://www.abdn.ac.uk/ims/staff/details.php?id=n.gow Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. 2007. Basic and Clinical Pharmacology, 11 th edition. http://www. accessmedicine. Com.
116
XII. Saját közlemények jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. Szabó Zs., Tóth B, Kovács M, Kardos G, Maráz A, Rozgonyi F, Majoros L. 2008. Evaluation of the new MICRONAUT-Candida system for yeast identification against the API ID32C method. J. Clin. Microbiol. 46: 1824-5. IF: 3, 945 2. Szabó Z., G. Sóczó, C. Miszti, P. Hermann, F. Rozgonyi. 2008. In vitro activity of fluconazole and amphotericin B against Candida inconspicua clinical isolates as determined by the time-kill method. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 55: 53-61. IF: 0,0 3. Varga I, Sóczó G, Kardos G, Borbély Á, Szabó Z, Kemény-Beke Á, Majoros L. 2008. Comparison of killing activity of caspofungin against Candida parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis. J. Antimicrob. Chemother. 62: 1466-68. IF: 4, 328. 4. Szabo Z, Borbely A, Kardos G, Somogyvari F, Kemény-Beke A, Asztalos L, Rozgonyi F, Majoros L. 2009. In vitro efficacy of amphotericin B, 5-fluorocytosine, fluconazole, voriconazole and posaconazole against Candida dubliniensis isolates using time-kill methodology. Mycoses. 53 (3): 196-9. IF: 1, 402
Egyéb közlemények 1. Szabó Z, Szilágyi J, Tavanti A, Kardos G, Rozgonyi F, Bayegan S, Majoros L. 2009. In vitro efficacy of 5 antifungal agents against Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis as determined by time-kill methodology. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64: 283-8. IF: 2, 451 Összes IF: 12, 126
117
Fontosabb poszterek, elıadások 1. Csukásné Bagoly E, Szabó Z, Széll M, Szabó J. Intenzív osztályok prevenciós vizsgálatai során izolált baktériumok elıfordulási gyakoriságának és antibiotikum rezisztenciájának változásai. ÁNTSZ Hajdú-Bihar megyei Intézete, DEOEC Mikrobiológiai Intézete, Debrecen. MLDT 2002. évi Nagygyőlése, Gyula, 2002. augusztus 28-31(poszter: P20/01). 2. Szabó Z, Kristóf K, Cser V, Kardos Sz, Ghidán Á, Rozgonyi F. A 2001-2003 idıszak klinikai mintáiból izolált MSSA és MRSA törzsek fenotípúsaiban mutatkozó eltérések a Semmelweis Egyetem Orvosi Mirkobiológiai Intézetében. Semmelweis Orvostudományi Egyetem, Budapest. A Magyar Mikrobiológiai Társaság 2004. évi Nagygyőlése, Keszthely, 2004. október 7-9 (elıadás). 3. Majoros L, Szabó Z, Falusi E, Sóczó G, Kardos G. Comparison of the performance of the new commercial yeast susceptibility panel MICRONAUT –AM to the standard method 3rd Trends in Medical Microbiology. Poster N0: PO27. 28-31 October 2007. Turin, Italy. IF: 1, 342. 4. Szabó Z, Földi R, Falusi E, Sóczó G, Kardos G, Rozgonyi F, Majoros L. Comparison of the performance of the new commercial yeast susceptibility panel MICRONAUT-AM to the standard method. Fourth Hungarian Conference of Mycology. May 29-31, 2008, Debrecen, Hungary. 5. Szilágyi J, Bayegan S, Gesztelyi R, Kardos G, Mózes J, Kemény-Beke Á, Szabó Z, Majoros L. In vivo efficiacy against Candida orthopsilosis in a neutropenic mouse model. 2nd Central Europen Forum for Microbiology (CEFORM). October 7-9. 2009, Keszthely, Hungary (elıadás: ML-7). 6. Bayegan S, Szilágyi J, Gesztelyi R, Kardos G, Mózes J, Kemény-Beke Á, Szabó Z, Kovács R, Majoros L. Correlation between postantifungal effect and the efficacy of the single 5 and 10 mg/kg caspofungin doses for treatment of disseminated candidiasis caused by Candida krusei in a neutropenic mouse model. 2nd Central Europen Forum for Microbiology (CEFORM). October 7-9. 2009, Keszthely, Hungary (poszter: MP 19).
118
XIII. Köszönetnyilvánítás A disszertáció elkészítése során több kollégával dolgozhattam együtt, akik munkája nélkül az eredmények és e dolgozat sem jöhetett volna létre. Köszönöm a PhD ösztöndíjat a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájának és Dr. Szél Ágoston professzor úrnak, a Doktori Tanács korábbi elnökének. Köszönettel tartozom korábbi program- és témavezetımnek Dr. Rozgonyi Ferenc professzor úrnak, aki a kezdetektıl fogva lehetıvé tette és nagyban támogatta munkámat. Ösztönzı és készséges hozzáállása sokat jelentett számomra. Hálával tartozom késıbbi témavezetımnek, Dr. Majoros László docens úrnak, akinek szakmai hozzáállását és kutatói munkáját mindenképpen példaértékőnek tartom. Egyénisége mind klinikai, mind kutatói gondolkodásmódom kialakításában fontos szerepet játszott. Köszönettel tartozom Dr. Tulassay Zsolt professzor úrnak, hogy a Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola vezetıjeként lehetıvé tette számomra tanulmányaim folytatását. Hálás vagyok Dr. Kárpáti Sarolta professzor asszonynak, hogy a „Bırgyógyászat és venerológia” program vezetıként engedélyezte a programhoz való csatlakozásomat. Hálás vagyok Dr. Gergely Lajos professzor úrnak, valamint Dr. Kónya József docens úrnak, a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézete korábbi, illetve jelenlegi vezetıinek, hogy biztosították számomra a Semmelweis Egyetem Bır-, Nemikórtani és Bıronkológiai Klinikával történı együttmőködés keretében a kísérletes munka feltételeit. Köszönetemet
szeretném
kinyilvánítani
Pappné
Falusi
Erzsébetnek,
akinek
nélkülözhetetlen munkájával a laboratóriumi kísérleteket kivitelezhettem. Köszönet illeti Dr. Kardos Gábort, Hartmann Zsoltot, valamint a DEOEC Orvosi Mikrobiológiai Intézet minden munkatársát, hogy segítı fáradtságos és rugalmas munkájukkal lehetıvé tették kutatásaimat, és PhD értekezésem megírását. Hálával tartozom Dr. Sóczó Georginának és Szilágyi Juditnak, akik barátságukkal, bíztatásukkal és értékes ötleteikkel sokat segítettek. Végül, de nem utolsó sorban hálával tartozom családomnak türelmükért, kitartásukért, támogatásukért és ösztönzı magatartásukért.
119
XIV. Mellékletek 1. A. melléklet. Manuális kiértékeléső azonosító kereskedelmi kitek Termék
API 20C (43 faj) API Candida (26 faj) Auxacolor
Fungichrom
Fungifast
Teszt típusa
0
idı
Helyes azonosítás (%)
C
24 ó
48 ó
30
93,0-100,0
-
5C, 6G, U
24-48 ó
37
68,0-97,4
95,5
13C, P, X
24-48 ó
30
63,8-95, 0
94,1
24-48 ó
30
65,0-95,6
-
24-48 ó
37
65, 0-84,7
98,0
4-5 ó
30
87,1- 99,0
-
2-7 nap
22-30
92,4
87,0-99,1
4A, 7C, 2G, P, U, X A, 6C, G, P, U
Plus (43 faj)
3M, U 7C, CM, K, U
Az ısszehasonlítás alapjául szolgáló módszer
48-72 ó
3A, 5C, 6G,
Tek
Hımérséklet
19 C
RapID Yeast
UniYeast
Inkubációs
Hagyományos, ITS2 Hagyományos, API 20C, ID32C Hagyományos, ID32 C Hagyományos Hagyományos, ID32C Hagyományos, ID32C, API 20C Hagyományos, API 20C
1. B. melléklet. Automatizált kiértékeléső azonosító kereskedelmi kitek Termék
Teszt típusa
ID 32C
24C, E, 5O, X
VITEK
21 C, K, N, O,
Yeast BC
U, X
VITEK 2
9A, 20C, 8G,
ID-YST
K, 6O, M, U, X
VITEK 2 YST
Inkubálási idı
Hımérséklet 0
C
Az
Helyes
Az összehasonlítás
azonosítható
azonosítás
alapjául szolgáló
fajok száma
(%)
módszer
Hagyományos
24-48 ó
30
36
88,0-98,0
24-48 ó
30
26
84,9-97,2
15 ó
35
21
96,3
18 ó
35
39
98,5
4A, 25C, E, 3G, K, 2N, 9O,
Hagyományos, API20 C ID 32C
Hagyományos,
U
API 20C
Röviditések: A-aminopeptidáz, C-szénhidrát asszimiláció, E-eszkulin hidrolizis, G-glükozidáz, KKNO3 asszimiláció, M-„vegyes” enzim, N-nitrogén asszimiláció, O-szerves sav asszimiláció, Xcikloheximid rezisztencia, CM-kukorica-liszt, P-fenoloxidáz, U-ureáz (Pincus és mtsai 2007).
120
2. A. melléklet. A MICRONAUT-Candida System (Merlin Diagnostika Gmbh, Bornheim, Germany) adatbázisában megtalálható gombafajok: Candida africana Candida krusei Candida valida Candida albicans Candida lambica Cryptococcus albidus Candida catenulata Candida lipolytica Cryptococcus humicola Candida dubliniensis Candida lusitaniae Cryptococcus neoformans Candida famata I. Candida magnoliae Cryptococcus terreus Candida famata II. Candida membranaefaciens Geotrichum candidum Candida famata III. Candida norvegensis Geotrichum capitatum Candida famata IV. Candida norvegica Rhodotorula glutinis Candida glabrata Candida parapsilosis Rhodotorula mucilaginosa Candida guilliermondii Candida pelliculosa Saccharomyces cerevisiae TRECandida inconspicua Candida rugosa/pararugosa Saccharomyces cerevisiae TRE+ Candida intermedia Candida tropicalis Trichosporon fajok Candida kefyr Candida utilis Trichosporon fajok RAF-/MEL2. B. melléklet. A MICRONAUT-Candida System (Merlin Diagnostika Gmbh, Bornheim, Germany) tesztlemezén megtalálható szubsztrátok: Az alábbi enzimek
Asszimilációs szubsztrátok:
kromogén szubsztrátjai: NGA: N-acetil-β-D-galaktózaminidáz α- GAL: α-galaktozidáz PRO: L-prolinaminopeptidáz PGUR: p-nitrofenil-β-glükuronozidáz PHE: L-fenilalanin aminopeptidáz α-GLU: α- glükozidáz β-GLU: β- glükozidáz ONC: kromogén szubsztrát kontroll
ACO: asszimilációs kontroll MEL: mellibióz XYL: D-xilóz RHA: L-ramnóz GENA: gentibióz GLU: D-glükóz INO: inozitol CEL: cellobióz SUC: szacharóz TRE: trehalóz GAL: galaktóz MALA: maltóz LAC: laktóz RAF: raffinóz
URE: ureáz UCO: ureáz kontroll
121
2. C. melléklet. A MICRONAUT-Candida tesztlemezén megtalálható szubsztrátok elrendezıdése (a gyártó leírása alapján)
1
2
3
4
5
A
NGA
PRO
PHE
βGLU
URE
B
α-GAL
PGUR
αGLU
ONC
C
NGA
PHE
D
α-GAL
E
NGA
F
α-GAL
G
NGA
H
α-GAL
PRO PGUR PRO PGUR PRO PGUR
6
7
8
9
10
11
12
ACO
XYL
GENA
INO
SUC
GAL
LAC
UCO
MEL
RHA
GLU
CEL
TRE
MALA
RAF
βGLU
URE
ACO
XYL
GENA
INO
SUC
GAL
LAC
αGLU
ONC
UCO
MEL
RHA
GLU
CEL
TRE
MALA
RAF
PHE
βGLU
URE
ACO
XYL
GENA
INO
SUC
GAL
LAC
αGLU
ONC
UCO
MEL
RHA
GLU
CEL
TRE
MALA
RAF
PHE
βGLU
URE
ACO
XYL
GENA
INO
SUC
GAL
LAC
αGLU
ONC
UCO
MEL
RHA
GLU
CEL
TRE
MALA
RAF
2. D. melléklet. Az API ID 32C tesztcsíkon megtalálható szubsztrátok (a gyártó leírása alapján) SOR: szorbitol
GAL: galaktóz
XYL: D-xilóz
ACT: aktidion
RIB: ribóz
SAC: szacharóz
GLY: glicerol
NAG: N-acetil-glükóz-amin
RHA: ramnóz
LAT: DL-laktát
PLE: palatinóz
ARA: L-arabinóz
ERY: erytritol
CEL: cellibióz
MEL: mellibióz
RAF: raffinóz
GRT: glükuronát
MAL: maltóz
MLZ: melezitóz
TRE: trehalóz
GNT: glükonát
2KG: 2-keto-D-glükozid
LVT: levulinát
MDG: α-metil-D-glükozid
GLU: glükóz
MAN: mannitol
SBE: szorbóz
LAC: laktóz
GLN: glükóz-amin
INO: inozitol
ESC: eszkulin
0: kontroll
122
3. melléklet: A fontosabb antifungális szerek szerkezeti képlete Amphotericin B:
5-fluorocitozin:
Flukonazol:
Itrakonazol:
123
3. melléklet (folytatás): A fontosabb antifungális szerek szerkezeti képlete
Vorikonazol:
Posakonazol:
Caspofungin:
124
3. melléklet (folytatás): A fontosabb antifungális szerek szerkezeti képlete
Anidulafungin:
Micafungin:
125
