121, Kroměříž

Doc. Ing. Dr. Jaroslav Benada, CSc.



Agrotest fyto, s.r.o.



Zemědělský výzkumný ústav Kroměříž, s.r.o.



Havlíčkova 2787/121, 767 01 Kroměříž

Význam redoxních potenciálů a pH pletiv rostlin pro jejich rezistenci k chorobám a pro fyziologii rostlin. Review. Redox potential and pH in plants and their function in the mechanism of resistance to diseases and in plant physiology. Review.

Kroměříž 2012 1

Práce byla oponována: Doc. RNDr. Jan Špaček, CSC., Brno Doc. ing. Eduard Pokorný, Ph.D., Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, AF Mendelu v Brně

ISBN 978-80-87555-06-4 © Jaroslav Benada, 2012, [email protected]

2

Abstrakt Mechanismus odolnosti rostlin k chorobám byl předmětem zájmu výzkumu od počátku fytopatologie jako vědy. Zpravidla se hledaly rozdíly v nějakých živinách nutných pro parazita nebo v poslední době především molekulárně genetické rozdíly u odrůd s různou odolností. Podobně se hledala příčina tak zvané „nonhost resistance“. Zde je ukázáno, že i u náchylných rostlin k obligátním parazitům se odolnost jejich pletiv mění vlivem ontogeneze a vlivem vnějších podmínek. Tuto odolnost lze měřit hodnotou redoxního potenciálu přenašeče elektronů, který vzniká v rostlině enzymatickou reakcí spojenou s dýcháním. Přenašeče elektronů jsou ve vodě rozpustné a nejsou oxidovány vzdušným kyslíkem. V buňkách není volný kyslík, veškerá oxidace a redukce probíhají enzymaticky. Tyto reakce jsou vysoce specifické pro daný přenašeč elektronů a tedy i druh rostliny. Hostitel i parazit mají rozdílné nosiče elektronů. Parazit nemá sám o sobě dostatečně výkonnou terminální oxidázu, nachází ji ale v hostiteli. Hodnoty redoxního potenciálu jsou vhodné také pro studium celistvosti rostliny, výživy rostlin i pro jiné složky základního výzkumu ve fyziologii rostlin. Podle hodnot pH rostlinných pletiv se mění i druh rozmnožovacích orgánů parazitů (u padlí konidie/kleistothecia, u rzí uredie/telie). Klíčová slova: aerobní měření, hypoxie, prepolarizace, podstata odolnosti rostlin, gradient choroby, celistvost rostliny, korelační vztahy, biofyzikální stavy, historie výzkumu, padlí travní, rzi, hrách, len, slunečnice.

3

Summary The study of biophysical states in plants was initiated 35 years ago in connection with the looking for the mechanism of plant resistance to parasites. Here the attention was focused on the variable resistance of cereals to obligate parasites such as powdery mildew and rusts. It was necessary to find out a factor which changes during the ontogeny and through the environment and which involves: 1. the disease gradients on plant, 2. the change of susceptibility of organs during the ontogeny and growth, 3. the difference in resistance in individual plant cells, 4. relatively swift changes of resistance during a couple of hours. This factor could be found in the biophysical states of plant organs (redox potential (RP) and pH). The method of RP measurement in plant tissues in aerobic conditions and measurement in hypoxia are presented. The redox state changes during the growth and development of organs and is influenced by the outer conditions such as light, temperature, moisture, growth regulators, nutrition, etc. and by the organ senescence. Redox potential (redox or RP) measurement methods in plant Definition: This is not a standard redox potential, as defined in physical chemistry, which is constant, but redox potential in plant is dependent on activity of respiration enzymes and it changes. The actual state can be red from the lower turn point of mV changes on indication instrument (milivoltmetre) with input resistance at least 10 MΩ. Electrodes: Standard reference electrode – the saturated calomel elecrode. Experimental half cell – the bright platinum electrode 5 x 5 mm sheet or needleform. Prepolarisation: before measurement the Pt electrode was dipped for a moment into the solution of kalium-ferricyanide (1 g in 1000 ml H2 O) and then rinsed with distiled water. Measurement in aerobic conditions. Filter paper was inserted to the bottom of a glass dish and sufficiently wetted with 0,1% solution of KCl . The calomel electrode was attached. The plant leaf was rolled lenghtwise and the Pt electrode was run through the leaf tissue so that the whole surface of the electrode was covered with the leaf tissue. As far as one leaf was too small to cover the electrode, then it was necessary to take two adjacent leaves for measurement. In the case of solid organs such as potato tuber, the Pt electrode could be pricked directly. 4

The Pt electrode with plant tissue was then put on the filter paper. The electric potential value in most cases began to sink, then was fixed for some time and thereafter began to rise. This lower-turn point was written as the redox potential of the plant organ. More details of measurement method ca be obtained in particular papers, mainly Benada J.:The gradients of oxidation-reduction potentials in cereals and the dependence of obligate parasites on the redox potentials of the host. Phytopath. Zeitschrift 55 (1966): 265 – 290. There are gradients of redox potential in plants. The tissues disintegration disturbs redox potential. To simplify the RP interpretation the shown data do not regard the potential of saturated calomel electrode (+244 mV). Generally 10 leaves or other organs were taken for one series of measurement and the results were expressed as mean and SEM (standard error of mean). Measurement in hypoxia. The non-invasive method for RP measurement can be used especially under conditions of substantial decrease in air access to plant tissues by their submergence in water. In following experiments, current tap water was used. In this water no redox systems are present which could react with redox systems of the cell. In tap as well as distilled water the air oxygen is dissolved that could react with a Pt electrode. The concentration of this redox system is however low. The values of RP system diffusing from the cell are dependent on enzyme systems coupled with respiration. The electron carriers of cells do not react with oxygen directly, only by means of respiration enzymes. RP was measured by a bright Pt electrode and a comparative saturated calomel electrode placed freely beside the plant parts submerged in water. The lower turn point was looked similarly as in the case of measurement in aerobic condition. More details can be found in Benada J.: Non-invasive method for redox potential measurement. Obilnářské listy 17(2009): 15- 18.č.1. Using this method the evidence was obtained that redox potential in plant tissue is very close to the value of surrounding solution and that electron carriers diffuse from plant tissue and they are soluble in water.

5

A hypothesis was formulated for further investigation: The principle of resistance consists in the ability of the parasite to gain the energy in the host cell. The parasite uses the terminal oxidase of the host plasmalemma. The specific phenolics are the substrate for this enzyme. The main features of this hypothesis are: 1. There is no free oxygen in the cell plasma. 2. The redox potentials are generated by the respiration of the cells by the sum of activities in cell organelles which produce the electrons and the activity of oxidoreductase (the terminal oxidase) in the plasmalemma. The electron carriers can permeate from the cell to the environment and they are soluble in water. 3. The redox potential is the basis of electric gradients in the plant which plays the main role in its integrity as well as for the life of the parasite. 4. The parasite respires through the terminal oxidase of the host. 5. The environmental conditions influence the enzyme activity of host and parasite cells differently by which different redox potentials may appear in the host and parasite cells resulting in unspecific oxidation or reduction of electron carriers. 6. The acidity of the host cells determinates the formation of conidia or cleistothecia (in powdery mildew) or formation of redia or telia (in rusts). 7. Depend on redox potential it is possible to explain some correlations in plants. Without knowledge of RP gradients it is not possible to explain the integrity of plants and related phenomena. Key words: aerobic conditions, biophysical states, correlations, disease gradient, hypoxya, investigation history, linen, nature of plant resistance, peas, plant integrity, powdery mildew, prepolarisation, redox potential measurement, rusts, sunflower.

6

Obsah: 1 Úvod

................................................................................................................................... 11

2 Metoda měření redoxních potenciálů (RP) v rostlině..................................12

2.1 Elektrody a měřicí přístroje............................................................................................ 12



2.2 Aerobní způsob měření RP............................................................................................ 13



2.3 Měření RP v hypoxii.......................................................................................................... 14



2.4 Prepolarizace...................................................................................................................... 14



2.5 Reprodukovatelnost měření......................................................................................... 14



2.6 Některé výsledky............................................................................................................... 15



2.6.1 Aerobní podmínky měření..................................................................................... 15





Variabilita RP u prvních listů obilnin vypěstovaných ve skleníku............. 15





Gradienty RP v čepelích pšenice listů různého pořadí na stéble.............. 16





Proměnlivost RP......................................................................................................... 16





Světlo.............................................................................................................................. 16





Teplota........................................................................................................................... 17





Výživa............................................................................................................................. 17





Ontogeneze................................................................................................................. 17





2.6.2 Měření v hypoxii............................................................................................... 17





Zjištění potřeby NO3 pro růst rostlin................................................................... 17



2.7 Diskuze.................................................................................................................................. 18



2.7.1 Aerobní a anaerobní podmínky............................................................................ 18



2.7.2 Jak vzniká RP................................................................................................................ 18



2.7.3 Jiné metody měření RP v půdě............................................................................. 19

3 Měření pH........................................................................................................20

3.1 Některé výsledky............................................................................................................... 20

7

4 Hledání podstaty odolnosti rostlin k parazitům na základě hodnot RP.........21

4.1 Gradienty choroby na rostlině...................................................................................... 21



Změny náchylnosti.................................................................................................................. 22



4.2 Gradienty RP....................................................................................................................... 22



4.3 Nástin hypotézy o resistenci a diskuze...................................................................... 22



Fenolické látky.......................................................................................................................... 24



4.4 Závěr o podstatě odolnosti........................................................................................... 25

5 Význam hodnot RP pro fyziologii celistvosti rostliny..................................26

5.1 Úvod 26

5.2 Výklad některých korelačních jevů u rostlin popsaných prof. Dostálem a dalšími z hlediska RP................................................................................................... 27

5.3 Korelační vztahy a RP u obilnin.................................................................................... 27



Vliv světla na RP........................................................................................................................ 27



Gradienty RP v obilninách.................................................................................................... 28

6 Historie výzkumu biofyzikálních stavů rostlin v Zemědělském výzkumném ústavu v Kroměříži....................................................................32 7 Přínos předložené výzkumné práce:.............................................................32

7.1 Praktické aplikace............................................................................................................. 32



7.2 Přínos pro základní výzkum.......................................................................................... 33

8 Uveřejněné práce o redoxním potenciálu a pH u rostlin. (List of publications on redox potential and and pH in plants.)..................34 9 Přílohy

................................................................................................................................... 38

Biophysical states in plants and their function in the mechanism of resistance to diseases and in plant physiology - review....................................... 38

Summary

................................................................................................................................... 39

1 Introduction....................................................................................................40

8

2 Redox potential (RP) and pH.........................................................................41

2.1 Methods............................................................................................................................... 41



2.2 Properties of RP................................................................................................................. 42



2.2.1 Influence of environment....................................................................................... 42





2.2.1.1 Light.................................................................................................................. 42





2.2.1.2 Temperature................................................................................................... 42





2.2.1.3 Water................................................................................................................. 43





2.2.1.4 Nutrition.......................................................................................................... 43





2.2.1.5 Anaerobic conditions................................................................................. 43



2.2.2 Influence of ontogeny and senescence............................................................. 44



2.2.3 Gradients in plant....................................................................................................... 44



2.2.4 Other electric measurement in plants................................................................ 45



2.3 Discussion of RP................................................................................................................. 46

3 Function of RP in the mechanism of resistance to plant pathogens..........46

3.1 Variable resistance............................................................................................................ 46



3.2 Comparison of non-host resistance and VR............................................................ 47



3.3 Disease gradients.............................................................................................................. 47



3.4 Resistance and RP............................................................................................................. 47



3.5 Attempt to formulate the theory of resistance on the basis of RP.................. 48



3.6 Why RP has decisive function in the mechanism of resistance........................ 49



3.6.1 Electron transport...................................................................................................... 49



3.7 Phenolics.............................................................................................................................. 49



3.8 Concentration of electron carriers.............................................................................. 50



3.9 Redox values....................................................................................................................... 50



3.10 Obligate parasites.......................................................................................................... 51

9



3.11 Support of hypothesis.................................................................................................. 52



3.12 Expected objections against the hypothesis....................................................... 53



3.13 The role of pH................................................................................................................... 54

4 Function of RP in plant integrity...................................................................54

4.1 Peas and flax....................................................................................................................... 54



4.2 Cereals................................................................................................................................... 55



4.3 Other examples................................................................................................................. 56

5 Conclusions.....................................................................................................57 REFERENCES ................................................................................................................................... 63

10

1 Úvod Mechanismus odolnosti rostlin k chorobám byl předmětem zájmu výzkumu od počátku fytopatologie jako vědy. Vysvětlování vždy bylo spojeno se stavem znalostí, které odrážely rozvoj určitého obecnějšího vědního úseku v daném časovém úseku. Souhrny poznatků do r. 1976 jsou obsaženy v  kompendiích: Heitefuss R., Williams P.H.(Eds.): Physiological plant pathology. Encyclopedia of plant physiology, New Series Vol. 4, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1976, z  pozdější doby dále např. Hartleb H., Heitefuss R., Hoppe H.-H. (Eds.): Resistance of crop plant against fungi. Fischer Verlag Jena 1997, nebo např. Heath Michele C.: Plant resistance to fungi. Canad. J. Pl. Path. 18, 1996:469-475, u padlí travního např. Bushnell („The role of powdery mildew research in understanding host-parasite interaction: Past, present, and future“ ve sborníku Bélanger R.R et al. Eds.:The powdery mildews. A comprehensive treatise. APS St. Paul 2002). Novější výzkum je zaměřen převážně na molekulární genetiku. Základní úloha je připisována mechanismu rozpoznávání hostitele parasitem. V poslední době nabyla otázka závažného významu zejména ve spojení s genovými manipulacemi a snahou využít pro šlechtění tzv. odolnost nehostitelských rostlin. Bez znalosti podstaty odolnosti nebudeme vědět, které geny přenášet z cizorodých rostlin a zda má tento směr vůbec význam. I když byly formulovány některé hypotézy na základě dílčích výsledků s jednotlivými parasity, vždy se ukázalo, že zevšeobecnění není možné. Proto považuji za správný názor prof. Fuchse z University v  Göttingen v  citovaném kompendiu z  roku 1976, že řešení problému bude třeba hledat v zásadně novém přístupu. Jako nový přístup byly zvoleny biofyzikální stavy.Tyto stavy byly studovány od roku 1963 na obilninách a jejich parazitech (padlí travní a rzi), na dalších rostlinách, jako jsou brambory a rajčata a jejich parazité plíseň bramboru, okurka a plíseň okurky, réva a  její parazit peronospora révy, dále byly studovány biofyzikální stavy na slunečnici, hrachu, lnu a  jiných. Za základ byla vzata tzv. proměnlivá odolnost (někdy zvaná polní odolnost, rasově nespecifická odolnost, částečná odolnost, horizontální odolnost, obecná odolnost), i když se obsah těchto pojmů kryje s  proměnlivou odolností jen částečně, což odráží neznalost podstaty odolnosti. Nejvíce experimentální práce bylo provedeno s padlím travním na ječmeni a pšenici. Pojem „proměnlivá odolnost“ zahrnuje takovou odolnost, která se mění během ontogeneze hostitele a vlivem vnějších podmínek.

11

Tato odolnost je charakterizována: 1. gradientem choroby na rostlině, to je rozdílným napadením starších a mladších listů, např. u obilnin během sloupkování, 2. změnou náchylnosti orgánů rostliny během ontogeneze a růstu, 3. rozdílnou náchylností jednotlivých buněk ležících blízko sebe, 4. relativně rychlou změnou odolnosti i během několika hodin. Jestliže byly stanoveny vlastnosti této odolnosti, bylo jasné, že odolnost nemůže spočívat v nějaké živině nutné pro parazita, ale v nějakém velmi dynamickém faktoru. Postupně byla pozornost soustředěna na změny biofyzikálních stavů, především redoxního potenciálu a pH. V souvislosti se změnami odolnosti rostlin k chorobám byla hledána i příčina změn tvorby pohlavního a nepohlavního stádia u padlí a tvorba uredií a telií rzí. Podrobně byla nově rozpracována především metodika měření redoxního potenciálu.

2 Metoda měření redoxních potenciálů (RP) v rostlině Nejedná se o standardní redoxní potenciál, jak je definován ve fyzikální chemii, ale sledují se změny napětí na měřící elektrodě. RP se měří jako elektrický proud mezi standardní elektrodou kalomelovou nebo chloridstříbrnou a měřící Pt elektrodou. Tento elektrický článek nelze však zatížit větším odběrem proudu, proto měřicí přístroj musí mít vysoký vstupní odpor alespoň 10 MΩ.

2.1 Elektrody a měřicí přístroje Byly používány běžně prodávané platinové a standardní srovnávací nasycené kalomelové elektrody (národní podnik Laboratorní potřeby, Monokrystaly Crytur Turnov a jiné v průběhu let). Později pro speciální měření RP byly vyrobeny i malé jehlové elektrody z Pt drátu o průměru kolem 0.5 mm. Tvar měřících elektrod: plíšková 5 x 5 mm, zašpičatělé nebo tyčinkové 1 mm x 5 mm. Nejsou vhodné kombinované elektrody, protože neumožňují stanovení RP aerobním způsobem v pletivech rostlin. Vyústění standardní elektrody leží příliš vysoko nad Pt elektrodou. 12

Nejdříve byl používán k  měření kompenzační milivoltmetr československé výroby (Mikrotechna Praha), později byly k dostání různé milivoltmetry s vysokým vstupním odporem a mnohem lacinější.

2.2 Aerobní způsob měření RP Do Petriho misky nebo jiné misky vložíme na dno filtrační papír, navlhčíme jej 1% roztokem KCl v destilované vodě nebo vodovodní vodou. Srovnávací elektrodu umístíme tak, aby se dotýkala vlhkého papíru (fritou nebo uhlíkovým uzávěrem). Měření se provádí na oddělených orgánech rostlin. Úkrojek bramborové hlízy nebo vegetační vrchol řepky propíchneme Pt elektrodou (nejlépe tyčinkovou) tak, aby celý povrch elektrody byl pokryt rostlinným pletivem. Pro měření RP v  listech je třeba je svinout, např. listy obilnin svinout po délce od špičky, a  ve směru vodivých svazků zabodnout do smotku plíškovou Pt elektrodu. Je třeba počítat s tím, že v rostlinných orgánech existují gradienty RP, např. u obilnin hodnota RP klesá od báze ke špičce čepele, nebo u bramborové hlízy je podstatný rozdíl RP mezi povrchem hlízy a její vnitřní částí. Pokud bychom elektrodou propíchli složitější orgán jako je např. pupen stromu, naměřená hodnota RP bude představovat průměr RP jednotlivých základů listů v pupenu. V případě aerobního způsobu se měří na tak zvaný spodní bod obratu. Pt elektrodu je třeba prepolarizovat na vyšší hodnotu RP než je očekávána v pletivu a pak sledovat po vpichu pokles hodnoty RP. Po nějaké době (u prvních listů obilnin to trvá 1 až 2 minuty) potenciál přestane klesat a začne stoupat. Tuto hodnotu zapíšeme. Některé komplikovanější přístroje s funkcí „data hold“ jsou schopny spodní bod obratu zachytit. Odpadá tím nutnost stále sledovat změny RP. Tato metoda byla používána od roku 1964 a  publikována v  roce 1966 (Benada J.:The gradients of oxidation-reduction potentials in cereals and the dependence of obligate parasites on the redox potentials of the host. Phytopath. Zeitschrift 55 (1966): 265 – 290.)

13

2.3 Měření RP v hypoxii Při ponoření studované části rostliny pod hladinu vody (hypoxie) počne RP klesat až na hodnotu kolem –300 mV. Je to způsobeno tím, že enzymatický redukční systém je plně aktivní, kdežto oxidační enzym není aktivní, protože ve vodě je podstatně méně kyslíku než při plném přístupu vzduchu k  pletivu. Rychlost poklesu RP závisí na životnosti pletiv a aktivitě dehydrogenáz. Např. u klíčících obilek obilnin pokles na tuto spodní hranici může nastat již za 15 minut, ale může trvat i několik hodin. Proto se zaznamenává i doba měření, případně za poslední hodnotou se uvádí poznámka: RP klesá – pomalu, rychle, nemění se nebo kolísá. Při použití této metody bylo zjištěno, že stejná nebo velmi podobná hodnota RP byla naměřena jak v ponořeném pletivu, tak v okolním vodním prostředí. Z toho lze odvodit, že přenašeče elektronů, u nichž měříme RP, jsou rozpustné ve vodě. Metoda byla publikována v roce 2009 (Benada J.:Non-invasive method for redox potential measurement. Obilnářské listy 17: 15- 18, č.1)

2.4 Prepolarizace. Před měřením je nutno Pt elektrodu opláchnout zředěným roztokem ferrikyanidu. K  prepolarizaci je možno použít i  vodovodní vodu, která sice zpravidla neobsahuje nějaké redoxní systémy, ale obsahuje rozpuštěný kyslík, který rovněž prepolarizuje elektrodu na vyšší hodnotu RP než bude očekávaná hodnota RP pletiva. Prepolarizaci je třeba provádět opatrně, protože přenašeče elektronů jsou málo koncentrované a vyšší koncentrace jiného redoxního systému by mohla výsledky zkreslit.

2.5 Reprodukovatelnost měření U  srovnatelných rostlinných orgánů vyrostlých v  podobných podmínkách a  při užití aerobního způsobu měření byla variabilita RP vyjadřována průměrem měření a  střední chybou průměru. Kolísání hodnot RP u  mladých rostlin obilnin jen s několika listy bylo zpravidla v rozmezí 10 až 20 mV. U dospělejších rostlin je rozptyl hodnot RP v rámci gradientů větší a je vhodnější uvádět konkrétní hodnoty každého měření. Jestliže uvážíme, že RP se mohou měnit poměrně rychle činností enzymů, pak jsou důležitější gradienty RP v individuální rostlině než průměrné hodnoty. Tak lze vymezit oblasti náchylnosti nebo odolnosti (např. u brambor oblast náchylnosti pro plíseň bramboru je uvnitř hlízy s RP nižším než +344 mV a oblast odolnosti na povrchu hlízy nad touto hodnotou RP). 14

2.6 Některé výsledky Uvádím část výsledků týkajících se biofyzikálních stavů v rostlině a jejich aplikací na fytopatologii i na rostlinnou fyziologii. Předkládané výsledky jsou uváděny v hodnotách přímo naměřených, není tedy proveden přepočet na potenciál nasycené kalomelové elektrody (+244 mV).

2.6.1 Aerobní podmínky měření RP v  listech obilnin leží zhruba v  oblasti od -100 do +100 mV, děložní listy slunečnice mají mnohem vyšší RP (vyšší než +200 mV), naproti tomu děložní listy hrachu mají nízký RP (nachází se v záporných hodnotách: byly naměřeny hodnoty -27 až -140 mV).

Variabilita RP u prvních listů obilnin vypěstovaných ve skleníku. Bylo měřeno 10 listů. Tento soubor každé odrůdy pšenice byl nakonec rozdrcen ve třecí misce a okamžitě byl měřen RP. K pokusu byly voleny odrůdy světového sortimentu s různým genetickým založením. (Tab.1) Tab.1. Variabilita RP

Odrůda Salzmünde 14/44 Red Fern Normandie Halle 13471 Weihenstephan M 1 Hope

Průměr RP nedrcených listů

Střední chyba průměru

Průměr z rozdrcených pletiv

+31,5 +10,6 +7,9 +11,6 +16,1 +13,0

2,5 2,4 3,8 4,0 2,3 1,3

+15 -50 -20 -23 -17 -47

Z pokusu vyplývá, že v rozdrcených pletivech naměřený RP neodpovídá RP v nerozdrcených pletivech.

15

Gradienty RP v čepelích pšenice listů různého pořadí na stéble. Listy číslovány od vrcholu stébla. Ve sloupcích jsou uvedeny hodnoty RP jednoho stébla. Čísla v závorce znamenají délku čepele v cm. (Tab.2) Tab.2. Gradienty RP

Pořadí listu 1 2 3 4

Jednotlivé rostliny jedné odrůdy +9 (13) -35 (32) -27 (17) +12 (12)

+10 (10) -14 (27) -17 (16) +7 (5)

+4 (18) -17 (31) -19 (24) -1 (7)

+40 (10) -21 (38) -8 (23) -8 (10)

-4 (18) -22 (39) -24 (16) +4 (6)

-6 (18) -16 (29) -2 (8) -

Závěr: Mladé (horní) i staré (spodní) čepele mají vyšší RP než čepele středních listů na stéble. Mezi délkou čepelí a RP nebyla zjištěna závislost.

Proměnlivost RP Během dne se u obilnin RP mění. Ráno mají listy relativně vysoký RP, kolem poledne RP klesá a k večeru stoupá. Na vymetaných rostlinách jsou RP čepelí nízké (záporné hodnoty), během jednotlivých dnů RP kolísá a v době dozrávání rostliny RP stoupá do kladných hodnot.

Světlo Světlo nejvíce ovlivňuje hodnotu RP. Nízké hodnoty RP byly naměřeny u obilnin jen na rostlinách na poli. Části listů, které jsou kryty delší dobu jinými částmi, např. bazální části čepelí a pochvy, mají vyšší potenciál.

Teplota Vliv teploty je komplikován tím, že RP je zároveň závislý na světle. V laboratorních pokusech zvýšení teploty u  obilnin vedlo k  vyššímu RP. Nižší teplota snižovala RP. Ale je pozoruhodné, že teplota pod +5 oC vedla k zvýšenému RP.

16

Výživa První listy rostlin obilnin ve skleníku při plné výživě měly nižší RP než rostliny rostoucí v hydroponii bez živin.

Ontogeneze V listech obilnin na poli RP klesl z cca + 50 mV na počátku vzcházení na - 100 mV nebo i níže během sloupkování. V děložních listech slunečnice byl RP cca + 260 mV, v listech na lodyze slunečnice klesl až na hodnotu kolem - 20 mV. Pokles RP v listech během ontogeneze se zdá být platný pro většinu druhů rostlin.

2.6.2 Měření v hypoxii Zjištění potřeby NO3 pro růst rostlin Pro regenerační hnojení obilnin v předjaří je třeba zjistit v půdě obsah nitrátového iontu, který je schopen při zvýšení teploty nastartovat rychlý růst rostlin. Metodika: 50 g rozdrobené vlhké půdy vložit do kádinky, přidat 2 g naklíčených obilek, kde kořeny jsou dlouhé minimálně 5 mm, zalít 50 ml vody, promíchat. Toto je kontrolní varianta. Varianta s NO3: jako kontrola, přidat 0.3 g Ca(NO3)2 v krystalické podobě nebo příslušné množství roztoku soli. Pak měřit RP. Pokud je v půdě dostatek NO3, pak rozdíl mezi oběma variantami bude malý. Pokud v půdě je NO3 málo, bude rozdíl 200-300 mV, při čemž varianta bez přídavku dusičnanu bude mít nízký RP. Kyslík z dusičnanu je účinkem nitrátreduktázy využíván pro aerobní dýchání, i když pletivo je ponořeno do vody. (Poznámka: u obilnin se nitrátreduktáza nachází v kořenech. U hlíz bramboru byla rovněž zjištěna aktivní nitrátreduktáza. To znamená, že jako zdroj dehydrogenázy pro zjištění potřeby N03 je možno použít i bramborové hlízy. Dále: vzorek půdy by neměl být vysušen, protože na drobtech půdy se může vázat nějaké množství vzduchu, což v hypoxii zpomalí pokles RP.) Příklad rozboru jednoho vzorku půdy, který nebyl hnojen, měření po 20 hodinách: Kontrola -267 mV , NO3 +107 mV. (Hodnoty RP přepočteny na hodnotu RP kalomelové elektrody +244 mV)

17

2.7 Diskuze 2.7.1. Aerobní a anaerobní podmínky Bylo zjištěno, že většina orgánů obilnin je velmi citlivá na aerobní a anaerobní podmínky. Nejvýraznější rozdíl RP byl pozorován v exudátech kořenů: v aerobních podmínkách bylo naměřeno kolem +160 mV, v anaerobních podmínkách (hypoxie) trvajících 24 - 40 hodin -560 mV. I hypokotyl slunečnice je velmi citlivý na anaerobní podmínky. Během hodiny klesl z  +200 mV na + 60 mV. Listy obilnin jsou méně citlivé na anaerobní podmínky.

2.7.2 Jak vzniká RP Jedná se o enzymatickou reakci spojenou s dýcháním, povařením nebo rozdrcením rostlinných pletiv přestává RP fungovat. Dehydrogenáza je poměrně odolná k varu na rozdíl od oxidázy. Dehydrogenáza a terminální oxidáza jsou přísně specifické vůči přenašeči elektronů, který je rozpustný ve vodě a může difundovat ven z buňky. Podle různých projevů příznaků chorob se jedná o fenolické látky. V systému dýchání rostliny hrají rozhodující roli aspoň dva redoxní systémy: dehydrogenáza a terminální oxidáza. Oba tyto enzymy jsou různě citlivé na vnější podmínky, tedy i jejich aktivita je různá a tak vzniká i různý RP. U živočišné terminální oxidace jedná se o celý komplex redoxních enzymů za účasti cytochromů, kde jedním z přenašečů elektronů je uváděn ubichinon. Tento systém je vázán na mitochondrie a vytváří v organismu energii – ATP. Výsledky měření redoxních systémů u rostlin přinášejí některé nové poznatky o dýchání. Bude nutno zjistit, zda tento systém je spojen s oxidativní fosforylací a vytváří v rostlině energii – ATP. Navržený systém pro rostliny předpokládá, že v rostlinné buňce není volný kyslík a terminální oxidace probíhá ve stěně buněčné (plasmalemmě). Zde se také odehrává poznávací proces mezi parazitem a hostitelem. Je zajímavé, že v hypoxii byl u rostlinných tkání (klíčící obilky ) naměřen RP kolem -256 mV až –316 mV (přepočtené hodnoty na kalomelovou elektrodu). Tato hodnota byla různá u různých vzorků.Podle našeho odhadu se může jednat o vliv pH pletiv, které mohou RP změnit o 46 mV. Pak bychom se přiblížili k hodnotě standardního redoxního potenciálu pro NADH +H+, která se uvádí jako –320 mV. Je třeba také objasnit podstatu spodního bodu obratu při měření RP a další jevy.

18

2.7.3 Jiné metody měření RP v půdě V pedologii se používají i jiné metody měření RP, např. Střálková R., Podešvová J.:Metodika měření redox potenciálu v  půdě. Agrotest fyto, s.r.o. Kroměříž 2009 ISBN 978-80-86888-06-4. Autorka popisuje metodiku měření RP v  půdě, jak se používá na Vysoké škole zemědělské v Brně po mnoho let (citován Dvorník a kol.). RP se měří minimálně po dobu 15 minut od zasunutí Pt elektrody do půdy a zapisuje se změny jejich hodnot. Autorky uvádějí, že cílem měření bylo zjistit, zda v  půdě jsou aerobní nebo anaerobní podmínky (= vysoký nebo nízký RP). Problém spočívá v  tom, že RP závisí na aktivitě dýchacích systémů, zda obsah kyslíku v  půdě je dostatečný pro dané množství živých organismů a orgánů. Nebude-li kyslík stačit, RP klesne. Chybí vysvětlení podstaty měřených jevů (hodnot) a  příčiny změn během měření, to znamená redoxních procesů na Pt elektrodě. Při výkladu RP je třeba začít fyzikální chemií, jak se měří RP (roztoky ve vodě, je třeba vždy míchat roztokem, aby se potenciál na povrchu elektrody obnovoval). Jak měřit RP v půdě nebo jiných živých pletivech (orgánech)- bez míchání a jak lze kompenzovat tento nedostatek? (Při měření RP u rostlin jsem použil prepolarizace =nabití elektrody na vyšší RP ponořením elektrody do zředěného redoxního roztoku o vyšší hodnotě, než se očekával v pletivu a měření na spodní bod obratu.) Hodnoty měření citovanou metodikou jsou sice hodnoty RP, ale dané složitou reakcí mezi RP půdních částic (RP anorganické složky) a RP dané dýcháním mikroorganismů nebo živých kořenů a redoxních pochodech na povrchu Pt elektrody souvisejících se způsobem měření (pravděpodobně se projevuje i elektrolýza vody). Závěrem k citované metodice:Snaha najít konstantní stav PR v živé půdě je marná, RP je dynamický jev.

19

3 Měření pH K  měření byla použita skleněná elektroda nebo chinhydronová elektroda vždy ve spojení se standardní kalomelovou elektrodou. Zkoumaná pletiva byla rozdrcena ve třecí misce. Chinhydronová elektroda byla použita v těch případech, kdy objem zkoumané drti byl malý. Zde se uplatnily miniaturní platinové jehlové elektrody. Poznámka k měření pH chinhydronovou elektrodou: Je známo, že chinhydron je citlivý k redukujícím látkám z živých pletiv- dehydrogenázám, proto hodnoty nemusí být přesné. Toto je třeba vzít v úvahu při interpretaci výsledků.

3.1 Některé výsledky V rostlinných orgánech existuje podobný gradient pH, jako byl zjištěn u RP. Mladé orgány jsou kyselé (pH 5 až 6), staré orgány mají pH blížící se 7.V závislosti na pH se mění symptomy chorob, ale i produkce konidií nebo kleistothecií u padlí, nebo tvorba urediospor nebo teliospor u obilních rzí. Konidie a urediospory se tvoří za kyselejší reakce, kleistothecia a teliospory za neutrální reakce. Na čepelích obilnin během sloupkování při pH pod 6.00 se objevují chlorotické skvrny a při pH nad 6.00 hnědé skvrny. Tento příznak je u různých odrůd různě intenzivní a často nad skvrnami nacházíme klíčící konidie padlí. Čepele jsou v tomto období odolné, mají nízký RP, konidie nejsou spojeny s epidermálními buňkami appresoriem a snadno opadávají. Skvrny na čepelích se objevují i v případě, že porost byl ošetřen fungicidem a konidie byly usmrceny. K reakci v hostitelských buňkách vedoucích ke vzniku popsaných skvrn dochází vždy, když konidie dopadne na čepel. Reakci způsobují zřejmě přenašeče elektronů z parazita. Skvrny na čepelích mohou vznikat i po kontaktu s konidiemi některých jiných parazitů nebo třeba i pylovými zrny, např. jehličnanů, trav aj.

20

4 Hledání podstaty odolnosti rostlin k parazitům na základě hodnot RP Jak bylo uvedeno v úvodu měření bylo prováděno na náchylných odrůdách obilnin (na odrůdách bez rasově specifické odolnosti k padlí), později i jiných rostlin a byla hledána příčina tak zvané proměnlivé odolnosti. Vlastnosti této odolnosti jsou uvedeny rovněž v úvodu.

4.1 Gradienty choroby na rostlině Po rozříznutí koleoptile ječmene po délce a po naočkování konidiemi padlí bylo zjištěno, že vnitřní část koleoptile je náchylná k chorobě, vnější je odolná. Rozdíly RP zde nebylo možno měřit pro malé rozměry tkání. Nejvýrazněji se gradient projevuje na listech sloupkujících rostlin pšenice nebo ječmene vůči padlí. Spodní listy náchylných odrůd bývají pokryté bělavými kupkami padlí, směrem k horním listům se napadení ztrácí a kupky nejsou patrné. Je třeba vzít na vědomí, že inkubační doba padlí při teplotách kolem 20 oC (květen - červen) je jen cca 4 dny. Kdyby listy byly stejně náchylné, pak by s výjimkou posledního nejmladšího listu byly všechny listy pokryté kupkami padlí. Během 14 dnů se listy postupně stávají náchylnými a  mění se i  příznaky. Nejdříve se na listech objevují chlorotické skvrny, později tyto skvrny hnědnou a až nakonec se objevují kupky padlí. Tyto kupky padlí na listech sloupkujících rostlin už nejsou bílé jako kupky padlí na mladých rostlinách ve skleníku, ale šedé až hnědé, a mezitím rostliny většinou vymetají. Se změnou barvy kupek je spojena i změna tvorby rozmnožovacích orgánů. Pokud jsou kupky bílé, tvoří se v nich konidie, na hnědých kupkách se tvoří kleistothecia (vřeckaté stadium). Velmi výrazné gradienty plísně bramboru jsou patrné na bramborách. Horní mladé čepele a přilehlé stonky jsou zpočátku odolné. Až listy zestárnou, stávající se náchylnými. U bramborové hlízy jsou vnější části odolné k plísni, vnitřní jsou náchylné. Rozdílný výskyt chorob na jedné rostlině (gradient choroby) je velmi častý u různých parazitů a jejich hostitelů.

21

Změny náchylnosti Při podrobném studiu ječmene bylo zjištěno, že dokonce i sousední epidermální buňky se liší v náchylnosti k padlí a že tato odolnost se může měnit během 2 hodin. V  epidermálních buňkách obilnin lze náchylnost dobře hodnotit podle vzniku haustorií.

4.2 Gradienty RP RP v listech obilnin leží zhruba v oblasti od + 100 mV do - 100 mV, u slunečnice děložní listy mají vysoký RP (více než +200 mV), děložní listy hrachu mají naproti tomu redoxní potenciál nízký (v záporných hodnotách). U mladých rostoucích listů obilnin má špička čepele nižší RP než jeho báze. Naproti tomu u stárnoucích čepelí bývá gradient obrácený: báze má nižší RP než špička. Pochvy mají RP mnohem vyšší než čepele. U bramborové hlízy mají vnější pletiva RP většinou vyšší než +100 mV, vnitřní části mají RP nižší než +100 mV.

4.3 Nástin hypotézy o resistenci a diskuze Najít úzkou a přímou závislost mezi určitou biofyzikální hodnotou (RP a pH) v hostitelské buňce a náchylností k určité chorobě se nepodařilo. Neměl jsem k dispozici metodu měření biofyzikálních hodnot v jednotlivé buňce. Byly však zjištěny gradienty těchto hodnot v rámci pletiv a celé rostliny a bylo možno vytyčit oblasti náchylnosti a odolnosti. Na základě dosavadních studií bylo možno odvodit, že tento vztah je velmi dynamický a závisí na dýchání. Na dýchání se podílejí především dva enzymy: dehydrogenáza a  terminální oxidáza, oba přísně druhově specifické vůči druhově specifickému přenašeči elektronů, který je rozpustný ve vodě a může difundovat ven z buňky. Podle různých projevů příznaků chorob se jedná o  fenolické látky. Oba tyto enzymy jsou různě citlivé na vnější podmínky, tedy i jejich aktivita je různá a tak vzniká i různý RP. U živočišné terminální oxidace jedná se o celý komplex redoxních enzymů za účasti cytochromů, kde jedním z přenašečů elektronů je uváděn ubichinon. Tento systém je vázán na mitochondrie a vytváří v organismu energii – ATP. Zda se u rostlin jedná také o složitější komplex, je třeba dále prozkoumat. Bude nutno zjistit, zda tento systém je spojen s oxidativní fosforylací a vytváří v rostlině energii – ATP. Studium RP umožní tyto procesy měřit. Navržený systém pro rostliny předpokládá, že v rost22

linné buňce není volný kyslík a terminální oxidace probíhá ve stěně buněčné (plasmalemmě). Zde se také odehrává poznávací proces mezi parazitem a hostitelem. Pokud se týče obligátního parazita jako je padlí, pak se domnívám, že jeho obligátní parazitizmus spočívá v tom, že nemá dost výkonnou vlastní terminální oxidázu, která by zabezpečila dost energie pro jeho růst a  vývoj. Takovou terminální oxidázu však mu může poskytnout vhodný hostitel. Např. u padlí je známo, že když konidie padlí dopadne na list obilniny, uvolní se z  konidie jeho specifické přenašeče elektronů (fenolické látky). Pokud je hostitel náchylný, jeho oxidáza v epidermální buňce zoxiduje specificky přenašeč elektronů parasita, RP ve špičce infekčního vlákna se zvýší, tímto směrem začne translokace jeho auxinu a  tímto směrem roste i  infekční vlákno. Vytvoří se appresorium. Kritická situace nastane, když toto infekční vlákno začne pronikat do hostitelské buňky. Tady je už parazit odkázán jen na terminální oxidázu hostitele. Protože RP v  jednotlivých buňkách může mít rozdílnou hodnotu, bylo pozorováno, že infekční vlákno v méně příznivých případech se několikrát přimkne ke stěně buněčné, pokusí se vytvořit appresorium. Když se to parazitu nepodaří u jedné buňky, roste obloukem dál až v některé buňce vytvoří haustorium. Předpokládám, že po nějaké době úspěšného parazitizmu, parazit udržuje RP a pH hostitelské buňky na hodnotách, které mu vyhovují. Jestliže parasit pronikne dovnitř do epidermální buňky a RP a pH hostitelské buňky se nepříznivě změní v raných fázích parazitismu, haustorium odumře a vytvoří se tělísko s granulovaným obsahem jako projev odolnosti. Dojde k  vytvoření nespecificky zoxidovaných fenolických látek (přenašeče elektronů), které se již nemohou zapojit do dýchacího řetězce.Objeví se hnědá nebo chlorotická skvrna na čepeli. Zbývá vysvětlit, proč za vysokého nebo častěji nízkého RP parazit nemůže v buňce žít. Je známo, že redoxní soustava s vysokým RP oxiduje jiné redoxní soustavy s nižším RP a obráceně. Po vytvoření haustoria se v hostitelské buňce setkávají dva systémy dýchání se dvěma specifickými přenašeči elektronů. Jestliže v buňce jsou biofyzikální hodnoty vyhovující oběma účastníkům, může parazit i hostitelská buňka žít vedle sebe po nějakou dobu. Jestliže se biofyzikální hodnoty v pletivu hostitele změní, např. RP silně klesne, pak může nastat vzájemná interakce přenašečů elektronů hostitele a parazita, při níž dochází k nespecifické redoxní reakci. Protože přenašeči elektronů jsou rozpustné látky, pak špatně zoxidovaná nebo redukovaná látka hostitele nebo parazita nemůže již sloužit jako přenašeč elektronů. U hostitele může být nahrazena rozpustnými přenašeči elektronů z okolních buněk. Parazit však v buňce odumírá.

23

Aby fenolické látky v širokém pojetí (tedy i jiné heterocyklické aromatické látky) mohly sloužit jako přenašeče elektronů, musí mít tyto vlastnosti: 1. rozpustnost ve vodě, 2. tvořit redoxní páry, 3. nesmí být oxidovatelné vzdušným kyslíkem nebo aspoň ne specificky, 4. mít schopnost exudace z pletiv, ale i prostupovat rostlinné orgány, 5. v oxidovaném nebo redukovaném stavu je možno je získat navozením aerobních nebo anaerobních podmínek pro rostlinné orgány, např. kořenů. Základním problémem v rostlinné patologii je princip poznávání vhodného hostitele. Podle uvedené hypotézy toto poznávání spočívá v reakci specifických fenolů parazitů se specifickou terminální oxidázou hostitele. Shora uvedena hypotéza by měla u rostlin platit obecně. To znamená i pro růst pylové láčky na blizně, pro alelopatii (nesnášenlivost různých rostlinných druhů navzájem), ale i pro parazitní rostliny, např. u kokotice bylo uvedeno (Petr J.: Kokotice vyčenichá své oběti. Úroda 2007 č. 2, 84-85), že kokotice čichá svého hostitele. Podle navržené hypotézy by přenašeče elektronů by byly fenolické látky působící v parách.

Fenolické látky Už v minulosti bylo hodně pozornosti v souvislosti s odolností věnováno fenolickým látkám. V rostlinných buňkách je přítomno mnoho fenolických látek. Tato různorodost způsobovala, že při studiu rezistence byly většinou fenolické látky brány v souhrnu a když se jednalo o enzymech, tak se mluvilo o polyfenoloxidáze. Bylo také známo, že fenoly (ale i další látky jako např. cukry) jsou vylučovány z rostlinné buňky včetně konidií padlí a spor rzí. Vysvětlení vlivu pH pro změnu konidiového stadia na vřeckaté u padlí a obdobně uredií na telie u rzí v současné době nemám k disposici. Domnívám se však, že tato změna je také spojena s oxidací fenolických látek jako nosičů elektronů.

24

4.4 Závěr o podstatě odolnosti Na vysvětlení mechanismu podstaty odolnosti se tedy podílejí 2 druhově specifické enzymatické systémy: dehydrogenáza a terminální oxidáza, a jeden druhově specifický přenašeč elektronů zapojený do dýchání. Toto stejně platí pro hostitele i parazita. Parazit nemá sám o sobě dostatečně výkonnou terminální oxidázu, nachází ji ale v hostiteli. Přenašeče elektronů mají tyto vlastnosti: 1) jsou ve vodě rozpustné, difundují z buňky ven i dovnitř, některé ve formě par (kokotice), 2) nejsou oxidovány vzdušným kyslíkem, 3) v buňkách není volný kyslík, veškerá oxidace přenašeče elektronů probíhá enzymaticky specifickou terminální oxidázou ve stěně buněčné, 4) redukce substrátů v buňce dehydrogenázami, které jsou vysoce specifické pro daný přenašeč elektronů a tedy i druh rostliny, 5) hostitel i parazit mají rozdílné nosiče elektronů, 6) pokud se setkají redoxní systémy parazita a hostitele v buňce, mohou navzájem při nevhodném RP reagovat. Při tom produkty této reakce se liší od oxidace, kterou provádí terminální oxidáza. Tyto produkty buňka nemůže použít pro vlastní dýchání. Proto infekční proces se při nevhodném RP v hostiteli zastaví, na straně hostitele vznikne jen hnědě zbarvená buňka nebo chloróza podle hodnoty pH. Na straně hostitele je vyšší koncentrace přenašečů, hostitel nevhodnou oxidaci přežije, parazit však odumírá spolu s infikovanou buňkou.

25

5 Význam hodnot RP pro fyziologii celistvosti rostliny 5.1 Úvod Zjištěné gradienty RP u rostlin se jevily vhodným podkladem pro vysvětlení některých korelačních jevů. Korelace, to je vzájemné vztahy mezi částmi rostliny, jsou základním projevem celistvosti rostliny. Podílejí se na nich rostlinné hormony, které se tvoří v nepatrných množstvích v určité části těla rostliny, odtud proudí do jiné části jejího těla a tím je zajištěna růstová i metabolická celistvost rostliny. Nejdůležitějším rostlinným hormonem je kyselina β-indolyloctová (IAA), která se tvoří v meristematických pletivech, odtud proudí k vrcholu rostliny nebo jejího orgánu (akropetálně) nebo k základu orgánu (bazipetálně). Při použití externí IAA ve formě pasty lze studovat nejrůznější projevy inhibice nebo stimulace tvorby dalších orgánů. Výklad těchto korelací je velmi komplikovaný. Všechny následující dedukce se odvíjejí od zjištění, že transport IAA (ale pravděpodobně i  jiných hormonálních regulátorů) je závislý na elektrickém gradientu v rostlině. V pokusech se slunečnicí bylo prokázáno, že IAA je translokován do oblasti vysokého RP (Benada J. (1968): The effect of IAA on the tropisms of Helianthus annuus L. seedlings in the relationship with redox potential gradients. Flora Abt. A 159: 367-378). Zde uvádím jen příklad hrachu a lnu. (Benada J.(1986):[ Attempt for the elucidation of some correlations in peas and flax from the redox potentials point of view.] Acta Univ. Agric.(Brno),Fac. Agr. 34: 69-73).

26

5.2 Výklad některých korelačních jevů u rostlin popsaných prof. Dostálem a dalšími z hlediska RP Hrách a len přestavují dvě typické rostliny, na nichž byly studovány korelace a apikální dominance. Základní údaje získané pro toto studium jsou obsaženy v práci R. Dostála (1959) „O celistvosti rostlin“, SZN Praha a později v několika příručkách (Šebánek J. a kol (1983).:Fyziologie rostlin. Praha, Procházka S., Šebánek J. a kol (1997).:Regulátory rostlinného růstu. Praha). V souhrnu bylo zjištěno: epigeické dělohy lnu stimulují růst děložních axilárů (větví vyrůstajících v úžlabí děloh), naproti tomu hypogeické dělohy hrachu zabraňují jejich růstu. Vysvětlení těchto korelací dosud spočívalo hlavně interferenci různých růstových látek. Z hlediska RP je situace následující: RP v děložních listech lnu vyrostlého na světle byl v průměru +237 mV. V dělohách hrachu byly naměřeny poměrně kolísající hodnoty od -27 do -140 mV anebo ještě nižším. U hrachu hypogeická děloha (děloha zůstávající po vyklíčení v půdě) působí zábranně na růst svého úžlabního pupenu. U  lnu epigeická děloha (děloha vyrůstající při klíčení nad povrch půdy) působí stimulačně na růst svého úžlabního pupenu. Výklad z hlediska gradientů RP: u hrachu s nízkým RP v dělohách je translokace IAA do děloh omezena, u lnu s vysokým RP je translokace IAA do děloh stimulována. V obou případech se předpokládá, že v  místě tvorby úžlabních pupenů v  meristematických pletivech je supraoptimální koncentrace IAA a RP je velmi nízký. Experimentálně byla zkoušena řada variant předchozích korelačních pokusů, kterým by bylo možno lépe porozumět, pokud by byly prostudovány i gradienty RP v pokusných rostlinách.

5.3 Korelační vztahy a RP u obilnin Vliv světla na RP Nízké hodnoty RP jsou v  čepelích obilnin dosahovány jen na poli za intenzivního slunečního světla. Proto také ty části orgánů rostlin, které jsou kryty jinými částmi, mají vysoký RP, např. bazální části čepelí v době jejich tvorby, dále rostliny ve skleníku mají vyšší RP než rostliny z polních podmínek. Vliv světla na pokles RP je ukázán v tabulce 3.

27

Tab.3. Vliv světla na RP prvního listu ječmene „Bolivia“ ve skleníku, datum měření 24.února, n = 10.

S Rostliny zastíněné Rostliny na plném světle

+77.8 +47.1

2.8 3.5

Gradienty RP v obilninách Klíčící obilka: V embryu byl zjištěn nízký RP, v endospermu vysoká hodnota. V koleoptili byly naměřeny vysoké hodnoty RP. Gradient RP v klíčících obilkách ovsa je uveden v tabulce 4. Horní část koleoptile má vyšší RP než spodní část. Nejvyšší RP byl zjištěn v hypokotylovém článku.

Tab.4. Gradient RP v klíčící obilce ovsa ve tmě v laboratorní teplotě (n = 10).

S Horní část koleoptile

+27.5

2.4

Spodní část koleoptile

+18.9

4.6

Horní část hypokotylového článku

+33.3

3.9

Spodní část hypokotylového článku

+53.3

3.9

Mladé rostliny ve skleníku. První plně vyvinutý list má nižší RP než druhý, teprve rostoucí list. Jestliže je druhý list již plně vyrostlý, pak má zpravidla nižší RP než první list. Gradient RP existuje také v každém listu. Špička čepele, která je starší, má nižší RP než báze čepele, která je růstově mladší. Ve stárnoucím listu se gradient zpravidla obrátí a špička čepele má vyšší RP než bazální část. Zatímco rostliny ve skleníku vyrůstající zpravidla za vyšší teploty a  nižšího osvětlení mají poměrně vysokou hodnotu RP, rostliny na poli mají nízký RP. Gradienty RP listů odnožujícího ječmene jsou uvedeny v tab. 5. Zpravidla RP v čepelích na stéble klesá pravidelně směrem nahoru a každá vyšší čepel má nižší hodnotu RP. Nejhořejší list většinou není ještě plně vytvořen a má RP vyšší než předposlední list.

28

Tab.5. Gradienty RP v odnožujících rostlinách ječmene Diamantu na poli, datum měření 15. května, listy číslovány od spodu.

Pořadí listu 1 2 3 4

Jednotlivé rostliny -3 -28 -56 -39

-15 -37 -45 -32

-8 -49 -63 -38

Průměr -14 -47 -54 -27

-20 -43 -49 -22

-12 -40,8 -53,4 -31,6

U  odnožujících rostlin jsou dělivá pletiva pro zakládání a  růst listů na bázi rostliny, v tak zvaném odnožovacím uzlu. V úžlabí mladých listů se zakládá i pupen odnože, ale její další růst je řízen RP příslušného listu. Mladé listy mají na počátku vysoký RP, IAA je translokován do těchto listů a listy se prodlužují. Jakmile list dospívá, jeho RP klesá, tím nastane reversní jev, IAA směřuje k bázi a pupen vyroste v odnož. Nejnižší hodnoty RP u vymetaných rostlin pšenice má nejhořejší (praporcový) list, u ječmene předposlední list. Je velmi pravděpodobné, že RP každého vyššího listu na stéble závisí na RP předcházejícího listu a na povětrnostních podmínkách, za nichž list vyrůstal. Mezi odnožemi téže rostliny jsou značné rozdíly v RP. Hlavní odnož má v průměru mnohem nižší RP než vedlejší slabší odnož (Tab. 6). Tímto lze vysvětlit známou kompetici (soutěžení) mezi hlavním stéblem a vedlejší odnoží. Proč se obilniny nevětví výše na stéble : Čepele na stéble mají poměrně brzy nízký RP, což má za následek translokaci IAA do prodlužovací zóny internodia s vysokým RP, internodia se prodlužují. Ale za nízkého RP v čepelích sloupkujících rostlin se nezaloží pupen v  jejich úžlabí, protože je zde supraoptimální koncentrace auxinu, a tedy se ani nemůže prodloužit v odnož (větev).

29

U studovaných odrůd ječmene a pšenice byly v pochvách naměřeny vysoké hodnoty RP, mnohem vyšší než v čepelích. Tab.6. Rozdíl RP v čepelích hlavní a vedlejší odnože žita. U hlavní odnože v době odběru listů skončilo kvetení, u vedlejší pozdní odnože klas právě kvetl (8. června). Listy číslovány shora.

Pořadí listu 1 2 3

Hlavní stéblo

První vedlejší odnož

S -76,1 -67,2 -57,8

4,5 4,1 1,0

S -35,6 -51,8 -27,2

4,2 2,2 4,7

Ještě je třeba vysvětlit běžný jev, proč listy obilnin ze skleníku, rostoucí za nedostatečného světla a vyšší teploty mají dlouhé tenké listy, zatímco listy rostlin na poli se stejným počtem listů mají listy kratší a širší: Ve skleníku mají listy vysoký RP, IAA je translokován do horní část čepelí, které se protahují. Na poli je RP podstatně nižší, IAA je natlačován do růstové zóny základů čepelí, kde se buňky dělí, takže vznikají širší kratší listy. Z rozložení RP v rostlině a korelačními poměry lze vysvětlit i některé další projevy růstu obilnin. Je známo, že odnožovací uzel se vytváří v půdě v různé hloubce. Jestliže obilka klíčí příliš hluboko v půdě, pak při nedostatku světla je rozložení RP takové, jak bylo ukázáno v tabulce 2. Nejvyšší RP je v hypokotylovém článku a v horní části koleoptile.Tyto partie se také nejintenzivněji prodlužují. Jakmile se špička koleoptile přiblíží k  povrchu půdy, účinkem světla v  ní klesne RP, příliv auxinu se zastaví a auxin se začne hromadit v bazální části koleoptile, která nyní bytní a dá vznik odnožovacímu uzlu. Proč se neprodlužuje dál hypokotyl, nelze zatím zodpovědět. Bylo by třeba sledovat změny v hypokotylu během jeho stárnutí. Vysvětlení korelačních jevů na základě různé koncentrace a přesunu IAA je sice jednoduché a  má jednotný základ, avšak problémem zůstává ověření, jaká je skutečná koncentrace IAA na určitém místě. Tato koncentrace záleží nejen na produkci přirozeného IAA v rostlině na určitém místě, ale i na jejím přesunu a odbourávání, které může být způsobeno auxinoxidázou. Aktivita tohoto enzymu může být různá na různých místech a  může se měnit podle vnějších podmínek a se stářím orgánů. Proto se domnívám, že vztah mezi korelačními jevy a RP bude třeba teprve studovat. Ale je třeba začít s měřením RP v modelových rostlinách. Pokud taková měření nejsou provedena, není možno vysvětlit obrovské množství pokusů experimentální morfologie z tohoto nového hlediska. 30

Je to ale námět pro experimenty. Jen bych zde citoval závěr 17. kapitoly - Rostlinné hormony a apikální dominance - str. 229, autor S. Procházka (citovaná příručka Regulátory rostlinného růstu, 1997):“ Auxin ovlivňováním polarity buněk s velkou pravděpodobností řídí růst axilárních pupenů. Jak auxin kontroluje buněčnou polaritu, není ještě známo, ale může to být významným předpokladem pro pochopení mechanismu apikální dominance.“ Já bych z hlediska RP jen dodal, že polarita v rostlině a velmi pravděpodobně i v buňce je dána gradientem RP, který vzniká tak základním procesem jako je dýchání. Druhotně pak dochází k translokaci auxinu a dalších růstových látek se všemi důsledky pro celistvost rostliny. Růstové oblasti (meristém) s nízkým RP, odkud je IAA translokován do oblastí s vysokým RP, lze v rostlinách jednoduše vyznačit tvorbou červeného formazanu ponořením pletiv do 1% vodného roztoku tetrazolium chloridu. Účinek světla na RP rostlin je odlišný u dvouděložných a jednoděložných rostlin. V  předcházejícím pojednání byl vyložen vliv světla u  jednoděložných obilnin. U dvouděložných rostlin (slunečnice a jiné) světlo výrazně zvyšuje RP. To je zřejmě také příčinou, proč některé hormonální herbicidy působí na dvouděložné rostliny destrukčně, naproti obilniny nejsou ve vyzkoušených koncentracích poškozeny.

31

6 Historie výzkumu biofyzikálních stavů rostlin v Zemědělském výzkumném ústavu v Kroměříži Problematika studia biofyzikálních stavů v  rostlinách byla zahájena v  roce 1966 v rámci výzkumného úkolu A-0-29-4/16 : Studium podstaty odolnosti obilnin proti obligátním parazitům. Závěrečné zprávy byly podány a  úspěšně obhájeny v  letech 1968 a  1970. Pak byl další výzkum v  tomto směru zastaven přechodem Výzkumného ústavu obilnářského ústavu v Kroměříži na jiné úkoly (nástup nového ředitele v rámci normalizace). Řešitel pak pokračoval ve studiu podstaty odolnosti rostlin a studiu významu biofyzikálních jevů soukromě až do odchodu do důchodu a dále až do nynější doby. Velmi významný přínos k problematice redoxních potenciálů byl publikován v roce 2009 (Benada J.: Non-invasive method of redox potential measurement.-Neinvazivní metoda měření redoxních potenciálů u  rostlin. Ob. Listy 17:15-18,2009. Návrh dalšího směru výzkumu).Bohužel se nikde nenašel pokračovatel v této práci, protože v biologickém výzkumu převládly molekulárně genetické metody. Výzkum podstaty odolnosti založený na jiných metodách je považován za zastaralý a  tomu odpovídá i  odmítání publikací redakcemi předních biologických a fytopatologických časopisů. Podání žádosti o grant výzkumu založený na biofyzikálních metodách nemá naději na přijetí. Proto i předložené výsledky jsou považovány za hypotézu, protože nejsou ověřeny jinými autory. Ale je třeba zároveň říci, že dosud nebyla publikovaná žádná jiná ucelená práce vysvětlující podstatu odolnosti rostlin k chorobám. Přehled publikací o tomto výzkumu je uveden v samostatném souboru. Od roku 1991 byly postupně uveřejňovány souhrny dosažených výsledků a zpřesňována předložená teorie podstaty odolnosti rostlin proti chorobám.

7 Přínos předložené výzkumné práce: 7.1 Praktické aplikace Odolnost rostlin se během jejich růstu a vývoje mění. Během stadia odolnosti (u obilnin je to období sloupkování) není třeba chemická ochrana. Tím by se snížily náklady. Tato odolnost je universální. Stupeň odolnosti se může v jednotlivých ročnících do určité míry vlivem počasí, výživy, agrotechniky atd. měnit. Konec stadia odolnosti u obilnin končí v době květu se začátkem stárnutí orgánů, které je charakterizováno stoupáním pH k  hodnotě kolem 7. Stárnutí listů postupuje od spodních listů k horním. Stav náchylnosti lze měřit jako redoxní potenciál. 32

Stav stadijní náchylnosti u řady pěstovaných rostlin je znám praktickým agronomům (např. u brambor, révy) a je některými zohledňován. U obilnin výrobci fungicidů při doporučení pro chemickou ochranu většinou tuto odolnost neberou v úvahu. Situace u chemických látek je komplikována tím, že některé z nich ovlivňují i biochemické procesy v rostlině a mohou ovlivňovat výnos. Zjišťování aktuálního obsahu dusičnanového iontu v půdě redoxním potenciálem.

7.2 Přínos pro základní výzkum Redoxní potenciál má svůj základ v dýchání rostlin (v terminální oxidaci). Přenašečem elektronů při dýchání není v tucích rozpustný ubichinon, ale ve vodě rozpustné látky, pravděpodobně fenolické povahy, mající schopnost difundovat ven z buňky a tvořící část rozpoznávacího procesu mezi hostitelem a parazitem. Přenašeče elektronů nejsou oxidovány vzdušným kyslíkem. Tvorba pohlavního a nepohlavního stadia obligátních parazitů (padlí) a tvorba uredií a telií u rzí závisí na pH hostitelského pletiva, což dosud není v publikacích nikde uváděno. Redoxními potenciály bylo možno poměrně jednoduše vysvětlit řadu korelačních jevů u rostlin, např. u lnu, hrachu, slunečnice, ale i obilnin. Z předložených pokusů vyplývá, že v živé buňce není přítomen volný kyslík a terminální oxidace probíhá ve stěně buněčné. Dehydrogenázy i terminální oxidázy účastnící se dýchání jsou vysoce specializované na druhově specifického přenašeče elektronů.

33

8 Uveřejněné práce o redoxním potenciálu a pH u rostlin. (List of publications on redox potential and and pH in plants.)

Benada J.: The growth of powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) on the coleoptiles and on the young leaves of barley. Phytopath. Z. 51: 187–189, 1964a. Benada J.: Consideration about the resistance of barley against powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) from the point of view of oxidation-reduction potentials. Scientific Works Cereal Res. Inst.,Kroměříž, 219–223, 1964b. Benada J.: Die Veränderungen in der Resistenz gegen Mehltau und Roste während der ontogenetischen Entwicklung der Getreidearten. Symposium: Host-parasite relations in plant pathology, Budapest, 235–238, 1964c. Benada J.: The influence of pH of barley tissues on the symptoms caused by powdery mildew (Erysiphe graminis DC.). Phytopath. Z. 54: 185–192, 1965. Benada J.: The gradients of oxidation-reduction potentials in cereals and the dependance of obligate parasites on redox potentials of the host tissues. Phytopath. Z. 55: 265–290, 1966a. Benada J.: The occurence of telia of rusts and cleistothecia of powdery mildew on cereals and an attempt to find a factor conditioning it.- Zentr. Bak.,Infek.,Hygiene II. Abt. 120: 427–433,1966b. Benada J.: Effect of CCC on oxidation-reduction potentials of cereals under the influence of environment. Flora, Abt. A 157: 334–349, 1966c. Benada J.: The dependance on the pH of the host tissue for the production of uredia and telia in Uromyces pisi (Pers.) de Bary. Česká mykologie 21: 90–91, 1967a.

34

Benada J.: Redox potential gradients in the flower. Biol. Plantarum 9: 202–204, 1967b. Benada.:

The distribution of redox potentials and pH values in the leaves of cereal tillers during the stem extension. Flora Abt. A 158: 343–350, 1967c.

Benada J.: Anaerobe Beizung von Getreidesaatgut im Blickpunkt der Redoxpotentiale. - Intern. Pflanzenschutzkongress Wien 1967, 155–156, 1967d. Benada J.: The effect of wilting on redox potential of cereal leaves. Biol. Plantarum 9: 447–453, 1967e. Benada J.: A study on the correlation between the expansion of plant organs and oxidation reduction potentials. Flora Abt. A 157: 552–560, 1967f. Benada J.: The measurement of redox potential in plants and some applications on the growth and development of cereals. Flora Abt. A 159: 104–127, 1968a. Benada J.: The effect of IAA on the tropisms of Helianthus annuus L. seedlings in the relationship with redox potential gradients. Flora Abt. A 159: 367–378, 1968b. Benada J.: The germination of cereal seeds and the anaerobic treatment of them from the point of view of redox potential. Phytopath. Z. 63: 135–141, 1968c. Benada J.: Brown pathes on leaves of barley in the relationship to powdery mildew. - Phytopath. Z. 65: 288–290, 1969. Benada J.: Chlorotic spots on cereal leaves as the expression of resistance against powdery mildew. Phytopath. Z. 67: 89–92, 1970a. Benada J.: Observation of early phases of infection by powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) Phytopath. Z. 68: 181–187, 1970b.

35

Benada J.: The effect of different conditions of cultivation of powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) on the infectivity. Phytopath. Z. 69: 273–276, 1970c. Benada J.: The testing of correlation between the biophysical states in host tissues and the susceptibility of cereals to powdery mildew (Erysiphe graminis DC.).- Phytopath. Z. 70: 127–136, 1971. Benada J.: Použití redoxních potenciálů při studiu ekologie obilnin. [The use of redox potential measurement in the study of cereal ecology.] Rostl. Výr. 19: 815–820, 1973. Benada J.: Náchylnost a odolnost pletiv okurky a tykve vůči padlí Sphaerotheca fuliginea v závislosti na redoxním potenciálu a pH. [The susceptibility and resistance of Cucumis sativa and C. pepo organs to powdery mildew Sphaerotheca fuliginea in the dependance on redox potential and pH.] Česká mykologie 28: 44–53, 1974. Benada J.: Pokus o vysvětlení korelací u hrachu a lnu z hlediska redoxních potenciálů. [Attempt for the ellucidation of some correlations in peas and flax from the redox potentials point of view.] Acta Univ. Agric.(Brno), Fac. Agr. 34: 69–73, 1986. Benada J.: The nature of resistance of plants to obligate parasites. Ochr. Rostl. 27: 9–14, 1991. Benada J.: Electric potentials as a factor of morphogenesis and ontogenesis of plants.- 9th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Brno, p. S97, 1994. Benada J.: Měření redoxních potenciálů v půdě. [The measurement of redox potential in soil.] Ob. listy No.3: 48–49, 1995. Benada J.: Mechanism of plant resistance to obligate parasites in relation to biophysical states. Pflanzenschutzberichte 57: 37–48,1997. Benada J.: Význam biofyzikálních stavů pro fytopatologii a fyziologii rostlin. [Importance of biophysical states for phytopathology and plant physiology.] Agro 1998, č.5, 55–63.] 36

Benada J.: O estado biofísico das plantas e sua funçâo no mecanismo da resisténcia ás doenças. Revisao Anual de Patol. de Plantas 10:347-372, 2002, Brasil. From English original translated by Mauricio Fernandes. Benada J.: Změny odolnosti bramboru vůči plísní Phytophthora infestans. [Changes of resistance of potatoes to Phytophthora infestans]. Rostlinolékař 19: 26–27, 2008a, č. 2). Benada J.: Redox potential and pH in plants and their function in the mechanism of resistance to diseases and in plant physiology. Review. Redoxní potenciál a pH u rostlin a jejich funkce v odolnosti rostlin. Ob. Listy 16 : 114–117, 2008b. Benada J.: Non-invasive method of redox potential measurement.- Neinvazivní metoda měření redoxních potenciálů u rostlin. Ob. Listy 17: 15–18, 2009. Benada J.: Využití hodnot redoxního potenciálu půdy ve výživě rostlin. [Redox potential in soil for plant nutrition]. Úroda 19: 8–10, 2010, č.5). In Czech Benada J., Váňová M.: The growth of the roots of barley in the dependence on oxidation reduction potential, nitrogen nutrition and aeration of nutrient solution. - Biológia (Bratislava) 27: 53–61, 1972. Benada J., Vaňová M.: Effect of various levels of nitrogen, potassium and phosphorus on oxidation reduction potentials in barley. Biol. Plant. 14: 124–125, 1972. Benada J, Klusák H.: Oxidation of indole-3-acetic acid by supernatants of homogenates of barley infected with powdery mildew (Erysiphe graminis DC) and by extracts from surphace of barley roots. Biol. Plant. 16: 204–209, 1974. Tvarůžek L.: The determination of stress effect on wheat disposition to Septoria nodorum Berk. based on electric potential. Ochr. Rostl. 27: 183–190, 1991.

37

9 Příloha Biophysical states in plants and their function in the mechanism of resistance to diseases and in plant physiology - review. (Benada J.: O estado biofísico das plantas e sua funçâo no mecanismo da resisténcia ás doenças. Revisao Anual de Patol. de Plantas 10:347-372, 2002, Brasil. From English original translated by Mauricio Fernandes.)

38

Summary The study of biophysical states in plants was initiated 35 years ago in connection with the looking for the mechanism of plant resistance to parasites. Here the attention was focused on the variable resistance of cereals to obligate parasites such as powdery mildew and rusts. It was necessary to find out a factor which changes during the ontogeny and through the environment and which involves: 1. the disease gradients on plant, 2. the change of susceptibility of organs during the ontogeny and growth, 3. the difference in resistance in individual plant cells, 4. relatively swift changes of resistance during a couple of hours. Such a factor could be found in the biophysical states of plant organs (redox potential and pH). A hypothesis was formulated for further investigation: The principle of resistance consists in the ability of the parasite to gain the energy in the host cell. The parasite uses the oxidoreductase of the host plasmalemma. The specific phenolics are the substrate for this enzyme. The main features of this hypothesis are: 1. There is no free oxygen in the cell plasma. 2. The redox potentials are generated by the respiration of the cells by the sum of activities in cell organelles which produce the electrons and the activity of oxidoreductase (the terminal oxidase) in the plasmalemma. 3. The redox potential is the basis of electric gradients in the plant which plays the main role in its integrity as well as for the life of the parasite. 4. The parasite respires through the terminal oxidase of the host. 5. The environmental conditions influence the enzyme activity of host and parasite cells differently by which different redox potentials may appear in the host and parasite cells resulting in unspecific oxidation or reduction.

Additional key words: redox potential, pH, gradients, powdery mildew, rusts, phenolics, respiration, oxygen, oxidoreductase, plant integrity, correlations.

39

1 Introduction In spite of the attention paid to looking for the principle of disease resistance by plant pathologists over many years (see the review by Fuchs (1976), there is still missing general explanation of its nature (Heitefuss 1992, Hartleb, Heitefuss, Hoppe 1997). The basic role is ascribed to the recognition of the host by the parasite and to the exploitation of the host as a substrate without declaring what the real mechanism is. Unconscious generalisation of results obtained with special objects lead to theories which were not generally applicable. Fuchs (l.c.) concluded that the problem was necessary to recede to new, unknown horizons. The older data on hostparasite relationships were summarized in compendia such as those by Heitefuss & Williams (1976), Vanderplank (1982) and Horsfall and Cowling (1980). In the last 20 years more success has been expected from molecular biology and molecular genetics (Heitefuss 1992) and summarized e.g. by Newton and Andrivon (1995). At the beginning there was investigation of variable resistance (VR) to obligate parasites such as powdery mildew of cereals and rusts (Benada 1964b, c). To limited extent other host-parasite couples were studied (Benada 1967a, 1974). For elucidation the VR mechanism the attention was focused on redox potential (RP) and pH (Benada 1966a, 1967c, 1968a). The reasons for the selection of this direction of investigation are mentioned in the cited literature. In this article will be presented most author‚s investigations on variable resistance as a starting point for considering the nature of disease resistance, some selected data of redox potential and pH and its application on plant physiology. The variable resistance (sometimes termed field resistance, race non-specific resistance, partial resistance, horizontal resistance, general resistance) designates a plant resistance which changes during the ontogeny of the host and under the environment and which involves: 1. the disease gradients on a plant, 2. the change of susceptibility of organs during the ontogeny and growth, 3. the difference in resistance in individual cells of a plant and relatively swift changes of its resistance during a couple of hours. The aim of this article is to formulate a hypothesis why the biophysical states may play such an important role in resistance and in plant physiology in general.

40

2 Redox potential and pH 2.1 Methods Bright foil platinum electrode and saturated calomel electrode was used for RP measurement in the tissues non-damaged by disintegration (Benada 1966a). The prepolarisation of the Pt electrode by ferricyanide was necessary in some cases to obtain the distinct lower turn point. To simplify the RP interpretation the shown data do not regard the potential of saturated calomel electrode (+244 mV). Generally 10 leaves or other organs were taken for one series of measurement and the results were expressed as mean and SEM (standard error of mean). Before measurement the leaf blade was rolled from the tip to the base and the Pt electrode was run through the leaf tissue so that the whole surface of the electrode was covered with it. Then the leaf was put in a Petri dish with 0.1 % KCl solution in bottom or with the tap water. In potato tubers the electrode was simply inserted into the tissue. The measurement must be done under aerobic conditions (with the exception of experiments in anaerobiosis). It must be taken into consideration that RP is dependent on the enzyme activity and that it changes during a time period. Since the RP is dependent on enzyme activity, the use of redox dyes is limited for measurement. The above electrode couples were used for RP measurement in roots exudates (Benada 1995) similarly to that used in the soil by other authors, e.g. Flessa and Fischer (1992), Králová (1992). For measurement in the soil the measurement „in situ“ was prefered. pH was measured using a  glass electrode in a  drop of disintegrated tissue (Benada 1965, 1966b, 1967a), but other methods were tried too.

41

2.2 Properties of RP 2.2.1 Influence of environment The redox state changes during the growth and development of organs and it is influenced by outer conditions such as light, temperature, moisture, growth regulators, nutrition, etc.(Benada 1966c, 1967e, Benada and Váňová 1972).

2.2.1.1 Light Light is the most important factor in influencing the RP values in leaves. Low values of RP were obtained under intensive light in the field only. Those parts of leaves, which were covered by other parts, had high RP, e. g. basal parts of leaf blades covered by the sheaths during their development. The influence of light on the decrease in RP is shown in Table 1. Table 1. The effect of light on redox in the first leaf of the wheat and barley in the glasshouse (Benada 1966a)

Light

Dark S

Wheat Barley

+4.6 +19.9

3.2 2.2

S +30.8 +60.7

2.1 3.3

2.2.1.2 Temperature The influence of the temperature is complicated by the fact that RP is simultaneously dependent on the light. In the laboratory trials the increased temperature caused the increase in RP and the lower temperature had a reverse effect. On the contrary, the temperature below +5 oC resulted in the increase in RP.

42

2.2.1.3 Water It was found that the wilting of young plant leaves in the glasshouse which had the high RP values at the beginning of experiment caused an increased RP. On the contrary, in leaves of plants growing in the field with initial low RP the wilting resulted in the decrease in RP values (Benada 1967e).

2.2.1.4 Nutrition The first leaves of cereals growing in the hydroponic culture with full nutrition had lower RP than plants growing in pure water (Table 2). Table 2. The effect of nutrition on redox of the first leaf of cereals (Benada 1973)

with nutrients barley var. Valtický wheat var. Zlatka

+38,1 +10.6

without nutrients S 2.5 4.3

+71.4 +45.0

S 2.7 3.1

2.2.1.5 Anaerobic conditions It was assessed that RP state was very sensitive to aerobic conditions of measured organs (Benada 1965, 1966a, 1967d, 1968a, c). The most expressive effect of anaerobic conditions was observed in the inundated roots of cereals where in the root exudates RP sank to -560 mV after 40 hrs or within 30 minutes only in dependence of temperature and plant material, whereas in the aerobic conditions it was +160 mV (Benada 1995).The addition of KNO3 solution prevented the decrease of RP. It is explained that nitrate with combination with nitratereductase supplies oxygen for respiration. Some plant organs (e.g. sunflower hypocotyls) are very sensitive to anaerobic conditions, too. During one hour, RP sank from +200 mV to +60 mV in them. The cereal leaves are not so sensitive.

43

2.2.2 Influence of ontogeny and senescence In cereal leaves growing in the field RP sank from approx. +50 mV to -100 mV or lower during the ontogenetic development. In dicotyledon plants such as the sunflower RPs in cotyledons were approx. +260 mV, in the leaves on the stem it sank to the area of -20 mV. The decrease in RP seems to be of general validity during the ontogeny in all plants. During the senescence the RP of leaves increases as can be seen in Table 3. Table 3 Change of redox potential in barley leaves during the senescence (Benada 1966a) - (First leaf in the greenhouse were investigated)

Date of measurement

March 27

March 30

April 2

April 8

S

+10.4 2.8 10

-1.5 2.6 10

-6.4 3.5 8

-1.4 3.1 8



2.2.3 Gradients in plant There are gradients of RP in the whole plant. In cereal leaves during the stem elongation the lowest RP value was in the second upper leaf (Table 4), whereas when the ear appeared, then in wheat the lowest value was in the top leaf (Benada 1967c). The RP gradients were not so regular in some cases.

44

Table 4. RP gradient in the cereal leaves during the stem elongation.

1 -18 -48

Wheat Barley

2 -47 -71

The leaf range from top 3 4 -37 -15 -67 -38

5 +2 -16

6 +2 +32

There are differences of RP in leaves on the main and side tillers (Table 5), the main tiller having lower values (Benada 1966a). More data are obtained in author‚s cited publications. There are gradients in other plants, too (Benada 1967b) as well as gradients of pH.: young organs being acidic, older ones having pH near the neutral point. In dependence on pH values the symptoms of powdery mildew as well as production of conidia and cleistothecia in powdery mildew or uredia and telia of rusts were changed (Benada 1965, 1966b, 1967a, 1970a). The formation of conidial stage of powdery mildew or uredial stage of rusts was linked with tissues of pH value 6 and lower , the cleistothecia of powdery mildew and telia of rusts were formed at tissue pH around 7 and higher.

Table 5. Differences in redox values in the leaves of main and side tiller in rye

Leaf range 1 2 3

Main tiller -76.1 -67.2 -57.8

Side tiller S 4.5 4.1 1.0

-35.6 -51.8 -27,2

S 4.2 2.2 4.7

2.2.4 Other electric measurement in plants Measurement of the RP difference between the plant and soil were performed by Keppel et. al. (1997). When there are RP gradients in the plant, then the RP difference may be examined. Similarly the electric current (in mA) was measured by Rajda (1992, 1996). Generally when the RP difference between tree and soil is low or when there is low electric current, the health state of the tree or other plants is bad.

45

2.3 Discussion of RP From above and other experiments I came to the conclusion that RP is generated by the respiration of plants, it is by the production of electrons by dehydrogenases and by the activity of terminal oxidoreductases. It is supposed that the activity of these enzyme groups is changing and so different RPs may be created. The increase of RP value during longer time of measurement may be due to electrolysis of water and development of oxygen on the electrode. The analysis of free O2 in the cell is difficult and up to this time the importance of such investigations has not been put in foreground [e.g. Linskens and Jackson (1990)]. Most plant physiologist presume that O2 is present in the cell. Nevertheless, when the RP in plant tissues should be dependent directly on O2 pressure, then there would not be any gradient of RP. But the gradients of RP within different plant organs do exist.

3 Function of RP in the mechanism of resistance to plant pathogens 3.1. Variable resistance The variable resistance in some characteristics is close to race non-specific resistance. The meaning of race non-specific resistance (called field resistance, general, non specific, partial resistance ) have been formulated by many authors and sometimes with different contents. A recent example is given by Jorgensen (1987): 1. it reduces the amount of powdery mildew , irrespective of the pathogen genotype, 2. it is governed by apparently many additive acting genes, and 3. it is expressed (and measured) in quantitative terms. The differences in the definition of different kinds of resistance reflects the present insufficient knowledge of the mechanism of it. The experiments with VR have advantage in investigation of resistance nature because we can use one variety only, we can take different organs and parts of it and in this way to eliminate the chemical differences given by varieties.

3.2 Comparison of non-host resistance and VR In experiments and observations of plants grown in the field it was noticed that during the stem elongation of cereals the new leaves were temporarily fully resistant to powdery mildew and behaved similarly to those in the case of non-host resistance (Benada 1966a) in respect to haustoria formation.

46

3.3 Disease gradients The lower leaves developed on the cereal plants during the stem elongation are susceptible to powdery mildew, the upper ones are resistant for some time (Benada 1966a). This is called the infection gradient (Tapke 1953 who reviewed the literature on this topic). The outer side of coleoptiles and the young leaves in them are resistant, which was demonstrated by an inoculation test on isolated organs (Benada 1964a, c). Distinct differences in resistance were found within one leaf blade, between its top and base, between leaf sheaths and the stem. Quantitative differences in resistance were found even in neighbouring individual epidermis cells (Benada 1969, 1970a, b, c, 1971) and it was found that the resistance could change within few hours, which could be demonstrated by haustoria formation (fig.1). The dependence of resistance on the ontogeny and on the environment is known for a long time in many parasite-host couples and was shown in the case of powdery mildew (Benada 1966a where some fundamental papers are reviewed).

3.4 Resistance and RP Already earlier investigations (Benada 1966a) suggested that the biophysical states in plants could accomplish the requirements for expressing the VR: 1the disease gradients on a  plant, 2the change of susceptibility of organs during the ontogeny and growth, 3the difference in resistance in individual cells of a plant, 4. relatively swift changes of resistance during a couple of hours. In special experiments on detached leaves of cereals (Benada 1971) we tried to find exact limits of RP and pH values for resistance or susceptibility against powdery mildew. Because measurement of RP and pH in individual cells was not possible such exact limits could not be found. Nevertheless, organs with a low RP (lower than 0 mV) were resistant against powdery mildew, organs with a  higher value were susceptible (Benada, 1971). In the case of tomatoes the resistant leaves and fruits against Phytophthora infestans had RP higher than +100 mV, the susceptible ones had lower RP (in potato Fig 2).So, the leaves of cucumber were resistant against Pseudoperonospora cubensis at RP higher than 0 mV. The RP of older leaves on the stem was falling under 0 mV and they grew susceptible. In potato tubers the inner part of it having RP bellow +100 mV is susceptible to Phytophthora infestans, the outer part having RP above +100 mV is resistant.

47

3.5 Attempt to formulate the theory of resistance on the basis of RP It was shown that the resistance in examined plants was linked with areas of distinct RP and that powdery mildew of cereals was a very suitable object of resistance investigation because the development of haustoria could be relatively simply observed. The strategy of looking for the mechanism of resistance on the basis of molecular biology in a substance seems to be very complicated, because there is a great number of substances at stake. Moreover, the valid mechanism of resistance must be applicable in the other areas of plant physiology. During 30 years of investigation it has been shown that the RP values could be measured and that under similar conditions the respective organs had rather the same RP. Up to that time biophysical states have not included in the consideration the mechanism of plant resistance at least as it will be formulated in the next part. The electric potential in plants is not a  redox potential in a  strict sense of physical chemistry because it has no steady state and it only reflects the oxidative and reductive processes in plant cells. Therefore, the measurement of RP in plant is not accepted by the researchers in physical chemistry and it is not mentioned in Physical methods in plant sciences by Linskens and Jackson (1990).

3.6 Why RP has decisive function in the mechanism of resistance 3.6.1 Electron transport The hypothesis has been formulated that there is no free oxygen in the cytoplasma and the transport of electrons among cell organelles is mediated by a system of „phenolics“ forming redox couples in combination with highly specific oxido-reductases being fixed in cell wall (plasmalemma) and cell organelle wall. The specificity consists in oxidation or reduction of OH/O groups of „phenolics“ in distinct positions only. The electron exchange must take place in the same position by the enzyme in the walls of inner organelles: chloroplasts, mitochondria, nucleus, etc. I suppose it is the same enzyme as that in outer cell wall which can work as oxidase or reductase in dependence on the supply or demand of oxygen/electrons. The specificity is implemented by this mechanism. The parasite in host cell cannot use its own enzyme (terminal oxidase, oxido-reductase), because there is no free oxygen in the cell cytoplasma, it must use the enzyme 48

in outer membrane of the host cell. The oxidation of its „phenolics“ must be so specific that the reductase of inner membrane of its own organelles converts the „phenolics“ to the original state. In other cases non specifically oxidized „phenolics“ accumulate in the host cell and the parasite dies for the lack of energy. Because these „phenolics“ of the parasite are „strange“ for the enzyme of the host, the specific oxidation is very sensitive to redox and pH stage of the host. The analysis of free O2 in the cell is difficult and up to this time the importance of such investigations has not been put in foreground (e.g. Linskens and Jackson (1990).

3.7 Phenolics There are many redox systems that operate in the plant cell. With respect to the method of measurement and that the redox system exudates from roots (Benada 1995) and from other plant organs (unpublished results) the attention was concentrated on phenolic compounds (Vaugham and Ord 1991). Moreover, the phenols are supposed to play an important role in resistance. The exudation of phenol compounds takes place from both powdery mildew conidia (Vizarová and Janitor 1968) and uredospores of rust (Summere et al. 1957). Nevertheless, I suppose that the target redox systems are not only phenols but other aromatic (heterocyclic) hydroxy compounds, too. The generally present ascorbic acid redox system is not specific enough for electron exchange (see later) with the exception that it would be combined with phenols. Further on the designation „phenolics“ will be used for all these electron carriers.

Expected properties of „phenolics“ as carriers of electrons in respiration: 1. Solubility in water. 2. Formation of the redox system in cytoplasma connecting all cell organelles in demand and supply of electrons. 3. Absence of oxidation by the air oxygen at all or of specific oxidation. The same is valid for hydrogen peroxide and other oxidizing factors. 4. Formation of exudates. 5. The phenolics can be obtained in oxidized or reduced states by inducing aerobic or anaerobic conditions. Point 1., 3., 4., and 5., could be demonstrated by growing the cereal plants in hydroponic culture (Benada 1995). The exudation of phenolics and other substances from roots is known (Přikryl and Vančura 1990). 49

3.8 Concentration of electron carriers The exact concentration of electron carriers is not known. It can be only estimated e.g. from the experiments with self-inhibition of rust spore germination (Macko et al. 1971). The concentration of respective phenol substances is approximatelly 10-8 till 10 -10 molar solution. They are therefore amongst the most highly active biological agents, equally active or more so than the sex hormones (Allen 1976). When there is interferention with the electrone cariers, then this effect can be understood.

3.9 Redox values Having found that the plant organs are resistant/susceptible within certain limits of RP and pH , it was necessary to ask a question why RP played such an important role. RP was supposed to play a significant role in respiration of both host and parasite and in the ability of the parasite to gain the energy in the host (Benada 1964a,1991). The influence of the environment on the activity of reducing enzymes in cell organelles and on the activity of terminal oxidase in cell wall (plasmalemma) is expected to be different, therefore low or high RP results. It remains to explain why the parasite cannot live in the cell at a high, or more often, low RP. It is known that the redox system with a high RP oxidizes other redox systems with a lower RP and vice versa. If the parasite produces its own redox system in the cell which is oxidized by the host at a proper site, but this system interferes with the redox system of the host with much lower RP, then non-specific reduction takes place which cannot be oxidized by the terminal oxidase. It is similar at a high RP of the host cell, too. Thus, the importance of RP of the host cell or tissue consists in the fact that the redox system of the host and parasite interfere mutually through oxidation or reduction, but non-specifically, i.e. in non-correct sites of OH/O groups. Also, reverse reaction would be possible. Here the amount of the redox system of the parasite would surpass the amount of the redox system of the host. However, the host cell would die. Fig.3. Up to now, I do not have the explanation of the pH function for the transformation of the conidium stage to ascomycete one, and similarly uredia to telia. I am of the opinion that this change is also associated with the oxidation of phenolic substances as carriers of electrons. On the other hand, an appropriate value of pH is necessary for correct function or oxidation-reduction enzymes.

50

3.10 Obligate parasites An obligate parasite without the host has not its terminal oxidase (phenol oxido-reductase) active enough to ensure its energy requirement for the growth and multiplication. For example, the conidia of powdery mildew germinate on leaf surface and the infection hypha grow mainly above the septa of cells where the highest accumulation of host oxidase may be expected (Benada 1970b). Haustoria of powdery mildew are formed in the host epidermal cell only when its redox and pH stage are suitable for the specific oxidation/reduction and in this way satisfying enough energy by respiration. Moreover, IAA (indole acetic acid) is translocated to mycelium areas with high RP and therefore the mycelium grows in the direction of the highest oxidation. The above principle should be the same for the race-specific and race nonspecific resistance (Benada 1997). Each race has its own substrate and oxidation/ reduction enzyme. When the enzyme of the host is not suitable, then there is no energy supply and no growth of the parasite. This fits with the „gene-for-gene“ theory formulated by Flor (1942) very well. The host for mono- and dicaryotic states of some rusts are different. Therefore, the respiratory substrate must be different at these two stages and the parasite grows in host with suitable oxidase for the specific substrate only. Since cereal powdery mildew infects epidermal cells only and rust does mesophyl cells, therefore the different oxidation-reduction enzymes are expected in them. It is not clear if there are different substrates for them, too, or if there is the same substrate, but only the oxidation and reduction go in other places of the same molecule. What may be the fate of this substrate when it comes to the epidermal cell and vice versa is open for further investigation.

3.11 Support of hypothesis The above-mentioned hypothesis is supported by some previous findings of other authors (cited from Heitefuss and Williams 1976): Control of spore germination and infection structure (Allen, p.78) endogenous inhibitors are diffusible, readily reversible dormancy agents, small molecular compounds, the target of their action is the spore wall and they are characterized by their mobility from cell to cell.

51

Protein metabolism (Uritani, p.521): „The injury or death of parasitized cells often induce oxidation of polyphenols or the formation of lignin in the infected cells and in the non-infected cells adjacent to the infected cells.“ Endogenous auxins in healthy and diseased plants (Pegg, p.575): „Particular interest centres around the role of phenolic compounds and auxin metabolism. The production of phenolic compounds and phenol oxidases and hydroxylases is an almost universal feature of disease involving facultative pathogens.“ Oxidative enzymes (Frič, p.623): „Increased phenolase activity in diseased or wounded areas of plant tissues is generally accompanied by increased concentration of phenolic substances.“ Phytoalexins (Kuc, p.646): „It appears that the key to the timing of the response is determined by the plant`s ability to react to components in or produced by the infection agent (recognition). It is suggested a surface phenomenon based on components of cell walls or membranes.“ Increased respiration connected with infection (Daly, p.541). My own explanation: when the „phenolics“ of the parasite is not specifically oxidized, the product cannot be used for energy gain of the parasite. Also, the „phenolics“ from the parasite enter the host cell, they cause damage by competition with indigenous phenolic substances and increased respiration results. The observed different susceptibility of neighbouring epidermal cells to powdery mildew and rapid changes of susceptibility and resistance (Benada 1970b) can be understood by different biophysical states in them.

3.12 Expected objections against the hypothesis A  general opinion of plant physiologists on electron transport in the cell counts that cytochrome system takes the function of terminal oxidase. Because the most parts of respective experiments were done in disintegrated cells or isolated cell components, it would be necessary to make experiments with intact cells. There are several reviews dealing with a possible role of phenolic compounds in diseased plants (Farkas and Király 1962, Rohringer and Samborski 1967, Kosuge 1969, and others). Other literature cannot be listed here. The general opinion is that phenol oxidations are always connected with cell disintegration (Frič, l.c., p.623.). Nevertheless, Frič (l.c., p.627) is aware of that there are no data on their physiological role in intact plants. 52

The researchers in molecular plant pathology (e.g. Patil et al. 1991) will claim that the genes which are responsible for production of toxins, enzymes, etc. are the cause of resistance. From the point of view of my hypothesis this may be correct in a special case, nevertheless this does not cover all aspects of VR.

3.13 The role of pH The telia of cereal rusts can scarcely be found on cereal seedlings grown in the greenhouse and they occur in uredial stage mostly on younger tissues in the field, too. Similarly, the powdery mildew on the seedlings in the greenhouse occurs only in the conidial form. The cleistothecia can be found abundantly on the mature plants in the field. This phenomenon is generally known and several attempts were made in the past to explain it (Benada 1966b). Up to this time it is not clear why pH of host tissue plays such an important role in the change of the conidial or uredial stage of parasites. It is very conspicuous that simultaneously symptoms caused by the parasite in the host change, too (e.g. brown patches or chlorotic spots developing in connection with powdery mildew infection) (Benada 1969).

4 Function of RP in plant integrity All deductions originate in the findings that transport of IAA (probably other hormone regulators too) depends on the electric gradient in the plant (Benada 1968b). I will present examples on peas and flax.

4.1 Peas and flax Peas and flax are two typical plants which were used for studying correlations and apical dominances. Basic data achieved in this study are reported by Dostál (1959) and later in several other contributions (Šebánek et al. 1983, Procházka et al. 1997, and others). Conclusions were as follows: epigeic cotyledons of flax stimulate the growth of their axils. By contrast, hypogeic cotyledons of peas suppress their growth. Until now, explanations of these correlations have consisted in interferences of various growth substances. 53

The situation from the RP point of view is as follows: RP in cotyledon leaves of flax which grew in the light was on the average +237 mV. In cotyledons of pea, decreasing values from -27 to -140 mV with further decrease were measured. As far as roots are concerned, my technique enabled only to measure in part RP in roots (particularly in cereals) because I use common metal sheet electrodes which are too rough to measure RP. However, based on experiments with root exudates, I suppose that a very high RP (more than +100 mV) is in roots under aerobic conditions. Similarly to flax, cotyledons of sunflower also exhibit high RP. The experiments with sunflower showed that IAA was translocated in the field of high RP. A high (supraoptimum) concentration of auxin which inhibits growth is assumed in axile buds. The concentration is lowered by auxin transfer in the field of high RP. By contrast, organs with low RP increase the concentration in axile buds.

4.2 Cereals The presented examples of correlations in dicotyledonous plants are completed with correlations in cereals: tillering plants show high RP in leaves in the beginning. Under these conditions, buds are formed in axils. (A precondition: again supraoptimum concentration of IAA; it decreases by its translocation in young blades with high RP). As the leaf grows up, RP goes down and causes reverse reaction, IAA is translocated to the bud that grows to a tiller (shoot). Why do cereals not branch higher on the stem: Blades on the stem show low RP relatively soon, which induces translocation of IAA in an elongation zone of the internodium with high RP, and internodia are elongated. In the case of low RP in blades during stem extension of elongating plants the bud is not formed, so it cannot be elongated in the branch. Generally, I incline to the opinion that the bud is not formed at all in cotyledon axils with low RP in pea from the beginning, but it is formed later, after increasing RP. The development of buds should be studied with regard to dynamics of changes in RP. It remains to explain a common phenomenon why plants in the glasshouse growing in the insufficient light and higher temperatures have long thin leaves, whereas plants in the field with the same number of leaves have shorter and wider leaves. Plants in the glasshouse have high RP, IAA is transferred in the upper part of blades which lengthen. In the field, RP is considerably lower, IAA is pressed in the growth part of blade bases, therefore, wider and shorter leaves are formed. In the plant physiology manuals auxin is considered to be produced in the top of coleptiles of cereals and transported basipetally. In other case it is produced in the root and stem tips. From the root tips it is transported acropetally, from the stem tips basipetally. The explanation of these differences is lacking. 54

In my opinion IAA is produced in every case in dividing cells /tissues) which have low RP (compare the reaction with triphenyltetrazolium). From these parts it is transported to tissues with higher RP, because there are RP gradients. In the tip of coleoptile there is no IAA production, only the secondary accumulation of it due to high RP It is the oldest part of the coleoptile. The dividing tissue in the case of coleoptile are on the basis of it similarly as in any leaf. Without knowledge of RP gradients it is not possible to explain the integrity of plants and related phenomena.

4.3 Other examples The explanation of correlation phenomena based on different concentration and translocation of IAA is simple and has a uniform basis, but there is a problem to verify what is the actual concentration of IAA at a certain place. This concentration depends not only on production of natural IAA in the plant at a certain place, but as well as on its translocation and reduction which could be caused by auxin oxidase. The activity of this enzyme can be different at different places and can change depending on environmental conditions and the age of organs. Therefore, I am of the opinion that the relationships between correlations and RP are necessary to study. If such measurements are not carried out, a great number of experiments aiming at experimental morphology from this new point of view are not possible to explain. However, that is a subject to explore. I would like to cite the conclusion of the 17th chapter Plant hormones and apical dominance, page 229, by Procházka (1997): „Auxin affects the polarity of cells and thus is likely to control the growth of axile buds. It is not yet known how auxin controls the cell polarity, but it can be an important precondition to understand the mechanism of apical dominance“. Considering RP, I would add that the polarity in the plant and most likely in the cell too is conditioned by a RP gradient which originates through such a basic process as respiration. A secondary process is the translocation of auxin and other growth substances with all implications for the plant integrity. In this context, I would only mention the study by Adamec, Macháčková et al. (1989). Unfortunately, I do not have any experience with lambsquarters goosefoot (Chenopodium rubrum) in relation to RP. However, generally, light decreases RP, darkness increases RP and as well as the translocation of IAA in leaves with high RP. If the authors connected electric current (cathode, i.e. a negative pole) to prepared leaves in the darkness (I suppose the leaves with high RP), anthesis was inhibited. Plants which were grown in the light (low RP in leaves), did not flower at all. Thus, the stimulation to induce flowering is reduction of an IAA level in the apex through its translocation in the field of organs (leaves) with high RP. 55

The new hypothesis will also be probably used in the field of plant allelopathy. (One plant species exudates phenolic substances from roots or other organs which inhibit terminal oxidation in another species.) It can also have an uncoupling effect when a  strange phenol is oxidized non-specifically in such a  way that reductase cannot return it back to the initial state, the phenolic substance begins to accumulate, respiration increases but without energy gain (i.e. without formation of macro-ergic bounds). The distribution of RP in plant organs can explain the morphology and ontogeny of plants (Benada, 1986). The fruits of plants with dividing cells have very low RP (Benada 1967f ). The knowledge of RP is a useful tool in cereal ecology (Benada 1973). Compatibility in pistil-pollen relationship is probably of the same principle as in host-parasite relationship.

5 Conclusions 1. The principle of resistance is the ability of the parasite to gain the energy in the host cell. 2. The parasite must use the oxido-reductase in the cell wall (plasmalemma) of the host, because there is no free oxygen in the cell plasma. The specific phenolics are the substrate for this enzyme. 3. The function of this enzyme is dependent on redox potential and pH of the host cell, mainly in the case of „strange“ (non-specific) phenolic substances of the parasite. 4. The redox potentials are generated by the respiration of the cells by the sum of activities in cell organells which produce the electrons and the activity of oxidoreductase (the terminal oxidase) in the plasmalemma. 5. The redox potential is the basis of electric gradients in the plant which plays the main role in its integrity as well as for the life of the parasite. 6. The environmental conditions influence the enzyme activity of host and parasite cells differently by which different redox potentials may appear in the host and parasite cells resulting in unspecific oxidation or reduction. Increased respiration results.

56

Fig. 1: Various forms of epidermal cell infection by powdery mildew (Benada 1970)

a) A resistant epidermal cell with a granular body. b) The granular body and the haustorium from one infection peg. c) Two infection pegs. The host cell was first resistant (granular body formation) and then susceptible (haustorium developed). d) Two neighbouring cells: one is resistant (with a granular body), the other is susceptible (with haustorium). e) Two haustoria from different conidia in a single host cell. Abbreviations: C = conidium, A = appresorium, H = haustorium, G = granular body

57

Fig. 2: Dependance of susceptibility of potato tuber to late blight (Phytophthora infestans) on redox potential

Slices of potato tuber (red variety Rosara) inoculated with late blight (Phytophthora infestans) and gradient of redox potential (RP) 1) Inner part - susceptible, RP < +100 mV 2) Outer part - resistant, RP > +100 mV 3) Surface to the depth of 5 mm removed - susceptible, RP < +100 mV 4) Surface to the depth of 3 mm removed - partly susceptible, RP approx. +100 mV 5) Only the cork layer removed – resistant.

58

Fig. 3: Model of proposed function of redox potentials carriers in the resistance.

Why redox potential plays an important role in plant resistance

59

REFERENCES Allen, P.J.: Spore germination and its regulation. In Heitefuss and Williams, 1976, pp. 51-85. Adamec, L., Macháčková I.,Krekule J. and Nováková M.: Electric current inhibits flowering in the short-day plant Chenopodium rubrum. J. Plant Physiol. 134: 43-46,1989. Benada J.: The growth of powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) on the coleoptiles and on the young leaves of barley. Phytopath. Z. 51:187-189, 1964a. Benada J.: Consideration about the resistance of barley against powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) from the point of view of oxidation-reduction potentials. - Scientific Works Cereal Res. Inst.,Kroměříž, 219-223, 1964b. Benada J.: Die Veränderungen in der Resistenz gegen Mehltau und Roste während der ontogenetischen Entwicklung der Getreidearten.- Symposium: Hostparasite relations in plant pathology, Budapest, 235-238, 1964c. Benada J.: The influence of pH of barley tissues on the symptoms caused by powdery mildew (Erysiphe graminis DC.).- Phytopath. Z. 54: 185-192, 1965. Benada J.: The gradients of oxidation-reduction potentials in cereals and the dependance of obligate parasites on redox potentials of the host tissues. - Phytopath.. Z. 55: 265-290, 1966a. Benada J.: The occurence of telia of rusts and cleistothecia of powdery mildew on cereals and an attempt to find a factor conditioning it.- Zentr. Bak., Infek., Hygiene II. Abt. 120: 427-433,1966b. Benada J.: Effect of CCC on oxidation-reduction potentials of cereals under the influence of environment. - Flora, Abt. A 157: 334-349, 1966c. Benada J.: The dependance on the pH of the host tissue for the production of uredia and telia in Uromyces pisi (Pers.) de Bary. Česká mykologie 21: 90-91, 1967a. Benada J.: Redox potential gradients in the flower. - Biol. Plantarum 9: 202-204, 1967b. Benada.:

60

The distribution of redox potentials and pH values in the leaves of cereal tillers during the stem extension. Flora Abt. A 158: 343-350, 1967c.

Benada J.: Anaerobe Beizung von Getreidesaatgut im Blickpunkt der Redoxpotentiale. Intern. Pflanzenschutzkongress Wien 1967, 155-156, 1967d. Benada J.: The effect of wilting on redox potential of cereal leaves. Biol. Plantarum 9: 447-453, 1967e. Benada J.: A study on the correlation between the expansion of plant organs and oxidation reduction potentials. - Flora Abt. A 157: 552-560, 1967f. Benada J.: The measurement of redox potential in plants and some applications on the growth and development of cereals. Flora Abt. A 159: 104-127, 1968a. Benada J.: The effect of IAA on the tropisms of Helianthus annuus L. seedlings in the relationship with redox potential gradients. Flora Abt. A 159: 367-378, 1968b. Benada J.: The germination of cereal seeds and the anaerobic treatment of them from the point of view of redox potential. Phytopath. Z. 63: 135-141, 1968c. Benada J.: Brown pathes on leaves of barley in the relationship to powdery mildew. - Phytopath. Z. 65: 288-290, 1969. Benada J.: Chlorotic spots on cereal leaves as the expression of resistance against powdery mildew. - Phytopath. Z. 67: 89-92, 1970a. Benada J.: Observation of early phases of infection by powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) - Phytopath. Z. 68: 181-187, 1970b. Benada J.: The effect of different conditions of cultivation of powdery mildew (Erysiphe graminis DC.) on the infectivity.- Phytopath. Z. 69: 273–276, 1970c. Benada J.: The testing of correlation between the biophysical states in host tissues and the susceptibility of cereals to powdery mildew (Erysiphe graminis DC.).- Phytopath. Z. 70: 127–136, 1971. Benada J.: [ The use of redox potential measurement in the study of cereal ecology.]- Rostl. Výr. 19: 815–820, 1973. [In Czech.] Benada J.: [The susceptibility and resistance of Cucumis sativa and C. pepo organs to powdery mildew Sphaerotheca fuliginea in the dependance on redox potential and pH.] Česká mykologie 28: 44–53, 1974. [In Czech.] 61

Benada J.: [ Attempt for the ellucidation of some correlations in peas and flax from the redox potentials point of view.]- Acta Univ. Agric.(Brno), Fac. Agr. 34: 69-73, 1986. [In Czech.] Benada J.: The nature of resistance of plants to obligate parasites.- Ochr. Rostl. 27: 9-14, 1991. Benada J.: Electric potentials as a factor of morphogenesis and ontogenesis of plants.- 9th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology , Brno, p. S97, 1994. Benada J.: [The measurement of redox potential in soil.] Ob. listy No.3:48-49, 1995. [In Czech.] Benada J.: Mechanism of plant resistance to obligate parasites in relation to biophysical states. Pflanzenschutzberichte 57: 37-48,1997. Benada J., Váňová M.: The growth of the roots of barley in the dependence on oxidation reduction potential, nitrogen nutrition and aeration of nutrient solution. - Biológia (Bratislava) 27: 53-61, 1972. Dostál J. :

[On plant integrity.] State Agron. Publis. House Praha 1959. [In Czech.]

Farkas G. L., Kiraly Z.: Role of phenolic compounds in the physiology of plant disease.- Phytopath. Z. 44: 105-150, 1962. Flesssa H., Fischer W.R.: Redox processes in the rhizosphaere of terestrial and marsh plants.- Zeitschrift f. Pfanzenernährung und Bodenkunde 155: 373-378, 1992. Flor H.H.: Inheritance of pathogenicity of Melampsora lini. Phytopathology 32: 653-669, 1942. Fuchs W.H.: History of physiological plant pathology. In: Heitefuss R.,Williams P.H.(eds.), 1976, pp. 1-26. Hartleb H., Heitefuss R., Hoppe H.-H.(eds.): Resistance of crops plant against fungi. Fischer Verlag Jena 1997. Heitefuss R.: 40 Jahre Forschung und Lehre im Pflanzeschutz an der GeorgAugust- Universität Göttingen, - Versuch einer Bilanz.- 48. Deutsche Pflanzenschutz-Tagung in Göttingen, Mitteil. Biol. Bundesanst. Land. Forstwirtschaft Berlin-Dahlem Heft 283: 35-46, 1992.

62

Heitefuss R., Williams P.H.,(eds.): Physiological plant pathology.- Encyclopedia of plant physiology, New series Vol. 4. Springer - Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1976. Horsfall J.G., Cowling E.D. (eds.): Plant Disease Treatise. Vol.5, How plants defend themselves. Academic Press, New York -London, 1980. Jorgensen J.H.: Three kinds of powdery mildew resistance in barley. Barley Genetics 5:583-593, 1987. Keppel H., Pieber K., Solar F: Investigations into the redox potential at planting site and into he potential difference soil/plant as a measure for general vitality. 1st information: connection between difference and vitality of fruit trees at the same planting site. Mitteil. Klosterneuburg 47, 205-210, 1997. (in German). Kosuge T.: The role of phenolics in the host response to infection.- Ann. Rev. Phytopathol. 7: 195-222, 1969. Králová M.: [ Oxidation-reduction potentials in soil.] - Rostl. Výr. 38: 39-46, 1992. [In Czech.] Macko V. et all.: Identification of the germination self-inhibitor from wheat stem rust uredospores. Science 173, 835-836, 1971. Linskens H.F., Jackson J.F.(eds.): Physical methods in plant sciences. Springer Verlag, Berlin, 1990. Newton A.C., Andrivon D.: Assumption and implications of current gene-for-gene hypothesis.- Plant Pathology 44: 607-618, 1995. Patil S.S., Ouchi S., Mills D., Vance C.(eds.): Molecular strategies of pathogens and host plants. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1991. Procházka S, Šebánek J. et al. : [Plant growth regulators.] Academia Praha 1997. [In Czech. ] Přikryl Z., Vančura V.: Root exudates of Plants. VI. Wheat root exudation as dependent of growth, concentration gradient of exudates and the presence of bacteria.- Plant and Soil 57: 69-83, 1990. Rajda V.:

Electro-diagnostics of the health of oak trees. Nat.Sci Work of Czecoslovak Acad. Sci. Brno 26, 1-44, 1992.

Rajda V.:

(Health stand of plants, trees and woods can be measured objectively by the electrodiagnostics.) Zemědělec 1996, No.33 (in Czech).

63

Rohringer R., Samborski D.J.: Aromatic compounds in the host- parasite interaction.- Ann. Rev. Phytopathol. 5: 77-86, 1967. Summere C.F. van, van Summere-de Preter D., Vining L.C., Ledingham G.A.: Coumarins and phenolic acids in the uredospores of wheat stem rust. Canad. J. Microbiol.3: 847-862, 1957. Šebánek J. et al. : [Plant physiology.] State Agron. Publish. House Praha 1983. [In Czech.] Tapke V.F.: Further studies on barley mildew as influenced by environment. Phytopathology 43: 162-166, 1953. Vanderplank J.E.: Host-pathogen Interaction in Plant Disease. Academic Press, New York-London, 1982. Vaughan D., Ord B.G.: Extraction of potential allelochemicals and their effects on root morphology and nutrient content. Plant root growth: an ecological perspective. British Ecol. Soc. Special Publication No 10: 399-421, 1991. Blackwell Sci. Publ. Vizárová G., Janitor A.: Contribution to the physiological study on the effect of the substance isolated from conidia of the fungus Erysiphe graminis f.sp. hordei Marchal.- Phytopath. Z. 62: 311-318, 1968.

64