1. ÚVOD A PROBLEMATIKA

1. ÚVOD A PROBLEMATIKA

1.1. CYTOCHROMY P450 Cytochromy P450 (CYP) jsou biotransformační enzymy odpovědné za detoxikaci a eliminaci organických cizorodých látek (xenobiotik). Jsou zahrnuty v oxidativním metabolismu endogenních i exogenních molekul. Mezi endogenní substráty patří steroidy, mastné kyseliny, prostaglandiny, leukotrieny a biogenní aminy. Exogenní substráty zahrnují rostlinné toxiny, léčiva a karcinogeny. Enzymy CYP provádějí redukci, C-, N-, Shydroxylaci,

dealkylaci,

dehalogenaci

a

deaminaci

molekul

substrátů

(více

na

https://www.zdravcentra.cz/cps/rde/xchg/zc/xsl/3141_1447.html). Účastní se první fáze metabolismu a eliminace endogenních a exogenních molekul a přijatých látek. Oxidací přeměňují tyto látky na elektrofilní meziprodukty, které jsou dále enzymy druhé fáze konjugovány na hydrofilní deriváty vylučované močí (OMIM 124030).

1.1.1. Cytochrom P450 2D6 Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6), tzv. debrisoquin 4-hydroxyláza, patří mezi nejvíce studované biotransformační enzymy. Je zahrnut v metabolismu asi 100 léčiv. Jedná se o některá antidepresiva, neuroleptika, beta blokátory, antiarytmika a další (Caraco, 2004). Aktivita enzymu se mezi jednotlivci liší. Populaci proto můžeme rozdělit do 4 hlavních skupin – pomalí metabolizátoři (PM), intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři (EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM). PM nemají žádnou enzymovou aktivitu, IM sníženou, EM normální a UM mají extrémně zvýšenou enzymovou aktivitu. Frekvence jednotlivých fenotypů v kavkazské populaci je následující: UM 3-5%, EM 7080%, IM 10-15%, PM 7-10% (Denson aj., 2005).

1.1.1.1. Genetický polymorfismus CYP2D6 Rozdílná metabolická aktivita enzymu mezi jedinci je dána polymorfismem genu CYP2D6. Doposud bylo popsáno více než 100 alel. Jejich kompletní seznam je volně přístupný na adrese http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm. Systematická nomenklatura byla zavedena v r. 1996. Alely, které sdílejí stejnou klíčovou mutaci, tj. sekvenční změnu s významným funkčním efektem nebo sekvenční změnu vedoucí ke změně aminokyseliny, se označují stejným číslem (např. *6). Písmeny jsou 1

rozlišeny další varianty alel, které mají stejnou klíčovou mutaci, ale různé doplňkové sekvenční změny s minoritním funkčním významem (např. *6A, *6B, *6C, *6D). U běžných alel je znám jejich vliv na fenotyp, který byl stanoven na základě korelace fenotypu s genotypem při studiích in vivo, při studiích vzorků z lidských jater nebo pomocí rekombinantního expresního systému (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). CYP2D6*1 je alela se standardní sekvencí genu, tzv. wild type (wt). Stejně jako některé další alely (*2, *33, *35) kóduje protein s normální enzymatickou funkcí, zatímco jiné alely kódují enzym buď s redukovanou aktivitou, neaktivní enzym nebo dokonce může výsledný produkt úplně chybět (Juřica, 2004). Přestože existuje velké množství alel, většina z nich se v lidské populaci vyskytuje vzácně. Nejčastější jsou alely *1, *2, *4, *5, *10, *17 a *41 (Ingelman-Sundberg, 2005). Gen CYP2D6 vykazuje značnou interetnickou variabilitu. Frekvence jednotlivých alel se mezi populacemi liší, existují dokonce alely typické jen pro určité populace (Bertilsson aj., 2002). Například CYP2D6*17 se prakticky vůbec nevyskytuje u bělochů a Asiatů, zato v Africe její frekvence dosahuje až 35% (Ingelman-Sundberg, 2005).

1.1.1.1.1. Nulové alely Souhrnně jsou označovány jako CYP2D6*0. Kódují nefunkční protein. V homozygotním stavu způsobují fenotyp pomalého metabolizátora (fenotyp PM se tedy dědí jako autozomálně recesivní znak). Je známo několik mechanismů, které vedou ke ztrátě funkce proteinu: -

bodové mutace (substituce, delece, inzerce), které narušují čtecí rámec, zasahují do správného sestřihu nebo vedou k předčasné terminaci translace (např. alely *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44).

-

velké chromozomové delece (alely *5, *13, *16).

-

mutace vedoucí ke ztrátě funkce proteinu přičemž jeho délka zůstává zachována (např. alely *7, *12, *14, *18) (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004).

V kavkazské populaci je nejčastější nulovou alelou *4 s frekvencí 12-21%. U Asiatů se vyskytuje s frekvencí 1% a v Africe s frekvencí 1-4% (Ingelman-Sundberg, 2005). Klíčovou mutací je zde 1846G>A. Tato tranzice změní konsensuální akceptorové místo GA na 3´ konci intronu 3. Následkem je nesprávný sestřih, mRNA s pozměněným čtecím rámcem a předčasná terminace translace (Kagimoto aj., 1990; Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004).

2

Alela *5 se ve všech populacích vyskytuje s frekvencí 2-7% (Ingelman-Sundberg, 2005). Je dána rozsáhlou delecí (asi 17,5 kb) v lokusu CYP2D, kdy dojde ke ztrátě celého genu CYP2D6 (Jong aj., 2005) (obr. 1).

Obr. 1: Restrikční mapa lokusu CYP2D s delecí genu CYP2D6. B = BamHI; E = EcoRI; K = KpnI (podle Gaedigk aj., 1991). Alely *13 a *16 jsou 5´-CYP2D7P/CYP2D6-3´ hybridní geny, které vzniknou delecí různých částí lokusu CYP2D. Alela *13 je hybrid CYP2D7P(exon 1)/CYP2D6(exony 2-9) (Panserat aj., 1995). Alela *16 je hybrid CYP2D7P(exony 1-7)/CYP2D6(exony 8-9) (Daly aj., 1996). Obě alely se vyskytují vzácně.

1.1.1.1.2. Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí Tyto alely kódují enzym s redukovanou aktivitou. V homozygotním stavu nebo spolu s nulovou alelou v heterozygotním stavu způsobují fenotyp IM. Patří sem např. CYP2D6*9, *10, *17, *36, *41 (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). Nejběžnější alelou u Asiatů je *10 s frekvencí 50-70%. V kavkazské populaci se vyskytuje s frekvencí 1-5% a u Afričanů s frekvencí 3-9%. Klíčovou mutací je 100C>T, která vede k záměně prolinu v poloze 34 za serin. Tato mutace naruší důležité místo ve struktuře proteinu, které je nezbytné pro jeho sbalení. Enzym je proto velmi nestabilní a má sníženou afinitu k substrátu (Ingelman-Sundberg, 2005; Ji aj., 2002; Zhuge, Yu a Wu, 2004). Mutace 100C>T se vyskytuje i v jiných alelách jako doplňková mutace.

1.1.1.1.3. Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí Molekulární podstatou vysokých hladin proteinu je zvýšený počet aktivních genových kopií. Zmnoženy bývají alely *1, *35, ale nejčastěji je to *2 (Steijns a Weide, 1998; Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). Frekvence genové duplikace je v kavkazské populaci 1-5%, v Asii 0-2% a v některých oblastech Afriky dokonce 10-16% (Ingelman-Sundberg, 2005).

3

Vznik duplikace je spojen se vznikem delece. Následkem homologní nepravidelné rekombinace je vznik alely s duplikací CYP2D6 a alely s delecí CYP2D6 (obr. 2). V dalších generacích se duplikované a deletované alely dědí samostatně (Ledesma a Agúndez, 2005).

Obr. 2: Mechanismus vzniku alel s duplikací a delecí genu CYP2D6. Při nerovnoměrném homologním crossing-overu se uplatňují 2,8 kb dlouhé přímé repetice (podle Løvlie aj., 1996).

1.1.1.2. Klinické důsledky polymorfismu CYP2D6 Variabilita v aktivitě CYP2D6 vede k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv. PM nejsou schopni metabolizovat substráty CYP2D6, a proto při běžně podávané dávce mají ve srovnání s EM vyšší koncentrace léku v plasmě. To má za následek zvýšené riziko předávkování a výskytu vedlejších efektů. Na druhé straně, u UM je koncentrace léku v plasmě mnohem nižší než je terapeuticky účinná koncentrace, a proto u nich nedochází k žádné terapeutické odpovědi (obr. 3). Léčivo nemusí být vždy přijaté jako aktivní sloučenina, ale také jako tzv. prekurzor léku, který vyžaduje metabolickou aktivaci. Typickým příkladem je kodein. PM nejsou schopni aktivovat tato léčiva a naopak u UM dochází k extrémní aktivaci těchto léčiv. Individuální rozdíly v metabolismu léčiv mohou být částečně kompenzovány úpravou dávky léku. Výběr léku a dávkování by mělo být individuální a mělo by pomoci vyvarovat se nežádoucím reakcím nebo terapeutickému selhání. Nicméně, klinický význam polymorfismu pro konkrétní léky není vždy jasný a závisí na několika faktorech. Enzym nemusí vždy metabolizovat veškeré množství léku. Pokud metabolismus zprostředkovaný polymorfním enzymem hraje pouze minoritní roli v celkové eliminace léku nebo pokud existuje alternativní metabolická cesta, efekt polymorfismu je zanedbatelný. Problematické jsou léky s nízkým terapeutickým rozsahem. Na základě všech

4

těchto kritérií je polymorfismus CYP2D6 velmi důležitý u tricyklických antidepresiv, některých antipsychotik a kardiovaskulárních léčiv (Weide a Steijns, 1999).

Obr. 3: Vztah genotyp – fenotyp, farmakokinetika a klinické důsledky. Nulové alely jsou vyjádřeny prázdnými boxy, normální alely černými boxy a alely se sníženou funkcí šrafovanými boxy. Alela bez boxu představuje genovou deleci. Grafy znázorňují koncentraci léku v plazmě v závislosti na čase. Šedými boxy je v grafu znázorněna koncentrace léku odpovídající optimální terapeutické odpověďi (podle Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004).

1.1.1.3. Struktura lokusu CYP2D Lokus CYP2D o délce asi 45 kb se u člověka nachází na dlouhém raménku chromozomu 22. Skládá se ze tří homologních genů - CYP2D8P, CYP2D7P (GenBank; accession number M33387) a CYP2D6 (GenBank; accession number M33388), uspořádaných v tandemu. CYP2D8P je pravý pseudogen. Jeho exony obsahují mnoho delecí a inzercí a terminační kodony. Nemá otevřený čtecí rámec (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004; Panserat aj., 1995). Pseudogen CYP2D7P je velmi podobný genu CYP2D6, sekvenční homologie je 97% (Kagimoto aj., 1990). Leží mezi CYP2D8P a CYP2D6 (obr. 1). Jeho kódující sekvence obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, inzerci T138 v prvním exonu, která mění čtecí rámec a má za následek předčasnou terminaci translace (Panserat aj., 1995). Bylo zaznamenáno více variant pseudogenů, lze je dále rozlišovat na CYP2D7P1, CYP2D7P2, CYP2D8P1 a CYP2D8P2 (Denson aj., 2005). Gen CYP2D6 byl poprvé izolován v r. 1988 z lidské cDNA knihovny pomocí krysích protilátek a následně somatickou hybridizací lokalizován na chromozom 22. Přesná poloha na 5

chromozomu 22q13.1 byla určena v r. 1993 metodami somatické hybridizace, in situ hybridizace a vazebné analýzy (OMIM 124030). Gen CYP2D6 se, stejně jako ostatní členové CYP2D lokusu, skládá z 9 exonů a 8 intronů. Je dlouhý 4 378 bp (Kimura aj., 1989), mRNA má 1655 bp (více na http://www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas/fiche.php?n=11073). Gen CYP2D6 je lemován dvěma dlouhými přímými repeticemi délky 2,8 kb (CYPREP). CYP-REP obsahuje Alu-element a tandemově uspořádanou 10 bp dlouhou přímou repetici, tj. sekvence, které se mohou uplatnit při homologní rekombinaci (Løvlie aj., 1996). V lokusu CYP2D byla také pozorována genová konverze, a to mezi CYP2D7P a CYP2D6 a mezi CYP2D8P a CYP2D7P (Kagimoto aj., 1990).

1.1.1.4. Protein CYP2D6 Protein CYP2D6 je složený ze 497 aminokyselin. Patří do skupiny enzymů obsahujících železo. Trojrozměrná struktura byla odhalena v r. 2006 (Rowland aj.). Substráty pro CYP2D6 jsou lipofilní báze s protonovaným atomem dusíku a s planární strukturou. Ve vzdálenosti 5 až 7 Å od dusíku dochází k hydroxylaci. Experimenty prováděné místně řízenou mutagenezí ukázaly, že za vazbu dusíku je zodpovědný negativně nabitý asparagin v poloze 301 (Ingelman-Sundberg, 2005; Rathbone aj., 2005; Rowland aj.,2006). CYP2D6 je exprimován v mozku, v plicích, v prsní tkáni, v močovém měchýři, v enterocytech, nejvíce však v jaterních hepatocytech, kde se uplatňuje při metabolismu přijatých sloučenin. Exprese CYP2D6 není regulována žádným environmentálním faktorem, není ani indukována žádným hormonem. Inhibice enzymu možná je. Mnoho léků, které slouží jako substráty pro CYP2D6, ale i léky, které nejsou metabolizovány CYP2D6, jsou jeho možnými kompetitivními inhibitory. Může dojít k interakci mezi léčivy a ke kompletní blokádě metabolismu některého léku. In vivo pak pozorujeme změnu fenotopu, např. z EM na PM. Tento jev se označuje jako fenokopie a byl pozorován u léčiv jako jsou quinidin, flecainidin, paroxetin, fluoxetin nebo fluvoxamin. Fenokopie představují velký problém hlavně v psychiatrii, protože mnoho antidepresiv a antipsychotik jsou zároveň možnými inhibitory CYP2D6 (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004).

1.2. STANOVENÍ FENOTYPU IN VIVO Metabolické schopnosti jedince se in vivo zjišťují po podání testovací látky na základě tzv. metabolického poměru (MR). Jako testovací látky se používají substráty pro CYP2D6, nejčastěji je to dextrometorfan (tzv. dextrometorfanový test). MR je definován jako poměr 6

koncentrace podaného léku (dextrometorfan) ke koncentraci jeho metabolitů (dextrorfan), které se objeví v moči během určité doby od podání testovací látky. Koncentrace obou látek se stanovují pomocí chromatografických metod. Zjištěný MR přiřadí testovaným osobám typ metabolismu (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004; Chou aj., 2003).

1.3. MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DETEKCE ALEL CYP2D6 Defektní alely byly zpočátku identifikovány metodou analýzy délky restrikčních fragmentů (RFLP) s následným Southernovým přenosem. Skoda aj. (1988) testovali DNA PM a EM. Nalezli asociaci některých restrikčních fragmentů s fenotypem PM. Změny byly následně stanoveny na sekvenční úrovni (Nobumitsu, 1990). Kagimoto aj. (1990) některé mutantní alely klonovali a sekvencovali a pomocí exprese chimerických genů studovali funkční význam jednotlivých mutací. RFLP využili i další autoři, někteří analýzu dále upravili na PCR-RFLP a rozšířili ji na více alel (Sachse aj., 1997). Broly aj. (1995) vyvinuli vyhledávací metodu jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP), pomocí které mohly být nalezeny známé i neznámé mutace v genu CYP2D6. Testováním této metody ve velké populaci objevili Marez aj. (1997) několik nových polymorfismů. K rychlé identifikaci sekvenčních změn zavedli Daly aj. (1995) alelově specifickou polymerázovou řetězovou reakci (AS-PCR) s použitím primerů tvořících na 3´ konci mismatch. Hersberger aj. (2000) tuto metodu dále upravili na tetra-primer PCR assay. Nejdříve je specificky amplifikován gen CYP2D6, který slouží jako templát pro následnou AS-PCR. Obě reakce probíhají v jediné zkumavce. Výhodou této metody je minimální riziko kontaminace, falešně negativní výsledky jsou vyloučeny díky amplifikaci genu CYP2D6, který slouží i jako kontrolní fragment. Syntéza dlouhých úseků (long-PCR) se využila pro amplifikaci celého genu CYP2D6 (Sachse aj., 1997) a pro detekci strukturních přestaveb jako jsou delece (Daly a Steward, 1995), duplikace (Løvlie aj., 1996) a hybridní geny (Panserat aj., 1995; Daly aj., 1996). Mezi moderní metody DNA diagnostiky patří PCR v reálném čase. Stamer aj. (2002) využili PCR v reálném čase s následnou analýzou bodu tání fluorescenčně značených sond pro detekci pěti nulových alel (*3, *4, *6, *7 a *8). Ve své práci se také zaměřili na srovnání této metody s AS-PCR. PCR v reálném čase je rychlejší, nevyžaduje další procedury jako např. gelovou elektroforézu, odpadá práce s toxickými činidly (ethidium-bromid, akrylamid), riziko kontaminace vzorků je minimální. Nevýhodou je vyšší cena reagencií a potřeba nalézt

7

optimální podmínky reakcí pro jednotlivé sekvenční změny. AS-PCR vždy neposkytuje jasné výsledky, na gelu se někdy vyskytuje více nežádoucích produktů. Jako kvantitativní metodu využili Bodin, Beaune a Loriot (2005) PCR v reálném čase s TaqMan sondami. Jako referenční použili gen pro ribonukleázu P, který amplifikovali společně s genem CYP2D6. Na základě relativního poměru těchto dvou produktů stanovili počet kopií genu CYP2D6. James aj. (2004) využili k detekci alel CYP2D6 přímé sekvencování. Nejdříve ve dvou reakcích syntetizovali 2 úseky zahrnující exony 3-6 a tyto úseky následně sekvencovali. Hlavní výhody jsou podle autorů zachycení všech sekvenčních změn ve vybraných úsecích, jednoduchost, spolehlivost a snadná interpretace. Sekvencování je považováno za referenční metodu, která nevyžaduje kontrolní materiál a je vhodná pro analýzu jednoho ale i několika vzorků. Sistonen aj. (2005) navrhli nový způsob detekce mutací genu CYP2D6 založené na kombinaci PCR a mnohonásobné extenze primerů s fluorescentně značenými ddNTP (SNaPshot™; Applied Biosystems). Metoda je přesná, rychlá a snadná na provedení. Výhodou je detekce několika mutací současně v jediné reakci a dále možnost zvyšování počtu detekovaných mutací. V roce 2004 byl na evropský trh uveden testovací přístroj AmpliChip CYP450 (obr. 4). Jedná se o první farmakogenetický čip na světě určený pro využití v běžné lékařské praxi. Byl vytvořen ve spolupráci Roche a Affymetrix. Čip umožňuje detekci 29 známých polymorfismů genu CYP2D6, včetně genové duplikace a genové delece, a dvou hlavních polymorfismů genu CYP2C19. Výsledkem analýzy je počítačově zpracovaný protokol s předpokládaným fenotypem pacienta (více na http://www.roche-diagnostics.cz/pages/mol/amplichip.asp). Heller aj. (2006) porovnali výsledky analýzy pomocí AmpliChip CYP450 s jinými metodami. Zjistili, že analýza pomocí čipu je rychlá a spolehlivá. Nevýhodou čipu je však jeho vysoká cena.

8

obr. 4: Struktura čipu (http://www.rochediagnostics.cz/download/press/sada_amplichip/amplichip_technologie.pdf)

1.4. OBLASTI VYUŽITÍ 1.4.1. Léčba rakoviny N-desmethyltamoxifen je hlavní primární metabolit tamoxifenu, využívaného při léčbě rakoviny prsu. Reakcí zprostředkovanou CYP2D6 je dále hydroxylován na endoxifen, který má značnou antiestrogenní aktivitu. Koncentrace endoxifenu v plasmě je výrazně nižší u PM ve srovnání s EM a také u EM, kteří užívají léky inhibující aktivitu CYP2D6. CYP2D6 metabolismus a jeho inhibitoři tedy ovlivňují výsledek léčby u žen užívajících tamoxifen v časných stádiích rakoviny prsu (Borges aj., 2006; Goetz aj., 2007). Také působení některých antiemetik je závislé na CYP2D6 genotypu. Žádný léčebný efekt nebyl pozorován u pacientů nesoucích více aktivních kopií genu (Ingelman-Sundberg, 2005).

1.4.2. Psychiatrie Metabolismus asi 50% běžně užívaných antipsychotik je závislý na CYP2D6 genotypu. Počet nepříznivých efektů je vyšší u PM než u EM. Při užívání antipsychotik se objevují vedlejší efekty spojené s kardiovaskulárním systémem, např. arytmie nebo prodloužení QT intervalu. U PM jsou tudíž větší náklady na léčbu a doba trvání léčby je také delší (Dorado aj., 2006; Ingelman-Sundberg, 2005).

9

Při léčbě schizofrenie byla pozorována závislost sedativního účinku léků na genotypech pacientů. Ukázalo se, že odbourávání haloperidolu je spojeno s počtem aktivních genových kopií (Ingelman-Sundberg, 2005). Vztah PM a pseudoparkinsonismu byl vyšetřován v několika studiích. Riziko vzniku parkinsonismu jako vedlejšího efektu při léčbě antipsychotiky je u PM vyšší než u EM (Ingelman-Sundberg, 2005). Asi polovina antidepresiv je metabolizována prostřednictvím CYP2D6. U PM bývají vlivem předávkování pozorovány vedlejší efekty. Častým problémem při léčbě antidepresivy jsou pacienti nereagující na léčbu. Nedostatek odpovědi je typickým jevem UM (IngelmanSundberg, 2005).

1.4.3. Kardiovaskulární onemocnění Monohydroxylace perhexilinu, léku na anginu pectoris, je zprostředkována CYP2D6 s aktivitou 100x nižší u PM než u EM. Perhexilin způsobuje v závislosti na jeho koncentraci v plasmě hepatotoxicitu a periferní neuropatii. Na základě znalosti genotypu lze pacientům stanovit optimální dávky a vyloučit tak riziko toxicity (Ingelman-Sundberg, 2005). Metoprolol patří do skupiny beta blokátorů metabolizovaných CYP2D6. U skupiny pacientů, kterým byl podáván tento lék a objevily se u nich závažné vedlejší efekty, byl při retrospektivní studii stanoven genotyp. U těchto pacientů se ukázala 5x vyšší frekvence PM ve srovnání s kontrolní skupinou (Ingelman-Sundberg, 2005). Ismail a Teh (2006) studovali význam CYP2D6 polymorfismu při dlouhodobém užívání metoprololu u pacientů s onemocněním kardiovaskulárního systému. Koncentrace léku v plasmě se mezi pacienty výrazně lišila, nejvyšší byla u PM. Autoři uvádějí, že znalost genotypu je obzvlášť důležitá pro počáteční dávkování. Pro další sledování průběhu léčby je možné využít MR.

1.4.4. Rekreační drogy MDMA (3,4-methylendioxymethamphetamin, extáze) je prostřednictvím CYP2D6 demetylován na HHMA (3,4-dihydroxymethamphetamin). HHMA způsobuje neurotoxicitu v CNS. Torre aj. (2005) srovnali metabolismus MDMA u PM a EM. Farmakokinetika MDMA a HHMA se liší podle genotypů a má vliv na rozvoj akutní a dlouhodobé toxicity.

10

1.4.5. Molekulární epidemiologie CYP2D6 genotyp bývá vyšetřován s ohledem na riziko vzniku rakoviny a různých onemocnění. PM jsou delší dobu vystaveni toxickým efektům přijatých sloučenin než EM. Předpokládá se, že jsou proto náchylnější ke vzniku rakoviny. Naopak při metabolické aktivaci prokarcinogenů jsou většímu riziku vystaveni EM a UM. Jong aj. (2005) vyšetřovali polymorfismy několika genů ve vztahu s rakovinou prsu. Pro CYP2D6 nalezli u PM vyšší riziko vzniku rakoviny prsu. U EM byla také nalezena vyšší incidence rakoviny plic, jater a močového měchýře (Lavandera aj., 2006). Někteří autoři předpokládají vliv CYP2D6 na vzniku Parkinsonovy nemoci. Bialecka aj. (2007) však při asociační studii Parkinsonovy nemoci a polymorfismů 4 kandidátních genů tuto hypotézu nepotrvrdili. Lavandera aj. (2006) se zabývali CYP2D6 polymorfismem u pacientů s porfyrií, dědičnou poruchou metabolismu porfyrinu. Při testování alel *3 a *4 se ukázalo, že mohou být spojeny se vznikem nemoci.

Genotyp CYP2D6 se ukázal být dobrým prediktorem metabolických schopností jedinců, a je proto spojen s vedením farmakoterapie či s odhadováním kancerogeneze. Znalost genotypu CYP2D6 může vysvětlit individuální metabolické rozdíly a předejít terapeutickému selhání.

Genetický

polymorfismus

CYP2D6

je

proto

středem

zájmu

mnohých

farmakogenetiků a jeho znalost směřuje k individualizované medicíně.

11

2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE

Cílem diplomové práce bylo zavedení vyšetření alel CYP2D6 pomocí přímého sekvencování a long PCR u pacientů s depresivními a úzkostnými poruchami (ve spolupráci s LF MU Brno a Psychiatrickou klinikou FN Brno) s následnou možností porovnání výsledků získaných dextrometorfanovým testem a molekulárně genetickou detekcí. Molekulárně genetická detekce alel CYP2D6 bude mít do budoucna velký význam pro úpravu dávek aplikovaných léčiv u pacientů.

Úspěšné zpracování diplomové práce předpokládá: -

umět pracovat s dostupnými zahraničními literárními údaji k danému tématu.

-

zvládnout molekulárně genetické metody, potřebné pro uvedenou diagnostiku.

-

na základě nalezených sekvenčních změn v jednotlivých exonech genu a na základě nalezených strukturních variant genu CYP2D6 přiřadit správně popsané alely a stanovit genotyp pacienta.

-

správně interpretovat získané výsledky.

12

3. MATERIÁL A METODY

3.1. PŘÍSTROJE Automatické sekvenátory: ABI PRISM 310 ABI PRISM 3100 Centrifugy: Eppendorf mini Spin plus Eppendorf 5410 Jouan MR 22i Heraus SEPATECH Varifuge 20RS Mikrocentrifuga MiroGene Labnet International, Inc.Minicentrifuge C-1200 Elektroforetické aparatury: Hoefer Scientific Instrument Scie-Plas Spektrofotometr: UV/VIS Perkin Elmer Lambda Bio Termocyklery: Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400 Techne Touchgene Gradient Techne Termocycler Flexigene Tc-412 GeneAmp PCR System 9700 PTC-220 DNA Engine Dyad Peltier Thermal cycler Termostat: BT-120 EKOM Třepačky: Eppendorf Thermomixer Comfort 5355 Vortex MiroGene Heidolph Microshaker ML-1

3.2. BIOLOGICKÝ MATERIÁL Jako biologický materiál byla použita periferní krev 66 pacientů s depresivními a úzkostnými poruchami. Pacienti byli léčeni antidepresivy, která jsou metabolizována CYP2D6. Koncentrace izolované DNA se pohybovala v rozmezí 0,1-0,6 µg/µl (množství max. 800 µl). DNA pacienta s genotypem *1/*16 (koncentrace 1 µg/µl, množství 10 µl) jsem získala na základě korespondence s A. K. Daly (Department of Pharmacological Sciences, University of Newcastle). Veškerá DNA se uchovávala při 4 °C.

13

3.3. METODY 3.3.1. Izolace DNA DNA byla izolována z lymfocytů periferní krve. A. Lyze erytrocytů a odstranění hemoglobinu 1. 10 ml krve + 0,3 ml 0,5 M EDTA protřepat a ředit sterilní vodou (1:1) 2. inkubovat při –20°C přes noc 3. pomalu rozmrazit při pokojové teplotě 4. centrifugace 10 000 g, 5 min, 4 °C 5. odstranit supernatant a přidat 1 – 2 objemy sterilní destilované vody, řádně protřepat 6. centrifugace 10 000 g, 5 min, 4 °C 7. odstranit supernatant a přidat 1 objem fyziologického roztoku, řádně protřepat 8. centrifugace 10 000 g, 5 min, 4 °C B. Lyze leukocytů 9. odstranit supernatant 10. sediment rozpustit v 0,5 ml fyziologického roztoku 11. přidat 3 ml roztoku Fasano A a 5 µl proteinázy K (Serva, 20 mg/ml) 12. protřepat a inkubovat při 50 °C přes noc C. Deproteinace DNA 13. buněčný lyzát temperovat při pokojové teplotě 14. přidat 1,4 ml 5 M NaCl a promíchat 15. přidat 1 objem chloroformu (LACHEMA), promíchávat 30 min 16. centrifugace 10 000 g, 10 min, 10 °C D. Srážení DNA 17. horní vodnou fázi odebrat do čisté zkumavky 18. přidat 1 objem izopropylalkoholu (LACHEMA), promíchávat 60-90 min 19. vysráženou DNA přenést do čisté zkumavky, přidat 1 ml vychlazeného 70% etanolu a 10 min promíchávat 20. krátce centrifugovat 21. odstranit supernatant, přidat 1 ml 96% etanolu 22. vysušit DNA 23. DNA rozpustit ve 100-800 µl 10 mM TE pufru (pH 7,8) Po izolaci se spektrofotometricky stanoví koncentrace DNA. Hodnota A260 = 1, měřená v 1 cm kyvetě, odpovídá koncentraci DNA 50 µg/ml.

14

Použité roztoky: 0,5 M EDTA, pH 8,0: EDTA Na2.2H2O (LACHEMA) .......................186,1 g NaOH (LACHEMA) .............................................20 g destilovanou vodou doplnit do ........................1000 ml

Roztok Fasano A: 5 M NaCl (LACHEMA)........................................4 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (LACHEMA)......................4 ml 1 M Tris, pH 7,8 (MERCK) ..................................4 ml 20% SDS (SERVA)............................................2,5 ml destilovaná voda ...............................................85,5 ml

Fyziologický roztok: NaCl (LACHEMA) ............................................4,38 g destilovanou vodou doplnit do ..........................500 ml

TE pufr: 0,5 M EDTA (LACHEMA) ...............................0,4 ml 1 M Tris, pH 7,6 (MERCK) ...............................2,0 ml destilovaná voda .............................................197,6 ml

3.3.2. PCR 3.3.2.1. Primery Primery jsem navrhla pomocí programu Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) nebo jsem je převzala od jiných autorů (tab. 1).

15

Tab. 1: Primery použité pro detekci alel CYP2D6 Primer

Sekvence primeru (5′→3′)

P1

CGT GAC AGC TTT GAG GCT CA

Panserat aj., 1995

P2

CCC GGG TCC CAC GGA AAT CT

Panserat aj., 1995

71F

TCC GAC CAG GCC TTT CTA CCA C

Daly aj., 1996

IN6-7

TGG GGC CCA AGG CAG GGA CT

Daly aj., 1996

JM3

TGC TCA GCC TCA ACG TAC CCC

Daly aj., 1996

9F

GGA GTC TTG CAG GGG TAT CA

Primer3

9R

GGA CCC GAG TTG GAA CTA CC

Primer3

8F

GAG GCC GTC TGG GAG AAG

Primer3

9R-new

CCT CAA CGT ACC CCT GTC TC

Primer3

1F

GCA CAG TCA ACA CAG CAG GT

Primer3

1R

TTC TGG TAG GGG AGC CTC AG

Primer3

2D7-1R

TGG TGG TGG GGC ATC CTC AG

Primer3

2D7/2D6-1R

ATG GCT GCC TCA CTA CCA AC

Primer3

207F

CCC TCA GCC TCG TCA CCT

Løvlie aj., 1996

17F

TCC CCC ACT GCA CCA ACT CT

Løvlie aj., 1996

32R

CAC GTC CAG GGC ACC TAG AT

Løvlie aj., 1996

13F

ACC GGG CAC CTG TAC TCC TCA

Daly a Steward, 1995

24R

GCA TGA GCT AAG GCA CCC AGA C

Daly a Steward, 1995

1A

TGC TAA CTG AGC ACA GGA TG

Daly aj., 1995

4A

CCA AAG CGC TGC ACC TCA TG

Daly aj., 1995

1C

CTGGAATCCGGTGTCGAAGT

Daly aj., 1995

2G

CTCGGTCTCTCGCTCCGCAC

Daly aj., 1995

7R

TAC CTT AGG GAT GCG GAA GC

Primer3

CYP2D6-F

CCA GAA GGC TTT GCA GGC TTC A

Sistonen aj., 2005

CYP2D6-R

ACT GAG CCC TGG GAG GTA GGT A

Sistonen aj., 2005

2R

GTC CCA CGG AAA TCT GTC TC

Primer3

3.3.2.2. Zásobní roztoky Zde uvádím pouze koncentrace zásobních roztoků použitých kitů. Výsledné složení reakčních směsí, které bylo třeba optimalizovat, bude popsáno v kapitole Výsledky.

16

AmpliTaq Gold® PCR Kit (Applied Biosystems) AmpliTaq Gold DNA polymeráza (5 U/µl) 10x PCR Gold pufr bez MgCl2 10 mM směs dNTP (2,5 mM každý dNTP) 25 mM MgCl2

DyNAzyme™ EXT PCR Kit (Finnzymes) DyNAzyme™ EXT DNA polymeráza (1 U/µl) 10x EXT pufr s 15 mM MgCl2 10x EXT pufr bez MgCl2 50 mM MgCl2 100% DMSO

Expand Long Template PCR Kit (Roche) Expand Long Template Enzyme mix (Taq a Tgo DNA polymeráza, 5 U/µl) 10x pufr 1 se 17,5 mM MgCl2 (pro délky 0,5 – 9 kb) 100 mM dATP, 100 mM dCTP, 100 mM dGTP, 100 mM dTTP (Roche)

GeneAmp® XL PCR Kit (Applied Biosystems) rTth DNA polymeráza, XL (2 U/µl) 3.3x XL pufr II 25 mM Mg(OAc)2 GeneAmp 10 mM směs dNTP (2,5 mM každý dNTP) Kontrolní DNA fága λ (0,1 µg/100 µl) Primer SC1011 (5´→3´GCTGAAGTGGTGGAAACCGC) (1,25 nmol/50 µl) Primer SC1002 (5´→3´GCCTCGCATATCAGGAAGCAC) (1,25 nmol/50 µl)

HotStarTaq PCR Kit (Qiagen) HotStarTaq Master Mix (2x koncentrovaný) obsahuje –

HotStarTaq DNA polymerázu (5 U/µl)

– pufr s 3 mM MgCl2 –

400 µM každý dNTP

25 mM MgCl2

17

Taq PCR Kit (Fermentas) Taq DNA polymeráza (5 U/µl) 10x Taq pufr s KCl 25 mM MgCl2 10 mM směs dNTP (2,5 mM každý dNTP)

3.3.2.3. PCR exonů 1, 3+4 a 5+6+7 Primery: 1F, 1R .....................................exon 1 (1. PCR) 1C, 2G...............................exony 3+4 (2. PCR) 1A, 4A ......................... exony 5+6+7 (3. PCR) Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x

95 ºC 15 min

40x

95 ºC 1 min

1x

72 ºC 7 min

55 ºC 1 min

72 °C 1 min

……… exony 3+4 a 5+6+7 1x

95 ºC 15 min

30x

95 ºC 1 min

1x

72 ºC 7 min

60 ºC 1 min

72 °C 1 min 30 s

……… exon 1

3.3.2.4. Detekce alely *13 Primery: P1, P2 Syntéza: Taq PCR (Fermentas) Složení reakční směsi: 0,5 U Taq DNA polymerázy 1x Taq pufr s KCl 2,5 mM MgCl2 0,125 mM každý dNTP 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomické DNA Celkový objem: 25 µl 18

Program: 1x

94 ºC 5 min

30x

94 ºC 30 s

1x

72 ºC 7 min

58 ºC 30 s

72 °C 2 min

3.3.2.5. PCR genu TACI Primery: 3A (5´→3´ TGG TCA AAC CCA GAG TTC CTG CTA GT) 3B (5´→3´ TCC CAC GCT TTC TCA CCC TGC) Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x

95 ºC 15 min

35x

95 ºC 30 s

1x

72 ºC 7 min

60 ºC 30 s

72 °C 1 min

3.3.3. Štěpení restrikčními enzymy 3.3.3.1. Štěpení NcoI NcoI (Takara)

8U

10x pufr K

2 µl

0,1 % BSA

1 µl

H2O

1 µl

DNA

15 µl

Celkový objem.............. 20 µl Štěpení při 37 °C, přes noc.

3.3.3.2. Štěpení BamHI BamHI (BioLabs)

12 U

10x pufr pro BamHI

2 µl

H2O

2 µl

DNA

15 µl

Celkový objem.............. 20 µl Štěpení při 37 °C, přes noc. 19

3.3.4. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Složení 5% polyakrylamidového gelu (PAG) s poměrem akrylamidu (AA) ku N,N´metylenbisakrylamidu (bisAA) 19:1: 40% AA (BioRad) ..............................................................3,75 ml 2% bisAA ...........................................................................3,75 ml 5x TBE pufr .............................................................................6 ml destilovaná voda .................................................................18,2 ml persíran amonný (APS) (100 mg/ml, SERVA) ................... 350 µl N, N, N´, N´- tetrametylendiamin (TEMED) (SIGMA)........ 20 µl - všechny složky smíchat, aplikovat mezi dvě skla - polymerizace v horizontální poloze při pokojové teplotě alespoň 30 min - do jamek nanášet 1-2 µl produktu PCR spolu s nanášecím pufrem (bromfenolová modř a xylen cyanol) - elektroforéza v elektroforetické vaně s 1x TBE pufrem

Jako hmotnostní standard jsem používala pBR322/AluI (Fermentas) (příloha č. 1).

5x TBE pufr: Tris (MERCK)........................................54 g kyselina boritá (PENTA) .....................27,5 g 0,5 M EDTA, pH 8 (LACHEMA)........20 ml destilovanou vodou doplnit do .........1000 ml

3.3.5. Barvení PAG stříbrem 1. gel nechat sklouznout ze skla pod proudem destilované vody do skleněné vany, promýt destilovanou vodou a vodu odsát vývěvou 2. fixovat 2x 5 min v roztocích 15% metanolu a 0,5% kyseliny octové v poměru 1:1 3. 2x krátce promýt destilovanou vodou 4. barvit 30 min v 0,1% AgNO3 (ve tmě, na třepačce) 5. promýt destilovanou vodou 2x 10 s 6. krátce propláchnout v 1,5% NaOH 7. gel vyvolat v 1,5% NaOH, 0,08% Na2B4O7 a 0,16% formaldehydu (1:1:1) 10-15 min 8. promýt destilovanou vodou 20

9. stabilizovat proužky v 0,75% Na2CO3 5 min 10. pro uchování použít 2% kyselinu octovou 11. gel zatavit do fólie a skladovat v lednici

3.3.6. Elektroforéza v agarózovém gelu Příprava 1% agarózového gelu: 1. 30 ml 0,5x TAE pufru + 0,3 g agarózy 2. krátce povařit, zchladit na 50 °C 3. přidat 1-2 µl ethidium-bromidu (zásobní roztok: 10 mg/ml H2O) 4. polymerace na nosiči v horizontální poloze alespoň 30 min 5. nosič umístit do elektroforetické vany s 0,5x TAE pufrem 6. do jamek nanést 4-8 µl produktu PCR + zatěžovací směs Orange G 7. elektroforéza v horizontální poloze

Detekce segmentů po elektroforetické separaci se provede na transiluminátoru ozářením UV světlem vlnové délky 312 nm. Jako hmotnostní standardy jsem používala Lambda/HindIII (Fermentas), 1 kb DNA Ladder (New England BioLabs), 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), MassRuler DNA Ladder High Range (Fermentas) a MassRuler DNA Ladder Low Range (Fermentas) (příloha č. 1).

50x TAE pufr: Tris (MERCK).........................................242 g kyselina octová .....................................57,1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 .............................100 ml destilovanou vodou doplnit do ............1000 ml

Orange G: 20% glukóza (LACHEMA)....................200 µl 0,5x TAE ................................................600 µl akridinová oranž (SIGMA).......... do zabarvení

3.3.7. Izolace produktů PCR z gelu K izolaci produktů PCR z gelu se použije QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce. 21

3.3.8. Přečištění produktů PCR K přečištění produktů PCR se použije MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce.

3.3.9. Příprava vzorků na sekvencování Pro sekvenační reakci se použije ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, verze 1.1 nebo 3.1.

Složení reakční směsi: Terminator Ready Reaction Mix ........ 8,0 µl Primer................................................. 0,5 µl Deionizovaná voda............................. 9,5 µl Produkt PCR....................................... 2,0 µl Celkový objem: 20 µl Program: 25x 96 °C/10 s

50 °C/5 s

60 °C/4 min

K přečištění vzorků po sekvenační reakci se použije DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce. Následně se vzorky nechají sušit v exsikátoru. Po vysušení se přidá 15 µl deionizovaného formamidu. Vzorky se denaturují 3 min při 95 °C a pak rychle zchladí v ledové lázni. Sekvencování probíhá na automatickém kapilárním sekvenátoru ABI PRISM 310 nebo ABI PRISM 3100.

22

4. VÝSLEDKY

4.1. PCR EXONŮ 1, 3+4 a 5+6+7 Při určování alel CYP2D6 jsem vycházela z exonů 3-7. Tyto úseky byly pro diagnostiku vybrány jako základní, protože se zde nachází nejvíce sekvenčních změn (obr. 5). V laboratoři již byla PCR exonů 3-7 zavedena (kap. 3.3.2.3). Používaly se primery navržené Daly aj. (1995). První PCR zahrnovala exon 3 a exon 4, druhá PCR zahrnovala část exonu 5, exon 6 a část exonu 7. Na základě zachycených změn v těchto úsecích lze jednoznačně stanovit alely *3, *4, *6, *7, *8, *9, *14 a *41. Jako doplňující byla navržena PCR exonu 1, která může odhalit další alely nebo pomoci upřesnit základní vyšetření (obr. 6).

Obr. 5: Schéma hlavních úseků genu CYP2D6, kde se nachází nejvíce sekvenčních změn. Jednotlivé sekvenční změny, běžné v kavkazské populaci, jsou znázorněny hvězdičkami (podle James aj., 2004). 1

2

3

4

Obr. 6: Exony 1, 3+4 a 5+6+7. Dráha 1: exon 1 (410 bp); dráha 2: exony 3+4 (722 bp); dráha 3: exony 5+6+7 (813 bp); dráha 4: pBR322/AluI (5% PAG, 8 V/cm, 2 hod).

4.2. AMPLIFIKACE KONTROLNÍ DNA FÁGA λ Long-PCR, kterou jsem využila při diagnostice alel CYP2D6, je založena na syntéze dlouhých úseků (několik kb). rTth DNA polymeráza, XL (GeneAmp XL PCR Kit, Applied Biosystems) je enzym určený pro amplifikaci sekvencí DNA dlouhých až 40 kb. Součástí kitu 23

jsou primery SC1011 a SC1002 a DNA fága λ, která slouží ke kontrole kvality polymerázy. Lze tak amplifikovat produkt délky 20,8 kb (obr. 7). 1

2

Obr. 7: Amplifikace kontrolní DNA fága λ. Dráha 1: Lambda/HindIII; dráha 2: 20,8 kb DNA fága λ (1% agaróza, 8 V/cm, 2 hod).

4.3. AMPLIFIKACE GENU CYP2D6 Amplifikace genu CYP2D6 je doporučována pro zabránění nespecifické amplifikace sekvencí psedogenů. Primery, které jsem použila, jsou navrženy tak, že dochází k amplifikaci produktu délky 5,1 kb (příloha č. 5). Pro syntézu jsem vybrala dva různé kity, které jsou určeny pro syntézu dlouhých oblastí. V obou případech docházelo k efektivní amplifikaci bez nespecifických produktů. Gen CYP2D6 jsem následně využila jako templát pro nested PCR některých exonů (kap. 4.9 a 4.14) a pro objasnění strukturních změn v genu CYP2D6 (kap. 4.11).

Primery: CYP2D6-F, CYP2D6-R Syntéza 1: GeneAmp XL PCR (Applied Biosystems). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem vycházela z protokolu navrženém Sistonen aj. (2005). Amplifikace však byla za našich laboratorních podmínek úspěšná až po úpravě koncentrací Mg(OAc)2 a primerů (obr. 8). Program PCR je navržen Sistonen aj. (2005). Složení reakční směsi: 1,5 U rTth DNA polymerázy, XL 1x XL pufr II 1,1 mM Mg(OAc)2 0,2 mM každý dNTP 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: 1x

94 ºC 1 min

10x

94 ºC 30 s

68 ºC 10 min

25x

94 ºC 30 s

68 ºC 10 min + 15 s na každý další cyklus

1x

72 ºC 30 min 24

1

2

Obr. 8: Amplifikace genu CYP2D6 pomocí GeneAmp XL PCR. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2: gen CYP2D6 (5,1 kb) (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod). Primery: CYP2D6-F, CYP2D6-R Syntéza 2: Expand Long Template PCR (Roche). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek a při návrhu programu PCR jsem postupovala podle pokynů společnosti Roche. Složení reakční směsi: 3,75 U Expand Long Template Enzyme mix 1x pufr 1 (1,75 mM MgCl2 v reakci) 0,35 mM každý dNTP 0,15 µM každý primer 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: 1x

93 ºC 2 min

10x

93 ºC 10 s

68 ºC 30 s

68 ºC 4 min

25x

93 ºC 15 s

68 ºC 30 s

68 ºC 4 min + 20 s na každý další cyklus

1x

68 ºC 7 min

V protokolu dodávaném spolu s polymerázou se doporučuje před přípravou reakční směsi zahřát pufr na teplotu 37-56 ºC, popř. přidat do reakce aditiva. PCR s přidaným 1% DMSO a pufrem zahřátým na 50 ºC jsem porovnala s PCR probíhající bez DMSO a pufrem rozpuštěným při pokojové teplotě. DMSO ani zahřátí pufru neměli na průběh syntézy vliv (obr. 9).

25

1

2

3

4

5

Obr. 9: Amplifikace genu CYP2D6 pomocí Expand Long Template PCR. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2: PCR s 1% DMSO, pufr zahřátý na 50 ºC; dráha 3: PCR s 1% DMSO, pufr bez zahřátí; dráha 4: PCR bez DMSO, pufr zahřátý na 50 ºC; dráha 5: PCR bez DMSO, pufr bez zahřátí (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod).

4.4. KONTROLA SPECIFICKÉ AMPLIFIKACE GENU CYP2D6 Pro další postup bylo nezbytné vědět, zda dochází k amplifikaci pouze genu CYP2D6 nebo je také amplifikován blízký homolog CYP2D7P. Kontrolu jsem provedla na základě analýzy délky restrikčních fragmentů. Restrikční enzymy jsem vybrala pomocí programu DNA Star (dostupný na http://ludwig.chem.wesleyan.edu/dna/) tak, aby byly schopny štěpit gen i pseudogen na fragmenty odlišných délek. Vybrala jsem enzymy NcoI a BamHI. Jako templát pro štěpení jsem použila produkt syntézy podle kap. 4.3. Na základě vzniklých fragmentů jsem mohla zjistit, jestli dochází k nespecifické amplifikaci pseudogenu CYP2D7P (obr. 10 a 11).

Restrikční enzym NcoI: Délky produktů štěpení CYP2D6 .............600 bp, 4500 bp Délky produktů štěpení CYP2D7P...........340 bp, 4750 bp

1

2

3

4

Obr. 10: Gen CYP2D6 štěpený NcoI. Dráha 1: Mass Ruler DNA ladder High Range; dráha 2: neštěpený produkt PCR; dráha 3: štěpený produkt PCR; dráha 4: MassRuler DNA Ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod).

26

Vzhledem k nepřítomnosti fragmentu délky 340 bp jsem usoudila, že k amplifikaci pseudogenu CYP2D7P nedochází.

Restrikční enzym BamHI: Délky produktů štěpení CYP2D6 ...........1700 bp, 3400 bp Délky produktů štěpení CYP2D7P.........1200 bp, 3900 bp

1

2

3

Obr. 11: Gen CYP2D6 (genotyp *1/*1) štěpený BamHI. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: štěpený produkt PCR; dráha 3: MassRuler DNA Ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). Vzhledem k nepřítomnosti fragmentu délky 1200 bp jsem usoudila, že k amplifikaci pseudogenu CYP2D7P nedochází. Jako templáty pro štěpení enzymy NcoI a BamHI jsem použila vždy dvě různé DNA: DNA standardního genotypu (*1/*1) a DNA genotypu *1/*4. Po štěpení DNA genotypu *1/*4 enzymem BamHI se objevily fragmenty typické pro CYP2D6 (1700 bp) i pro CYP2D7P (1200 bp), ale vznikl i fragment nový (2200 bp), který neodpovídal štěpení genu ani pseudogenu (obr. 12). Tento nečekaný restrikční profil byl způsoben sekvenční změnou 843T>G v intronu 1 alely *4, čímž vzniklo nové cílové místo pro BamHI. Místo fragmentu délky 3400 bp vznikly dva nové fragmenty o délce 1200 bp a 2200 bp. O nespecifickou amplifikaci pseudogenu CYP2D7P se tedy nejednalo.

27

1

2

3

4

Obr. 12: Gen CYP2D6 (genotyp *1/*4) štěpený BamHI. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: neštěpený produkt PCR; dráha 3: štěpený produkt PCR; dráha 4: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 2 hod).

4.5. DETEKCE ALEL S DUPLIKACÍ GENU CYP2D6 Pro detekci duplikovaných alel jsem použila primery navržené Løvlie aj. (1996). Vycházela jsem ze znalosti nejčastěji duplikovaných alel. Při testování jsem se zaměřila pouze na alely *1 a *2, tj. aktivní formy genu, které v duplikovaném stavu způsobují fenotyp UM. Dále jsem k testování použila DNA pacientů, kteří byli dextrometorfanovým testem stanoveni jako UM.

Primery: 17F a 32R ........................... 1. PCR 207F a 32R ......................... 2. PCR Syntéza: Expand Long Template PCR (Roche). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek a při návrhu programu PCR jsem postupovala podle pokynů společnosti Roche. Složení reakční směsi: 2,5 U Expand Long Template Enzyme mix 1x pufr 1 (1,75 mM MgCl2 v reakci) 0,1 mM každý dNTP 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x

94 ºC 2 min

10x

94 ºC 10 s

65 ºC 30 s

68 ºC 4 min

20x

94 ºC 10 s

65 ºC 30 s

68 ºC 4 min + 20 s na každý další cyklus

1x

68 ºC 7 min

Primery 17F a 32R jsou navrženy tak, že v případě genové duplikace dojde k amplifikaci CYP2D6-CYP2D6 mezigenové oblasti délky 3,6 kb. Navíc je s těmito primery

28

u každého vzorku amplifikována kontrolní CYP2D7P-CYP2D6 mezigenová oblast délky 5,2 kb (obr. 13) (příloha č. 2). Primery 207F a 32R slouží pro kontrolní reakci. U duplikovaných alel dochází k syntéze CYP2D6-CYP2D6 mezigenové oblasti délky 3,2 kb, zatímco u duplikacenegativních vzorků je výsledek PCR negativní (obr. 14). 1

2

3

4

5

6

7

Obr. 13: PCR s primery 17F a 32R pro detekci duplikace genu CYP2D6. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2-6: duplikace-negativní vzorky (3,6 kb); dráha 7: duplikace-pozitivní vzorek (5,2 kb a 3,6 kb) (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod). 1

2

3

4

5

6

7

Obr. 14: Kontrolní PCR s primery 207F a 32R pro detekci duplikace genu CYP2D6. Dráha 1-5: duplikace-negativní vzorky; dráha 6: duplikace-pozitivní vzorek (3,2 kb); dráha 7: 1 kb DNA Ladder (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod).

4.6. DETEKCE ALEL S DELECÍ GENU CYP2D6 Pro detekci genové delece (alela *5) jsem jako základní použila primery 13F a 24R. Tyto primery jsou navrženy tak, že v případě delece dojde k amplifikaci produktu délky 3,5 kb (příloha č. 3). Do reakce jsem navíc přidala primer 207F, který spolu s primerem 24R umožní syntézu kontrolního úseku délky 3,0 kb (obr. 15).

Primery: 13F, 207F, 24R Syntéza: DyNAzyme EXT PCR (Finnzymes). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem vycházela z protokolu navrženém Sistonen aj. (2005). Výsledek amplifikace však byl za našich laboratorních podmínek optimální až po úpravě koncentrací primerů. 29

Složení reakční směsi: 1 U DyNAzyme EXT DNA polymerázy 1x EXT pufr bez MgCl2 1 mM MgCl2 0,2 mM každý dNTP (Roche) 0,25 µM primer 207F 0,25 µM primer 24R 0,35 µM primer 13F 100-600 ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: Navržen Sistonen aj. (2005), stejný jako pro amplifikaci genu CYP2D6 pomocí GeneAmp XL PCR (kap. 4.3).

1

2

3

4

5

6

Obr. 15: Detekce delece genu CYP2D6. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2-4: delecepozitivní vzorky (3,5 kb a 3,0 kb); dráha 5 a 6: delece-negativní vzorky (3,0 kb) (1% agaróza, 4 V/cm, 2 hod).

4.7. DETEKCE ALELY *16 Alela *16 je hybridní gen CYP2D7P (exony 1-7)/CYP2D6(exony 8-9). Její detekce je založena na dvou paralelních reakcích. S primery 71F a 24R dochází k amplifikaci produktu délky 8 kb, s primery IN6-7 a JM3 vzniká produkt délky 1,4 kb (příloha č. 4). Jako kontrolní jsem použila DNA genotypu *1/*16 (obr. 16).

Primery: 71F a 24R ............... 1. PCR IN6-7 a JM3............ 2. PCR Syntéza: GeneAmp XL PCR (Applied Biosystems). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem postupovala podle pokynů společnosti Applied Biosystems. Program PCR je navržen Daly aj. (1996).

30

Složení reakční směsi: 2 U rTth DNA polymerázy, XL 1x XL pufr II 1 mM Mg(OAc)2 0,2 mM každý dNTP 0,2 µM každý primer 100-600 ng genomické DNA Program: 1 x

93 ˚C 1 min

35 x

93 ˚C 1 min

1x

72 ˚C 5 min

64 ˚C 2 min

68 ˚C 8 min

……….primery 71F a 24R 1x

93 ˚C 1 min

30 x

93 ˚C 1 min

1x

72 ˚C 5 min

67 ˚C 1 min 30 s

68 ˚C 5 min

……….primery IN6-7 a JM3

1

2

3

Obr. 16: Detekce alely CYP2D6*16 u kontrolní DNA. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: PCR s primery IN6-7 a JM3 (1,4 kb) ; dráha 3: PCR s primery 71F a 24R (8 kb) (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). V případě delece genu CYP2D6 vzniká při PCR s primery 71F a 24R produkt délky 9,5 kb (obr. 17).

1

2

3

Obr. 17: PCR s primery 71F a 24R u alel *5 a *16. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; Dráha 2: DNA - genotyp *1/*16 (8 kb); dráha 3: DNA - genotyp *5/*41 (9,5 kb) (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod).

31

4.8. DETEKCE ALELY *13 Alela *13 je hybridní gen CYP2D7P(exon 1)/CYP2D6(exony 2-9). K její detekci jsem použila primery P1 a P2 a postupovala jsem podle protokolu navrženém Panserat aj. (1995) (příloha č. 4). U žádného vzorku však nebyl výsledek PCR pozitivní.

4.9. PCR A SEKVENCOVÁNÍ EXONU 9 Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µM každý primer 0-5 mM MgCl2 max. 600 ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x

95 ºC 15 min

30x

95 ºC 1 min

1x

72 ºC 7 min

Ta 1 min

72 °C 1 min

Pro exon 9 jsem nejdříve navrhla primery 9F a 9R (příloha č. 5). Očekávaný produkt má délku 324 bp. Při PCR (Ta = 60 ˚C) se však syntetizoval také delší nespecifický produkt. Množství vstupní DNA jsem snížila 3x a testovala koncentraci MgCl2 (1,5-5 mM) (termocykler Perkin Elmer). Nespecifický produkt se nepodařilo odstranit. Pro exon 9 jsem tedy vytvořila teplotní gradient v rozmezí 56,2-63,8 °C (termocykler Techne) (obr. 18).

1

2

Ta (°C): 60,0

3

4

56,2

57,0

5

6

57,9 58,7

7

8

9

10

11

12

59,6

60,2 61,2 62,2 63,0 63,8

Obr. 18: Optimalizace PCR exonu 9 s primery 9F a 9R. Dráha 1: pBR322/AluI; dráha 2: Ta = 60 °C, 5 mM MgCl2, termocykler Perkin Elmer; dráha 3-12: teplotní gradient 56,2-63,8 °C, 5 mM MgCl2, termocykler Techne (5% PAG, 8 V/cm, 2 hod). 32

Přestože PCR probíhala na obou termocyklerech za stejných reakčních podmínek, při PCR na přístroji Techne Touchgene Gradient žádné nespecifické produkty nevznikaly. Vzorky z dráhy 2 a 8 (stejné Ta) jsem sekvencovala. Výsledky byly srovnatelné. Porovnáním se sekvencí pseudogenů jsem zjistila, že primery se připojují i na exon 9 pseudogenu CYP2D7P a u obou vzorků byl tedy amplifikován i pseudogen. Na základě výsledků sekvencování nebylo možné odečíst případné sekvenční změny. Pro zabránění amplifikace pseudogenu jsem využila nested PCR. Templátem byl místo genomové DNA gen CYP2D6 (2 µl, podle kap. 4.3). PCR probíhala za těchto podmínek: Ta = 60 °C, 5 mM MgCl2, termocykler Perkin Elmer. Opět vznikal nespecifický produkt, který se ani přečištěním přes kolonku Min Elute nepodařilo odstranit. Při sekvencování se však ukázalo, že je amplifikován pouze gen CYP2D6. Protože tato syntéza byla zdlouhavá a nákladná, navrhla jsem pro přímou amplifikaci exonu 9 primer 8F, který na 6. pozici od 3´ konce tvoří mismatch (příloha č. 5). Tento primer se připojuje k exonu 8 a lze tak zachytit i případné sekvenční změny v části exonu 8 a v intronu 8. Jako zpětný primer jsem použila 9R. Očekávaný produkt má délku 461 bp. PCR probíhala při Ta = 60 °C, testovala jsem různé koncentrace MgCl2 (1,5-5 mM). Opět se tvořily nespecifické produkty. Sekvencovala jsem produkt PCR s 5 mM MgCl2, při které se tvořilo nejmenší množství nespecifických produktů. Ukázalo se, že rozdíl sekvence primerů pouze v jedné bázi v tomto případě nestačí, amplifikoval se i pseudogen CYP2D7P. K primeru 8F jsem tedy navrhla primer 9R-new. Tento primer se připojuje k sekvenci intronu 9, která se od pseudogenu CYP2D7P liší přítomností dvou bází navíc (příloha č. 5). Očekávaný produkt má délku 569 bp. Testovala jsem 1,5 mM a 3 mM MgCl2 a pro obě tyto koncentrace jsem vytvořila teplotní gradient v rozmezí 54,3-60,0 °C (obr. 19).

1

2

3

4

5

6

Ta: 54,3 56,0 57,4 58,4 59,1 60,0

7

8

9

10

11

12

13

54,3 56,0 57,4 58,4 59,1 60,0 (°C)

Obr. 19: Optimalizace PCR exonu 9 s primery 8F a 9R-new. Dráha 1-6: 1,5 mM MgCl2; dráha 7: Mass Ruler DNA ladder Low Range; dráha 8-13: 3 mM MgCl2 (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod).

33

Produkt PCR s 1,5 mM MgCl2, Ta = 58,4 °C (dráha 4) jsem sekvencovala. Kombinace těchto primerů byla dostatečná pro specifickou amplifikaci genu CYP2D6 (příloha č. 6).

4.10. PŘÍPADY PCR EXONU 1 S NEGATIVNÍM VÝSLEDKEM U devíti vzorků DNA pacientů se syntéza exonu 1 nedařila ani po opakovaném nasazení. Předpokládala jsem, že může jít o změnu v místě nasedání jednoho z primerů nebo o deleci exonu 1. Pro objasnění, o jakou změnu se jedná, jsem amplifikovala 2 oblasti kolem exonu 1. Pro 1. PCR jsem použila primery CYP2D6-F a 1R (příloha č. 5). Při této reakci by se měl amplifikovat exon 1 spolu s 5´ oblastí genu, kde má svou komplementární cílovou sekvenci primer 1F. Výsledný produkt by měl mít délku 575 bp. Jako templát jsem použila 2 µl produktu syntézy podle kapitoly 4.3. PCR probíhala za stejných podmínek jako PCR pro exon 1 (kap. 3.3.2.3). Teploty tání těchto dvou primerů se lišily o 4 °C (Tm primeru CYP2D6F je 68 °C, Tm primeru 1R je 64 °C). Vytvořila jsem proto teplotní gradient v rozmezí 61-67 °C. Při PCR vzniklo mnoho nespecifických produktů. Podle očekávání vznikl i produkt délky 575 bp. Z toho jsem usoudila, že se o deleci exonu 1 nejedná. Produkt PCR s Ta = 67 °C jsem přečistila a sekvencovala. Sekvence však nebyla čitelná. Pro 2. PCR jsem použila primery 1F a 2R (příloha č. 5). Při této reakci by mělo dojít k amplifikaci exonu 1 spolu s intronem 1, kde má primer 1R svou cílovou komplementární sekvenci. Teploty tání obou primerů jsou stejné (62 °C). Očekávaný produkt má délku 1255 bp. Pro syntézu jsem použila DyNAzyme™ EXT PCR kit. 50 µl reakce obsahovala 1 U DyNAzyme™ EXT DNA polymerázy, 1x EXT pufr s MgCl2, 0,05 mM každý dNTP, 0,1 µM každý primer a 5 % DMSO. Jako templát jsem do reakce přidala 2 µl produktu PCR podle kap. 4.3. Syntéza probíhala za těchto podmínek: počáteční denaturace 93 °C 1 min, 30 cyklů 93 °C 1 min, 62 °C 2 min a 68 °C 10 min, závěrečná extenze 68 °C 10 min. Při PCR vznikl kromě produktu délky 1255 bp i jeden kratší nespecifický produkt. Po přečištění jsem vzorek sekvencovala. Tento postup jsem zopakovala i pro DNA se standardní syntézou exonu 1. Porovnáním těchto dvou sekvencí jsem zjistila, že u DNA s neúspěšnou PCR exonu 1 není v intronu 1 CYP2D6-specifická sekvence, kam se komplementárně připojuje primer 1R, ale je tu sekvence pseudogenu CYP2D7P (přílohy č. 7 a 8). Pro odlišení této varianty od falešně negativní PCR jsem k primerům 1F a 1R (produkt délky 410 bp) přidala primer 2D7/2D6-1R (0,2 µM). Tento primer se komplementárně připojuje k sekvenci před exonem 1 pseudogenu CYP2D7P a v kombinaci s primerem 1F

34

dojde k amplifikaci kontrolního fragmentu délky 178 bp (obr. 20). Jako templát slouží genomová DNA.

1

2

3

Obr. 20: Multiplex PCR s primery 1F, 1R a 2D7/2D6-1R. Dráha 1: DNA se standardní sekvencí v intronu 1 (410 bp, 178 bp); dráha 2: DNA s CYP2D7P-specifickou sekvencí v intronu 1 (178 bp); dráha 3: pBR322/AluI (5% PAG, 8 V/cm, 2 hod). Všech devět vzorků DNA pacientů jsem tímto způsobem otestovala. V žádném případě se nejednalo o falešně negativní PCR. Tyto vzorky jsem dále testovala na přítomnost alel *13 a *16. Jedná se o hybridní alely, které nemají v intronu 1 CYP2D6-specifickou sekvenci pro komplementární navázání primeru 1R. Žádný vzorek však nebyl ani pro jednu alelu pozitivní. Předpokládala jsem tedy, že u těchto vzorků může jít o další strukturní změnu, která se označuje jako genová konverze 2D6/2D7. Při genové konverzi je část sekvence intronu 1 genu CYP2D6 vyměněna za sekvenci intronu 1 pseudogenu CYP2D7P.

4.11. DŮKAZ GENOVÉ KONVERZE V INTRONU 1 GENU CYP2D6 Pro důkaz genové konverze v intronu 1 genu CYP2D6 jsem použila primer 2D7-1R, který nasedá na stejnou pozici jako primer 1R, jeho sekvence je však CYP2D7P-specifická. Použila jsem vzorky DNA pacientů, u kterých vycházela negativní syntéza exonu 1. Nejdříve jsem amplifikovala gen CYP2D6 (podle kap. 4.3) a ten jsem následně použila jako templát pro PCR s primery 1F a 2D7-1R. Syntéza proběhla za stejných podmínek jako PCR exonu 1 (kap. 3.3.2.3), Ta jsem na základě Tm obou primerů stanovila na 64 °C. Očekávaný produkt má délku 410 bp (obr. 21).

35

1

2

3

4

5

6

Obr. 21: Důkaz genové konverze v intronu 1. Dráha 1-5: produkty PCR s primery 1F a 2D71R s vstupní DNA různých pacientů; dráha 6: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). Abych dokázala, že primer CYP2D7-1R se připojuje pouze k sekvenci genu CYP2D6 a ne k sekvenci pseudogenu CYP2D7P, použila jsem gen CYP2D6 jako templát pro reakci s primery 1F a 2D7/2D6-1R. Při reakci by neměl vznikat žádný produkt, protože primer 2D7/2D6-1R je CYP2D7P-specifický. Složení 5 různých reakčních směsí je popsáno v tabulce 2, program PCR je stejný jako pro PCR exonu 1 (kap. 3.3.2.3).

Tab. 2: Podmínky PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R (HSTMM-HotStarTaq Master Mix, * produkt přečištěný přes kolonku Min Elute). Reakce č. HSTMM

Primery

Templát

1

1x

0,2 µM

2 µl

2

1x

0,2 µM

1 µl

3

1x

0,2 µM

1 µl*

4

1x

0,2 µM

0,5 µl

5

1x

0,1 µM

0,5 µl

Při PCR se však produkt tvořil, a to i při nižší koncentraci primerů a templátové DNA. Ani přečištění přes kolonku Min Elute nemělo na syntézu produktu vliv (obr. 22). Nespecifické připojování primeru 2D7/2D6-1R je znázorněno v příloze č. 5. 1

2

3

Obr. 22: PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R. Dráha 1: produkt PCR délky 178 bp; dráha 2: negativní kontrola; dráha 3: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod).

36

Z těchto výsledků jsem usoudila, že v reakci je také genomová DNA, tedy i pseudogen CYP2D7P, kde má primer 2D7/2D6-1R specifickou komplementární sekvenci. Kontaminaci použitých zásobních roztoků jsem vyloučila na základě výsledku negativní kontroly, kdy byla do reakce namísto DNA přidána voda.

4.12. DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI GENOMOVÉ DNA V REAKCI Přítomnost genomové DNA v reakci jsem se pokusila dokázat použitím produktu PCR podle kapitoly 4.3 jako templátu pro reakci s primery, které specificky amplifikují jiný gen než CYP2D6. Pro tuto rekci jsem použila primery 3A a 3B, které se v Genetické laboratoři CKTCH běžně využívají pro amplifikaci genu TACI (transmembrane activator and CAML interactor). TACI patří do rodiny receptorů TNF. Syntéza proběhla pomocí HotStarTaq PCR kitu (Qiagen) podle kapitoly 3.3.2.5 (obr. 23).

1

2

Obr. 23: Důkaz přítomnosti genomické DNA v reakci. Dráha 1: Mass Ruler DNA ladder Low Range; dráha 2: amplifikace genu TACI (366 bp) (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). Z obrázku 23 je zřejmé, že k syntéze genu TACI došlo, v reakci tedy zůstává dostatečné množství celkové genomové DNA. Jako templát pro další reakci jsem tedy použila 5,1 kb fragment (gen CYP2D6) izolovaný z gelu. Zde jsem předpokládala, že jde pouze o gen CYP2D6 bez genomové DNA. Před elektroforézou jsem na gel nanesla 8 µl produktu syntézy podle kapitoly 4.3, výsledkem extrakce bylo 50 µl produktu. 2 µl tohoto produktu jsem použila jako templát pro dvě reakce: 1. PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R, 2. PCR s primery 3A a 3B (obr. 24).

37

1

2

3

Obr. 24: PCR po izolaci genu CYP2D6 z gelu. Dráha 1: PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R (178 bp); dráha 2: PCR s primery 3A a 3B (366 bp); dráha 3: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). Z obrázku 24 je zřejmé, že po izolaci produktu PCR z gelu k syntéze genu TACI ve velmi malém množství došlo. Naproti tomu produkt PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R se opět tvořil ve velkém množství. Předpokládala jsem tedy, že připojování primeru 2D7/2D6-1R k sekvenci genu CYP2D6 může být způsobeno sekvenční změnou v genu CYP2D6. Mohlo např. dojít k záměně –18T>G v místě komplementárním 3´ konci primeru 2D7/2D6-1R (příloha č. 5). Tuto oblast jsem proto sekvencovala. Využila jsem primery 1F a 2D7-1R, které tuto oblast ohraničují. Ukázalo se však, že k žádné sekvenční změně nedošlo, tato oblast odpovídala standardní sekvenci genu CYP2D6. Na základě toho jsem se rozhodla zabránit nespecifické amplifikaci zpřísněním některých podmínek reakce s primery 1F a 2D7/2D6-1R.

4.13. ÚPRAVA PODMÍNEK PCR S PRIMERY 1F A 2D7/2D6-1R Nejdříve jsem se rozhodla porovnat výsledky PCR při různých teplotách navázání primerů. Optimální teplota tání uváděná pro dané primery je 60 °C, vytvořila jsem proto teplotní gradient v rozmezí 54,8-64,0 °C (primery 0,1 µM; 0,5 µl DNA podle kap. 4.3). Produkt se však syntetizoval rovnoměrně ve všech případech (obr. 25).

1

2

3

4

Ta: 54,8 55,6 56,8 58,3

5

6

7

8

9

10

11

60,1 61,4 62,4 63,1 63,8 64,0 (°C)

Obr. 25: Teplotní optimalizace PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R. Dráha 1-10: teplotní gradient 54,8-64,0 °C; dráha 11: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod).

38

Dále jsem testovala koncentraci dNTP. Pro syntézu jsem použila Taq polymerázu (Fermentas). Jako templát opět sloužil gen CYP2D6 (kap. 4.3). Složení reakční směsi: 2,5 U Taq polymerázy, 1x Taq pufr s KCl, 1,5 mM MgCl2, dNTP v koncentracích od 50 µM do 5 µM a 1 µl DNA. Program PCR: počáteční denaturace 95 °C 5 min, 30 cyklů 95 °C 1 min, 60 °C 1 min a 72 °C 1 min, závěrečná extenze při 72 °C 7 min. Pro porovnání jsem stejnou reakci provedla s genem CYP2D6 izolovaným z gelu (obr. 26) a také s celkovou genomovou DNA (obr. 27). 1

2

3

4

50 µM 10 µM 5 µM

5

6

7

50 µM 10 µM 5 µM

Obr. 26: Optimalizace PCR s 50, 10 a 5 µM dNTP. Dráha 1-3: templát = gen CYP2D6; dráha 4-6: templát = gen CYP2D6 izolovaný z gelu; dráha 7: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). 1

2

3

50 µM

10 µM

5 µM

4

Obr. 27: PCR s 50, 10 a 5 µM dNTP. Dráha 1-3: templát = genomová DNA; dráha 4: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). Se snižujícím se množstvím dNTP v reakci se snižovalo i množství syntetizovaného produktu. Stejný výsledek jsem pozorovala jak při použití genu CYP2D6 jako templátu, tak po jeho izolaci z gelu. K syntéze nespecifického produktu došlo i za velmi nízké koncentrace dNTP (5 µM) v reakci. Snižující se množství produktu PCR jsem pozorovala i u reakce s genomovou DNA. Na základě těchto výsledků se domnívám, že snižující se množství produktu PCR bylo dáno nedostatečným množstvím dNTP a že tedy nespecifická amplifikace produktu délky 178 bp nebyla způsobena nadbytkem dNTP.

39

Dále jsem zkoušela ředit templátovou DNA. Navrhla jsem dvě reakce, 1. PCR s primery 1F a 2D7-1R, 2. PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R. Do každé reakce jsem přidala 0,05 µl produktu PCR podle kapitoly 4.3. Syntéza probíhala s HotStarTaq polymerázou a 0,1 µM primery. Navíc jsem snížila počet cyklů PCR z 30 na 15 (obr. 28). 1

2

3

Obr. 28: Optimalizace PCR ředěním templátové DNA a snížením počtu cyklů PCR. Dráha 1: PCR s primery 1F a 2D7-1R (410 bp); dráha 2: negativní PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R; dráha 3: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). Kombinace ředění templátové DNA a nižší počet cyklů PCR zabránila amplifikaci nespecifického produktu. K syntéze produktu délky 410 bp za stejných podmínek došlo, proto můžu vyvrátit domněnku, že množství templátové DNA v reakci a počet cyklů PCR byly nedostačující. Další testování podmínek reakce (např. různé koncentrace MgCl2, jiná polymeráza) nebylo nutné. Z těchto výsledků je jasné, že CYP2D7P-specifický primer 2D7-1R se nepřipojuje na sekvenci pseudogenu CYP2D7P, ale má v intronu 1 genu CYP2D6 své specifické komplementární místo, které souvisí s genovou konverzí.

4.14. PROBLEMATICKÉ SEKVENCOVÁNÍ EXONŮ 5+6+7 U DVOU PACIENTŮ Sekvence exonů 5+6+7 u dvou vzorků DNA pacientů nebyla od určitého místa čitelná, nebylo proto možné stanovit sekvenční změny. Porovnáním se sekvencí pseudogenu CYP2D7P jsem zjistila, že je sekvencován i pseudogen CYP2D7P. Předpokládala jsem opět, že chybná syntéza může být způsobena změnou v místě nasedání primerů. Protože primer 1A není CYP2D6-specifický, ale připojuje se k sekvenci genu i pseudogenu, ke změně by muselo dojít v místě nasedání primeru 4A. Tento primer tvoří mismatch na 3. pozici od 3´ konce, a tím je CYP2D6-specifický (příloha č. 5). Pro amplifikaci úseku zahrnujícího místo nasedání primeru 4A jsem využila primer 1A v kombinaci s primerem 9R (příloha č. 5). Pro syntézu jsem použila AmpliTaq Gold PCR kit (Applied Biosystems). 50 µl reakce obsahovala: 3,75 U AmpliTaq Gold DNA polymerázy, 40

1x PCR Gold pufr bez MgCl2, 0,25 mM každý dNTP, 1,8 mM MgCl2, 0,2 µM každý primer, 100-600 ng genomové DNA. PCR proběhla za těchto podmínek: počáteční denaturace 95 °C 12 min, 35 cyklů 95 °C 1 min, 60 °C 1 min a 72 °C 8 min, závěrečná extenze 72 °C 10 min. Očekávaný produkt má délku 1747 bp. Cílové místo primeru 4A je blíže 5´ konci, proto bylo výhodnější použít pro sekvencování primer 9R. Sekvence však byla čitelná asi do 500 bp a místo nasedání primeru 4A nezachytila. Pro zachycení očekávané sekvenční změny jsem tedy navrhla primer 7R, který není sekvenčně specifický a nasedá na koncovou sekvenci exonu 7 (příloha č. 5). V kombinaci s primerem 1A dojde k amplifikaci genu CYP2D6 současně s pseudogenem CYP2D7P a během jednoho sekvencování můžu porovnat sekvence genu CYP2D6 ale i pseudogenu CYP2D7P. Pro syntézu jsem použila HotStarTaq PCR Kit (Qiagen). 30 µl reakce obsahovala 1x HotStarTaq Master Mix, 0,2 µM každý primer, 100-600 ng genomové DNA a různé koncentrace MgCl2 (1,5 mM, 3 mM, 5 mM). PCR probíhala za těchto podmínek: počáteční denaturace 95 °C 15 min, 40 cyklů 95 °C 1 min, 60 °C 1 min a 72 °C 1 min, závěrečná extenze 72 °C 7 min. Očekávaný produkt má délku 813 bp (obr. 29). Produkt PCR s 3 mM MgCl2 jsem sekvencovala. Pro porovnání jsem sekvencovala stejný úsek u vzorků se standardní sekvencí exonů 5+6+7 (přílohy č. 9 a 10).

1

2

3

4

Obr. 29: PCR exonů 5+6+7 s primery 1A a 7R. Dráha 1: Mass Ruler DNA ladder Low Range; dráha 2: 1,5 mM MgCl2; dráha 3: 3 mM MgCl2; dráha 4: 5 mM MgCl2 (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). V exonu 7 pseudogenu CYP2D7P jsem našla sekvenční změnu, kterou jsem identifikovala jako 3212C>T. Díky této změně se v exonu 7 pseudogenu CYP2D7P vytvořilo místo pro komplementární připojení primeru 4A. Pro stanovení sekvenčních změn v exonech 5+6+7 genu CYP2D6 u těchto dvou pacientů jsem využila gen CYP2D6 jako templát s následnou nested PCR s primery 1A a 4A.

41

4.15. VÝSLEDKY VYHLEDÁVÁNÍ MUTACÍ U VYŠETŘOVANÉHO SOUBORU PACIENTŮ Ve vyšetřovaném souboru 66 pacientů jsem přímým sekvencováním identifikovala celkem 6 různých mutací, které mají vliv na metabolickou aktivitu enzymu (tab. 3). Číslování sekvenčních změn je založeno na počátku translace. Tab. 3: Vyšetřované exony a nalezené kauzální mutace ve vztahu k metabolismu léčiv. Exon 1

Exony 3+4

Exony 5+6+7

Exon 9

100C>T

1661G>C

2850C>T

4180G>C

1846G>A

2988>A

Alely jsem stanovila na základě mutací detekovaných přímým sekvencováním vybraných exonů a na základě výsledků testů na genovou deleci a duplikaci. Při jejich označování a následném přiřazování předpokládaných fenotypů jsem vycházela z literatury (James aj., 2004; Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004) a z databáze alel CYP2D6 dostupné na webové adrese http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm (tab. 4; tab. 5; tab. 6). Frekvence identifikovaných alel odpovídá jejich frekvenci popsané pro kavkazskou populaci (James aj., 2004). Frekvence stanovených fenotypů odpovídá jejich zastoupení v kavkazské populaci (Denson aj., 2005).

42

Tab. 4: Příklady stanovení genotypů a fenotypů pacientů na základě nalezených mutací ve vytipovaných oblastech genu CYP2D6 Vysvětlivky: konverze - konverze v intronu 1 v homozygotním stavu, (-) – negativní výsledek, (+) – pozitivní výsledek, genotyp – alely stanovené na základě nalezených mutací, fenotyp – předpokládaný metabolický typ odpovídající stanovenému genotypu, DMT – metabolický typ stanovený na základě dextrometorfanového testu, N – nevyšetřeno.

pacient

100C>T

6

konverze

1661G>C

1846G>A

2850C>T

2988G>A

4180G>C

delece

duplikace

genotyp

fenotyp

DMT

+

non

non

hom

hom

hom

-

N

*41/*41

IM

PM

19

hom

non

hom

non

non

hom

+

N

*4/*5

PM

N

20

non

non

non

het

non

het

-

-

*1/*2

EM

EM

21

hom

hom

hom

non

non

hom

-

N

*4/*4

PM

PM

22

hom

het

het

non

non

hom

-

N

*4/*10

IM

EM

28

non

non

non

het

non

N

+

-

*2/*5

EM

N

34

het

het

het

non

non

het

-

-

*1/*4

EM

EM

36

non

non

non

non

non

N

+

+

*1x2/*5

UM

UM

43

+

non

non

hom

het

hom

-

-

*2/*41

EM

N

47

+

hom

non

hom

non

hom

-

-

*2/*2

EM

PM

48

non

het

het

het

non

hom

-

-

*2/*4

EM

PM

49

non

non

non

non

non

non

-

-

*1/*1

EM

EM

53

het

het

non

non

non

het

-

-

*1/*10

EM

N

59

non

non

non

non

het

N

-

-

*1/*41

EM

N

hom

non

hom

hom

N

+

N

*5/*41

IM

N

non

non

hom

hom

N

-

N

*41/*41

IM

N

65 66

+ non

43

Tab. 5: Alely identifikované u vyšetřovaného souboru pacientů: jejich frekvence, hlavní sekvenční změny a aktivita enzymu, který je kódován těmito alelami. alela

sekvenční změny (James aj., 2004)

aktivita enzymu

frekvence alely (%)

*1

referenční alela

normální

38,6

*2

1661G>C, 2850C>T

normální

18,9

*4

100C>T, 1661G>C, 1846G>A

žádná

18,2

*5

delece genu CYP2D6

žádná

5,3

*10

100C>T, 1661G>C

snížená

6,8

*41

1661G>C, 2850C>T, 2988G>A

snížená

11,4

*1x2

duplikace genu CYP2D6

zvýšená

0,8

Tab. 6: Genotypy identifikované ve vyšetřovaném souboru pacientů, předpokládané fenotypy a jejich frekvence. genotyp

počet pacientů

fenotyp

frekvence fenotypů (%)

*1/*1

15

*1/*2

7

*1/*4

7

*1/*5

1

*1/*10

2

*1/*41

4

EM

74,2

*2/*2

5

*2/*4

4

*2/*5

1

*2/*10

2

*2/*41

1

*4/*10

2

*5/*41

1

*10/*10

1

IM

13,6

*10/*41

1

*41/*41

4

*4/*4

4

*4/*5

3

PM

10,6

*1x2/*5

1

UM

1,5

44

5. DISKUZE

Cytochrom P450 2D6 zprostředkovává metabolismus asi 25% v současnosti užívaných léčiv. Vykazuje značnou interindividuální variabilitu, která je primárně dána polymorfismem genu CYP2D6. Doposud bylo popsáno asi 100 různých alel. Současné možnosti molekulární biologie umožňují rychlé a přesné stanovení genotypu a dovolují tak zavedení diagnostiky alel CYP2D6 do běžné klinické praxe. Ve své diplomové práci jsem k detekci alel CYP2D6 použila long PCR a přímé sekvencování. Vycházela jsem z již zavedené diagnostiky mutací v exonech 3-7, kde se nachází nejvíc sekvenčních změn. Ve dvou reakcích se paralelně syntetizují dva úseky: v 1. reakci je to exon 3+4, ve 2. reakci exon 5+6+7. Jako další bylo v laboratoři zavedeno vyšetřování exonu 1. Během diplomové práce jsem diagnostiku rozšířila na exon 9, genovou deleci se syntézou kontrolního úseku a genovou duplikaci.

Primery 1A/4A pro exony 3+4 a primery 1C/2G pro exony 5+6+7 byly navrženy Daly aj. (1995), a to tak, že dochází k amplifikaci pouze genu CYP2D6 a ne homologních pseudogenů. Primery 1F/1R pro amplifikaci exonu 1 byly navrženy pomocí programu Primer3. Při syntéze exonů 5+6+7 se využívají primery 1A/4A, kdy specifická amplifikace genu CYP2D6 je dána primerem 4A. Je známo, že mismatch na 3´ konci primeru znemožní PCR, čehož se využívá při AS-PCR. V případě primeru 4A se mismatch nachází až na 3. pozici od 3´ konce, přesto je tato změna dostatečná pro specifickou amplifikaci genu CYP2D6. Pro exon 9 jsem navrhla primer 8F, který tvoří mismatch na 6. pozici od 3´ konce. Tato změna však specifické nasedání primeru nezajistila, přestože teplota annealingu byla vysoká a obsah GC primeru 8F (67%) byl také vyšší než v případě primeru 4A (60%). Pravděpodobně vzdálenost nepárujícího nukleotidu od 3´ konce je příliš velká na to, aby zabránila amplifikaci sekvencí pseudogenu CYP2D7P. Jelikož v okolí se nenacházela žádná další báze, kterou by se odlišoval gen CYP2D6 od pseudogenů, nebylo možné vnést do jednoho primeru víc nepárujících nukleotidů. Kombinace primeru 8F s primerem 9R-new již byla dostatečná pro specifickou amplifikaci genu CYP2D6.

45

Pro zabránění amplifikace pseudogenů někteří autoři doporučují v 1. kroku amplifikaci genu CYP2D6 a následně nested PCR jednotlivých exonů (Marez aj., 1997; Roberts a Kennedy, 2006; Sachse aj., 1997; Sistonen aj., 2005). Tento postup jsem využila i já pro nested PCR exonu 9 a exonů 5+6+7 a dále pro důkaz některých strukturních variant genu CYP2D6 (např. konverze). Fragment délky 5,1 kb zahrnující gen CYP2D6 jsem štěpila dvěma restrikčními enzymy, a dokázala jsem tak, že během reakce nedochází k nespecifické amplifikaci pseudogenu CYP2D7P. Neobvyklou kombinaci restrikčních fragmentů, která neodpovídala CYP2D6 ani CYP2D7P, jsem pozorovala při štěpení alely *4. Kagimoto aj. (1990) uvádějí, že tato alela obsahuje v intronu 1 další místo rozeznávané BamHI. Sekvenční změnou, kterou jsem identifikovala jako 843T>G, dojde k vytvoření nového místa rozeznávaného BamHI. Tato sekvenční změna se vyskytuje pouze u alel *4M a *4N. Po štěpení těchto alel restrikčním enzymem BamHI tak vznikají fragmenty délky 1200 bp, 2200 bp, 1700 bp.

Gen CYP2D6 jsem syntetizovala v objemu 50 µl. Pro následnou nested PCR lze brát různá množství templátu. V literatuře jsem se setkala s množstvím 1/25 až 1/1000 (Marez aj., 1997; Roberts a Kennedy, 2006; Sachse aj., 1997; Sistonen aj., 2005). Pro nested PCR s primery 9F/9R a 1A/4A jsem použila 1/25, která byla vhodná pro specifickou amplifikaci genu CYP2D6 a nebylo proto třeba většího ředění. Při PCR s primery 1F a 2D7/2D6-1R se nespecifický produkt podařilo odstranit teprve použitím 0,05 µl templátu, což odpovídá 1/1000. Protože se ukázalo, že v reakci při ředění 1/10 a 1/100 zůstává dostatečné množství genomové DNA (kap. 4.12), lze předpokládat, že primery 1F a 2D7/2D6-1R se připojovaly k pseudogenu CYP2D7P genomové DNA. Ředění 1/1000 je pravděpodobně dostatečně velké na to, aby v reakci zůstal PCR produkt první reakce (gen CYP2D6) bez velkého množství genomové DNA. Část sekvence genu CYP2D6, kde se nespecificky připojoval primer 2D7/2D6-1R, jsem sekvencovala. Žádnou sekvenční změnu, která by ovlivnila nasedání primeru, jsem nenašla. Dalším možným vysvětlením proto může být samotná struktura primeru 2D7/2D61R. Jelikož primer 1F může nasedat na sekvenci genu i pseudogenu, specifitu reakce zajišťuje primer 2D7/2D6-1R. Tvoří mismatch na 3´ konci a na 3. a 4. pozici na 5´ konci. Se sekvencí genu CYP2D6 vytváří na 3´ konci nekomplementární spojení C-T (primer-templát). Vliv nekomplementárních vazeb primer-templát na PCR studovali Kwok aj. (1990). Zjistili, že na průběh PCR má vliv pozice, ve které se mismatch nachází, počet těchto nekomplementárních spojení a dále podmínky reakce. Jejich výsledky testování primerů, 46

které tvoří pouze jeden mismatch, a to na 3´ konci, jsou shrnuty v tabulce 7. Je zřejmé, že přítomnost T na 3´ konci primeru dovoluje amplifikaci bez ohledu na odpovídající sekvenci templátu (efekt je symetrický, PCR tedy proběhne i v přítomnosti T na templátu).

Tab. 7: Relativní úspěšnost amplifikace s primerem obsahujícím 3´-koncový mismatch a 800 µM dNTP v reakci (komplementární spojení: relativní úspěšnost 1,0) (podle Kwok aj., 1990). Na průběh PCR může mít vliv změna některé reakční složky nebo také teplota annealingu. Při testování různých teplot annealingu, jsem pozorovala, že zvyšující se teplota nezabránila nespecifickému připojení primeru 2D7/2D6-1R. Kwok aj. (1990) zjistili, že při 6 µM dNTP došlo k prodloužení pouze těch primerů, které tvořily na 3´ konci s templátem komplementární vazbu (výjimkou byl mismatch T-G). Testovala jsem tedy různé koncentrace dNTP od 400 µM do 5 µM, při kterých jsem pozorovala snižující se množství produktu PCR. Nicméně, i při 5 µM dNTP k tvorbě produktu docházelo. Při kontrolní PCR s klesající koncentrací dNTP, kde templátem byla celková genomová DNA, také docházelo ke snižování množství produktu PCR. Na základě toho usuzuji, že klesající množství produktu PCR je v tomto případě dáno nedostatečným množstvím dNTP. Pokud by koncentrace dNTP v reakci měla vliv na extenzi primeru tvořící vazbu C-T, očekávala bych, že při 5 µM dNTP již k reakci nedojde nebo že při kontrolní PCR s genomickou DNA nebude množství produktu klesat stejně jako při PCR s genem CYP2D6 jako templátem. Co se týká ředění templátové DNA pouze 1/50, lze nespecifické připojování primeru 2D7/2D6-1R také vysvětlit tím, že gen CYP2D6 je v reakci ve velkém nadbytku. Pokud předpokládáme, že mismatch na 3´ konci primeru nemá na PCR zásadní vliv, pak je-li navíc v reakci velké množství templátové DNA, může docházet k nespecifickému připojování primeru. Nespecifitu se mi tedy nakonec podařilo odstranit kombinací těchto podmínek: ředění 1/1000 a snížení počtu cyklů v nested PCR z 30 na 15. Mohu vyvrátit domněnku, že k syntéze nespecifického produktu nedošlo v důsledku vysokého ředění nebo malého počtu cyklů, protože za stejných podmínek došlo k amplifikaci produktu PCR s primery 1F a 2D7-1R.

47

Tento problém nespecifického připojování primeru by si bezesporu zasloužil další pozornost. Pro další testování by bylo vhodné navrhnout primery, které by specificky amplifikovaly pouze pseudogen CYP2D7P. Produkt této PCR by pak byl použit jako templát pro reakci s primery 1F a 2D7/2D6-1R. Za výše uvedených podmínek PCR (ředění 1/1000, 15 cyklů PCR) bych v tomto případě produkt očekávala. Dále bych také navrhla takové kombinace reakcí, které by ukázaly, zda k připojení primeru 2D7/2D6-1R nedošlo jen díky většímu ředění templátové DNA, nebo jen díky sníženému počtu cyklů PCR, nebo zda je potřebná kombinace obou těchto podmínek. Při návrhu primerů pro další práci bych postupovala podle Kwok aj. (1990), kteří doporučují vnést do sekvence primeru alespoň dva nepárující nukleotidy, jeden na 3´ konci a druhý ve vzdálenosti maximálně 4 míst od 3´ konce, a to tak, aby se v sekvenci primeru ani templátu nevyskytoval v těchto nepárujících místech tymin.

S primery 1F a 2D7-1R a genem CYP2D6 jako templátem se mi podařilo dokázat přítomnost CYP2D7P-specifické sekvence v intronu 1 genu CYP2D6. Tento jev se označuje jako konverze 2D6/2D7. Jedná se o záměnu 7 nukleotidů v pozicích +214, 221, 223, 227, 232, 233 a 245 (Soyama aj., 2002). Tato změna brání připojení primeru 1R a znemožní tak průběh PCR. Ve vyšetřovaném souboru pacientů bylo 9 homozygotních pro konverzi v intronu 1. Konverze je spojena s alelami *2A, *2M, *14B, *21B, *41A, *51, *56 a *58 a je doprovázena

mutací

2850

C>T

(neplatí

to

však

naopak)

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). Biologický význam intronových sekvencí nebyl dosud zcela objasněn. I zde pravděpodobně samotná konverze nemá na funkci proteinu vliv. Významné jsou ale mutace, které konverze v jednotlivých alelách doprovází (např. 1758G>A: alela *14B nebo 2988G>A: alela *41A). Alela *41, objevená v roce 2004, je schopna předpovědět přes 60% IM (Roberts a Kennedy, 2006). Sníženou aktivitu enzymu způsobuje 2988G>A, mutace v intronu 6, která sice neleží v konsenzuální sekvenci místa sestřihu, ale předpokládá se, že má vliv na průběh sestřihu (Toscano aj., 2006). Kromě 2988G>A a konverze v intronu 1 je tato alela dána 1661G>C,

2850C>T,

4180G>C

a

sekvenčními

změnami

v promotorové

oblasti

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). Zajímavé jsou výsledky analýzy některých pacientů homozygotních pro mutaci 2988G>A (např. tab. 4, pacient č. 66). Tito pacienti by měli být homozygotní také pro konverzi v intronu 1 a PCR exonu 1 by proto měla být neúspěšná. Exon 1 se však 48

amplifikovat dařilo. U některých pacientů se navíc ukázalo, že mutace 2988G>A není vždy doprovázena 1661G>C a 2850C>T (tab. 4, pacienti č. 6, 43, 59, 66). Pravděpodobně se může jednat o nové subtypy alely *41 obsahující 2988 G>A bez některých doplňkových mutací. Pro nepřímý důkaz genové konverze lze také použít multiplex PCR s primery 1F, 2D7/2D6-1R a 1R (obr. 20). V této reakci dojde k amplifikaci kontrolní CYP2D7P-specifické sekvence, a je proto zamítnuta falešně negativní PCR. Navrhla jsem tedy 2 možné způsoby, kterými lze detekovat konverzi v homozygotním stavu. Heterozygotní stav bych například testovala ve dvou reakcích, které jsem znázornila na obrázku 30. Pro tyto reakce by však bylo třeba nejdříve navrhnout nové primery, a to 1F* a 1R*, které by oba byly CYP2D6specifické. Jako templát by v tomto případě sloužila genomová DNA.

Obr. 30: Navržený postup pro detekci konverze v homozygotním i heterozygotním stavu. Paralelně probíhají 2 PCR, z nichž jedna slouží k detekci konvertované sekvence a druhá k detekci standardní sekvence. V každé reakci se syntetizuje kontrolní oblast, která slouží k vyloučení falešně negativní PCR. Panserat aj. (1995) uvádějí, že u jedince s genotypem *5/*13 také úspěšně amplifikovali všechny exony s výjimkou exonu 1. Alely *13 a *16 jsou hybridní geny, jejichž 5´ oblast genu je CYP2D7P-specifická. Testovala jsem proto jedince s neúspěšnou PCR exonu 1 na přítomnost těchto dvou alel. Žádný jedinec se však nejevil pozitivní. Primery 71F a 24R jsou navrženy tak, že by měly odhalit obě hybridní alely, *13 i *16 (příloha č. 4). Tyto primery tedy slouží k jejich základnímu určení. Jednotlivé hybridní alely lze následně přesně rozlišit pomocí primerů IN6-7 a JM3 (CYP2D6*16) a pomocí primerů P1 a P2 (CYP2D6*13). Pro alelu *13 jsem neměla k dispozici kontrolní DNA, nemohla jsem tedy ani optimalizovat podmínky pro úspěšnou detekci této alely. Na základě negativních výsledků PCR s primery 71F a 24R však mohu říci, že ve vyšetřovaném souboru nebyl žádný z pacientů nositelem hybridní alely, a tedy ani alely *13.

49

Ve farmakoterapii představují problém pacienti nereagující při standardním dávkování na léčbu. Jedná se o jedince s rychlým metabolismem. Molekulárně genetickým základem tohoto fenotypu může být duplikace funkčních alel genu CYP2D6. Pro testování genové duplikace jsem si vybrala sedm pacientů, kteří byli dextrometorfanovým testem stanoveni jako UM a dále jedince nesoucí alely *1 a *2. Jako duplikace-pozitivní byl pouze jeden pacient (tab. 4, pacient č. 36). Velmi nízká hodnota MR (0,000064) u něj potvrdila, že se jedná o UM (pro srovnání MR např. pacienta č. 20 byl 0,0334). Sekvencováním se ukázalo, že jedinec je homozygotní pro alelu *1. Současně jsem u něj prokázala genovou deleci. Tento pacient byl tedy nositelem dvou genových přestaveb, duplikace a delece, a jeho genotyp jsem určila jako *1x2/*5. Ostatní testovaní pacienti byli duplikace-negativní, přestože fenotyp některých z nich byl na základě MR stanoven jako rychlý. Duplikace funkčních genů se tedy vyskytovala u 1,5% jedinců. Vyšší frekvenci duplikace našli Steijns a Weide (1998), kteří k její detekci také použili primery 17F, 32R a 207F. Mezi 202 vyšetřovanými jedinci našli 8 duplikace-pozitivních, s následujícími genotypy: *2x2/*2 (5x), *1x2/*1 (2x) a *4x2/*4 (1x). Duplikace funkčních genů CYP2D6 se v této studii vyskytovala u 3,5% jedinců. Pacient s genotypem *4x2/*4 nebyl klasifikován jako UM, neboť jeho obě alely (nulové) nekódují funkční protein. Duplikace funkčních genů však vysvětluje pouze část (10-30%) UM pozorovaných v kavkazské populaci. V ostatních případech se může jednat o multiduplikace. PCR s primery 17F, 32R a 207F však není schopna zachytit více než dvě genové kopie. Johansson aj. (1993) vyšetřovali rodiny, které vykazovaly velmi rychlý metabolismus debrisoquinu. Na základě analýzy RFLP zjistili u jedné rodiny přenos třinácti genových kopií. Jednalo se o multiduplikaci alel *2. Pozornost je také věnována polymorfismům v oblasti promotoru a v 5´ kódujících oblastech, které mohou být příčinou rychlého metabolizmu. Løvlie aj. (2001) hledali tyto sekvenční změny u duplikace-negativních jedinců s fenotypem UM. Zjistili signifikantně vyšší frekvenci 31G>A u UM oproti EM. Polymorfismus 31G>A určuje spolu s 2850C>T alelu *35. Zajímavé je také vyšší zastoupení –1584C>G, polymorfismu v oblasti promotoru. Tento polymorfismus se nachází uvnitř Alu-repetice, což může mít podle autorů funkční význam. Navíc přišli se zajímavou myšlenkou, která by mohla vysvětlit rychlý fenotyp. Pseudogen CYP2D7P obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, 137insT, která mění čtecí rámec. Na základě vyšší frekvence genových konverzí a rekombinací v lokusu CYP2D autoři předpokládali, že oblast exonu 1 pseudogenu CYP2D7P může být konvertována zpět na

50

originální sekvenci CYP2D6. Exprese CYP2D7P by pak měla stejný efekt jako duplikace CYP2D6. Tato domněnka však nebyla potvrzena. Na základě dextrometorfanového testu bylo ve vyšetřovaném souboru pacientů stanoveno 7 UM. Pouze jeden z nich byl nositelem duplikace funkčního genu. Žádný z těchto sedmi UM nebyl nositelem sekvenční změny 31G>A. Genetickou podstatu rychlého metabolismu většiny vyšetřovaných pacientů se mi tedy nepodařilo určit. Je možné, že někteří jedinci byli nositeli více než dvou genových kopií, nebo mohli být nositeli sekvenční změny v oblasti promotoru, kterou jsem v rámci diplomové práce nevyšetřovala. Protože indukce enzymu CYP2D6 není možná, je dán rychlý metabolismus pouze genetickými faktory, které však nejsou všechny zcela známy. V literatuře zatím nebyla kromě duplikace a multiplikace funkčních genů žádná jasná příčina rychlého metabolismu popsána.

Další častou strukturní variantou genu CYP2D6 je delece. Zpočátku se v laboratoři delece genu CYP2D6 detekovala podle Daly a Steward (1995) pouze s primery 13F a 24R. Tyto primery jsou navrženy tak, že nasedají za místa zlomu a v případě delece se při PCR tvoří produkt délky 3,5 kb. Metoda má však nevýhodu, že neodliší delece-negativní výsledky od falešně negativní PCR. Zvláště jde-li o dlouhé úseky, je nutné počítat s možnými neúspěchy při syntéze. Vycházela jsem proto z metody, kterou zavedli Sistonen aj. (2005). Do reakce je přidán primer 207F, který spolu s primerem 24R umožní syntézu kontrolního fragmentu délky 3,0 kb. Pro reakci bylo třeba použít takové koncentrace primerů, které zajistí tvorbu vyváženého množství produktů. Problém však byl také s rozdělením produktů na 1% agaróze. Produkty PCR (3,0 kb a 3,5 kb) se mi podařilo rozdělit při napětí 4 V/cm. Při vyšším napětí k rozdělení produktů nedošlo a produkty se chovaly jako jeden fragment. Ve vyšetřovaném souboru pacientů se delece genu CYP2D6 (alela *5) vyskytovala s frekvencí 5,1%. Pacienti byli heterozygotními nositeli alely *5. Při sekvencování vykazovali homozygotnost, což odpovídá faktu, že nesou pouze jednu alelu. Delece byla doprovázena alelami *1 (2x), *2 (1x), *4 (3x), *41 (1x). Žádný pacient nebyl homozygotním nositelem alely *5. Taková sestava alel však známa je, jak uvádějí např. Ledesma a Agúndez (2005), kteří při vyšetřování 640 pacientů identifikovali jednoho jedince s genotypem *5/*5. Fukuda aj. použili pro detekci delece genu CYP2D6 dvě různé sady primerů: 13F/24R a D1/D2 (příloha č. 3). 4 ze 771 vzorků vykazovaly pozitivní výsledky pouze s primery 13F/24R, PCR s primery D1/D2 byla negativní. Zjistili, že se u těchto vzorků nejedná o deleci, ale o neobvyklou strukturu genu CYP2D6. Inzercí určité části sekvence došlo k vytvoření nového místa nasedání primeru 13F a výsledek byl tedy falešně pozitivní. Autoři 51

proto doporučují použít pro detekci delece alespoň dvě různé sady primerů nasedající na různé pozice. S podobnými výsledky jsem se setkala při testování delece u pacienta č. 65. Tento pacient byl delece-pozitivní s primery 13F/24R. S primery 71F/24R byl delece-negativní. S těmito primery, navrženými pro detekci hybridních alel *13 a *16, dochází v případě delece k syntéze fragmentu délky 9,5 kb. Vzhledem k častým přestavbám v lokusu CYP2D je tedy možné, že i u tohoto pacienta k nějaké strukturní změně došlo. Může se jednat o získání nového místa pro navázání některého z primerů 13F/24R nebo o ztrátu místa pro navázání některého z primerů 71F/24R.

Polymorfismus se netýká pouze genu CYP2D6 ale i obou pseudogenů. V exonu 7 pseudogenu CYP2D7P jsem u dvou vzorků DNA pacientů zachytila sekvenční změnu. Jednalo se o 3212C>T. Tato změna jedné báze umožnila navázání primeru 4A na pseudogen a jeho následnou amplifikaci. V jedné reakci byl tedy amplifikován gen CYP2D6 spolu s pseudogenem CY2D7P. Výsledek sekvencování s přímým primerem 1A byl u obou vzorků stejný. Sekvence byla do určitého místa čitelná a od tohoto místa dále vykazovala stejnou formu jakoby se jednalo o heterozygotní deleci nebo inzerci jedné báze. Během sekvencování těchto dvou vzorků se zpětným primerem 4A byl výsledek opět stejný. Sekvence byla čitelná jen do určitého místa. To odpovídá faktu, že intron 5 pseudogenu CYP2D7P se od intronu 5 genu CYP2D6 liší přítomností jedné báze navíc, která způsobí posunutí a nečitelnost sekvence. Intron 6 pseudogenu CYP2D7P se od intronu 6 genu CYP2D6 liší delecí jedné báze, sekvence je proto od tohoto místa dále opět čitelná. Exony 5+6+7 se mi podařilo amplifikovat pomocí nested PCR za použití genu CYP2D6 jako templátu, žádnou neobvyklou změnu (inzereci nebo deleci) jsem u nich nepozorovala. Nečitelnost sekvence exonů 5+6+7 u dvou pacientů tedy nebyla dána mutací v genu CYP2D6, ale sekvenční změnou v pseudogenu CYP2D7P. Tato změna nemá na fenotyp pacientů vliv.

Při porovnávání fenotypů přiřazených na základě genotypů s fenotypy stanovenými na základě dextrometorfanového testu jsem se setkala s jevem, který se označuje jako fenokopie. Pacienti, kteří byli molekulárně genetickým vyšetřením stanoveni jako EM, vykazovali velmi vysoké hodnoty MR typické pro PM (např. pacient č. 47: MR = 1,4559; pacient č. 48: MR = 4,011). U těchto pacientů došlo ke snížení metabolické aktivity CYP2D6 vlivem inhibičních látek. Nejčastěji jde o léčiva, která způsobí utlumení funkce enzymu. Dojde tak ke změně fenotypu např. z EM na PM. 52

Individuální genetické rozdíly CYP2D6 ovlivňují metabolismus některých léčiv. Mohou se objevit nežádoucí účinky, variace v terapeutické účinnosti nebo dokonce kompletní rezistence k léčbě. Vyšetření genotypu před začátkem terapie může pomoci identifikovat rizikové pacienty, zlepšit výběr vhodného léku a stanovit počáteční dávkování. Jako referenční metoda pro eliminaci farmakokinetických rozdílů slouží monitorování hladin léku in vivo. Kromě genetického základu zachytí i negenetické faktory mající vliv na efekt léčby. Je však možné jen u omezeného počtu léčiv a často vyžaduje opakované měření. Měření je závislé na podání testovací látky a znamená pro pacienta s defektním metabolismem jisté riziko. Vzhledem k interakci s ostatními léky je vhodné, aby pacienti zůstali po určitou dobu neléčeni, což je další problém. Molekulárně genetické metody naproti tomu vyžadují pouze jednorázový odběr krve, jsou specifické a nezávislé na ostatních podávaných lécích. Pokud má být genotyp stanoven v určitém časovém limitu před začátkem terapie, je třeba, aby zvolená metoda byla rychlá a spolehlivá a dále by měla být schopna detekovat všechny významné polymorfismy specifické pro danou populaci (Müller aj., 2003).

Vyšetřování CYP2D6 na OLG FN v Brně patřilo mezi první v České Republice. Alely typické pro naši populaci nebyly doposud nikým popsány, bylo možné je pouze předpovědět na základě frekvence alel v celé kavkazské populaci. Z toho důvodu považuji za vhodné, že byla k detekci alel CYP2D6 vybrána sekvenační analýza. Tato metoda je schopna zachytit co nejvíce změn, zatímco ostatní metody jsou omezeny na detekci určitých polymorfismů. Na základě sekvenčních změn stanovených během této studie, bych pro následná vyšetřování využila některou rychlejší metodu, např. PCR v reálném čase a zaměřila bych se pouze na detekci těchto mutací: 100C>T, 1661G>C, 1846G>A, 2850C>T, 2988G>A, 4180 G>C, delece a duplikace.

53

6. SOUHRN Detekce mutací v genu CYP2D6 cytochromu P450 – jejich vliv na metabolismus léčiv Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6) je enzym odpovědný za metabolismus mnoha běžně užívaných léčiv jako jsou antidepresiva, neuroleptika, beta blokátory a antiarytmika. Individuální rozdíly v aktivitě CYP2D6 jsou primárně dány genetickým polymorfismem CYP2D6. V současnosti je známo více než 100 různých alel. Důsledky polymorfního metabolismu jsou zvýšené riziko nepříznivých reakcí nebo nedostatek terapeutické odpovědi. Pro detekci mutací v genu CYP2D6 u 66 nepříbuzných pacientů, léčených pro depresivní nebo úzkostné poruchy, byla použita long PCR a přímé sekvencování DNA. Byly specificky amplifikovány dva úseky zahrnující exony 3-7, ve kterých se nachází nejvíce sekvenčních změn Produkty PCR byly sekvencovány. Long PCR byla použita k detekci delece a duplikace genu CYP2D6. Pro přesné určení alel byla analýza doplněna o exony 1 a 9. Přímým sekvencováním exonů 3-7 byly stanoveny alely *1, *2, *4, *10 a *41, s frekvencemi 36,8%, 18,9%, 18,2%, 6,8% a 11,4%. Delece genu CYP2D6 se vyskytovala s frekvencí 5,3%. Pouze jeden vzorek DNA byl duplikace-pozitivní. U 9 vzorků DNA byla identifikována genová konverze v intronu 1 v homozygotním stavu. V exonu 7 pseudogenu CYP2D7P byla detekována sekvenční změna 3212C>T. Na základě stanovených genotypů byly přiřazeny odpovídající metabolické typy, které byly porovnány s fenotypy stanovenými dextrometorfanovým testem. Frekvence identifikovaných alel souhlasí s frekvencemi dříve popsanými pro kavkazskou populaci. V rámci diplomové práce byla zavedena DNA diagnostika alel CYP2D6. Přímé sekvencování vybraných exonů a long PCR jsou vhodné metody pro identifikaci alel CYP2D6 typických pro kavkazskou populaci.

54

7. SUMMARY The detection of the mutations in the CYP2D6 gene of the cytochrome P450 – their influence on the metabolism of drugs The cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) is an enzyme responsible for the metabolism of many commonly used drugs such as antidepressants, neuroleptics, beta blockers and antiarrhythmics. Individual differences in the CYP2D6 activity are primarily due to the genetic polymorphism of the CYP2D6. At present, more than 100 different alleles are known. The consequences of the polymorphic metabolism are the increased risk of adverse reactions or the lack of the therapeutic response. Long PCR and direct DNA sequencing were used for the detection of the mutations in the CYP2D6 gene in 66 unrelated patients treated for depression or anxiety disorders. Two sections spanning exons 3-7, in which most sequence alterations are located, were amplified. PCR products were sequenced. Long PCR was used for the detection of the deletion and the duplication of the CYP2D6 gene. For the precise determination of alleles, the analysis was supplemented with exons 1 and 9. By direct sequencing of exons 3-7, alleles *1, *2, *4, *10 and *41 with frequencies 36,8%, 18,9%, 18,2%, 6,8% and 11,4% were determined. The frequence of the deletion of the CYP2D6 gene was 5,3%. Only one sample of DNA was duplication-positive. In 9 DNA samples was identified a gene conversion in intron 1 in the homozygous state. The sequence change 3212C>T was detected in exon 7 of the CYP2D7P pseudogene. According to the genotype, corresponding types of metabolism were assigned, which were compared with the fenotypes from the dextrometorfan test. The frequencies of the identified alleles are in agreement with the frequencies charactered in the caucasian population. Within the graduation theses, DNA diagnostic of alleles CYP2D6 was introduced. Direct sequencing of selected exons and the long PCR are appropriate methods for the identification of alleles CYP2D6, which are typical of the caucasian population.

55

8. LITERATURA

1.

Bertilsson, L., Dahl, M.-L., Dalén, P. and Al-Shurbaji, A. 2002. Molecular

genetics of CYP2D6: Clinical relevance with focus on psychotropic drugs. Br. J. Clin. Pharmacol. 53: 111-112. 2.

Bialecka, M., Klodowska-Duda, G., Honczarenko., K., Gawronska-Szklarz, B.,

Opala, G., Safranow, K. and Drozdzik, M. 2007. Polymorphisms of catechol-Omethyltransferase (COMT), monoamine oxidase B (MAOB), N-acetyltransferase 2 (NAT2) and cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) gene in patients with early onset of Parkinson´s disease. Parkinsonism Relat. Disord., in Press. 3.

Bodin, L., Beaune, P. H. and Loriot M.-A. 2005. Determination of Cytochrome

P450 2D6 (CYP2D6) Gene Copy Number by Real-Time Quantitative PCR. J. Biomed. Biotechnol. 3: 248-253. 4.

Borges, S., Desta, Z., Li, L., Skaar, T. C., Ward, B. A., Nguyen, A., Jin, Y.,

Storniolo, A. M., Nikoloff, D. M., Wu, L., Hillman, G., Hayes, D. F., Stearns, V. and Flockhart, D. A. 2006. Quantitative effect of CYP2D6 genotype and inhibitors on tamoxifen metabolism: implication for optimization of breast cancer treatment. Clin. Pharmacol. Ther. 80 (1): 61-74. 5.

Broly, F., Marez, D., Sabbagh, N., Legrand, M., Millecamps, S., Guidice, J. M.,

Boone, P. and Meyer, U. A. 1995. An efficient strategy for detection of known and new mutations of the CYP2D6 gene using single strand conformation polymorphism analysis. Pharmacogenetics 5 (6): 373-384. 6.

Caraco, Y. 2004. Genes and the Response to Drugs. N. Engl. J. Med. 351 (27):

2867-2869. 7.

Daly, A. K. and Steward, A. 1995. Use of the Expand™ Long Template PCR

System in Genotyping for Polymorphisms in the Human Cytochrome P450 CYP2D6 Gene. Biochemica 4: 31-32. 8.

Daly, A. K., Fairbrother, K. S., Andreassen, O. A., London, S. J., Idle, J. R.

and Steen, V. M. 1996. Characterization and PCR-based detection of two different hybrid CYP2D7P/CYP2D6

alleles

associated

with

the

poor

metabolizer

phenotype.

Pharmacogenetics 6: 319-328.

56

9.

Daly, A. K., Leathart, J. B. S., London, S. and Idle, J. R. 1995. An inactive

cytochrome P450 allele containing a deletion and a base substitution. Hum. Genet. 95: 337-341. 10.

Denson, J., Wu, Y., Yang, W. and Zhang, J. 2005. Inter-individual variation of

several cytochrome P450 2D6 splice variants in human liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 330: 498-504. 11.

Dorado, P., Berecz, R., Penas-Lledo, E. M., Caceres, M. C. and Llerena, A.

2006. Clinical implications of CYP2D6 genetic polymorphism during treatment with antipsychotic drugs. Curr. Drug Targets 7 (12): 1671-1680. 12.

Fukuda, T., Maune, H., Ikenaga, Y., Naohara, M., Fukuda, K. and Azuma, J.

2005. Novel Structure of the CYP2D6 Gene that Confuses Genotyping for the CYP2D6*5 Allele. Drug Metab. Pharmacokinet. 20 (5): 345-350. 13.

Gaedigk, A., Blum, M., Gaedigk, R., Eichelbaum, R. and Meyer, U. A. 1991.

Deletion of the Entire Cytochrome P450 Gene as a Cause of Impaired Drug Metabolism in Poor Metabolizers of the Debrisoquine/Sparteine Polymorphism. Am. J. Hum. Genet. 48: 943-950. 14.

Goetz, M. P., Knox, S. K., Suman, V. J., Rae, J. M., Safgren, S. L., Ames, M.

M., Visscher, D. W., Reynolds, C., Couch, F. J., Lingle, W. L., Weinshilboum, R. M., Fritcher, E. G., Nibbe, A. M., Desta, Z., Nguyen, A., Flockhart, D. A., Perez, E. A. and Ingle, J. N. 2007. The impact of cytochrome P450 2D6 metabolism in women receiving adjuvant tamoxifen. Breast Cancer Res. Treat. 101 (1): 113-121. 15.

Heller, T., Kirchheiner, J., Armstrong, V. W., Luthe, H., Tzvetkov, M.,

Brockmoller, J. and Oellerich, M. 2006. AmpliChip CYP450 GeneChip: a new gene chip that allows rapid and accurate CYP2D6 genotyping. Ther. Drug Monit. 28 (5): 673677. 16.

Hersberger, M., Marti-Jaun, J., Rentsch, K. and Hänseler, E. 2000. Rapid

Detection of the CYP2D6*3, CYP2D6*4, and CYP2D6*6 Alleles by Tetra-Primer PCR and of the CYP2D6*5 Allele by Multiplex Long PCR. Clin. Chem. 46 (8): 1072-1077. 17.

Chou, W.-H., Yan, F.-X., Robbins-Weilert, D. K., Ryder, T. B., Liu, W. W.,

Perbost, C., Fairchild, M., Leon, J., Koch, W. H. and Wedlung, P. J. 2003. Comparison of Two CYP2D6 Genotyping Methods and Assessment of Genotype-Phenotype Relationships. Clin. Chem. 49 (4): 542-551.

57

18.

Ingelman-Sundberg, M. 2005. Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2D6

(CYP2D6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity. Pharmacogenomics J. 5: 5-16. 19.

Ismail, R. and Teh, L. K. 2006. The relevance of CYP2D6 genetic polymorphism

on chronic metoprolol therapy in cardiovascular patients. J. Clin. Pharm. Ther. 31: 99-109. 20.

James, H. M., Coller, J. K., Gillis, D., Bahnisch, J., Sallustio, B. C. and

Somogyi, A. A. 2004. A new simple diagnostic assay for the identification of the major CYP2D6 genotypes by DNA sequencing analysis. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 42 (12): 719-723. 21.

Ji, L., Pan, S., Marti-Jaun, J., Hänseler, E., Rentsch, K. and Hersberger, M.

2002. Single-Step Assays to Analyze CYP2D6 Gene Polymorphisms in Asians: Allele Frequencies and a Novel *14B Allele in Mainland Chinese. Clin. Chem. 48 (7): 983-988. 22.

Johansson, I., Lundqvist, E., Bertilsson, L., Dahl, M. L., Sjöqvist, F. and

Ingelman-Sundberg. 1993. Inherited amplification of an active gene in the cytochrome P450 CYP2D locus as a cause of ultrarapid metabolism of debrisoquine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11825-11829. 23.

Jong, M. M., Nolte, I. M., Meerman, G. J., Graaf, W. T. A., Oosterwijk, J. C.,

Kleibeuker, J. H., Schaapveld, M. and Vries, E. G. E. 2005. Genes other BRCA1 and BRCA2 involved in breast cancer susceptibility. J. Med. Genet. 39: 225-242. 24.

Juřica, J. 2004. Cytochrom P450 a klinicky významné interakce. Rigorózní práce,

VFU Brno. 25.

Kagimoto, M., Heim, M., Kagimoto, K., Zeugin, T. and Meyer, U. A. 1990.

Multiple Mutations of the Human Cytochrome P450IID6 Gene (CYP2D6) in Poor Metabolizers of Debrisoquine. J. Biol. Chem. 265 (28): 17209-17214. 26.

Kimura, S., Umeno, M., Skoda, R. C., Meyer, U. A. and Gonzalez, F. J. 1989.

The Human Debrisoquine 4-Hydroxylase (CYP2D) Locus: Sequence and Identification of the Polymorphic CYP2D6 Gene, a Related Gene, and a Pseudogene. Am. J. Hum. Genet. 45 (6): 889-904. 27.

Kwok, S., Kellogg, D. E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and

Sninsky, J. J. 1990. Effects of primer–template mismatches on the polymerase chain reaction: Human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucleic Acids Res. 18 (4): 999-1005. 28.

Lavandera, J. V., Parera, V. E., Batlle, A. and Buzaleh, A. M. 2006. CYP2D6

Polymorphisms in Patients with Porphyrias. Mol. Med. 12 (9-10): 259-263. 58

29.

Ledesma, M. C. and Agúndez, J. A. G. 2005. Identification of Subtypes of

CYP2D Gene Rearrangements among Carriers of CYP2D6 Gene Deletion and Duplication. Clin. Chem. 51 (6): 939-943. 30.

Løvlie, R., Daly, A. K., Matre, G. E., Molven, A. and Steen, V. M. 2001.

Polymorphisms in CYP2D6 duplication-negative individuals with the ultrarapid metabolizer phenotype: a role for the CYP2D6*35 allele in ultrarapid metabolism? Pharmacogenetics 11: 45-55. 31.

Løvlie, R., Daly, A. K., Molven, A., Idle, J. R. and Steen, V. M. 1996. Ultrarapid

metabolizers of debrisoquine: Characterization and PCR-based detection of alleles with duplication of the CYP2D6 gene. FEBS Letters 392: 30-34. 32.

Marez, D., Legrand, M., Sabbagh, N., Guidice, J.-M., Spire, C., Lafitte, J.-J.,

Meyer, U. A. and Broly, E. 1997. Polymorphism of the cytochrome P450 CYP2D6 gene in a European population: characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequencies and evolution. Pharmacogenetics 7: 193-202. 33.

Müller, B., Zöpf, K., Bachofer, J. and Steimer, W. 2003. Optimized Strategy for

Rapid Cytochrome P450 2D6 Genotyping by Real-Time Long PCR. Clin. Chem. 49 (10): 1624-1631. 34.

Nobumitsu, H., Kimura, S., Meyer, U. A. and Gonzalez, F. J. 1990. The Human

CYP2D Locus Associated with a Common Genetic Defect in Drug Oxidation: A G1934→A Base Change in Intron 3 of a Mutant CYP2D6 Allele Results in an Aberrant 3´ Splice Recognition Site. Am. J. Hum. Genet. 47: 994-1001. 35.

Panserat, S., Mura, C., Gérard, N., Vincent-Viry, M., Galteau, M. M., Jacqz-

Aigrain, E. and Krishnamoorthy, R. 1995. An unequal cross-over event within the CYP2D gene cluster generates a chimeric CYP2D7/CYP2D6 gene which is associated with the poor metabolizer phenotype. Br. J. Clin. Pharmacol. 40: 361-367. 36.

Rathbone, D. L., Ali, A., Antonaki, P. and Cheek, S. 2005. Towards a polymeric

binding mimic for cytochrome CYP2D6. Biosens. Bioelectron. 20: 2353-2363. 37.

Roberts, R. L. and Kennedy, M. A. 2006. Rapid detection of common

cytochrome P450 2D6 alleles in Caucasians. Clin. Chim. Acta 366: 348-351. 38.

Rowland, P., Blaney, F. E., Smyth, M. G., Jones, J. J., Leydon, V. R., Oxbrow,

A. K., Lewis, C. J., Tennant, M. G., Modi, S., Eggleston, D. S., Chenery, R. J. and Bridges, A. M. 2006. Crystal Structure of Human Cytochrome P450 2D6. J. Biol. Chem. 281 (11): 7614-7622.

59

39.

Sachse, Ch., Brockmöller, J., Bauer, S. and Roots, I. 1997. Cytochrome P450

2D6 Variants in a Caucasian Population: Allele Frequencies and Phenotypic Consequences. Am. J. Hum. Genet. 60: 284-295. 40.

Sistonen, J., Fuselli, S., Levo, A. and Sajantila, A. 2005. CYP2D6 Genotyping

by a Multiplex Primer Extension Reaction. Clin. Chem. 51 (7): 1291-1294. 41.

Skoda, R. C., Gonzalez, F. J., Demierre, A. and Meyer, U. A. 1988. Two mutant

alleles of the human cytochrome P-450db1 gene (P450C2D1) associated with genetically deficient metabolism of debrisoquine and other drugs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5240-5243. 42.

Soyama, A., Saito, Y., Komamura, K., Ueno, K., Kamakura, S., Ozawa, S. and

Sawada, J. 2002. Novel single nucleotide polymorphisms in the CYP2D6 gene associated with CYP2D6*2 and/or CYP2D6*10 alleles. Drug Metab. Pharmacokin. 17 (5): 475-478. 43.

Stamer, U. M., Bayerer, B., Wolf, S., Hoeft, A. and Stüber, F. 2002. Rapid and

Reliable Method for Cytochrome P450 2D6 Genotyping. Clin. Chem. 48: 1412-1417. 44.

Steijns, L. S. W. and Weide, J. 1998. Ultrarapid drug metabolism: PCR-based

detection of CYP2D6 gene duplication. Clin. Chem. 44 (5): 914-917. 45.

Torre, R., Farré, M., Mathúna, B. Ó., Roset, P. N., Pizarro, N., Segura, M.,

Torrens, M., Ortuno, J., Pujadas, M. and Camí, J. 2005. MDMA (ecstasy) pharmacokinetics in a CYP2D6 poor metaboliser and in nine CYP2D6 extensive metabolisers. Eur. J. Clin. Pharmacol. 61: 551-554. 46.

Toscano, C., Klein, K., Blievernicht, J., Schaeffeler, E., Saussele, T.,

Raimundo, S., Eichelbaum, M., Schwab, M. and Zanger, U. M. 2006. Impaired expression of CYP2D6 in intermediate metabolizers carrying the *41 allele caused by the intronic SNP 2988 G>A: evidence for modulation of splicing events. Pharmacogenet. Genomics 16 (10): 755-66. 47.

Weide, J. and Steijns, L. S. W. 1999. Cytochrome P450 enzyme system: genetic

polymorphisms and impact on clinical pharmacology. Ann. Clin. Biochem. 36: 722-729. 48.

Zanger, U. M., Raimundo, S. and Eichelbaum, M. 2004. Cytochrome P450 2D6:

overview and update on pharmacology, genetics, biochemistry. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 369: 23-37. 49.

Zhuge, J., Yu, Y. N. and Wu, X. D. 2004. Stable expression of human cytochrome

P450 2D6*10 in HepG2 cells. World J. Gastroenterol. 10 (2): 234-237.

60

9. PŘÍLOHY

Příloha č. 1: Hmotnostní standardy Příloha č. 2: Místa připojení primerů 17F, 32R a 207F Příloha č. 3: Místa připojení primerů 13F, 24R, D1 a D2 Příloha č. 4: Hybridní geny a místa připojení primerů použitých k jejich detekci Příloha č. 5: Sekvence genu CYP2D6 s vyznačenými místy nasedání primerů Příloha č. 6: Výsledek sekvencování exonu 9 s primery 8F a 9R-new Příloha č. 7: CYP2D6-specifická sekvence v intronu 1 genu CYP2D6 Příloha č. 8: CYP2D7P-specifická sekvence v intronu 1 genu CYP2D6 Příloha č. 9: Standardní sekvence exonu 7 pseudogenu CYP2D7P Příloha č. 10: Sekvenční změna v exonu 7 pseudogenu CYP2D7P Příloha č. 11: Publikace a prezentace výsledků

61