1 ÚVOD 1.1 Bakterie ve vodách a jejich rozdělení Voda je jedním z přirozených prostředí výskytu mikroorganismů, z nichž bakterie jsou považovány za nejvýznamnější a nejpočetnější skupinu. Nicméně rozdělení bakterií vyskytujících se ve vodním prostředí a jejich zařazení do taxonomických skupin je komplikované. Důvodem jsou především - nejasná definice taxonomických skupin, vysoká variabilita mezi členy jedné taxonomické skupiny a nejasný vztah mezi taxony a jejich ekologickou úlohou (Straškrabová a kol., 1996). V mikrobiologii vody se běžně využívá rozdělení bakterií podle následujících hledisek: tvaru (koky, tyčky), složení buněčné stěny (grampozitivní, gramnegativní), způsobu získávání živin (autotrofní, heterotrofní) a energie (chemotrofní, fototrofní), vztahu ke kyslíku (aerobní, fakultativně anaerobní, anaerobní, mikroaerofilní), původu v prostředí (autochtonní, alochtonní), jejich hygienického významu (patogenní, potenciálně patogenní, nepatogenní), indikačních schopností (indikátory fekálního znečištění, indikátory organického znečištění), schopnosti degradovat a transformovat chemické sloučeniny (bakterie degradující a transformující sloučeniny uhlíku, dusíku, síry apod. – fyziologické skupiny) či genetické a fylogenetické příbuznosti (fylogenetické skupiny). Klasické studium bakterií vodního prostředí spočívá v měření jejich aktivit (metabolický potenciál, úroveň chemické transformace, kinetická měření apod.), odhadu množství mikrobiální biomasy (pomocí stanovení množství organické hmoty, proteinů, ATP, lipidů apod.), mikroskopickém pozorování (zejména pomocí fluorescenční mikroskopie) a kultivačním stanovení (Brenner a kol., 2005a; Delahaye a kol., 2003). Běžné postupy používané k izolaci bakterií z vodního prostředí jsou založeny na kultivačních metodách. Ty mají nezastupitelnou úlohu zejména při mikrobiologickém rozboru pitných, povrchových a odpadních vod. Nicméně nejsou schopny postihnout rozmanité životní podmínky vodního prostředí a proto neumožňují detekci všech přítomných bakterií, ale jen asi 0,01–0,1 % (Straškrabová a kol., 1996). Použití těchto metod navíc komplikuje fakt, že některé bakterie, které lze jinak běžně vykultivovat, za stresových podmínek (hladovění, neoptimální teplota růstu, zvýšený osmotický tlak, nevhodné světelné podmínky apod.) omezují svoji metabolickou aktivitu a stávají se nekultivovatelnými (viable but nonculturable, VBNC); za příznivých podmínek jsou tyto bakterie schopné opět svoji metabolickou aktivitu obnovit. Tento stav byl zjištěn např. u bakterií podrobených chloraci odpadních vod (Oliver, 2005). Nové přístupy studia bakterií ve vodním prostředí vycházejí z informací uložených přímo v genomu bakterií, který je odlišný od genomu eukaryotických organismů. Bakteriální genom se skládá z jádra a plazmidů. Prokaryotické jádro (nukleoid) je obvykle tvořeno jednou kružnicovou molekulou dvouřetězcové DNA (dsDNA), na které jsou umístěny všechny pro život nepostradatelné geny. Jádro není ohraničeno od cytoplazmy jadernou membránou a nedělí se mitoticky. Kromě jádra mohou prokaryotické buňky obsahovat i plazmidy, malé kružnicové molekuly dsDNA, nesoucí geny, které nejsou pro život nezbytné, ale mohou být důležité (např. geny rezistence k antibiotikům) (Rosypal, 1
1998). Metody molekulární biologie, které v současné době nacházejí uplatnění v mikrobiologii vody, vycházejí především z primární struktury jaderné DNA a ribozomální RNA (16S rRNA). Jde např. o polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) (Daubner a kol., 1967; Häusler, 1995; Štěpánek a kol., 1979; Amann a kol., 1997; Brenner a kol., 2005a). V této práci byla největší pozornost věnována skupině indikátorových a hygienicky významných bakterií a možnostem jejich izolace a identifikace z vodního prostředí.
1.1.1 Indikátorové bakterie Při rutinním mikrobiologickém rozboru vod není možné stanovovat všechny potenciálně přítomné patogeny, proto byla zavedena koncepce indikátorových organismů, jejichž výskyt ve vodách je odrazem mikrobiologické kvality vod (Tortorello, 2003; WHO, 2004; Štěpánek a kol., 1979; Häusler, 1995). Existují 2 skupiny běžně stanovovaných indikátorů: indikátory organického (obecného) znečištění a indikátory fekálního znečištění.
1.1.1.1 Indikátory organického znečištění Jedná se o uměle vytvořenou skupinu organotrofních mikroorganismů, zahrnující bakterie, kvasinky a plísně, které jsou schopné růst při definované teplotě na obohacených neselektivních médiích bez inhibičního účinku selektivních činidel. Vzhledem k tomu, že nelze zajistit vhodné kultivační podmínky pro všechny přítomné mikroorganismy, lze detekovat pouze jejich malý podíl. Z hygienického hlediska se jedná o skupinu méně významnou, kde jsou zahrnuty zejména autochtonní vodní mikroorganismy a mikroorganismy pocházející z půdy a kořenových systémů rostlin. Průkaz těchto mikroorganismů ve vodách je odrazem celkového mikrobiálního oživení, jejich množství je známkou míry znečištění vodního zdroje snadno rozložitelnými organickými látkami. Stanovení životaschopných mikroorganismů je účelné i z hlediska posouzení účinnosti procesů úpravy vody. Do této skupiny se zařazují mikroorganismy s růstovým optimem kolem 20 a 37 °C schopné růstu na definovaných neselektivních médiích (Häusler, 1995; Bartram a kol., 2003; Maier a kol., 2000). V cizojazyčné literatuře bývají označeny jako HPC (heterotrophic plate counts). Nejčastěji se jedná o zástupce rodu Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium a zástupce enterobakterií a vibrií (Baudišová, 2007). Podle české legislativy jsou do této skupiny zařazeny: Psychrofilní bakterie - jedná se o organotrofní bakterie s růstovým optimem kolem 20 °C, které vytvářejí kolonie na neselektivním živném médiu (masopeptonový agar) po 72 h inkubace (ČSN 75 7842). Jejich stanovení bylo v ČR standardně vyžadováno pro pitné a koupací vody do roku 2004, v současné době není českou legislativou vyžadováno v žádném typu vod.
2
Mezofilní bakterie - jsou organotrofní bakterie, které mají optimum růstu na definovaném neselektivním živném médiu 37 °C a tvoří kolonie po 48 h (ČSN 75 7841). Jejich stanovení bylo rovněž standardně vyžadováno pro pitné a koupací vody do roku 2004, v současné době nejsou stanovovány v žádném typu vod. Kultivovatelné mikroorganismy (stanovované při 22 °C a 36 °C) - do této skupiny se řadí bakterie, kvasinky a plísně, které se množí nejlépe při teplotě 22±2 °C a 36±2 °C. Na definovaném kultivačním médiu (tryptonový agar s kvasničným extraktem) tvoří kolonie po 72 h, respektive po 48 h (Häusler, 1995; ČSN EN ISO 6222). Jejich detekce je vyžadována pro stanovení jakosti pitných vod (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vod (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupališť (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).
1.1.1.2 Indikátory fekálního znečištění Organismy, používané jako fekální indikátory by měly splňovat následující požadavky: nebýt patogenní, být přítomny ve vysokém počtu v exkrementech teplokrevných živočichů, nemnožit se ve vodě, být snadno stanovitelné, přetrvávat ve vodě minimálně stejně dlouhou dobu jako patogeny a být rezistentní k dezinfekčním činidlům a vlivům okolního prostředí podobně jako střevní patogeny (WHO, 2004; Tortorello, 2003). Mezi indikátory fekálního znečištění se řadí bakterie, jejichž přítomnost ve vodě může indikovat kontaminaci střevními patogeny, jako jsou např. salmonely, shigely, patogenní sérovary Escherichia coli, kampylobaktery apod. (Häusler, 1995). Za nejvhodnější bakteriální indikátory fekálního znečištění jsou považovány E. coli, termotolerantní koliformní bakterie a intestinální enterokoky, ačkoli žádný z nich nesplňuje zcela zmíněná kritéria pro fekální indikátory. Mezi další používané fekální indikátory patří koliformní bakterie a Clostridium perfringens, které jsou používány především jako indikátory účinnosti dezinfekčních procesů při úpravě pitné vody (Payment a kol., 1993). Vhodnost a spolehlivost používání fekálních indikátorů je dlouhodobě předmětem odborných diskusí. Noble (2003) zjistil, že stanovení počtu intestinálních enterokoků při testování kvality mořské vody pro rekreaci by mohlo vést k častějším omezením a uzavírkám rekreačních oblastí, jelikož počty intestinálních enterokoků přesahovaly hygienické limity mnohem častěji než počty koliformních a termotolerantních koliformních bakterií. V pitné vodě studoval bakteriální indikátory Collin a kol. (1988), který uvedl, že nejvhodnějším indikátorem pro pitné vody jsou intestinální enterokoky. Atherholt a kol. (2003) hodnotil použití fekálních indikátorů v podzemních vodách a zjistil, že nejspolehlivějším indikátorem fekálního kontaminace podzemních vod jsou koliformní bakterie. Vzhledem ke skutečnosti, že ne všechny koliformní bakterie jsou fekálního původu, navrhnul připojit stanovení termotolerantních koliformních bakterií, E. coli nebo intestinálních enterokoků. Stuart a kol. (1976) ve své studii popsal nízký výskyt bakteriálních indikátorů ve vysokohorských vodách, které indikovaly výskyt přirozených populací hlodavců a losů v dané oblasti.
3
Podle české legislativy jsou mezi fekální indikátory zařazeny: Koliformní bakterie - gramnegativní tyčky, které netvoří spóry, mají negativní cytochromoxidázový test a za aerobních podmínek tvoří kolonie během 24 h kultivace při 36±2 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydu (TNV 75 7837). Definice koliformních bakterií podle ČSN EN ISO 9308–1 je velmi podobná. Za koliformní bakterie byli původně považováni pouze příslušníci rodu Escherichia, Citrobacter, Klebsiella a Enterobacter, ale ukázalo se, že tato skupina je mnohem více heterogenní a zahrnuje i další bakteriální rody, např. Serratia, Hafnia či Rahnella. Je to způsobeno změnami v definicích koliformních bakterií. Do roku 1994 byli za koliformní bakterie považováni zástupci čeledi Enterobacteriaceae, kteří produkují kyselinu a plyn z laktózy během 24–48 hod při 37 °C. Od roku 1994 jsou koliformní bakterie definovány jako gramnegativní bakterie s negativním cytochromoxidázovým testem, které tvoří kyselinu z laktózy během 24–48 hod při 37 °C. V poslední době se uvažuje o další změně definice koliformních bakterií na základě přítomnosti enzymu β-Dgalaktosidázy (Stevens, 2003). Nové metody používané ke stanovení koliformních bakterií založené na stanovení aktivity β-D-galaktosidázy (ONPG test), prvního enzymu účastnícího se štěpení laktózy, mají za následek vznik skupiny koliformních bakterií, která je ovšem mnohem širší než v případě sledování konečných produktů utilizace laktózy. Kmeny fermentující laktózu na kyselinu, příp. plyn musí mít enzym β-D-galaktosidázu, kdežto kmeny s aktivní β-D-galaktosidázou (ONPG pozitivní) nemusí fermentovat laktózu na konečné produkty (Baudišová, 2007). Skupina koliformních bakterií navíc obsahuje jak druhy fekální tak environmentální (Serratia fonticola, Rahnella aquatilis, Buttiauxella agrestis apod.), což poněkud zpochybňuje její použití jako indikátoru fekálního znečištění (Häusler, 1995; WHO, 2004; Veger a kol., 1996; Tortorello, 2003). Používá se ale stále jako indikátor účinnosti úpravy pitné vody v distribuční síti (McFeters a kol., 1986). Stanovení je nadále vyžadováno pro povrchové vody (Nařízení vlády [NV] 229/2007), pro pitné vody (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balené vody (Vyhl. 275/2004 Sb.) i koupaliště (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.). Termotolerantní (fekální) koliformní bakterie - jde o gramnegativní tyčky netvořící spóry, s negativním cytochromoxidázovým testem, které tvoří za aerobních podmínek kolonie během 24 h kultivace při 44 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydu (TNV 75 7835). Bylo zjištěno, že původem těchto mikroorganismů nemusí být vždy trávicí trakt, ale např. průmyslové vody, rozkládající se rostlinný materiál, půda apod. Z této skupiny převládají ve vodách bakterie rodu Escherichia, Citrobacter, Klebsiella a Enterobacter. Termotolerantní koliformní bakterie se používají pro zhodnocení kvality pitné vody a jako indikátor účinnosti dezinfekce (WHO, 2004; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). Jejich stanovení je českou legislativou vyžadováno v povrchových vodách (NV 229/2007, normou ČSN 75 7221/98) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).
4
Escherichia coli - podle normy ČSN EN ISO 9308–1 jsou bakterie rodu E. coli definovány jako koliformní bakterie, které produkují indol z tryptofanu. Norma TNV 75 7835 je popisuje jako termotolerantní koliformní bakterie, které mají schopnost hydrolyzovat specifickým enzymem β-D-glukuronidázou 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glukuronid (MUG) za vzniku 4-methyl-umbelliferonu; ten vykazuje modrou fluorescenci v UV světle (WHO, 2004; Tortorello, 2003; Veger a kol., 1996; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). E. coli je považována za nejvhodnější indikátor čerstvého fekálního znečištění, a to i přesto, že bylo prokázáno, že se může pomnožovat ve vodě a v tropických půdách (Solo-Gabriele a kol., 2000; Desmarais a kol., 2002). Její stanovení je českou legislativou vyžadováno v v povrchových vodách (NV 229/2007), pitných vodách (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vodách (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.). Intestinální enterokoky - jsou bakterie, které mají schopnost redukovat 2,3,5trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzovat eskulin při 44 °C na definovaných médiích (ČSN EN ISO 7899–2). Jedná se o grampozitivní fakultativně anaerobní koky s negativní katalázou, které rostou i při zvýšené teplotě (45 °C), zvýšené koncentraci solí (6,5 %) a žluči (40 %) a vysokém pH (9,6) (Maier a kol., 2000). Jsou odolnější vůči vysušení a dezinfekci, ale ve vodách jsou citlivější vůči vlivům okolního prostředí než koliformy a málokdy se zde pomnožují (Tree a kol., 2003; Baudišová, 2007). Intestinální enterokoky se obdobně jako E. coli používají k indikaci čerstvého fekálního znečištění a indikaci nedostatečné dezinfekce pitné vody (Cloete a kol., 2004; WHO, 2004; Häusler, 1995; Štěpánek a kol., 1979). Jejich stanovení je českou legislativou vyžadováno v povrchových vodách (NV 229/2007, normou ČSN 75 7221/98), pitných vodách (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vodách (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.). Udává se, že poměr počtů termotolerantních koliformních bakterií a enterokoků odráží původ fekálního znečištění (Baudišová, 2007). Clostridium perfringens - klostridia jsou grampozitivní, anaerobní, sporulující, siřičitany redukující bakterie, běžně se vyskytující v trávicím traktu teplokrevných živočichů. Lze je také nalézt v půdě či odpadní vodě. Díky extrémně dlouhému přežívání spór v prostředí, které je výrazně delší než přežívání střevních patogenů, se od rutinního stanovení ve vodách upouští (WHO, 2004; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). Průkaz klostridií bývá považován za indikaci možného výskytu parazitických prvoků a střevních virů. Stanovují se na základě požadavku vyhlášek pro pitnou vodu (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.).
1.1.2 Hygienicky významné bakterie ve vodách Ve vodách se kromě autochtonních a saprofytických bakterií splavených ze svrchních vrstev půdy mohou vyskytovat i bakterie potenciálně patogenní a patogenní (Macler a kol., 2000; Mendoza a kol., 2004; Bifulco a kol., 1989; Lamka a kol., 1980).
5
První a z hygienického hlediska nejvýznamnější skupinou jsou patogenní bakterie pocházející z trávicího traktu člověka a teplokrevných živočichů. Jedná se především o zástupce čeledi Enterobacteriaceae (salmonely, shigely, patogenní sérovary E. coli aj.). Ty mohou snadno kontaminovat vodní zdroje, přežívat zde až několik měsíců, šířit se a sloužit tak jako potenciální zdroj nákazy pro člověka i zvířata. Fekální znečištění vod pochází především z komunálních odpadů (žumpy, septiky, městské kanalizace), odpadů ze zemědělství (kejda, hnůj) či potravinářského průmyslu (jatky), které nejsou dostatečně ošetřeny a zabezpečeny proti průniku do povrchových i podzemních vod. Největší rizika jsou spojena s kontaminací zdrojů pitných vod a povrchových zdrojů využívaných pro rekreaci. Výskyt nejčastějších patogenů v hnoji popsala Pell (1997). Hrudey a kol. (2003) sledoval kontaminaci pitné vody E. coli v Ontariu, která byla způsobena splavením kontaminovaného dobytčího hnoje do komunálního zdroje pitné vody. Dále uvedl i několik dalších případů epidemií, jejichž příčinou byla střevními patogeny kontaminovaná pitná voda. Solomon a kol. (2002) naznačil možný přenos E. coli O157:H7 z kontaminované půdy nebo závlahové vody na listy salátu transportem patogenů kořenovým systémem. Islam a kol. (2004) testoval přežívání salmonel v půdě a na zelenině. Bylo dokumentováno, že salmonely přežívaly v půdě po dobu několika měsíců a byly detekovány i na zelenině rostoucí v takto kontaminované půdě. Výskyt E. coli O157:H7 u býků od odstavení až do porážky na jatkách (asi v 16. měsíci věku) sledovala Lahti a kol. (2003). E. coli O157:H7 byla detekována v 16 % vzorků výkalů. Omisakin a kol. (2003) nalezl ve fekáliích u 7,5 % kusů dobytka určeného na porážku patogenní E. coli O157:H7. Přežívání střevních patogenů prasat a skotu (Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Cryptosporidium, Giardia) ve výkalech, půdě a vodě a jejich možný přenos na člověka popsal ve své práci Guan a kol. (2003). Zjistil, že ve výkalech nejdéle přetrvává E. coli O157:H7, a to při teplotě kolem 8 °C; podobná byla situace i s přežíváním ve vodě a půdě. U ostatních patogenů se také prokázala schopnost dlouho přetrvávat v uvedených prostředích. Přežívání patogenní E. coli O157:H7 v sedimentech vodního žlabu zkoumal LeJeune a kol. (2001). Prokázal, že studovaný kmen E. coli zůstává virulentní pro telata i po 6 měsících. Druhou skupinu tvoří gramnegativní nefermentující bakterie, které se běžně nalézají ve vodním prostředí (např. Pseudomonas, Legionella), ale mohou se chovat jako potenciální patogeny, zejména u osob s oslabeným imunitním systémem, jako jsou děti, staří lidé, nemocní a imunosuprimovaní jedinci. Barbeau a kol. (1998) popsal význam sladkovodních bakterií při vzniku oportunních a nozokomiálních infekcí ze zubařských nástrojů. Van Asperen a kol. (1995) zjistil, že bakterie Pseudomonas aeruginosa byla původcem zánětu vnějšího ucha po plavání ve sladkovodním jezeře. Ve vířivkách našel P. aeruginosa Price a kol. (1988). Ratnam a kol. (1986) shrnul poznatky o 13 případech folikulitid, které byly vyvolány přítomností P. aeruginosa ve vířivkách. Nejnovější informace o legionelách, jejich výskytu, patogenezi, diagnostice i epidemiologii shromáždili Atlas (1999), Fields a kol. (2002) a Cloete a kol. (2004). Třetí skupinou je skupina grampozitivních koků s nejznámějším zástupcem Staphylococcus aureus, jenž je původcem většiny pyogenních infekcí. Proto se jeho výskyt sleduje ve vodách určených k rekreaci a relaxaci (bazény, koupaliště, sauny), kde dochází
6
ke styku celého povrchu kůže s vodou (Štěpánek a kol., 1979; WHO, 2004; Freiman a kol., 2004). Další skupinou hygienicky významných bakterií, které je potřeba věnovat pozornost, je skupina potenciálně patogenních atypických (=oportunních, podmíněně patogenních, netuberkulózních, environmentálních) mykobakterií (M. kansasii, M. avium komplex, M. xenopi, M. chelonae apod.), pro které je voda jedním z přirozených prostředí výskytu. Mykobakteria lze nalézt v pitné, povrchové i odpadní vodě, byla izolována i ze vzorků vod z bazénů, koupališť a koupelí. Byl popsán jejich výskyt v biofilmech a spojení s volně žijícími amébami (Vaerewijck a kol., 2005). Výskyt potenciálně patogenních mykobakterií ve vzorcích povrchových, odpadních a koupacích vod, lesní, orné půdy, půdy luk a pastvin, prachu, ovoce a zeleniny, obilí a jeho produktů, trusu zvířat, sena a slámy, trávy, siláže, pilin a hoblin shromáždila ve své práci popisuje Horváthová a kol. (1997). Vaerewijck a kol. (2005) shrnul dostupné informace o výskytu mykobakterií v distribučních systémech pitné vody. Uvádí, že z cca 100 popsaných druhů mykobakterií bylo z pitné vody izolováno více než 30 %, obecně se ovšem předpokládá výskyt mnohem vyšší. Falkinham III a kol. (2001) se zabýval vyhodnocením faktorů ovlivňujících počet bakterií M. intracellulare a M. avium v distribuční síti pitné vody. Zjistil, že přítomnost M. intracellulare je spojena s výskytem biofilmu a přítomnost M. avium se snadno rozložitelnými organickými uhlíkatými sloučeninami. Lumb a kol. (2004) našel spojení mezi výskytem plicních onemocnění a lázeňskými bazény. Dailloux a kol. (2003) sledoval M. xenopi a biofilmy v pitné vodě. Z širokého spektra výše popsaných hygienicky významných bakterií vyskytujících se ve vodách budou dále blíže popsáni nejvýznamnější zástupci s častým výskytem v našich povrchových vodách.
1.1.2.1 Escherichia coli Escherichie jsou gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčky čeledi Enterobacteriaceae, optimálně rostoucí při 37 °C. Pro E. coli je charakteristická fermentace řady cukrů, např. laktózy za tvorby kyselin a plynu, produkce indolu z tryptofanu a neschopnost tvorby sirovodíku. Metabolicky inaktivní kmeny E. coli jsou zaměnitelné se shigelami. Patogenní sérovar E. coli O157:H7 většinou nefermentuje sorbitol (Brenner a kol., 2005b). E. coli je součástí běžné mikroflóry střev lidí a jiných teplokrevných živočichů, a proto je používána jako indikátor fekální kontaminace vod. Jako potenciální patogen může být původcem infekcí močových cest, průjmových onemocnění, bakteriémií a meningitid. Podle virulentních faktorů se rozdělují kmeny E. coli způsobující průjmová onemocnění do několika skupin na kmeny: enteropatogenní (EPEC), enterotoxinogenní (ETEC), enteroinvazivní (EIEC), enteroagregativní (EAEC) a enterohemoragické (EHEC) (Nataro a kol., 1998). Z EHEC je nejvýznamnější sérovar O157:H7, jenž je původcem hemoragické kolitidy a hemolyticko-uremického syndromu (akutní selhání ledvin,
7
hemolytická anémie a trombocytopenie). Za patogenitu těchto kmenů je zodpovědná produkce shiga-like toxinů (verotoxinů), které jsou podobné toxinům shigelovým. Ty inhibují proteosyntézu střevních buněk depurinací adeninu v 28S rRNA, způsobují jejich odumírání a uvolňování vody do lumen střeva (Cloete a kol., 2004; Greenwood a kol., 1999; Paton a Paton, 1998a; Brenner a kol., 2005b). Zdrojem EHEC jsou především výkaly skotu a ovcí, méně pak prasat, koz a kuřat. Infekce se přenáší kontaminovanými potravinami (maso, zelenina, džusy), vodou, kontaktem s nemocnými lidmi a zvířaty (WHO, 2004; Cotruvo a kol., 2004). Rozsáhlá epidemie vyvolaná E. coli O157:H7 z pitné vody kontaminované výkaly byla zaznamenána v roce 2001 v Kanadě v Ontariu, kde onemocnělo přes 2 300 obyvatel a 7 zemřelo (Hrudey a kol., 2003).
1.1.2.2 Salmonella sp. Jde o pohyblivé (kromě Salmonella sérovar Gallinarum) gramnegativní fakultativně anaerobní tyčkovité bakterie čeledi Enterobacteriaceae, které rostou při teplotě od 7 do 48 °C, při pH 4–8. Mohou se ale množit i při teplotě nižší než 4 °C a extrémním pH (Cotruvo a kol., 2004). Jejich charakteristickou vlastností je produkce sirovodíku, neschopnost fermentace laktózy, fermentace glukózy, maltózy a manitolu. Na základě jejich antigenní struktury (somatického O-antigenu, kapsulárního Vi-antigenu a bičíkového H-antigenu) jsou rozděleny do více než 2 000 sérovarů (Kauffmann-Whiteova klasifikace). Všechny sérovary jsou zařazeny do 2 druhů – Salmonella enterica a Salmonella bongori (Brenner a kol., 2005b). Salmonely jsou patogeny v přírodě velmi rozšířené, vyskytují se ve střevech obratlovců, ale i hmyzu a klíšťat. Některé salmonely (S. Typhi, S. Paratyphi) mají úzké hostitelské spektrum a vyvolávají onemocnění pouze u několika druhů živočichů. Naproti tomu např. Salmonella Typhimurium se vyznačuje širokou hostitelskou specifičností a postihuje nejen člověka, ale i drůbež, prasata, krávy, ovce a plazy (Cotruvo a kol., 2004; WHO, 2004). Salmonelové infekce probíhají pod obrazem čtyř hlavních klinických projevů: jako gastroenteritida a alimentární intoxikace, bakteriémie nebo septikémie, tyfus a paratyfus a asymptomatické nosičství. Gastroenteritidy způsobené požitím potravy kontaminované salmonelami a jejich toxiny patří mezi nejčastěji se vyskytující onemocnění na celém světě (Cotruvo a kol., 2004). Jen v České republice bylo zaznamenáno během roku 2006 25 102 případů salmonelóz (EPIDAT, SZÚ). Šíření salmonel probíhá fekálně-orální cestou. K infekci může dojít po kontaktu s nemocným jedincem, po požití kontaminované potravy (vejce, maso, mléko) nebo vody (Štěpánek a kol., 1979; Greenwood a kol., 1999; WHO, 2004).
1.1.2.3 Legionella pneumophila Zástupci rodu Legionella jsou gramnegativní aerobní pohyblivé tyčky, které ke svému růstu potřebují L-cystein a ionty železa, neoxidují ani nefermentují cukry, udává se,
8
že nepřežívají teplotu nad 60 °C a nerostou při teplotě nižší než 20 °C. V buněčné stěně obsahují větvené mastné kyseliny, díky kterým jsou špatně barvitelné Gramovým barvením. V přirozeném prostředí legionely vyžadují přítomnost prvoků (zejména rody Naegleria, Acantamoeba, Hartmannella, Tetrahymena), kteří jsou považováni za jejich přirozené hostitele. Je známo 50 druhů legionel (Stølhaug a Bergh, 2006), jejichž nejvýznamnějším zástupcem je L. pneumophila s třemi poddruhy – L. pneumophila ssp. pneumophila, L. pneumophila ssp. fraseri, L. pneumophila ssp. pascullei (Brenner a kol., 1988; Brenner a kol., 2005b). Přirozeným prostředím výskytu L. pneumophila jsou sladkovodní systémy (Fliermans a kol., 1981; Fields a kol., 2002). Nalezneme ji v teplovodních systémech (Wellinghausen a kol., 2001), lázních (Nagai a kol., 2003), bazénech (Leoni a kol., 2001), chladících věžích (Pascal a kol., 2001; Ishimatsu a kol., 2001) apod. Legionely přežívají v biofilmech a sedimentech, kde je lze detekovat snadněji než v tekoucí vodě (WHO, 2004; Greenwood a kol., 1999). Bylo pozorováno, že legionely procházejí technologiemi čistíren odpadních vod a přežívají i v mořské vodě (Palmer a kol., 2003). Legionely jsou potenciálně patogenní bakterie, které napadají především nemocné a imunosuprimované jedince. Legionelové infekce probíhají jako legionelóza (legionářská nemoc) nebo pontiacká horečka. Legionelóza je charakterizována jako horečnaté onemocnění s těžkým zápalem plic a s mortalitou kolem 15 %. Pontiacká horečka je mírnější onemocnění podobné chřipce (Grenwood a kol., 1999). Ročně je u nás diagnostikováno cca 10-15 případů legionelózy (EPIDAT, SZÚ). Cestou přenosu je inhalace aerosolu s bakteriemi a aspirace kontaminované vody. Přenos kontaktem s nemocnými pozorován nebyl (WHO, 2004).
1.1.2.4 Staphylococcus aureus Stafylokoky jsou grampozitivní fakultativně anaerobní nepohyblivé koky, které jsou kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Nejlépe rostou při 37 °C, rostou i v přítomnosti 10 % NaCl. Je popsáno 27 druhů stafylokoků, které spadají do 2 skupin podle schopnosti koagulovat plazmu. Staphylococcus aureus je nejvýznamnějším zástupcem koagulázapozitivních stafylokoků (Holt a kol., 1994). S. aureus se běžně vyskytuje na kůži a sliznicích teplokrevných živočichů včetně člověka, až 30 % zdravých jedinců je jeho nosičem. Je ale i původcem řady hnisavých infekcí, např. folikulitid, furunklů, karbunklů, abscesů, impetig, mastitid, osteomyelitid apod. Byla popsána i produkce stafylokokových toxinů, které zapříčiňují vznik alimentárních intoxikací, syndrom toxického šoku či syndrom opařené kůže (Greenwood a kol., 1999; Rogolsky, 1979; Dinges a kol., 2000). Stafylokoky se šíří kontaktem s jedinci s kožními infekcemi a kontaminovanými potravinami, které jim poskytují ideální prostředí pro množení a produkci toxinů (WHO, 2004; Štěpánek a kol., 1979).
9
1.1.2.5 Pseudomonas aeruginosa Jedná se o gramnegativní aerobní rovné nebo mírně zakřivené tyčky pohyblivé pomocí jednoho nebo dvou polárních flagel. Většina kmenů P. aeruginosa produkuje na vhodných kultivačních půdách pigmenty: zelenomodrý pyocyanin a fluorescentní žlutozelený pyoverdin, alternativně i červený pyorubin a hnědý melanin. Jsou kataláza a oxidáza pozitivní a tvoří amoniak z argininu. Některé kmeny tvoří extracelulární polysacharidovou matrix zvanou alginát, který je jedním z faktorů virulence. Pseudomonády jsou přirozeně vysoce odolné vůči dezinfekčním a antimikrobiálním látkám (Holt a kol., 1994; WHO, 2004; Greenwood a kol., 1999; Brenner a kol., 2005b). P. aeruginosa je v prostředí široce rozšířena, lze ji nalézt v půdě, vodě (i odpadní) a vlhkém prostředí, ale i ve výkalech zdravých lidí (asi u 10 % jedinců). Za určitých podmínek vystupuje jako patogen – je původcem nozokomiálních nákaz, infikuje popáleniny, rohovku, bércové vředy či plíce pacientů s cystickou fibrózou. U imunosuprimovaných jedinců často způsobuje generalizované infekce, které mohou končit až úmrtím (Greenwood a kol., 1999). Po plavání v bazénech se může objevit folikulitida a zánět zevního ucha (Asperen a kol., 1995; WHO, 2004). Pseudomonády se šíří kontaktem poraněné tkáně s kontaminovanou vodou, vzduchem nebo roztoky používanými v nemocničních zařízeních. Infekce oka souvisejí s používáním kontaminovaných kontaktních čoček (Greenwood a kol., 1999; WHO, 2004).
1.2 Metody izolace a identifikace bakterií ve vodách K izolaci a identifikaci bakterií z vodního prostředí byla vyvinuta řada fenotypových i genotypových metod. Identifikace bakterií pomocí fenotypových metod je založena na využití vlastností bakterií, které jsou určeny spolupůsobením genotypu a prostředí. Z mikrobiologie vody jsou pro izolaci a rodovou a druhovou identifikaci popsány především metody kultivační, biochemické a fyziologické (např. stanovení metabolické aktivity či intenzity chemických transformací). Metody imunologické, chemotaxonomické, biotypizační, fagotypizační aj. lze aplikovat k typizaci izolátů (Stead a kol., 1998; Rompré a kol., 2002). Jejich použití v mikrobiologii vody je omezené. Genotypové metody (molekulárně-biologické), které využívají genetickou informaci uloženou v buňce, jsou k identifikaci stále více používané. Aplikace amplifikačních a hybridizačních technik bývá popisována nejčastěji. Těmito technikami lze detekovat bakteriální rody, druhy i kmeny (Cloete a kol., 2004; Ambrožová, 2004). K typizaci izolátů byly popsány metody jako náhodná amplifikace polymorfních úseků DNA (RAPD), multilokusová sekvenční typizace (MLST) či ribotypizace. Podrobnějšímu popisu kultivačních a vybraných molekulárně-biologických metod využívaných k izolaci a identifikaci bakterií z vod jsou věnovány následující kapitoly.
10
1.2.1 Kultivační metody Kultivační metody mají v současné době při mikrobiologickém rozboru vod nezastupitelnou úlohu. Jedná se o metody nepřímé, jejichž principem je pomnožení bakterií na nebo v uměle připravených médiích za vhodných podmínek za účelem zisku kolonií čistých kultur, které mohou být poté podrobeny dalším testům. Existuje velké množství kultivačních médií, která svým složením vyhovují nárokům některých druhů bakterií přítomných ve vodách, avšak převážná většina druhů se stále řadí mezi nekultivovatelné mikroorganismy, tj. nerostoucí na kultivačních médiích. Vzhledem k rozdílným fyziologickým vlastnostem bakterií je nemožné vyvinout jedno univerzální kultivační médium, které by zachytilo veškeré bakteriální druhy vyskytující se ve vodách (Austin a kol., 1988; Maier a kol., 2000; Häusler, 1994a, b; Daubner a kol., 1967; Štěpánek a kol., 1979). Kultivační média lze rozdělit podle různých hledisek do několika skupin. Nejvýznamnější členění vychází z účelu a použití těchto médií na média základní, obohacená, resuscitační, diagnostická, selektivní, selektivně diagnostická, pro anaerobní kultivaci, ke stanovení citlivosti na antimikrobiální látky, ke stanovení vitamínů a dalších účinných látek, média k testování sterility a stanovení účinnosti dezinfekčních látek, média transportní či média k uchování kultur (Votava, 1999). Mikrobiologický rozbor vod vychází z národních norem a je založen na stanovení základních ukazatelů kultivačními metodami. Kultivace se provádí v tekutých médiích nebo na pevných půdách. K identifikaci presumptivních bakterií se používají konfirmační testy.
1.2.1.1 Kultivace v tekutých médiích Výhodou tekutých půd je snadný přístup vody a živin ke kultivovanému mikroorganismu. Tekuté půdy se používají ke kultivaci poškozených nebo stresovaných mikroorganismů (Häusler, 1994b), k pomnožení mikroorganismů před dalšími testy, k průkazu biochemických vlastností (kvasná zkouška, „pestré řady“, mikrotesty; Štěpánek a kol., 1982), stanovení fyziologických skupin bakterií metodou MPN (metoda nejvíce pravděpodobných počtů, most probable number) aj. Principem biochemických identifikačních testů je kultivace bakterií v tekutých půdách s přídavkem substrátu a sledování schopnosti bakterií příslušné biochemické přeměny (např. fermentace cukrů s následnou změnou pH produkcí kyseliny, změnou barvy média rozkladem definovaného chromogenního substrátu, apod.). Biochemické mikrotesty určené k identifikaci bakterií jsou vyráběny komerčně, např. ENTEROTUBE, API-systém, mikrotesty firmy Pliva-Lachema, aj. Kvantifikace bakterií při použití tekutých půd je možná pomocí metody MPN, jejíž podstatou je určení pozitivní reakce (přítomnosti mikroorganismů) v určitém objemu vody nebo zředěného vzorku. MPN je statistický odhad průměrného počtu mikroorganismů ve vzorku, jehož přesnost závisí na počtu zkumavek ředící řady použitých pro analýzu (Häusler, 1994b; Rompré a kol., 2002; Tortorello, 2003; Maier a kol., 2000). Variantou těchto metod jsou miniaturizované metody definovaného substrátu, které k detekci bakterií
11
využívají přítomnost fluorogenního nebo chromogenního substrátu v médiu, nejčastěji onitrophenyl-β-D-galaktopyranosidu (ONPG) a 4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronidu (MUG) pro stanovení koliformních bakterií a E coli a 4-methylumbelliferyl-β-D-glukosidu (MUD) pro stanovení intestinálních enterokoků (Rompré a kol., 2002; Manafi, 1991).
1.2.1.2 Kultivace na pevných médiích Tato metoda umožňuje kvantifikovat stanovované mikroorganismy v testovaném objemu vody. Objem a ředění inokulovaného vzorku vody se volí tak, aby po inkubaci na pevné půdě vyrostly samostatné kolonie, tedy klony jednotlivých buněk. Výsledný počet narostlých kolonií se uvádí jako počet KTJ (kolonie tvořící jednotka, CFU, colony forming unit), který se přepočítává na objem původního vzorku (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000; Rompré a kol., 2002). V posledních letech dochází k rozvoji aplikace chromogenních a fluorogenních substrátů, které umožňují detekovat aktivitu specifických enzymů. Ve srovnání s kultivacemi na běžných médiích jsou kultivace na těchto substrátech rychlejší a přesnější (Manafi, 1991; Manafi, 2000; González a kol., 2003; Feng a kol., 1982; Augoustinos a kol., 1993). V současné době se používají dva postupy inokulace vzorku na pevné půdy. Metoda přímého výsevu je založena na inokulaci zvoleného objemu vzorku do nebo na povrch kultivačního média. Inokulace do kultivačního média je vhodná při stanovení fakultativně anaerobních nebo mikroaerofilních bakterií, které normálně žijí při vyšší teplotě, takže teplota 45 °C roztopeného agaru jim nezpůsobí teplotní šok. Metoda přímého výsevu na povrch kultivačního média je vhodná pro kultivaci aerobů, jež se přirozeně vyskytují v chladnějších vodách (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000). Při zpracování větších objemů vzorku se používá metoda membránových filtrů, která je založena na zakoncentrování potřebného množství vzorku filtrací (10–1 000 ml). Metoda je vhodná pro vody obsahující malý počet bakterií a malé množství nerozpuštěných látek (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000).
1.2.1.3 Konfirmační testy Pro bližší taxonomické zařazení bakterií vykultivovaných na nebo v selektivních médiích je nutné provést tzv. konfirmační (potvrzující) testy. Tyto testy jsou na bázi biochemických, imunologických a chemotaxonomických metod. Kmeny, které splňují podmínky testů, jsou označovány za presumptivní (Häusler, 1994b; Rompré a kol., 2002). Identifikace biochemickými testy - v současné době patří mezi nejčastěji používané konfirmační techniky. Využívá se stanovení snadno detekovatelných a stálých biochemických vlastností. Např. konfirmace presumptivních kolonií E .coli se provádí cytochromoxidázovým testem (průkaz cytochromoxidázy c), průkazem tvorby indolu z tryptofanu (dekarboxylace peptidů tryptofanázou), stanovením aktivity β-Dglukuronidázy (štěpení 4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronidu [MUG]). K rychlé identifikaci bakterií byly vyvinuty diagnostické soupravy (mikrotesty). Soupravy jsou
12
vytvořeny např. jako mikrotitrační destičky, jejichž jamky obsahují dehydratovaná kultivační média. Příkladem mohou být MIKRO-LA-TESTY fy Pliva-Lachema, a.s. (Häusler, 1994b). Často se využívají také fluorogenní a chromogenní substráty. Tyto postupy nejčastěji využívají enzymy ze skupiny glykosidáz. Mezi nejznámější patří β-Dglukuronidáza (enzym z 94–96 % specifický pro E. coli, nalézá se i u některých kmenů shigel, salmonel, yersinií, stafylokoků, klostridií apod.) a β-D-galaktosidáza (enzym katalyzující štěpení laktózy, využívá se ke stanovení koliformních bakterií). K detekci βD-glukuronidázy se nejčastěji využívají tyto substráty: fenolftalein-mono-β-Dglukuronidový komplex (PHEGLR), p-nitrofenol-β-D-glukuronid (PNPGLR), 5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-glukuronid (XGLR) a 4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid (MUG). Aktivita β-D-galaktosidázy se zjišťuje pomocí následujících substrátů: o-nitrophenyl-β-Dgalaktopyranosid (ONPG), p-nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (PNPGAL), 6-bromo-3indolyl-β-D-galaktopyranosid (salmon-Gal), 6-bromo-2-naphthyl-β-D-galaktopyranosid (BNGAL), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (XGAL) a 4methylumbelliferyl-β-D-galaktopyranosid (MUGAL) (Manafi, 1991; Manafi, 2000). Identifikace imunologickými metodami - je založena na identifikaci bakteriálních antigenů pomocí specifických protilátek. Imunologické metody umožňují detekci antigenů čeledě, rodů druhů či sérovarů. Své místo v mikrobiologii vod mají: latexová aglutinace, enzymatická imunoanalýza (ELISA) a přímá a nepřímá imunofluorescence (IFA). Jejich výhodou je rychlost, jednoduchost a citlivost. Omezením těchto metod je specifičnost a koncentrace protilátky, koncentrace antigenu a typ reakčního roztoku. Navíc může docházet ke zkříženým reakcím. Používají se např. při identifikaci patogenních sérovarů E. coli či salmonel (Häusler, 1994b; Bartie a kol., 2003; Austin a kol., 1988; Rompré a kol., 2002). Identifikace chemotaxonomickými metodami - jsou založené na studiu chemického složení buněčné stěny lze využít pro typizaci bakterií. Z používaných metod lze uvést analýzu profilů proteinů a mastných kyselin (Stead a kol., 1998; Häusler, 1994b; Austin a kol., 1988). Při rutinních mikrobiologických analýzách se nevyužívají.
1.2.2 Molekulárně-biologické metody Během posledního desetiletí došlo k mohutnému rozvoji molekulárně-biologických věd, pro které je charakteristická menší časová náročnost (není nutná kultivace a konfirmace), vyšší citlivost (detekce i 1 molekuly DNA) a specifičnost (založená na detekci skupinově-, rodově-, druhově-, poddruhově-specifických sekvencí DNA či RNA, které jsou v čase neměnné a nejsou ovlivněny podmínkami okolního prostředí) (Cloete a kol., 2004; Rompré a kol., 2002). Mezi základní techniky běžně používané k identifikaci druhů, příp. i kmenů bakterií se řadí polymerázová řetězová reakce (PCR) a fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Jejich princip a podrobnější popis je uveden v následujících kapitolách.
13
V rámci epidemiologických a fylogenetických studií je mnohdy nedostačující detekce bakteriálního druhu, ale je důležité odlišit jednotlivé kmeny (Versalovic a Lupski, 2002). Za tímto účelem byla vyvinuta řada genotypizačních metod. Např. pulzní gelová elektroforéza (PFGE), spočívající v separaci velkých fragmentů DNA vzniklých restrikčním štěpením, je využívána nejčastěji (Versalovic a Lupski, 2002; Olive a Bean, 1999). Dále se uvádí použití metody stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP), kdy po amplifikaci konzervativní oblasti DNA dochází k jejímu restrikčnímu štěpení a separaci gelovou elektroforézou (Stead a kol., 1998). Metoda stanovení polymorfizmu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) je naopak založena na selektivní amplifikaci restrikčních fragmentů genomové DNA (Vos a kol., 1995). Z dalších typizačních metod lze zmínit náhodnou amplifikaci polymorfních úseků DNA (RAPD), multilokusovou sekvenční typizaci (MLST), ribotypizaci, analýzu plazmidů či sekvenaci (Olive a Bean, 1999).
1.2.2.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Základem pro rozvoj molekulárně-biologických metod bylo vyvinutí metody PCR v 80. letech 20. století (Mullis a kol., 1987). Během krátké doby se PCR stala nejpoužívanější amplifikační metodou. Její aplikace jsou známy z mnoha odvětví a v posledních letech se začíná využívat i v environmentální mikrobiologii. Principem je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vážících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3´OH-konce směřují proti sobě (Rosypal a kol., 2002). Jako primery se obvykle používají oligonukleotidy o délce kolem 20 párů bazí (bp), které jsou komplementární ke koncům amplifikovaného úseku. Pro provedení amplifikace musí PCR směs kromě templátové DNA a primerů obsahovat deoxyribonukleotidtrifosfáty (dNTP) a termostabilní DNA polymerázu, která katalyzuje vlastní syntézu nových řetězců. Postup PCR spočívá v opakování tří kroků: denaturace, při které dochází k rozvolnění řetězců templátové DNA (92-96 °C), anelace, kdy dochází k připojení primerů k rozvolněným řetězcům (anelační teplota se odvíjí od struktury primerů), a extenze (=polymerace), kdy dochází k prodlužování nových řetězců (72 °C) (Rompré a kol., 2002; Cloete a kol., 2004) (viz obr. 1.1). PCR obvykle probíhá po 30–40 cyklů, během nichž se geometricky zvyšuje počet cílových sekvencí DNA. Amplifikované úseky (amplikony) se detekují gelovou elektroforézou, hybridizací se značenou sondou či sekvenováním (Rosypal a kol., 2002).
14
Obr. 1.1: Princip polymerázové řetězové reakce
Kromě základní metody PCR byla vyvinuta řada modifikací, z nichž některé jsou uvedeny níže: Náhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD, AP-PCR) - vychází z klasické metody PCR, ale na rozdíl od ní využívá pouze jeden krátký primer o velikosti 9-10 bp s náhodnou sekvencí, který hybridizuje s DNA matricí za nízké anelační teploty. Vzhledem k použití nespecifických primerů není nutné znát sekvenci DNA matrice. Amplifikační produkty o neznámé sekvenci, které vznikají v případě, že RAPD primery nasedají na protilehlé řetězce DNA proti sobě a ve vzájemné vzdálenosti do několika málo kbp, jsou separovány gelovou elektroforézou a obarveny ethidium bromidem. Délka amplifikačních produktů odpovídá vzdálenosti mezi dvěma protilehlými primery (Williams a kol., 1990; Welsh a McCleeland, 1990; Olive a Bean, 1999). Jelikož se počet a umístění míst přisednutí RAPD primerů liší mezi kmeny téhož druhu, je výsledkem spektrum amplifikačních produktů (fingerprint), které by mělo být charakteristické pro zkoumaný kmen. Nicméně je známo, že nepatrné změny koncentrace solí, anelační teploty, koncentrace templátové DNA, délky primerů a jejich sekvence mají zásadní vliv na počet, intenzitu a reprodukovatelnost fingerprintu (Welsh a McCleeland, 1990). Multiplex PCR - při jejím provedení se využívá více párů primerů současně, které se vyznačují podobnou teplotou tání. To umožňuje paralelní identifikaci více genových úseků jednoho mikroorganismu (např. genů virulence) nebo identifikaci více mikroorganismů (Mazura a kol.; Campbell a kol., 2001; Bej a kol., 1991b).
15
Nested PCR - probíhá jako dvě po sobě následující amplifikace s cílem zisku dostatečného množství DNA fragmentu. Metoda se používá zejména v případech, kdy je amplifikováno malé množství DNA (Juck a kol., 1996). Oba páry primerů používané při nested PCR musí specificky reagovat v očekávané oblasti a musí mít odlišný bod tání (Mazura a kol., 2001). Reverzně transkripční PCR (RT-PCR) - je určená k amplifikaci molekul RNA (včetně mRNA a rRNA). RNA je nejdříve přepsána pomocí reverzní transkriptázy do cDNA (komplementární DNA) a teprve potom amplifikována (Rosypal a kol., 2002). Kvantitativní PCR (Q-PCR) - umožňuje průběžné sledování tvorby PCR produktů již během jednotlivých amplifikačních cyklů a tedy jejich kvantifikaci (Ibekwe a kol., 2003).
Klíčovou úlohu pro úspěšné provedení a vyhodnocení PCR mají zejména: výběr vhodné sekvence k amplifikaci, čistota a množství DNA matrice, typ DNA polymerázy a amplifikační podmínky, přítomnost inhibitorů, detekce produktů amplifikace a kontroly amplifikace (Rådström a kol., 2004; Altwegg, 1995; Wilson, 1997). Výběr oligonukleotidové sekvence - je zásadním krokem při použití amplifikačních metod. Cílová sekvence musí být specifická pro příslušný organismus či organismy. Podle typu aplikace je možné hledat sekvenci specifickou pro celou taxonomickou skupinu (tj. geny kódující 16S rRNA) nebo sekvenci specifickou pro daný organismus (geny pro funkční molekuly). Pro dosažení vyšší citlivosti je vhodné zaměřit se na sekvence vyskytující se v buňkách ve více kopiích. To však neplatí pro genové sekvence na plazmidech, které mohou z buňky vymizet (Altwegg, 1995; Johnson, 2000). Čistota a množství templátové DNA - získání DNA matrice o vhodné čistotě a dostatečném množství je klíčovým krokem pro úspěch amplifikačních metod. Postupy pro izolaci bakteriální DNA by měly být časově a finančně nenáročné, jednoduché, reprodukovatelné a bezpečné pro obsluhu (Rantakokko-Jalava a Jalava, 2002). Jejich cílem je odstranění inhibičních látek a zakoncentrování cílových molekul DNA ze vzorku (Rådström a kol., 2004). Existuje řada izolačních metod, ale pouze některé jsou aplikovatelné na příslušný druh vzorku (Horáková a kol., 2008). Vzhledem k vysoké citlivosti amplifikačních technik je možné pro zisk DNA z čistých kultur použít i metody poskytující horší kvalitu DNA matrice, např. povaření, alkalická lyze apod., které poskytují jen hrubý lyzát. U vzorků z přírodního prostředí je situace odlišná, tj.: malý počet cílových molekul DNA, extrémně vysoká doprovodná flóra a množství inhibičních látek. Proto je zde nezbytné zařadit po lyzi buněk extrakční krok následovaný krokem purifikačním. K tomuto účelu bylo popsáno použití např. imunomagnetických částic, gradientové centrifugace, filtrace či dvoufázových systémů. Často používané extrakční postupy využívající organická rozpouštědla však nejsou příliš vhodné, a to z následujících důvodů: (i) tyto postupy zahrnují mnoho dílčích kroků, kdy časté otvírání zkumavek vede ke
16
zvýšení pravděpodobnosti vzniku kontaminace, (ii) etanolová precipitace následovaná fenol/chloroformovou extrakcí vede ke snížení výtěžku, který je zásadní zejména při práci s malým množstvím DNA, (iii) stopy fenolu mohou inhibovat amplifikační reakci. Nejvyšší výtěžek, koncentraci a čistotu poskytují komerčně dostupné izolační kity. Jejich nevýhodou je ale finanční nákladnost (Altwegg, 1995; Rådström a kol., 2004). Vhodně zvolené složení PCR směsi a amplifikační podmínky - jsou nezbytné pro správný průběh amplifikační reakce. Významná je volba termostabilní DNA polymerázy. Existuje množství DNA polymeráz, každá se vyznačuje jinými vlastnostmi a odolností vůči různým složkám biologických vzorků. Bylo zjištěno, že např. polymerázy Tth si udržují svoji polymerázovou aktivitu i v přítomnosti stopových množství fenolu, ale na nejčastěji používanou Taq polymerázu působí fenol inhibičně. Správnou volbou termostabilní DNA polymerázy je možné se do jisté míry vyhnout náročným purifikačním krokům při přípravě DNA templátu. Zásadní je také správná volba primerů, časů a dob jednotlivých kroků amplifikační reakce a koncentrace iontů hořčíku nezbytných pro správnou funkci DNA polymeráz (Rådström a kol., 2004; Wilson, 1997). U metody RAPD byl pozorován zásadní vliv nepatrných změn koncentrace solí, anelační teploty, délky primerů a jejich sekvence na počet, intenzitu a reprodukovatelnost fingerprintu (Welsh a McCleeland, 1990). Inhibitory PCR - inhibice amplifikační reakce může být způsobena mnoha vlivy. Přítomnost inhibitorů je častá zejména ve vzorcích z potravin, prostředí a klinického materiálu. Mechanismus inhibice spočívá v (i) interferenci při lyzi buněk, jež je nezbytná pro extrakci DNA, (ii) degradaci a precipitaci nukleových kyselin a (iii) inhibici DNA polymeráz; což ve výsledku vede ke snížení citlivosti PCR nebo k celkovému zablokování reakce (Wilson, 1997). Inhibitory lze rozdělit do dvou skupin: 1) endogenní (obsaženy přímo ve zpracovávaném vzorku, používaných enzymech nebo materiálu); 2) exogenní (pocházející z okolního prostředí, např. bakterie, prach, pyl, celulóza nebo pudr z rukavic). Z endogenních inhibitorů z klinického materiálu jsou známy např. hemoglobin, bilirubin, heparin, žlučové kyseliny, sérové proteiny, močovina. Mezi inhibitory z potravin patří mléčné proteiny, ionty vápníku, termostabilní nukleázy, proteázy, tuk, sacharóza, či glykogen. Ve vzorcích z prostředí se často nacházejí inhibující huminové a fulvové kyseliny, fenolické sloučeniny, těžké kovy, rostlinné polysacharidy, bakteriální zbytky apod. (Wilson, 1997). Omezení výskytu exogenních inhibitorů je možné při dodržování čistoty a sterilních podmínek práce v laboratoři. Zamezit přítomnosti endogenních inhibitorů ve vzorcích je proces náročnější, spočívá např. v aplikaci vhodných purifikačních technik vedoucích k zisku dostatečně čisté DNA (Wilson, 1997). Bylo popsáno, že zvýšení účinnosti amplifikace je možné dosáhnout přídavkem specifických sloučenin - enhancerů (aditiv) do amplifikační směsi. Enhancery působí v různých krocích amplifikace, např. ovlivňují stabilitu templátové DNA nebo působí na správnou funkci DNA polymerázy. Jsou to: proteiny (BSA=bovinní sérový albumin, gp32=DNA vazebný protein kódovaný genem gp32 bakteriofága T4), organická rozpouštědla (dimetylsulfoxid, formamid), detergenty (Tween 20, Triton X), biologicky kompatibilní rozpuštěné látky
17
(betain, glycerol) a polymery (polyetylenglykol, dextran) (Rådström a kol., 2004; Henke a kol., 1997; Back a kol., 1979; Pomp a Medrano, 1991). Detekce PCR produktů - metody detekce amplifikovaných úseků mají různou citlivost. Nejjednodušší, ale současně málo citlivou metodou, je elektroforéza v agarózovém gelu. Principem této metody je obarvení amplikonů rozdělených podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti náboje fluorescenčním barvivem. Nejčastěji se používá ethidiumbromid, který interkaluje mezi nukleotidy. K vizualizaci obarvených amplikonů dochází pomocí UV transiluminátoru (Maniatis a kol., 1982). Vysokou citlivostí (20 – 100krát vyšší než u agarózové elektroforézy) a specifičností se vyznačuje metoda Southern blot kombinovaná s hybridizací (Altwegg, 1995). Tato technika spočívá v přenosu a následné imobilizaci amplifikonů na membráně, kde jsou podrobeny hybridizaci se specifickou sondou. Kontroly - správný průběh reakce je u amplifikačních metod zajištěn použitím pozitivní a negativní kontroly při každé analýze (Altwegg, 1995). Kontrola správné velikosti amplifikovaného produktu se provádí srovnáním s velikostním markerem. Pro kontrolu specifičnosti PCR produktu lze využít sekvenaci.
1.2.2.3 Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) K vyhledání specifických sekvencí lze použít i metody hybridizační, jejich principem je schopnost hybridizace dvou navzájem komplementárních jednořetězcových DNA či RNA molekul (Rosypal a kol., 2002). Příkladem může být metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Principem FISH je hybridizace fluorescenčně značené DNA sondy se specifickým úsekem 16S nebo 23S rRNA. Tato metoda umožňuje detekovat specifické genové sekvence v cytologických preparátech, v biofilmech, sedimentech, kalech a vzorcích vod. Zhybridizované sondy se poté kvantifikují pomocí fluorescenčního mikroskopu (BrehmStecher a kol., 2004; Rosypal a kol., 2002; Grimm a kol., 1998; Daims a kol., 2001; Ravenschlag a kol., 2001; Sekar a kol., 2003; DeLong a kol., 1999; Glöckner a kol., 1999; Declerck a kol., 2003a; Rompré a kol., 2003; Brenner a kol., 2005). Běžně se používají oligonukleotidové sondy (méně než 20 nukleotidů), aplikace sond polynukleotidových (více než 50 nukleotidů) či proteinnukleotidových (PNA-protein nucleic acid) se provádí za účelem zvýšení specifičnosti a citlivosti analýzy, výhodné je jejich použití k detekci grampozitivních bakterií (Stender a kol 2002; Brehm-Stecher a kol., 2004) a bylo popsáno i k detekci legionel přímo v nárostech ve vodovodním potrubí (Wilks a kol., 2005). Značení sond je provedeno obvykle jedním fluorescenčním barvivem na 5´-konci sondy přes linker, v některých případech lze použít i více sond značených různými fluorescenčními barvivy najednou. Obyčejně se jako fluorescenční barviva používají: fluorescein, tetramethylrhodamin, texaská červeň, kyselina 7-amino-4-methykumarin-3octová a indokarbocyaninová barviva Cy3, Cy5 a Cy7 (Amann a kol., 1995).
18
Postup FISH spočívá ve fixaci buněk ve vzorku, jejich zakoncentrování a vlastní hybridizaci. Před pozorováním ve fluorescenčním mikroskopu, za použití vhodných filtrů, které zachytí emitované záření, je nutné vymýt nezhybridizovanou sondu. FISH je rychlou, citlivou a specifickou metodou, lze ji aplikovat tam, kde nedostačují klasické kultivační metody. Tato metoda má ale také několik nevýhod. Je omezena pouze na pozorování metabolicky aktivních buněk s dostatečným množstvím rRNA. Pozorované buňky musí být zakoncentrovány tak, aby bylo dosaženo koncentrace alespoň 103 buněk/cm2 membrány či filtru, jinak není možné fluorescenční signál pozorovat. Nevhodná sonda, špatné pronikání sondy do buňky nebo malé množství cílových rRNA molekul vedou ke slabému signálu. Ten je možné zintenzívnit použitím nepřímé vazby fluorescenční značky, použitím citlivějších sond (sonda s křenovou peroxidázou v metodě CARD-FISH [CARD=catalyzed reporter deposition], na kterou se pro zesílení signálu posthybridizačně naváže tyramid značený fluorochromem) nebo vícečetným fluorescenčním značením (Amann a kol., 1995). FISH je využívána nejen k detekci fylogenetických a fyziologických skupin bakterií, ale i k detekci bakterií patogenních a potenciálně patogenních, např. E. coli, S. aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium a legionel (Szewzyk a kol., 1994; Oliveira a kol., 2002; Declerck a kol., 2003a; Grimm a kol., 1998; Manz a kol., 1995; Beimfohr a kol., 1993).
1.3 Mikrobiologický rozbor vod v ČR podle současně platné legislativy Rozsah stanovovaných mikrobiologických ukazatelů v jednotlivých typech vod se řídí platnými vyhláškami 252/2004 Sb. (Vyhláška, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody), 187/2005 Sb. a 293/2006 Sb. (Vyhlášky, kterými se mění Vyhl. 252/2004 Sb.), 275/2004 Sb. (Vyhláška o požadavcích na jakost a zdravotní nezávadnost balených vod a o způsobu jejich úpravy), NV 61/2003 Sb. (Nařízení vlády o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod, náležitostech povolení k vypouštění odpadních vod do vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblastech), NV 61/2003 Sb. ve znění NV 229/2007 Sb., ČSN 75 7221/1998 Sb. (Klasifikace jakosti povrchových vod) a 135/2004 (Vyhláška, kterou se stanoví hygienické požadavky na koupaliště, sauny a hygienické limity písku v pískovištích venkovních hracích ploch) a 292/2006 Sb. (Vyhláška, kterou se mění Vyhl. 135/2004 Sb.). Prováděcí normy, které obsahují postupy stanovení požadovaných mikrobiologických ukazatelů, jsou uvedeny v tabulce 1.1.
19
Tab.1.1: Přehled platných norem pro stanovení mikrobiologických ukazatelů ve vodách označení normy
název normy
TNV 75 7835
Jakost vod – Stanovení termotolerantních koliformních bakterií a Escherichia coli
TNV 75 7837
Jakost vod – Stanovení koliformních bakterií v nedesinfikovaných vodách
ČSN ENSO 9308–1
Jakost vod – Stanovení Escherichia coli a koliformních bakterií – Část 1: Metoda membránových filtrů
ČSN EN ISO 7899–2
Jakost vod – Stanovení intestinálních enterokoků – Část 2: Metoda membránových filtrů
ČSN EN ISO 6222
Jakost vod – Stanovení kultivovatelných mikroorganismů – Stanovení počtu kolonií očkováním do živného svarového kultivačního média
Council Directive Stanovení Clostridium perfringens (včetně spór) 98/83/EC, Vyhláška 252/2004 ČSN EN 12780
Jakost vod – Stanovení Pseudomonas aeruginosa metodou membránových filtrů
ČSN EN ISO 6888–1
Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy) – Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera
TNV 75 7855
Jakost vod – Průkaz přítomnosti bakterií rodu Salmonella
ČSN ISO 11731
Jakost vod – Stanovení bakterií rodu Legionella
ČSN ISO 11731–2
Jakost vod – Stanovení bakterií rodu Legionella – Část 2: Metoda přímé membránové filtrace pro vody s malým počtem bakterií
1.4 Možnosti izolace a identifikace vybraných hygienicky významných a indikátorových bakterií ve vodách Velké množství bakterií vyskytující se ve vodním prostředí lze považovat za hygienicky významné buď přímo pro jejich patogenitu, potenciální patogenitu nebo pro jejich indikátorový význam. V této práci byly pro detailní studium vybrány indikátorové bakterie – E. coli, intestinální enterokoky a Clostridium perfringens a patogenní a podmíněně patogenní bakterie – salmonely, legionely, Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus.
1.4.1 Izolace a identifikace E. coli Fenotypové metody: Izolace a identifikace E. coli ve vzorcích vod je standardně založena na kultivačním stanovení. V ČR je stanovována 2 principy (tab. 1.1): 1) podle ČSN EN ISO 9308–1 kultivací na laktóza-TTC půdě s průkazem β-D-galaktozidázy, cytochromoxidázy c a produkce indolu z tryptofanu; 2) podle TNV 75 7835 kultivací na m-FC agaru při 44 °C s následným průkazem β-D-glukuronidázy. 20
Pro stanovení E.coli lze obecně použít poměrně velké spektrum kultivačních půd a konfirmačních postupů, které však mají významně odlišnou záchytnost a selektivitu. Augoustinos a kol. (1993) zhodnotila použití m-FC agaru pro kultivaci fekálních koliformů a E. coli a následnou konfirmaci pomocí testu na produkci enzymu β-D-glukuronidázy jako vysoce účinnou metodu jejich stanovení. Srovnání dvou metod definovaného substrátu (Colilert, ColiQuick) pro stanovení E. coli z chlorovaných vod s kultivační metodou využívající EC médium s MUG (fluorogenní médium pro stanovení E. coli) popsal Covert a kol. (1992). Colilert poskytl výsledky srovnatelné s kultivací na EC médiu. Eckner (1998) se také zabýval srovnáním metody definovaného substrátu (Colilert) s metodou MPN a membránovou filtrací pro pitné a koupací vody, přičemž výsledky všech použitých metod byly srovnatelné. Účinnost analýzy β-D-glukuronidázy pro identifikaci fekálních E. coli pomocí definovaného substrátu (Colilert) sledoval Rice a kol. (1990). Zjistil, že po 24 h kultivace bylo pozitivních 95,5 % izolátů a po 28 h 99,5 %. Francy a kol. (2000) porovnávala 4 metody stanovení E. coli ve vodách určených k rekreaci. Testované metody poskytly rozdílné výsledky. K monitoringu fekálního znečištění pobřežních vod použil Fiksdal a kol. (1994) rychlé enzymatické metody, jejichž detekční limit pro fekální koliformy byl 100-1 000 KTJ/100 ml a pro E. coli 10-100 KTJ/100 ml. George a kol. (2002) sledovala účinnost eliminace fekálních koliformů ve 12 čistírnách odpadních vod (ČOV) klasickými plotnovými metodami a metodami enzymatickými. Zjistila, že účinnost odstranění fekálních bakterií je závislá na procesech čištění ČOV. UV záření používané k dezinfekci nepůsobilo na snížení počtu E. coli. Použitím chromogenních a fluorogenních substrátů k izolaci a identifikaci E. coli se zabývali Suiero a kol. (2001), Robertson a kol. (1998), González a kol. (2003), Feng a kol. (1982), Farnleitner a kol. (2002), Berg a kol. (1988), George a kol. (2001). Shrnutí poznatků o stanovení koliformů v pitných vodách obsahuje práce Rompré a kol. (2002). Pro typizaci kmenů E. coli byla popsána např. metoda latexové aglutinace pro detekci shiga-like toxinů (Karmali a kol., 1999) nebo multilokusová enzymová elektroforéza (MLEE) (Souza a kol., 1999; Pupo a kol., 1997). Genotypové metody: Koliformní bakterie byly poprvé identifikovány pomocí PCR amplifikací úseku genu pro β-D-galaktosidázu (lacZ) Bejem a kol. (1990, 1991a, b). Amplifikace specifického úseku genu uidA (β-D-glukuronidáza) byla použita Tsaiem a kol.(1993) a Juckem a kol. (1996) k identifikaci E. coli. K identifikaci patogenních kmenů E. coli bylo vypracováno mnoho PCR postupů založených na detekci faktorů virulence. Nejčastěji byla pozornost zaměřena na amplifikaci sekvencí genů: stx I a II (shiga-like toxiny), lt (teplotně labilní toxin), st (teplotně stabilní toxin), ipaH (fragment invazivního plazmidu), eaeA (intimin), hlyA (enterohemolyzin), invE, bfpA, rfb, fliC (další povrchové antigeny) a uidA (β-D-glukuronidáza) (Watterworth a kol., 2005; Vidal a kol., 2004; Wang a kol., 2002; Venkateswaran a kol., 1997; Jinemann a kol., 2003; Jothikumar a kol., 2002; Paton a Paton, 1998b; Reid a kol., 1999; Toma a kol., 2003; Gannon a kol., 1997; Franck a kol., 1998; Fagan a kol., 1999; Cerna a kol., 2003; Ibekwe a kol., 2003; Campbell a kol., 2001; Louie a kol., 1998; Bertin a kol., 1996). K bližší charakterizaci kmenů byly použity tyto metody: ribotypizace (Carson a kol., 2001), polymorfizmus délky restrikčních fragmentů
21
(RFLP) (Arthur a kol., 1990), pulzní gelová elektroforéza (PFGE), polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) (Smith a kol., 2000), multilokusová sekvenční typizace (MLST) (Tartof a kol., 2005) anebo náhodně amlifikovaná polymorfní DNA (RAPD) (Hurtado a Rodríguez-Valera, 1999).
1.4.2 Izolace a identifikace salmonel Fenotypové metody: Standardními metodami pro detekci salmonel jsou metody kultivační. V ČR je ke stanovení salmonel používána kultivační metoda podle TNV 75 7855 (Tab. 1.1). Principem metody je pomnožení v neselektivním tekutém médiu (peptonová voda) a následná kultivace na selektivních půdách xylóza-lysin-dezoxycholátovém médiu a médiu s brilantovou zelení, fenolovou červení a laktózou podle Edela a Kampelmachera. K izolaci salmonel ze vzorků vod a výkalů bylo popsáno použití neselektivních a následně selektivních pomnožovacích médií a kultivace na modifikovaném RappaportVassiliadisově a poté Hektoen agaru (Feder, 2001). Freydiere a kol. (1991) ve své práci použila ke stanovení salmonel v klinické mikrobiologii Rambachův agar. Koivunen a kol. (2001) zjistil, že pro stanovení salmonel z komunálních odpadních vod je jednokrokové pomnožení v Preussově tetrationátovém bujónu lepší než použití peptonové vody a Rappaport-Vassiliadisova média. Alonso a kol. (1992) srovnával vhodnost použití dvou tekutých médií k pomnožení a Rambachova a Hektoen agaru k izolaci salmonel z mořské vody. Rambachův agar spolu s testovanými tekutými médii prokázal největší účinnost a selektivitu. Vykultivované kolonie byly podrobeny aglutinaci se séry proti O, Vi a H antigenům. Kromě sérologické typizace bylo popsáno použití fagotypizace či analýzy celobuněčných proteinů SDS-PAGE (Betancor a kol., 2004). Genotypové metody: Identifikaci salmonel pomocí PCR použila řada autorů. Jones a kol. (1993) a Burtscher a kol. (1999) použili k identifikaci gen hns (DNA vazebný protein). Amplifikaci sekvence genu hilA (hyperinvazivní lokus A ostrova patogenity 1) popsali Cardona-Castro a kol. (2002) a Pathmanathan a kol. (2003). Cohen a kol. (1996) zkoumal možnost identifikace salmonel pomocí amplifikace fragmentu genu fimA (hlavní podjednotka fimbrie typu 1), Feder a kol. (2001) invA (gen invazivity) a Riyaz-Ul-Hassan (2004) stn (gen pro enterotoxin salmonel). Molekulární typizací izolátů Salmonella enterica ssp. enterica se zabývala Thorpdahl a kol. (2005). Testovala využití metod MLST, PFGE a AFLP. Z těchto metod byla zvolena jako nejvhodnější metoda PFGE.
1.4.3 Izolace a identifikace enterokoků Fenotypové metody: Pro izolaci a identifikaci enterokoků byla popsána řada kultivačních médií. U nás se podle ČSN EN ISO 7899–2 (tab. 1.1) používá selektivní médium Slanetz-Bartley s následnou konfirmací produkce eskulinu.
22
Brodsky a Schiemann (1975) hodnotili záchyt intestinálních enterokoků na Pfizerově selektivním enterokokovém (PSE) a KF agaru (médium pro stanovení intestinálních enterokoků podle American Public Health Association) a zjistili, že na PSE byl sice záchyt nižší, ale toto médium bylo selektivnější. Slanetz a kol. (1957) sledoval počty intestinálních enterokoků ve vodě a výkalech pomocí m-enterokokového agaru, který vyvinul. Yoshpe-Purer (1989) srovnávala použití KF, m-enterokokového a žlučeskulinového agaru pro stanovení intestinálních enterokoků v mořské vodě. KF médium bylo shledáno neselektivním a nevhodným k izolaci intestinálních enterokoků z mořské vody. Přehled dostupných chromogenních a fluorogenních médií k izolaci intestinálních enterokoků uvádí ve své práci Manafi (2000). K detekci intestinálních enterokoků podle standardních (normovaných) metod jsou využívána média podle Slanetze-Bartleyové, aziddextrózový bujón a média s přídavkem eskulinu a nebo žlučových kyselin (Doming a kol., 2003a). Z dalších fenotypových metod byly pro typizaci popsány: biotypizace na základě fermentace cukrů a enzymatické aktivity (Lang a kol., 2001), analýza profilů celobuněčných proteinů SDS-PAGE (Tyrrell a kol., 2002), latexová aglutinace (Petts, 1995), MLEE (Tomayko a kol., 1995) či analýza metylesterů mastných kyselin (FAME) (Lang a kol., 2001). Genotypové metody: K molekulární identifikaci a typizaci enterokoků jsou využívány metody: PCR zaměřená na amplifikaci úseků genů pro 23S rRNA (Frahm a kol., 2003), 16S rRNA (Santo Domingo a kol., 2003) nebo tuf genu, který kóduje elongační faktor Tu (Ke a kol., 1999), FISH, RAPD, AFLP, ribotypizace (Beimfohr a kol., 1993; Doming a kol., 2003b) aj.
1.4.4 Izolace a identifikace Clostridium perfringens Fenotypové metody: Klasická identifikace C. perfringens podle Vyhl. 252/2004 Sb. spočívá v kultivaci v thioglykolátovém bujónu, na mCP agaru, zesíleném klostridiovém bujonu či tryptózosulfit-cykloserinovém agaru za anaerobních podmínek (Votava, 1999; Goldner a kol., 1985; Armon a kol., 1988; Bisson a Cabelli, 1979). Pro typizaci izolátů se používají sérologické metody (McClane a kol., 1984; Genigeorgis a kol., 1973; Fach a kol., 1997). Genotypové metody: Pro identifikaci C. perfringens je nejrozšířenější používanou metodou PCR. Augustynowicz a kol. (2002), Fach a kol. (1997) a Kanakaraj a kol. (1998) identifikovali C. perfringens pomocí genů plc (fosfolipáza C) a cpe (enterotoxin). Yoo a kol. (1997) ve své práci provedl pomocí PCR rozdělení izolátů do pěti skupin podle schopnosti produkovat hlavní letální toxiny. Van Damme-Jongsten (1990) zjišťovala přítomnost genu pro enterotoxin DNA hybridizací u C. perfringens typu A. Billington a kol. (1998) hledal u izolátů C. perfringens typu E tichý gen pro enterotoxin. Typizace izolátů byla provedena
23
např. ribotypizací, RFLP, PFGE nebo analýzou plazmidů (Schalch a kol., 1994; Maslanka a kol., 1999; Eisgruber a kol., 1995; Sparks a kol., 2001).
1.4.5 Izolace a identifikace legionel Fenotypové metody: První kultivace byla provedena na agaru Mueller-Hintonové s přídavkem hemoglobinu a IsoVitaleXu (suplement s L-cysteinem), které byly později nahrazeny pyrofosfátem železitým a L-cysteinem a vedly k vývoji Feeley-Gormanova agaru (Feeley a kol., 1978). Později byl aktivním uhlím nahrazen škrob a zdrojem aminokyselin se stal kvasničný extrakt, což je základ pro většinu médií používaných ke kultivaci legionel (Feeley a kol., 1979). V současné době se používá agar s aktivním uhlím a kvasničným extraktem obohacený α-ketoglutarátem a selektivními doplňky (Fields a kol., 2002). Ke stanovení legionel z vodovodní vody z nemocnic byla Reinthalerem a kol. (1993) testována tři selektivní média: MWY, BMPAα a GVPC agar (média se selektivními suplementy pro kultivaci legionel). Autor doporučil používat ke kultivaci GVPC agar po úpravě vzorku kyselinou. Bartie a kol. (2003) izolovala legionely z prostředí na αBCYE (médium s růstovým suplementem pro kultivaci legionel), GVPC a MWY agaru. Nejcitlivějším médiem bylo médium αBCYE, selektivita u těchto médií byla srovnatelná. Metoda přímé fluorescence byla popsána k detekci legionel v plicní tkáni a respiračních sekretů nebo k identifikaci izolátů legionel (Hayden a kol., 2001). Ze sérologických metod je známá nepřímá imunofluorescence, enzymatická imunoanalýza a mikroaglutinace (Farnshy a kol., 1978; Klein a kol., 1979). Metoda MLEE byla použita k odlišení subtypů L. pneumophila (Selander a kol., 1985). Metoda, zavedená v posledních letech v ČR (ČSN ISO 11731-2), je založena na zakoncentrování vzorku a jeho tepelné nebo kyselé úpravě za účelem minimalizace doprovodné mikroflóry a kultivaci na tlumivém kultivačním médiu s aktivním uhlím a kvasničným extraktem a tlumivém kultivačním médiu s aktivním uhlím, kvasničným extraktem a selektivním suplementem. Genotypové metody: Genotypová identifikace legionel je založena především na amplifikaci sekvence genu pro 5S rRNA, 16S rRNA a oblasti 23S-5S spaceru (mezigenový mezerník) (Mahbubani a kol., 1990; Miyamoto a kol., 1997; Rantakokko-Jalava a Jalava, 2001; Bej a kol., 1991d; Herpers a kol., 2003). Identifikace L. pneumophila spočívá v amplifikaci úseku genu mip (zesilovač infektivity pro makrofágy) (Bej a kol., 1991c; Ballard a kol., 2000; Catalan a kol., 1994; Declerck a kol., 2003b; Lindsay a kol., 1994; 2003; Pascal a kol., 2001; Wellinghausen a kol., 2001; Wilson a kol., 2003). Hybridizaci kolonií použil Satoh a kol. (2002). K odlišení kmenů L. pneumophila byly použity metody PFGE, RAPD, AFLP, ribotypizace, plazmidová analýza (Gomez-Lus a kol., 1993; Valsangiacomo a kol., 1995; Maher a kol., 1987; Fields a kol., 2002) aj.
24
1.4.6 Izolace a identifikace Staphylococcus aureus Fenotypové metody: Pro stanovení S. aureus jsou standardně používány kultivační metody. U nás je podle ČSN EN ISO 6888-1 běžné použití Baird-Parkerova agaru a konfirmace koagulací králičí plazmy. Flowers a kol. (1977) sledoval růst stresovaných bakterií S. aureus na následujících médiích po přídavku katalázy: Baird-Parkerova agaru, tryptikázo-sójového (TSA), TSA se 7 % NaCl, Vogel-Johnsonova agaru, slaného agaru s manitolem, telurit-polymyxinžloutkového agaru, staphylococcus 110 agaru, tryptikázo-sójového bujónu (TSB) a TSB s 10 % NaCl. Výsledkem jeho práce bylo zjištění, že přítomnost katalázy výrazně zvyšuje počet resuscitovaných buněk. Niskanen a kol. (1978) porovnával šest selektivních médií pro stanovení enterotoxinogenních kmenů Staphylococcus aureus a zjistil, že BairdParkerův agar je z nich nejvhodnější. Biotypizace, fagotypizace, imunoblotování, MLEE apod. slouží spolu s genotypovými metodami k charakterizaci kmenů S. aureus (Tenover a kol., 1994). Genotypové metody: Pro detekci Staphylococcus aureus byla popsána amplifikace genu nuc (termonukleáza) (Kim a kol., 2001). U meticilin rezistentních kmenů je pozornost zaměřena na hledání sekvence mecA (meticilinová rezistence) genu (Jaffe a kol., 2000; Mason a kol., 2001). Pro typizaci izolátů lze použít metody: ribotypizace, plazmidová analýza, restrikční analýza amplifikovaného genu pro koagulázu, typizace sekvence IS257/431, restrikční analýza inter-IS 256, PFGE aj. (Tenover a kol., 1994; Deplano a kol., 1997).
1.4.7 Izolace a identifikace Pseudomonas aeruginosa Fenotypové metody: Základní metodou podle ČSN EN 12780 pro detekci P. aeruginosa je kultivace na selektivních médiích s cetrimidem a kyselinou nalidixovou (Kodaka a kol., 2003; Doern a kol., 1992; Fonseca a kol., 1986). Charakterizace kmenů se provádí biotypizací, sérotypizací nebo stanovením antibiotické citlivosti (Hernandez a kol., 1997). Genotypové metody: Z těchto metod je známa aplikace PCR, zaměřená na detekci specifických úseků genů 16S rDNA, algD (alginát), oprI a oprL (otevřený čtecí rámec), genu pro exotoxin A (da Silva Filho a kol., 1999; McIntosh a kol., 1992; De Vos a kol., 1997; Spilker a kol., 2004; Khan a kol., 1994). Metody jako plazmidová analýza, ribotypizace, RAPD, PFGE jsou používány k typizaci kmenů (Hernandez a kol., 1997; Bennekov a kol., 1996; Blanc a kol., 1993; Kersulyte a kol., 1995; Mahenthiralingam a kol., 1996).
25
