Kapilláris elektroforézis lehetőségei a haematológiai-immunológiai laboratóriumi diagnosztikában Miklós Kata, Szabó Zsófia és Németh Julianna Országos Gyógyintézeti Központ (OGYK), Immundiagnosztikai Osztály Budapest, Szabolcs utca 2007. január A különböző testváladékok fehérjéinek analízise elektroforézissel fontos laboratóriumi vizsgálat, melynek segítségével az egyes fehérje frakciók szétválaszthatók, mennyiségi és minőségi eltérései láthatóvá, mérhetővé tehetők. A klinikai gyakorlatban leggyakrabban szérum és/vagy vizelet minták fehérjeeltéréseit vizsgáljuk. A fehérje elektroforézisnek kiemelkedő jelentősége van a gammopathiákkal járó hematológiai-immunológiai betegségekben, de diagnosztikai értékű lehet gyulladásos betegségekben, fertőzésekben, vesebetegségekben és immunológiai eltérésekben. A modern laboratóriumi diagnosztikában jó felbontásuk miatt (high resolution) két elektroforézis rendszert alkalmazunk: az agaróz gél elektroforézist és a kapilláris elektroforézist. A kapilláris elektroforézisnél (capillary electrophoresis, CE) az elektromos térben való vándorlás és elválasztás egy vékony, puffer oldattal töltött kapillárisban történik. A kapilláris nagy elektromos ellenállásánál fogva jelentős térerő alakul ki, mely rövid mérési időt, valamint nagy elválasztási hatékonyságot és felbontást biztosít. Az elektroozmotikus áramlás pedig lehetővé teszi valamennyi oldott részecske egyidejű vizsgálatát, a töltéssel nem rendelkezőkét is. Minimális mintamennyiséget igényel (1-100 µl), könnyen automatizálható. Ezért a CE széles körben alkalmazható: pl. aminósavak, vitaminok, peptidek, fehérjék, szénhidrátok, de DNS részek ill. sejtek, vírusok elválasztásához, meghatározásához is. A korszerű, nagy mintaszámot feldolgozó központi labordiagnosztikai műhelyekben néhány éve alkalmaznak kapilláris elektroforézis készülékeket. Az OGYK Immundiagnosztikai Osztálya 2004-ben az országban elsőként tért át a szérumfehérjék kapilláris készülékben történő analizálására, a Sebia Capillarys b1b2 készüléken.
Alfa-2: haptoglobin ceruloplasmin Gc globulin α2 macroglobulin α lipoprotein
albumin Alfa-1:
beta2
β lipoprotein C3 complement
beta1
α1 antitrypsin transferinorosomucoid hemopexin α1 antichymotrypsin
gamma
1. ábra: egészséges, normál szérumfehérje -frakciók (bal) ill.-komponensek (jobb) kapilláris elektroforézis képe
1
Haematológiai-immunológiai szempontból hangsúlyosan a béta és gamma frakciókban megfigyelhető változások kapnak jelentőséget, de az albumin ill. alpha frakciók lefutása is klinikailag értékes információt hordozhat. Az alábbiakban néhány példát mutatunk be.
albumin
alfa-1
alfa-2
béta
gamma
2. ábra két komponensből álló albumin frakció, ami az igen ritkán megfigyelhető bisalbuminaemiának felel meg
albumin alfa-1 alfa-2
béta
gamma
3. ábra: jelentősen emelkedett alpha1 és alpha2 frakciók, amely aktív gyulladásos folyamatot jelez. Poliklonális gammopathia jelentősen emelkedett gamma frakciót eredményez, mely autoimmun kórképre utal. Monoklonális komponens (M komponens) jelenléte a szérumban és/vagy vizeletben haematológiai szempontból az egyik legfontosabb elváltozás az elektroforetikus görbe béta vagy gamma frakciójában. Kimutatása diagnosztikai értékű az un. monoklonális gammopathiákban. A monoklonális gammopathiák az immunrendszer B-limfoid sejtjeinek gyakran rosszindulatú betegségei. Legismertebb típusa a mieloma multiplex. A monoklonális gammopathiák közös tulajdonsága a kóros (monoklonális) intakt immunglobulint (nehéz és könnyűlánc együtt) vagy csak könnyűláncot változó mennyiségben termelő B-sejt klón jelenléte. A monoklonális immunglobulin (Ig) általában gamma (IgG), alfa (IgA) vagy mű (IgM) nehézláncot és egyfajta könnyűláncot (kappa vagy lambda) tartalmaz. Ezeket az immunglobulinokat azonos kémiai szerkezet jellemzi, mely azonos mozgékonyságot eredményez és az elektroferogrammon homogén csík, M komponens jelenik meg. A mielomák mellett monoklonális immunglobulin termeléssel többféle betegség járhat pl: - monoklonális gammopathia ismeretlen jelentőséggel (MGUS) 2
- fertőzések - autoimmun kórképek - non-Hodgkin limfóma - krónikus limfoid leukémia A monoklonális komponens mennyiségi-minőségi elemzésének döntő jelentősége van a diagnózis felállításában, a terápia követésében és mivel a monoklonális immunglobulin mennyisége korrelál a tumoros sejt tömeggel prognosztikai jelentőséggel is bír.
4. ábra M komponens a béta (bal) ill. gamma (jobb) frakciókban A készülékhez kapcsolt számítógépes szoftver segítségével lehetőség van a homogén komponens alatti terület bejelölésére, százalékos arányának kifejezésére, ill. az összfehérje érték ismerete mellett a paraprotein mennyiség g/l-ben történő megadására. Ennek döntő jelentősége van a kezelés megválasztásában, annak követésében vagy pl. csontvelő transzplantáció után a fennmaradó vagy ismételten megjelenő betegség ellenőrzésében. Az elektroforézissel kimutatott homogén immunglobulint a gyakorlatban un. immunfixációs eljárással azonosítjuk. Így lesz teljes a korábban immunelektroforézis-ként elterjedt diagnosztikai eljárás.
3
.
5. ábra: normál (negatív) szérum immunfixációs képe (jobb)
6. ábra: M komponens: éles, homogén csúcs a béta-gamma frakció határán (bal) homogén festődési csík egy nehéz és egy könnyűláncban azonos magasságban, IgG lambda típusú monoklonális gammopathia immunfixációs képe (jobb).
7. ábra: biklonális gammopathia: két homogén csík két különböző nehézláncban IgG kappa és IgA kappa biklonális gammopathia 4
8. ábra: oligoklonális gammopathia: IgG kappa/lambda α-, µ- nehézlánc Megoldandó problémák, melyek kapilláris elektroforézissel elnézhetők pl.: a szérumból vagy vizeletből kimutatható monoklonális szabad könnyűlánc (Bence Jones protein, BJP) vesetoxikus hatású, mely súlyos következményekkel járhat.
albumin
alfa-1 alfa-2
béta
gamma
9. ábra monoklonális szabad könnyűlánc „megbújása” a béta frakcióban (bal), könnyűlánc gammopathia: homogén csík csak a lambda könnyűláncban (jobb)
rejtett M komponens
IgA lambda típusú monoklonális gammopathia
5
10. ábra: a látszólag normál szérum elektroforézis görbe (bal), immunfixációval a kis mennyiségű M komponens azonosítható (jobb) Újdonság a kapilláris elektroforézis készülékre kifejlesztett un. immunotyping rendszer, mely nem más, mint a kapilláris elektroforézishez kifejlesztett immunfixáció. Az elektroforézis, majd az M komponens azonosítása egy lépésben történik. A mintacső mellett 5 küvettában 5 különböző antiszérumot mérünk anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-ĸ és anti-λ antiszérumokat
11. ábra: immunotyping alap elektroforézis görbéje antiszérum nélkül: kettős M komponens a gammában A rendszer az öt antitestet külön csövekben, egyenként méri a vizsgálandó mintához, specifikus reakció esetén immunkomplex alakul ki, mely csökkenti a mobilitást, ezáltal eltérés figyelhető meg a referencia görbéhez képest
M komponens gammában
anti-IgG
anti-IgM
anti-kappa
IgG kappa/lambda gammopathia
6
anti-IgA
anti-lambda
Vizelet fehérjék immunológiai vizsgálata ☺minta előkészítése: - vizelet bekoncentrálás (érzékenység növelés) - elektroforetikus fehérje szétválasztás - immunfixáció specifikus ellenanyagokkal: szabad könnyűláncokkal is - festés
ELP GAM K L Kf Lf ELP GAM K L Kf Lf
Bence Jones protein (BJP) nem ürül
szabad könnyűlánc (BJP) ürül
AHS GAM ĸ λ free ĸ free λ
Újdonság a vizeletvizsgálatra kifejlesztett kapilláris elektroforézis teszt (capillarys urine teszt) A vizsgálandó vizeletmintát gyári mintacsövekben három lépésben előkészítjük, ezek: centrifugálás - koncentrálás - dializálás - futtatás/detektálás
GAM
kappa
free kappa
12. ábra: kevés albumin mellett Bence Jones protein a vizeletben, kimutatás kapilláris elektroforézissel (bal), azonosítás agaróz gélen immunfixációval (jobb)
7
GAM
kappa(ĸ) freeĸ
13. ábra: mini Bence Jones protein a vizeletben, kimutatás kapilláris elektroforézissel (bal), azonosítás agaróz gélen immunfixációval (jobb)
GAM
ĸ
λ
freeĸ freeλ
14. ábra: intakt immunglobulin mellett szabad könnyűlánc ürül a vizeletben (Bence Jones protein), kimutatás kapilláris elektroforézissel (bal), azonosítás agaróz gélen immunfixációval (jobb) Felhasználói tapasztalataink alapján megállapítható, hogy a kapilláris elektroforézis módszer a klinikai diagnosztikában hi-tech eljárás, melynek segítségével egészen kezdeti kórós elváltozásokat (gammopathiákat) is megtalálunk, így lehetőség van a betegség korai felismerésére, terápiájára. A teljesen automatizált futtatás minta felhasználása csekély, kis mennyiségű (gyermek) mintákból is eredményesen tudunk dolgozni. A rendszerhez csatolt software lehetővé teszi a görbék archiválását, a többszöri megjelenéskor kapott görbék egymásra vetítését, a betegek longitudinális követését. Mindez hatékonyan segíti a laboratóriumi szakemberek munkáját, a leletek interpretációját.
8
