1�6z. Ut\U
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Perbandingan Efektifitas dari Fish Oil, Kurkumin dan Metformin pada Perbaikan Resistensi Insulin Mencit Obes
l • t·�e}j I9?cr9n re,.,,r;j ...1{�}�\1PP nf1Ci1��) 3n;·� n ,. ..
Nama Penyusun Laporan : 1.
Mardiana
2.
Nur Ashari
3. A. Yasmin Syauki
Bagian ilmu Gizi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar
2011
·
..
.
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Perbandingan Efektifitas dari Fish Oil, Kurkumin dan Metformin pada Perbaikan Resistensi Insulin Mencit Obes
_ _ _
f6atlao Pencli.l.iC!l dun Pcngemb:m�:m Kt'M.�hr.llw PERPUSTAKAAN ----·
Nama Penyusun Laporan :
1. Mardiana 2. Nur Ashari 3. A. Yasmin Syauki
Bagian ilmu Gizi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar 2011
--
DAFTAR lSI
.
. . .
'
Halaman
i-ii
DAFTAR lSI BAB I.
BAS II.
PENDAHULUAN
1.1
Latar-belakang masalah ...................... .
1
1.2
Rumusan masalah ..............................
.
6
1.3
Tujuan Penelitian .
..
7
1.3.1
Tujuan Umum ...................................... .
7
1.3.2
Tujuan Khusus .................................... .
7
1.4
Hipotesis Penelitian
1.5
Manfaat Penelitian ...............................
.
....
. . ..
......
............
..
.. .
....
..
.
......
. .. .
..........
8
..
8
.
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
11.1.
Efek Fish Oil Terhadap Sensitivitas Insulin ... .. . .. . . . . . .. .. . ... .. . . . . . . . ... . . . ...
11.2
12
.
Efek Kurkumin Terhadap Sensitivitas Insulin ... . . . :
. . .. . .
. . .. . .
BAB Ill.
KERANGKA KONSEP
BAB IV.
METODOLOGI PENELITIAN
. .
. . . . . .
.
15
. . . . . . . . ... .
... . . . .. . . . . . . . ......... . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . .
IV. 1
Desain Penelitian
IV.2
Tempat dan waktu penelitian .............
································
..
20
21 21
IV.3
Subyek Penelitian .................. .......
IV.4
ljin Penelitian dan
IV.5
AIat dan Bahan Penelitian .................
IV.6
Prosedur Penelitian............................
22
IV.7
Cara Pengumpulan Data .............
27
IV.8
ldentifikasi Variabel ....................
IV. 9
Definisi Operasional. .....................
IV.10
Analisis Data dan Uji Statistik............
31
IV. 1 1
Alur Penelitian............................
31
Ethical C/eartmce..
.
.
.
.
.
21 21 22
27
. .
.
.
28
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1
Hasil... . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . ..
32
fV.2
Pembahasan... . . . . . ... . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . .
37
.
.
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN V.1
Kesimpulan...
... ... ... ... . . . ... ... ... ... ... ...
41
V.2
Saran... .. .. . .. . . . . .. . . .. . . . . .. .. . . .. . . . .. . . . . .. . .
42
DAFTA R PUSTAKA . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . .. .. . . ... .. .. .. . . . .. .. .. .. . . . . . .. .. . . .. . ..
43
LAMPIRAN
48
...
.
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
1
BAB I PENDAHULUAN
Obesitas dengan
didefinisikan
penimbunan
jaringan
sebagai lemak
suatu secara
keadaan yang berlebihan
ditandai
dari
yang
diperlukan untuk fungsi tubuh yang normal. Obesitas telah menjadi pandemi global di seluruh dunia dan dinyatakan oleh
Word Health
Organization (WHO) sebagai masalah kesehatan kronis terbesar pada orang dewasa (Soegih R, 2009). Pada tahun 2003 Badan Kesehatan Dunia
(WHO} menunjukkan data bahwa 17,5% populasi Indonesia
dikategorikan over weight (kegemukan) dan 4, 7% obesitas. Apabila digunakan klasifikasi obesitas untuk orang Asia yaitu indeks massa tubuh lebih dari 25 kg/m2, maka hasilnya menjadi 48,97% pria dan 40,65% wanita (Nugraha, 2009). Hasil
penelitian
akhir-akhir
ini
menunjukkan
bahwa
jaringan
adiposa bukan hanya sebagai tempat penyimpanan lemak, tetapi juga merupakan organ endokrin yang berperan penting dalam interaksi dengan signal endokrin, metabolik dan inflamasi untuk mengatur homeostasis energi. Matsuzawa dkk telah buktikan set lemak (adiposa) mengsekresi berbagai macam protein ke dalam sirkulasi. Protein ini secara kolektif disebut sebagai adipositokin, yang sekarang lebih sering disebut sebagai adipokin, yaitu leptin,
plasminogen activator inhibitor�1 (PAI-1), adipsin,
resistin, dan adiponektin. Tidak seperti yang lainnya, adiponektin ternyata
2
unik oleh karena dapat meningkatkan sensitivitas insulin (Matsuzawa Y, 2004). Penelitian akhir-akhir ini merubah pandangan kita tentang jaringan adiposa. Anggapan awal bahwa jaringan adiposa merupakan jaringan yang pasif dan hanya berfungsi sebagai tempat menyimpan kelebihan energi (dalam bentuk trigliserida) telah berubah secara drastis. Asam lemak bebas adalah bentuk bebas lipoprotein akibat adanya enzim
lipoprotein lipase
(LPL)
yang masuk
ke
dalam
sel
adiposa, dan
berkumpul kembali dalam bentuk trigliserida melalui proses esterifikasi menjadi gliserol. Sel adiposa mempunyai peran fisiologi yang penting dalam memelihara trigliserida dan kadar asam lemak bebas, juga mempengaruhi resistensi insulin.
Dengan demikian jaringan adiposa
saat
aktif
ini merupakan jaringan yang
berperan
dalam mengatur
secara aktif jalur homeostatis energi. Aktivitas tersebut dikendalikan oleh jalinan kerja sinyal hormonal dan neuronal yang kompleks (Bray, 2004) (Fruhbeck G, 2001).
Jaringan lemak mempunyai dua fungsi yaitu sebagai tempat penyimpanan lemak dalam
bentuk trigliserida, dan sebagai organ
endokrin. Sel lemak menghasilkan berbagai harmon yang disebut juga adipositokin (adipokin) yaitu leptin, tumor necrosis factor alpha (TNF-alfa), interleukin-6 (IL-6), resistin, dan adiponektin. Hormon-hormon tersebut berperan juga pada ter jadinya resistensi insulin.
3
Sel adiposa yang membesar akan merangsang te�adinya inflamasi sehingga makrofag masuk ke jaringan adiposa dan melepaskan sekret protein proinflamasi. Oleh karena itu mengendalikan respon proinflamasi bermanfaat mencegah atau memperbaiki efek patologis dari obesitas (Kelley D, 2000). Jaringan adiposa model binatang coba yang obes ditandai dengan adanya suasana inflamasi atau disebut juga sebagai sel lemak yang sedang "sakir (sick fat cells), serta tampak adanya infiltrasi makrofag yang sejalan dengan derajat obesitas. Perubahan pada sel adiposa dalam hal jumlah dan ukuran sel, menyebabkan perubahan pada daerah sekitamya dan te�adi modifikasi fungsi parakrin dari jaringan adiposa (Lee, 2005).
Pada
kondisi obesitas akan
terjadi
penurunan
konsentrasi
adiponektin. Penurunan kadar adiponektin diduga berperan dalam patogenesis resistensi insulin terlepas apakah termasuk kategori obesitas atau tidak, penyakit kardiovaskular yang terkait dengan obesitas (Yildiz 80,
2004), (Chandran M,2003), (Trujillo ME, 2005) . Konsentrasi
adiponektin disimpulkan ada hubungan yang kuat dengan obesitas sentral dan resiko penyakit
kardiovaskuler (Smith, 2006). Obesitas sentral
mempunyai risiko hipoadiponektinemia 5 kali lebih besar dibandingkan dengan non obesitas sentral (Gotera, 2006). Adiponektin merupakan salah satu dari banyak faktor spesifik jaringan adiposa. Adiponektin berperan memperbaiki sensitivitas insu1in
4
dan menghambat peradangan vaskuler. Kadar adiponektin di dalam plasma secara bermakna menurun pada subyek yang mengalami obesitas, resistensi insulin, dan pengidap diabetes melitus tipe 2 (Roberto B, 2004). Berbagai penelitian menunjukkan bahwa aktifasi AMP kinase merupakan bagian dari efek signalling dari adiponektin. AMP kinase akhir akhir ini, dianggap sebagai komponen yang berperan dalam mekanisme kerja metformin sehingga diduga adiponektin mempunyai efek metabolik anti diabetik melalui peningkatan sensitivitas insulin (Fernandez-Real, 2004). Secara garis besar dampak adiponektin terhadap respon inflamasi adalah menghambat produksi TNF-a, sehingga dianggap adiponektin adalah anti inflamasi (Chandran M, 2003). Adiponektin juga menurunkan kadar trigliserida hati dan otot melalui peningkatan ekspresi gen peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)
a
dan y (Chan NN,
2005). Saat ini penelitian ekstrak kurkuma
lebih
difokuskan
pada
mekanisme efek molekulemya. Kurkumin sebagai zat aktif yang terdapat pada ekstrak kurkuma diketahui mempunyai sifat anti inflamasi dengan cara menghambat produksi IL-1 , IL-6 dan TNF-a dan merangsang sekresi IL-10 pada hewan coba (Sharma, 2007). Kurkumin juga dilaporkan mempunyai efek anti inflamasi yang diperlihatkan dengan memicu ekspresi PPARy (Leu TH; 2002).
5
Fish
oil yang banyak mengandung n�3 sebagai prekursor EPA dan
DHA telah dibuktikan dalam beberapa penelitian mempunyai efek anti inflamasi. Penelitian oleh Neschen melaporkan fish oil 27% dalam diet binatang percobaan dapat memicu sekresi adiponektin secara tidak langsung, yaitu melalui jalur PPAR-y dan PPAR-a (Neschen, 2006). Kurkumin dan fish oil keduanya merupakan bahan alami yang berlimpah di tanah air kita, pemanfaatan keduanya perlu dilakukan untuk memberi manfaat bagi kita semua. Dari beberapa bukti diatas bahwa efek fish oil dan anggap
kurkumin sebagai anti inflamasi maka penelitian ini saya
penting
dilakukan
sehingga
nantinya
keduanya
dapat
direkomendasikan sebagai suplementasi bagi penderita obes. Penelitian ini dilakukan pada mencit mengingat pada penelitian hewan perbedaan faktor genetik dapat dikendalikan dan pengaruh rancu dari lingkungan dapat diminimalisasi sehingga patomekanisme penyakit dapat menjadi lebih baik ditelusuri dibanding penelitian pada manusia. Menurut pengetahuan kami, belum pernah ada penelitian untuk membandingkan efek gabungan keduanya dengan melihat peningkatan sensitivitas
insulin
berdasarkan
adiponektin
dengan kontrol positif
mekanisme
peningkatan
kadar
obat anti diabetes metformin pada
mencit obes maka kami anggap sebagai nilai novel penelitian ini. Berdasarkan uraian di atas maka hal tersebut mendorong penulis untuk melakukan penelitian mengenai "pengaruh pemberian
fish
oil,
6
ekstrak kurkuma dan terhadap peningkatan kadar adiponektin mencit obes".
1.2 rumusan masalah Berdasarkan Jatar belakang yang telah diuraikan di atas maka dapat dirumuskan masalah penelitian sebagai berikut yaitu : 1. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap perbaikan sensitivitas insulin pada mencit obes ? 2. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap berat badan pada mencit obes ? 3. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap peningkatan kadar adiponektin, pada mencit obes ? 4. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap penurunan TNF-a, pada mencit obes? 5. Sejauh mana pengaruh pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dibanding metformin terhadap penghambatan ekspresi Sterol Regulatory Element Binding Protein (SREBP-1c) pada mencit obes? 6. Sejauh
mana
hubungan
peningkatan
kadar
adiponektin
penurunan TNF-a, penghambatan ekspresi Sterol Regulatory
7
Element Binding Protein (SREBP-1c) dengan penurunan berat badan dan sensitivitas insulin melalui tes toleransi glukosa, tes toleransi insulin pada mencit obes?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum Melihat pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit obes.
1.3.2 Tujuan Khusus a. Membandingkan berat badan sebelum dan setelah intervensi pada mencit kontrol dan perlakuan. b. Membandingkan resistensi insulin melalui tes toleransi glukosa dan Insulin (TTG
&
TTl) setelah intervensi pada mencit kontrol dan
perlakuan. c. Menganalisa
mekanisme
perbaikan
resistensi
insulin
dan
metabolisme glukosa dengan mengukur kadar protein dan ekspresi adiponektin, TNF-a, SREBP-1c, setelah intervensi pada mencit kontrol dan perlakuan.
8
1.4. Hipotesis Penelitian Pemberian fish oil dan ekstrak kurkuma dapat memperbaiki resistensi insulin melalui peningkatan kadar adiponektin, penurunan TNF a,
penghambatan ekspresi Sterol Regulatory Element Binding Protein
(SREBP-1c) dan penurunan berat badan mencit obes.
1.5 Manfaat Penelitian a. Memberikan informasi ilmiah mengenai manfaat suplementasi fish oil dan kurkuma dalam perbaikan metabolism glukosa melalui peningkatan kadar adiponektin, penurunan TNF-a dan penurunan ekspresi SREBP-1c sehingga meningkatkan oksidasi lemak. b. Memberi informasi kepada masyarakat manfaat suplementasi fish oil dan kurkuma yang dapat menurunkan berat badan penderita obes. c. Dapat dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya untuk menggali mekanisme molekuler selanjutnya. d. Dapat menjadi bahan pertimbangan industri masyarakat untuk lebih mengembangkan pemanfaatan fish oil (minyak ikan) dan kurkuma (kunyit) karena berdasarkan manfaatnya bagi penderita obes. e. Dapat
dijadikan
sebagai
sumber
informasi
untuk
peneliti
selanjutnya, antara lain penelitian dengan suplemen gabungan keduanya
pada
penelitian
berhubungan dengan obesitas.
manusia
pada
penyakit
yang
9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Jaringan adiposit model binatang coba yang obes ditandai dengan adanya suasana inflamasi atau disebut juga sebagai sel lemak yang sedang "sakif (sick fat cells}, serta tampak adanya infiltrasi makrofag yang sejalan dengan derajat obesitas. Perubahan pada adiposit dalam hal jumlah dan ukuran sel, menyebabkan perubahan pada daerah sekitarnya dan terjadi modifikasi fungsi parakrin dari adiposit. Pada keadaan obes, adiposit akan mengsekresi TNF-a, yang akan menstimulasi preadiposit mengeluarkan monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Dengan pola yang sama, sel endotel juga menghasilkan MCP-1 sebagai respons terhadap rangsangan sitokin. (Lee,2005)
Resistensi
insulin
pada
keadaan
prediabetes
menyebabkan
peningkatan faktor-faktor pro inflamasi seperti hsCRP, TNFa, IL-6 serta terjadinya penurunan faktor anti inflamasi. Penelitian oleh Pradhan dkk menyimpulkan bahwa kadar hsCRP dan kadar IL-6 yang tinggi merupakan faktor risiko bagi penyakit diabetes mellitus dan kardiovaskuler di kemudian hari. (Pradhan,2001)
Pada
kondisi
obesitas
adiponektin. Penurunan
akan
terjadi
penurunan
konsentrasi
kadar adiponektin diduga berperan dalam
patogenesis resistensi insulin ter1epas apakah termasuk kategori obesitas
10
atau tidak. (Chandran M,2003) (Trujillo ME, 2005)
Adiponektin teHetak
pada kromosom 3q27, sebuah lokus yang juga diketahui secara struktural homolog dengan TNF�a. Produksi TNF a yang berlebihan oleh jaringan adiposa menyebabkan terjadinya resistensi insulin. Penurunan kadar adiponektin plasma berperan kausatif terhadap perkembangan resistensi insulin. (Hotta,2000). adiponektin
Oleh
terhadap
sebab
respon
itu
secara
inflamasi
garis
adalah
besar
dampak
menghambat
efek
proinflamasi dari TNF-a, sehingga ada anggapan adiponektin sebagai anti inflamasi.
Adiponektin adalah protein yang disekresikan secara spesifik oleh adiposit. Kadarnya akan meningkat sebagai respon terhadap adanya paparan agonis PPARy sehingga kadar adiponektin dalam serum akan meningkat secara signifikan. (Bouskila M,2005).
Peningkatan asam lemak bebas pada subyek obes merupakan akibat dari resistensi insulin dan peningkatan TNF-a sehingga terjadi Lipolisis terutama dari lemak
intraperitoneal.
Asam lemak
ini
akan
menghambat kerja insulin di jaringan perifer terutama otot skelet yang akan menggunakan 70% dari glukosa darah. Peningkatan oksidasi lemak di jaringan otot misalnya dengan aktivitas akan meningkatkan sensitivitas
insulin. Obat diabetes golongan metformin merupakan salah satu obat paling unggul untuk meningkatkan sensitivitas insulin melalui peningkatan
11
oksidasi lemak di hati dan otot skelet dengan target peningkatan aktivitas AMPK, PPAR-a, dan inhibisi ekspresi Sterol Regulatory·Eiement Binding Protein (SREBP-1c) di hati yang merupakan faktor transkripsi untuk sintesa protein dan enzim sintesa lemak. Penurunan akumulasi lemak ini akan menurunkan inflamasi yang merupakan penyebab resistensi insulin (Hotta,2000)(8erg AH,2002) (Berg AH, 2005).
Hati merupakan tempat metabolisme asam lemak. Faktor transkripsi SREBP-1c merupakan kunci dalam metabolism asam
lemak
melalui
pengaturan ekpresi variasi gen yang berkontribusi terhadap sintesis asam lemak. Sebuah observasi menyatakan bahwa ekspresi SREBP-1c dalam hati adalah up-regulated pada model tikus obes dan bahwa ekspresi bertebihan transgenik SREBP-1c menginduksi hipertrigliseridemia atau hepatik steatosis, disarankan bahwa peningkatan melimpah
SREBP-1 c yang
dalam hati memberi kontribusi terhadap patogenesis dari
penyakit ini. Mekanisme yang mendasari peningkatan ekspresi SREBP-1c pada binatang obes bagaimanapun
tetap tidak diketahui. (Mototsugu
Takashima, 2009). Prinsipnya bahwa SREBP-1c adalah mediator sentral aktifitas genomik insulin terhadap metabolism karbohidrat dan lipid dalam hati dan jaringam adiposa (Smih, 2002) .
11.1 Efek Fish Oil Terhadap Sensitivitas Insulin
Minyak Omega merupakan minyak yang memiliki kadar tinggi asam lemak omega (omega berarti akhir). Jadi asam lemak Omega-3 berarti memiliki ikatan rangkap tak jenuh yang terdapat pada atom C ketiga dan keempat terakhir dihitung dari gugus methy/-nya, demikian seterusnya bagi Omega-6 dan Omega-9.
Penelitian pada binatang model, untuk melihat kadar adiponektin setelah pemberian omega 3 menunjukkan efek anti inflamasi dapat meningkatkan sensitivitas
insulin melalui mekanisme yang mandiri
PPARy-dependent mechanism dan adiponectin dependent mechanism. Kesimpulan dari penelitian ini bahwa omega 3 berperan untuk menurun gejala gangguan metabolisme seperti peradangan, kelainan kelainan,
fungsi
endotel,
dan tekanan
darah
melalui
Profil
lipid
adiponectin
dependent mechanism. (D, 2007)
Penelitian mencit obesitas dapat melihat omega 3 mencegah resistensi insulin melalui jalur PPARa-dependent pathway dimana diacylglycerol (DAG) dianggap sangat berperan sebagai prediktor sensitivitas insulin. (Neschen S, 2006)
13
Pada model tikus obesitas dan lipoatrofi, terjadi resistensi insulin yang disertai dengan penurunan kadar adiponektin. Pada manusia, kadar adiponektin secara bermakna lebih rendah pada keadaan resistensi insulin, termasuk diabetes tipe-2 .. Penelitian meta analisis membuktikan pengaruh omega 3 dalam menurunkan glukosa darah pada penderita diabetes. (Friedberg C, 1998). Omega 3 juga dapat meningkatkan adiponektin plasma pada penelitian tikus. (Duda MK, 2007) Kenyataan membuktikan jaringan adiposit berhubungan erat dengan ukuran besarnya sel adiposit dan menyebabkan ekspresi proinflamasi, sehingga timbul resistensi insulin, seperti TNF a. (Weisberg S P, 2003) (Xu H, 2003)·
Pada beberapa penelitian tahun-tahun terakhir menjelaskan efek omega 3 menjelaskan mekanisme kerjanya, bersifat memicu PPARy sehingga menghambat aktivitas kerja makrofag. (Ricote M, 1998)
Eicosanoid (EPA) banyak dijelaskan mempunyai kemampuan menghambat inflamasi jaringan adiposa. Aktivitas hambatan inflamasi in melalui peroxisome proliferator-activator receptors (PPARs) a,
B
and y,
yang pada penelitian akhir-akhir ini dianggap bersifat anti pada jaringan adiposa dan makrofag. (Kliewer SA, 1997) (Tsuchida A, 2005) Omega-3 dalam fish
oil
menghambat transkripsi gen SREBP-1 (sterol regulatory
element binding) yang mengatur produksi enzim lipogenesis seperti fatty
14
acid synthase (FAS), acetyJ-CoA carboxylase (ACC), stearoyi-CoA desaturase (SCD), dan S14 protein. (Fujiwara H, 2008). Penelitian hewan menunjukkan pemberian fish oil dapat menekan proses lipogenesis melalui penekanan pematangan SREBP1 melalui penekanan terhadap ekspresi mRNA SREBP1 c. SREPB1 adalah gen yang mengatur enzim cholesterologenic dan lipogenic (Kim HJ, 1999) Minyak ikan
(fish oiQ mengandung asam eicosapentanoat (EPA)
(C20:5n-3) dan asam docosa-heksanoat (DHA) (C22:6n-3) yang termasuk dalam kelompok asam lemak w-3.Secara lengkap kandungan Fish oil yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: 14:0 Myristic acid, 6-9%, 16:0 Palmitic acid, 15-20%,16:1 Palmitoleic acid, 9-14%, 18:0 Stearic acid, 34%, 18:1 Oleic acid, 5-12%, 18:2 Linoleic acid, <3%, 18:3 Linolenic acid, <3%, 18:4 Octadecatetraenoic acid*, 2-4%, 20:4 Arachidonic acid, <3%, 20:5 Eicosapentaenoic acid*, 1 0-15%, 22:6 Docosahexaenoic Acid*, 815%.( * adalah asam lemak omega 3 ) yang berasal dari produk sigma.
Omega-3 dalam fish oil menghambat transkripsi gen SREBP-1 (sterol regulatory element binding) yang mengatur produksi enzim lipogenesis seperti fatty acid synthase (FAS), acetyl-CoA carboxylase (ACC), stearoyl CoA desaturase (SCD), dan S14 protein. Selain itu, asam lemak omega-3 meningkatkan transkripsi enzim regulator untuk oksidasi asam lemak, seperti acyl-CoA oxidase (ACO), medium-chain acyi-CoA dehydrogenase (MCAD), lipoprotein lipase (LPL), Fatty Acid Binding Protein (FABP), acyl-
15
CoA synthetase (ACS), uncoupling protein-2 (UCP2), dan palmitoyltransferase-1
(CPT� 1 ),
dengan
mengaktiva si
camitine peroxisome
proliferator-activated receptor (PPAR)-a. (Reddy J , 1999) melaporkan fish oil 27% dalam diet binatang percobaan dapat memicu sekresi adiponektin secara tidak langsung, yaitu melalui jalurPPAR-y dan PPAR-a. (Neschen s ,2006) Dalam suatu penelitian yang menggunakan fs i h oil dalam jangka pendek dan jangka lama ternyata menunjukkan hasil peningkatan kadar gen adiponektin sekitar 2 kali lipat dalam lemak epididimal, yang selaras dengan peningkatan 2-3 kali lipat ekspresi PPAR-y. Hal ini menunjukkan fish oil
merupakan suatu bahan alami yang merupakan aktivator dari
PPARa dan PPARy. Fish oil yang banyak mengandung n-3 sebagai prekursor EPA dan DHA telah dibuk.tikan dalam beberapa penelitian mempunyai efek
anti-inflamasi,
anti-thrombosis,
hipolipidemia,
dan
meningkatkan kadar adiponektin plasma. (Ridker, 1999)
11.2 Tinjauan Efek Kurkumin dalam Perbaikan Sensitivitas Insulin
Kunyit (Curcuma longa Linn.) Sinonim :Curcuma domestics Val.atau C. domestics
Rumph
:Zingiberaceae.
atau
C.
longa
Auct.
Merupakan
Familia
16
Nama Lokal : Turmeric, Saffron (lnggris), Kurkuma (Belanda), Kunyit (Indonesia
dan Malaysia);
Kunir
(Jawa),
Koneng
(Su · nda),
Konyet
{Madura).
Kunyit (Curcuma domestic} termasuk salah satu tanaman rempah dan obat, habitat asli tanaman ini meliputi wilayah Asia khususnya Asia Tenggara. Tanaman ini kemudian mengalami penyebaran ke daerah Indo Malaysia,
Indonesia,
Australia
bahkan Afrika.
Hampir
setiap
orang
Indonesia dan India serta bangsa Asia umumnya pemah mengkonsumsi tanaman rempah ini, baik sebagai pelengkap bumbu masakan. jamu atau untuk menjaga kesehatan dan kecantikan. Rhizoma dari kunyit ini telah lama dikenal di dunia sebaga dapur dan pewarna makanan. Juga digunakan sebagai tanaman obat untuk perlakukan keseleo dan radang di India, negeri China dan negara-negara Asia lainnya.
Di Asia lebih dari 30 jenis spesies kurkuma
(Zingiberaceae)
ditemukan di Asia, dimana rhizome dari tumbuhan ini dapat digunakan baik sebagai bahan bumbu makanan dan obat, seperti pada obat tradisional Indonesia (Jamu) and obat tradisional Cina. Tumbuhan ini berbau
harum
dan
carminative,
dan
digunakan
pada
gangguan
pencemaan, penyakit hepatitis, ikterus, diabetes, atherosklerosis dan pengobatan akibat infeksi bakteri. Beberapa spesies
Kurkuma seperti
Curcuma longa, Curcuma aromatica and Curcuma xanthorrhiza adalah bentuk-bentuk yang popular. Komponen utama dari spesies curcuma
17
adalah
kurkuminoid
(curcumin,
desmetoxicumin
dan
bisdesmetoxicurcumin). Kurkumin adalah komponen yang terbanyak dan menjadi komponen penting yang ditemukan pada tumbuhan ini. (ltokawa H, 1985)
Pertama kali diisolasi tahun 1870, tapi struktur kimianya baru dapat ditemukan sampai tahun 1910. Kurkuminoid sebagai komponen yang utama
dalam jenis
kurkuma
,yang bertanggung jawab untuk efek
farmakologis karena sifat kimia dan biologinya. Kurkuminoid dalam
C.
longa dan spesies kurkuma lainnya terutama terdiri dari curcumin (1), bis demethoxycurcumin (2) and demethoxycurcumin (3) dimana banyak penelitian
menunjukkan
spectrum
aktivitas
biologiknya.
Kurkumin
[(diferuloylmethane, 1,7 -bis-( 4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione] adalah bentuk pemberi wama kuning yang diisolasi dari
longa dan jenis Curcuma lainnya. (Uehara S, 1987), (Milobedzka Efek
terkenal
dari
kurkumin
adalah
anti
inflamasi.
C.
J, 1910)
Aktivitas
kurkumin yang lain adalah dapat menurunkan kolesterol darah, lipoprotein ( LDL) yang teroksidasi, (Soni KB, 1992) menghambat agregasi platelet, menekan trombosis dan infark miokard, menekan DM tipe II,
rheumatoid
arthritis, multiple sclerosis dan Alzheimer's disease, menghambat replikasi virus
human immunodeficiency virus (HIV), mempercepat penyembuhan
luka, meningkatkan sekresi empedu,
hepatoprotektor, cataract formation,
pulmonary toxicity dan fibrosis, anti-leishmaniasis dan anti-atherosclerotic,
18
baik pada saat pencegahan maupun pengobatan. Efek toksisitas kurkumin tidak ditemukan bahkan pada dosis tinggi, dan telah digolongkan sebagai
'generally recognized as safe' (GRAS) oleh National Cancer Institute. Saat ini penelitian lebih difokuskan pada mekanisme efek molekulernya. (leu TH, 2002} (Aggarwal BB, 2003). Penelitian dengan binatang membuktikan kurkumin dapat menghambat adipogenesis dan angiogenesis pada tikus obesitas. Penelitian ini dilakukan pada mencit yang diberi diet tinggi lemak dan intervensi dengan kurkumin 500 mg/kg selama 12 minggu (Ejaz A, 2009).
Dalam berbagai studi binatang, didapatkan suatu dosis curcumin pada 100-200 mg setiap kilogram berat badan sebagai anti inflamasi. Dengan dosis yang sama tidak menimbulkan efek kurang baik pada manusia. Dosis fetal
peroral ( LD50) pada tikus, yang lebih tinggi
dibanding 2.0 g/kg badan., sifat anti inflamasi kurkumin dengan cara menghambat produksi IL-1, IL-6 dan
TNF-a dan merangsang sekresi IL-
1 0. (Sharma, 2007)
Beberapa laporan menggambarkan kemampuan kurkumin sebagai anti diabetes. Kurkumin dapat menurunkan level glukosa darah pada penelitian tikus. (Mahesh T, 2005)
52
dan kurkumin juga dilaporkan dapat
meningkatkan sensitivitas insulin pada tikus percobaan (Weisberg SP, 2008). Dari penelitian tikus yang lain, dapat ditarik kesimpulan kurkumin
19
mempunyai efek anti inflamasi yang dapat menghambat produksi glukosa pada hepatosit (Fujiwara H, 2008).
Kurkumin dilaporkan mencegah stimutasi efek insulin pada adiposit. Efek kurkumin mencegah penghambatan terhadap
reseptor GLUT4
sebagai transporter glukosa di sel. (lkonomov OC, 2002). GLUT 4 adalah reseptor glukosa pada permukaan sel, yang menjelaskan kemampuan ambilan glukosa oleh sel. Tapi efek kurkumin dilaporkan menghambat secara langsung transport glukosa ke jaringan adiposit, dan jarang mempunyai efek pada insulin. lni adalah alasan kurkumin sebagai anti diabetes dijelaskan oleh Grenn dkk, pada penelitian berjudul Curcumin is a Direct Inhibitor of Glucose Transport in Adipocytes. Curcumin dapat menekan ekspresi gen
(Green A, 2006).
LDLR dengan mengaktifkan
PPARy dan menekan ekspresi gen SREBP1c. (Qiaohua Kang, 2009)
20 BAB Ill. KERANGKA KONSEP
{ ] ( Fish�il J
h
Kurkwni
eI
c>
nonnal
[
Metfonnin
adiposa
Diet
� ·-
tinggi
obes
Keterangan:
c:::.::>
Variabel bebas
0
=
Variabel tergantung
�
�
=
Variabel antara
===>
=
PPARy,
·
AMP-
J,e11�
Variabel kendali
.
. } .II '-
' Kelan)S..· .
Ji.
c.. .J!t .
rn::¢
=
Hubungan variabel bebas
=
Hubungan variabel tergantung
=
Hubungan variabel antara
=
Hubungan variabel kendali
�I Q I
1J
� �
I
=
c:rr::J
I
kinase
i
c:J
1
J � L::C_j
I
I� GLUT-4
PPARa,
Sel
adiposa
Kurkumin +Fish Oil
TNF -a,
Berat Badan, TTG, m.
Adiponektin, TNF-a,
SREB.Plc
21
BABIV METODE PENELITIAN
IV.1 Desain Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental.
IV.2 Tempat Dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di
animal laboratorium Fakultas Kedokteran
UNHAS Makassar, direncanakan mulai bulan juli sampai desember 2011.
IV.3 Subyek Penelitian Populasi yang digunakan adalah mencit sehat, jenis kelamin jantan dengan galur C57BU6J. Sampel yang diambil adalah mencit umur 5 minggu dengan berat badan 15-20 gram sebanyak 30 ekor. Dibagi dalam 6 kelompok, disetiap kelompok terdapat 5 ekor men cit.
IV.4 ljin Penelitian dan Ethical Clearance Permintaan ijin penelitian ini dinyatakan memenuhi persyaratan etik penelitian
hewan
dari
Komisi
Etik
Penelitian
Biomedis
Fakultas
Kedokteran Universitas Hasanuddin, seperti terlihat pada lampiran 3.
22
IV.S Alat dan Bahan Penelitian IV.5.1 Alat Penelitian Kandang mencit, sterilisator, autoklaf, elektroforesis, ELISA (lab. System Multiscan Ascent) machine, QRT-PCR machine, inkubator C02, mikropipet (Ependorf Tube 1,5 cc,), sentifuge, seperangkat alat bedah hewan, dan timbangan digital mencit, disposible 1 cc, tabung 50 cc, PCR Tube, tips kuning, tips biru, glukometer. hand shoen free powder, QRT-PCR master mjx.
IV.4.2 Bahan Penefitian
Mencit jantan C57BU6J umur 5 minggu, Diet 10% fat (0124508) dan 45% fat(012451), Rodent Diet with 45 kcal% Fat. Including 3 gms Menhaden Oil per 100 gms (011031002) ,kurkumin C7727, Metformin 500 mg, 0-glukosa powder, Insulin injeksi, , strip glukometer, Aquades injeksi 20
cc, mause adiponektin elisa
kit, Primers adiponektin,
RNAesay mini kit., buvicaine 0,25%.
IV.6 Prosedur Penelitian IV.6.1 Prosedur Penelitian Eksperimental Seluruh mencit dikandangkan pada kondisi bebas patogen dan diadaptasikan
pada kondisi
laboratorium
selama 2
minggu
dengan
pemberian makanan normal dan diberi siklus penerangan 12 jam gelap, 12 jam terang. Mencit kemudian dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu:
1 . Kelompok 1: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberikan diet normal, sebagai kelompok kontrol normal.
•
2. Kelompok II: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, mencit ini tetap diberi diet tinggi lemak kembali tanpa intervensi selama 5 minggu, sebagai kelompok kontrol negatif. 3. Kelompok Ill: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi kurkumin selama 6 minggu, sebagai kelompok intervensi kurkumin. 4. Kelompok IV: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi
fish oil selama 8
minggu, sebagai kelompok intervensi fish oil. 5. Kelompok V: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama
12 minggu, setelah didapatkan mencit
dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi selama
8
minggu,
sebagai
kelompok
fish oil+ kurkumin intervensi
fish
oi/+kurkumin. 6. Kelompok VI: Mencit umur 5 minggu, sebanyak 5 ekor diberi diet tinggi lemak selama 12 minggu, setelah didapatkan mencit
24
dengan berat 35-40 gram, diberi intervensi metformin selama 8 minggu, sebagai kelompok kontrol positif.
Selama perlakuan dilakukan menimbangan pellet dan pembersihkan kandang setiap 3 hari. Pencatatan kenaikan berat badan mencit dilakukan setiap minggu.
Pada
akhir
masa
perlakuan
dilakukan
pemeriksan
TIGmt
kemudian mencit akan dikorbankan dengan menggunakan anestesi lokal intraperitoneum dengan bupivicaine (0.25%) dan jaringan lemak epididirnis akan ditimbang lalu diambil untuk pemeriksaan adiponektin.
IV.6.2 Prosedur Perneriksaan Tes Toleransi Glukosa
1 . Mencit dipuasakan selama 16 jam. 2. Berat masing-masing
mencit
diukur untuk
menentukan
dosis
glukosa yang akan diberikan. 3. Setiap mencit diberikan dosis glukosa 2,5 mg/grBB. 4. Bubuk glukosa yang disiapkan diencerkan dengan konsentrasi 400 mgt ml NaCL 0,9%. 5. Ukur glukosa darah sebelum penyuntikan glukosa menggunakan glukometer untuk mendapatkan nilai kadar glukosa 0 menit. 6.
Darah diambil dari ekor mencit yang sebelurnnya telah di anastesi
25
lokal dengan bupivicaine (0.25%) untuk menekan nyeri akibat pemotongan ekor mencit. 7. Lakukan suntikan glukosa melalui intraperitoneum dengan dosis berat badan dalam gram dikalikan 10 ul yang diambil dari glukosa yang sudah diencerkan. 8. Glukosa darah kemudian diukur pada 30, 60, 120 menit setelah penyuntikan glukosa.
IV.6.3 Prosedur Pemeriksaan Tes Toleransi Insulin
1. Mencit dipuasaka selama 4 jam. 2. Berat masing-masing mencit diukur untuk menentukan dosis insulin yang akan diberikan. 3. Penyuntikan insulin secara intraperitoneum dilakukan dengan dosis 0,75 U/kgbb. 4. Insulin disiapkan dengan melarutkan insulin 16,6 ul dari 10 mg/ml dalam 40 ml BPS untuk mendapatkan insulin 0,1 U/ml. 5. Ukur glukosa darah sebelum penyuntikan glukosa menggunakan glukometer untuk mendapatkan nilai kadar glukosa 0 menit. 6. Darah diambil dari ekor mencit yang sebelumnya telah di anastesi lokal dengan bupivicaine (0.25%) untuk menekan nyeri akibat pemotongan ekor mencit. 7. Lakukan penyuntikan insulin melalui intraperitoneum dengan dosis berat badan dalam gram dikalikan 7,5 ul dari 0,1 Ulml larutan
26
insulin.
8. Glukosa darah kemudian diukur pada 30, 60, 120 · menit setelah penyuntikan insulin.
IV.6.4 Prosedur Pemeriksaan ELISA Jumlah protein adiponektin serum akan diukur dengan metode Elisa. Sampel darah disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm pada suhu 4 derajat celsius, kemudian serum (supernatan) diambil, untuk kemudian dimasukkan dalam mesin elisa.
IV.6.5 Prosedur Pemeriksaan RT•PCR QRT-PCR digunakan untuk menilai ekspresi SREBP-1c di hati, TNF-alfa dan adiponektin di Jaringan lemak epididymis. diekstraksi
dari jaringan
lemak epididymal, hati,
dan
RNA total otot
dengan
menggunakan RNeasy kit (Qiagen) atau ISOGEN. Quantitative RT..PCR dilakukan dengan menggunakan SYBR Green QRT-PCR Master Mix, 1 step sesuai protokol dari produsen (stratagene), yaitu mensintesa eDNA dan Real Time PCR dilakukan satu step dengan menggunakan RNA diamplikasi pada Stratagene Mx3000P QPCR System (Stratagene, USA). Hasilnya dinormalisasi dengan internal kontrol �-actin. SREBP-1c: forward primer: ATCGGCGCGGMGCTGTCGGGGTAGCGTC Reverse primer: TGAGCTGGAGCATGTCTTCAA, adiponectin forward primer: 5' GCCCAGTCATGCCGMGA-3',
27
adiponectin reverse primer, 5'-TCTCCAGCCCCACACTGAAC-3' {product size: 332 bp); b-actin forward primer, 5'-ATGGATGACGATATCGCT-3', b actin reverse primer, 5'-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3' (product size: 588 bp).
Tnfa forward, 5'-CCAGACCCTCACTAGATCA-3'; Tnfa reverse, 5'-CACTIGGTGGTTTGCTACGAC-3'
IV.7 Cara Pengumpulan Data Penelitian dilakukan pada sampel yang memenuhi kriteria hewan coba. Data diperoleh dengan cara primer. Data yang diperoleh diolah dengan
meggunakan
analisa
statistik,
SPSS
15.
Untuk
melihat
perbandingan hasil terapi di antara keenam kelompok digunakan Uji AN OVA dengan batas kemaknaan p
IV.8 ldentifikasi Varia bel a. Variabel bebas (lndependen): Kurkumin, Fish oil, Fish oil+kurkumin, metformin. b. Variabel antara : Proses inflamasi pada obesitas. c. Variabel tergantung (dependent): Berat Badan (BB), TIG, Til, dan Adiponektin.
IV.9 Definisi Operasional
1. Diet normal adalah diet yang mengandung 10 % lemak, yang
didatangkan dari
Research Diet Amerika, seperti terlihat pada
lampiran 1. 2. Diet tinggi lemak adalah diet yang mengandung 45% lemak, yang didatangkan dari
Research Diet Amerika, seperti terlihat pada
lampiran 2. 3. F s i h oil terdapat dalam Diet 45% lemak, yang mengandung 3 gram Menhaden Oil dalam
100 gram diet,
yang didatangkan dari
Research Diet Amerika, seperti terlihat pada lampiran 2. 4. Kurkumin adalah ekstrak kurk.umin, dengan kode C7727 yang diproduksi oleh Sigma Ltd (Amerika), dicampukan ke dalam diet 45% lemak dan dibuat pellet. 5. Metformin, dibeli dalam bentuk tablet 500 mg di apotik setempat dengan menggunakan resep dokter dan dicampur ke dalam diet 45% lemak. 6. Mencit kontrol normal adalah mencit jantan, sehat galur C57BU6J, didatangkan langsung dari umur
5
minggu
yang
Animal Research Centre (Australia),
diberi
diet
normal,
komposisi
pakan
mengandung 10% lemak. 7. Mencit kontrol negatif ( mencit obes) adalah mencit jantan, sehat galur C57BL/6J,
didatangkan langsung dari
Animal Research
Centre (Australia), umur 5 minggu, yang telah diberi per1akuan diet
tinggi lemak, komposisi pakan mengandung 45% lemak, selama 12 minggu sampai mendapatkan berat 35-40 gra ni dan tetap diberi diet 45% lemak sampai akhir percobaan. 8. Mencit perlakuan ( intervensi ) adalah mencit yang telah diberi diet tinggi lemak selama 3 bulan sampai berat didapatkan 35-40 gram. yang diberi diet 45% lemak ditambah suplemen kurkumin atau
fish oil atau
fish oil dan kurkumin melalui oral yang dicampur
kedalam pellet yang dimakan selama 8 minggu. 9. Mencit kontrol positif adalah mencit yang telah diberi diet tinggi lemak selama 3 bulan
ditambah
metformin
yang dicampur ke
dalam pellet yang dimakan selama 8 minggu.
1 0. Berat badan adalah nilai berat badan mencit yang di dapat dengan mengukur berat badan mencit setiap minggu selama penelitian bertangsung
dengan
menggunakan
timbangan
digital
mencit
dengan ketelitian 0,1 gram. 11. Tes Toleransi Glukosa (TTG) adalah pemeriksaan untuk melihat sensitivitas insulin dengan cara mencit dipuasakan selama 16 jam kemudian larutan glukosa diinjeksi secara intraperitonium dengan dosis 2,5 gram/ kgbb. Kadar gula darah diukur dengan mengambil darah dari vena ekor
pada
menit 0,
30,
60,
120
dengan
menggunakan glukometer. 12. Tes Toleransi Insulin
(TTl) adalah pemeriksaan untuk melihat
sensitivitas insulin dengan cara mencit dipuasakan selama 4 jam
30
kemudian larutan
insulin diinjeksi secara intraperitonium dengan
dengan dosis 0,75 U/kgbb. Kadar gula darah diukur dengan •
mengambil darah dari vena ekor pada menit 0, 30,
60, 120 dengan
menggunakan glukometer. 13. Adiponektin adalah harmon yang didapatkan di jaringan serum plasma mencit dan jaringan adiposa epididimis setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik RT-PCR di Laboratorium Percobaan Hewan dan Unit Penelitian Fakultas Kedokteran UNHAS Makassar. 14. TNF-a adalah didapatkan di jaringan serum plasma mencit dan jaringan adiposa epididimis setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik Elisa dan RT -PCR di Laboratorium Percobaan Hewan dan Unit Penelitian Fakultas Kedokteran UNHAS Makassar. 15. SREBP1c adalah didapatkan di jaringan hati setelah 8 minggu intervensi, diperiksa mengunakan teknik Elisa dan RT-PCR di Laboratorium Percobaan
Hewan dan Unit Penelitian Fakultas
Kedokteran UNHAS Makassar 16.1nsulin resisten adalah keadaan jika terjadi peningkatan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0,30,60 ,90 dan 120 menit setalah penyuntikan glukosa intraperitoneum. 17. Insulin sensitivitas adalah keadaan jika terjadi penurunan kadar glukosa darah sesuai waktu pada 0,30,60,90 dan 120 menit setalah penyuntikan insulin intraperitoneum.
31
IV. 10 Ana lis is Data Dan Uji Statistik Data yang dikumpul diolah menggunakan analisis 'statistik dengan menggunakan SPSS 15 .. Untuk melihat perbandingan hasil terapi di antara keempat
digunakan Uji ANOVA dengan
kelompok
batas
kemaknaan 5% (p<0,05}.
IV.11 Alur Penelitian Mencitjantan, sehat, galur C57BV6J, umur 5minggu, BB: 15·20 gram, 30 ekor
l
T
N
Kondisi bebas pathogen,
G G
u
12
adaptasi .- .
...
�
�
5 ekor, ukur BB, diet
25 ekor. Ukur BB, diet tinggi
normal (10% lcmak)
lemak (45% lemak)
M r
Setelah mendapat berat mencit 35-
N
40 gram ( mencit obes)
G G
u
8 M I
N
G G u
5 ekor Kontrol normal
�
5 ekor, Kontrol
perlaku an
!
5 ekor, lntcrvensi Ekstrak Kurkuma SOOmglkg
l
5 ekor,
Intervensi Fish oil 3 g/100 g diet
.. ,, { .....
I
-Uk:ur komsumsi pellet tiap 3 hari Ukur BB setiap minggu,
-Tes Toleransi Glukosa (TTG) -Tes Toleransi lnsulin (TII)
- Adiponektin, TNF-a serum
-Eksprcsi TNF-a, Adiponcctin lemak intraabdomen - Eksnresi SREBP1c di hati
_i
5 ckor,
3 g/100 g
metformi
diet Fish oil + 500 mg/kg ..
l
�
5 ekor, lntervensi
l
.
intervensi
n 350
..
I
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN V.1. HASIL Sebanyak 30 ekor mencit CL57BU6J terlibat dalam penelitian ini, yang terbagi dalam 6 kelompok yaitu 5 ekor ketompok kontrol normal, 5 ekor kelompok kontrol negatif, 5 ekor kelompok kontrol positif, 15 ekor kelompok intervensi
yang
masing-masing
kelompok intervensi fish oil,
kurkumin,
terdiri
dan
dari
5 ekor,
yaitu
gabungan fish oil dan
kurkumin. Pada keenam kelompok tersebut kemudian dilakukan analisis terhadap sejumlah variabel yang akan menjadi acuan dalam melakukan penilaian adanya pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit obes.
V. 1 . 1 . Karakteristik -dasar responden Pada tabel berikut
memperlihatkan
perbedaan karakteristik keenam
kelompok.
label Data berat badan mencit C57BU6J sebelum intervensi KODE
·
·
Berat Badan Pre lntervensi(gram j_
Diet Normal
27.08
Hfd
34.82
Hfd + Fish Oil
34.98
Hfd + Curcumin
34.98
Hfd + Fish Oil + Curcumin
34.85
Hfd
+
Metformin
34.83
Tabel . Karakteristik dasar subyek Variabel
BB pre intervensi mgg18
Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 Kelompok 6
34.81 ± 4.33 34.98 ± 2.86 34.90 ± 5.02 34.90 ± 2.71 34.83± 5.12
p
1.0
V. 1. 2 Data Asupan Selama lntervensi
TabeJ Data Efek Asupan Selama lntervensi terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J Asuppo 6)
15uppost
Asuppost (mg 1}
Asuppost(mg 2}
Asuppost(mg 3)
Asuppost(mg 4}
Asuppost(mg
Kelompok 1
95.4
88.9
98.4
104.4
96.3
91.1
105.6
5}
}
Kelompok 2
121.8
93.7
105.0
134.4
123.3
129.4
108.4
Kelompok 3
134.4
113.0
100.8
119.7
124.7
116.8
100.2
Kelompok 4
124.5
155.8
136.1
150.2
130.6
135.2
120.3
Kelompok S
144.9
115.1
111.7
154.4
144.7
169.5
150.8
Kelompok 6
147.0
108.6
127.3
144.3
136.5
161.3
135.0
Gao
� �� �
------80 + --'-� ------
60 +------ � +--------20 +---- ---....,...,...-0 +-
-+-Kelompok 1 ..,._Kelompok 2 Kelompok3 �Kelompok4 �KelompokS Kelompok 6
V. 1. 3 Efek Berat Badan
Tabet Data Efek Berat Badan Selama lntervensi terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J BERAT BADAN POST INTERVENSI Variabel
minggul Mean ±SD
Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok S Kelompok 6
Minggu2
p
Mean ±SD
33.88± 4.51
34±4.1 5 35.82±2.6 1 37.55±5.0 0 34.77±3.2 7 34.93±3.4 0
35.13± 2.43 36.81± 5.20
0.74
36.08± 2.72 35.60± 3.56
Minggu 3
p
0.5 6
Mean±SD
Minggu 4
p
Mean±SD
36.43±5.06
37.5±5.72.
37.2± 2.83
39.2±2.79
39.85±4.81
0.62
41.01±4.7
7 39.03± 4.05 37.95±3.6 2
37.2±3.81 36.72±3.41
BERAT BADAN POST INTERVENSI Variabel
Minggu s Mean±SD
Mean ±SO
p
Minsgu 7 Mean±SD
38.67±5.77
41.23±5.87
40.98±3.07
39.68±2.18
42.27±3.86
42.12±4.38
42.78±4.50
Kelompok 2
39.38±6.03
Kelompok 3 Kelompok4 KelompokS
39.7±4.71
Kelompok 6
p
Minggu 6
40.08±3.83
0.83
41 .57±5.24 41 .58±3.57
0.52
44.4±4.84 42.75±5.92 43.38±3.67
p
0.84
p
0. 67
35
--BB ---------� selama interv�nsi
Perbandingan 'CIO -
c
"'
"a
"'
ICQ .....
(!!
cu
ICQ
48 45 42
-+- Kelompok 1
39 36 33 30 27 24 21 18 15
....,. Kelompok2 -- Kelompok 3 ""'*-Kelompok 4 -l!E-Kelompok 5 1
2
3
4
5
6
7
-
Kelompo k 6
Lama intervensi (minggu)
Gambar: Efek pada berat bad an terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J
V. 1 . 4 Efek Glukosa Toleransi Tes Tabel Data Efek Glukosa Toleransi Tes Setelah lntervensi terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J
0' 30' 60' 120'
Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok 3 2 4 1 5 6 85.00 99.00 109 60.80 1 04.60 95.83 331.61 323.33 291.00 355.67 308.2 329.80 283.00 295.67 176.20 286.50 324.00 328.8 172.00 189.33 135.60 207.33 218.40 227.4
36
r:� I I I1
I I
300
250 200 15o 1
00
50
I
-------
0 �
-----
30.
0'
120'
60'
�Kelompok 1 �Kelompok 2 � Kelompok 3 �Kelompok 4 -.-Kelompok 5
Kelompok 6
Gam bar: Efek glukosa toleransi tes terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J
V. 1 . 5 Efek Insulin Toleransi Tes Tabel Data Efek Insulin Toleransi Tes Setelah lntervensi terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J
Kelompok 1
Kelompo k2
Kelompo k3
Kelompo k4
Kelompo k5
Kelompo k6
0' 15'
145.00
1 97.00
2 1 5 00
160 00
21 8.00
166
59.00
129.00
168.00
135.00
162.00
118
30'
33.00
81 .00
100.00
67.00
79.00
76
45'
22.00
82.00
1 35.00
57.00
103.00
93
60'
20.00
89.00
1 52.00
66.00
125.00
110
75'
20.00
97.00
233.00
83.00
1 50.00
147
90'
20.00
1 09 00
238.00
75.00
165.00
171
.
.
.
37
r
2so
I
� 1so I1 zoo
100 so 0
1 I
•
•
•
5'
' 90
� --------- ------0'
15'
' 30
45'
60'
7
�Kelompok 1 �Kelompok 2
.- Kelompok 3
-*-Kelompok 4 �Kelom pok 5
Kelompok 6
Gambar: Efek insulin toleransi tes terhadap keenam kelompok pada mencit C57BU6J
.
V. 1 PEMBAHASAN
Penelitian ini dimulai pada pemeliharaan mencit yang berumur lima minggu dimana semua berat badan mencit rata-rata 19 gram, sebanyak 30 ekor mencit yang diteliti dibagi dalam 2 jenis diet yang masing-masing 5 ekor untuk diet normal, dan 25 ekor diberi diet tinggi lemak, yang mengandung 45% lemak. Selama 12 minggu pemeliharaan telah didapatkan 2 kelompok mencit dengan berat badan yang signifikan berbeda antara kelompok diet normal dan kelompok diet tinggi lemak. Selanjutnya dilakukan pengelompokan mencit yang diberikan diet tinggi lemak menjadi 5 kelompok, yang dibagi menjadi lima ekor masing-masing setiap kelompok, dilakukan dengan tes homogenitas dan didapatkan
38
bahwa tidak ada perbedaan berat badan yang signifikan antara kelima kelompok. Selanjutnya dari kelima kelompok ini, diberi diet tinggi lemak sebagai kontrol negatif, diet tinggi lemak ditambah intervensi fish oil, diet tinggi lemak ditambah intervensi kurkumin, diet tinggi lemak ditambah intervensi fish oil dan kurkumin, diet tinggi lemak ditambah metformin sebagai kontrol positif. Sedangkan diet normal sebagai kontrol normal
Setelah intervensi dilakukan uji statistik analisis multivariate dengan SPSS 15 terhadap berat badan setiap kelompok, dan didapatkan terdapat perbedaan
berat badan
yang
signifikan
antara
keenam
kelompok, kemudian analisis ini dilanjutkan dengan uji post hoc untuk melihat sejauh mana perrbedaan itu disetiap kelompok dan didapatkan perbedaan berat badan yang signifikan
tedapat pada kelompok diet
normal dibanding kelompok lainnya. Perbedaan signifikan yang terbesar terdapat pada kelompok diet normal dan diet tinggi lemak dengan tambahan metformin.
Uji statistik berat badan setelah intervensi ini, kemudian diikuti dengan uji stastistik terhadap asupan selama intervensi. Uji statistik terhadap asupan total selama intervensi didapatkan perbedaan asupan yang signifikan didapatkan jika dibandingkan dengan diet normal. Jika uji dilakukan pada semua kelompok diet tinggi lemak didapatkan tidak ada
. perbedaan asupan yang signifikan selama intervensi. Namun tren asupan yang tinggi terdapat pada kelompok fish oil dan kurkumin.
•
Diantara lima kelompok diet tinggi lemak, walaupun tidak terdapat perbedaan berat badan yang signifikan, namun terlihat bahwa diet tinggi lemak ditambah intervensi kurkumin mempunyai berat badan yang lebih tinggi dibanding lainnya, tapi jika dilihat dari asupan total selama intervensi didapatkan asupan lebih tinggi pada kelompok diet tinggi lemak ditambah intervensi fish oil dan kurkumin, hal ini bisa dijelaskan pada pemeriksaan selanjutnya dengan melihat apakah efek ini akibat penekanan pada mekanisme inflamasi yaitu penekanan pada TNF a
oleh fish oil dan kurkumin lebih tinggi jika keduaanya digabungkan.
Uji statistik glukosa darah puasa, terhadap keenam kelompok didapatkan terdapat perbedaan glukosa darah puasa yang signifikan diantara semua ketompok, selanjutnya dilakukan uji post hoc dengan metode Bonferroni dan Tukey untuk melihat perbedaan signifikan dalam kelompok, didapatkan perbedaan glukosa darah puasa yang signifikan terjadi diantara kelompok diet normal dan diet tinggi lemak ditambah metformin. Diet tinggi lemak ditambah metformin jika dibandingkan dengan kelompok diet tinggi lemak yang lain, tidak terdapat perbedaan glukosa darah puasa yang signifikan.
40
Uji statistik glukosa darah setelah pemberian glukosa 2,5 mg/ gram berat badan mencit, tidak terdapat perbedaan glukosa darah setelah 30 menit pemberian glukosa 2 mg/gram berat badan yang signifikan diantara semua kelompok.
Uji statistik glukosa darah setelah pemberian glukosa 2,5 mg/gram berat badan mencit, terdapat perbedaan glukosa darah yang signifikan diantara semua kelompok. selanjutnya dilakukan uji post hoc dengan metode Bonferroni dan Tukey untuk melihat perbedaan signifikan dalam kelompok, didapatkan perbedaan glukosa darah setelah 60 menit pemberian glukosa 2 mg/gram berat badan yang signifikan terdapat antara kelompok diet normal dan diet tinggi lemak ditambah metformin.
Uji statistik glukosa darah setelah pemberian glukosa 2,5 mg/gram berat badan mencit, terdapat perbedaan glukosa darah yang signifikan diantara semua kelompok. selanjutnya dilakukan uji post hoc dengan metode Bonferroni dan Tukey untuk melihat perbedaan signifikan dalam kelompok, didapatkan perbedaan glukosa darah setelah 120 menit pemberian glukosa 2 mg/gram berat badan yang signifikan terdapat antara kelompok diet normal dan diet tinggi lemak ditambah metformin.
Uji statistik untuk pemeriksaan insulin belum dapat dilakukan Karena data yang dikumpul belum mewakili data kelompok.
41
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN Vl.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan pada 30 subyek penelitian untuk mengetahui adanya pengaruh pemberian fish oil, kurkumin dan kombinasi keduanya terhadap mekanisme perbaikan resistensi insulin mencit bbes, maka dapat disimpulkan : 1 . Penelitian ini telah berhasil memulai penelitian hewan mencit C57BU6J yang pertama difakultas kedokteran dengan memberi kenaikan berat badan yang bermakna setelah pemberian diet normal dan diet tinggi lemak selama 3 bulan. 2. Dari beberapa uji statistik yang dilakukan terhadap kenaikan barat badan, jumlah asupan dan glukosa toleransi tes disimpulkan ada perbedaan hasil penelitian dengan penelitian sebetumnya, ini diakibatkan karena rendahnya jumlah metformin yang diberikan yaitu 350 mg/kg diet. Penelitian sebelumnya diberikan dengan 350 mglkgBB. 3. Dengan pertimbangan kurangnya dosis metformin yng diberikan maka penelitian ini kami putuskan akan dilanjutkan untuk 2 minggu ke depan dengan menambah dosis metformin menjadi 3 gr/kg diet 4. Pemeriksaan lain yang dilakukan seperti TNF-a, adiponektin dan SREBP1 c dengan metode Elisa dan RT-PCR dengan sendirinya
belum dapat dilakukan. Hasil pemeriksaan tersebut diatas akan ·
dilaporkan setelah dilakukan pemeriksaan 3 minggu kedepan.
Vl.2. Saran Dari
kendala
yang
didapatkan
selama
penelitian
berupa
rendahnya dosis metformin yang diberikan, maka dianjurkan untuk sebelum melakukan penelitian dilakukan beberapa analisis penelitian penelitian sebelumnya.
43
DAFTAR PUSTAKA Aggarwal BB, Kumar A. Burr AC. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 2003;23:363-398. Berg AH, Combs TP, Scherer PE. ACRP30/adiponectin: an adipokine regulating glucose and lipid metabolism. Trends Endocrinol Metab. 2002;13:84-89. Bouskila M, Pajvani UB and Scherer PE. Adiponectin: a relevant player in PPARy
agonist
mediated
improvements
in
hepatic
insulin
sensitivity? lnt J Obesity 2005; 29:S1 7-S23 Bray GA. Medical Consequences of Obesity. J Cl in Endocrine! Metab. 2004;89:2583-2589. Chan NN, Kong AP, Chan. JC, et al. Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes: The Hong Kong
Perspective. Clin
Biochem
Rev.
2005;26:51-57. Chandran M, Phillips SA. Ciaraldi T, et al. Adiponectin: More Than Just Another Fat Cell Hormone? Diabetes Care. 2003;26:2442-2450. Dyck OJ, Heigenhauser GJF, Bruce CR. The role of adipokines as regulators of skeletal muscle fatty acid metabolism and insulin sensitivity. Acta Physiol. 2006;186:5�16. Duda MK, 0. K.. Dietary supplementation with {omega}-3 PUFA increases adiponectin and attenuates ventricular remodeling and dysfunction with pressure overload. Cardiovascular Research, 2007;303-310. Ejaz A, Wu 0, Kwan P,Curcumin Inhibits Adipogenesis in 3T3-L 1 Adipocytes and Angiogenesis and Obesity in C57/BL Mice. Journal of Nutrition. 2009; 139:91 9-925. Fernandez-Real J-M, Castro A, Vazquez G. Adiponectin is associated with vascular function independent of insulin sensitivity. Diabetes Care. 2004;27:739-745.
44
Friedberg C, Janssen M, Heine R, Grobbee D. Fish oil and glycemic control in diabetes. A meta-analysis. Diabetes Care 1998;21 :494 500. Fruhbeck G, Gomez-Ambrosi J, Muruzabal FJ, et al. The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism
regulation.
Am
J
Physiol
Endocrinol
Metab.
2001 ; 280(6): E827-847. Fujiwara H, Hosokawa M, Zhou X, et al. Curcumin inhibits glucose production in isolated mice hepatocytes. Diabetes Research and Clinical Practice 2008;80: 185-191. Gotera W, Aryana S, Suastika K, et al. Hubungan antara obesitas sentral dengan adiponektin pada pasien geriatri dengan penyakit jantung koroner. J Peny Dalam. 2006;7:102-107. Green A, Talhapak S, Basile R, et al. Curcumin is a Direct Inhibitor of Glucose Transport in Adipocytes. Cooperstown, NY: From the Bassett Research Institute. Hotta K, F. T. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arterioscler Thromb Vase Bioi , 2000 ;1595-1599.
lkonomov OC, Sbrissa D, Mlak K, et al. Requirement for PIKfyve enzymatic activity in acute and long-term insulin cellular effects. Endocrinology. 2002;143:4742-4754. ltokawa H, Hirayama F, Funakoshi K, et al. Studies on the antitumor bisabolane sesquiterpenoids isolated from Curcuma xanthorrhiza. Chern Pharrn Bull. 1985;33:3488-3492.
Kelley D, Mandarino L, . Fuel selection in human skeletal muscle in insulin resistance: a reexamination. Diabetes Care. 2000;49:677-683. Kim HJ, T. M. Fish oil feeding decreases mature sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP-1) by down-regulation of SREBP-1 c mRNA in mouse liver. A possible mechanism for down-regulation of lipogenic enzyme mRNAs. Kim HJ, Takahashi M, Ezaki 0. Fish oil
45
feeding decre ases m ature sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP-1) by d J Bioi Chern. 1999 , 25892-8.
Kliewer SA,
Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression
through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors a and y. Proc Nat/ Acad Sci , 1 997;4318-4323. Lee YH, Pratley RE. The evolving role of inflammation in obesity and the metabolic syndrome. Current diabetes reports. 2005;5(1):70-75. Leu TH, Man MC. The molecular mechanisms for the antitumorigenic effect of curcumin. Curr Med Chern Anticancer Agents. 2002;2:357370. Mahesh T, B. M.Effect of photo-irradiated curcumin treatment against oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats. J Med. Food 1
2005; 251-255.
Matsuzawa Y,Funahashi T,Nakamura T. Adiponectin and metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vase Bioi. 2004;24:29-33. Milobedzka J, K. S. Curcumin. Chern Ber . 191; 2163-2170. Mototsugu Takashima, W. 0 .. Regulation of SREBP1c Expression by mTOR Signaling in Hepatocytes. Kobe J. Med. Sci , 2009; E45E52. Neschen S, Morino K, Rossbacher J C et al. Fish Oil Regulates Adiponectin Secretion by a Peroxisome Proliferator Activated Receptor Dependent Mechanism in Mice. Diabetes J. 2006;55: 924-928. Nugraha IG. Etiologi dan patofisiologi obesitas. Obesitas,Permasalahan dan Terapi Praktis. Jakarta; 2009. Qiaohua Kang, A. C. Curcumin suppresses expression of low-density lipoprotein (LDL) receptor, leading to the inhibition of LDL-induced activation of hepatic stellate cells. Br J Ph armacal , Qiaohua Kang, Anping Chen . 2009; 1 354-1367
_
Reddy J, Mannaerts GP. Peroxisomal lipid metabolism. Annu. Rev. Nutr. 1994;14:343-370.
46
Ricote M, l. A.Theperoxisome proliferator activated receptor-y is a negative regulatorof macrophage activation. Nature 1998; 19-82. ,
Ridker PM. Evaluating Novel Cardiovascular Risk Factors: Can We Better Predict Heart Attack ? Ann Intern Med. 1999; 1 30: 933- 937 Roberto B, Sabrina A, Claudia 0, et al. Adiponectin Relationship with Lipid Metabolism Is Independent of Body Fat Mass: Evidence from Both Cross-Sectional and Intervention Studies. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89(6):2665-2671 . Sharma S, Chopra K, Kulkarni SK, et al. Resveratrol and curcumin suppress immune response through CD28/CTLA-4 and CD80 co stimulatory pathway. . Clin Exp lmmunol. 2007;147(1 ):155-163. Smih, P. R.Transcriptional Regulation of Adipocyte Hormone-Sensitive Lipase by Glucose. Diabetes , 2002; 293-300. Smith J, AI-Amri M, Sniderman A, et al. leptin and adiponectin in relation to body fat percentage, waist to hip ratio and the apoB/apoA1 ratio in Asian Indian and Caucasian men and women. Nutrition & Metabolism 2006;3: 18: 1-8. Soegih
R.
Tren obesitas dulu,sekarang
dan
yang
akan datang.
Obesitas,Permasalahan dan Terapi Praktis. Jakarta; 2009. Soni KB, Effects of curcumin administration on serum peroxides and cholesterol levels in human volunteers. Indian J Physiol Pharmacol '
1992; 273-275.
Trujillo ME, Scherer PE. Adiponectin - journey from an adipocyte secretory protein to biomarker of the metabolic syndrome. Journal of Internal Medicine. 2005;257:167-175. Tsuchida A, Y. T. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) a activation increases adiponectin receptors and reduces obesity related inflammation in adipose tissue: comparison of activation of PPARa, PPARy, and their combination. Diabetes , 2005; 33583370.
47
Uehara S, Y.
I.
Diarylheptanoids
from the rhizome of Curcuma
xanthorrhiza and Alpinia officinarum. Chern Pharm Bull.
•
1987;
3298-3304. Weisberg SP, Leibel R, Tortoriello DV. Dietary Curcumin Significantly Improves Obesity-Associated Inflammation and Diabetes in Mouse Models of Diabesity. Endocrinology 2008:3549-3558. Weisberg S P, M. D. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest 2003; 1796-1 8082. .
Xu H, B. G . Chronic inflammation infat plays a crucial role in the development of obesity-relatedinsulin resistance. J Clin Invest
•
2003; 1796-1 8082. Yildiz 80, S. M. Alterations in the Dynamics of Circulating Ghrelin, Adiponectin and Leptin in Human Obesity. PNAS 1 0439.
•
200410434-
48
Lampiran 1 . Komposisi Diet Nonnal
D12450J
Protein
C:ubob.ydtate Fat
cmx 19.2
kcaB
613
70
4.3 Totar kat!em
20 10
tOO 3.85 em
200 3 315 35
12
350
1260 140 1400
Cellulase_ BWlOO
50
0
Soybean Oil
2S
225
20
180
10
0
Com Stadl Maltodextrin lO Sucrose
Lard· Mmera!Mix Sl0026
DtCalcmm Phosphate Calcium Carbonate Po&assicm Cin�. I H20
Vitamin. Mix VlOOOl Cbotiue Bibmate FD&C Yellow � #'5
1.3
5.5 16.5
0 0 0
10 2
40
0.05
0
0
49
Lampiran 2. Komposisi Diet Tinggi lemak dan Tinggi Lemak+ menhaden Fish Oil. 012451
Product # �"(I.
gm
kcal
Protein
24
20
Carbohydrate
4•1
35
Fat
24
Total kcal/gm
45
100
Ingredient
gm
gm
Jccal
24
20
41
35
24
45
roo
4.7
4.7
Casein, 80 Mesh
New Diet ·
kcal
gm
kcal
200
800
3
12
29 1 400
3
800 12
72.8
291
72.8
172.8
691
172.8
691
Cellulose, BW200
50
0
50
0
Soybean Oil
25
225
25
225
151.8
1366
L-Cystine Corn Starch
t\ loltodextrin
10
Sucrose
Menhaden Oil
200
·100
0
177.5
Lord 1\.hneral Mix S t 0026
10
D1Calclum Phosphate
13
C alcium Carbonate
Potosstum Citrate, 1 H20
voomtn Mix
v·woo 1
Choline 6�tartmte FO&C Yelho;,\tDye #5 FD&C Red Dye #40 FD&C Blue Dye .:.;.·1
Total
400
0 1598
100
25 .7
0 0
10 13
5.5
0
0
l6.5
10
40 0
tO
16.5
2 0 0.05
Q
()
5.5
2 0
231
0 0 0 0
40 0 0
0
.()
4057
0
0
0.05
858. 1 5
4057
858.15
0
50
Lampiran
3: Rekomendasi Komisi Etik
r KEMENTERIAN
=
.. ,\i,� " , cT'
-�y
P�:NI>IIliKAN NMiiONJ\1.
UNIVERSITAS IIASJ\N\'l>OIN FAKULTAS KEOOKTERAN
KOMISI ETIK PENELITIAN Kf.Sf.IIATAN
" · . :.l �i!I..I·N�Iri:H : l.uuu.ti �\ Cl'liuuu. l.l•t')u''llttJriutu I �rpu1l11 J l l•t WI..: I ' I t..J \�I IotHt ,,..... .._,�,_H't " I \\1 \!. \..,.IH .... t..." 'l• "·\ r 1.1 ·�JI I I too;1<>: 1 1 1 A! (_' " m " •'l O,.'ho ll'l l , \:i: U"�HIIhn lhll.hA r i, I 'II U r.,ll ( ; 1 111' !' "'I � I I!JI'>r • 'l � fl l • 'II 10)' \�..l'llll,ti A.fl"rl .1 \,lh,.,, o' no
......
...
l\1
RE..:OMENO-\Sl l't:I�SETl'.H ''"' FTJK
Nomot' : 0075 II..I.S.•t5..'lld'I';(,�K.Oi\ll I I K1:!0 1 1
"'-"'mi'' Lail. Pcncl11ian �'-'�t. ·hatan
t-al..tllta' �t.·tiPI-.1-.:-r;lll l lll\t.'r'llu' l l w·• •lnuc..ldin. ...�r..:luh mcl�1lui J>ctnh:th�hm1 d:tn pcnilai�m. pada rupu1 h:.-a.mg�._�;l 2'' Uc,cmh,�r 2fl I 0. tdnh OM:O\Utu'i.lr..:tn. (lmlokol pC 1\Ciili:ln ht:rjuduJ:
l't·rhumlinJ.!ttll
l�ft·*tii / lu'> clari Fi.\h 01l. f:k,traA A.urJ..umu d.m Re�"'"'li!'ll'' '""""" \/(·not 01�ot•,
\.J.,.·tformm J'd4ill J•vrhatlmu
1J
d\:'lh!an 1 l.' h!lili I Hlma: dr. :'t1:.trdi�tn:J II II lJ � -�
()
.!
P�·rh:u l...m dih:rim:l l:tngg:lf; 'J..:' J�lnu�•ri 2011 das,"t dt�ctuiui unruk ctllak.-.anakan di
.\nimsl l.nbur:Hnrhun tlnn l'nlt t•t•nclilian
FukuJI:I"' Kt.·cloktcran t ni\'crsi1:lS Has:mudi.Jin. Pcr..,�,.·tuiu:m
1 - rik
iui
hcrlaku c *' j:lk
1'�CI:If..S,.(UUl!ln J'l\. '4!1,.'1iti:ln.
lang_wtl
ditc-Tapf..:.l't
...._11111' ,i
Uc..·nrarl h;ttth \\�tklll
c
P;t�b nkhir J'H.'llchti:m. lupunu1 Jlt.···htk. .,.anaan ttctwlitian h11n1� "'" rahhnn �CI':tda � I· PK I ;.IJ..ulta.._ "cduJ..lcr..tn \. 'nha�. Jifr..a nd:t pcrubuh�n, pw1o���� dan ��H:HT J)crp;mj:utt,;nu r�.:nclhi:tn h3rus tlh.'nga_io \..;:m kcmhaJi. JX!.f't11 0hl)r1 �111 k�ljhJil �1ik pcn lit i:m lamamlt:mcn
c
prn1nt.:ol ).
"I.'IU�l
-) .. ....'
�
..
l"'rt•f.Ur.•lr.Sur\':ln1i "\s':ui.,J.Sc S u ,(';K N I P l'l60U!\114 I')R6 Ill 2 002
