06

HYDRAGEL ISO-LDH K20

Ref. 3020

2015/06

HYDRAGEL ISO-LDH K20 - 2015/06

POUŽITÍ KITU

HYDRAGEL ISO-LDH K20 kit je určen k elektroforetické identifikaci a kvantifikaci pěti izoenzymů laktát dehydrogenázy (LD) lidského séra na alkalicky pufrovaných (pH 8.4) agarózových gelech. Po elektroforetické separaci jsou izoenzymy LD vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrátu. Po osušení jsou agarózové plotny připraveny k vyhodnocení. Denzitometrie poskytuje přesnou relativní kvantifikaci jednotlivých zón. Každý agarózový gel soupravy HYDRAGEL ISO-LDH K20 je určen pro analýzu 7 mi vzorků. Pouze pro diagnostické použití in vitro.

PRIncIP TESTU

Každý izoenzym LD je tetramer složený ze čtyř podjednotek (polypeptidových řetězců). Existují 2 typy těchto podjednotek označované M ("muscle") a H ("heart"). Jejich kombinací vzniká pět izoenzymů lišících se elektroforetickými vlastnostmi – LD1 je izoenzym s největší elektroforetickou pohyblivostí, tj. putuje nejblíže k anodě. V následující tabulce jsou sumarizovány nomenklatura, složení a primární tkáňové zdroje izoenzymů. nOMEnKLATURA LD1

SLOŽEnÍ H4

LD4

HM3

LD2 LD3 LD5

H3M

H2M2 M4

ZDROJOVÁ TKÁŇ

srdce (myocardium) srdce (myocardium)

různá množství-různé tkáně různá množství-různé tkáně kosterní svalstvo, játra

Největší význam elektroforézy izoenzymů LD spočívá v diagnostice infarktu myokardu (MI). V séru zdravého člověka je poměr LD1 / LD2 < 1, u srdečního infarktu stoupá především hodnota LD1 a v menší míře LD2 a poměr LD1 / LD2 > 1 (tzv. LD1 / LD2 flip). Během 12 - 24 hodin po MI se zvyšuje koncentrace celkové LD 2 - 3x. Maxima aktivity celkové LD je dosaženo po 2 - 3 dnech a ještě přibližně 14 dnů zůstává ve zvýšených hodnotách. Analýza izoenzymů LD se obvykle provádí současně s analýzou izoenzymů CK nebo jiných časných markerů IM k jeho vyloučení nebo potvrzení a stanovení jeho vážnosti a monitorování pacientova stavu. Protože izoenzymy LD jsou dosti specifické pro různé tkáně, jejich stanovení v séru pomáhá diagnostikovat tkáňové poškození a odlišit např. plicní a ledvinné infarkty a jaterní onemocnění. Všechny izoenzymy LD katalyzují tutéž reverzibilní reakci, která je využita při jejich vizualizaci. V setu HYDRAGEL ISO-LDH K20 kit je k vizualizaci izoenzymů LD využito následu-jících reakcí : LD Laktát + NAD Pyruvát + NADH2 NADH2 + PMS Reduk. PMS + NAD Reduk. PMS + NBT PMS + reduk. NBT precip. formazán. modři

Množství výsledného formazánového precipitátu je přímoúměrné enzym. aktivitě LD.

Pozn. : nAD : nicotinamid Adenin Dinucleotid PMS : Phenazin Methosulfát nBT : nitro Blue Tetrazolium

REAGEncIE A MATERIÁL OBSAŽEnÝ V KITU HYDRAGEL ISO-LDH K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

POLOŽKY Agarózové gely (připraveno k použití) HYDRAGEL ISO CK/LD pufr (zásobní roztok) Roztok k rozpuštění substrátu (připraveno k použití) Substrát ISO-LDH (lyofilizát) Zastavovací roztok ISO CK/LD (připraveno k použití) Odbarvovací roztok (zásobní roztok) Aplikátory (7 zubů) (připraveno k použití) Tenké filtrační papíry Tlusté filtrační papíry

KAT. Č. 3020 10 gelů 3 lahv. po 100 mL 1 lahv. 45 mL 10 lahv. 1 lahv. 40 mL 1 lahv. 100 mL 1 bal., 10 ks 1 bal., 10 ks 1 bal., 10 ks

Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 °C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti.

PRo oPTIMÁLnÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PRoSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALoVÝ LETÁK.

1. AGARÓZOVÉ GELY

Příprava

Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok pH 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. - 100 -

SEBIA NÁVOD - Czech


Použití

Podpůrné medium pro elektroforézu izoenzymů LD.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladujte v horizontální poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě (15 - 30 °C) nebo v chladničce (2 - 8 °C). Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či na obalech gelů (šipka na čelní straně krabice musí směřovat vzhůru). Neukládejte v blízkosti oken nebo tepelných zdrojů. Teplota skladování nesmí mít výkyvy. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování).

2. PUFR HYDRAGEL ISO cK/LD

Příprava

Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok s pH 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pufr na elektroforézu.

Skladování, stabilita a známky poškození

Zásobní roztok se skladuje v ledničce nebo při pokojové teplotě. Je stabilní několik let - nejméně do data exspirace vyznačené na krabici soupravy či na štítku lahvičky. Zředěný pufr je stabilní jeden rok v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Při změně vzhledu, např. výskytu zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. Pozn. : V průběhu skladování může pufr zežloutnout bez následků na provedení testu.

3. ROZTOK K ROUZPUŠTĚnÍ SUBSTRÁTU

Příprava

Rozpouštědlo je připraveno k použití, obsahuje laktát lithný a přísady nezbytné pro správné provedení, v použité koncentraci neškodné.

Použití

K přípravě vyvíjecího roztoku – viz odstavec 4.

Skladování, stabilita a známky znehodnocení

Skladuje se při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Roztok vyřaďte z použití při změně jeho vzhledu, tj. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace.

4. ISO-LDH SUBSTRÁT

Příprava

Každá lahvička substrátu obsahuje : nikotinamid dinukleotid - NAD, nitro blue tetrazolium NBT, phenazin methosulfát - PMS a přísady neškodné v použité koncentraci, nezbytné pro optimální provedení testu. Roztok se připravuje na nepřímém světle, 10 minut před použitím přidáním 2.25 mL rozpouštědla do lahvičky se substrátem. Zavřete lahvičku, ponechejte 5 minut při pokojové teplotě a poté jemně promíchejte.

Použití

K vizualizaci elektroforeticky rozdělených izoenzymů LD.


ISO-LDH substrát je nutno skladovat v ledničce (2 - 8 °C). Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Substrát nesmí být zeleně nebo fialově zbarvený. Pozn. : Po dobu transportu lze ISo-LDH substrát ponechat až 15 dní mimo ledničku (15 - 30 °C) bez nepříznivých efektů na provedení testu.

5. ZASTAVOVAcÍ ROZTOK ISO cK/LD

Příprava

Blokovací roztok je připraven k použití. Obsahuje kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

K zastavení enzymatické reakce po inkubaci gelů.


Zastavovací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v ledničce a je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky.

6. ODBARVOVAcÍ ROZTOK

Příprava

Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 mL zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny.

Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku

Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Rortok je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Nepřidávejte azid sodný! Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μL/dL roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 mL). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAn PRoTECT. - 101 -


Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky.

7. APLIKÁTORY

Použití

Na jedno použití, k aplikaci vzorků.

Skladování

Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

8. TEnKÉ FILTRAČnÍ PAPÍRY

Použití

Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

9. TLUSTÉ FILTRAČnÍ PAPÍRY

Použití

K odsátí přebytečného zastavovacího roztoku z povrchu gelu před sušením.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

POTŘEBnÉ REAGEnTY nEOBSAŽEnÉ V BALEnÍ

FYZIOLOGIcKÝ ROZTOK

Příprava

Musí se připravit v laboratoři – 0.9 g/dL NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě.

Použití

Ředění vzorků séra pro dosažení celkové aktivity CK přibližně 750 IU/L, pokud je aktivita > 750 IU/L.

Skladování

Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dL azidem sodným.

PoznÁMKY : zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µS/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm.

ZAŘÍZEnÍ nEZBYTnÁ K PROVEDEnÍ TESTU

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. HYDRAGEL ENZ K20 ACCESSORY kit, SEBIA, kat. č. 1422, s nosičem šablon K20 a šablonou ENZ 4 mL k aplikaci reagencií. Vlhká komůrka kat. č. 1270. Elektroforetická komora : K20 SEBIA, kat. č. 1400. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi : HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. Pipety 10 µL, 200 µL a 5 mL. Sušička - Inkubátor : IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 10. Materiály ke kontrole kvality.

VZORKY K AnALÝZE

Odběr vzorků a skladování

Pro analýzu jsou vhodné čerstvé vzorky séra. Odběr proveďte způsobem obvyklým v dané laboratoři. V případě potřeby je možno takto odebrané vzorky skladovat do 7-mi dnů při pokojové teplotě (15 - 30 °C). DŮLEŽITÉ : Neskladujte vzorky při teplotě 2 - 8 °C.

Příprava vzorků

Použijte čiré vzorky séra. Pokud aktivita celkové LD přesahuje hodnotu 750 IU/L je nutno vzorek ředit fyziologickým roztokem tak, aby se výsledek pohyboval přibližně kolem této hodnoty (750 IU/L). Po promíchání inkubujte 10 minut při pokojové teplotě.

nepoužívat

Nepoužívejte zmražené nebo hemolyzované vzorky.

PoznÁMKA : odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 102 -


POSTUP

I. MIGRAcE 1. 2. 3. 4.

5. 6.

7. 8. 9.

10. 11.

12. 13. 14. 15.

Umístěte nosič aplikátorů na rovný povrch a zvedněte část s očíslovanými zuby (viz Obr. 1). Na spodní třetinu vyznačeného rámečku napipetujte 120 µL destilované vody. Vybalte gelovou plotnu. Rozviňte rychle a rovnoměrně jeden tenký filtrační papír po povrchu plotny a odsajte přebytek tekutiny. Neponechávejte však příliš dlouho, aby nedošlo k dehydrataci gelu plotny. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu – hrozí dehydratace gelu! Položte plotnu (gelem nahoru) okrajem ke stop značce na spodní straně vyznačeného rámečku (viz Obr. 2). Plotnu ohněte a položte ji na napipetovanou vodu a zajistěte, aby se voda rozprostřela rovnoměrně bez vzniku vzduchových bublin pod celou plotnou, zarovnanou s natištěným rámečkem (viz Obr. 2). Snižte nosič aplikátoru s očíslovanými zuby do střední polohy. Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (viz Obr. 3). Aplikujte 10 µL čirého séra do jamek aplikátoru. Všechny jamky nutno napipetovat do 2 minut. - Použijte aplikátory okamžitě. - Pro pozdější použití vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček). Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. Odlomte rámeček chránící zuby aplikátoru. Umístěte aplikátor do pozice č. 6 na nosič aplikátoru. DŮLEŽITÉ : Čísla na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4). Snižujte aplikátorový nosič opatrně tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. Po 5-ti minutách aplikátor zvedněte a odstraňte. Nyní gel s nanesenými vzorky umístěte podle polarity do elektroforetické komory. Při použití SEBIA K20 komůrky umístěte plotnu na můstek gelovou stranou dolů, plotna by měla být ponořena v pufru do hloubky 1 cm na každé straně. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. Komoru zapojte do zdroje proudu.

PODMÍnKY DĚLEnÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel)

SEBIA K20 150 mL 300 mL 25 minut 80 V 10 ± 2 mA

16. Po rozdělení odpojte komůrku a vytáhněte z ní gelovou plotnu.

II. PŘÍPRAVA InKUBAcE S ISO-LD SUBSTRÁTEM

DŮLEŽITÉ: Doporučuje se předehřát inkubátor-sušičku na dobu 5 minut při teplotě uvedené níže před vložením držáku šablony K20 a gelu pro inkubaci. 1. Umístěte nosič šablon na rovný povrch a zvedněte víko. 2. Na spodní třetinu vyznačeného rámečku napipetujte 120 µL destilované vody. 3. Umístěte plotnu gelem nahoru a okrajem proti značce stop na spodku rámečku (viz Obr. 6). 4. Plotnu ohněte a položte ji na napipetovanou vodu a zajistěte, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celou plotnou bez vniknutí vzduchových bublin, zarovnanou s tiště-ným rámečkem (viz Obr. 6). 5. Aplikační šablonu ENZ 4 mL nastavte na nosiči následujícím způsobem (viz Obr. 7) : - umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky, - držte šablonu jako za úchyt a položte ji na gel. 6. Napipetujte 2.25 mL roztoku substrátu ISO-LDH následujícím způsobem (viz Obr. 8) : - pipetu držte ve vertikální poloze, - lehce vtiskněte špičku pipety do otvoru na šabloně, - postupně lehce pipetujte reagencii pod šablonu bez vniknutí vzduchových bublin. 7. Nosič šablony přikryjte víkem (viz Obr. 9). 8. Nyní nosič se šablonou umístěte do inkubátoru při 51 °C na 25 minut. 9. Po inkubaci vyjměte nosič šablony z inkubátoru a umístěte ho na rovnou plochu. 10. Sejměte víko a před odstraněním substrátu nechejte 5 minut stát při pokojové teplotě.

III. ODSTRAnĚnÍ SUBSTRÁTU A APLIKAcE ZASTAVOVAcÍHO ROZTOKU 1. Odstraňte zbývající roztok substrátu : - Pipetou drženou ve vertikální poloze a lehce vtisknutou v otvoru šablony. - Postupně vytáhněte přebytek reagencie. 2. Napipetujte 2 mL zastavovacího roztoku. Vyvarujte se napipetování bublin. 3. Ponechte 10 minut při pokojové teplotě bez víka na nosiči šablon.

IV. ODSTRAnĚnÍ ZASTAVOVAcÍHO ROZTOKU A APLIKAcE FILTRAČnÍHO PAPÍRU 1. Odstraňte vyvíjecí roztok - (viz ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU). 2. Vyjměte šablonu : - Uchopte šablonu za držátko. - Zvedněte šablonu a vyjměte ji. 3. Gel ponechte v nosiči.

- 103 -


4. Na tři minuty přiložte silný filtrační papír : - nakloňte filtrační papír do úhlu cca 45°, - srovnejte spodní okraj filtračního papíru se spodním okrajem gelu, - položte filtrační papír na gel, - přitiskněte filtrační papír celou plochou, tak, aby dokonale přilnul k povrchu gelu. 5. Po 3 minutách odstraňte filtrační papír a gel vysušte při 51 °C. 6. Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a osušte ji pečlivě měkkým savým papírem. Před novým použitím se ujistěte, zda je šablona dokonale suchá.

V. SKEnOVÁnÍ GELU

1. Očistěte zadní stranu (plastická podpůrná) osušené plotny pomocí zvlhčeného měkkého papíru. 2. Pozor na vlákna buničiny ! 3. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání.

VI. PROMYTÍ GELU

Po naskenování můžete pro lepší ochránění elektroforeogramů (aby jste předešli zbarvení pozadí) gel promýt. 1. Ponořte gel na 10 minut do odbarvovacího roztoku. 2. Gel usušte teplým vzduchem při 51 °C.

KOnTROLA KVALITY

Kontrola kvality - doporučuje se zařadit kontrolní vzorek se známými hodnotami (např. Enzycontrol SEBIA, kat. č. 4790) do každé série měření.

VÝSLEDKY Hodnoty

Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) relativních koncentrací každé frakce. Po elektroforetickém rozdělení a vizualizaci jsou jednotlivé frakce identifikovány takto : LD1 - nejrychlejší frakce se nachází v zóně albuminu, LD5 – frakce nejblíže ke katodě se vyskytuje v zóně gamaglobulinů. U normálních vzorků je největší frakcí LD2, následována LD1 a LD3, LD4 a LD5 jsou menšími složkami. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) jednotlivých frakcí stanovené metodou HYDRAGEL ISO-LDH K20 byly stanoveny vyšetřením 200 zdravých dospělých jedinců (mužů i žen) : LD1 LD2 LD3 LD4 LD5

: : : : :

16.1 - 31.5 % 29.2 - 41.6 % 17.0 - 26.2 % 5.9 - 12.3 % 3.2 - 17.3 %

Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty.

Interpretace

SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Výsledky rozdělení LD izoenzymů by neměly být interpretovány bez znalosti pacientova klinického stavu a anamnézy. Příklady abnormálního rozdělení LD izoenzymů a jejich interpretace : 1. Zvýšení LD1 a LD2 – hodnota frakce LD1 je větší než hodnota LD2 (LD1 / LD2 flip) : - infarkt myokardu, stavy po chirurgických výkonech, - perniciózní anemie, hemolytická anemie, akutní srpkovitá anemie a megaloblastická anemie, - hemolýza z jakékoli příčiny, - Duchennova svalová dystrofie (relativní zvýšení LD1 a LD2). 2. Zvýšení frakcí "střední zóny" – LD3 a obecně i frakcí LD2 a LD4 : - masívní rozpad krevních destiček – např. u plicního infarktu, - postižení lymfatického systému – infekční mononukleóza, lymfomy a lymfatické leukemie. 3. Zvýšení LD5 : - poranění, zánětlivá a degenerativní onemocnění kosterního svalstva, - poškození jater – cirhóza jater, zánět jater, městnání v játrech, - městnavé srdeční selhání.

Problémy

Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte TechnickoServisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY".

- 104 -


HODnOTY

Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení.

Reprodukovatelnost na gelu

Tř různé vzorky séra (A, B a C) byly analyzovány elektroforézou na HYDRAGEL ISO-LDH K20 gelech dvou šarží. Vzorky A, B a C byly séra se sníženou LD1, průměrnou LD1 a zvýšenou frakcí LD1. Každý vzorek byl testován na všech drahách jednoho gelu obou šarží. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každou LD frakci všech tří vzorků a každé šarže. PARAMETR LD1 Vzorek A : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 16.3 / 16.3 SD 0.2 / 0.1 CV (%) 1.2 / 0.7 Vzorek B : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 25.2 / 26.9 SD 0.3 / 0.3 CV (%) 1.3 / 1.3 Vzorek C : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 32.1 / 34.2 SD 0.3 / 0.6 CV (%) 1.1 / 1.8

LD2

LD3

LD4

LD5

34.0 / 33.2 1.2 / 0.6 3.5 / 1.9

22.4 / 25.5 1.1 / 1.0 4.8 / 3.8

10.8 / 10.5 0.3 / 0.4 2.9 / 3.6

16.5 / 14.5 0.5 / 0.4 3.2 / 2.7

35.3 / 33.0 0.7 / 0.8 2.1 / 2.3

19.5 / 20.7 0.5 / 0.6 2.6 / 2.8

7.6 / 7.5 0.3 / 0.7 3.9 / 9.3

5.5 / 4.6 0.3 / 0.4 5.4 / 8.4

36.4 / 35.2 0.9 / 0.7 2.5 / 2.1

20.8 / 23.4 0.5 / 0.5 2.4 / 2.2

9.2 / 7.9 0.4 / 0.4 4.1 / 4.9

8.4 / 6.6 0.5 / 0.3 5.6 / 4.2

Reprodukovatelnost mezi gely

Sedm (7) různých vzorků séra bylo podrobeno testům každý na 10ti gelech HYDRAGEL ISO-LDH K20 stejné šarže. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje rozsahy SD a CV pro každou LD frakci a průměrné CV pro všechny vzorky. FRAKcE

SD

LD1 LD2 LD3 LD4 LD5

Přesnost - Srovnávací Studie

cV (%)

0.7 – 1.1 0.5 – 1.7 0.7 – 1.1 0.3 – 0.7 0.2 – 1.7

PRŮMĚR cV (%)

2.9 – 5.2 1.6 – 5.6 2.4 – 5.4 3.7 – 9.3 3.5 – 7.5

4.2 3.2 3.7 6.1 5.5

Třicet (30) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL ISO-LDH K20 soupravy fy SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů LD. Výsledky lineární regresní analýzy denzitometrických hodnot obou technik jsou vyneseny v následné tabulce. Poměr LD1 / LD2 byl spočítán pro každý vzorek a techniku. Shoda byla v 94.0 % mezi oběmi technikami v identifikaci vzorků podle LD1 / LD2 poměrů ratio < 1.0 a s LD1 / LD2 poměr > 1.0. PARAMETR Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah % hodn. (ISo-LDH K20) "test"

Linearita - citlivost

LD1 0.965 2.014 0.970

13.3 - 32.4

LD2 0.892 -6.123 1.095

LD3 0.945 -1.304 1.166

22.8 - 48.3

17.1 - 28.8

LD4 0.940 -0.742 1.027

5.2 - 12.8

LD5 0.988 -0.931 1.020

2.8 - 36.2

Na gel byl aplikován vzorek s celkovou aktivitou 50 IU/L to 750 IU/L, který vykazoval perfektní linearitu pro všech 5 frakcí HYDRAGEL ISO-LDH K20 technikou. Dobrou citlivost dokazuje, že průměrná variace 2 IU/L na frakci, může být detekována.

- 105 -


BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY

Amador E, Dorfman LE, Wacker WEC: Serum lactic dehydrogenase: An analytical assessment of current assays. Clin. Chem. 9:391, 1963. Erickson RJ, Morales DR: Clinical use of lactate dehydrogenase. n. Engl. J. Med. 265:478, 1961. Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp 652-660. Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp 365-368. 5. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. ImpactInternat, 1986 ; Sept : 93-97.

1. 2. 3. 4.

- 133 -


ScHÉMAS / FIGURES Figure 1

Figure 2

1 2 3 4 5 6 7

Figure 3

Figure 4

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 7 5 6 3 4 1 2

Figure 5

Figure 6

1 2 3 4 5 6 7

- 134 -


ScHÉMAS / FIGURES Figure 7

Figure 8

Figure 9

- 135 -

06

Recommend Documents