0123.!+67'5! 8,-

! " &! !

%

$!

#

' ( )! *!

+ ,

-.

/ 01 23 1 8

45 +/ 01 23 . ,

! +67 -.

'

5

!

29) :- "- 8 ; <= *> ? ? % + / 01 23 %+/ 0 8! ?# !$

>* ?+ <= $

*

*> ! ?

%

/ 01 23 1

?!<

#

29) :- "- 8 + 9 8 4 2A 6." B $! * ! * -2 ? < D<= ! <<= " ? !$

* .

! ?

"- 8 ! !

L

! +9 8 4

%

?/ 0 + 4?

$ >

! ? 4!< ? G
%

@ >

8 <=! 6

! *!

+ 2A 6." ) ! ! E!<= *!

4 # H*!+ ! ! < !4

#

< *

!<= >

*>

2A 6." ) $ < ,C' C2. <=

F $! ! !

!4 $!=

!*!

! +

< < D<=

<

"- 8 * = $! * ! * ! !! > ?+ ! $! ! 4 0 ! 9 ? ! !4 * = ! > > ? ! ! J .0 ! ' ' '' ' ' ' ', ,' ' , ' ', G K 5 GG 7: 8 <=! : @ > < =

' / 01 23 + E!<=

>

?= *!

Obsah 1.

Obsah ............................................................................. 5

2.

Skladování...................................................................... 5

3.

Další pot ebné vybavení................................................ 5

4.

Všeobecná preventivní opat ení................................... 6

5.

Informace o p vodcích.................................................. 6

6.

Princip PCR s hodnocením v reálném ase ................ 6

7.

Popis produktu .............................................................. 7

8.

Protokol .......................................................................... 7

9. 10.

8.1

Izolace DNA .................................................................................. 7

8.2

Interní kontrola ............................................................................ 10

8.3

Kvantifikace ................................................................................. 11

8.4

P íprava PCR .............................................................................. 12

8.5

Programování p ístroje LightCycler ........................................... 16

®

Vyhodnocení ................................................................ 19 ešení problém .......................................................... 22

11. Specifikace................................................................... 24 11.1 Analytická senzitivita ................................................................... 24 11.2 Specificita .................................................................................... 25 11.3 P esnost ...................................................................................... 26 11.4 Reprodukovatelnost .................................................................... 28 11.5 Diagnostické hodnocení .............................................................. 28

12. Zvláštní pokyny pro použití produktu ........................ 28 13. Bezpe nostní informace ............................................. 28 14. Kontrola kvality............................................................ 28

artus EBV LC PCR Kit 06/2007

3

15. Literatura ...................................................................... 29 16. Vysv tlení symbol ..................................................... 29

4


artus® EBV LC PCR Kit ®

Pro použití s p ístrojem LightCycler .

1. Obsah Ozna ení

Kat. ís. 4501063

Kat. ís. 4501065

a obsah

24 reakcí

96 reakcí

2 x 12 rxns

8 x 12 rxns

1 x 200 µl

1 x 200 µl

1 x 200 µl

1 x 200 µl

EBV LC Master

Modrá ervená

EBV LC/RG/TM QS 1 5 x 104 cop/µl

¤

ervená

EBV LC/RG/TM QS 2 5 x 103 cop/µl

¤

ervená

EBV LC/RG/TM QS 3¤ 5 x 102 cop/µl

1 x 200 µl

1 x 200 µl

ervená

EBV LC/RG/TM QS 4¤ 5 x 101 cop/µl

1 x 200 µl

1 x 200 µl

Zelená

EBV LC IC¤

1 x 1 000 µl

2 x 1 000 µl

Bílá

Water (PCR grade)

1 x 1 000 µl

1 x 1 000 µl

¤

QS IC

= =

Kvantifika ní standard Interní kontrola

2. Skladování Komponenty artus EBV LC PCR Kit se skladují p i -20°C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabra te opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. P i nepravidelném používání by proto m ly být reagencie alikvotovány. V p ípad , že je nutné komponenty skladovat p i teplot +4°C, skladujte je takto maximáln po dobu p ti hodin.

3. Další pot ebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izola ní souprava (viz 8.1 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špi ky s filtrem Vortex mixer


5

Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Color Compensation Set (Roche Diagnostics, kat. . 2 158 850) pro vytvo ení souboru Crosstalk Color Compensation ®

LightCycler kapiláry (20 µl) ®

LightCycler Cooling Block ®

LightCycler p ístroj LightCycler® Capping Tool

4. Všeobecná preventivní opat ení Uživatel by m l dbát na následující: Používejte sterilní pipetovací špi ky s filtrem. Skladujte, izolujte a p idávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty p ed po átkem testu úpln

rozmrazte p i

pokojové teplot . Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v LightCycler® Cooling Block.

5. Informace o p vodcích P enos

viru

Epsteina

a

Barrové

(EBV)

probíhá

oráln ,

v tšinou

kontaminovanými slinami. Infekce EBV probíhá zpravidla asymptomaticky, zvlášt v d tství. Klinickým projevem akutní infekce je infek ní mononukleóza s hore kou, únava, angína a také zdu ení lymfatických uzlin a sleziny. U n kterých pacient infekce

EBV

mohou potíže p etrvávat chronicky a recidivovat. Formy s t žkým

pr b hem

jsou

sledovány

zvlášt

u

imunosuprimovaných pacient a u osob s defektem T-bun k.

6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase P i diagnostikování pomocí polymerázové

et zové reakce (PCR) se

amplifikují specifické oblasti genomu p vodce. Detekce probíhá p i PCR v reálném ase pomocí fluorescen ních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná

6


na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v pr b hu PCR v reálném

ase umož uje

pr kaz a kvantifikaci produkt , aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací kapiláry (Mackay, 2004).

7. Popis produktu artus EBV LC PCR Kit je systém k p ímému použití pro pr kaz EBV DNA pomocí polymerázové

®

et zové reakce (PCR) v p ístroji LightCycler .

EBV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 97 bp dlouhého úseku genomu viru EBV a také pro bezprost ední detekci ®

amplifikátu ve fluorimetrickém kanálu F2 p ístroje LightCycler . Krom

toho

obsahuje artus EBV LC PCR Kit druhý heterologní amplifika ní systém pro pr kaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako Interní kontrola (IC) ve fluorimetrickém kanálu F3. Limit detekce analytické EBV PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) p itom není negativn

ovlivn n. Spolu

s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4), s jejichž pomocí lze ur it množství p vodce ve vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.3 Kvantifikace. Upozorn ní:

Teplotní

artus EBV LC PCR Kit

profil

pro

odpovídá

detekci

teplotním

EBV

DNA

profil m

za

pomoci

souprav

artus

HSV-1/2 LC PCR Kit, artus VZV LC PCR Kit a artus CMV LC PCR Kit. Díky tomu mohou být reakce PCR pro tyto artus systémy provedeny a analyzovány v jednom b hu. Dbejte p itom prosím speciálních pokyn pro vyhodnocení v kapitolách 8.3 Kvantifikace a 9. Vyhodnocení.

8. Protokol 8.1 Izolace DNA DNA-izola ní soupravy nabízejí r zní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a prove te izolaci DNA podle návodu. Doporu ujeme následující izola ní soupravy:


7

Izola ní souprava

Katalogové íslo

Výrobce

Nosi RNA

QIAamp DNA Mini Kit (50)

51 304

QIAGEN

neobsažen

QIAamp UltraSens Virus Kit (50)

53 704

QIAGEN

obsažen

krevní bu ky

QIAamp DNA Blood Mini Kit (50)

51 104

QIAGEN

neobsažen

plazma

EZ1 DSP Virus Kit (48)*

62 724

QIAGEN

obsažen

Vzorek

sérum, plazma, likvor

*Pro použití v kombinaci s BioRobot EZ1 DSP Workstation (Kat. ís. 9001360) a EZ1 DSP Virus Card (Kat. ís. 9017707).

D ležité pokyny pro použití souprav QIAamp UltraSens Virus Kit, QIAamp DNA Blood Mini Kit a QIAamp DNA Mini Kit: Užití nosi e RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výt žek DNA/RNA. Pokud použitá izola ní souprava neobsahuje žádný nosi

RNA, povšimn te si prosím, že je p i izolaci nukleových kyselin

z nebun

ných t lesných tekutin resp. materiál

DNA/RNA (nap . likvor) d razn

s malým obsahem

doporu eno p idat nosi

homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat.

RNA (RNA

ís. 27-4110-01).

Prosím postupujte následujícím zp sobem: a) Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA v elu ním pufru (nepoužívejte lyza ní pufr) izola ní soupravy (nap . AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp DNA Blood Mini Kit) a ed ním vytvo te roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozd lte tento roztok nosi e RNA na po et alikvot

odpovídající Vaším požadavk m a skladujte je p i -20°C.

Zabra te opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosi e RNA. b) Používejte 1 µg nosi e RNA na 100 µl lyza ního pufru. Je-li extrak ním protokolem stanoveno 200 µl lyza ního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosi e RNA (1 µg/µl) p ímo do lyza ního pufru. P ed

za átkem

každé

pipetovacího schématu

izolace erstv

musí

být

podle

následujícího

vytvo ena sm s lyza ního pufru a

nosi e RNA (pop . i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola):

8


Po et vzork

1

Lyza ní pufr

12

nap . 200 µl

nap . 2 400 µl

2 µl

24 µl

Celkový objem

202 µl

2 424 µl

Objem pro izolaci

200 µl

po 200 µl

Nosi RNA (1 µg/µl)

c) Tuto erstv

vytvo enou sm s lyza ního pufru a nosi e RNA vložte

ihned do izolace. Skladování sm si není možné. Užití nosi e RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výt žek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosi e RNA dodávaného s QIAamp UltraSens Virus Kit, doporu ujeme následující postup lišící se od údaj uvedených v p íru ce izola ní soupravy: a.

Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA p ed prvním použitím izola ní soupravy v 310 µl elu ního pufru obsaženého v souprav (kone ná koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyza ní pufr). Rozd lte tento roztok nosi e RNA na po et alikvot

odpovídající Vaším požadavk m a

skladujte je p i -20°C. Zabra te opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosi e RNA. b.

P ed za átkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu

erstv

vytvo ena sm s lyza ního pufru a

nosi e RNA (pop . i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Po et vzork

12

Lyza ní pufr AC

800 µl

9 600 µl

Nosi RNA (1 µg/µl)

5,6 µl

67,2 µl

805,6 µl

9 667,2 µl

800 µl

po 800 µl

Celkový objem Objem pro izolaci

c.

1

Tuto erstv vytvo enou sm s lyza ního pufru a nosi e RNA vložte ihned do izolace. Skladování sm si není možné.

Použitím QIAamp UltraSens Virus Kit lze docílit zkoncentrování vzorku. Pokud se v p ípad vašeho vzorku nejedná o sérum nebo plazmu, p idejte k vzorku alespo 50 % (v/v) negativní lidské plazmy.


9

Antikoagulanty obsažené ve zkumavkách pro odb r krve mohou mít inhibitivní ú inek na PCR, ale uvedené izola ní soupravy je dob e eliminují. Doporu ujeme nepoužívat heparinovou krev. P i izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmíne n zajist te, aby byl p ed elucí proveden ješt

jeden centrifuga ní krok (t i

minuty, 13 000 ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. P edejdete tak možným inhibicím PCR. artus EBV LC PCR Kit není vhodný pro izolace na bázi fenolu. D ležité upozorn ní k použití soupravy EZ1 DSP Virus Kit: Užití nosi e RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výt žek DNA/RNA. P idejte tedy prosím ke každé izolaci pot ebné množství nosi e RNA a držte se pokyn v EZ1 DSP Virus Kit Handbook. D ležité: Interní kontrolu soupravy artus EBV LC PCR Kit lze vložit p ímo do izolace (viz 8.2 Interní kontrola).

8.2 Interní kontrola Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (EBV LC IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz Obr. 1). P i použití EZ1 DSP Virus Kit musí být Interní kontrola vložena podle instrukcí v EZ1 DSP Virus Kit Handbook. Používáte-li QIAamp UltraSens Virus Kit, QIAamp DNA Blood Mini Kit nebo QIAamp DNA Mini Kit, p idejte Interní kontrolu k izolaci v pom ru 0,1 µl na 1 µl elu ního objemu. Jestliže nap íklad používáte QIAamp DNA Mini Kit a eluujete DNA v 50 µl AE pufru, vložte 5 µl Interní kontroly. Množství vkládané Interní kontroly závisí pouze na elu ním objemu. Interní kontrola a nosi

RNA (viz 8.1 Izolace DNA) by m ly být

p idávány pouze k sm si lyza ního pufru a vzorku nebo p ímo k lyza nímu pufru. Interní kontrola nesmí být p idána p ímo ke vzorku. P i p idání k lyza nímu pufru se musí dbát na to, aby byla sm s Interní kontroly, lyza ního pufru a

10


nosi e RNA

erstv

pokojové teplot

p ipravena a ihned použita (skladování sm si p i

nebo v lednici m že již po n kolika hodinách vést

k vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a nosi RNA nepipetujte p ímo do vzorku. Voliteln

lze Interní kontrolu použít výhradn

PCR (viz Obr. 2). V tomto p ípad

ke kontrole možné inhibice

p idejte 0,5 µl Interní kontroly na jednu

testovací sm s p ímo do 15 µl EBV LC Master. Pro každou PCR reakci *

použijte 15 µl takto vytvo eného Master Mixu a p idejte následn 5 µl izolátu. Jestliže p ipravujete jeden b h pro více vzork , zvyšte pot ebná množství EBV LC Master a Interní kontroly podle po tu vzork (viz 8.4 P íprava PCR). Soupravy artus EBV LC PCR Kit a artus CMV LC PCR Kit obsahují identickou Interní kontrolu (IC). Také artus HSV-1/2 LC PCR Kit a artus VZV LC PCR Kit obsahují identickou Interní kontrolu.

8.3 Kvantifikace S Kvantifika ními standardy (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4) dodávanými spolu s produktem se zachází stejn jako s již izolovanými vzorky a p idávají se ve ®

stejném objemu (5 µl). Standardní k ivku v p ístroji LightCycler vytvo íte tak, že vložíte všechny

ty i Kvantifika ní standardy dodávané s produktem,

definujete je v Sample Loading Screen jako standardy a zadáte uvedené koncentrace (viz LightCycler Operator’s Manual, Version 3.5, Chapter B, 2.4. Sample Data Entry). Tuto standardní k ivku lze použít také pro následné kvantifikace, pokud je b hem aktuálního b hu použit alespo jeden standard jedné definované koncentrace. K tomu je zapot ebí d íve vytvo enou standardní k ivku importovat (viz LightCycler Operator’s Manual, Version 3.5, Chapter B, 4.2.5. Quantification with an External Standard Curve). U této formy kvantifikace je však t eba zohlednit skute nost, že v d sledku variability mezi PCR b hy m že nastat odchylka ve výsledku.

*

Zvýšení objemu podmín né p idáním Interní kontroly je p i p íprav opominuto. Senzitivita není omezena.


PCR reakce

11

Pokud máte v b hu integrován více než jeden Herpes-artus systém, dbejte na to, aby byly analyzovány odd len p íslušnými Kvantifika ními standardy. Upozorn ní: Kvantifika ní standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro p epo et hodnot získaných pomocí standardní k ivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec:

výsledek (kopie/ml)

=

výsledek (kopie/µl) x elu ní objem (µl) objem vzorku (ml)

Prosím povšimn te si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadn p vodní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku p ed izolací nukleových kyselin pozm n n (nap . redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení napln ním na objem požadovaný pro izolaci). D ležité: Na www.qiagen.com/Products/ByLabFocus/MDX je k dispozici p íru ka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systém

artus na

®

®

p ístroji LightCycler (Technical Note for quantitation on the LightCycler ®

1.1/1.2/1.5 or LightCycler 2.0 Instrument).

8.4 P íprava PCR Ov te, že je Cooling Block s uvnit

obsaženými adaptéry (p íslušenství

®

p istroje LightCycler ) p edem vychlazen p ibližn

na +4°C. Do adaptér

Cooling Blocku vložte takový po et kapilár LightCycler®, který je pot ebný pro plánované reakce. Dbejte na to, aby byl spole n proveden alespo

s každým b hem PCR

jeden Kvantifika ní standard a jedna negativní kontrola

(Water, PCR grade). Pro vytvo ení standardní k ivky použijte prosím u každého b hu PCR všechny spolu s produktem dodávané Kvantifika ní standardy (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4). Všechny reagencie se musí p ed za átkem testu zcela rozmrazit p i pokojové teplot , musí být dob e promíchány (opakovaný náb r pipetou a vypušt ní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány.

12


Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, musí být nap ed Interní kontrola p idána k izolaci (viz 8.2 Interní kontrola). V tomto p ípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický p ehled na Obr. 1):

1. P íprava Master Mixu 2. P íprava PCR reakce

Po et vzork

1

EBV LC Master

15 µl

180 µl

0 µl

0 µl

celkový objem

15 µl

180 µl

Master Mix

15 µl

po 15 µl

5 µl

po 5 µl

20 µl

po 20 µl

EBV LC IC

vzorek celkový objem

12

Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole PCR inhibice, je t eba ji p idat p ímo do EBV LC Master. V tomto p ípad

používejte

následující schéma pipetování (viz také schématický p ehled na Obr. 2):

1. P íprava Master Mixu 2. P íprava PCR reakce

Po et vzork

1

EBV LC Master

15 µl

EBV LC IC

0,5 µl

celkový objem Master Mix vzorek celkový objem

12 180 µl 6 µl *

15,5 µl

186 µl*

15 µl*

po 15 µl*

5 µl

po 5 µl

20 µl

po 20 µl

Do plastikového zásobníku každé kapiláry pipetujte 15 µl Master Mixu. Následn

p idejte 5 µl eluátu z izolace DNA. Podobn

pozitivní

kontrolu

5 µl

(EBV LC/RG/TM QS 1 - 4)

alespo a

jako

jednoho

musíte p idat jako

Kvantifika ního

negativní

kontrolu

standardu 5 µl

vody

(Water, PCR grade). Uzav ete kapiláry. Sm s p evedete z plastikového zásobníku do kapiláry tak, že na stolní centrifuze centrifugujete adaptéry s uvnit obsaženými kapilárami po dobu deseti sekund p i maximáln 400 x g (2 000 ot/min).

*

Zvýšení objemu podmín né p idáním Interní kontroly je p i p íprav opominuto. Senzitivita není omezena.


PCR reakce

13

P idání Interní kontroly k izolaci

Izolace sm s lyza ního pufru a vzorku + 0,1 µl IC* na 1 µl elu ního objemu

5 µl izolátu*

15 µl artus Master*

Sklen ná kapilára

LightCycler®

Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a PCR inhibice. *

14

P i každém pipetovacím kroku je t eba bezpodmíne n dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované.


P idání Interní kontroly k artus Master

0,5 µl IC*

Izolace

15 µl artus Master*

15,5 µl Master Mix*

5 µl izolátu*

15 µl Master Mix*

Sklen ná kapilára

LightCycler®

Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu PCR inhibice. *

P i každém pipetovacím kroku je t eba bezpodmíne n dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované.


15

8.5 Programování p ístroje LightCycler® Pro detekci EBV DNA vytvo te na p ístroji LightCycler

®

teplotní profil

následujícími p ti pracovními kroky (viz Obr. 3 - 7): A.

Po áte ní aktivace Hot Start enzymu

Obr. 3

B.

Krok “Touch Down”

Obr. 4

C.

Amplifikace DNA

Obr. 5

D.

K ivka tání (volitelné)

Obr. 6

E.

Chlazení

Obr. 7

Dbejte zvlášt

na nastavení Analysis Mode, Cycle Program Data a

Temperature Targets. Na obrázcích jsou tato nastavení zvýrazn na ernými ráme ky. Pokyny pro programování p ístroje LightCycler® naleznete v p íru ce LightCycler Operator’s Manual. Vytvo ení kroku D k ivka tání je volitelné. K ivka je pot ebná výhradn pro rozlišení mezi HSV-1 a HSV-2 p i sou asném nasazení artus HSV-1/2 LC PCR Kit.

Obr. 3: Po áte ní aktivace Hot Start enzymu.

16


Obr. 4: Krok “Touch Down”.

Obr. 5: Amplifikace DNA.


17

Obr. 6: K ivka tání.

Obr. 7: Chlazení.

18


9. Vyhodnocení U vícebarevných analýz se mezi fluorimetrickými kanály vyskytují interference. Software p ístroje LightCycler

®

obsahuje soubor ozna ený jako Color

Compensation File, který tato zá ení kompenzuje. Tento soubor otev ete p ed, v pr b hu nebo po skon ení PCR aktivací p epínací plochy Choose CCC File resp. Select CC Data. Není-li instalován žádný soubor Color Compensation File, vytvo te soubor podle návodu v p íru ce LightCycler Operator’s Manual. Po aktivaci souboru Color Compensation File se ve fluorimetrických kanálech F1, F2 a F3 objeví odd lené signály. Pro analýzu výsledk PCR, které byly získány pomocí artus EBV LC PCR Kit, zvolte prosím pro analytickou EBV PCR pohledovou funkci F2/Back-F1 resp. F3/Back-F1 pro PCR Interní kontroly. P i analýze kvantitativních b h

dodržujte bezpodmíne n

oddíl ®

8.3 Kvantifikace a Technical Note for quantitation on the LightCycler 1.1/1.2/1.5 or LightCycler

®

2.0 Instrument, která je k dispozici na

www.qiagen.com/Products/ByLabFocus/MDX. Pokud máte v b hu PCR integrován více než jeden Herpes-artus systém, dbejte na to, aby byly vzorky EBV analyzovány odd len . Pro vyhodnocení zvolte odpovídající pozice rotoru. M že dojít k následujícím výsledk m: 1. Ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 je detekován signál. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje EBV DNA. V tomto p ípad je detekce signálu v kanálu F3/Back-F1 podružná, protože vysoké výchozí koncentrace EBV DNA (pozitivní signál v kanálu F2/Back-F1) mohou vést k redukovanému až chyb jícímu fluorescen nímu signálu Interní kontroly v kanálu F3/Back-F1 (kompetice).

2. Ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 není detekován žádný signál, nýbrž pouze v kanálu F3/Back-F1 (signál Interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná EBV DNA. Lze jej proto považovat za negativní. P i negativní EBV PCR vylu uje detekovaný signál Interní kontroly možnost inhibice PCR.


19

3. Signál není detekován ani v kanálu F2/Back-F1 ani v kanálu F3/Back-F1. Není možné u init diagnostický záv r. Pokyny týkající se zdroj 10.

chyb a jejich odstran ní jsou uvedeny v kapitole

ešení problém .

P íklady pozitivních a negativních PCR reakcí jsou uvedeny na Obr. 8 a Obr. 9.

20


Obr. 8: Pr kaz Kvantifika ních standard (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1. NTC: non-template control (negativní kontrola).

Obr. 9: Pr kaz Interní kontroly (IC) ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1 p i sou asné amplifikaci Kvantifika ních standard (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4). NTC: non-template control (negativní kontrola).


21

10. ešení problém Žádný signál p i pozitivních kontrolách (EBV LC/RG/TM QS 1 - 4) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1: Volba fluorimetrického kanálu p i analýze dat PCR neodpovídá protokolu. K analýze dat zvolte fluorimetrický kanál F2/Back-F1 pro analytickou EBV PCR a fluorimetrický kanál F3/Back-F1 pro PCR Interní kontroly. ®

Naprogramování teplotního profilu p ístroje LightCycler je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.5 Programování ®

p ístroje LightCycler ). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.4 P íprava PCR) a pop . PCR zopakujte. Podmínky

skladování

jednoho

nebo

více

komponent

soupravy

neodpovídají p edpis m uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla p ekro ena doba použitelnosti soupravy artus EBV LC PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop . novou soupravu. Slabý nebo chyb jící signál Interní kontroly ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1 p i sou asné nep ítomnosti signálu v kanálu F2/Back-F1: Podmínky PCR neodpovídají protokolu. Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a pop . PCR zopakujte s opraveným nastavením. PCR byla inhibována. Ujist te se, že používáte námi doporu ený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se p esn p edpis výrobce. P esv d te se, že byl p i izolaci DNA p ed elucí proveden dodate ný doporu ený centrifuga ní krok k úplnému odstran ní zbytk

etanolu

(viz 8.1 Izolace DNA). B hem izolace dochází k úbytku DNA. Byla-li k izolaci p idána Interní kontrola, m že nep ítomnost signálu Interní kontroly znamenat úbytek DNA b hem izolace. Ujist te se, že

22


používáte námi doporu ený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se p esn p edpis výrobce. Podmínky

skladování

jednoho

nebo

více

komponent

soupravy

neodpovídají p edpis m uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla p ekro ena doba použitelnosti soupravy artus EBV LC PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop . novou soupravu. Signály p i negativních kontrolách ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 analytické PCR. B hem p ípravy PCR došlo ke kontaminaci. Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzav ete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadn jako poslední. Ujist te

se,

že

jsou

pracovní

plochy

a

p ístroje

pravideln

dekontaminovány. B hem izolace dochází ke kontaminaci. Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzork

za užití nových

reagencií. Ujist te

se,

že

jsou

pracovní

plochy

a

p ístroje

pravideln

dekontaminovány. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu.


23

11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita Pro zjišt ní analytické senzitivity artus EBV LC PCR Kit byla vytvo ena ada ed ní standard

od 50 do nomináln

0,005 EBV-ekvivalent

kopie*/µl a

analyzována pomocí artus EBV LC PCR Kit. Experimenty byly provedeny ve t ech r zných dnech formou osminásobných ur ení. Výsledek byl zjišt n pomocí probitové analýzy. Jeho grafické vyhodnocení je zobrazeno na Obr. 10. Limit detekce artus EBV LC PCR Kit leží proto u 5,78 kopií/µl (p = 0,05). To znamená, že je s 95 % pravd podobností detekováno 5,78 kopií/µl. ®

Probitová analýza: Virus Epsteina a Barrové (LightCycler )

Obr. 10: Analytická senzitivita artus EBV LC PCR Kit.

*

U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjišt na spektrální a fluorescen ní fotometrií.

24


11.2 Specificita Specificita artus EBV LC PCR Kit je v první ad zaru ena výb rem primer a sond, jakož i volbou p ísných reak ních podmínek. Primery a sondy byly na základ

sekven ní analýzy p ezkoušeny na eventuální homologie se všemi

sekvencemi publikovanými v genových bankách. Tímto zp sobem byla kontrolována také detekovatelnost všech relevantních genotyp . Validace specificity byla provedena na šesti r zných EBV negativních sérových vzorcích, které spolu s EBV specifickými primery a sondami obsaženými v EBV LC Master negenerovaly žádný signál. K ur ení specificity artus EBV LC PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v Tabulce 1 testována na k ížovou reaktivitu. Žádný z testovaných p vodc nebyl reaktivní. Tabulka 1: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciáln k ížov reaktivních p vodc . EBV (F2/Back-F1)

Interní kontrola (F3/Back-F1)

Lidský herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1)

-

+

Lidský herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2)

-

+

Lidský herpesvirus 3 (Varicella zoster virus)

-

+

Lidský herpesvirus 5 (Cytomegalovirus)

-

+

Lidský virus leukémie T-bun k 1

-

+

Lidský virus leukémie T-bun k 2

-

+

Kontrolní skupina


25

11.3 P esnost Údaje o p esnosti pro artus EBV LC PCR Kit umož ují stanovení celkové variability

testovacího

systému.

Tato

celková

z Intra-Assay variability (variabilita vzork

variabilita

se

skládá

stejné koncentrace v rámci

jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita zp sobená provedením experimentu r znými osobami v jedné laborato i a užitím r zných p ístroj stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita zp sobená použitím r zných šarží). P itom byla vždy vypo ítána standardní odchylka, variance a koeficient variace jak pro specifickou PCR p vodce, tak i pro PCR Interní kontroly. Tyto

údaje

byly

Kvantifika ního

pro

artus EBV LC PCR Kit

standardu

s

nejnižší

stanoveny

koncentrací

(QS 4;

na

základ

50 kopií/µl).

Experimenty byly provedeny formou osminásobných ur ení. Vyhodnocení výsledk

bylo provedeno na základ

Ct hodnot amplifika ních k ivek (Ct:

threshold cycle, viz Tabulka 2) a z toho ur ených kvantitativních hodnot v kopiích/µl (viz Tabulka 3). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace

iní tedy 1,17 % (Ct) resp. 14,54 % (konc.), pro pr kaz Interní

kontroly 1,02 % (Ct). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech díl ích hodnot zjišt ných variabilit.

26


Tabulka 2: Údaje o p esnosti na základ Ct hodnot. Standardní odchylka

Variance

Koeficient variace [%]

0,20

0,04

0,90

0,04

0,00

0,28

0,27

0,07

1,24

0,11

0,01

0,72

0,47

0,07

1,44

0,19

0,03

1,23

0,26

0,07

1,17

0,15

0,02

1,02

Intra-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola

Tabulka 3: Údaje o p esnosti na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Standardní odchylka

Variance

Koeficient variace [%]

1,36

1,85

13,48

1,68

2,83

16,61

1,33

1,77

13,19

1,47

2,16

14,54

Intra-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: EBV LC/RG/TM QS 4


27

11.4 Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou po izovány za ú elem pravidelného hodnocení výkonnosti artus EBV LC PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základ

ú astí na

mezilaboratorních pokusech.

11.5 Diagnostické hodnocení artus EBV LC PCR Kit je v sou asné dob evaluován v n kolika studiích.

12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prost edek by m li používat pouze pracovníci, kte í jsou speciáln pou eni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). P esné dodržování protokolu je bezpodmíne n

nutné k dosažení

optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých

komponent.

Nepoužívejte

reagencie

s prošlou

trvanlivostí.

13. Bezpe nostní informace Bezpe nostní informace k souprav

artus EBV LC PCR Kit naleznete v

odpovídajících bezpe nostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na www.qiagen.com/support/msds.aspx.

14. Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spole nosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO 13485 byla každá šarže artus EBV LC PCR Kit testována podle p edem stanovených specifikací, aby byla zaru ena jednotná kvalita produktu.

28


15. Literatura Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): 190 - 212.

16. Vysv tlení symbol

Použitelné do

íslo šarže

Výrobce

Katalogové íslo íslo materiálu Manuál

Diagnostický zdravotnický prost edek in vitro

Obsah posta ující pro test

Teplotní rozmezí Kvantifika ní standard Interní kontrola


29

30



31

:MN! ;

!

,

C ,7

7

K O , ,

;

! ,

7 ' 7

!

"

;

!

7

7

7'

K O

7

;

!

7

7

# ;

!

)

7

K O

7

I! ! =

!

7

'7 ,

7

7

K O

7

' ! ,

,

7

-.

7,

'

'

K O,

I

I!<= < , 7 +

'7 , , N! ,

7

7

7

4! ? : ! 7' ,7

'

7

7

7

7'' '

5

!

7

I!<= <

I N! 7

763 07"82" ,

: 3 ,:

7

7

P

7

K O

;

' - ; J 8I09; 2J K - 262Q

!

C

7

P

I!<= <

7

+

1

(" ;

7

7

'

C ,7

:" ,

7

1

"& ' !

7

K !G

% $

;

!

K O

"$

J

,

I!<= < ,

/ 01 23 .

#

B !

I!<= <

8

7

7

! 'C

7

0 !

K O,

!

C ,7

7',' ,

<=

-=

I!<= <

,

5

I!<= < ) ! < I!<= < ,

7

!

-=

7

+I ?

'7 ,

4 !<= 7

7

7

-0 763 07"82" ,

7

7'' '

7

0123.!+67'5! 8,-

Recommend Documents