N O RO K Ú M PPR YK ÁM DY HÁ OD OH VO NÁ ÁV ÚLLO
S SP CV Z FFY PE VIIČ EC YZ CIIÁ ČE ZIIO EN ÁL NÍÍ Z OL LN LO NÍÍ C OG GIIE E Ž ŽIIV VO OČ ČIIC CH HŮ Ů
ZÁKLADNÍ PRACOVNÍ TECHNIKY 1. Rozdělení pracovních úloh Při provádění pokusů obyčejně pracuje jeden z pracovníků jako operatér, který provádí operaci na zvířeti a řídí práci celé pracovní skupiny. Druhý pracovník jako jeho asistent připravuje nástroje, podává je, pomáhá operatérovi při operaci a stará se o dostatečnou narkózu. Je-li ještě další pracovník ve skupině, má na starosti ostatní přístroje a vybavení potřebná k pokusu a v případě kritické nutnosti pomáhá operatérovi a asistujícímu zvládnout situaci při práci s pokusným zvířetem. 2. Zacházení se zvířaty Jedním z nejpoužívanějších pokusných zvířat ve fyziologii je albinotická forma potkana Rattus norvegicus. Je to dáno především vhodnou velikostí, umožňující poměrně snadnou manipulaci, drobné operační zákroky, opakované odběry krve, nenáročností chovu a snadným množením. Proto se při stručném popisu zaměříme na manipulaci s laboratorním potkanem. Pro vyzvednutí z chovné nebo transportní klece a případné přemístění do jiné klece, pokusné aparatury nebo zvážení je nejjednodušší uchopit zvíře za kořen ocasu (nikoli na špičce, protože to by mohlo vést ke stržení kůže) a rychle je vyzvednout ven. Pak se zvíře vloží do jiné vhodné nádoby na vážení nebo přemístí jinam. Dlouhé držení potkana tímto způsobem se nedoporučuje, pokud jej nepostavíme, aby se aspoň předními končetinami mohl dotýkat nějaké podložky (k tomu může posloužit i předloktí experimentátora). Je-li potkan pouze držen za ocas bez opory (visí ve vzduchu hlavou dolů) po chvíli se začne zmítat a snaží se uniknout ze sevření, případně i kousnout toho, kdo jej drží; není to tedy vhodný postup pro delší manipulaci se zvířetem. Vážení se nejlépe provádí v předem zvážené, přiměřeně velké nádobě s víkem, aby zvíře nemohlo uniknout. Základem úspěšného zacházení s laboratorním zvířetem je nenásilný a klidný přístup ke zvířeti, tlumené světlo v místnosti a především nehlučné prostředí. Hodně pomůže tichá a klidná „promluva“ se zvířetem, pomalé a rozvážné pohyby a eventuelní seznamovací doteky, které nevyvolávají u zvířete pocit ohrožení. Pro složitější zásahy, např. injekce, se musí potkan uchopit pevně jednou rukou shora (nejlépe tou, která není dominantní, protože ta se pak použije k vlastní aplikaci injekce) v přední polovině těla a palcem a ukazováčkem obejmout pod spodní čelistí (ale ne pod krkem), aby se zabránilo případnému kousnutí. Potkana nesmíme svírat příliš silně, abychom mu nepůsobili bolest a neomezovali dýchací pohyby, přesto však uchopení musí být dostatečně pevné, aby se nevyprostil a nekousl experimentátora nebo neunikl. Není výhodné při práci s potkanem používat kožené rukavice (na zdánlivou ochranu proti kousnutí) neboť se ztrácí cit při uchopování a zvíře se často podráždí, takže to práci s ním ztěžuje. Proti kousnutí je navíc taková ochrana naprosto nedostatečná, protože potkan dokáže prokousnout mnohem silnější vrstvu, než je tloušťka rukavice. Má-li někdo přece jen obavu před uchopením laboratorního potkana holou rukou nebo je-li zvíře hodně neklidné, je výhodnější přidržet je za ocas na podložce a shora přikrýt slabým čistým kouskem látky. Potkan se obvykle uklidní (šero, pocit skrýše) a je pak snadné jej shora přes látku uchopit obvyklým způsobem při zachování dostatečného citu.
2
3. Celková anestézie V praktiku budeme používat celkovou anestézii, abychom zaručili bezbolestné provádění operačních zásahů, nutných k provedení příslušných fyziologických experimentů. Existuje řada způsobů jak navodit celkovou anestézii pokusných zvířat, ale pro naše účely je nejvhodnější aplikace vhodného anestetika do břišní dutiny (intraperitoneální injekce), odkud se daná látka rychle vstřebává do krve a je transportována na místo svého účinku – do CNS. Z legálních důvodů budeme požívat THIOPENTAL, derivát barbiturové kyseliny, který ve vhodné dávce vyvolá rychle celkovou anestézii potkana, dostatečně hlubokou a dlouhou pro pokusy, které budeme provádět. Analgetické účinky barbiturátů nejsou sice výrazné, ale celkové anestézie je dosaženo celkovým útlumem (sedací) CNS, takže bolestivé vjemy z periferie nedocházejí vědomí. Jistou nevýhodou je určité přetrvávání reflexních pohybů při nižší dávce a útlum dechového centra v prodloužené míše při vyšší dávce thiopentalu. Thiopental (sterilně balený v uzavřených lahvičkách v množství 500 mg) se těsně před použitím rozpustí ve 20 ml vody pro injekce (sterilní a apyrogenní), takže jeho koncentrace bude 25 mg/ml. Na celkovou anestézii potkana je vhodná dávka 50 mg/kg hmotnosti zvířete (tzn. na 100 g hmotnosti zvířete se aplikuje 0,2 ml roztoku thiopentalu). Podle předem zjištěné hmotnosti potkana si do injekční stříkačky připravíme přesně odměřené množství thiopentalu (vyzkoušíme průchodnost injekční jehly, vypudíme bublinky vzduchu). Potkana uchopíme do levé ruky (pokud budeme ovládat injekční stříkačku pravou rukou) a zadníma nohama jej přitiskneme ke svému levému boku. Tak zvíře fixujeme a vypneme jeho břišní stěnu. V dolní polovině břicha energickým pohybem vbodneme (pokud možno kolmo) injekční jehlu stříkačky s thiopentalem do břišní dutiny (jehla musí proniknout vrstvou kůže i svaloviny). Pak jehlu trochu povytáhneme (prevence proti aplikaci do střeva), stříkačku mírně skloníme a pomaleji zase zasuneme hlouběji do břicha; pak aplikujeme celou odměřenou dávku narkotika. Po vytažení jehly zvíře odložíme do transportní klece a počkáme 10 až 15 min do rozvoje celkové narkózy. Ta je charakterizována ztrátou svalového tonusu (zvíře se převalí na bok) a vědomí, zeslabením reflexních reakcí na mechanické podráždění kůže a jejich případným vymizením (také např. zeslabením až vymizením rohovkového reflexu – zvíře nemrká, dotkneme-li se chomáčkem vaty jeho rohovky). Dech je mělký, ale pravidelný a pravidelná je i srdeční činnost. V pracovní skupině je možno provést intraperitoneální injekci narkotika tak, že operatér uchopí potkana klasickým způsobem kolem hrudníku a asistující spolupracovník podrží zvířeti zadní nohy. Tak vypnou zvířeti břišní stěnu, do které operatér provede aplikaci narkotika podobně, jak je výše popsáno. Doporučuje se sklonit zvíře hlavou dolů, aby obsah břišní dutiny „sklouzl“ směrem k hlavě a tak se snížilo nebezpečí nabodnutí střev. Vpich se provádí ve spodní třetině břicha, těsně vlevo vedle střední linie, opět kolmo na rovinu břišní stěny. Při vpichu narkotika do střeva se zásadním způsobem zpomalí jeho vstřebávání do krve a důsledkem je jeho nedostatečná koncentrace v místě působení – mozku a tudíž nedokonalá anestézie. To může vážně narušit provádění dalších zásahů. Pro zachování dostatečného citu (motorické kontroly pohybu stříkačky s jehlou vůči objektu – pokusnému zvířeti) při injekci do břišní dutiny je proto bezpodmínečně nutné, aby vpich prováděl ten, kdo zvíře drží za hruď a aby asistující v žádném případě nepustil zadní končetiny dříve, než bude injekce dokončena. Trvá-li pokus s anestetizovaným zvířetem déle, je možné aplikovat pro prohloubení narkózy opět intraperitoneálně ještě čtvrtinu až polovinu původní dávky anestetika. Za kontrolu dostatečné hloubky narkózy během operace je zodpovědný asistent operatéra a je samozřejmý etický požadavek, že zvíře nesmí při pokusných zásazích pociťovat bolest. Pro delší práci je také třeba dbát na to, aby zvíře neprochladlo, protože celková anestézie naruší regulaci tělní teploty. K tomu účelu se často používá vyhřívací operační stolek nebo podložka.
3
4. Kanylace krčních cév Při déletrvajících pokusech v narkóze bývá často příčinou nezdaru selhání dýchání. Pro snadnou resuscitaci je výhodné kanylovat před započetím pokusu tracheu vhodně silnou trubičkou, která umožní odsávání sekretů z dýchacích cest. Pro odběr větších objemů krve (nebo opakované odběry) je výhodné kanylovat arterii carotis umělohmotnou kanylou, stejně tak např. pro měření velikosti arteriálního tlaku přímým způsobem. Kanylace veny jugularis se zase používá pro intravenózní injekce nebo je případně možné touto cestou zasunout kanylu až do pravé srdeční komory pro odběry venózní krve (třeba při zjišťování minutového výdeje srdečního Fickovým principem). Tyto operační zásahy na laboratorním potkanovi jsou velmi často používány, a proto jejich zvládnutí představuje nezbytný úvodní krok pro studenty, kteří se chtějí zabývat fyziologii živočichů. V akutním pokuse trvajícím desítky minut nehrozí nebezpečí mikrobiální infekce, proto v našich podmínkách nemusíme dodržovat přísné zásady sterilní práce. Chronické kanylace cév a operace vyžadující sterilní práci přesahují rámec tohoto praktika a nebudeme se jimi zabývat. Po skončení pokusu je ovšem nutné zvíře usmrtit, aby nedošlo k zbytečnému vystavení bolesti při odeznění narkotického účinku. Podle legálních předpisů je nejlepší prohloubit anestézii, proto zvýšíme dávku thiopentalu (je možná i aplikace do cévy prostřednictvím kanyly) a pak zvíře vhodným způsobem usmrtit. Samotné předávkování narkotikem není doporučeníhodný způsob usmrcení; lepší je (i z důvodů jeho definitivního ověření) porušit nějaký pro život nepostradatelný orgán (krční míchu, mozek, bránici nebo srdce). Před likvidací karkasu se má podle legálních norem vyčkat, dokud se nedostaví posmrtná ztuhlost. Nutné vybavení: chirurgické nůžky, oční nůžky, anatomická pinzeta, oční pinzeta, pean, jehelec s chirurgickou šicí jehlou, jemná cévní svorka, chirurgický šicí materiál, injekční stříkačky a jehly vhodného objemu a průměru, protisrážlivý roztok (nejlépe heparin), fyziologický roztok, umělohmotné kanyly správného průměru, ajatin tinktura nebo jiný povrchový desinfekční roztok. Postup práce: a) trachea V celkové anestézii upevníme potkana v poloze na zádech a kůži na krku ve střední čáře potřeme ajatin tinkturou. Ta odstraní nečistoty ze srsti a desinfikuje povrch kůže; zároveň slepí chloupky srsti, takže se snáze odstraňují z operačního pole a není třeba kůži před zákrokem srsti zbavovat. Kůži na krku nazdvihneme a chirurgickými nůžkami jedním střihem podélně rozstřihneme (od brady ke sternu). Při tomto jediném střihnutí se zpravidla nepoškodí cévy, takže krvácení v ráně je minimální. Další střih do hloubky by vedl k poškození krevních kapilár a difusnímu krvácení do operační rány, které by znepřehledňovalo operaci. Proto se dál postupuje tzv. tupou preparací, kdy se pomocí dvou pinzet od sebe oddělují vrstvy pojiva, slinné žlázy a lymfatické uzliny směrem do stran a postupuje se směrem do hloubky až se odkryje svalová vrstva. Podélně mediálně uložený sval – musculus sternohyoideus – kryje shora tracheu. Sval podélně rozdělíme, tracheu jemně podebereme pinzetou a v krátkém úseku uvolníme od ostatních tkání. Nesmíme při tom vytvořit ostrý zlom nebo ji rozdrtit. Pak pomocí pinzety podvlékneme chirurgickou nit a připravíme smyčku na upevnění kanyly. Kouskem buničité vaty osušíme okolní tkáně a tracheu nastřihneme nůžkami. Do otvoru vsuneme kanylu kaudálním směrem a fixujeme ji připravenou smyčkou (nit musí být silnější
4
a hodně zatažená, aby případnou mezerou nevdechl potkan exudát z operační rány). Kanyla musí vyčnívat nad okraj rány, aby po jejím zašití nedošlo k omezení ventilace. V případě nutnosti (při nahromadění sekretů v dýchacích cestách) je možné tenkou kanylou nasunutou na injekční stříkačku odsávat hleny a zprůchodnit dýchací cesty. b) artérie carotis Kanyly pro a. carotis a v. jugularis jsou polyetylenové nebo polypropylenové trubičky vhodného průřezu naplněné protisrážlivým roztokem, na jednom konci uzavřené snímatelným uzávěrem. Před pokusem si kanyly naplňte a uzavřete tak, aby neobsahovaly bubliny vzduchu (zvlášť důležité u venózní kanyly – nebezpečí plynové embólie). A. carotis je uložena hlouběji podél mezi svaly m. sternohyoideus a omohyoideus pod svalem m. sternomastoideus. Ve svém průběhu je provázena svazkem nervových vláken vagu a krčního sympatiku, které se jeví jako bílé provazce (vagus je silnější). Po oddělení m. sternohyoideus a omohyoideus spatříme v hloubce tepající karotidu. Oční pinzetou podebereme celý cévněnervový svazek a vyzdvihneme jej k povrchu. S pomocí další pinzety opatrně odpreparujeme nervy, aniž bychom je poškodili, a cévu osvobodíme i ze zbytků okolní vazivové tkáně. Tím karotida velmi naběhne a dá se uvolnit podélně v dostatečně dlouhém úseku pro kanylaci. Pomocí pinzety podvlékneme dva podvazy, připravíme smyčky a jednu těsně zatáhneme co možná nejblíže k hlavě a zajistíme uzlem. Na druhou stranu (směrem k srdci) uvolněné cévy položíme jemnou cévní svorku, abychom zamezili krvácení po rozstřižení. Jemnými nůžkami nastřihneme opatrně stěnu cévy a do vzniklého otvoru zasuneme kanylu směrem k srdci (obr. č. 3.) Asistent operatéra pak uvolní cévní svorku, kanylu zasuneme asi 2 – 3 cm hluboko a pevně ji fixujeme připravenou smyčkou. Je dobré přesvědčit se, zda byla kanylace úspěšná. Peanem s ochrannou bužírkou stiskneme kanylu, sejmeme zátku na konci a opatrně uvolňujeme stisk peanu. V případě úspěšné kanylace se kanyla okamžitě plní arteriální krví. Nasadíme stříkačku s protisrážlivým roztokem, krev z kanyly vytlačíme zpátky a kanylu opět uzavřeme. c) vena jugularis V. jugularis je umístěna laterálněji a povrchově. Hustota nervových zakončení v tkáni je veliká, a proto při uvolňování z okolní tkáně se často objevují reflexní pohyby přesto, ze anestézie je dostatečná. Stěny žil jsou jemnější a méně odolné proti mechanickému namáhání, je proto třeba šetrnější manipulace než v případě kanylace karotidy. Někdy se céva v průřezu zatáhne a pak se dá jen těžce nakanylovat. Pro intravenózní injekci se kanyluje podobně jako a. carotis, pro odběr venózní krve je třeba zasunout kanylu až do pravé srdeční komory, nebo nakanylovat cévu opačným směrem – tedy k hlavě. Při zasunování kanyly je nutno postupovat velmi obezřetně, aby její konec neprorazil stěnu žíly. V případě kanylace pro odběr venózní krve se o správně provedené kanylaci přesvědčíme podobně jako při kanylaci artérie, v případě kanylace pro i.v. injekci injikujeme pokusně malý objem protisrážlivého roztoku a pozorujeme, zda injekce neklade odpor a zda se netvoří edém ve stěně žíly. Pozor na injekci vzduchových bublin – nebezpečí embólie. 5. Odběr nesrážlivé arteriální a venózní krve z cévní kanyly Dobře těsnící tuberkulinovou stříkačku s jehlou vhodného průměru propláchneme nebo naplníme protisrážlivým roztokem. Použijeme-li Heparin-Spofa, zředíme originální roztok z ampule (2 ml) fyziologickým roztokem do konečného objemu 10 ml (konečná
5
koncentrace 1000 mezinárodních jednotek/ml). Pro zamezení srážení krve stačí injekční stříkačku tímto roztokem pouze propláchnout (nabraná krev se téměř vůbec neředí). Použijeme-li jako protisrážlivý roztok 3,8% citronan sodný, mísíme jej s krví v poměru 1 : 4 (1 díl citronanu, 4 díly krve). Do stříkačky si tedy předem nasajeme 1/5 objemu protisrážlivého roztoku a zbytek (4/5 objemu) doplníme krví. Při kvantitativním stanovení látek v krvi pak musíme počítat s patřičným zředěním! Příslušnou arteriální nebo venózní kanylu stiskneme peanem s ochrannou bužírkou, odzátkujeme ji a po uvolnění peanu necháme odtéci z kanyly roztok s malou částí krve. Pak nasadíme připravenou injekční stříkačku, uvolníme pean a pomalu nasáváme krev, aby nepěnila. Po odběru vhodného množství stiskneme pean, injekční stříkačku sejmeme a nasadíme stříkačku s protisrážlivým roztokem. Krev z kanyly vytlačíme zpět (nesmíme injikovat bublinu vzduchu) a kanylu opět zazátkujeme. Při odběru pro stanovení krevních plynů stříkačku s krví ihned těsně uzavřeme připraveným uzávěrem a neprovádíme-li stanovení ihned, uložíme ji do chladu. Obr. 1: Uchopení laboratorního potkana pro i.p. injekci.
6
Obr. 2: Provedení intraperitoneální aplikace narkotika.
7
Obr. 3: Kanylace artérie carotis.
8
STANOVENÍ OBJEMU KRVE DILUČNÍ TECHNIKOU Jako příklad měření velikosti jednoho z oddílů extracelulární tekutiny si provedeme stanovení objemu krve, respektive její tekuté části - krevní plasmy, zřeďovací technikou. Princip měření diluční technikou je v tom, že známé množství látky se rovnoměrně rozptýlí v celém objemu rozpouštědla a změříme-li pak výslednou koncentraci, můžeme spočítat neznámý objem. Pro látky, které se používají k tomuto účelu platí určitá omezeni - např. v případě měření objemu plasmy nemá látka procházet stěnami cév, nemá být v daném časovém intervalu prakticky vylučována ani metabolizována a má být neškodná. V našem praktiku používáme k tomu kongočerveně, jejíž známé množství se intravenózně aplikuje a změří se pak její koncentrace v plasmě. Z objemu plasmy se spočítá celkový objem krve, známe-li hematokrit. Hematokrit je číslo, která udává objemové procento krvinek v krvi a měří se klinicky v přesně kalibrovaných hematokritových zkumavkách, v nichž se nesrážlivá krev definovanou dobu centrifuguje. Výška sedimentovaného sloupce krvinek se vyjádří v procentech celého sloupce krve - jako hematokrit. My použijeme méně přesnou, ale rychlejší mikrometodu. Nesrážlivá krev se vpraví do skleněné kapiláry, která se na jednom konci opatrně zataví, aby se krev nesrazila. Kapilára se odstřeďuje 4 min v mikrohematokritové centrifuze a výška sloupce krvinek se vyjádří v procentech celkové výšky krve v kapiláře po změření měřítkem. U člověka se hodnota hematokritu pohybuje kolem 45 % a mění se za některých patologických stavů. Postup: Narkotizovanému potkanovi s nakanylovanou artérií carotis odebereme cca 0,7 ml arteriální krve do injekční stříkačky propláchnuté heparinem (zabrání vysrážení krve). Přibližně 70 µl se použije na stanovení hematokritu, zbytek se vpraví do malé plastikové zkumavky (Eppendorf), odstředí při 5 – 10 tisících otáčkách/min po dobu 5 minut a čistá krevní plasma (budeme ji označovat v dalším textu ČP) se přepipetuje do čisté zkumavky. Mezitím, ihned po odběru krve, se prostřednictvím arteriální kanyly aplikuje 0,5 ml 0,2% roztoku kongočerveně. Dávka musí být naprosto přesně odměřená (použijte 1 ml tuberkulinovou stříkačku s kovovou jehlou č. 6, která má tupé zakončení a dokonale těsní v arteriální kanyle a pečlivě odstraňte bublinky). Část roztoku kongočerveně, která zůstane v kanyle, je třeba vpravit do oběhu promytím kanyly malým množstvím fyziologického roztoku (cca 0,2 ml). Po dvou až třech minutách, kdy dojde k dokonalému promíchání kongočerveně s krví, se odebere další vzorek krve (cca 0,5 ml), odstředí se a zbarvená plasma (tu budeme značit ZP) obsahující zředěnou kongočerveň se přepipetuje do další čisté zkumavky. Zkumavky je samozřejmě nutno předem označit, aby nedošlo k záměně vzorků. Po druhém odběru, který se ukončí opětovným promytím arteriální kanyly fyziologickým roztokem a uzavřením kanyly zátkou, je část experimentu na zvířeti ukončena. Aplikujte další dávku thiopentalu na prohloubení narkózy a prostřižením bránice zvíře usmrťte. Po ověření exitu je možné vyjmout kanyly a karkas odložit do mrazícího boxu. Po skončení této části experimentu se provede stanovení koncentrace kongočerveně v krevní plasmě.
9
Stanovení koncentrace kongočerveně v krevní plasmě: fotometrické stanovení při vlnové délce 510 nm. Připravíme tři konečné vzorky, které budeme označovat blank (B), vzorek zbarvené plasmy (V) a standard kongočerveně (S), následujícím způsobem: B 0,1 ml ČP + 1,9 ml H2O V 0,1 ml ZP + 1,9 ml H2O S 0,1 ml ČP + 0,1 ml standardního roztoku kongočerveně + 1,8 ml H2O. Standardní roztok kongočerveně se připraví tak, že 2,5 ml 0,2% kongočerveně se doplní do objemu 100 ml destilovanou vodou. Jeho koncentrace tedy je 5.10-3 %, čili cs = 50 µg/ml. Na spektrofotometru změříme absorbanci blanku, vzorku a standardu, a protože konečné zředění plasmy i standardu v kyvetě je stejné, je výpočet jednoduchý: cp = cs (AV – AB)/(AS – AB) kde cs je koncentrace standardu, cp je koncentrace kongočerveně v krevní plasmě, AV, AS, AB jsou absorbance vzorku, standardu a blanku. Injikované množství (Mi) je rovno součinu podávané koncentrace (ci = 0,2 %, tj. 2.103 µg/ml) a objemu (Vi = 0,5 ml): Mi = ci Vi Množství přítomné v krvi, resp. v její tekuté části – krevní plasmě (Mp) je stejně velké (látka za tak krátkou dobu nepodlehne významnému vylučování nebo metabolické přeměně) Mi = M p a je také rovno součinu koncentrace látky v plasmě (cp) a objemu plasmy (Vp): Mp = cp Vp Z fotometricky stanovené výsledné koncentrace kongočerveně v krevní plasmě a ze známých údajů můžeme lehce spočítat objem krevní plasmy a celkový objem krve. ci Vi = cp Vp Vp = ci Vi / cp Hematokrit (H) je definován takto:
H = 100 Vk/(Vp + Vk)
kdeVk je objem krvinek a celkový objem krve (Vkrve) je součtem Vp + Vk. Vk můžeme tedy vyjádřit jako rozdíl celkového objemu krve a plasmy (Vk = Vkrve - Vp). Z toho plyne po dosazení a úpravě jednoduchý vztah: Vkrve = 100 Vp/(100 – H) Zjistěte objem krve potkana v ml a vyjádřete jej v procentech celkové hmotnosti zvířete (při zjednodušujícím předpokladu, že hustota krve je 1 g na 1 ml).
10
KALORIGENNÍ ÚČINEK NORADRENALINU U POTKANA U některých menších savců dochází chladovou aklimací k vývinu specifického mechanismu produkce tepla, který se označuje jako netřesová termogeneze, protože i v situaci kdy je zabráněno (např. farmakologicky) aktivaci svalových stahů, mohou tato zvířata zvyšovat svou produkci tepla. Významně se při tom uplatňuje hnědá tuková tkáň, ale také kosterní svalovina. Netřesová termogeneze (NST) je v organismu aktivována katecholaminy. Fyziologickým „mediátorem“ NST je především noradrenalin uvolňovaný z nervových zakončení postgangliových sympatických vláken. Proto se v souvislosti s tímto dějem také často mluví o „kalorigenním účinku“ noradrenalinu. Také jiný katecholamin - adrenalin - má kalorigenní účinek, ale na rozdíl od netřesové termogeneze indukovatelné chladovou adaptací, která je především spouštěna noradrenalinem, se tento jev vyskytuje i u živočichů, kteří nejsou adaptovaní na chlad a dokonce i u nižších obratlovců. Přítomnost hnědé tukové tkáně tedy není podmínkou kalorigenního účinku adrenalinu. Místem kde dochází k produkci tepla, jsou zejména srdce, kosterní svaly a viscerální orgány. Rovněž v tomto případě není zdrojem produkce tepla svalový třes. Kalorigenní účinek adrenalinu se prokáže i u větších savců včetně člověka, ale jeho fyziologický význam není zcela jednoznačný. Kromě obrany organismu proti chladu (zejména při akutní exposici chladovému podnětu) se zřejmě uplatňuje i při udržování energetické bilance organismu a řízení tělesné hmotnosti. Zvýšená produkce tepla stimulovaná adrenalinem vede k větší spotřebě substrátů a tak může vyrovnávat nadměrný příjem potravy a omezovat vznik obezity. V praktické úloze prokažte kalorigenní účinek noradrenalinu u potkana aklimovaného na nízkou teplotu okolí. Chladově aklimovaného potkana (chovaného při teplotě okolí pod 10 °C) anestetizujte thiopentalem (i.p. dávka 50 mg kg-1). V celkové anestézii nakanylujte pravou venu jugularis a abyste předešli problémům s dýcháním, proveďte tracheotomii a zaveďte rovněž tracheální kanylu. Ta bude vyúsťovat asi 2 cm nad operační ránu, kterou zašijete. Potkana umístěte do vyhřívané metabolické komory, aby nepodchládal. Připravte si infuzní roztok noradrenalinu v 5 % glukóze, aby jeho koncentrace byla 20 µg ml-1 na 100 g tělesné hmotnosti potkana (tedy např. při hmotnosti 400 g to bude 4x více, tj. 80 µg ml-1). Katecholaminy jsou na světle nestálé, proto se vyhýbáme přímému intenzivnímu osvětlení infuzního roztoku. Zásobní roztok noradrenalinu Spofa obsahuje 1 mg noradrenalinu v 1 ml. Infuzní roztok nasajte do 5 ml infuzní stříkačky, nasaďte na infuzní pumpu a kanylou spojte s jugulární kanylou potkana. Nepatrná bublinka vzduchu, kterou záměrně ponecháte v kanyle, vám umožní visuálně se přesvědčit po spuštění infuze, že infuzní roztok skutečně proudí. Před vlastní infuzí noradrenalinu spojte zvíře prostřednictvím masky s analyzátorem kyslíku Spirolyt a po dobu 10 až 20 min měřte celkovou spotřebu kyslíku. Teprve pak zahájíte infuzi noradrenalinu rychlostí 7,5 µl min-1 (tj. v dávce 1,5 µg min-1 kg-1); na infuzní pumpě zvolte rychlost 1. Když spotřeba kyslíku dosáhne ustáleného stavu, zvýšíte infuzní rychlost na 10 µl min-1 (rychlost 2). Po ustálení spotřeby kyslíku na vyšší hladině znovu zvyšte infuzní rychlost (a tedy i dávku) na 20 µl min-1 (rychlost 4). Vyšší infuzní dávky noradrenalinu tedy dosahujeme zvýšením infuzní rychlosti, i když správnější by bylo používat konstantní infuzní rychlost a měnit koncentraci použitého roztoku noradrenalinu. Na demonstraci kalorigenního účinku noradrenalinu se s tímto jednodušším experimentálním uspořádáním spokojíme.
11
Po dosažení ustálené spotřeby kyslíku při této nejvyšší použité dávce noradrenalinu infuzi ukončete a pokračujte v měření spotřeby kyslíku, dokud opět neklesne na klidovou úroveň. Po skončení pokusu potkana usmrťte (po předchozím prohloubení celkové anestézie) prostřižením bránice. Vyhodnoťte záznam celkové spotřeby kyslíku a vyneste do grafu její závislost na dávce noradrenalinu (event. infuzní rychlosti). Mimoto vyjádřete maximální dosažený kalorigenní účinek noradrenalinu v absolutních jednotkách (např. ml O2 g-1 h-1) i jako relativní převýšení nad klidovou úroveň v procentech. V kontrolním pokuse použijete potkana chovaného ve vyšší okolní teplotě (cca 20 °C). Při zachování stejného časového schematu infuzních rychlostí se přesvědčete, zda dochází ke zvyšování celkové spotřeby kyslíku i v tomto případě. Doložte grafem.
12
OVLÁDÁNÍ KONCENTRACE GLUKÓZY V KRVI U zdravého člověka je ranní koncentrace glukózy 80-100 mg ve 100 ml krve. Zvýšení této koncentrace (hyperglykemie) nad 180 mg ve 100 ml, stejně jako snížení (hypoglykemie) pod 75 mg ve 100 ml je nefyziologické a větší hodnoty obou odchylek vedou ke smrti. Z hlediska teorie regulace se jedná o regulaci na konstantní hodnotu. Taková regulace se realizuje v regulačním obvodě, který se skládá ze soustavy, regulátoru a jejich zpětnovazebného propojení. Je možno exaktně popsat činnost soustavy a regulátoru a řešit tak konkrétní úlohy regulace (např. jaké jsou nároky na regulátor při změně koncentrace glukózy po požití sacharidů, při svalové práci apod.). Protože relativně konstantní hladina glukózy v krvi je životně důležitou podmínkou homeostáze, existuje v organismu složitý regulátor pracující řadou fyziologických mechanismů ovládání koncentrace glukózy v krvi. Koncentrace je zvyšována hormony: adrenalinem, glukagonem, hormony hypofýzy – souborně označovanými jako adenohypofyzární diabetogenní faktory a glukokortikoidy kůry nadledvin; snižována je inzulínem. V praktiku budeme „charakterizovat soustavu“ testem tolerance glukózy. 1. Tolerance glukózy Schopnost organismu zpracovat podanou dávku glukózy se nazývá tolerancí glukózy. Test tolerance glukózy (glykemická křivka) je klinicky používán k diagnostice některých nemocí jako diabetes, renální glykosurie apod. Klinicky se podává po celonočním lačnění 50 g glukózy per os. Vzorky venózní či kapilární krve se odebírají před požitím glukózy a potom v půlhodinových intervalech a v každém se stanoví koncentrace glukózy. Tak se získá glykemická křivka. V praktiku provedeme tento test na laboratorním potkanovi v celkové anestézii v poněkud modifikované verzi s ohledem na odlišnou velikost organismu. Postup: Uspořádání pokusu. Budeme pracovat na narkotizovaném bílém potkanu s nakanylovanou karotidou kanylou PP 50. Stanovíme koncentraci glukózy v arteriální krvi živočicha před pokusem. Podáme glukózu v dávce 50 mg na 100 g živé hmotnosti do a. carotis. 30 sekund po podání stanovíme koncentraci glukózy. Okamžik počátku odběru je pro nás počátek pokusu, tj. nultá minuta. Dále odebíráme krev ke stanovení glukózy v 5 časových okamžicích: v 5., 10., 15., 20., 30. minutě pokusu. Vzorky krve (přibližně 120 – 150 µl ) necháme po uplynutí příslušné doby odkápnout z konce kanyly do testovací destičky s důlky, které byly předem vypláchnuty heparinem a usušeny. Z nich pak příslušný objem krve odpipetujeme přímo do předem připravených centrifugačních zkumavek s 50 µl izotonického roztoku NaCl. Tímto způsobem provedeme celkem sedm časových odběrů. Pro stanovení glukózy je zapotřebí 50 µl krve. V každém časovém okamžiku odebíráme paralelně dva vzorky, tj. dvakrát 50 µl krve. K sestrojení glykemické křivky budeme tedy mít celkem dvakrát šest vzorků plus dva kontrolní před pokusem, tj. celkem 14 stanovení. Proměřte a analyzujte průběh glykemické křivky v krvi potkana po glukózové zátěži 500 mg kg-1. Stanovení glukózy proveďte pomocí diagnostického testu na glukózu GLU GOD 250.
13
Princip stanovení glukózy: glukózaoxidáza glukóza + H2O + O2 ───────────────> glukonová kyselina + H2O2 peroxidáza H2O2 + 4-aminoantipyrin + p-hydroxybenzen sulfonát ──────────────> ────────────> chinonimin (barvivo) + H2O Absorpční maximum je při vlnové délce 498 nm, reakce probíhá při pH 8. Na stanovení se používá krevní plasma nebo sérum. Postup stanovení: Vzorky krve o objemu 50 µl převedeme do zkumavek s 50 µl izotonického roztoku NaCl, promícháme a odstředíme. Na stanovení glukózy odpipetujeme 20 µl supernatantu a přidáme k němu 2 ml reagenčního roztoku. Po promíchání inkubujeme 30 min v laboratorní teplotě; inkubační roztok musí být chráněn před přímým světlem. Do 40 min po skončení inkubace změříme absorbanci na spektrofotometru při 498 nm proti destilované vodě. Současně proměříme slepé stanovení (blank), při němž místo plasmy použijeme izotonický roztok NaCl. Proměřte rovněž kalibrační křivku glukózy v rozmezí 0 až 40 mmol l-1. Protože intenzita zabarvení se mění s časem, je důležité dodržet dobu od smíchání vzorku s reagenčním roztokem do jeho změření. Naplánujte si proto vhodně časovou posloupnost přípravy všech vzorků. Dlouhé stání krve má za následek pokles koncentrace glukózy, neboť ta je metabolizována erytrocyty. Je proto třeba krev co nejrychleji odstředit a plasmu přepipetovat do připravených zkumavek. Z toho důvodu je také vhodnější přidávat reagenční roztok k biologickému vzorku dodatečně. Reagenční směs míchejte šetrně, aby roztok nepěnil. Koncentraci glukózy po odečtení absorbance blanku určíte z kalibrační křivky; vyjádřete ji v mmol l-1 celé krve. Při konečném hodnocení nezapomeňte, že krev jste zředili. Schéma postupu: 50 µl krve + 50 µl NaCl, promíchat, odstředit 20 µl supernatantu + 2 ml reagenčního roztoku, jemně promíchat inkubovat 30 min při pokojové teplotě chráněné před světlem změřit absorbanci při vlnové délce 498 nm v 1 cm kyvetě V blanku nahradit supernatant roztokem NaCl, pro kalibrační křivku použijte roztoky glukózy o koncentraci 5, 10, 15, 20, 30 a 40 mM. Zásobní vodný roztok glukózy o koncentraci 40 mM na přípravu kalibrační křivky připravíte kvantitativním rozpuštěním 0,72 g glukózy (nebo 0,793 g monohydrátu glukózy) v 100 ml odměrné baňce. Alternativní možnost je použít roztok glukózy na infuzi po vhodném naředění. Hodnocení pokusu. Nedílnou součástí experimentální práce je hodnocení pokusu a správná interpretace získaných výsledků. Odhadněte nejprve koncentraci glukózy v nulté minutě pokusu po podání zátěžové dávky za předpokladu, že by glukóza z krve neunikala. Porovnejte předpoklad se získanými experimentálními hodnotami pro t = 0. Prvním výsledkem práce je
14
tedy závěr, že glukóza z krve uniká. Uvažujme jaké jsou hlavní cesty úniku glukózy z krve a dále se pokusme vyjádřit velikost tohoto experimentálně potvrzeného úbytku. Z teorie znáte, že glukóza je vychytávána játry, kde podléhá enzymatickým reakcím, difunduje do extravazálních a dále tělních tekutin, případně by mohla být vylučována do moče. Do jaké míry je potom oprávněná představa, že úbytek glukózy v krvi je v každém čase úměrný momentální koncentraci? Matematickým vyjádřením tohoto předpokladu je diferenciální rovnice: (d ct) / (d t) = - k ct
(1)
kde ct je koncentrace v čase t a k je rychlostní konstanta s řešením ct = co e – k
t
(2)
kde co je koncentrace na počátku pokusu pro t = 0. Do protokolu zakreslete v lineárních souřadnicích glykemickou křivku, tj. koncentraci glukózy jako funkci času a výsledek srovnejte s předpokladem, s rovnicí (2). Takto jsme získali názor, pouhou představu jak asi vypadá v čase – studovaný děj. K popisu děje je třeba znát kromě počáteční koncentrace i velikost rychlostní konstanty, kterou získáte provedením grafické analýzy glykemické křivky. Grafická analýza vychází ze skutečnosti, že rovnice (1) je matematicky vzato lineárním operátorem, z jehož základní vlastnosti vyplývá možnost sčítání více exponenciálních funkcí. Rovnici (2) je možno tedy chápat takto: ct = Σ coi e -ki t
(i = 1,2,....,n)
(3)
Jestliže experimentální data vyneseme jako jejich logaritmy proti času nebo přímo vyneseme experimentální data na semilogaritmický papír, dostaneme v případě, že rovnice (2) je jedna exponenciální křivka – přímku. Tato přímka nám vytkne na logaritmické ose y počáteční koncentraci co. Rychlostní konstantu určíme jako směrnici příslušné přímky (resp. její absolutní hodnotu; k se chápe jako kladné číslo, proto je na pravé straně rovnice (1) záporné znaménko). Lze ji spočítat regresní analýzou závislosti logaritmu koncentrace na čase nebo určit z grafického výnosu jako hodnotu tangenty úhlu příslušné regresní přímky s osou x. V případě, že v semilogaritmickém vyjádření nezískáte přímku, je nutno uvažovat rovnici (3). Pak postupujeme takto. Přímkou je možno proložit poslední body glykemické křivky. Průsečík s osou y (t = 0) udává con a kn počítáme ze sklonu přímky. V dalším kroku analýzy odečteme graficky výraz con e -knt od všech bodů, které neleží na přímce a výsledná křivka reprezentuje výraz c’t = Σ coi e -kit (i = 1,2,......,n-1) Opět proložíme přímku posledními body a postup se opakuje tak dlouho, dokud číselně neseparujeme všechny výrazy rovnice (3). Protože je známo, že hladina glukózy v krvi je regulována na konstantní úroveň, jednoduchá funkce typu rovnice (2) obyčejně neposkytne dostatečně přesný popis sledovaného děje. Je proto vhodné uvažovat rovnici (3), kde jeden z členů je konstanta (K), tzn. při t = ∞, kdy člen e-k t je roven nule, je dosažená koncentrace glukózy v krvi rovna této konstantě. Je pochopitelně nejjednodušší předpokládat, že konstanta K je rovna klidové 15
koncentraci glukózy v krvi před gukózovou zátěží. Jestliže tuto hodnotu odečteme od všech naměřených hodnot (od času 0 do času 30), získáme upravená data pro grafickou analýzu popsanou výše a tak můžeme zjistit parametry funkce popisující příslušnou glykemickou křivku ve formě: ct = K + Σ coi e-ki t
(i = 1,2,....,n).
Detailnější – modelový příklad postupu grafické analýzy je demonstrován na stránkách 17 – 20 a jeho prostudování vám usnadní vlastní provedení anylýzy glykemické křivky. Grafické zpracování analýzy naměřené toleranční křivky glukózy vlepte do protokolu. Slovně vyjádřený závěr této analýzy glykemické křivky je závěrem této úlohy. Obr. 1 Příklad grafické analýzy exponenciálního poklesu veličiny y v čase. Výsledná funkce má tvar: y = 0,60 e-0,7275t + 0,69 e-0,1305t + 1,35 e-0,0061t
16
MODELOVÝ PŘÍKLAD GRAFICKÉ ANALÝZY EXPONENCIÁLNÍHO POKLESU KONCENTRACE LÁTKY V KRVI
(analýza experimentálních dat podle dvoukompartmentového farmakokinetického modelu) Intravenózní jednorázovou injekcí bylo podáno 0,373 g fenylbutazonu. V krevní plazmě byla měřena jeho koncentrace v různých časech po aplikaci, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce (c1(t) znamená koncentraci fenylbutazonu v krevní plazmě, kterou považujeme za součást centrálního kompartmentu): čas [hod] c1(t) [mg/ml]
0,25 0,50 0,75
1,0
1,5
2
3
6
12
24
48
72
66,9 60,7 57,0 54,6 49,8 49,0 44,7 40,2 37,8 33,1 24,4 13,6
Vynesení závislosti ln (c1) vůči času ukazuje, že tato závislost není lineární, průběh koncentrace látky v závislosti na čase tedy neodpovídá jednokompartmentovému modelu (obr. P1). Provedeme analýzu získaných dat metodou "sloupnutí". Budeme předpokládat dvoukompartmentový model, popsaný následující rovnicí: c1(t ) = A exp(− α t ) + B exp(− β t )
.
Metodou sloupnutí (také metoda zbytků) chceme odhadnout koeficienty A a B a hybridní konstanty modelu α a ß; z nich pak určit farmakokinetické parametry
17
Obr. P1. Zjištění parametrů dvoukompartmentového modelu po jednorázové intravenózní injekci metodou "sloupnutí". A: závislost koncentrace fenylbutazonu [µg ml-1] v krevní plazmě na čase [h]; injikována byla dávka 0,373 g. B: totéž v semilogaritmickém vynesení (kroužky); osa y = ln(c1). Plná čára (podle rovnice (P2)) vytíná na ose y úsek o velikosti ln B; absolutní hodnota její směrnice odpovídá hybridní konstantě eliminační fáze ß (ln B = 3,84 → B = 46,75 µg ml-1; ß = 0,0160 h-1). Po "sloupnutí" eliminační fáze a zlogaritmování dostáváme hodnoty ln(c'(t)) (hvězdičky), jimiž proložíme druhou přímku (čárkovaná čára). Ta vytíná na ose y úsek ln A, absolutní hodnota její směrnice je rovna hybridní konstantě distribuční fáze α ; ln A = 3,17 → A = 23,88 µg ml-1; ß = 1,016 h-1).
nezávislé na typu dvoukompartmentového modelu (neboť nevíme, zda eliminace probíhá výlučně z centrálního nebo periferního kompartmentu, či z obou dvou). Uvedená rovnice nejde jednoduše analyticky řešit. Z obr. P1 se dá sestupná fáze koncentrační křivky (v semilogaritmickém vynesení) považovat zhruba za lineární od času 3 hod po injekci. Hybridní konstanta distribuční fáze α je větší než hybridní konstanta eliminační fáze ß; látka zprvu mizí z centrálního kompartmentu rychleji. Proto pro vysoké hodnoty času t, je hodnota výrazu exp(-α t) malá ve srovnání s výrazem exp(-ß t) a lze ji zanedbat. Budeme tedy nejprve předpokládat, že od tohoto času (3 hod) je eliminace látky 18
z centrálního kompartmentu určována především druhým členem na pravé straně výše uvedené rovnice, tedy že platí (pro t > 3 hod): c1(t ) = B exp(− β t )
(P1).
Tato rovnice je formálně shodná s rovnicí pro jednokompartmentový model (ct = c0 exp(-k t) a dovedeme ji snadno vyřešit. Zlogaritmováním dostaneme rovnici přímky (ve tvaru y = a + b t) : ln c1(t ) = ln B − β t
(P2);
platí přitom substituce y = ln c1(t), ln B = a, -ß = b. Koeficienty této přímky se získají regresní analýzou experimentálních dat v logaritmické transformaci (viz tabulka):
čas
3
ln c1(t)
6
12
24
48
72
3,80 3,69 3,63 3,50 3,19 2,61
Regresní analýza vede k následujícím hodnotám : ln B = 3,84; z toho B = 46,75 µg ml-1; ß = 0,0160 h-1. ß odpovídá absolutní hodnotě směrnice přímky (P2), ln B úseku, který tato přímka vytíná na ose y (obr. P1). V počáteční fázi křivky se současně uplatňují procesy distribuce i eliminace. Protože jsme již určili obě konstanty eliminační fáze křivky, můžeme snadno spočítat podíl eliminace na změnách koncentrace látky v centrálním kompartmentu na začátku časové křivky koncentrace (eliminační fázi odečteme - "sloupneme" od původní křivky). Výchozí rovnici upravíme následujícím způsobem : c1(t ) − B exp(− β t ) = A exp(− α t )
(P3).
Pro dosud neuvažované časy (t = <0,25; 2>) spočítáme hodnotu c'(t) podle levé strany rovnice (P3): c´(t ) = c1(t ) − B exp(− β t )
(P4).
19
Rovnici (P3) můžeme přepsat ve tvaru c´(t ) = A exp(− α t )
(P5).
zcela analogickém rovnici (P1) a řešíme ji stejným způsobem. Podle (P4) a následným zlogaritmováním spočítáme pro t = 0,25 až 2 hod:
čas [hod] c'(t) [mg/ml]
0,25
0,50
0,75
1,0
1,5
2
20,33
14,32
10,80
8,59
4,15
3,72
ln c'(t)
3,01
2,66
2,40
2,15
1,42
1,31
Stejným způsobem jako pro eliminační fázi křivky určíme koeficienty A a a regresní analýzou přímky ln c'(t) = ln A – α t. Výsledky jsou následující : ln A = 3,17 : A = 23,88 µg ml-1; α = 1,016 h -1 . Koncentrace fenylbutazonu v centrálním kompartmentu v libovolném čase t po jeho jednorázové intravenózní aplikaci v dávce 0,373 g je popsána rovnicí : c1(t ) = 23,9 . exp(− 1,016 . t ) + 46,8 . exp(− 0,016 . t ) .
Tímto způsobem určené hodnoty konstant A, B, α a ß jsou zatíženy jistou chybou, která má dvě hlavní příčiny: 1. zanedbáváme vliv procesů distribuce v pozdějším čase po podání látky; 2. logaritmická úprava odvozených rovnic poskytuje pomocné veličiny ln c(t) a ln c'(t) jejichž rozložení není normální (lineární regresní analýza předpokládá normalitu rozložení nezávisle i závisle proměnné veličiny). V praxi se proto tato čísla používají jako výchozí odhady parametrů v nelineární regresní analýze a počítačovým zpracováním se získají definitivní koeficienty, určující nejlepší proložení koncentrační křivky experimentálními body (ve smyslu nejmenšího součtu čtverců odchylek reálných a modelových dat).
20
SPALNÉ TEPLO POTRAVY Pro měřeni spalných tepel při konstantním objemu používáme kalorimetr se spalovací bombou. Popis přístroje: Hlavní část kalorimetru je tvořena postříbřenou kovovou nádobou. Aby výměna tepla z okolního prostředí byla co nejmenší, je tato část umístěna na podstavci v koncentrickém, vodou naplněném kovovém plášti. Před každým měřením je nádoba naplněna určitým množstvím vhodně teplé vody, do které je pak ponořena připravená spalovací bomba. Změny teploty při spalováni vzorku změříme na velmi přesném teploměru (stupnice dělená po 0,0l °C). Rovnoměrný převod tepla je zajišťován míchadlem. Stanovte vodní hodnotu kalorimetru pomocí spalného tepla kyseliny benzoové a změřte spalné teplo standardní krmné diety. Z hodnot klidové spotřeby kyslíku získaných měřením vybraných zvířat na příslušném zařízení (Spirolyt), vypočtěte (resp. odhadněte) denní teoretickou energetickou spotřebu a určete ekvivalentní dávku standardní potravy. Postup: Odvažte asi 1 g vzorku a v lisu, který tvoří příslušenství kalorimetru, jej upravte do tvaru tabletky, ve které je zalisován asi 10 cm dlouhý drátek. Při lisování je nutno dbát, aby zářezy, kterými vyčnívá drátek z formy se kryly, neboť jinak dojde k ustřižení drátku. Potom tabletku opět zvažte a odečtěte váhu drátku, čímž dostanete čistou navážku. Vrchní část spalovací bomby zavěste do speciálního stojanu, tabletku vložte do mističky zavěšené na tyčince umístěné ve víku bomby a vyčnívající drátky upevněte jednak k této tyčince, jednak k tyčince další, která dohromady tvoří kontakty pro přívod proudu. Přesvědčte se, zda se tyto kontakty navzájem nedotýkají, na dno bomby napipetujte 10 ml vody, lehce navlhčete gumový těsnící kroužek pod víkem a víko důkladně utáhněte maticovým uzávěrem. Potom nasaďte přívod z kyslíkové lahve k napouštěcímu ventilu bomby, otevřte výpustný ventil a ponechte nějakou dobu procházet mírný proud kyslíku, aby byl odstraněn přítomný vzduch. Výpustný ventil uzavřete a redukčním ventilem tlakové lahve zvyšte tlak na 3,0 MPa. Po úplném uzavření přívodu kyslíku z lahve opatrně odpojte kalorimetrickou bombu a napouštěcí ventil, který zabraňuje uniknutí st1ačeného kyslíku, uzavřete šroubem proti vniknutí vody. Spalovací bombu vložte nyní do vnitřní nádoby kalorimetru, která je naplněna
21
vodou tak, aby celá bomba kromě kontaktů a ventilů byla ponořena. Množství vody je při známé hodnotě vodní konstanty stálé (nádobu s vodou bez bomby před změřením zvažte). Teplotu vody nastavte tak, aby mírně převyšovala teplotu pláště a zároveň, aby dosahovala teploty 18 °C, což je spodní hranice stupnice používaného teploměru. Výhodnější je použiti Beckmanova teploměru. Připojte kabel pro přívod proudu z ovládací sekce, uzavřete víko a zapněte míchadlo. Vyčkejte ustálení teploty a po dobu asi 5 minut odečítejte teplotní údaje na teploměru v intervalu 20 sekund. Potom stisknutím tlačítka po dobu asi 5 sekund proveďte zapálení tablety, které je indikováno zhasnutím červeného kontrolního světla. Pokračujte v odečítání teploty až do jejího ustálení a pak ještě asi 5 minut. Po skončení měření nejdříve opatrně vypusťte stlačený plyn a teprve potom bombu otevřete a řádně vyčistěte! Výpočet. Výpočet vodní hodnoty kalorimetru (Ck) a spalného tepla neznámé látky (hSp) proveďte podle rovnice: g . hSp = Ck . T kde g = navážka, T = vzrůst teploty lázně. Spalné teplo kyseliny benzoové je 26 469,65 J/g. Jelikož se během měření část tepla vyměňuje s okolím je nutno provést na tuto výměnu korekci. V grafu vyneste závislost teploty na čase. Za předpokladu, že teplota vnitřku kalorimetru byla během měření vyšší než teplota pláště a děj byl exotermní, prodlužte lineární větve AC a BD a veďte přímku AB kolmo k časové ose tak, aby plochy ACE a BDE byly stejné (Obr. 4). V případě, že během pokusu teplotní křivka kalorimetru protne přímku teploty pláště, postupujte tak, že na počáteční lineární větvi, těsně před jejím koncem, zvolte bod A, veďte přímku AC kolmo k teplotní ose a bod B na sestupném rameni stanovte tak, aby plochy ACE a BDE byly opět stejné.
22
Obr. 4. Znázornění korekce na výměnu tepla s okolím při měření spalného tepla.
23
