záření)

27.9.2011

Genotoxicita - úvod • Genotoxicita: toxická látka ovlivňuje genetický materiál buňky (nukleové kyseliny) • Při působení vyšších koncentrací genotoxických látek dochází k přímému úhynu buněk • Nižší koncentrace způsobují poškození genetické informace • Důsledkem nemusí být smrt buňky či organismu, ale neletální genetické změny, jež jsou trvalého charakteru • Následně vznikají defektní buňky či mutanty organismů

Genotoxicita

Mgr. Klára A. Mocová, Ph.D. Ústav chemie ochrany prostředí

VŠCHT Praha

1

2

Mutageneneze: základní terminologie

Genotoxicita - rozdělení • Mutageneze – vznik chyby na DNA

mutagen (chemická látka / záření)

• Karcinogeneze – nádorové bujení – nekontrolované množení buněk (předchází chyby na DNA anebo napadení virem)

(proces) mutace (trvalá = dědičná změna v DNA)

• Teratogeneze – vznik vady na vyvíjejícím se plodu (mechanismus nejasný, předpoklad chyby na DNA)

Dělení mutací: genové, chromozomální, genomové 3

4

1

27.9.2011

Rekombinace, segregace - nástroje genetické variability

Meióza: rekombinace, segregace - nástroje genetické variability

5

Nejvýznamnější genotoxiny

Mutageny 1) Fyzikální – různé typy záření (UV, paprsky X …) 2) Chemické – látky alkylující, silně oxidující, deaminující, analogy dusíkatých bází …) Mechanismus účinku mutagenů: Tvorba nestandardních chemických vazeb polymerace DNA podle matrice

6

znemožnění

Nestandardní párování nukleotidů, změna nukleotidů v DNA sekvenci změna AMK sekvence proteinu Fragmentace DNA ztráta nebo přestavba částí chromosomů, změna intenzity proteosyntézy 7

 alkylsulfáty  N-nitrososloučeniny a halogennitrososloučeniny  estery kyseliny metansulfonové  yperit (sirný, dusíkatý)  aldehydy  epoxidy  halogenderiváty alifatických uhlovodíků  polycyklické aromatické uhlovodíky  substituované polycyklické aromatické uhlovodíky  aromatické a heterocyklické primární, sekundární a terciální aminy  azobarviva  akridinová barviva 8

2

27.9.2011

Struktura DNA

Genetický kód Kodón (triplet) = trojice sousedních nukleotidů Genetický kód je tripletový = 1 triplet nukleotidů kóduje

Komplementační pravidla:

1 aminokyselinu

Adenin – Thymin (AT páry) Guanin – Cytosin (GC páry)

3 stop kodóny

9

Adenin – Uracyl (na RNA)

10

Translace = překlad z RNA do proteinu

I. Mutace genové (bodové) 1) Záměnové a) samesense … beze změny AMK sekvence b) missense … vznik kodónu pro jinou AMK c) nonsense … vznik stop kodónu 2) Posunové – delece či inzerce NT (počet není násobkem 3 NT) Výsledkem je změna celého úseku genu od místa bodové mutace Často vznik stop kodónu uvnitř posunuté sekvence 11

Vysvětlivky: AMK…aminokyselina, NT…nukleotid

12

3

27.9.2011

I. Genové mutace

Tautomerismus bází

• Divoká alela (původní forma genu) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg cag act ctg gcc ggg gtg aac ctg...

Deaminací Cytosinu vzniká Uracyl

• Neutrální mutace (3. báze) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg caa act ctg gcc ggg gtg aac ctg... • Missense mutace M D D Q S M R L K T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg aag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... • Nonsense mutace M D D Q S M R L stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg tag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... • Posun čtecího rámce vedoucí k předčasné terminace proteosyntézy M D D Q S M R L R L W P G stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg aga ctc tgg ccg ggg tga acc tg...

Analogy dusíkatých bází: 5BrU = 5-bromuridin -keto…2H-vazby s Adeninem -enol…3H-vazby s Guaninem 2AP = 2-aminopurin -amino…2H-vazby s Thyminem -imino…3H-vazby s Cytosinem

13

Stavba eukaryotického chromosomu

14

II. Chromosomální aberace = strukturní změny chromosomů •Delece – ztráta úseku chromosomu •Inzerce – vložení úseku chromosomu •Duplikace – zdvojení úseku chromosomu •Inverze – převrácení úseku chromosomu •Translokace – přesun úseku chromosomu na nehomologní chromosom a) prostá – přesun pouze z jednoho na jiný chromosom b) reciproká – vzájemná výměna mezi dvěma chromosomy ; zvl. případ je Robertsonova translokace (=centrická fúze dvou akrocentrických chromosomů) 15

16

4

27.9.2011

II. Chromosomální aberace

Klastogeneze, Klastogeny • Klastogeny – látky způsobující zlomy na chromosomech (klastogenezi) • Klastogeny chemické – analogy bází (bromuracil) látky interkalační (akridin oranž), látky deaminující báze (HNO2) • Fyzikální (UV, X-paprsky…)

delece

inverze

akridin oranž

bromuracil

translokace

Cytogenetické vyšetření pacienta: šipkou vyznačeny některé aberace 17

18

III. Genomové mutace – početní změny chromosomů

III. Genomové mutace

Ploidie – počet chromosomových sad 1) Euploidie – změna počtu celých chromosomových sad: haploidie (1), diploidie (2), triploidie (3), tetraploidie (4) atd. 2) Aneuploidie – změna počtu jednotlivých chromosomů: nulisomie (0), monosomie (1) disomie (2, oba chromosomy však pocházejí od stejného rodiče = chyba !!!) trisomie (3), tetrasomie (4) atd. 19

Downův syndrom

Triploidie u člověka

47,XY+21

69,XXY

20

5

27.9.2011

III. Genomové mutace

Shrnutí klasifikace mutací

• Způsobeny nondisjunkcí (chybou) chromosomů při jaderném dělení • Příklady mutagenů: - kolchicin, oryzalin (vznik polyploidie), užívají se záměrně při šlechtění a při mikroskopickém pozorování chromosomů - koffein – u rostlin brání vzniku buněčné stěny při dělení buněk - uvedené látky působí na genetický materiál nepřímo – vazbou na cytoskeletární struktury (vlákna buněčné „kostry“), které mají funkci při dělení buňky (DNA i dalšího materiálu)

1) Mutace genové (bodové) – mění kvalitu genu a potažmo proteinu 2) Mutace chromosomální (chromosomální aberace) – přestavby chromosomů způsobují změnu genové exprese (intenzitu syntézy proteinů), v některých případech ztrátu či změnu genů 3) Mutace genomové – způsobují disbalanci genových produktů (proteinů), potíže s reprodukcí, sterilitu, smrt - u člověka jsou zpravidla letální (triploidie a tetraploidie v potratech), některé aneuploidie jsou životaschopné … Down, Turner …

21

- pro rostliny zpravidla nejsou genomové mutace letální, některé plodiny jsou šlechtěny na polyploidii (např. gigantické kedlubny, ovocné stromy, obiloviny)

22

Mutace – přítel nebo nepřítel ?

Mutageneze a reparace DNA - Neustále dochází ke změnám na DNA

- K opravě vzniklých chyb slouží různé reparační systémy - Pokud rychlost mutageneze (genové mutace) přesáhne kapacitu reparačních systémů, mutace se zakonzervují - Mutace v genech odpovědných za reparaci – těžké postižení - Např. onemocnění Xeroderma pigmentosum … postižení postrádají funkční opravný systém vůči následkům UV záření, silně pigmentovaná kůže (pihy), nemocní se nesmí vystavovat slunečnímu záření 23

Nepřítel: mutace způsobují méně či více závažné poškození organismu, znemožňují reprodukci, smrt organismu Přítel: mocný nástroj evoluce – v důsledku genových duplikací vznik genových rodin, vznik nových genů (alel), které se uplatnily v nových přírodních podmínkách, vznik nových biologických druhů Závěr: Postiženému jedinci mutace zpravidla mnoho radosti nepřinese, avšak z pohledu velkého časového měřítka pomáhá biologickým druhům v boji o přežití Výhodné pro mikroorganismy s krátkou generační dobou – soutěž „kdo s koho“ – parazit pomocí mutací bojuje proti vývoji imunitních reakcí hostitele (tedy odolností) 24

6

27.9.2011

Malárie a srpkovitá anemie

Testy genotoxicity: Amesův test • Testovací organismus: bakterie Salmonella typhimurium • Kmen bakterie vyžadující přítomnost určité látky v mediu (aminokyselina) = auxotrofní; zde konkrétně vyžaduje histidin

+

• Živné medium tuto látku neobsahuje • Naočkování bakterií, přidání testované chemikálie

Normální červené krvinky

Výsledky:

malárie

Plasmodium

Srpkovitá anemie

• Bakterie nerostou – chemikálie nezpůsobuje genové mutace

Heterozygoti pro srpkovitou anemii (60% normálního Hb + 40% HbS) jsou vůči malárii odolní

• Bakterie rostou – látka je mutagenní, ač je bakterie závislá na přísunu urč. látky (AMK), která není v mediu přítomna, je schopna života = PROBĚHLA MUTACE, díky níž se objevila schopnost bakterie syntetizovat potřebnou AMK 25

Amesův test

• Ames-test hodnotí reverzní mutace

26

Muta-chromoPlate test Obdoba Amesova testu uzpůsobená pro mikrotitrační destičky Slouží ke stanovení mutagenních účinků látek přítomných v kapalných, pevných i plynných vzorcích. Testovací organismus: Salmonella typhimurium Žlutá - mutagenní 27

Červená - negativní 28

7

27.9.2011

SOS chromotest

Waxy mutační test na kukuřici

• speciální kmen bakterie • Detekce genové mutace • Waxy gen podmiňuje přítomnost amylózy v pylových zrnech kukuřice, ječmene a rýže • Dominantní forma (Wx) – amylopektin + amylóza; při reakci s jódem modré zbarvení (normální škrob) • Recesivní forma (wx) – pouze amylopektin; při reakci s jódem červené zbarvení pyl. zrna („waxy“ škrob) • Zea mays waxy test sleduje v pylových zrnech kukuřice pomocí jodidové zkoušky frekvenci zpětných mutací z wx na Wx • Využití sporadické – časově náročné (je třeba získat pyl z kvetoucích rostlin)

Escherichia coli • genotoxický vzorek způsobuje změnu zbarvení • možnost použití automatických čtecích spektrofotometrů • srovnatelné s Amesovým testem Další obdoby Amesova testu: - Arabinózový test - Ampicilínový test 29

30

Test somatické mozaiky na sóje

Waxy kukuřice (Vosková kukuřice)

• Sleduje změnu barvy skvrnitých listů kódovanou genem Y11 • Dominantní homozygoti Y11Y11 - tmavě zelené listy (vlivem mutací se na nich mohou tvořit světlé nebo velmi tmavé skvrny) • Heterozygoti Y11y11 – světle zelené listy (vlivem mutací: tmavě zelené, žluté nebo dvojité skvrny; dvojitou skvrnou se myslí vznik žluté a tmavě zelené skvrny v těsné blízkosti) • Recesivní homozygoti y11y11 - žluté listy (mutace způsobují světle zelené skvrny) • Indukce barevně kontrastních skvrn u homozygotů způsobena bodovými mutacemi v genu Y11; u heterozygotů i díky somatickému crossing-overu nebo chromozomálním aberacím • Test se provádí na semenech / semenáčcích, trvá 4-5 týdnů, hodnotí se počet a typ skvrn na listech 31

32

8

27.9.2011

Mikrojaderné testy na rostlinách

Somatický crossing-over

Micronucleus = mikrojádro

• Probíhá při meióze při tvorbě pohlavních buněk • K somatickému crossing-overu dochází v ostatních tělních buňkách – ale je to chyba

• Semena bobu (Vicia faba), nebo cibule (Allium cepa) se nechají vyklíčit v roztoku s testovanou chemikálií (výluh půdy apod.). Test se provádí také na pylových zrnech tradeskancie (Tradescantia). • Testu předchází test inhibice elongace kořene • Příprava mikroskopických preparátů z kořenové špičky • Mikroskopické pozorování buněčných jader Mikrojádro = fragmenty chromosomů, obalené jaderným obalem (membránou) Přítomnost mikrojader – chemikálie mutagenní Nepřítomnost mikrojader – nelze tvrdit, že vzorek není mutagenní; mikrojaderný test nehodnotí např. genové mutace ani všechny chromosomální aberace 33

Mikrojaderný test

34

Teratogeneze • Vznik poškození u plodu (malformace = znetvořené orgány, vrozené vývojové vady) • Př. malformace – polydaktylie (mnoho prstů), – rozštěp rtu • Faktory způsobující malformace = teratogeny • Teratogeny chemické (rozpouštědla, léky...), fyzikální (RTG záření, vysoká teplota u člověka) i biologické (choroby – viry, toxoplasmosa) • Potencionálními teratogeny mohou být i mutagenní látky (např. těžké kovy) 35

36

9

27.9.2011

Test teratogenity

FETAX

• Test „FETAX“ • Drápatka vodní Xenopus laevis • Test probíhá na vajíčkách a v raných embryonálních stádiích. • Sledované znaky: úhyn, malformace

Testovací organismus: drápatka vodní, Xenopus laevis Velikost:

samice až 13 cm, samci 7-8 cm

Počet embryí v jedné misce: 25 Sledovaná odezva: úhyn, malformace Opakování: 2 Objem testované koncentrace: 10 ml Teplota: 24±2 °C Doba expozice: 96 hodin Osvětlení: světelný cyklus 16 h / 8 h (světlo / tma) Pomůcky a zařízení: binokulární lupa zvětšující 30krát, inkubátor

37

38

Index teratogenity

Genotoxické účinky vyvolávají látky i ve velmi nízkých koncentracích.

• Index teratogenity (TI)

U  f (ct ) n

U ... účinek látky c ... koncentrace látky t ... doba působení látky

exponent n ... klasické jedy: 0-1 UV záření: cca 2 genotoxické látky: >5 U genotoxických látek účinek závislý především na délce expozice, zatímco u ostatních látek záleží hlavně na koncentraci Lze těžko hovořit o neškodné koncentraci genotoxické látky 39

TI 

LC 50 TC 50

LC50 – letální koncentrace TC50 – teratogenní koncentrace • Hodnota LC50 se získá z měření úhynu embryí, TC50 z hodnocení malformací • Čím je index teratogenity vyšší, tím vyšší představuje látka riziko, že bude mít v životním prostředí teratogenní účinky • Předpokládá se, že látky s TI < 1,5 nepředstavují z hlediska teratogeneze závažné riziko 40

10