XXIII. SBORNÍK PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ PROGRAM BIOCHEMICKÝ SJEZD BRNO

XXIII.

BIOCHEMICKÝ SJEZD České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a Slovenské spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu

BRNO  26. – 29. 8. 2012

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ PROGRAM www.csbmb.cz âESKÁ SPOLEâNOST PRO BIOCHEMII A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

SSB MB

Slovenská spoločnosť pre biochémiu a molekulárnu biológiu Člen IUBMB a FEBS

středoevropský technologický institut BRNO | ČESKÁ REPUBLIKA

RÁMCOVÝ PROGRAM NEDĚLE 26. 8. 2012 8:00 – 20:00

REGISTRACE

9:00 – 16:00 Sekce mladých / SÁL B 16:30

Zahájení sjezdu / SÁL A

18:00 – 18:50 Plenární přednáška: prof. Robert J. Woods / SÁL A 19:00 – 22:00 Společenský večer / areál Univerzitního kampusu Bohunice

PONDĚLÍ 27. 8. 2012 8:00 – 18:00

REGISTRACE

8:30 – 9:20 Plenární přednáška: prof. Jiří Friml / SÁL A

ÚTERÝ 28. 8. 2012 8:00 – 14:00

REGISTRACE

8:30 – 12:00 Jednání v sekcích

Struktura a funkce biomolekul / SÁL A

Biotechnologie / SÁL B

Patobiochemie a klinická biochemie / SÁL C

12:10 – 13:15 Výherci Ceny Arnolda Beckmana a Ceny Josefa V. Koštíře / SÁL A 13:15 – 13:35 Firemní přednáška – firma Illumina / SÁL A 13:15 – 14:00 Oběd

Volné odpoledne

Exkurze a výlety

STŘEDA 29. 8. 2012


Xenobiochemie a toxikologie / SÁL A

8:00 – 16:00

Bioinformatika a výpočetní biochemie / SÁL B


Rostlinná biochemie / SÁL C

Molekulární genetika / SÁL A

Proteomika a metabolomika / SÁL B

13:00 – 13:20 Firemní přednáška – firma MERCK / SÁL A 13:00 – 14:00 Oběd 14:00 – 17:30 Jednání v sekcích

REGISTRACE

12:10 – 13:00 Plenární přednáška: prof. Miloš V. Novotný / SÁL A 13:00 – 14:00 Oběd

Glykobiochemie / SÁL A

14:00 – 17.30 Jednání v sekcích

Bioelektrochemie a bioanalytika / SÁL B

Buněčná signalizace a regulace / SÁL C

Výuka biochemie / SÁL A

Membránová biochemie a bioenergetika / SÁL B

17:30

Přednáškové prostory: SÁL A = místnost 132 SÁL B = místnost 205 SÁL C = místnost 206

Závěr sjezdu / SÁL A Vyhlášení ceny za nejlepší poster

XXIII. biochemický sjezd České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a Slovenské spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu pod záštitou hejtmana Jihomoravského kraje JUDr. Michala Haška a rektora Masarykovy univerzity Doc. PhDr. Mikuláše Beka, Ph.D.

Brno, 26. – 29. srpna 2012

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ PROGRAM

2

OBSAH

Úvodní slovo

5

Program

12–26

Sborník přednášek a posterů

29–184

Autorský rejstřík

186–189

3

4

Vážené kolegyně, vážení kolegové, vítejte na XXIII. biochemickém sjezdu, jehož organizací byla letos poctěna Masarykova Univerzita v Brně. Přesto, že se zde datuje historie samostatných oborů biochemie a molekulární biologie již od roku 1950, tentokrát se scházíme na půdě nově postaveného univerzitního kampusu, kde se budou konat přednášky i doprovodné programy a můžeme tak plně využít moderně vybavené přednáškové sály. Hlavní předností sjezdu je možnost setkání všech aktivních účastníků, ať už v roli garantů sekcí, předsedajících, přednášejících, či prezentujících plakátové sdělení. Vy všichni se podílíte na kvalitě probíhajícího sjezdu. Velký dík patří všem, kteří si dokázali v období prázdnin udělat čas na přípravu vědeckých příspěvků, především pak garantům sekcí, kteří od brzkého jara vytrvale spolupracovali na tvorbě konferenčního programu a plně při tom využili svých vědeckých kontaktů a zkušeností. Zvláštní dík patří významným hostům, kteří nás poctí svou návštěvou a přednesou své plenární přednášky. Ze zámoří se do své domoviny vrací, aby nám přiblížil výsledky své dlouhé a úspěšné vědecké kariéry, prof. Miloš V. Novotný. Dalším neméně významným hostem je čerstvý laureát ceny EMBO Gold Medal 2012, prof. Jiří Friml. V neposlední řadě mezi nás zavítá i přední světový odborník v oblasti glykobiochemie, prof. Robert J. Woods. Vedle těchto zkušených vědců se za své výsledky nemusí stydět ani laureáti našich národních cen, Ceny Josefa V. Koštíře a Ceny Arnolda Beckmana, kteří se představí v úterý v poledne. S pomocí všech členů organizačního výboru se nám podařilo sestavit pestrou směsici sekcí s kvalitním programem, které svým zaměřením kopírují moderní trendy současné biochemie a molekulární biologie. Věříme, že odborná vystoupení na sjezdu ukážou, že česká ani slovenská věda nepokulhává za světovým výzkumem, ale je mu důstojným partnerem. Dobrou známkou sjezdu je i mimořádný zájem odborných firem o účast a prezentaci, což napomáhá hladké organizaci akce. Zvláštností tohoto sjezdu je zařazení Sekce mladých před oficiální vědecký program. Proto možná někteří z Vás budou číst tato slova až poté, co proběhlo dvacet jedna přednášek zástupců naší mladé vědecké generace. Možná už také známe výherce nejlepší z nich. To ovšem nic nemění na tom, že je radost sledovat zvyšující se úroveň a odbornou kvalitu všech příspěvků studentů, kteří pracují na budoucnosti české a slovenské vědy. Držme jim tedy palce a na některém z příštích sjezdů jim rezervujme prostor v řádných sekcích. Věřím, že pro nás všechny bude sjezd příležitostí k setkání s přáteli, k navazování nových kontaktů, k načerpání vědomostí a především zajímavých podnětů a motivace pro další vědeckou práci.

Michaela Wimmerová za celý přípravný tým předsedkyně organizačního výboru sjezdu

5

Předseda sjezdu prof. RNDr. Václav Pačes, DrSc. předseda České společnosti pro biochemii a molekulární biologii

Místopředseda sjezdu prof. RNDr. Ján Turňa, CSc. předseda Slovenské spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu

Čestné předsednictvo doc. PhDr. Mikuláš Bek, Ph.D. rektor Masarykovy univerzity v Brně JUDr. Michal Hašek hejtman Jihomoravského kraje prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc. ředitel Středoevropského technologického institutu Masarykovy univerzity v Brně doc. RNDr. Jaromír Leichmann, Dr. děkan Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc. děkan Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně

6

Vědecký výbor Prof. RNDr. Emil Paleček, DrSc. (předseda) Prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc. Ing. Peter Šebo, CSc. RNDr. Zdena Tuháčková, CSc. Prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. MUDr. Josef Houštěk, DrSc. Doc. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D. Prof. MUDr Radim Černý, CSc. Prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc. Ing. Jan Dohnálek, Ph.D. Prof. RNDr. Eva Táborská, CSc. Prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.

Organizační výbor Doc. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. (předseda) Prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc. Ing. Irena Krumlová Prof. RNDr. Emil Paleček, DrSc. Mgr. Veronika Papoušková Zina Pecková Mgr. Martina Pokorná, Ph.D. Prof. RNDr. Eva Táborská, CSc. Doc. RNDr. Josef Tomandl, CSc. Doc. RNDr. Petr Zbořil, CSc. Doc. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.

Organizační sekretariát sjezdu

Congress Business Travel, spol. s.r.o. (CBT) Lidická 43/66 150 00 Praha 5 – Anděl e-mail: [email protected] web: www.csbmb2012.cz tel: + 420 224 224 646, + 420 224 942 575 / 579 fax: + 420 224 942 550

7

MÍSTO KONÁNÍ SJEZDU Masarykova univerzita, Univerzitní kampus Brno-Bohunice Kamenice 5 Brno – Bohunice, 625 00

Parkování Parkování v neděli 26. 8. 2012 bude umožněno na parkovištích před pavilonem A22 (hlavní vchod), dále pak u pavilonu A34 a v obchodním centru Campus Square. V dalších dnech, tedy od pondělí 27. 8. do středy 29. 8. 2012 bude možné parkovat pouze v okolí pavilonu A34 a v obchodním centru Campus Square.

VÝSTAVA FIREM Výstava firem je umístěna v prostorách Univerzitního kampusu.

STRAVOVÁNÍ Během přestávek se bude podávat káva/čaj a malé občerstvení. Obědy se budou podávat v areálu Univerzitního kampusu od 13:00 do 14:00.

8

SPOLEČENSKÝ PROGRAM NEDĚLE, 26. SRPNA 2012 l Slavnostní zahájení (16:30 – 18:00) / SÁL A (zahrnuto v registračním poplatku)

l Společenský večer (19:00 – 22:00) /areál Univerzitního kampusu (zahrnuto v registračním poplatku, vstupenka pro doprovodnou/ neregistrovanou osobu 300 Kč) Pohoštění formou bufetu.

ÚTERÝ, 28. SRPNA 2012 l Výlet do Punkevních jeskyní v blízkosti propasti Macocha (14:30 – 19:00)

Cena 300 Kč /osobu zahrnuje dopravu autobusem, dopravu silničním vláčkem, vstupné na prohlídku, doprovod hostesky

l Výlet do Valtic spojený s prohlídkou Valtického podzemí a s řízenou degustací vína, občerstvení (15:00 – 21:00)

Cena 300 Kč /osobu zahrnuje dopravu autobusem, prohlídku Valtického podzemí, řízenou degustaci vína, občerstvení, doprovod hostesky

Odjezd autobusů vždy od Univerzitního kampusu.

9

REGISTRAČNÍ POPLATKY do 20. 5. 2012

od 21. 5. 2012

na místě

Sekce mladých

1 500 Kč

1 500 Kč

1 500 Kč

Člen ČSBMB + SSBMB

3 900 Kč

4 400 Kč

4 900 Kč

Ostatní účastníci

4 300 Kč

4 800 Kč

5 300 Kč

Účastníci do 30-ti let

2 900 Kč

3 400 Kč

3 900 Kč

Jednodenní registrace

1 500 Kč

1 500 Kč

1 500 Kč

REGISTRAČNÍ POPLATEK ZAHRNUJE: l vstup na odborná jednání l vstup na výstavu firem l sjezdové materiály l obědy a občerstvení během přestávek l slavnostní zahájení a společenský večer 26. 8. 2012 l certifikát o účasti (pouze na vyžádání) Pro uplatnění sníženého poplatku “Účastníci do 30-ti let” je nutné při registraci předložit průkaz totožnosti.

JEDNODENNÍ REGISTRACE 26. 8. 2012 – Sekce mladých

barva jmenovky ŠEDÁ

27. 8. 2012

barva jmenovky ČERVENÁ

28. 8. 2012

barva jmenovky ZELENÁ

29. 8. 2012

barva jmenovky ŽLUTÁ

JEDNODENNÍ REGISTRACE NA SEKCI MLADÝCH ZAHRNUJE: l vstup na odborné jednání 26. 8. 2012 l oběd a občerstvení během přestávky l slavnostní zahájení a společenský večer 26. 8. 2012 Účastníci do 30 let, kteří zaplatí plný registrační poplatek, mají také volný vstup do sekce mladých v neděli 26. 8. 2012, REGISTRACE ALE NUTNÁ.

10

REGISTRAČNÍ HODINY neděle, 26. 8. 2012

08.00 – 20.00

pondělí, 27. 8. 2012

08.00 – 18.00

úterý, 28. 8. 2012

08.00 – 14.00

středa, 29. 8. 2012

08.00 – 16.00

INTERNET V celém areálu je možnost připojení k internetu pomocí Wi-fi. Přístupový kód bude každému účastníkovi přidělen při registraci.

PŘEDNÁŠKY Pro přednášející bude zajištěna prezentační technika pro projekci z PC (PC bude k dispozici, není možné použití vlastního laptopu). Žádáme přednášející, aby předali své prezentace technikovi v sále včas, nejpozději během přestávky před začátkem své sekce na CD anebo USB. Technik – modré tričko s nápisem ,,staff”.

POSTERY Rozměry posterů jsou 150 cm na výšku a 95 cm na šířku, kobercová úprava stojanu, připevnění špendlíky.

11

PROGRA M

PROGRAM SJEZDU Neděle 26. 8. 2012 8:00 – 20:00 REGISTRACE

Sekce 14 – Sekce mladých / SÁL B Garant: Zdeněk Glatz 9:00 – 9:05 Zahájení Zdeněk Glatz 9:05 – 9:20 K. Bednářová, INTRAMOLECULAR AND INTERMOLECULAR GUANINE QUADRUPLEXES OF DNA IN AQUEOUS SALT AND ETHANOL SOLUTIONS 9:20 – 9:35 K. Frnková, ANALYSIS OF TOTAL POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS CONCENT IN ENVIRONMENTAL SAMPLES BY INDIRECT COMPETITIVE IMMUNOASSAY, RESULTS COMPARISON WITH GC-MS (ESI) ANALYSIS 9:35 – 9:50 M. Kříž, SURFACE IMMOBILIZED NANOCHANNELS FOR IMPROVED CONSTRUCTION OF BIOSENSORS 9:50 – 10:05 Š. Novotná, INNOVATIVE PROCEDURE FOR SIMPLE AND EFFECTIVE SYNTHESIS OF BORONIC ACID PROTEIN CONJUGATES 10:05 – 10:20 S. Petrik, UTILIZATION OF WHEAT STRAW HYDROLYZATE TO PRODUCTION OF ENRICHED YEAST BIOMASS 10:20 – 10:40 Přestávka 10:40 – 10:55 M. Zábrady, IMMUNOMODULATION – SELECTION OF INTRACELLULARLY ACTIVE AFFINITY BIOMOLECULES 10:55 – 11:10 L. Maršálová, STUDY OF PLANT INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS AFFECTED BY ABIOTIC STRESSOR USING MASS SPECTROMETRY 11:10 – 11:25 L. Coufalová, PROTEOMIC STUDY OF PATHOLOGICAL BIOMINERALIZATION OF AORTIC VALVES 11:25 – 11:40 M. Crhová, PEPTIDE MASS MAPPING METHOD AS AN EFFECTIVE TOOL FOR THE ANALYSIS OF HISTORICAL MORTARS 12

I . Nečasová, HOW DOES BASIC DOMAIN OF GENOME GUARDING TELOMERIC PROTEIN AFFECT ITS DNA BINDING AFFINITY?

11:55 – 12:10 J. Nováček, CARBON DETECTION, NON-UNIFORM SAMPLING AND HIGH DIMENSIONALITY AS MEANS OF IMPROVING RESOLUTION FOR ASSIGNMENT OF DISORDERED PROTEINS 12:10 – 13:10

Oběd

13:10 – 13:25 G. Jančaříková, EXPRESSION AND PRODUCTION OF HUMAN GLYCOSYLTRANSFERASES 13:25 – 13:40 J. Komárek, CLONING AND CHARACTERIZATION OF NOVEL JACALIN-RELATED LECTIN FROM ASPERGILLUS FUMIGATUS 13:40 – 13:55 T. Kunická, ROLE OF ABCC1 GENE IN PROGRESSION AND THERAPY OUTCOME OF BREAST CANCER 13:55 – 14:10 A. Lounková, FACTORS REQUIRED FOR REPLICATION OF AVIAN RETROVIRUS IN MAMMALIAN CELLS 14:10 – 14:25 E. Polanská, HMGB1 GENE KNOCKOUT IN MOUSE EMBRYONIC FIBROBLASTS RESULTS IN REDUCED TELOMERASE ACTIVITY AND TELOMERE DYSFUNCTION 14:25 – 14:45 Přestávka 14:45 – 15:00 Z. Střelcová, THE THEORETICAL INVESTIGATION OF CHITIN NANOFIBRILS MECHANICAL PROPERTIES 15:00 – 15:15 J. Bláha, TOWARDS THE STRUCTURE OF LYMPHOCYTE RECEPTOR HLLT1 15:15– 15:30 M. Darmostuk, IN VITRO STUDY OF NOVEL PORPHYRIN DERIVATIVES AS POTENTIAL PHOTOSENSITIZERS FOR CANCER TREATMENT AND IMAGING 15:30 – 15.45 J. Písačková, CHARACTERIZATION AND CRYSTALLIZATION OF ANTI-CD3 ANTIBODY RECOMBINANT FRAGMENT 15.45 – 16:00 H. Sedláčková, CHARACTERIZATION OF THE ROLE OF RECQ4 IN HOMOLOGOUS RECOMBINATION

13

PROGRA M

11:40 – 11:55

PROGRA M

16:30

Zahájení sjezdu / SÁL A

18:00 – 18:50

Plenární přednáška / SÁL A

Předsedající: Jaroslav Koča Robert J. Woods: VIRTUAL GLYCAN ARRAY SCREENING FOR SPECIFICITY PREDICTION: APPLICATION TO CARBOHYDRATE-BINDING PROTEINS AND ENZYMES

19:00 – 22:00

Společenský večer – Garden party / areál Univerzitního kampusu Bohunice

Pondělí 27. 8. 2012 8:00 – 18:00 REGISTRACE

8:30 – 9:20 Plenární přednáška / SÁL A Předsedající: Jiří Fajkus

J iří Friml: HOW CELLS MAKE A PLANT: ROLE FOR DIRECTIONAL AUXIN TRANSPORT

Sekce 13 – Xenobiochemie a toxikologie / SÁL A Garant: Marie Stiborová Předsedající – 1. část: Marie Stiborová, Tomáš Eckschlager 9:30 – 9:35 Zahájení Marie Stiborová 9:35 – 10:05 A. Breier, NEW INSIGHT INTO P-GLYCOPROTEIN AS A DRUG TARGET 10:05 – 10:25 P. Anzenbacher, CYTOCHROMY P450 – OD STRUKTUR K INTERAKCÍM S LÁTKAMI NEJRŮZNĚJŠÍHO PŮVODU 10:25 – 10:45 P. Hodek, STUDIUM MEMBRÁNOVÉ TOPOLOGIE SYSTÉMU CYTOCHROMU P450 POMOCÍ FOTO-CYTOCHROMU B5 10:45 – 11:05 V. Wsól, LIDSKÉ MIKROSOMÁLNÍ KARBONYL REDUKUJÍCÍ ENZYMY V METABOLISMU XENOBIOTIK Z NADRODINY SDR 11:05 – 11:30 Kávová přestávka 14

11:30 – 11:50 M. Machala, POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY A DIOXINY – MECHANISMY TOXICKÝCH ÚČINKŮ GENOTOXICKÝCH A NEGENOTOXICKÝCH LIGANDŮ AHR IN VITRO 11:50 – 12:10 M. Stiborová, HUMAN ENZYMES METABOLIZING CARCINOGENIC ARISTOLOCHIC ACID I: CHARACTERIZATION OF THEIR MECHANISMS OF ACTION WITH EXPERIMENTAL AND THEORETICAL APPROACHES 12:10 – 12:30 T. Eckschlager, REZISTENCE NÁDOROVÝCH BUNĚK K CYTOSTATIKŮM A MECHANIZMY JEJÍHO VZNIKU 12:30 – 12:45 J. Hudeček, PROČ MÁ REDUKTASA CYTOCHROMU P450 TAK SILNĚ KONZERVOVANOU SEKVENCI? 12:45 – 13:00 M. Martínková, MOLECULAR MECHANISM OF INTRAPROTEIN/ INTERDOMAIN SIGNAL TRANSDUCTION IN NOVEL HEME-CONTAINING SENSOR PROTEINS

Sekce 2 – Bioinformatika a výpočetní biochemie / SÁL B Garant: Jaroslav Koča Předsedající – 1. část: Robert J. Woods, Jaroslav Koča 9:30 – 9:35 Zahájení Jaroslav Koča 9:35 – 10:05 J. Šponer, MOLECULAR DYNAMICS SIMULATIONS OF NUCLEIC ACIDS AND THEIR APPLICATION TO RIBOSOMAL RNA 10:05 – 10:25 M. Otyepka, THEORETICAL STUDIES ON RNA 10:25 – 10:45 V. Spiwok, URYCHLOVÁNÍ SIMULACÍ POMOCÍ METADYNAMIKY 10:45 – 11:05

. Vácha, MORPHOLOGY AND KINETICS OF SELF-ASSEMBLED R PEPTIDE AGGREGATES USING COARSE GRAINED SIMULATIONS

11:05 – 11:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Jiří Šponer, Michal Otyepka 11:30 – 11:50

J . Koča, PROTEIN/CARBOHYDRATE INTERACTIONS – HYDROGEN BONDING OR DISPERSION FORCES?

15

PROGRA M

Předsedající – 2. část: Pavel Anzenbacher, Albert Breier

PROGRA M

11:50 – 12:10

. Hegyi, DIVAS: DOMAIN INTEGRITY VERIFICATION H OF ALTERNATIVE SPLICING – A SERVER TO PREDICT THE VIABILITY OF AS VARIANTS

12:10 – 12:30

. Svobodová-Vařeková, SEARCHING, COMPARISON AND R CHARACTERIZATION OF PROTEIN STRUCTURAL MOTIFS

12:30 – 12:45

. M. Ionescu, ROLE OF CHARGE TRANSFER IN THE C ACTIVATION OF PRO-APOPTOTIC REGULATORS BAX AND BAK

12:45 – 13:00

G. Demo, PROTEIN ENGINNERING OF b-D-MANNOSIDASE

Sekce 10 – Rostlinná biochemie / SÁL C Garant: Jiří Fajkus Předsedající – 1. část: Jiří Fajkus, Eva Benková 9:30 – 9:35 Zahájení Jiří Fajkus 9:35 – 10:05 E. Benková, MECHANISMY INTERAKCE AUXINU A CYTOKININU V REGULACI VÝVOJE ROSTLIN 10:05 – 10:25 E. Zažímalová, TRANSPORT OF PLANT HORMONE AUXIN ON A SINGLE CELLS LEVEL: MATHEMATICAL MODELLING 10:25 – 10:45 R. Dopitová, PREPARATION, CRYSTALLIZATION AND STRUCTURAL ANALYSIS OF AHP2 PROTEIN, THE SIGNAL TRANSMITTER FROM ARABIDOPSIS THALIANA 10:45 – 11:05 M. Žďárská, PROTEOME REGULATION IN ARABIDOPSIS REVEALS SHOOT- AND ROOT-SPECIFIC EFFECTS OF CYTOKININS ON HORMONAL HOMEOSTASIS AND CYTOKININ-ETHYLENE SIGNALING CROSSTALK 11:05 – 11:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Jiří Fajkus, Eva Zažímalová 11:30 – 12:00 E. Sýkorová, TELOMERES OF ALGAE – INSIGHT TO TELOMERE EVOLUTION 12:00 – 12:20 V. Muchová, INSTABILITY IN CHROMATIN ASSEMBLY – LOSS OF RIBOSOMAL DNA AND TELOMERIC REPEATS IN ARABIDOPSIS THALIANA 12:20 – 12:40 A. Ogrocká, DEVELOPMENTAL MAINTENANCE OF GENERAL EPIGENETIC PATTERN OF THE ARABIDOPSIS THALIANA TERT (TELOMERASE PROTEIN SUBUNIT) CHROMATIN

16

13:00 – 13:20

Firemní přednáška – firma MERCK / SÁL A

SBOHEM, PANE BRADFORDE ANEB INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE VE SLUŽBÁCH KVANTIFIKACE PROTEINŮ

13:00 – 14:00

Oběd

Sekce 5 – Glykobiochemie / SÁL A Garant: Libor Grubhoffer Předsedající – 1. část: Libor Grubhoffer, Katarína Mikušová 14:00 – 14:05 Zahájení Libor Grubhoffer, Katarína Mikušová 14:05 – 14:35

I . Tvaroška, CATALYTIC MECHANISM OF INVERTING GLYCOSYLTTRANSFERASES

14:35 – 14:55

. Pompach, SITE SPECIFIC GLYCOFORMS OF LIVER SECRETED P PROTEINS AS POTENTIAL DISEASE BIOMARKERS

14:55 – 15:15 J. Štěrba, ADVANCES IN TICK GLYCOBIOLOGY 15:15 – 15:35 L. Malinovská, LEKTINY Z BURKHOLDERIA CENOCEPACIA – KDYŽ DVA (TŘI, ČTYŘI) DĚLAJÍ TOTÉŽ … 15:35 – 16:00 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Libor Grubhoffer, Igor Tvaroška 16:00 – 16:20 J. Tkáč, MOŽNOSTI VYUŽITIA LEKTÍNOV V GLYKOMIKE A DIAGNOSTIKE 16:20 – 16:40 Z. Sulová, ZVÝŠENÁ EXPRESIA P-GLYKOPROTEÍNU V LEUKEMICKÝCH BUNKÁCH JE SPOJENÁ SO ZMENAMI V GLYKOZYLÁCII PROTEÍNOV 16:40 – 17:00 J. Nahálka, BIOINFORMATICKÁ ANALÝZA „MONOSACHARID ŠPECIFICKÝCH“ PROTEÍNOV NÁS VEDIE K NOVEJ „GLYKOKODÓNOVEJ“ TEÓRII 17:00 – 17:30 O. Vaněk, PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ S DEFINOVANOU GLYKOSYLACÍ A JEJICH VYUŽITÍ

17

PROGRA M

12:40 – 13:00 M. Petřivalský, S-NITROSOGLUTATHIONREDUKTASA – KLÍČOVÝ ENZYM REGULACE S-NITROSYLACE V ODPOVĚDI ROSTLIN NA STRESOVÉ PODMÍNKY

PROGRA M

Sekce 1 – Bioelektrochemie a bioanalytika / SÁL B Garant: Emil Paleček Předsedající – 1. část: Emil Paleček, Pavel Dráber, Jiří Homola, Václav Pačes 14:00 – 14:05 Zahájení Emil Paleček 14:05 – 14:35 J. Homola, SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSORS AND THEIR ANALYTICAL APPLICATIONS 14:35 – 14:55 E. Paleček, ELECTROCHEMISTRY OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS. CAN IT BE USEFUL FOR BIOCHEMISTS? 14:55 – 15:15 F. Foret, MINIATURIZACE V BIOANALÝZE 15:15 – 15:35 P. Skládal, REAL-TIME CHARACTERISATION OF AFFINITY INTERACTIONS USING PIEZOELECTRIC AND SURFACE PLASMON RESONANCE BASED BIOSENSORS 15:35 – 16:00 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: František Foret, Libuše Trnková, Viktor Brabec, Petr Skládal 16:00 – 16:20 V. Brabec, ANALYSIS OF DNA MODIFICATIONS BY PLATINUM COMPLEXES, RECOGNITION AND REPAIR OF THESE MODIFICATIONS. RELATIONSHIP TO ANTICANCER 16:20 – 16:40 P. Dráber, REGULATION OF MICROTUBULES IN ACTIVATED MAST CELLS 16:40 – 17:00 J. Fulneček, METODY ANALÝZY 5-METYLCYTOZINU V NUKLEOVÝCH KYSELINÁCH 17:00 – 17:15 L. Trnková, ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE KRÁTKÝCH OLIGODEOXYNUKLEOTIDŮ 17:15 – 17:30 M. Bartošík, ELECTROCHEMICAL SENSING OF NUCLEIC ACIDS

Sekce 4 – Buněčná signalizace a regulace / SÁL C Garant: Zdena Tuháčková Předsedající – 1. část: Zdena Tuháčková, Silvia Pastoreková 14:00 – 14:05 Zahájení Zdena Tuháčková 14:05 – 14:35 V. Brychtová, SIGNALIZACE A ÚLOHA PROTEINU ANTERIOR GRADIENT 2 V NÁDOROVÉ BUŇCE, MOŽNOSTI JEHO VYUŽITÍ JAKO PREDIKTIVNÍHO BIOMARKERU TAMOXIFENOVÉ REZISTENCE U KARCINOMU PRSU 18

14:55 – 15:15 P. Radvák, BUNKOVÉ SIGNÁLNE DRÁHY OVPLYVNENÉ EXPRESIOU KARBONICKEJ ANHYDRÁZY IX 15:15 – 15:35 Z. Tuháčková, MTOR-SIGNÁLNÍ PROTEIN ATRAKTIVNÍ A ZÁHADNÝ 15:35 – 16:00 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Zdena Tuháčková, Silvia Pastoreková 16:00 – 16:20

J . Mašín, TOKY IONTŮ PŘES MEMBRÁNU REGULOVANÉ ADENYLÁTCYKLÁZOVÝM TOXINEM OVLIVŇUJÍ JEHO CYTOTOXICITU PROTI CÍLOVÝM BUŇKÁM

16:20 – 16:40 Ľ. Nižnanský, GABA V BUNKOVEJ SIGNALIZÁCII VLÁKNITEJ HUBY TRICHODERMA ATROVIRIDE 16:40 – 17:00 J. Kormanec, INTRIGUING PROPERTIES AND REGULATION OF THE ANGUCYCLINE ANTIBIOTIC AURICIN IN STREPTOMYCES AUREOFACIENS CCM3239 17:00 – 17:15 M. Pekarova, NARUŠENÍ ROVNOVÁHY MEZI L-ARGININEM A ASYMETRICKÝM DIMETHYLARGININEM VEDE K DEREGULACI IMUNITNÍ ODPOVĚDI MAKROFÁGŮ 17:15 – 17:30 I. Barák, BACILLUS SUBTILIS AS A TOOL IN BASIC SCIENCE AND APPLIED RESEARCH

Úterý 28. 8. 2012 8:00 – 14:00 REGISTRACE

Sekce 11 – Struktura a funkce biomolekul / SÁL A Garant: Jan Dohnálek Předsedající – 1. část: Pavlína Řezáčová, Jan Dohnálek 8:30 – 8:35 Zahájení Jan Dohnálek 8:35 – 9:05

. Heinemann, STRUCTURAL INSIGHT INTO THE MOLECULAR U MACHINERY MEDIATING ENDOPLASMIC RETICULUMASSOCIATED DEGRADATION OF PROTEINS 19

PROGRA M

14:35 – 14:55 S. Pastoreková, CARBONIC ANHYDRASE INHIBITOR ACETAZOLAMIDE MODULATES TRANSCRIPTION AND SHEDDING OF TUMOR HYPOXIA-RELATED CARBONIC ANHYDRASE IX

PROGRA M

9:05 – 9:25

. Obšil, ROLE OF 14-3-3 PROTEINS IN THE REGULATION T OF G-PROTEIN SIGNALING

9:25 – 9:45 K. Kubíček, TOWARDS UNDERSTANDING OF THE CTD CODE 9:45 – 10:05

. Kovaľ, STRUCTURE AND REACTION MECHANISM OF PLANT T MULTIFUNCTIONAL PHOSPHODIESTERASE

10:05 – 10:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Tomáš Obšil, Jan Dohnálek 10:30 – 10:50

. Řezáčová, STRUCTURE OF THE EFFECTOR-BINDING DOMAIN P OF ARABINOSE REPRESSOR ARAR FROM BACILLUS SUBTILIS

10:50 – 11:10

. Tylichová, STRUCTURE-FUNCTION STUDY ON MAIZE M ENZYMES CONNECTED TO CYTOKININ METABOLISM – NUCLEOSIDE N-RIBOHYDROLASES AND ALDEHYDE DEHYDROGENASES

11:10 – 11:30

. Bařinka, TOWARDS NOVEL INHIBITORS OF HUMAN C GLUTAMATE CARBOXYPEPTIDASE II – FROM HIGH THROUGHPUT SCREENING TO STRUCTURE-BASED DESIGN

11:30 – 11:45

. Bumba, ANALYSIS OF BIOMOLECULAR INTERACTIONS L BY SURFACE PLASMON RESONANCE

11:45 – 12:00

J . Houser, STRUCTURAL INSIGHT INTO BINDING VARIABILITY OF ASPERGILLUS FUMIGATUS LECTIN

Sekce 3 – Biotechnologie / SÁL B Garant: Peter Šebo Předsedající – 1. část: Peter Šebo, Vladimír Křen 8:30 – 8:35

Zahájení Peter Šebo

8:35 – 9:05

. Křen, ENZYMATIC MODIFICATIONS OF V BIOTECHNOLOGICALLY IMPORTANT NATURAL PRODUCTS

9:05 – 9:25

. Petříčková, BIOSYNTÉZA MANUMYCINOVÝCH ANTIBIOTIK K U STREPTOMYCET

9:25 – 9:45 J. Turňa, VYUŽITIE PICHIA PASTORIS PRE HETEROLOGICKÚ EXPRESIU PROBLEMATICKÝCH PROTEINOV 9:45 – 10:05

. Levarski, OPTIMIZATION OF EXPRESSION AND CLEAVAGE Z CONDITIONS OF HUMAN GROWTH HORMONE FUSION PROTEIN

10:05 – 10:30 Kávová přestávka 20

10:30 – 10:50 P. Ulbrich, STUDIUM STRUKTURY NEZRALÉ RETROVIROVÉ ČÁSTICE 10:50 – 11:10

. Schneider, INCREASING AFFINITY BETWEEN INTERFERON B GAMMA AND ITS RECEPTOR BY COMPUTER DESIGN OF RECEPTOR MUTATIONS

11:10 – 11:30

. Kuchař, NOVEL HIGH-AFFINITY BINDERS OF HUMAN M INTERFERON GAMMA DERIVED FROM ALBUMIN-BINDING DOMAIN OF PROTEIN G

11:30 – 11:45

. Bočková, POLY-L-LYSINE BASED SURFACE CHEMISTRIES M FOR PROTEIN AND CELL IMMOBILIZATION

11:45 – 12:00 O. Staněk, NOVÉ VAKCINAČNÍ NÁSTROJE PRO INDUKCI T-BUNĚČNÉ IMUNITY

Sekce 8 – Patobiochemie a klinická biochemie / SÁL C Garant: Radim Černý Předsedající – 1. část: Jan Borovanský, Stanislav Kmoch 8:30 – 8:35 Zahájení Radim Černý 8:35 – 9:05 V. Kožich, BIOCHEMICKÉ A MOLEKULOVÉ MECHANISMY U HOMOCYSTINURIE: CO VÍME PO 50 LETECH STUDIA METABOLISMU SIRNÝCH AMINOKYSELIN? 9:05 – 9:25 H. Hansíková, PORUCHY MITOCHONDRIÁLNÍHO ENERGETICKÉHO METABOLISMU 9:25 – 9:45 J. Pláteník, OTEVŘENÍ MITOCHONDRIÁLNÍHO MEGAKANÁLU ŽELEZEM: KOMPETICE ŽELEZA S KALCIEM DŮLEŽITĚJŠÍ NEŽ OXIDAČNÍ STRES 9:45 – 10:05 L. Kubala, ROLE MYELOPEROXIDÁZY V CÉVNÍM ZÁNĚTU 10:05 – 10:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Viktor Kožich, Radim Černý 10:30 – 10:50 J. Borovanský, BIOCHEMICKÉ A PATOBIOCHEMICKÉ FUNKCE MELANOSOMŮ 10:50 – 11:10 J. Kotyza, PROZÁNĚTOVÁ SIGNALIZACE V KANCEROGENEZI

21

PROGRA M

Předsedající – 2. část: Bohdan Schneider, Ján Turňa

PROGRA M

11:10 – 11:30 M. Pešta, STANOVENÍ EXPRESE KÓDUJÍCÍCH A NEKÓDUJÍCÍCH RNA U NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ – JE VYUŽITELNÉ V KLINICKÉ PRAXI? 11:30 – 12:00 S. Kmoch, VZÁCNÉ GENETICKÉ VARIANTY U MENDELOVSKÝCH A KOMPLEXNÍCH ONEMOCNĚNÍ

12:10 – 13:15

Výherce Ceny Josefa V. Koštíře 2012 / SÁL A

Ondřej Šulák: BURKHOLDERIA CENOCEPACIA A JEJÍ SUPERLEKTIN

Výherci Ceny Arnolda Beckmana 2012 / SÁL A

J itka Fučíková: LIDSKÉ NÁDOROVÉ BUŇKY OŠETŘENÉ ANTRACYKLINY INDUKUJÍ PROTINÁDOROVĚ SPECIFICKOU IMUNITNÍ ODPOVĚĎ

enka Nosková (Stanislav Kmoch): L MUTATIONS IN DNAJC5, ENCODING CYSTEINE-STRING PROTEIN ALPHA, CAUSE AUTOSOMAL-DOMINANT ADULT-ONSET NEURONAL CEROID LIPOFUSCINOSIS

omáš Takáč: T PROTEOMICS ON BREFELDIN A-TREATED ARABIDOPSIS ROOTS REVEALS PROFILIN 2 AS A NEW PROTEIN INVOLVED IN THE CROSS-TALK BETWEEN VESICULAR TRAFFICKING AND THE ACTIN CYTOSKELETON

13:15 – 13:35

Firemní přednáška – firma Illumina / SÁL A

RANSLATIONAL GENOMICS: NEXT GENERATIONS T SEQUENCING SOLUTIONS “FROM BASIC RESEARCH TOWARDS CLINICAL DIAGNOSTIC”

13:15 – 14:00 Oběd

Volné odpoledne

Exkurze a výlety

14:30

odjezd autobusu do Punkevních jeskyní

15:00

odjezd autobusu do Valtic

22

8:00 – 16:00 REGISTRACE

Sekce 7 – Molekulární genetika / SÁL A Garant: Šárka Pospíšilová Předsedající – 1. část: Stanislav Kmoch, Šárka Pospíšilová 8:30 – 8:35 Zahájení Šárka Pospíšilová 8:35 – 9:05 D. Chudakov, QUANTITATIVE PROFILING OF TCR REPERTOIRES 9:05 – 9:25 K. Plevová, MOLEKULÁRNÍ VLASTNOSTI IMUNOGLOBULINŮ A JEJICH VÝZNAM V KLONÁLNÍ EVOLUCI CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE 9:25 – 9:45 M. Jáchymová, GENETICKÉ ODCHYLKY GENU PRO KARDIÁLNÍ TROPONIN T TYP 2 (TNNT2) U PACIENTŮ S HYPERTROFICKOU A DILATAČNÍ KARDIOMYOPATIÍ 9:45 – 10:05 V. Brynychová, PROGNOSTICKÝ A PREDIKTIVNÍ VÝZNAM EXPRESNÍCH HLADIN GENŮ KIF14, PRC1 A CIT U NÁDORŮ PRSU A OVÁRIÍ 10:05 – 10:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Dalibor Blažek, Tomáš Stopka 10:30 – 10:50 J. Brtko, DÔSLEDKY INTERAKCIE NUKLEÁRNYCH RECEPTOROV/TRANSKRIPČNÝCH FAKTOROV S HORMÓNOM ŠTÍTNEJ ŽĽAZY, RETINOVÝMI KYSELINAMI A DIHYDROXYVITAMÍNOM D3 10:50 – 11:10 J. Lochmannová, ANALÝZA MUTACÍ V GENECH PRO MIKRORNA U PACIENTŮ S CHRONICKOU LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIÍ 11:10 – 11:30 J. Paceková, FUNKCIA PDR TRANSPORTÉROV V ZÁSTUPCOCH RODU TRICHODERMA SP. 11:30 – 11:45 P. Věchtová, WHERE DO THE HOLOKINETIC CHROMOSOMES STORE THEIR ,,JUNK” DNA? 11:45 – 12:00 O. Hurba, FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKA ALELICKÝCH VARIANT SLC2A9 A SLC22A12 V ČESKÉ POPULACI

23

PROGRA M

Středa 29. 8. 2012

PROGRA M

Sekce 9 – Proteomika a metabolomika / SÁL B Garant: Marek Šebela Předsedající – 1. část: Marek Šebela, Petr Tarkowski 8:30 – 8:35 Zahájení Marek Šebela 8:35 – 9:05 Z. Zdráhal, SLEDOVÁNÍ VLIVU INHIBITORŮ HISTONOVÝCH DEACETYLÁZ NA STAV HISTONOVÝCH ACETYLACÍ 9:05 – 9:25 P. Bouchal, MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY METASTAZOVÁNÍ U LOW-GRADE KARCINOMŮ PRSU: OD PROTEOMICKÉHO PROFILOVÁNÍ K FUNKČNÍ CHARAKTERIZACI 9:25 – 9:45 G. Rylová, PROTEOMICKÉ METODY K IDENTIFIKACI PROTINÁDOROVÝCH CÍLŮ 9:45 – 10:05 A. Kádek, PROTEOMICKÁ CHARAKTERIZACE MEMBRÁNOVÝCH MIKRODOMÉN LIDSKÝCH NK BUNĚK 10:05 – 10:30 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Marek Šebela, Petr Tarkowski 10:30 – 10:50 T. Adam, POUŽITÍ CÍLENÉ METABOLOMIKY V DIAGNOSTICE DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH PORUCH 10:50 – 11:10 P. Tarkowski, PROFILOVÁNÍ CYTOKININŮ POMOCÍ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ DETEKCÍ 11:10 – 11:30 M. Jágr, KOMPLEXNÍ PROTEOMICKÁ ANALÝZA DENTINU LIDSKÝCH ZUBŮ 11:30 – 12:00 D. Holub, HEPCIDIN – KLINICKÝ VÝZNAM A VÝVOJ METODY PRO STANOVENÍ V LIDSKÉM SÉRU

12:10 – 13:00 Plenární přednáška / SÁL A Předsedající: Lukáš Žídek

iloš V. Novotný: M EVOLUTION OF BIOANALYTICAL SCIENCE: A PERSONAL ACCOUNT FROM DIFFERENT PLACES AND POLITICAL SYSTEMS

13:00 – 14:00 Oběd

24

Garant: Eva Táborská Předsedající – 1. část: Eva Táborská, Daniel Rajdl 14:00 – 14:05 Zahájení Eva Táborská 14:05 – 14:35 P. Zbořil, VÝUKA BIOCHEMIE NA PŘÍRODOVĚDECKÉ FAKULTĚ MU, HISTORIE A SOUČASNOST 14:35 – 14:55 Z. Ďuračková, TRADÍCÍA ODOVZDÁVANIA INFORMÁCIÍ O VÝUČBE LEKÁRSKEJ CHÉMIE A BIOCHÉMIE NA LEKÁRSKYCH FAKULTÁCH V SR A ČR (VÝZNAM OSOBNOSTI UČITEĽA PRE ZAUJATIE ŠTUDENTA) 14:55 – 15:15 H. Paulová, VYUŽITÍ MULTIMEDIÁLNÍCH TECHNIK A INTERAKTIVNÍCH PŘÍSTUPŮ VE VÝUCE BIOCHEMIE NA LÉKAŘSKÉ FAKULTĚ MASARYKOVY UNIVERZITY 15:15 – 15:35 P. Kosina, INOVACE PŘEDMĚTŮ BIOCHEMIE A KLINICKÉ BIOCHEMIE V RÁMCI SPEKTRA OBORŮ LÉKAŘSKÉ FAKULTY A FAKULTY ZDRAVOTNICKÝCH VĚD SMĚREM K LEPŠÍMU UPLATNĚNÍ ABSOLVENTŮ V OBLASTI VĚDY, VÝZKUMU I PRAXE 15:35 – 16:00 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Zdeňka Ďuračková, Petr Zbořil 16:00 – 16:20 D. Rajdl, E-LEARNING V KLINICKÉ BIOCHEMII – SPÁSA NEBO CESTA DO ZÁHUBY? 16:20 – 16:40 H. Klímová, BIOCHEMIE VE VZDĚLÁVÁNÍ UČITELŮ NA PŘÍRODOVĚDECKÉ FAKULTĚ UNIVERZITY KARLOVY V PRAZE 16:40 – 17:00 I. Malbohan, VOLITELNÉ PŘEDMĚTY VE VÝUCE LÉKAŘSKÉ CHEMIE A BIOCHEMIE NA 1. LF UK V PRAZE 17:00 – 17:15 M. Petřivalský, INOVACE PRAKTICKÉ VÝUKY V RÁMCI STUDIA BIOCHEMIE NA UP V OLOMOUCI

Sekce 6 – Membránová biochemie a bioenergetika / SÁL B Garant: Josef Houštěk Předsedající – 1. část: Josef Houštěk, Peter Polčic 14:00 – 14:05 Zahájení Josef Houštěk 25

PROGRA M

Sekce 12 – Výuka biochemie / SÁL A

PROGRA M

14:05 – 14:35 J. Lukeš, EUKARYOTICKÝ ŽIVOT BEZ HEMU: PŘÍPAD AEROBNÍHO BIČÍKOVCE PHYTOMONAS 14:35 – 14:55 M. Valachovič, INVOLVEMENT OF YEAST ATP-BINDING CASSETTE TRANSPORTERS IN STEROL UTILIZATION 14:55 – 15:15 P. Polčic, ANALÝZA PROTEÍNOV Z RODINY BCL-2 V KVASINKÁCH SACCHAROMYCES CEREVISIAE 15:15 – 15:35 M. Pravenec, ENDONUKLEÁZA G – NOVÁ GENETICKÁ DETERMINANTA HYPERTROFIE LEVÉ SRDEČNÍ KOMORY A MITOCHONDRIÁLNÍCH FUNKCÍ 15:35 – 16:00 Kávová přestávka Předsedající – 2. část: Julius Lukeš, Zdeněk Drahota 16:00 – 16:20 T. Mráček, PRODUKCE REAKTIVNÍCH FOREM KYSLÍKU FLAVINOVÝMI DEHYDROGENÁZAMI MITOCHONDRIÁLNÍHO RESPIRAČNÍHO ŘETĚZCE 16:20 – 16:40 K. Hejzlarová, TMEM70 PROTEIN – LOKALIZACE A ORIENTACE VE VNITŘNÍ MITOCHONDRIÁLNÍ MEMBRÁNĚ 16:40 – 17:00 P. Pecina, KVANTITATIVNÍ A KVALITATIVNÍ ZMĚNY FUNKCE CYTOCHROM C OXIDÁZY VYVOLANÉ ABSENCÍ ASEMBLAČNÍHO FAKTORU SURF1 17:00 – 17:30 L. Stibůrek, MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZA YME1L KONTROLUJE AKUMULACI PODJEDNOTEK RESPIRAČNÍHO ŘETĚZCE A JE NEZBYTNÁ PRO MORFOGENEZI KRIST, REZISTENCI VŮČI APOPTÓZE A BUNĚČNOU PROLIFERACI

17:30

Závěr sjezdu / SÁL A

Vyhlášení ceny za nejlepší poster

Přednáškové prostory:

ÁL A = místnost 132 S SÁL B = místnost 205 SÁL C = místnost 206 26

27

28

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ Přednášky jsou seřazeny dle sekcí a programu. Postery jsou seřazeny dle prvního uvedeného autora.

Texty abstrakt neprošly jazykovou ani redakční úpravou.

29

PLE NÁ RNÍ PŘE D NÁ Š K Y

PLENÁRNÍ PŘEDNÁŠKA / SÁL A

Neděle 26. 8. 2012

18:00 Woods Roberts J., Grant O. C.,Tessier M. B., Davis R. T., Lachele Foley B.

VIRTUAL GLYCAN ARRAY SCREENING FOR SPECIFICITY PREDICTION: APPLICATION TO CARBOHYDRATE-BINDING PROTEINS AND ENZYMES School of Chemistry, National University of Ireland, Galway, Ireland; Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 315 Riverbend Road, Athens, GA 30602, USA [email protected] We report the creation and screening of a virtual library of 3D structures for the known human glycome (Glibrary-3D), comprising approximately 7000 N- and O-linked glycans, populating approximately 500,000 stable conformations. In addition, we introduce the technique of Computational Carbohydrate Grafting as an improvement over automated docking for the prediction of the 3D structures of protein – glycan complexes. Lastly, we demonstrate that screening the virtual glycan library with Computational Carbohydrate Grafting leads to correct predictions of substrate specificities for carbohydrate – binding proteins. This is illustrated for carbohydrate-binding proteins and enzymes.


Pondělí 27. 8. 2012

8:30 Friml Jiří

HOW CELLS MAKE A PLANT: ROLE FOR DIRECTIONAL AUXIN TRANSPORT Institute of Science and Technology Austria (IST Austria), , A – 3400 Klosterneuburg, Austria CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, 601 77 Brno, Czech Republic [email protected] In plants, more than in other eukaryotes, establishment of cell polarity is one of the major developmental themes. Even fully specified plant cells often retain potential to re-define their polarity which is utilized during tissue regeneration and multiple patterning events. The process of tissue polarization inevitably encompasses de novo specification of individual cell polarities in cells within a polarizing tissue. The connection between cellular polarizing events and macroscopic manifestation of polarity such as specification of different cell types along the axis, depend on an action of the signalling molecule auxin and its intercellular directional movement. Auxin is a prominent intercellular signal in plants and its polar cell-to-cell transport mediates local auxin gradients, which are required for various patterning processes including apical-basal axis formation, organogenesis and tropisms. The prominent molecular components of polar auxin transport are auxin efflux catalysts of the PIN family, each with specific polar, subcellular localization, which determines direction of auxin flow. Despite critical importance of polar PIN localisation for plant development, little is known about how it is decided to which side of cell PIN proteins will be (re)targeted. Available data suggest existence of sequence-specific polar targeting signals and cell type-specific determinants. Here we will present novel concepts behind cellular mechanisms for cell polarity establishment and maintenance as well as auxin-mediated development. The emerging data provide a conceptual framework explaining some of important mechanisms behind astonishing flexibility and adaptability so typical for plant development.

30

Středa 29. 8. 2012

12:10 Novotny Milos V.

EVOLUTION OF BIOANALYTICAL SCIENCE: A PERSONAL ACCOUNT FROM DIFFERENT PLACES AND POLITICAL SYSTEMS Department of Chemistry, Indiana University, Bloomington, IN, USA [email protected] All rapidly developing fields of life sciences feature a common trend: from empirical and descriptive biology toward an improved knowledge of molecular and dynamic processes. This trend, in turn, necessitates continuous development of new analytical methodologies with increasingly improved measurement sensitivity and resolution of complex mixtures of biological compounds. In a personal scientific Odyssey, spanning countries with different political systems and science funding mechanisms, chromatography and mass spectrometry have frequently provided a common denominator to research activities as diverse as the search for human disease biomarkers and chemical communication in mammals. At different times, unique instrumental designs of miniaturized chromatography and electrophoresis in the capillary format became essential to a search for organics on the surface of Mars, identification of the first mammalian primer pheromones, studies of lipid peroxidation in disease, and the use of proteomics and glycomics in the structural identification of potential cancer biomarkers. The unique strengths of academic environment at a major U.S. university have helped to build our research group, attracting talented researches at the national level and from abroad.

31

PLE NÁ RNÍ PŘE D NÁ Š K Y


PLE NÁ RNÍ PŘE D NÁ Š K Y – Vý he rce ce n y Jo s e fa V. Ko š tí ř e

VÝHERCE CENY Josefa V. Koštíře 2012 / SÁL A

Úterý 28. 8. 2012

12:10 Šulák Ondřej et al.

BURKHOLDERIA CENOCEPACIA A JEJÍ SUPERLEKTIN Národní Centrum pro Výzkum Biomolekul (NCBR), Přírodovědecká fakulta, Masarykova universita, Brno, Česká republika Centre de Recherches sur les Macromolecules Vegetales - Centre National de la Recherche Scientifique (CERMAV-CNRS), Université Joseph Fourier, Grenoble, France [email protected] Chronické plicní kolonizace podmíněnými patogeny, jako jsou například Pseudomonas aeruginosa nebo také bakterie komplexu Burkholderia cepacia (BCC), představují vysoké riziko u pacientů s cystickou fibrózou či chronickým granulomatózním onemocněním. Tyto bakterie produkují lektiny, které jim napomáhají při adhezi k povrchu hostitelské buňky a usnadňují tak jejich proniknutí do organismu. Práce se zabývá studiem mechanismů molekulárních interakcí mezi lektiny a jejich přirozenými ligandy. Burkholderia cenocepacia produkuje čtyři známé rozpustné lektiny, avšak prezentované studium bylo zaměřeno na charakterizaci pouze jednoho z nich, lektinu zvaného BC2L-C, který je tvořen dvěma oddělenými cukr-vazebnými doménami s odlišnou specifitou a biologickou aktivitou. Tento unikátní protein se váže na povrch bakterií C-terminální doménou prostřednictvím manosových či heptosových receptorů a umožňuje tím tvorbu mikrokolonií. N-terminální doména rozpoznává striktně fukosylované oligosacharidy prezentované na povrchu dýchacích cest a svojí strukturou se podobá proteinu TNF-α. Tato doména, stejně jako TNF-α, je schopna indukovat produkci IL-8 v kultivovaných epiteliálních buňkách dýchacích cest, z čehož vyplývá, že může hrát významnou roli v prozánětlivé odpovědi, která je pozorovaná právě u plicních infekcí B. cenocepacia. Díky zmíněným neobvyklým vlastnostem může být lektin BC2L-C klasifikován jako zcela nový superlektin, který pomocí své dvojí a zcela odlišné vazebné specifitě domén zprostředkovává interakci patogenu s hostitelem. Smyslem práce byla zejména snaha porozumět molekulárním mechanismům, které používají patogenní organismy vůči svému hostiteli, a které mohou být v budoucnu využity k návrhu účinných léčiv, a tudíž k efektivnější léčbě pacienta. O. Šulák, G. Cioci, M. Delia, M. Lahman, A. Varrot, A. Imberty and M. Wimmerová (2010): A TNF-like trimeric lectin domain from Burkholderia cenocepacia with specificity for fucosylated human histo-blood group antigens, Structure 18, 59–72. O. Šulák, G. Cioci, E. Lameigne`re, V. Balloy, A. Round, I. Gutsche, L. Malinovská,M. Chignard, P. Kosma, D.F. Aubert, C.L. Marolda, M. Valvano, M. Wimmerová, A. Imberty. (2011): Burkholderia Cenocepacia Bc2l-C Is A Super Lectin With Dual Specificity And Proinflammatory Activity, Plos Pathogens 7(9), e1002238

32

Úterý 28. 8. 2012

12:10 Fučíková Jitka, Králíková P., Fialová A., Brtnický T., Rob L., Bartůňková J., Špíšek R.

LIDSKÉ NÁDOROVÉ BUŇKY OŠETŘENÉ ANTRACYKLINY INDUKUJÍ PROTINÁDOROVĚ SPECIFICKOU IMUNITNÍ ODPOVĚĎ Ústav Imunologie, 2. LF FN Motol, Praha; Gynekologicko-porodnická klinika, 2 LF a FN Motol [email protected] Buněčná smrt indukovaná antracykliny je v současné době považována za imunogenní typ buněčné smrti. Imunogenní buněčná smrt je charakterizována expresí molekul teplotního šoku (HSP) a kalretikulinu. Tyto molekuly exprimované na povrchu nádorových buněk jsou následně schopné indukovat maturaci dendritických buněk a usnadňují tak prezentaci nádorových antigenů dendritickými buňkami dalším buňkám imunitního systému. Pozdně imunogenní marker buněčné smrti High mobility group box 1 (HMGB1), vážící se na toll-like receptor 4 (TLR4) na povrchu dendritických buněk, usnadňuje prezentaci antigenů nádorových buněk dendritickým buňkám. Všechny dosavadní studie sledující imunogenní buněčnou smrt byly provedeny na myších modelech. V naší práci sledujeme schopnost různých chemoterapeutik, včetně antracyklinů, indukovat imunogenní buněčnou smrt na ovariální (OV90), prostatické (DU145) a leukemické nádorové linii a primárních buňkách karcinomu ovaria a leukemických blastech pacientů s ALL. Dalším cílem práce bylo charakterizovat, zda jsou imunogenní buňky schopné indukovat ve zvýšené míře fagocytózu dendritickými buňkami a jejich aktivaci. Pouze dokonale aktivovaná dendritická buňka je schopná indukovat protinádorově specifickou imunitní odpověď. Z našich výsledků vyplývá, že pouze antracykliny indukují translokaci kalretikulinu, HSP70 a 90 na buněčný povrch a uvolnění molekuly HMGB1 po 12 hodinové expozici chemoterapeutiku, jak jsme dokázali pomocí průtokové cytometrie a konfokálního mikroskopu. Dále jsme dokázali, že dendritické buňky fagocytují ve zvýšené míře nádorové buňky ošetřené antracykliny, což přímo souvisí s expresí kalretikulinu na jejich buněčném povrchu. U dendritických buněk pulzovaných nádorovými buňkami ošetřenými antracykliny vidíme fenotypickou maturaci. Pro studium mechanismů interakce dendritických buněk pulzovaných nádorovými buňkami s autologními lymfocyty byla vybrána nádorová linie REH (ALL). Dendritické buňky pulzované nádorovými buňkami ošetřenými antracykliny aktivují nejvíce specifických T lymfocytů produkujících IFNγ a zároveň inhibují populaci imunosupresivních regulačních T lymfocytů. Tato data definují molekulární charakteristiku imunogenní buněčné smrti jako klíčového parametru protinádorové imunitní odpovědi a ukazují možnou strategii immunogenní chemoterapie u onkologických pacientů.

33

PLE NÁ RNÍ PŘE D NÁ Š K Y – Vý he rci ce n y A rn o l da Be ck m an a

VÝHERCI CENY Arnolda Beckmana 2012 / SÁL A


Nosková Lenka, Stránecký V., Hartmannová H., Přistoupilová A., Barešová V., Ivánek R., Hůlková H., Jahnová H.,van der Zee J., Staropoli JF., Sims KB., Tyynelä J., Van Broeckhoven Ch., Nijssen PCG., Mole SE., Elleder M. & Kmoch S.

MUTATIONS IN DNAJC5, ENCODING CYSTEINE-STRING PROTEIN ALPHA, CAUSE AUTOSOMAL-DOMINANT ADULT-ONSET NEURONAL CEROID LIPOFUSCINOSIS Institute for Inherited Metabolic Disorders, Prague; Department of Molecular Genetics, University of Antwerp; Department of Neurology, Harvard Medical School, Boston; Institute of Biomedicine and Developmental Biology, University of Helsinki; Department of Neurology, St. Elisabeth Hospital, Tilburg; MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London [email protected] Autosomal-dominant adult-onset neuronal ceroid lipofuscinosis (ANCL) is characterized by accumulation of autofluorescent storage material in neural tissues and neurodegeneration and has an age of onset in the third decade of life or later. The genetic and molecular basis of the disease has remained unknown for many years. We carried out linkage mapping, gene-expression analysis, exome sequencing, and candidate-gene sequencing in affected individuals from 20 families and/or individuals with simplex cases; we identified in five individuals one of two disease-causing mutations, c.346_348delCTC and c.344T>G, in DNAJC5 encoding cysteine-string protein alpha (CSPa). These mutations-causing a deletion, p.Leu116del, and an amino acid exchange, p.Leu115Arg, respectively-are located within the cysteine-string domain of the protein and affect both palmitoylation-dependent sorting and the amount of CSPa in neuronal cells. The resulting depletion of functional CSPa might cause in parallel the presynaptic dysfunction and the progressive neurodegeneration observed in affected individuals and lysosomal accumulation of misfolded and proteolysis-resistant proteins in the form of characteristic ceroid deposits in neurons. Our work represents an important step in the genetic dissection of a genetically heterogeneous group of ANCLs. It also confirms a neuroprotective role for CSPa in humans and demonstrates the need for detailed investigation of CSPa in the neuronal ceroid lipofuscinoses and other neurodegenerative diseases presenting with neuronal protein aggregation.

34

PROTEOMICS ON BREFELDIN A-TREATED ARABIDOPSIS ROOTS REVEALS PROFILIN 2 AS A NEW PROTEIN INVOLVED IN THE CROSS-TALK BETWEEN VESICULAR TRAFFICKING AND THE ACTIN CYTOSKELETON Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Department of Cell Biology, Faculty of Science, Palacký University Olomouc; Life Sciences & Biotechnology Institute, Mississippi State University, MS 39762, USA [email protected] Proteomic and cell biology approaches were applied to study effects of brefeldin A (BFA), an inhibitor of vesicle recycling and secretion, in Arabidopsis roots. The main aim of this study was to obtain an overview of proteins affected by BFA, but especially to identify new proteins involved in the vesicular trafficking and its cross-talk to the actin cytoskeleton. The results showed that BFA altered vesicular trafficking and caused the formation of BFA-compartments which was accompanied by differential expression of several proteins in root cells. Some of the BFA-upregulated proteins belong to the class of the vesicular trafficking proteins, such as V-ATPase and reversibly glycosylated polypeptide, while others, such as profilin 2 and elongation factor 1 alpha, are rather involved in the remodeling of the actin cytoskeleton. Upregulation of profilin 2 by BFA was verified by immunoblot and live imaging at subcellular level. The latter approach also revealed that profilin 2 accumulated in BFA-compartments which was accompanied by remodeling of the actin cytoskeleton in BFA-treated root cells. Thus, profilin 2 seems to be involved in the cross-talk between vesicular trafficking and the actin cytoskeleton, in a BFA-dependent manner. We conclude that BFA primarily affects several vesicular trafficking proteins and secondarily affects actin binding proteins such as profilin 2 and EF1-alpha. They might participate on the formation of vesicular BFA compartments in Arabidopsis root cells. Finally, we believe that the use of large-scale proteomic and cell biological techniques in combination with a well-defined chemical agent such as BFA is a very feasible tool to identify new proteins involved in vesicular secretion pathways and their cross-talks with the plant cytoskeleton. This work was supported by by grant Nr. ED0007/01/01 to Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Palacký University, Olomouc, Czech Republic.

35


Takáč Tomáš, Pechan T., Šamaj J.

36

PŘEDNÁŠKY

37

S E KCE 1 4 – S E KC E ML A D Ý C H

INTRAMOLECULAR AND INTERMOLECULAR GUANINE QUADRUPLEXES OF DNA IN AQUEOUS SALT AND ETHANOL SOLUTIONS Bednářová K., Vorlíčková M. Biofyzikální ústav, Akademie věd České republiky, v.v.i. [email protected] DNA is known to adopt various conformations distinctly different from the classical Watson-Crick double helix. One of the anomalous DNA structures is a guanine (G) quadruplex. The guanine quadruplexes are all based on stacks of guanine tetrads but they are of many types differing by mutual strand orientation, topology, position and architecture of loops, and number of DNA molecules constituting their structure. It is thought that potassium or other cations present in the cavity between consecutive guanine tetrads are an integral part of the quadruplexes. We show using CD spectroscopy that ethanol induces the guanine quadruplexes like or even better than potassium cations. We have studied a series of nine DNA fragments (G3Xn)3G3, where X = adenine, cytosine or thymine, and n = 1, 2 or 3, to find how the particular bases and their number enable folding of the molecule into quadruplex and what type of guadruplex is formed. We have presented examples of ethanol stabilizing guanine quadruplexes even in cases when potassium cations fail to do so. Ethanol is a more potent DNA guanine quadruplex inducer than are ions in water solutions. Moreover, aqueous ethanol may better simulate crowded conditions existing in vivo than the aqueous solutions.

ANALYSIS OF TOTAL POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS CONCENT IN ENVIRONMENTAL SAMPLES BY INDIRECT COMPETITIVE IMMUNOASSAY, RESULTS COMPARISON WITH GC-MS (ESI) ANALYSIS Frnková K., Skládal P., Přibyl J. CEITEC MU; Department of Biochemistry, Masaryk University, Kamenice 5, 62500 Brno [email protected] Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), in general, are ubiquitous environmental pollutants and are formed from both natural and anthropogenic sources (forest fires, volcanic eruptions, incomplete combustion of hydrocarbons). Benzo[a]pyrene (BAP) is the best known and most widely spread member of PAH family. The genotoxicity of PAHs is caused by cytochrome generation of epoxide and keto metabolites, which can be bound to the DNA structure and thus cause mutations. The indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay has been developed for determination of benzo[a]pyrene and structural similar polyaromates presented in environmentalsamples extracts. The 1-benzo[a] pyrenebutyric acid, 1-pyrenebutyric acid, benzo[a]pyrene-7,8-dion and benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide were used for a synthesis of antigens with a bovine serum albumin as a carrier protein. A specific mouse monoclonal antibody clone BAP-13 was used for an immunoassay, peroxidise-labeled anti-mouse antibody was employed for visualization of assay results. The method allows analyse polyaromate hydrocarbons (PAHs) in a concentration range 8 – 310 ng/ ml, depending on used protein conjugate immobilised on a microwell plate. Typical assay time is 2 hours, however, within this time 96 samples (including calibration) can be analyzed. For the assay the amount of PAH was dissolved in 10% N,N-dimethylformamide. Environmental extracts obtained by solvent extraction of air-filters were also routinely analysed using gass chromatography followed by mass spectra detection of electron inonisated analytes. Comparison of these methods provided linear dependency, thus showing ability of developed immunoanalytical method to be used in routine, time and cost effective analysis of environmental samples. Acknowledgment This work was supported by The Ministry of Education. Youth and Sport of Czech republic, grant no. NPVII, 2B06056 and by Masaryk University, Czech republic project no. MUNI/A/0928/2009.

38

Kříž M., Přibyl J., Skládal P. CEITEC MU; Department of Biochemistry, Masaryk University, Kamenice 5, 62500 Brno [email protected] Enzymatic electrochemical biosensors create the basis of the biosensor and biotechnological research. Various methods including physical chemisorption, LB films and polymer layer mediated adsorption have been employed for immobilization of enzyme layer on the biosensor surface. However, use of thiol monolayer is probably the most sophisticated method, leading to the formation of uniform monolayer effectively isolated from the denaturation caused by the direct contact with the metal surface. On the other hand, the compact layer of thiol chains leads, in the ideal case, to the complete electrical isolation of the working electrode. The presented work shows immobilization procedure leading to the generation of nanochannels between the thiol chains (distance of 8.6 to 10.7 Å). Thus created system effectively prevents the enzyme molecules from the denaturizing effect of the electrode surface combined with excellent penetration of the charge through the nanochannels in the thiol layer structure. Function effectivity of the nanochannels was tested using the electrochemical methods (cyclic voltammetry, chronoamperometry and stripping voltammetry). First, when no enzyme layer was attached to the head group of thiols, strong effect of the applied potential was found. This effect can be suppressed by the head group modification by either short chain compound or by enzyme molecule. The concept of the nanochannels was verified, when monolayer of glucoseoxidase was covalently bound to the head group of thiol compound. Effective distribution of hydrogen peroxide generated by enzymatic conversion of glucose was about two orders higher (measured as amperometric signal) comparing to the biosensor employing the compact layer of thiol chains. Acknowledgements The research was supported by OPVK grant no. CZ.1.07/2.3.00/09.0167 and by Masaryk University, Czech republic project no. MUNI/A/0928/2009.

INNOVATIVE PROCEDURE FOR SIMPLE AND EFFECTIVE SYNTHESIS OF BORONIC ACID PROTEIN CONJUGATES Novotná Š., Přibyl J., Skládal P. CEITEC MU; Department of Biochemistry, Masaryk University, Kamenice 5, 62500 Brno [email protected] Boronic acid is in science widely used in many chemical, biochemical, farmacia and medicinal areas. The high application have been found as receptors for the direct determination of nucleic acids, as well as of vitamins, polysaccharides, glycoproteins, glycated hemoglobin specifically. It is know to form reversible and covalent bond with compounds containing 1,2-diol or 1,3-diol grups (vicinal diol grups). This interaction takes place in an aqueous medium with high affinity. A prerequisite for quality analysis is choice of a suitable boric acid derivative, its a sufficiently strong immobilization, the subsequent affinity with sugars and finally selection the appropriate detection. In our research, we used 3-(bromomethyl)phenylboronic acid (BrPBA) [1]. The idea of its conjugation to protein molecules started thanks to a well-known Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction, but in our study it was used for entirely different purposes. BrPBA derivative was coupled to various carrier proteins and enzyme molecules, e.g. to bovine serum albumine (BSA) and horseradish peroxidase. Formation of conjugates was verified by MALDi-TOF technique, when the molecular mass after and before conjugation was compared. Conjugation efficiency was very high, more than 90% of amingroups in the BSA structure was occupied by phenylboronic functional groups. Affinity function of prepared conjugates was verified by modified ELISA method, when the BSA-BrPBA was immobilized on the microtitre plate surface and binding of glycated protein was monitored. The specifity of affinity interaction was verified, when sorbitol as competitive agent was added and the final signal was therefore lowered. Acknowledgements The research was supported by OPVK grant no. CZ.1.07/2.3.00/09.0167 and by Masaryk University project no. MUNI/A/0928/2009. [1] K.Ngamdee, T. Noipa, S. Martwiset, T. Tuntulani and W. Ngeontae, Sens. Actuators B :Chem., 2011, 160, 129-138

39


SURFACE IMMOBILIZED NANOCHANNELS FOR IMPROVED CONSTRUCTION OF BIOSENSORS


UTILIZATION OF WHEAT STRAW HYDROLYZATE TO PRODUCTION OF ENRICHED YEAST BIOMASS Petrik S., Hároniková A., Kádár Z., Thygesen A., Márová I. Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre [email protected] Wheat straw, as ubiquitous agricultural waste product, represents one of the most crucial sources for bioethanol production. Prior to use of this substrate for biofuels production, wheat straw must be first hydrothermaly pre-treated under high pressure and temperature. Using different process temperatures (190°C, 195°C and 200°C) it is obtained a large bulk of hydrolysate which is composed mainly of glucose and C5 sugars (xylose and arabinose). Due to relatively rich sugars composition, hydrolysate has potential to be used also as a nutrition stress for cultivating red yeast strains. During the cultivation, as a stress response, it can be obtained different group of metabolites, especially carotenoids, lipids and sterols. In this work three carotenogenic yeasts strains (S.roseus, R.glutinis, C.capitatum) were cultivated at optimal growth conditions (28°C, permanent lighting and shaking). Basic glucose medium was used as a control, and media with or without adaptation to hydrolysate substrate were used for metabolite production. Carotenoids, ergosterol and ubiquinone were analyzed by HPLC/PDA/MS/ESI. The production of biomass, when cultivated on hydrolysate, was slightly decreased in comparison with control medium, approximately 2-3 times with adaptation on hydrolysate, and more than 5 times without adaptation. The biggest individual production of b-carotene (1.5 mg/g d.w.) was obtained in S. roseus when cultivated on adapted hydrolysate medium (pre-treated at 190°C). Productions of primary metabolites, especially ergosterol, have been increased in all strains when cultivated on hydrolysates. Wheat straw hydrolysate, obtained after pre-treatment process, can be used for cultivating red yeast to production different valuable metabolites, and also to justified and neutralize energy loss during hydrothermal pre-treatment in pilot plant. Acknowledgements: This work was supported by projects FR2322/G4/2012 and CZ.1.05/2.1.00/01.0012/ERDF.

IMMUNOMODULATION – SELECTION OF INTRACELLULARLY ACTIVE AFFINITY BIOMOLECULES Zábrady M., Janda L. Functional Genomics and Proteomics of Plants, CEITEC-MU, Brno [email protected] Affinity biomolecules provide an excellent tool for modulation of function of extrinsic or intrinsic molecules within the living cell. Exploiting their ability to bind target molecules, we can influence various processes, from pathogen resistance to cell development. Strategy of elimination of protein function via immunomodulation provides eligible choice for complex redundant protein families, exhibiting complex interactions, often found in higher organisms. Phosphotransfer proteins of A. thaliana (AHP), involved in cytokinin signalling, are among them. Partial homology of protein sequence is theoretically enough to rise a poly-specific affinity biomolecule, binding all members of the protein family, thus eliminating their function. Effectivity and practical value of immunomodulation correlates with ability of selection of affinity biomolecules active within reducing environment of cytosol. This is the limitation of most commonly used in vitro selection techniques. Here we present a modular approach adapting well known in vivo techniques. Yeast two-hybrid (Y2H) assay exploits well established eukaryotic model with possibility of high-throughput screening from diverse sources of affinity biomolecules e.g. single-chain variable fragment (scFv) library. Ability to bind target molecule in vivo is represented by positive growth of transformed yeast, expressing active affinity biomolecule. Using this technique we have raised a scFv from Human single fold library (Tomlinson A+B), recognizing AHP3 and AHP2 proteins respectively. We have further adapted yeast three-hybrid (Y3H) assay, to imitate competition of affinity biomolecules with natural interaction partners of target molecule. Ability of formerly mentioned scFv to inhibit interactions of AHP3 and AHP2 protein with receiver domain of cytokinin independent histidine kinase (CKI1RD) was confirmed.

40

Maršálová L., Hynek R. Institute of Chemical Technology, Prague [email protected] Plasma membrane is one of the first cellular compartments exposed to the stressor. This membrane is the most diverse cellular membrane in terms of protein composition. The proteomic apparatus is the most influenced by stressor especially and mediates defense reaction as well. Study of integral membrane proteins (IMPs) is necessary for better understanding of physiological/pathological processes in cell. However, IMPs constitute analytical chalenge. Classical proteomic method like two-dimensional electrophoresis cann‘t be used because of its extreme hydrophobicity. This problem can be elegantly solved by using Mass Spectrometry after the specific cleavage in solution with the addition of organic solvent. This method achieves high resolution and sensitivity. Moreover Mass Spectrometry already provide the relative quantification using for example label-free methods or iTRAQ tags (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation). Another issue with IMPs is great complexity of the mixture in which its occur with a large number of hydrophilic impurities. IMPs are purified and fractionated at the same time by reversed-phase chromatography. The methodology described was used in preliminary experiment to study influence of herbicide isoxaben to IMPs expression levels in cell culture of Arabidopsis thalina. Plasma membranes were isolated and 103 proteins were identified, 34 of which were belonged to the IMPs. 42 proteins were quantified , 15 of which were belonged to the IMPs. Levels of some H(+)-ATPase and beta-1,3-glucosidase isoforms were increased the most. These proteins are closely related to synthesis of cell wall that is inhibited by isoxaben. Efficiency of quantification was verified by Western Blot with imunochemical detection with antibody againts H(+)-ATPase. Financial support from grant no. 203/09/0036 from Grant Agency of the Czech Republic and from specific university research (MSMT No 21/2012).

PROTEOMIC STUDY OF PATHOLOGICAL BIOMINERALIZATION OF AORTIC VALVES Coufalová L., Kučková Š., Velčovská M., Hynek R., Zeman A., Šmíd M. VŠCHT v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice 16628; 1. LF UK v Plzni, Husova 3, Plzeň 306 05; ÚTAM AV ČR, v. v. i.; Prosecká 809/76, Praha 9 190 00 [email protected] Aortal valves mineralization is often the cause of the aortic stenosis, which is the most often surgically treated heart disease. Aortic stenosis is abnormal narrowing of the aortic valve. When the degree of narrowing becomes significant enough to impede the flow of blood from the ventricle to the arteries, the heart problems started. The phosphates are accumulated in valve tissues during the mineralization, but the mechanism of this process is unclear. The main causes of phosphates formation are degenerative phosphor and calcium deposits forming around the valve. Clinical studies dealing with aortic stenosis mainly discuss the influence of osteopontin and osteoprotegerin on the depositing mechanism, but the whole process is still unexplained. One of the views concerning the mechanisms of vascular phosphatation is based on its association with osteogenesis. We applied the method of peptide mapping combined with mass spectrometry on explanted aortal valves mineralizations. The samples were digested by trypsin and subsequently analysed by LC-MS/ MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry/Mass Spectrometry). Approximately 200 proteins were identified – mostly proteins soluble in the blood and proteins that are directly related to the mineralization (e.g. osteopontin, alkaline phosphatase, biglycan). In the case of finding a higher incidence of osteopontin and alkaline phosphatase as a factor promoting bone growth, it is possible to argue about the possibility of mineralization valves in the same process as a bone growth. Developing strategies to capture the early stages of aortic valves mineralization on the molecular level could contribute to understanding this process, which could consequently lead to effective prevention as well as to new ways of treatment of this disease. Financial support from specific university research (MSMT No 21/12).

41


STUDY OF PLANT INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS AFFECTED BY ABIOTIC STRESSOR USING MASS SPECTROMETRY


PEPTIDE MASS MAPPING METHOD AS AN EFFECTIVE TOOL FOR THE ANALYSIS OF HISTORICAL MORTARS Crhová M., Kučková Š., Hynek R., Kodíček M. Institute of Chemical Technology in Prague, Department of Biochemistry and Microbiology, Prague [email protected] In the past, milk, eggs, blood, oils and other organic additives were added to mortars to improve their properties. By the end of the 19th century, under the pressure of the Industrial Revolution, the old recipes for mortar mixtures with organic additives were forgotten. In the present study, we used the peptide mass mapping method for the rediscovery of traditional procedures and the identification of the additives that could help in the restoration of historical buildings. We prepared eight model mortar samples containing common protein additives and used peptide mapping with mass spectrometry to test them. The model samples were analyzed fresh and after a year’s ageing. After one year, the weight of the analyze sample was ten times higher, but still only 50 mg, and the additive was precisely identified. The model mortar samples were reanalyzed after five years, with the weight of the samples now measuring 100 mg. Again, we were able to identify each used additive. According to these results, the peptide mass mapping method is suitable for the analyses of historical mortars. Financial support from the Czech Ministry of Education (grant number 6046137305) and specific university research (MSMT no. 21/2012) is kindly acknowledged.

HOW DOES BASIC DOMAIN OF GENOME GUARDING TELOMERIC PROTEIN AFFECT ITS DNA BINDING AFFINITY? Nečasová I., Zimmermann M., Hofr C. Functional genomics and proteomics, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Czech Republic; Central European Institute of Techology, Masaryk University, Žerotínovo nám. 9, 601 77 Brno, Czech Republic [email protected] Maintaining of the human genome integrity is ensured by telomeres – nucleoprotein complexes at the ends of chromosomes. Telomeres protect chromosomal DNA against unwanted repairs and shortening during cell division. Telomere length is closely related to cell aging and carcinogenesis. Understanding of the molecular mechanism of telomere length regulation might be useful for designing new strategies for cancer therapy and tissue regeneration. The specific proteins involved in the protection of chromosomes form a functional complex named shelterin. The central role in the shelterin is played by the protein – telomeric repeat binding factor 2 – TRF2, which binds double-stranded telomeric DNA1. The binding of the protein TRF2 to DNA is mediated by its C-terminal Myb domain. Our attention was focused on the N-terminal basic part of TRF22, which is assumed to participate in the binding to telomeric DNA as well. The DNA binding of the truncated protein variant of TRF2 without N-terminal domain was compared with binding of full length protein in order to describe the effect of the domain on DNA binding. The binding affinity and specificity of TRF2 to telomeric DNA was studied by combination of fluorescence anisotropy and isothermal titration calorimetry. These studies provided the first detailed quantitative description of the effect of individual domains of human TRF2 protein on its DNA binding affinity. The obtained results will be used to further characterize the interactions of shelterin proteins essential for the regulation of telomere length. This work was realized in CEITEC with support of European Regional Development Fund (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) and the Czech Science Foundation (P205/12/0550). We thank Prof. Titia de Lange (Rockefeller University) for providing us with the hTRF2 protein construct. LITERATURE 1. de Lange T.: Science 326, 948 – 952 (2009) 2. Pedroso I. M., Hayward W., Fletcher T. M.: Nucleic Acids Res. 37, 1541 – 1554 (2009)

42

Nováček J., Papoušková V., Haba N., Zawadzka-Kazimierczuk A., Koźmiński W., Chill J., Žídek L., Sklenář V. NCBR & CEITEC, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5/A4, CZ-62500 Brno, Czech Republic; Department of Chemistry, Bar Ilan University, Ramat Gan 52900, Israel; Faculty of Chemistry, University of Warsaw, Pasteura 2, 02093 Warsaw, Poland [email protected] Intrinsically disordered proteins (IDPs) comprise a considerable part of human proteome. Thanks to the technical and methodological advances in various biophysical techniques over the last decade, the studies of unstructured or partially disordered proteins or protein folding have become accessible for the systematic research. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a leading technique for characterization of IDPs at atomic resolution. However, even the NMR based studies of the IDPs are not trivial mainly due to the spectral overlap caused by high flexibility of the disordered polypeptide chain or the occurrence of the repetitive motifs in the primary sequence. We present an approach that combines several methods that significantly simplify and shorten both man and machine time needed for thorough description of disordered systems. As an inherently insensitive spectroscopic technique, NMR always struggles with long measurement times. This problem is even more pronounced when high-dimensional spectra are acquired. It will be shown that by exploitation of non-uniform sampling of indirectly detected dimensions and by longitudinal relaxation optimization, the acquisition of high quality 4D/5D experiment can be performed on the same time scale that is typical for standard 3D experiments used in biomolecular NMR nowadays. Further, the detection of the poorly resolved amide proton resonances is interchange for the direct detection of carbonyl signals, that provide higher chemical shift dispersion. The inherently lower sensitivity of the direct carbon detection is partially retrieved by a slower transverse relaxation of the IDPs. The combination of these approaches with suitable selection of the correlation scheme diminishes the spectral overlap dramatically and allows to map the transient secondary structure motifs along the peptide backbone.

EXPRESSION AND PRODUCTION OF HUMAN GLYCOSYLTRANSFERASES Jančaříková G., Tvaroška I., Vaněk O., Wimmerová M. NCBR and Department of Biochemistry, Faculty of Science, MU, Brno; CEITEC, MU, Brno; Institute of Chemistry, Slovak Academy of Science, Bratislava; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Prague [email protected] Saccharides play due to their wide variability of conformational alternatives a crucial role in many recognition events including pathogen-cell adhesion and recognition, signaling, inflammatory response and others [1]. They are ordinarily found as glycoconjugates which are often localized on the cell surface or in the extracellular space. They are synthesized by glycosyltransferases in a process called glycosylation – one of the most common and imporatant enzymatic reaction in nature. This project is focused on human N-acetylglucosaminyltransferases, which add N acetylglucosaminyl residues to substrate. These glycosylation events accompany many physiological and pathological cell processes [2]. The upregulation of these enzymes may lead to an aberrant glycosylation and pathological modifications. Increased amounts of Lewis X and sialyl Lewis X is typical for cancer cells and the interaction between tumor-associated sialyl Lewis X and the endothelial cells of target organs, is one of the first and crucial steps of the metastasis cascade [3]. Thus these enzymes represent a prime target for the design of glycosylation inhibitors with the potential to specifically alter the structure of cell surface glycoproteins. Still, the responsible GnTs are poorly understood, because these enzymes are unstable, often membrane-associated and present in the cell in very low concentration. The contribution is focused on production of GnTs in different heterologous expression systems. This work was supported by the project “CEITEC – Central European Institute of Technology” (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) from European Regional Development Fund and Czech Science Foundation (GD301/09/H004). Literature: 1) Thibodeaux Ch. J., Melançon 3rd Ch. E., Liu H.: Angew Chem Int Ed Engl, 47(51): 9814–9859 (2008). 2) Raab, M., Kozmon, S., Tvaroška, I.: Carbohydrate Research 340: 1051–1057 (2005). 3) Ohyama, Ch.: The Japan Society of Clinicla Oncology, 13: 308-313 (2008).

43


CARBON DETECTION, NON-UNIFORM SAMPLING AND HIGH DIMENSIONALITY AS MEANS OF IMPROVING RESOLUTION FOR ASSIGNMENT OF DISORDERED PROTEINS


CLONING AND CHARACTERIZATION OF NOVEL JACALIN-RELATED LECTIN FROM ASPERGILLUS FUMIGATUS Komárek J., Houser J., Imberty A. and Wimmerová M. National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Masaryk University, Brno; CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno; CERMAV-CNRS, Grenoble [email protected] Lectins are proteins or glycoproteins of non-immune origin which recognize and bind reversibly to diverse sugar structures. They are involved in recognition events in a variety of biological processes, such as regulation of cell cycle, targeting of cells, host-pathogen interactions, plant defense and cell differentiation. Jacalin-related proteins (JRPs) represent a family of lectins that are structurally related to jacalin, a well-known plant seed lectin [1] isolated from jack fruit. JRPs are widespread among plants, while only few members have been found in fungi so far [2,3]. Despite high sequence similarity among jacalin-related proteins, they differ from each other with respect to carbohydrate-binding preferences. Aspergillus fumigatus is an ubiquitous saprophytic mold and opportunistic human pathogen responsible for severe infections in cystic fibrosis and lung transplant patients. Inhalation of the spores from the environment can result in invasive fungal infections and represents a serious threat for immuno-compromised individuals. In A. fumigatus, lectins are supposed to provide a possible mechanism of attachment of conidia to host tissues and could be an important virulence factor. The project is focused on cloning and characterization of a hypothetical lectin AFL4 from ascomycete A. fumigatus which shares a sequence similarity with JRPs. The afl4 gene was amplified, cloned into a plasmid vector and expressed in bacterial expression system. AFL4 is currently experimentally studied and should be characterized from structure-function point of view. [1] Sankaranarayanan, R. et al. (1996) Nat Struct Biol 3(7):596603. [2] Nagata, Y. et al. (2005) Biosci Biotechnol Biochem 69(12):2374-80. [3] Suzuki et al. (2012) Glycobiology 22(5):616-29. This work has been supported by Czech Science Foundation (GA303/09/1168, GD301/09/H004) and CEITEC with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund.

ROLE OF ABCC1 GENE IN PROGRESSION AND THERAPY OUTCOME OF BREAST CANCER Kunická T., Václavíková R., Brynychová V., Hlaváč V., Pecha V., Trnková M., Vodička P., Souček P. Department of Toxicogenomics, National Institute of Public Health, Prague; 3rd Faculty of Medicine, Charles University, Prague; Oncosurgery, Medicon a.s., Prague; BioLab Ltd., Prague; Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences, Prague [email protected] Breast cancer is the most common malignancy affecting women worldwide. One of the major obstacles to successful chemotherapy is multidrug resistance caused by increased expression of ABC (ATP-binding cassette) transporters exporting wide range of xenobiotics including chemotherapeutics outside of cells. The aim of our study was to assess the genetic variability of one of the most studied representatives of ABC transporters ABCC1 (MRP1 = multidrug resistance protein 1) in 574 patients with breast cancer and to determine its mRNA expression in 50 patients undergoing preoperative chemotherapy. Gene expression was measured in preamplified cDNA samples of breast carcinoma patients using real-time PCR with relative quantification (used reference genes: EIF2B1, MRPL19, UBB and IPO8). Genetic variability was determined by direct sequencing and HRM (high resolution melting) analysis. All methods for determination of the genetic variability of ABCC1 were introduced and optimized in the course of this study. Thirteen SNPs (single nucleotide polymorphisms) in the functional NBD1 (nucleotide binding domain) of ABCC1 were followed. Higher ABCC1 expression in tumors than in non-neoplastic tissues was observed. No effect of ABCC1 on the response to preoperative chemotherapy was found. Association of SNPs with age and family history of breast or ovarian cancer was found indirectly indicating that the protective allele may cause later onset of the disease. A significant association of SNPs with prognostic factors as clinical stage or tumor size was found too. The results suggest a possible role of ABCC1 in carcinogenesis. Genetic variability in ABCC1 can affect prognosis of breast carcinoma patients. The use in clinical practice for more precise determination of patient’s prognosis and choice of therapy is envisaged in case we verify observed associations in an independent study. Study was supported by grants no.: CSF-P304/12/1585 and IGA-NT13679.

44

Lounková A., Trejbalová K., Geryk J., Šenigl F., Dráberová E., Hejnar J., Svoboda J. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i. [email protected] Rous sarcoma virus (RSV), an avian retrovirus, can transform mammalian cells. Although RSV-infected mammalian cells integrate the provirus into their genome (and become virogenic cells), there is no virus production. However, this block can be overcome by fusion of virogenic mammalian cells with permissive chicken fibroblasts. Our study is focused on molecular characterization of the described virus rescue. In our experiments, the transforming virus rescued from the virogenic hamster cells was detectable on the third or fourth day after the fusion. The specific viral envelope glycoprotein was identified by immunofluorescent labeling in 20 % of polykaryons on the second day after the fusion. In contrast, the glycoprotein was not detected in mononuclear cells. The amount of unspliced RNA, which serve as the template for translation of polyproteins Gag and Gag-Pol and also as genomic RNA, was clearly lower in virogenic hamster cells compared to infected avian cells, but did not change after the fusion. Spliced env mRNA synthesis was kept very low in virogenic cells, but increased ten times after the fusion. Measurement of cytoplasmic and nuclear fractions revealed less efficient RNA export of unspliced mRNA in virogenic cells than in the fused cells. Based on our results we suggest that, in contrast to the avian cells, the mammalian cells lack splicing factors necessary for the proper processing of env mRNA and factors responsible for the transport of unspliced viral RNA.

HMGB1 GENE KNOCKOUT IN MOUSE EMBRYONIC FIBROBLASTS RESULTS IN REDUCED TELOMERASE ACTIVITY AND TELOMERE DYSFUNCTION Polanská E., Dobšáková Z., Dvořáčková M., Fajkus J., Štros M. Laboratory of Analysis of Chromosomal Proteins, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno; CEITEC, Masaryk Univerzity, Brno [email protected] Telomere repeats are added onto chromosome ends by telomerase, consisting of two main core components: a catalytic protein subunit (TERT), and an RNA subunit (TR). Here, we report for the first time evidence that HMGB1 (a chromatin-associated protein in mammals, acting as a DNA chaperone in transcription, replication, recombination and repair) can modulate cellular activity of mammalian telomerase. Knockout of the HMGB1 gene (HMGB1 KO) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) results in chromosomal abnormalities, enhanced co-localization of gamma-H2AX foci at telomeres, and a moderate shortening of telomere lengths. HMGB1 KO MEFs also exhibit significantly (>5-fold) lower telomerase activity than the wild-type MEFs. Correspondingly, enhanced telomerase activity is observed upon over-expression of HMGB1 in MEFs. HMGB1 physically interacts with both mTERT and mTR, as well as with active telomerase complex in vitro. However, direct interaction of HMGB1 with telomerase is most likely not accountable for the observed higher telomerase activity in HMGB1-containing cells, as revealed from the inability of purified HMGB1 protein to stimulate telomerase activity in vitro. While no transcriptional silencing of mTERT is observed in HMGB1 KO MEFs, levels of mTR are diminished (∼3-fold), providing possible explanation for the observed lower telomerase activity in HMGB1 KO cells. Interestingly, knockout of the HMGB2 gene elevates telomerase activity (∼3-fold) in MEFs, suggesting that the two closely related proteins of the HMGB family, HMGB1 and HMGB2, have opposite effects on telomerase activity in the cell. The ability of HMGB1 to modulate cellular activity of telomerase and to maintain telomere integrity can help to understand some aspects of the protein involvement in chromosome stability and cancer.

45


FACTORS REQUIRED FOR REPLICATION OF AVIAN RETROVIRUS IN MAMMALIAN CELLS


THE THEORETICAL INVESTIGATION OF CHITIN NANOFIBRILS MECHANICAL PROPERTIES Střelcová Z. , Kulhánek P.,Friák M. , Neugebauer J., Koča J. CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Czech Republic; Max-Planck-Institut für Eisenforschung GmbH, Max-Planck-Straße 1, 402 37 Düsseldorf, Germany [email protected] The native biomaterials often show interesting properties, which are potentially transferable to newly designed and synthesized materials. Exoskeletons of art arthropod (crabs, lobsters, etc.) provide very compact, solid but also easily exchangeable material. It is well known that the arthropod shells are created from the chitin fibrils, proteins and calcite deposits. In this work, we were focused only on the chitin fibrils, which represent the main structural pattern in the shells.The theoretical description of the structural and mechanical properties of two well described forms of chitin forms (alphaand beta) were studied by molecular modeling techniques. The combination of molecular mechanics and potential of mean force methods were used to provide detailed insight into the fibrils dynamic and interactions with solvent molecules. Especially, the helical shape of the nanofibrils was further studied from energy point of view. Obtained results will be further used for the hierarchical modeling of the lobster shell.Acknowledgement:This work was realized in CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure is supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 financed from European Regional Development Fund. The research has been supported by the EU Seventh Framework Programme under the „Capacities“ specific programme (Contract No. 286154) (JK) and by the Grant Agency of Czech Republic (GD301/09/H0040) (ZS). The access to the MetaCentrum computing facilities provided under the program „Projects of Large Infrastructure for Research, Development, and Innovations“ LM2010005 funded by the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic is acknowledged.

TOWARDS THE STRUCTURE OF LYMPHOCYTE RECEPTOR HLLT1 Bláha J., Vaněk O., Novák P., Skálová T., Dohnálek J., Harlos K., Pachl P., Bezouška K. Department of Biochemistry,Charles University in Prague; Institute of Microbiology, AS CR, v.v.i., Prague; Institute of Macromolecular Chemistry AS CR, v.v.i., Prague; Division of Structural Biology, University of Oxford and Oxford Protein Production Facility, The Henry Wellcome Building for Genomic Medicine, Headington, Oxford; Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR v.v.i., Prague [email protected] Natural killer (NK) cells are an intensively studied part of immune system, possessing unique ability to recognize and induce death of tumor and virus-infected cells without prior antigen sensitization. Their function is regulated by a fine balance of signals induced by multiple activating and inhibitory cell surface receptors and their interaction with the ligands present on the target cell. Recent research in their C-type lectin-like receptors repertoire has shown that ligands of some of these previously orphan receptors lie within their own family, describing a lectin-lectin interaction. This is the case of human inhibitory receptor NKRP1 and its ligand LLT1. Previous studies have shown that overproduction of LLT1 in cancer cells or lower production of NKRP1 in NK cells is connected to cancerous manifestations. Here we show a successful recombinant expression and characterization of soluble LLT1 based on transient transfection of modified human embryonic kidney (HEK 293) cell line. Five cysteins contained within the C-type lectin like domain of LL1 tend to cause misfolding and formation of aggregates. Using a multiple alignment tool with similar proteins from this family we identified a conserved region in primary sequence where LLT1 lacks its sixth cystein residue. Utilizing a site directed mutagenesis approach we were able to stabilize this structure by addition of this “missing” residue. This led to significant improvement in yield and homogeneity of product that already enabled successful crystallization in two different crystalline forms and solution of the structure at 2.0 Å. Supported by grant from Ministry of Education of Czech Republic (1M0505), Czech Science Foundation (P302/11/0855), European Commission: project SPINE2Complexes and the Infrastructure for Protein Production Platforms (P-CUBE).

46

Darmostuk M., Rimpelova S., Kral V., Ruml T. Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Food and Biochemical Technology, Institute of Chemical Technology, Prague 6; Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Engineering, Institute of Chemical Technology, Prague 6 [email protected] Photodynamic therapy (PDT) is one of the most promising approaches in modern cancer treatment. PDT of such cancer diseases as squamous cell carcinoma, early carcinomas of the oral cavity etc. is used routinely in everyday clinical practice. There are many photosensitizers (PSs) available, but despite their certain advantages some of their properties such as side toxicity, low penetration ability or low blood solubility stimulate continual research and development of new PSs. We designed, synthetized and studied properties of four porphyrin derivatives: 5,10,15,20tetrakis-(4-methoxyphenyl)-porphyrin; 5,10,15,20- tetrakis-(4-carboxymethyloxyphenyl)-porphyrin; 5,10,15,20- tetrakis(pentaflourophenyl)-porphyrin and [5,10,15,20-tetrakis-(pentafluorophenyl)-porphinato]-nickel II. Using different in vitro tests, we studied these new PSs from the perspective of their possible use in PDT. We have found that our porphyrin derivatives do not exibit dark cytotoxicity for 3 cancer cell lines: HeLa, PC3, KU812 and 1 non-cancer cell line as a control – HEK293T in various time points up to 72 h after the exposure. Investigation of intracellular localization of porphyrin derivatives was then performed by live-cell fluorescent microscopy in real-time. The phototoxicity of porphyrin derivatives to cancer cell lines is now an ongoing study. In conclusion, the conducted studies indicate that porphyrin derivatives synthetized by our group do not reveal cytotoxicity in dark conditions in vitro. In case of appropriate phototoxic efficiency of porphyrins to cancer cells, we will continue the study target-specific porphyrin conjugates and strive to generate optimal PSs. Finacial support from specific university research (MSMT No 21/2012) and from garnt KAN200200651

CHARACTERIZATION AND CRYSTALLIZATION OF ANTI-CD3 ANTIBODY RECOMBINANT FRAGMENT Písačková J., Fábry M., Král V. and Řezáčová P. Institute of Molecular Genetics of the ASCR, v.v.i., Prague; Biochemistry Department, Faculty of Science, Charles University in Prague [email protected] Monoclonal antibody MEM-57 recognizes CD3 antigen expressed on peripheral blood T-lymphocytes. CD3 surface glycoprotein associates with T-cell receptor and is responsible for activation signal transduction [1]. Antibody MEM-57 can therefore be used in cancer therapy, especially in the format of a „Bispecific T-cell Engager“ (BiTE) [2]. Single–chain variable fragment of MEM–57 (scFv MEM-57), equipped with C-terminal c–myc tag and His-tag, was produced from a modified pET22b vector into the periplasmic space of E. coli BL21(DE3) using pelB leader sequence. Two-step purification protocol employing nickel chelation affinity chromatography and ion–exchange chromatography was developed to produce high yield of pure protein. The antigen binding activity of scFv MEM–57 was confirmed by flow cytometry. Structural information on scFv MEM–57 would be of help in attempts to humanize the antibody and crystallographic studies were thus initiated. This poster focuses mainly on the improvement of protein crystallizability by means of pre–crystallization analysis and on the methods for crystallization optimization. Size– exclusion chromatography, dynamic light scattering and differential scanning fluorimetry (DSF) [3] analyses were performed to seek for conditions optimal for protein stability during crystallization. The positive effect of the starting buffer composition was confirmed by the results of crystallization trials. Capillary crystallization, sitting-drop and hanging–drop vapor diffusion methods were used to prepare monocrystals of scFv MEM-57. 1. Cantrell, D., Annu Rev Immunol, 1996. 14: 259-74. 2. Wolf, E., Hofmeister, R., Kufer, P., Schlereth, B., Baeuerle, P. A., Drug Discov Today, 2005. 10(18): 1237-44. 3. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P., Anal Biochem, 2006. 357(2): 289-98.

47


IN VITRO STUDY OF NOVEL PORPHYRIN DERIVATIVES AS POTENTIAL PHOTOSENSITIZERS FOR CANCER TREATMENT AND IMAGING


CHARACTERIZATION OF THE ROLE OF RECQ4 IN HOMOLOGOUS RECOMBINATION Sedlackova H., Bartosova Z., Krejci L. Department of Biology, Masaryk University, Brno, Czech Republic [email protected] Rothmund-Thomson syndrome (RTS) is an autosomal recessive disorder characterized by growth deficiency, skin and skeletal abnormalities and predisposition to cancer. Mutations in the RECQ4 gene, one of the five members of the RecQ helicase family, have been identified in a subset of RTS patients. Although the domains of the RecQ4 protein are similar to other members of the RecQ helicase family, whether it possesses helicase activity is still not clear and also its exact function is unknown. Recent genetic data indicate that RecQ4 might play a very important role in DNA replication as well as repair via homologous recombination (HR). In support of this notion, we have identified new interactions with Mus81/Eme1 and Rad51 proteins and mapped the minimal interaction domains within RecQ4 required for these interactions. We also discovered the ability of RecQ4 and its truncations to stimulate endonuclease activity of Mus81/Eme1 complex on 3´flap DNA substrate. In addition, we identified a new DNA binding domain within the N-terminus of the RecQ4 protein. All of this data point to an important role of RecQ4 in regulation of recombination and replication. However, further studies are required for molecular characterization of these protein interactions and its role in RTS biology.

48

Homola J. Institute of Photonics and Electronics, Prague [email protected] Optical biosensors based on surface plasmon resonance (SPR) present the most advanced optical label-free biosensor technology. Since their conception in early 1980s, SPR biosensors have received a great deal of attention and made significant advances both in terms of technology and applications. SPR biosensors have enabled direct observation of molecular interactions and have become an important research tool in molecular biology. Although the majority of SPR biosensors developed up to now have been designed for laboratory use, in recent years we have witnessed an increasing effort towards development of portable SPR sensing devices for the detection of chemical and biological species in the field. This paper reviews selected recent advances in the field of SPR biosensing, focusing particularly on advances in the SPR method and instrumentation. These include development of high-performance SPR biosensors for field use based on a recently developed approach to spectroscopy of surface plasmons and development of high-throughput SPR sensors based on SPR imaging in the polarization contrast. We also explore the potential of SPR sensors to detect a low number of molecules by using plasmonic nanostructures or SPR sensors with a read-out area of microscopic dimensions. Amplification methods that enhance the SPR sensor response by attaching a molecular tag with gold nanoparticles to the previously captured analyte are also discussed. Finally, examples of SPR biosensors for detection of analytes related to medical diagnostics (protein and microRNA biomarkers), environmental monitoring (endocrine disrupting compounds), and food safety (drug residues, pathogens, toxins) are provided.

ELECTROCHEMISTRY OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS. CAN IT BE USEFUL FOR BIOCHEMISTS? Paleček E., Bartošík M., Černocká H., Ostatná V., Trefulka M. Institute of Biophysics, Acad. Sci. CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic [email protected] First papers on nucleic acid electrochemistry were published about 55 years ago [1]. At present electrochemistry of NAs and proteins are booming fields [2,3]. We developed a simple label-free method for voltammetric detection of methylated DNA. Constant current chronopotentiometric stripping (CPS) with mercury or solid amalgam electrodes produces electrocatalytic peaks (peak H) of peptides and proteins down to nanomolar concentrations [4-8]. Peak H is highly sensitive to changes in protein structures [4-6]. Using CPS and thiol-modified Hg electrodes we found excellent correlation with structural and stability data of wild type and mutant p53 tumor suppressor protein [4]. With the same electrochemical system we discriminated between sequence-specific and non-specific p53 binding to DNA. Electroactive labels, based on complexes of six-valent osmium with different nitrogenous ligands [Os(VI)L], can be introduced in oligosaccharides and in ribose residues at the 3’-end of RNA molecules [8-10], yielding different electrocatalytic signals and redox couples. Our work is aimed to glycoproteins involved in cancer. [1] E. Palecek, Naturwiss. 45 (1958) 186-187; E. Paleček, Nature 188 (1960) 656. [2] E. Paleček, M. Bartošík, Chem. Rev. (2012) DOI: 10.1021/cr200303p [3] S. Campuzano et al., Biosens. Bioelectron. 26 (2011) 3577 [4] E. Paleček, et al., J. Am. Chem. Soc. 133 (2011) 7190 [5] V. Ostatnáet al., J. Am. Chem. Soc. 132 (2010) 9408 [6] E. Paleček, V. Ostatná, Chem. Commun. (2009) 1685 [7] P. Jusková et al, Anal. Chem. 82 (2010) 2690 [8] E. Paleček, et al., Chem. Rec. 12 (2012) 27 [9] M. Trefulka et al, Electrochem. Commun. 12 (2010) 1760 [10] E. Paleček, M. Trefulka, Analyst 136 (2011) 321

49

S E KCE 1 – B IOE L E K T ROC H E M I E A B I OA NA L Y TI K A

SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSORS AND THEIR ANALYTICAL APPLICATIONS


MINIATURIZACE V BIOANALÝZE Foret F. Ústav analytické chemie AV ČR, v.v.i., Brno [email protected] With the accelerating progress in biology, medicine and related research fields there is a permanent need for better analytical tools. System miniaturization is often cited as a prerequisite for increased speed of analysis and reduced cost of reagents. Additionally, as the size of the analytical devices shrinks, physicochemical phenomena, unimportant on the macro scale, may become dominant, opening new possibilities for conducting analyses. Such systems, often micromachined by processes common in microelectronics, allow manipulation and detection of extremely small sample amounts including preconcentration, extraction, loading/mixing, and/or separation. On the other hand the shrinking size provides also lower sample loading capacity leading to the need of different designs for different types of analyses. Clearly, the single cell analysis will need a different approach than agricultural analysis. While traditional column based analytical systems will dominate the chemical analysis market in the foreseeable future, new tools are under development for expansion into new areas, especially in biology related research. This presentation will describe some of the new technology developments related to miniaturization, mass spectrometry coupling, sample enrichment and detection.

REAL-TIME CHARACTERISATION OF AFFINITY INTERACTIONS USING PIEZOELECTRIC AND SURFACE PLASMON RESONANCE BASED BIOSENSORS Skládal P. Department of Biochemistry, Masaryk University, Brno [email protected] Biosensors provide an attractive label-free approach for characterisation of affinity interactions in real time. One of the binding partners becomes immobilised on the sensitive part of the transducer – piezoelectric (PZ) and surface plasmon resonance (SPR) will be considered. The other partner in solution forms affinity complex and the resulting surface mass change is continuously followed. Piezoelectric resonators are based on a thin plate of quartz with metal electrodes, at resonance frequency the whole system functions as a microbalance (QCM). A portable compact system using active measurement as well as passive impedance scanning approach will be introduced. For SPR, interaction of reflected light beam with plasmons in the thin metal layer provides resonance minimum and its position allows to determine the bound biomolecules; portable Spreeta and standard Biacore systems will be mentioned and compared with the resonant mirror based system IAsys. The examples of application will include antibody – antigen studies (immunosensing of pesticide haptens, protein markers and microbial cells – Escherichia coli, Bacillus subtilis, Francisella tularensis), ligand – receptor (cryptogein and its membrane-based receptor) and hybridization of complementary strains of oligonucleotides (viral infection, effect of mutations). Furthermore, the biosensor techniques allow rapid and straightforward measurement of kinetic paramters (rate and equilibrium association and dissociation constants) for the studied binding process (screening of antibodies and other recombinant biomolecules), the relevant background and methodology will be described and the experience from participation on global affinity kinetics studies will be presented. Finally, the attractive single-molecule interactions and binding forces studied using modified tips of cantilevers from atomic force microscopy will be briefly mentioned.

50

Brabec V. Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Brno [email protected] The development of metal-based antitumor drugs has been stimulated by the clinical success of cisdiamminedichloridoplatinum(II) (cisplatin) and its analogues and by the clinical trials of other platinum complexes with activity against resistant tumors and reduced toxicity including orally available platinum drugs. The widespread clinical applications of cisplatin and its simple analogues have inspired the synthesis and investigation of numerous platinum compounds as potential drug candidates. In particular, there is much interest in expanding the tumors that can be treated, limiting side effects, and targeting the cancer cell population. Broadening the spectrum of antitumor drugs depends on understanding existing agents with a view toward developing new modes of attack. In other words, a better understanding of the processes underlying biological effects of existing drugs would guide the choice of new compounds for more effective therapies. It is therefore of great interest to understand details of molecular and biochemical mechanisms underlying the biological efficacy of the platinum and other transition metal compounds. There is a large body of experimental evidence that the success of platinum complexes in killing tumor cells results from their ability to form on DNA various types of covalent adducts so that the research of DNA interactions of metal-based antitumor drugs has predominated. This contribution will summarize current knowledge on DNA modifications by new platinum antitumor complexes, their recognition by specific proteins and repair. It will also provide a strong support for the view that platinum drugs which bind to DNA in a fundamentally different manner to that of “classical” cisplatin will have altered pharmacological properties. It will be also demonstrated that this concept has already led to the synthesis of several new unconventional platinum antitumor compounds that violate the original structure-activity relationships.

REGULATION OF MICROTUBULES IN ACTIVATED MAST CELLS Sulimenko V., Hájková Z., Černohorská M., Vinopal S., Dráberová E., Dráber P. Department of Biology of Cytoskeleton, Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague [email protected] Mast cells play a pivotal role in innate immunity, allergy and inflammation. They express plasma membrane-associated high-affinity IgE receptors (FceRIs), the aggregation of which by multivalent antigen-IgE complexes triggers mast cell activation resulting in degranulation and release of inflammatory mediators such as histamine, proteases, lipid mediators, and cytokines. Tyrosine kinases of the Src family play important roles in activated signaling pathways. Although FceRI aggregation leads to reorganization of microtubules and their accumulation in the cell periphery, the molecular mechanisms that control microtubule rearrangement after cell activation are poorly understood. Here we show that changes in cytosolic calcium concentration, controlled by store-operated calcium entry (SOCE), affected microtubule plus-end dynamics detected by plus-end tracking protein EB1 and led to generation of protrusions containing microtubules. Experiments with knock-down or reexpression of STIM1, the essential regulator of SOCE, confirmed the important role of STIM1 in this process. Changes in calcium concentration also modulated interactions of gamma-tubulin, the key player in microtubule nucleation, with gamma-tubulin complex proteins (GCPs) as well as with other proteins that are substrates for tyrosine kinases of the Src family. Combined data suggest that rearrangement of microtubules in activated mast cells depends on STIM1-induced SOCE, and that calcium plays an important role in the formation of microtubule protrusions in activated mast cells.

51


ANALYSIS OF DNA MODIFICATIONS BY PLATINUM COMPLEXES, RECOGNITION AND REPAIR OF THESE MODIFICATIONS. RELATIONSHIP TO ANTICANCER EFFECTS OF PLATINUM COMPLEXE


METODY ANALÝZY 5-METALCYTOZINŮ V NUKLEOVÝCH KYSELINÁCH Fulneček J. Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. [email protected] Cytoziny metylované na uhlíku v pozici 5 (mC) se vyskytují v RNA i DNA u prokaryot i eukaryot. Metylace cytozinů eukaryotické DNA se řadí mezi jednu z nejdůležitějších epigenetických modifikací, která je nepostradatelná pro správný vývoj jedince, je spojována s umlčováním genů, imprintingem a inaktivací chromozómu X. Pro pochopení role DNA metylace, jakož i diagnostiku souvisejících patologických změn je nezbytné mít k dispozici vhodné metody pro stanovení množství a distribuce mC. Metody stanovení mC lze rozdělit na sekvenčně nespecifické a specifické. Nespecifické metody lze použít pro analýzu různých typů modifikovaných bazí a jejich kvantifikaci v organizmu, orgánu či tkáni. Řadí se sem především metody chromatografické a imunologické. Mezi sekvenčně specifické metody se řadí restrikční analýza pomocí metylačně citlivých restrikčních endonukleáz a tzv. hydrogensiřičitanové genomové sekvenování (HGS). Působení hydrogensiřičitanu na jednovláknové molekuly nukleových kyselin způsobuje deaminaci cytozinů na uracily, avšak mC nereagují. Po modifikaci a amplifikaci se tedy na původních místech cytosinů objeví tyminy, na místech metylcytozinů cytoziny. Metoda HGS se stala standardem pro analýzu mC a byla dokonce použita i pro celogenomové stanovení pozic mC. Ukázalo se však, že naše DNA obsahuje nezanedbatelné množství 5-hydroxymetylcytozinů (hmC). Pomocí HGS však nelze mC a hmC rozlišit, následoval proto návrat ke specifickým protilátkám. V květnu byla představena slibná metoda, založená na specifické oxidaci hmC pomocí KRuO4 na 5-formylcytoziny, které se podobně jako cytoziny modifikují na uracily působením hydrogensiřičitanu. Pozice C, mC a hmC mohou být tedy odvozeny po porovnání výsledků HGS oxidovaného a neoxidovaného vzorku. Velkou nadějí pro stanovení pozic všech typů bazí v naší DNA, nejen těch šesti nejčetnějších, je vývoj nových metod sekvenování, jako například metoda přímého sekvenování jedné molekuly v reálném čase či sekvenování na nanopórech.

ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE KRÁTKÝCH OLIGODEOXYNUKLEOTIDŮ Trnková L., Pilařová I. Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita [email protected] Elektrochemickému výzkumu DNA a oligodeoxynukleotidů (ODN) je v poslední době věnována značná pozornost, jednak kvůli možnosti hlubšího pochopení jejich struktury a funkce na nabitých fázových rozhraních, jednak kvůli možnosti aplikace elektroanalytických metod v biomedicíně pro diagnostické účely. Výhodou elektroanalytického přístupu je jednodušší a levnější přístrojové vybavení, menší časová náročnost, schopnost automatizace, miniaturizace a paralelní analýzy více vzorků (senzorové pole); nevýhodou je v některých případech citlivost a selektivita, které lze u voltametrických metod zvýšit pomocí eliminační voltametrie (EVLS – Elimination Voltammetry with Linear Scan). EVLS je transformační procedura využívající rozdílné závislosti dílčích voltametrických proudů na rychlosti polarizace. Výsledkem eliminace nežádoucích a zachování žádoucích proudových složek je eliminační funkce vyjádřená jako lineární kombinace celkových voltametrických proudů naměřených při různých rychlostech polarizace. EVLS je schopna signifikantně zvýšit proudovou citlivost, separovat překrývající se voltametrické signály, odhalit minoritní procesy skryté v procesech majoritních, rozšířit potenciálové okno a přispět k řešení mechanismu elektrodových procesů. Je též schopna citlivě a velmi rychle odhalit adsorbovaný stav elektroaktivní částice (pík-protipík). EVLS byla úspěšně využita při analýze krátkých homo- a hetero-ODN. Kromě nonamerů, u kterých byly zjištěny sekvenčně dependentní závislosti redukčních signálů cytosinu a adeninu na rtuťové elektrodě, byly studovány heptametry, včetně velmi stabilního fragmentu DNA d(GCGAAGC). Bylo dokázáno, že EVLS ve spojení s adsorptivní rozpouštěcí technikou je vhodným elektroanalytickým nástrojem studia strukturních změn ODN na povrchu rtuťových a uhlíkových elektrod. Práce byla finančně podporována projekty:(a) CEITEC – Central European Institute of Technology Project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 a (b) OPVK (NanoBioMetalNet) CZ.1.07/2.4.00/31.0023.

52

Bartošík M., Campuzano S., Kuralay F., Wang J., Trefulka M., Fojta M., Paleček E. Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic; Masaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic; Department of Nanoengineering, UC San Diego, La Jolla, CA 92093, USA [email protected] There has been a considerable increase in number of publications dealing with nucleic acids electrochemistry in last years, focusing mostly on development of DNA hybridization biosensors [1]. Electrochemistry appears as a promising method for faster and cheaper detection and/or analysis of DNA sequences, providing low detection limits and options for construction of portable sensors. Electrochemistry could also find its use in a cancer research, for instance in DNA methylation studies or detection of microRNA. We present here our recent contributions to this field, including (a) a construction of nucleic acid biosensor for detection of pathogen E. coli in complex media - undiluted blood serum or urine - using sophisticated surface engineering for minimizing nonspecific adsorption [2]; (b) new electrochemical method for detection of methylcytosine in DNA [3]. The method is based on transformation of electrochemically reducible cytosine to nonreducible uracil after the DNA treatment with sodium bisulfite. On the other hand, methylcytosine, which is not deaminated, yields reduction signal; (c) a method for introducing an electroactive label complex of Os(VI) and nitrogenous ligand - into the ribose at the 3’-end of the nucleic acids for their sensitive detection [4]. [1] E. Paleček, M. Bartošík, Chem. Rev. 112 (2012) 3427. [2] S. Campuzano et al., Biosens. Bioelectron. 26 (2011) 3577. [3] M. Bartošík, M. Fojta, E. Paleček, Electrochim. Acta 78 (2012) 75. [4] M. Trefulka, M. Bartošík, E. Paleček, Electrochem. Commun. 12 (2010) 1760. Acknowledgments This work was supported by GACR P301/11/2055, MEYS CR ME09038, and RECAMO CZ.1.05/2.1.00/03.0101.

53


ELECTROCHEMICAL SENSING OF NUCLEIC ACIDS

S E KCE 2 – B IOINFORMA T I K A A VÝ P OČ E T NÍ B IO C HE M I E

MOLECULAR DYNAMICS SIMULATIONS OF NUCLEIC ACIDS AND THEIR APPLICATION TO RIBOSOMAL RNA Šponer, J. Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno; CEITEC, Masaryk University, Brno [email protected] Structure and dynamics are both critical to RNA‘s vital functions in biology. Numerous techniques can elucidate the structural dynamics of RNA, but computational approaches based on experimental data arguably hold the promise of providing the most detail. I will highlight areas wherein molecular dynamics (MD) simulations with explicit inclusion of solvent and ions are applied to RNA, particularly in relation to complementary experimental studies. MD relies on simplified atomistic, pairwise additive interaction potentials (force fields). Because of limited sampling, due to the finite accessible simulation time scale and the approximated force field, high-quality starting structures are required. Then, simulations can very efficiently complement structural biology and structural bioinformatics. Careful analysis of MD simulations can identify problematic aspects of an experimental RNA structure, unveil structural characteristics masked by experimental constraints, reveal functionally significant stochastic fluctuations and flexibility, evaluate the structural role of base mutations, modification and ionization, and predict important details of the solvent behavior, including the presence of tightly bound water molecules. In contrast, the reliable prediction of structure from sequence information is beyond the applicability of MD tools. The ultimate utility of computational studies in understanding RNA function thus requires that the results are neither blindly accepted nor flatly rejected, but rather considered in the context of all available experimental data, with great care given to assessing limitations through the available starting structures, force field approximations, and sampling limitations. I will illustrate the advantages and limitations of the MD technique on our recent studies of flexible regions of the large ribosomal subunit, namely the A-site finger (Helix 38), the GTP-ase associated center ribosomal RNA, and the L1 stalk RNA.

THEORETICAL STUDIES ON RNA Banáš P., Šponer J., Otyepka M. Regional Centre of Advanced Technologies and Materials, Department of Physical Chemistry, Faculty of Science, Palacky University Olomouc; Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno; Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno [email protected] The role of RNA in numerous biological processes, e.g. translation, gene regulation, RNA processing, and viral replication invokes a growing interest in detailed understanding of RNA function, structure, and conformational dynamics. Without any doubt, structure and dynamics are both critical to RNA’s functions in biology. The structural dynamics of RNA, can be elucidated by a broad variety of techniques but computational approaches based on experimental data provide some details that are not fully available by experimental techniques. When judiciously applied, the computational methods provide insights at atomic and sub-picoseconds resolution simultaneously. Molecular dynamics (MD) simulations can identify problematic aspects of experimental structures, reveal functionally significant stochastic fluctuations, predict the impact of base ionization on RNA structure and dynamics, and characterize solvent behavior. Combining simulations with quantum mechanical (QM) calculations in QM/MM approaches expands the repertoire of applications to mechanistic questions concerning the reaction chemistry of catalytic RNAs, or ribozymes. QM techniques can help to understand significance of intermolecular interactions, which stand behind rich architecture of RNA structures. In this contribution we will discuss applications, limitations and development of QM, QM/MM and MD methods to RNA. References: Banas P et al. J. Chem. Theor. Comput, 6 (12), 3836-3849, 2010 Banas P et al. J. Phys. Chem. B, 114 (26), 8701-8712, 2010 Banas P et al. Methods, 49(2), 202-216, 2009 Ditzler M et al. Acc. Chem. Res., 43(1), 40-47, 2010 Mlynsky V et al. J. Phys. Chem. B, 115(47), 13911-13924, 2011 Mlynsky V et al. J. Phys. Chem. B, 114(19), 6642-6652, 2010 Zgarbova M et al. J. Chem. Theory Comput., 7 (9), 2886-2902, 2011 Zgarbova M et al. J. Phys. Chem. A, 115(41), 11277-11292, 2011

54

Spiwok V. Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha [email protected] Pomocí simulace molekulové dynamiky je možné předpovídat zastoupení klíčových stavů studovaného systému, jako jsou například jednotlivé důležité konformace molekuly, meziprodukty chemické reakce nebo stavy během vzniku nekovalentního komplexu dvou molekul. Bohužel, řada procesů je příliš pomalá na to aby bylo možné je efektivně studovat pomocí simulací. Jedním z možných řešení je použití „hrubé síly“ ve formě vysoce výkonných superpočítačů, speciálního hardwaru nebo grid computing. Alternativou k těmto přístupům je vývoj nových metod, které zlepšují vzorkování studovaného systému během simulace. Před deseti lety byla Laiem a Parrinellme představena metoda zvaná metadynamika. Jejím principem je využití urychlovacího potenciálu, který je definován v prostoru několika kolektivních souřadnic. Tento potenciál se akumuluje v průběhu simulace a energeticky znevýhodňuje již navštívené stavy studovaného systému. Navíc tento potenciál umožňuje odhadnout plochu volné energie a tak odhadnou rovnovážné a rychlostní konstanty studovaných změn. Metadynamika byla úspěšně použita při modelování mechanismů reakcí, interakcí protein-ligand a protein-protein, při studiu fázových změn, sbalování proteinů a podobně. V této přednášce budou představeny příklady aplikace metadynamiky zaměření na konformační modelování různých tříd molekul. Naším zájmem jsou hlavně sacharidy, konkrétně konformační chování pyranosových kruhů. Konformační rovnováhy byly studovány u beta-D-glukopyranosy, alfa-N-acetylneuraminové kyseliny a alfa-L-iduronové kyseliny. Design kolektivních souřadnic představuje proces snížení dimense studovaného systému. Při studiu konformačního chování biomakromolekul je využívána řada lineárních i nelineárních metod snížení dimense. Těmito metodami je možné odhalit kolektivní pohyby biomolekuly. Proto jsme se rozhodli zvýšit vzorkování ve směrech takto získaných kolektivních pohybů pomocí metadynamiky.

MORPHOLOGY AND KINETICS OF SELF-ASSEMBLED PEPTIDE AGGREGATES USING COARSE GRAINED SIMULATIONS Vacha R., Bieler N.S., Knowles T.P.J., Frenkel D. CEITEC and NCBR, Masaryk University Brno, Kamenice 5, 625 00, Czech Republic; Department of Chemistry, University of Cambridge, Lensﬁeld Road, Cambridge, CB2 1EW, United Kingdom [email protected] Proteins can self-assemble into a wide variety of structures including both beneficial filaments and fibrils as well as harmful amyloid aggregates which have been associated with neurodegenerative diseases. The self-assembly of proteins is usually driven by interactions between hydrophobic parts of protein, which would be otherwise unfavorably exposed to water. In addition, there is a role of shape the protein and other interactions, which all together determine the final aggregated structure. We have developed a coarse grained model of prolate amphiphilic peptides and used computer simulations to reveal the equilibrium self-assembly structures. All structures predicted by our model were identified with an experimentally observed protein aggregates including barrels, vesicles, coiled-coils, and amyloid ribbons. Furthermore, we employed Dynamics Monte Carlo technique to study the nucleation and kinetics of amyloid formation. We established connection between kinetic parameters measured in macroscopic experiments and molecular properties of small oligomers. Moreover, we have calculated the free energy landscape of nucleus formation and show the composition of oligomers on the nucleation path. The obtained information could help the rational design of molecules influencing the amyloid oligomerization, which has been implicated to be responsible for the cellular toxicity.

55


URYCHLOVÁNÍ SIMULACÍ POMOCÍ METADYNAMIKY


PROTEIN/CARBOHYDRATE INTERACTIONS – HYDROGEN BONDING OR DISPERSION FORCES ? Koča, J., Kozmon, S., Matuška, R., Spiwok, V., Nečasová, I., Mishra, S., Komárek, J., Wimmerová,M. CEITEC – Central-European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, Czech Republic; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00, Brno, Czech Republic; Institute of Chemical Technology, Department of Biochemistry & Microbiology, Technická 5, 166 28, Praha, Czech Republic; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00, Brno, Czech Republic [email protected] We have more and more information indicating that protein-carbohydrate interactions are important for many biological processes including cell signaling and/or cell-cell adhesion. In order to be able to influence such key processes, e.g., by drugs, it is important to understand all details of this kind of interactions. Computational methods may help markedly within this respect. There are basically two types of intermolecular forces involved in protein-carbohydrate interactions. The first is represented by polar interactions mainly between the OH group of the carbohydrate and polar amino acid residues of the protein. As these interactions must compete with the interaction of the carbohydrate OH groups with water molecules in the bulk solvent, they are often enlarged by presence of ions as a bridge particle. The second key type of protein-carbohydrate interaction is based on the interaction of a carbohydrate’s apolar part with aromatic amino acid residues of the protein, known as the dispersion interaction or the CH/pi interaction. Structural database shows that that also this type of interaction is very important as a reasonable amount of protein-carbohydrate complexes is based on such kind of interaction. It is easy to prove that also this type of interaction is important. This fact follows from structural databases data, where a reasonable amount of protein-carbohydrate complexes is based on such kind of interaction. We will show in this lecture that dispersion interactions are, for some protein-carbohydrate complexes, the key interactions that can be surprisingly strong. This work was funded by the European Community’s Seventh Framework Programme under the European Regional Development Fund (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) and Capacities specific programme (286154)., and the Czech Science Foundation (GD301/09/H004). The project is also supported within the SoMoPro programme (project No. 2SGA2747). The authors would like to thank the Czech National Supercomputing Centre, MetaCentrum, for providing computational resources. Access to the MetaCentrum computing facilities is provided under the research intent MSM6383917201.

DIVAS: DOMAIN INTEGRITY VERIFICATION OF ALTERNATIVE SPLICING – A SERVER TO PREDICT THE VIABILITY OF AS VARIANTS Hegyi H. Inst. of Enzymology [email protected] Motivation: Most natural proteins contain only full-length globular domains due to error checking mechanisms such as ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation) and UPR (Unfolded Protein Response). These safeguarding mechanisms ensure that truncated globular domains generated by alternative splicing and occasionally by chromosomal translocations are degraded in the cell owing to prohibitively large, newly exposed hydrophobic surface, which is usually normally buried in the hydrophobic core of intact globular proteins/domains. Method: We have developed a web server largely based on this principle. We calculate the HASA Hydrophobic Accessible Surface Area for each sequentially truncated subdomain of the structural protein domain in question and combine the calculated values with parameters derived from protein disorder predictions in the vicinity of the truncation and other attributes such as the remaining length of the truncated globular domain. For predictions we use the domain boundaries defined by the SCOP domain database. We currently make predictions for those alternatively spliced (or generated by other natural or artificial processes such as genetic engineering) proteins only that have an at least 60% sequence identity with a structural domain with a deposited structure in the PDB database. We feed the available parameters into a neural network that makes a prediction for the viability of the protein in question. Results: We trained our neural network on data produced by the structural genomics initiatives deposited in TargetDB. While there is no doubt about the positive sequences with at least solubility achieved for them, the lack of a soluble protein does not fully guarantee that the existence of the protein in question has been hampered by the newly exposed hydrophobic surface. Nevertheless, the extreme values in this respect were taken as indicators of this phenomenon. We achieved ∼70% accuracy for our predictions.

56

Svobodová Vařeková R.1, Sehnal D.1, Pravda L.1, Ionescu C-M.1, Wimmerová M.1, Koča J.1 1 National Centre for Biomolecular Research and CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic, 625 00, CZ [email protected] Nowadays, huge amount of information about protein 3D structures is available. This amount of data provides the opportunity to analyze large sets of protein structural motifs like binding sites, secondary structure elements, cavities and tunnels. Such analyses can help to identify patterns in drug discovery, to understand the relationship between a protein’s structure and its function, to classify proteins and alike [1-2]. In order to extract as much information as possible from this data, new techniques and software tools are necessary. For example, fast approaches to find specific protein structural motifs and perform the multiple superimposition of them. We would like to present our newly developed set of software tools, which are able to do such analyses. First tool is MotiveExplorer, an utility for searching user defined structural motifs. The motifs can be described by a simple and robust language MotiveQuery. Next tool is SiteBinder [3], which is able to process hundreds of protein structural motifs in a very short time. The last is Mole [4], software for searching of tunnels in proteins, their characterization and visualization. All the software have intuitive and user friendly interfaces. We also demonstrate the applicability of these software tools in benchmarking and case studies, focused on biologically important proteins and protein motifs. Specifically, we use MotiveExplorer for finding of all zinc finger Cys2His2 central motifs, PA-IIL sugar binding sites and BH3 domains. Afterwards, we superimpose all these set of motifs by SiteBinder. Then, we show a performance of Mole on selected proteins, which are frequent targets for tunnel analysis. [1] Baran I, Svobodová Vařeková R, Parthasarathi L, Suchomel S, Casey F, Shields DC: Identification of potential small molecule peptidomimetics similar to motifs in proteins, J Chem Inf Model 2007, 47, 464-474. [2] Watson JD, Laskowski RA, Thornton JM: Predicting protein function from sequence and structural data, Curr Opin Struct Biol 2005, 15, 275-284. [3] Sehnal D, Svobodová Vařeková R, Huber HJ, Giedl S, Ionescu CM, Wimmerová M, Koča J: SiteBinder – an improved approach for comparing multiple protein structural motifs, J Chem Inf Model 2012, 52, 2, 343–359. [4] Berka K, Hanak O, Sehnal D, Banas P, Navratilova V, Jaiswal D, Ionescu C-M, Svobodova Varekova R, Koča J, Otyepka M: MOLEonline 2.0: Interactive Web-based Analysis of Biomacromolecular Channels. Nucleic Acid Research 2012, in press.

ROLE OF CHARGE TRANSFER IN THE ACTIVATION OF PRO-APOPTOTIC REGULATORS BAX AND BAK Ionescu C-M., Svobodová Vařeková R., Huber HJ., Koča J. National Centre for Biomolecular Research and CEITEC – Central European Institute for Technology, Masaryk University, Brno [email protected] The activation of the proteins Bak and Bax is essential for programmed cell death (apoptosis) [1]. When activated, Bax and Bak homo-oligomerize and form pores in the mitochondrial outer membrane, causing the release of proteins that execute cell death. Yet, it is unknown precisely how Bak and Bax activation leads to their oligomerization, and what biophysical processes lead to a change in their structure and function [2]. A better understanding of these processes would help to design better drugs for overcoming apoptosis resistance in cancer, or for mitigating hypersensitive apoptosis during neuro-degenerative and auto-immune diseases. We investigated the role of charge transfer for the process of Bak and Bax activation by employing a method to calculate atomic charges of quantum chemical quality in proteins [3]. We identified a charge transfer network that conveys activation information from the Bax activation site to the well distanced sites required for Bax oligomerization. Our results confirm ongoing speculations of allosteric sensing during Bax activation, and reveal that allosteric regulation in Bax is mediated by charge transfer. Moreover, we found that such a charge transfer network is also plausible in Bak. Finally, our charge profile analysis identified new structural elements in Bax and Bak that represent novel targets for modulating apoptosis. We discuss these results here, and show how a straightforward analysis based on atomic point charges can be correlated with biological investigations. [1] Chipuk JE, Green DR (2008) Trends Cell Biol 18: 157-164 [2] Westphal D, Dewson G, Czabotar PE, Kluck RM (2011) Biochim Biophys Acta 1813: 521-531 [3] Ionescu C-M, Svobodová Vařeková R, Prehn JHM, Huber HJ, Koča J (2012) PLoS Comp Biol – in press

57


SEARCHING, COMPARISON AND CHARACTERIZATION OF PROTEIN STRUCTURAL MOTIFS


PROTEIN ENGINNERING OF b-D-MANNOSIDASE Demo G., Horska V., Fliedrova B., Weignerova L. and Wimmerova M. CEITEC, Masaryk University, Brno ; NCBR, Faculty of Science, Masaryk University, Brno ; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University ; Institute of Microbiology, Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic [email protected] N-Acetyl-D-mannosamine (ManNAc) is often used as a precursor in the chemical or enzymatic synthesis of the neuraminic acids found in glycolipids and glycoproteins. ManNAc is also a synthetic intermediate for a number of carbohydrate-derived families of biologically active compounds and pharmaceutical candidates. The main goal of this work is to produce b-N-acetyl-mannosaminidase via mutagenesis of b-D-mannosidase and to employ it in enzymatic synthesis of compounds containing ManNAc. Computational approaches were selected as initial tools to design b-Dmannosidase mutants capable to hydrolyze ManNAc derivatives. We used the in-house developed program Triton1, which has implemented program packages for docking as well as in silico mutagenesis. We used saccharides consisting of b-D-ManNAc or b-D-mannose in different conformations as ligands for docking studies. In silico mutagenesis was performed from single to multiple point mutations and promising mutants are being produced in vitro to confirm the proposed change in their substrate specificity from b-D-mannose to b-D-ManNAc. In addition,the investigation of the hydrolysis mechanism in native and in mutated enzymes in silico is examined. The reaction mechanism of b-Dmannosidase is tested with the MOPAC2 system, which is based on semi-empirical quantum chemistry algorithms. We expect that analysis of this hydrolysis in silico allow us to select mutants capable to convert b-D-ManNAc containing substrates also in vitro. This work is supported by the Grant Agency of the Czech Republic (P207/10/0321, GA/305/09/H008) and CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund. REFERENCES: 1. Prokop M., et al.: Bioinformatics 24, 1955-1956 (2008) 2. MOPAC2009, Stewart J. J. P., Stewart Computational Chemistry, Colorado Springs, CO, USA (2008)

58

Weignerová L., Gažák R., Gerstorferová D., Marhol P., Fliedrová B., Halada P. Institute of Microbiology, Czech Academy of Sciences, Vídeňská 1083, CZ 142 20 Praha 4, Czech Republic [email protected] Numbers of biologically active natural products are glycosides. Often, the glycosidic residue is crucial for their activity, in other cases glycosylation only improves pharmacokinetic parameters.1,2 Recent developments in molecular glycobiology brought better understanding to the aglycone vs. glycoside activities.3 Enzymatic modification of these glycosides - both extension of the glycoside moiety and its selective trimming - is advantageous due to selectivity and mildness of the reaction conditions in the presence of reactive and sensitive, complex aglycones. Moreover, enzymatic reactions enable to use resulting products as “natural products”, e.g. in nutraceuticals. Selective trimming by glycosidases will be demonstrated on the large-scale production of the high-value nutraceutical flavonoid quercetin-3-bD-glucopyranoside (isoquercitrin) from rutin by using a-L-rhamnosidase. Resulting compound is valuable antioxidant and antiallergic substance. Another approach, e.g. selective enzymatic deracemization of silybin using lipases provided optically pure diastereomers that enable targeted pharmacological and biomedicinal studies. Silybin and its derivatives experience now a boom both in science (over 100 papers/y.) and in novel medicinal applications as, e. g., prostate cancer treatment, liver regeneration and some others. Acknowledgements This work was supported by the grants from the Czech Ministry of Education LC06010, OC09045 and Czech Science Foundation P301/11/0662 and FP7 project NOVOSIDES. 1 V. Křen, L. Martínková: Glycosides in medicine: „The role of glycosidic residue in biological activity“. Curr. Med. Chem. Rev. 8, 1313–1338 (2001). 2 V. Křen: Glycoside vs. aglycon “The role of glycosidic residue in biological activity”, Fraser-Reid ed. Glycoscience, Springer, 2008. 3 V. Křen, T. Řezanka: Sweet antibiotics – the role of glycosidic residues in antibiotic and antitumor activity and their randomization. FEMS Microbiol. Reviews 32, 858-889 (2008)

BIOSYNTÉZA MANUMYCINOVÝCH ANTIBIOTIK U STREPTOMYCET Petříčková K., Pospíšil S., Rampírová P., Tylová T., Kuzma M., Petříček M. Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i., Praha [email protected] Manumycinová antibiotika jsou polyketidové sekundární metabolity streptomycet se slabým antimikrobiálním účinkem. Mají však řadu dalších biologických aktivit, z nichž nejvýznamnější jsou účinky antiproliferativní a protizánětlivé. Molekulární podstatou obou aktivit je enzymová inhibice několika významných složek eukaryotických regulačních drah – farnesyltransferasy buněčného RASu, kaspasy 1 a proteinkinasy IKK beta. Hlavní determinantou obou těchto aktivit je přitom struktura jednoho ze dvou polyketidových řetězců manumycinu (tzv. horního). V závislosti na ní se některé manumyciny chovají spíše kancerostaticky, zatímco jiné jsou spíše protizánětlivé a imunomodulační. Variabilita horního řetězce je dána substrátovou specifitou polyketidsyntasových (PKS) komplexů jednotlivých producentů a částečně také jejich interakcí s jinými polyketidsyntasami a syntasami mastných kyselin. Do jisté míry ji lze ovlivnit technikami genového inženýrství (disrupce genů pro složky PKS, výměny složek PKS mezi jednotlivými producenty apod.), přenosem kompletních genových biosyntetických shluků do specializovaných heterologních produkčních streptomycet, a též pomocí suplementace rekombinantních kmenů alternativními prekurzory polyketidových řetězců. V naší laboratoři jsme izolovali a charakterizovali biosyntetické shluky ze 4 producentů manumycinových látek a upřesnili jsme mechanismus některých biosyntetických kroků v dráze biosyntézy manumycinů. Tyto znalosti jsou pak základem pro tvorbu rekombinantních produkčních kmenů pro biosyntézu nových hybridních manumycinů. Protizánětlivá aktivita nových látek a jejich cytotoxicita je pak obvykle testována na kulturách aktivovaných lidských makrofágů s cílem vybrat nejlepší aktivní molekuly pro budoucí preklinické farmakologické testy. Pro svou obecně nízkou cytotoxicitu by manumyciny mohly v budoucnu najít využití jako farmaka pro léčbu chronického i akutního zánětu.

59

S E KCE 3 – B IOTE C HNOL OG I E

ENZYMATIC MODIFICATIONS OF BIOTECHNOLOGICALLY IMPORTANT NATURAL PRODUCTS


VYUŽITIE PICHIA PASTORIS PRE HETEROLOGICKÚ EXPRESIU PROBLEMATICKÝCH PROTEINOV Turňa J., Krahulec J., Stuchlík S., Dianovská D., Jiríčková K., Halászová H., Kandričáková M. Univerzita Komenského v Bratislave, Prirodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, 842 15 Bratislava, Slovensko [email protected] Biotechnologická produkcia, ale aj základný výskum funkcie peptidov a bielkovín je dnes nepredstaviteľný bez využitia expresných systémov, v ktorých je možné zvýšiť ich hladinu často aj o niekoľko rádov. Spravidla sa pri takejto expresii okrem samotného štrukturálneho génu využíva fúzia s takými funkčnými motívmi, ktoré zásadným spôsobom zefektívnia nasledovnú purifikáciu cieľového proteínu. Historicky najúspešnejším expresným systémom je bez pochýb hostiteľ Escherichia coli s celou výbavou vlastných, polosyntetických a fágových promótorov. Naše pracovisko má viac ako 25 rokov skúseností s využitím heterologickej expresie v E. coli. V tomto príspevku uvádzame práve prípady, kedy použitie hostiteľa E. coli nie je vhodné, alebo je dokonca nemožné. Použitie expresného systému Pichia pastoris rieši väčšinu problémov pre ktoré expresia v E. coli nie je vhodná. Metylotrofná kvasinka Pichia pastoris je jeden z najefektívnejších a najvšestrannejších systémov na produkciu heterologických proteínov. Typickým prípadom problemových proteinov pre expresiu v E. coli sú proteázy. Bližšie uvedieme riešenie expresie metaloproteázy hadieho jedu – ekarinu a vysokošpecifickej proteázy - enterokinázy. V ďalšom expresiu ľudského rastového hormónu – somatotropínu. V závere zhodnotíme výhody, ale aj úskalia využitia expresného systému Pichia pastoris. Príspevok je výsledkom realizácie projektu: “Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov (BIOREKPROT, ITMS 26240220048)“ na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

OPTIMIZATION OF EXPRESSION AND CLEAVAGE CONDITIONS OF HUMAN GROWTH HORMONE FUSION PROTEIN Levarski, Z., Wetzler, P., Krahulec, J., Jiričková, K., Dianovská, D., Bocánová, L., Stuchlík, S., Turňa, J. Katedra molekulárnej biológie, Príirodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave [email protected] Human growth hormone (hGH) was one of the first recombinant proteins approved for the treatment of human growth disorders. Its size of only 191 amino acids, presence of only 2 disulphide bonds and absence of posttranslational modifications make Escherichia coli a host of choice for both small and large scale production. By the application of rational design, we have developed an effective T7 expression system utilizing arabinose as an inducer. In this work, we present the results of optimization of cultivation and recombinant protein expression conditions with the focus on medium composition, cultivation temperature, concentration of expression inducer and induction time. After the product has been purified using affinity chromatography, we have assayed optimal conditions of proteolytic cleavage conditions yielding native form of human growth hormone. This work is the result of the project implementation: “Production of biologically active agents based on recombinant proteins“ (ITMS 26240220048) supported by the Research and Development Operational Program funded by the ERDF.

60

Ulbrich P., Füzik T., Píchalová R., Voráčková I., Rumlová M., Bharat T., deMarco A., Davey N., Riches J., Sachse C., Briggs J. a Ruml T. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, Praha 6; Ústav organické chemie a biochemie & Gilead Research Centre, Flemingovo nám. 2, Praha 6; Evropská molekulárně biologická laboratoř, Heidelberg, Německo. [email protected] Potlačení či zabránění infekcí způsobených retroviry je založené většinou na inhibici vybraných kroků jejich životního cyklu, zejména reversní transkripce či působení retrovirové proteasy. V poslední době se však pozornost zaměřuje i na zabránění tvorby retrovirové částice. Proto je detailní pochopení a studium tohoto procesu zásadní pro cílený návrh terapeuticky účinných inhibitorů. Ze strukturního retrovirového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV) jsme připravili in vitro dostatečné množství nezralých retrovirových částic pro studium jejich uspořádání a struktury. Pomocí mikroskopie atomárních sil, kryo-elektronové mikroskopie a tomografie jsme prokázali, že nezralé retrovirové částice nejsou ikosahedrální, jako je tomu u většiny jiných virů, ale jsou to nekompletní sféry, v nichž jsou strukturní proteiny uspořádány do hexagonální sítě, přerušované prasklinami a mezerami. Díky možnosti měnit tvar připravených částic, aniž by v nich docházelo ke změnám protein-proteinových interakcí, jsme připravili i pravidelné helikální tubuly M-PMV, výhodné pro analýzu s mnohem vyšším rozlišením než u sférické částice. Byla určena struktura nezralé retrovirové částice s 8 Å rozlišením, což umožnilo použití struktur proteinů M-PMV a HIV ke stanovení jejich přesného uspořádání v částici. Vzhledem k vysoké homologii retrovirových strukturních proteinů, je tento model obecně platný a lze jej použít k nalezení oblastí kritických pro protein-proteinové interakce a předpovězení strukturních změn, ke kterým dochází v průběhu zrání retrovirové částice, a které by mohly být cílem pro inhibici skládání retrovirů. Zabývali jsme se nejen strukturou nezralých retrovirových částic, ale i možností jejich využití při imunizacích, kdy je antigen exponován na povrchu retrovirové částice, či jako dopravního systému, kdy je na povrchu částice nesen epitop nezbytný pro interakci s cílovými buňkami a v částici může být inkorporován libovolný polyanion. Podpořeno grantem GAČR P302/12/1895.

INCREASING AFFINITY BETWEEN INTERFERON GAMMA AND ITS RECEPTOR BY COMPUTER DESIGN OF RECEPTOR MUTATIONS Mikulecký P., Černý J., Biedermannová L., Šebo P., Schneider B. Institute of Biotechnology AS CR, Vídeňská 1083, CZ-142 20 Prague, Czech Republic [email protected] Rational design of receptor molecules with purpose-modified functions remains a challenge. Here we chose to mutate the interferon gamma receptor 1, IFNgR1 to increase its affinity towards interferon gamma (IFNg) using computer modeling and checked suggested mutants by measurements of their affinity. We selected the IFNg/receptor system as a model because it is important for innate and acquired immunity in vertebrates and its targeted modification can lead to practical applications. We performed in silico mutation analysis of the interface between IFNg and IFNgR1; initial structural data are based on crystal structures of the complex. Each receptor residue interacting with IFNg was mutated by all remaining nineteen amino acids using empirical force field as implemented in FoldX (http://foldx.crg. es/). The calculations lead to predictions of fourteen receptor mutants that should strengthen the interaction. To check non-random nature of the alleged improvement of the binding we also selected three mutations that should lower the affinity. All seventeen in silico-designed mutants of IFNgR1 were successfully expressed and their affinities to IFNg determined by surface plasmon resonance. Of the selected positive mutants, four have slightly better affinity to IFNg than the wild type receptor and two have their affinity increased significantly. Therefore, our results indicate that rational design of mutations of proteins based on relatively simple and cheap computer models can predict mutations critical for influencing the interaction in the desired direction. Such an approach can lead to creating mutants useful for better understanding of protein-protein interactions and may also have practical use in detection of IFNg. Acknowledgements. Support from grant P305/10/2184 from the Czech Science Foundation and institutional grant AV0Z50520701 are greatly acknowledged.

61


STUDIUM STRUKTURY NEZRALÉ RETROVIROVÉ ČÁSTICE


NOVEL HIGH-AFFINITY BINDERS OF HUMAN INTERFERON GAMMA DERIVED FROM ALBUMIN-BINDING DOMAIN OF PROTEIN G Kuchař M., Jawid N. A., Osička R., Biedermannová L., Černý J., Šípová H., Homola J., Šebo P. and Malý P. Institute of Biotechnology AS CR, v.v.i., Prague; Institute of Microbiology AS CR, v.v.i., Prague; Institute of Photonics and Electronics AS CR, v.v.i., Prague. [email protected] Recombinant ligands derived from small protein scaffolds show promise as robust research and diagnostic reagents and next generation protein therapeutics. Here we derived high-affinity binders of human interferon gamma (hIFN-g) from the three helix bundle scaffold of the albumin-binding domain (ABD) of protein G from Streptococcus G148. Computational interaction energy mapping, solvent accessibility assessment and in silico alanine scanning identified 11 residues from the albumin-binding surface of ABD as suitable for randomization. A corresponding combinatorial ABD scaffold library was synthesized and screened for hIFN-g binders using in vitro ribosome display selection, to yield recombinant binders that exhibited Kd values for hIFN-g from 0.2 to 10 nM. Molecular modeling, computational docking onto hIFN-g and in vitro competition for hIFN-g binding revealed that four of the best ABD-derived ligands shared a common binding surface on hIFN-g, which differed from the site of human IFN-g receptor 1 binding. These hIFN-g binders thus provide a proof of concept for design of novel recombinant binding proteins derived from the ABD scaffold.

POLY-L-LYSINE BASED SURFACE CHEMISTRIES FOR PROTEIN AND CELL IMMOBILIZATION Bocková M., Homola J. Institute of Photonics and Electronics AS CR v. v. i., Praha [email protected] Immobilization of functional molecules on the surface of a sensor presents a crucial step in the development of an affinity biosensor with direct impact on performance characteristics of the sensor such as sensitivity, specificity and limit of detection. In this work, the immobilization of proteins and cells onto NH2-rich poly-L-lysine surfaces is investigated and evaluated using the surface plasmon resonance (SPR) biosensor technology. The poly-L-lysine polymeric layer provides well-defined surface structure and biocompatible properties and is used as a foundation layer for the immobilization of proteins and cells. In this work, a single layer structure or a three-layer sandwich-type structure were prepared and combined with the electrostatic and covalent binding of respective proteins and cells. The polyL-lysine approach was employed for the immobilization of model proteins and cells, such as antibody against the human chorionic gonadotropin or normal rat kidney epithelial cells, respectively. The resulting protein/cell assemblies were characterized using a four-channel SPR biosensor with wavelength modulation. Performance of the protein/cell coatings is evaluated in terms of sensitivity, specificity and level of non-specific adsorption using an SPR biosensor and compared to the performance obtained using the immobilization to the NH2-rich amine terminated self-assembled monolayers.

62

Staněk O., Majlessi L., Linhartová I., Leclerc C., Šebo P. Mikrobiologický ústav AV ČR , v.v.i., 142 20 Praha 4, Česká republika ; Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha, 166 28 Praha 6, Česká republika; Unité de Régulation Immunitaire et Vaccinologie, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U883, 75724 Paris Cedex 15, France; [email protected] Pro mnoho vakcinačních, imunoterapeutických a částečně také diagnostických aplikací je velmi důležité indukovat specifickou imunitu zprostředkovanou a T lymfocyty. To stále ale představuje technický problém. Prezentace antigenu (Ag) specifickým T-lymfocytům totiž závisí na způsobu doručení Ag do antigen presentujících buněk (APC). Pro prezentaci epitopů na MHC II molekulách specifickým CD4+ Th buňkám je žádoucí doručení Ag do endosomu APC, zatímco epitopů na MHC I molekulách cytotoxickým CD8+ T lymfocytům (CTL) vyžaduje doručení Ag do křížověprezentující organely nebo cytosolu APC. Nově jsme pro tyto účely vyvinuli alternativní a vysoce flexibilní systém, který umožňuje cílení Ag do APC přes různé povrchové receptory. Nejdříve jsou geny pro antigeny fúzovány se čtecím rámcem kódujícím streptavidin (SA) a z hybridního genu je pak exprimován fuzní Ag-SA nebo SA-Ag protein jako tetramer s velmi vysokou afinitou k biotinu. K zacílení do různých subtypů APC jsou pak připraveny komplexy Ag-SA s biotinylovanými monoklonálními protilátkami (biot.mAb) specificky rozeznávajícími povrchové receptory APC. Pro ověření účinnosti vyvinutého systému byly použity epitopy ze slepičího ovalbuminu a mykobakteriální antigeny CFP-10, ESAT-6 a Tb10.4, které byly geneticky připojeny na N- nebo C-konec streptavidinu. Ag-SA nebo SA-Ag proteiny byly produkovány a izolovány jako rozpustný tetramer, který byl následně smíchán s biot.mAb proti receptorům CD11b, CD11c, MHC II a DEC 206 za vzniku komplexu Ag-SA-biot.mAb. Indukce specifických T-buněčných odpovědí byla analyzována na myších dendritických buňkách in vitro a in vivo. Z výsledků vyplývá, že pro indukci účinné imunitní odpovědi je třeba velmi nízké dávky Ag (∼ 1 nM). V závislosti na použité protilátce byl Ag presentován in vivo jak v komplexu s MHC I, tak i s MHC II glykoproteiny, což umožnilo navodit specifické CTL tak CD4+ Th imunitní odpovědi proti daným antigenům.

63


NOVÉ VAKCINAČNÍ NÁSTROJE PRO INDUKCI T-BUNĚČNÉ IMUNITY

S E KCE 4 – B UNĚ Č NÁ S I G NA L I ZA C E A R E G UL AC E

SIGNALIZACE A ÚLOHA PROTEINU ANTERIOR GRADIENT 2 V NÁDOROVÉ BUŇCE, MOŽNOSTI JEHO VYUŽITÍ JAKO PREDIKTIVNÍHO BIOMARKERU TAMOXIFENOVÉ REZISTENCE U KARCINOMU PRSU Brychtová V. , Hrstka R. , Hupp T., Fabian P., Vojtěšek B. Masarykův onkologický ústav, RECAMO, Žlutý kopec 7, 656 53, Brno; University of Edinburgh, Cancer Research Centre, Edinburgh EH4 2XR, UK [email protected] Zvýšená exprese proteinu Anterior gradient 2 (AGR2) byla u řady nádorových onemocnění demonstrována jako negativní prognostický faktor. Poprvé byl tento protein detekován v buněčných liniích derivovaných od estrogen receptor pozitivních karcinomů prsu, avšak jeho přesná role v nádorové buňce doposud nebyla zcela objasněna. Terapie tamoxifenem bývá nejčastěji volena v první linii léčby estrogen receptor pozitivního karcinomu prsu a přináší významné zlepšení při jeho terapii, ovšem léčba samotná je limitována častým rozvojem lékové rezistence. Mechanismus odpovědný za vznik rezistence k tamoxifenu je pravděpodobně multifaktoriální a doposud není plně znám. V naší předchozí práci jsme prokázali indukci hladiny AGR2 při léčbě tamoxifenem, a to jak in vivo, tak i in vitro. Současně vysoká hladina AGR2 korelovala s lepší viabilitou AGR2 pozitivních buněk ovlivněných tamoxifenem. Naše výsledky tak potvrzují hladinu proteinu AGR2 jako významný prediktor odpovědi na léčbu tamoxifenem. Signalizace prostřednictvím estrogenního receptoru je však komplexní a kromě klasické genomické dráhy estrogenního receptoru zahrnující vazbu dimeru ke specifickým responzivním elementům v promotorech cílových genů, může estrogenní receptor ovlivnit expresi genů tzv. negenomickou cestou. Tato signalizace probíhá prostřednictvím protein-proteinových interakcí s transkripčními faktory bez přímé vazby na DNA. Zablokování těchto signálních drah by mohlo potenciálně přispět k senzitizaci nádorových buněk k léčbě tamoxifenem. Pomocí specifických inhibitorů jsme s ohledem na AGR2 status analyzovali signální dráhy, které by mohly hrát úlohu v mechanismech zodpovědných za rezistenci k tamoxifenu jako je EGFR, MAPK, PI3K/Akt a další. Naše data naznačují, že protein AGR2 se účastní buněčné signalizace zastoupené řadou pro-onkogeních signálních drah a mohl by sloužit jako cíl využitelný k překonání nejen rezistence k tamoxifenu. Tato práce byla podpořena GACR P301/10/1615 a RECAMO CZ.1.05/2.1.00/03.0101

CARBONIC ANHYDRASE INHIBITOR ACETAZOLAMIDE MODULATES TRANSCRIPTION AND SHEDDING OF TUMOR HYPOXIA-RELATED CARBONIC ANHYDRASE IX Pastorekova S., Zatovicova M., Iuliano F., Barathova M., Csaderova L., Ditte P., Takacova M., Labudova M., Sedlakova O., Svastova E., Kopacek J., Pastorek J. Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 9, 84505 Bratislava, Slovak Republic [email protected] Carbonic anhydrase IX (CA IX) is a cancer-associated cell surface enzyme, which serves as a marker of tumor hypoxia and a target for anticancer therapy. CA IX also actively participates in tumor biology through regulation of pH and cell migration/invasion in response to hypoxia, acidosis and growth factor stimulation. Classical CA inhibitor acetazolamide is a clinically approved drug that is used for systemic treatment of diseases associated with abnormal CA activity, such as glaucoma, epileptic seizures, altitude sickness, etc. Despite it is acting as a non-selective inhibitor of diverse CA isoforms, it may still be of value for clinical proof-of-concept testing of CA IX inhibition as an anticancer approach. Thus, we investigated in vitro and in vivo effects of acetazolamide on tumor cells that express hypoxia-induced carbonic anhydrase IX (CA IX). We performed a microarray analysis of RNA isolated from HeLa cells grown in 3D sferoids and subjected to long-term treatment by acetazolamide. The analysis revealed that in addition to inhibiting CA activity, acetazolamide affects transcriptional program of cells leading to many molecular changes including down-regulation of CA9 gene transcription and indirectly to increased shedding of CA IX protein. These effects may contribute to anticancer efficacy of acetazolamide in vivo by reducing pro-survival and pro-migratory properties of CA IX. Grant Support: 7th Framework program of EU (Collaborative project METOXIA), Research and Development Support Agency (APVV-DORP-0017-09), Research & Development Operational Program funded by the ERDF (ITMS 26240220062), Slovak Scientific Grant Agency (VEGA 2/0134/12).

64

Radvák P. P., Repič M., Švastová E., Takáčová M., Csaderová L., Pastorek J., Pastoreková S., Kopáček J. Virologický ústav, SAV,, Dúbravská cesta 9, 845 05 Bratislava, Slovenská republika, [email protected] Karbonická anhydráza IX (CA IX) je v súčasnosti jedným z najlepších markerov nádorovej hypoxie so sľubným diagnostickým a terapeutickým potenciálom. Hlavnou funkciou CA IX je udržiavanie fyziologického pH v hypoxických nádorových bunkách, čím ale súčasne CA IX prispieva k okysľovaniu extracelulárneho priestoru a k vytváraniu podmienok vedúcich k selekcii nádorových buniek s agresívnym fenotypom. Za účelom získania komplexného pohľadu o molekulárnych procesoch závislých na expresii CA IX, uskutočnili sme profilovanie génovej expresie fibrosarkómovej bunkovej línie HT-1080 u ktorej sme modulovali hladinu CA IX pomocou shRNA interferencie (shCa9). S využitím tohto systému sme identifikovali 109 diferenciálne exprimovaných génov medzi kontrolnými bunkami a bunkami so zníženou expresiou CA IX pomocou shRNA interferencie. Expresia 62 génov bola signifikantne znížená a naopak u 42 génov bola zvýšená. Za účelom identifikácie signifikantne deregulovaných bunkových signálnych dráh previedli sme analýzu s využitím Signaling Pathway Impact Analysis (SPIA) systému. Táto analýza odhalila že signálne dráhy označené ako malobunkový pľúcny karcinóm, fokálna adhézia a regulácia aktínového cytoskeletonu sú inhibované v shCa9 bunkách. Naopak dráhy zahrnuté v bunkovom cykle, procesingu proteínov v endoplazmatickom retikule boli identifikované ako aktivované v CA IX deficientných bunkách. poďakovanie Práca bola podporená grantami: Agentúra pre podporu vedy a výskumu APVV-0108-10, Vedeckou grantovou agentúrou SAV, VEGA č: 2/0130/11,. Agentúrou pre štrukturálne fondy EÚ, operačný program podporovaný ERDF (projekt PV-INF-PAT, ITMS 26240220032).

MTOR-SIGNÁLNÍ PROTEIN ATRAKTIVNÍ A ZÁHADNÝ Tuháčková Z., Ondrušová L., Réda J. Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. LF UK Praha [email protected] Nitrobuněčná signalizace zprostředkovaná kaskádami proteinkináz je často deregulována při lidských nemocech, zejména rakoviny a představuje tak cenný terapeutický cíl. Jednou ze základních a nejdůležitějších cest je vysoce konzervovaná signální dráha regulovaná serin/treonin-specifickou proteinkinázou mTOR. Ta hraje klíčovou roli v mnoha aspektech buněčné fysiologie a metabolismu, reguluje velikost a růst buněk, podílí se na regulaci translace a transkripce. Protein mTOR se vyskytuje ve dvou multiproteinových komplexech, mTORC1 a mTORC2, odlišných složením i funkcemi které jsou, převážně u mTORC1, inhibovány specifickým inhibitorem mTORu, rapamycinem. Signální dráha řízená mTORem je v současnosti předmětem intenzivního základního i klinického výzkumu, inhibitory na bázi rapamycinu jsou již používány klinicky. Jejich účinnost při léčbě nádorových onemocnění však často vede k chemoresistenci a nižšímu terapeutickému účinku, který rapamycin rovněž může způsobit. Dochází k aktivaci signální dráhy Akt zpětným mechanizmem a tím k potlačení antiproliferačního efektu inaktivace signální dráhy mTORC1. Tato negativní regulace Akt je zprostředkována, při nejmenším částečně, komplexem mTORC2, jehož protein rictor fosforylaci Akt katalyzuje, a který je ale sám jedním ze substrátů p70S6K1, cílového proteinu mTORC1. Toto vzájemné ovlivnění komplexů mTORC1 a mTORC2 vyvolává potřebu inaktivovat oba komplexy současně. Naše studium vysoce maligních melanomových buněk ukázalo, že na regulaci hyperaktivní signální dráhy mTORC1 v těchto buňkách se podílí aktivita proteinu kódovaného protoonkogenem src. Farmakologická inaktivace Src vede k hlubokému poklesu malignity a proliferace melanomových buněk, radikálnímu snížení aktivity signální dráhy mTORC1 a inhibici fosforylace a aktivity rictoru v komplexu mTORC2. Studie byla podporována grantem č. NT 11231-3/2010, přiděleným grantovou agenturou IGA MZ ČR.

65


BUNKOVÉ SIGNÁLNE DRÁHY OVPLYVNENÉ EXPRESIOU KARBONICKEJ ANHYDRÁZY IX


TOKY IONTŮ PŘES MEMBRÁNU REGULOVANÉ ADENYLÁTCYKLÁZOVÝM TOXINEM OVLIVŇUJÍ JEHO CYTOTOXICITU PROTI CÍLOVÝM BUŇKÁM Mašín J., Fišer R., Bumba L., Osička R., Konopásek I., Šebo P. Mikrobiologický ústav AV ČR v.v.i., Praha; Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, Praha [email protected] Adenylátcyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis, způsobující respirační onemocnění černý kašel. CyaA je unikátním příkladem bakteriálního toxinu schopného pronikat přes cytoplazmatickou membránu celé řady eukaryotních buněk. Toxin dopravuje svou adenylátcyklázovou doménu do cytozolu buněk imunitního systému, nesoucích na svém povrchu receptor CD11b/CD18. V nich vyvolává nekontrolovatelnou přeměnu ATP na cAMP. Vysoká hladina intracelulárního cAMP pak vede k narušení buněčné signalizace a inhibici funkcí buněk imunitního systému hostitele. CyaA také může vytvářet v cytoplazmatické membráně cílové buňky póry a narušit tím gradient iontů na cytoplazmatické membráně. Popsali jsme mechanizmus, jakým je CyaA schopen indukovat vstup vápenatých iontů do cytozolu cílových buněk. Dále jsme ukázali, že zvýšená hladina vápenatých iontů v cytozolu buňky po působení toxinu je zodpovědná za štěpení talinu, kotvícího receptor CD11b/CD18 k cytoskeletu buňky. To následně vyvolává přesun komplexu CyaA-CD11b/CD18 do lipidových raftů, kde dochází k dokončení translokace invazivní AC domény toxinu. Dále jsme ukázali, že vstup vápenatých iontů v kombinaci s toxinem-zprostředkovaným únikem draselných iontů z buněk vede ke zpomalení endocytózy komplexu toxin-CD11b/CD18. To vedlo k prodloužení pobytu toxinu na cytoplazmatické membráně a tedy ke zvýšené permeabilizaci buněk póry toxinu. Ukázali jsme tedy, že CyaA je schopen ovlivněním toku vápenatých a draselných iontů přes cytoplazmatickou membránu maximalizovat svůj cytotoxický účinek na cílové buňky.

GABA V BUNKOVEJ SIGNALIZÁCII VLÁKNITEJ HUBY TRICHODERMA ATROVIRIDE Nižnanský L., Kryštofová S., Varečka L., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie [email protected] Glutamát dekarboxyláza (GAD) katalyzuje dekarboxyláciu kyseliny L-glutámovej na kyselinu 4-aminobutánovú (GABA). Tento enzým je univerzálne prítomný vo všetkých živých organizmoch, od prokaryotov po vyššie eukaryoty. Delécia gad vo vyšších organizmoch je letálna. Na druhej strane vitalita gad mutantov prokaryotických a eukaryotických mikroorganizmov nie je významne ovplyvnená.. Mikroskopická analýza odhalila, že mutanty gad majú o 50 % viac multipolárne klíčiacich konídii ako divý kmeň (WT) a o 50 % nižší parameter HGU (hyphal growth unit), ktorý popisuje rastovú jednotku hýf a jej vetvenie. Farmakogenetická analýza WT a mutanta gad odhalila, že cyklosporín A, FK 506 ako inhibítory serín/treonín proteínovej fosfatázy kalcineurínu a rapamycín ako inhibítor TOR (target of rapamycin) kinázy, zvyšujú vetvenie hýf WT. Na mutanty Δgad však nemajú žiadny vplyv. Multipolárne klíčenie bolo u WT zvýšené len v prítomnosti cyclosporínu A a FK 506. Na základe súčasných ako aj minulých sa domnievame, že GAD by mohla byť „downstream“ efektorom kalcineurínu. Vo vyšších organizmoch sú známe GABA receptory lokalizované v plazmovej membráne. Z tohto dôvodu sme pripravili sadu experimentov, v ktorých sme sledovali vplyv nízkych koncentrácií GABA a neurofarmakologických látok zasahujúcich do GABA signálnych dráh u živočíšnych buniek na klíčenie a vetvenie. V prítomnosti GABA, lamotrigínu, baklofénu a bikukulínu sa vetvenie WT nemenilo, ale bolo pozorované znížené vetvenie v gad mutantoch..Zmeny multipolárneho klíčenia boli pozorovné len u lamotrigínu a bikukulínu. Tieto výsledky by naznačovali možnú úlohu GABA ako signálnej molekuly v Trichoderma atroviride. Grantová podpora: APVV-0282-10, APVV-LPP-0092-06.

66

Kormanec J., Novakova R., Feckova L., Rehakova A., Kutas P., Homerova D., Rezuchova B. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovakia [email protected] Gram-positive bacteria Streptomycetes are the main producers of bioactive natural products including many antibiotics. We identified a type II polyketide synthase gene cluster, aur1, in Streptomyces aureofaciens CCM3239 that was responsible for the production of angucycline polyketide antibiotic auricin. Auricin was produced in narrow growth phase interval after entry into stationary phase and afterwards it was degraded to non-active metabolites. However, purified auricin was stable in organic solvents and water for many days. Instability of auricin during cultivation was due to an increase of pH after production stage. Actually, purified auricin was stable at low pH. This specific production of auricin was due to a strict transcriptional regulation of auricin biosynthetic gene cluster, including feed-back negative control by a final product. Sequence analysis of the whole aur1 cluster revealed a huge number of regulatory genes and several of them have already been found to have a role in auricin regulation. Expression of the auricin biosynthetic genes is under control of the pathway-specific positive regulator Aur1P that belongs to the family of response regulators of bacterial two-component signal transduction systems and its binding activity was negatively affected by auricin intermediate(s). Moreover, the aur1Pp promoter was negatively regulated by the TetR family Aur1R repressor, and its binding to the promoter was also abolished by the presence of an auricin intermediate(s). In addition, two SARP family activators are important in regulation of several auricin biosynthetic genes. The data indicated that auricin biosynthesis is regulated by a complex mechanism in a cascade manner, thus ensuring a strict production of auricin in specific growth stage. This work was supported by the Slovak Research and Development Agency under the contracts No. APVV-0017-07 and No. APVV-0203-11.

NARUŠENÍ ROVNOVÁHY MEZI L-ARGININEM A ASYMETRICKÝM DIMETHYLARGININEM VEDE K DEREGULACI IMUNITNÍ ODPOVĚDI MAKROFÁGŮ Pekarova M., Twarogova M., Kubala L., Lojek A. Biofyzikální Ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká Republika [email protected] V posledních letech je stále více pozornosti věnováno zkoumání příčin vzniku endoteliální a imunitní dysfunkce, které jsou spojovány s rozvojem kardiovaskulárních onemocnění. Má se za to, že jedním z nejdůležitějších faktorů, přispívajícím ke vzniku těchto patofyziologických stavů, je snížení biologické dostupnosti oxidu dusnatého (endogenně produkované vasodilatační molekule). Bylo zjištěno, že snížení produkce oxidu dusnatého je doprovázeno jednak redukcí plazmatické koncentrace L-argininu (jediného známého substrátu pro produkci oxidu dusnatého) a také zvýšením koncentrace asymetrického dymethylargininu (endogenního inhibitoru produkce oxidu dusnatého). Jelikož jsou buňky imunitního systému klíčové pro regulaci fyziologických procesů probíhajících v cévách, je tato studie zaměřena právě na sledování efektů různých koncentrací L-argininu a asymetrického dimethylargininu na funkci imunitních buněk (konkrétně makrofágů). V této studii byly použity primární kultury makrofágů izolovaných z kostní dřeně myší, které byly inkubovány v přítomnosti různých koncentrací L-argininu a asymetrického dimethylargininu, přičemž bakteriální endotoxin byl použit pro simulaci zánětu. Následně byly analyzovány různé parametry, jako je produkce oxidu dusnatého, oxidativní vzplanutí, intracelulární koncentrace L-argininu, asymetrického dimethylargininu, intracelulární koncentrace vápníkových iontů, chemotaxe a exprese různých proteinů důležitých pro aktivaci signálních drah spojených se zánětlivou odpovědí makrofágů. Naměřená data poskytli unikátní informace potvrzující, že u zvýšené koncentrace asymetrického dimethylargininu docházelo k nežádoucí aktivaci makrofágů a všeobecně ke zvýšenému oxidativními stresu. Tyto procesy byly spojeny se změnou exprese různých proteinů, což vůbec poprvé naznačuje významné postavení asymetrického dimethylargininu nejen jako inhibitoru produkce oxidu dusnatého, ale také molekuly jenž je schopna regulovat signální dráhy spojené s aktivací makrofágů.

67


INTRIGUING PROPERTIES AND REGULATION OF THE ANGUCYCLINE ANTIBIOTIC AURICIN IN STREPTOMYCES AUREOFACIENS CCM3239


BACILLUS SUBTILIS AS A TOOL IN BASIC SCIENCE AND APPLIED RESEARCH Barák I., Muchová K., Krajčíková D., Pavlendová N., Florek P., Chromiková Z., Rešetárová S. and Melničáková J. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences [email protected] Bacillus subtilis is an internationally-recognised model organism, whose physiology, biochemistry and genetics has been studied for many years. Our research is oriented toward studying the proteins involved in basic processes in Bacillus subtilis as cell division, sporulation and programmed cell death. We will present our present knowledge of these basic cell processes and unanswered questions raised during our studies. One of the probably most controversial questions regarding cell division of rod-shaped bacteria concerns the mechanism that ensures correct placement of the division septum – mid-cell during vegetative growth or asymmetric during sporulation. Using membrane binding fluorescent dyes, we demonstrate the presence of lipid spirals extending along the long-axis of cells of the rod-shaped bacterium B. subtilis. These spiral structures are crucial in determining the site of cell division in bacterial cells. Little is known however of the origin of these spiral structures. In our current work we have focused on analyzing these lipid structures in correlation with other previously observed cytoskeletal helical structures in its close proximity. The programmed cell death (PCD) is a genetically regulated system what allows bacterial cell suicide in response to variety developmental and stress processes. We are studying a novel SpoIISA and SpoIISB proteins, representing the chromosomally encoded components of PCD in Bacillus subtilis. Our research is also oriented toward studies of protein-protein interactions of sporulation specific Cot proteins what are able to form highly ordered nano-scale layers. The aim of these studies is to develop new tools and nano-array based systems to form layers from protein molecules up to the scale of nano-particles. Acknowledgements: This work was supported by Grants VEGA 2/0016/10, by APVV-00335-10 and by the Wellcome Trust Project Grant 082829.

68

Tvaroška I. Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences [email protected] N- and O-linked oligosaccharide chains of glycoproteins play a crucial role in a number of biological processes. These compounds are found throughout biological systems and have been implicated in molecular recognition events such as bacterial, viral, and cell-cell adhesion, inflammation, and tumor invasion. Numerous glycosyltransferases, that catalyze the addition of a specific glycosyl residue from sugar nucleotide to an acceptor substrate, were validated as prime targets for therapeutic intervention in human diseases. Though transition state analogs are valued tools for drug discovery as potent and specific inhibitors of enzymes, up to date, the ability to generate transition state analogs of glycosyltransferases has lagged behind. It is obvious, that design of transition state analog inhibitors of an enzyme requires knowledge of the mechanism of the enzymatic reaction and the structure of transition state. Therefore, we have investigated the catalytic mechanism for inverting glycosyltransferases employing high level ab initio, DFT, and hybrid QM/MM calculations [1-7]. These results provided detailed insight into the mechanism of the monosaccharide transfer catalyzed by glycosyltransferases and revealed the main structural features of the transition states. The purpose of this paper is to summarize the structural insights into the catalytic mechanism of glycosyltransferases inferred from these calculations. Acknowledgments. This work was supported by the grants from the Slovak Research and Development Agency No. APVV-0607-07 and the Slovak Grant Agency VEGA No. 2/0128/08.

SITE SPECIFIC GLYCOFORMS OF LIVER SECRETED PROTEINS AS POTENTIAL DISEASE BIOMARKERS Pompach P., Brnakova Z, Chandler B.K., Edwards N., Sanda M., Goldman R. Department of Oncology, Georgetown University, Washington DC, USA [email protected] Glycoproteins fulfill many indispensable biological functions and changes in protein glycosylation have been observed in various diseases. Modern analytical tools allow the study of this common posttranslation modification in increasing detail. Changes in glycosylation have diagnostic potential, and some glycoproteins are already in use as clinical disease biomarkers. In this study we present a workflow for the analysis of glycan microherogeneity of haptoglobin by using two dimensional chromatography consisting of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) and nano reverse phase C18 chromatography coupled to a Q-TOF mass spectrometer. Big separation potential and high sensitivity enable to observe glycopeptide forms that were not described before. GlycoPeptideSearch, automated data interpretation software was developed to match a glycan composition from GlycomeDB glycan database containing human N-glycans to peptide backbone. In our study we have focused on differences between haptoglobin glycopeptides isolated from plasma of patients with HCC and controls with/out chronic liver disease. The results show that site-specific glycosylation of the proteins is altered in association with liver damage and the presence of HCC. Moreover “semistructural” analysis of one haptoglobin glycopeptide revealed interesting glycan isoforms related with liver diseases.

69

S E KCE 5 – GLYK OB I OC HE M I E

CATALYTIC MECHANISM OF INVERTING GLYCOSYLTTRANSFERASES


ADVANCES IN TICK GLYCOBIOLOGY Sterba J., Dupejova J., Vancova M., Grubhoffer L. Faculty of Science, University of South Bohemia, Ceske Budejovice, Czech Republic; Institute of Parasitology, Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Ceske Budejovice, Czech Republic [email protected] Glycosylation in invertebrates differ from vertebrate organisms. Traditionally, glycomic studies described the complexity of N- and O-glycomes predominantly from the model organisms such as the Drosophila fly, but structural data on other arthropod species are missing. This is surprising as the importance of invertebrate/arthropod glycoproteins for the transmission of pathogens by blood-feeding arthropods has been suggested and arthropod core-fucosylated N-glycans can be immunogenic to animal hosts. Among the clinically important arthropods belong the ticks, parasites feeding on the blood of animals and humans several times in their life. Core-fucosylation has been proved to be important for the transmission of Anaplasma marginale bacteria by ticks (Pedra et al. 2010). Lectin-based tick glycan analyses were prominent in the previous years. Our group introduced other means of study of limited amounts of tick glycans. Mass spectrometry analysis of the life-stages of the common European/Czech tick Ixodes ricinus revealed increasing complexity of observed structures similarly to observations in Drosophila flies. Moreover, analyses of N-glycans of salivary glands of fed and unfed adult I. ricinus ticks showed variability in their N-glycomes dependent on the bloodfeeding. MS analyses of salivary glands and other tissues confirmed the presence of sialic acid in tick samples; sialylated structures are of host origin most probably. Furthermore, the glycosylation of two tick hemolymph proteins were analyzed as well. Molecules originating in the blood meal were shown to survive tick molting and thus, the origin of glycans identified in tick samples could not be simply attributed to ticks. For this reason, we introduced bioorthogonally labeled saccharides into the blood meal of in vitro fed ticks and into the growth media of tick cell lines and localized the purely tick-originating glycans in tick tissues and tick cells.

LEKTINY Z BURKHOLDERIA CENOCEPACIA – KDYŽ DVA (TŘI, ČTYŘI) DĚLAJÍ TOTÉŽ... Malinovská L., Šulák O., Adamová L., Imberty A., Wimmerová M. Central European Institute of Technology, Masaryk University,Brno; CERMAV-CNRS, Grenoble; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Brno [email protected] Lektiny jsou proteiny, které specificky a reverzibilně vážou sacharidy. Patogenní organismy mohou využívat lektiny jako adhezivní molekuly a vázat se s jejich pomocí na glykoproteiny nebo glykolipidy na povrchu hostitelských buněk. Pro mnohé patogeny je adheze na buňky hostitele nezbytným předpokladem pro vývoj infekce. Lektiny jsou prokázanými faktory virulence i u Pseudomonas aeruginosa. Tato gramnegativní bakterie (podmíněný lidský patogen napadající především osoby trpící cystickou fibrózou) produkuje lektiny PA-IL a PA-IIL. Homology lektinu PA-IIL byly, mimo jiné, nalezeny i u bakterie Burkholderia cenocepacia. Tato bakterie je rovněž podmíněný patogen napadající pacienty s cystickou fibrózou. Obě bakterie jsou blízce příbuzné, mohou tvořit smíšení biofilmy a je u nich častý horizontální přenos genů. Homology PA-IIL z Burkholderia se tedy také mohou významně uplatňovat v patogenezi a jsou předmětem našeho výzkumu. U ostatních mikroorganismů se lektinu tohoto typu vyskytují pouze v jedné kopii, ale genom Burkholderia cenocepacia překvapivě obsahuje čtyři homology lektinu PA-IIL. Přestože jsou si tyto proteiny velmi podobné, vykazují rozdíly ve vazebné specifitě, termodynamických parametrech vazby sacharidu i struktuře. Tři lektiny z B. cenocepacia rovněž obsahují N terminální doménu, která se nevyskytuje u PA-IIL. N-terminální domény jednotlivých proteinů navíc nevykazují žádnou sekvenční podobnost a jejich možná funkce zůstává povětšinou neobjasněna. Počet a různorodost jednotlivých proteinů naznačují, že mohou v patogenezi zastávat zcela rozdílné a možná i nečekané úlohy. This work is supported by Ministry of Education (ME08008) and Grant Agency of Czech Republic (GD301/09/H004, GA/303/09/1168)

70

Tkac J., Bertók T., Katrlík J., Šefčovičová J., Šedivá A., Mislovičová D., Gemeiner P. Oddelenie glykobiotechnológie, Chemický ústav Slovenskej akadémie vied [email protected] V poslednej dobe sa hromadia dôkazy o veľmi významnej úlohe glykánov v mnohých fyziologických ale i patologických procesoch. Súčasne vzrastá aj potreba mať k dispozícii analytické nástroje, ktoré umožňujú zmeny glykánového profilu sledovať a kvantifikovať. Techniky ako chromatografia alebo hmotnostná spektroskopia však vyžadujú glykánové štruktúry pred analýzou z nosiča uvoľniť a teda neumožňujú in-situ analýzu glykánov na biologickom nosiči (proteín prípadne lipid). Lektíny schopné detekovať rozličné glykánové determinantny bez nutnosti glykány z nosiča uvoľňovať sú považované za rozpoznávacie molekuly schopné dešifrovať „glykokód“ a preto sú v našej práci systematicky využívané na stanovovanie glykoproteínov. Okrem klasickej techniky akou je ELLA (Enzyme-linked lectin assay), čo je analógia klasickej techniky ELISA, sa sústreďujeme na možnosti využitia techník akými sú SPR (Surface Plasmon Resonance), fluorescenčná microarray a EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy) v kombinácii s lektínmi. Validácia techník prebieha analýzou rozpoznávania známych glykoproteínov lektínmi a v prípade ELLA sa sústreďujeme aj na analýzu sér pacientov s reumatoidnou artritídou. Značné úsilie je venované konštrukcii lektínových biosenzorov s využitím EIS techniky, ktoré sú schopné detegovať proces rozpoznávania glykoproteínov lektínmi v tzv. label-free formáte bez nutnosti využívať pomocné značenie s možnosťou stanoviť glykoproteíny od koncentrácie 1 fM (≈ pg/L). V súčasnosti sa sústreďujeme na zvyšovanie citlivosti lektínových biosenzorov na báze EIS s možnosťami detekcie glykoproteínov rádovo v aM (≈ fg/L) koncentráciách s využitím zlatých nanočastíc a nových možností potlačenia nešpecifických interakcií. Poďakovanie: Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: Centrum excelentnosti pre Glykomiku, ITMS 26240120031, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

ZVÝŠENÁ EXPRESIA P-GLYKOPROTEÍNU V LEUKEMICKÝCH BUNKÁCH JE SPOJENÁ SO ZMENAMI V GLYKOZYLÁCII PROTEÍNOV Sulová Z., Šeres M., Bubenčíková T., Sedlák J., Ditte P.,Mislovičová D., Breier A. ÚMFG SAV, ÚEO SAV, VÚ SAV, CHÚ SAV [email protected] P-glykoproteín (P-gp) je integrálny glykoproteín plazmatickej membrány, ktorý plní funkciu efluxnej pumpy a je ABCB1 členom rodiny ABC transportérov. Jeho expresia v neoplastických bunkách vedie k rozvoju viacliekovej rezistencie a k zlyhávaniu chemoterapie. Zvýšená expresia tohto proteínu v leukemických bunkách L1210 je sprevádzaná výraznými zmenami v regulácii syntézy glykoproteínov. Pomocou 31P-NMR sme detekovali pokles hladiny ATP a UDP-cukrov v P-gp pozitívnych bunkách. Ďalej sme pozorovali znížený obsah glykoproteínov interagujúcich s lektínom ConA a aj nižšiu hladinu glykogénu, v porovnaní s P-gp negatívnymi bunkami L1210. Na základe interakcie s rôznymi lektínmi (ConA, LEA) sme zistili, že expresia P-gp vedie k remodelácii povrchových sacharidov. ConA výrazne znižuje viabilitu buniek L1210 (S), jeho cytotoxický vplyv na P-gp pozitívne bunky je podstatne nižší a to nezávisle od toho, či bola expresia P-gp navodená adaptáciou na vinkristín (R) alebo transfekciou s ľudským génom kódujúcim P-gp (T). Tunikamycín (inhibítor N-glykozylácie proteínov) menej potláča proliferáciu P-gp pozitívnych R a T buniek ako parentálnych S buniek. V R a T bunkách je možné kultiváciou v prítomnosti tunikamycínu dosiahnuť úplnú inhibíciu glykozylácie P-gp. Neglykozylovaný P-gp je však naďalej inkorporovaný v plazmatickej membráne a zachováva si transportnú aktivitu. Tunikamycín neovplyvňuje rezistenciu P-gp pozitívnych L1210 buniek na vinkristín. Supported by:, APVV-0290-10 and VEGA 2/0123/10, 2/0155/09.

71


MOŽNOSTI VYUŽITIA LEKTÍNOV V GLYKOMIKE A DIAGNOSTIKE


BIOINFORMATICKÁ ANALÝZA „MONOSACHARID ŠPECIFICKÝCH“ PROTEÍNOV NÁS VEDIE K NOVEJ „GLYKOKODÓNOVEJ“ TEÓRII Nahálka J. Chemický ústav, Centrum glykomiky, SAV, Bratislava; Chemický ústav, Centrum excelencie pre bielo-zelenú biotechnológiu, SAV, Nitra [email protected] Prezentovaná bioinformatická analýza „monosacharid špecifických“ proteínov naznačuje, že špecifické aminokyselinové triplety, glykokodóny, sú využívané pre čítanie glykánových sekvencií. Podobne ako u genetického kódu, kde najstaršie kodóny kódujú G, A, V, D aminokyseliny, aj pôvodné glykokodóny sú zložené z G, A, V, D aminokyselín. Súčasné glykokodóny môžu byť odvodené od GAVD-glykokodónov na základe hydropatickej podobnosti. Vo všeobecnosti, glyko-triplety sú zostavené z dipeptidu špecifického pre daný monosacharid a jednej polárnej aminokyseliny, napríklad AAR pre glukózu, GWN pre galaktózu, FSN pre GlcNAc a podobne. Tipy aminokyselín a peptidických väzieb v aktívnych centrách u kryštalizovaných lektín – glykán komplexoch a u oligosacharid – protein transferáz (OST) potvrdzujú túto teóriu. Teória deklaruje, že prebiotické GAVD-peptidy vyselektovali stereošpecificitu pre každý monosacharid a neskôr GAVD-proteíny vyselektovali stereošpecificitu pre rôzne oligosacharidové reťazce. V priebehu evolúcie GAVD-glykokodóny boli transformované na nové glykokodóny na základe pozitívnej selekcie pre zvýšenie diverzity a funkčnosti „glyko-proteínového jazyka“, čo bolo umožnené zvýšeným výberom aminokyselín. Jednako len, evolučný proces udržiaval hydropatickú podobnosť substituovaných aminokyselín, čo minimalizovalo chyby v uzákonených glykánproteínových interakciách. Biologické informácie, založené na glykánproteínových interakciách, sú vložené do glykoproteínov pomocou OST a čítané pomocou membránových lektínov. Tieto glykánproteínové biologické informácie sú spoľahlivo kódované pomocou glykokodónov, ktoré sú trojrozmerne rozmiestnené v OST a lektínoch. Tento príspevok vznikol vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: Centrum excelentnosti pre bielo-zelenú biotechnológiu, ITMS 26220120054, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ S DEFINOVANOU GLYKOSYLACÍ A JEJICH VYUŽITÍ Vaněk O., Bláha J., Dvorská A., Skálová T., Dohnálek J., Bezouška K. Katedra biochemie PřF UK, Praha; Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i., Praha [email protected] Příprava rekombinantních glykoproteinů v eukaryotických expresních systémech má dvojí tvář. Na jedné straně bývá často žádoucí či přímo nezbytné daný protein připravovat rekombinantní expresí v eukaryotickém organismu, neboť správné post-translační modifikace (a z nich především glykosylace) jsou nutné pro jeho nativní strukturu, stabilitu či aktivitu. Na druhé straně však glykosylace takto rekombinantně připraveného proteinu může pro některé aplikace představovat značnou překážku. Typickým příkladem je terapeutické využití daného proteinu v humánní klinické praxi, kdy potřebujeme, aby glykosylace co nejvíce odpovídala té přirozené lidské, což u heterologně exprimovaných proteinů není samozřejmost. A dalším příkladem je třeba proteinová krystalografie, kde flexibilní oligosacharidy představují obvykle překážku krystalizace proteinu. Oba příklady lze řešit volbou vhodného expresního systému, použitím geneticky upravených buněčných linií či s pomocí specifických chemických inhibitorů glykosyltransferas. První část přednášky bude aktuálním přehledem těchto způsobů manipulace glykosylace při rekombinantní expresi proteinů a jejich využití [1,2]. V druhé části přednášky bude představen expresní systém lidské embryonální ledvinné linie 293 (HEK293) využívaný na našem pracovišti, a to na konkrétním příkladu produkce rozpustných forem lektinových receptorů NK buněk pro účely proteinové krystalografie pomocí tranzientní transfekce buněčné linie HEK293S GnTI-, poskytující zcela homogenní N-glykosylaci typu Asn-(GlcNAc)2-(Man)5 [3,4]. Podpořeno projekty GAČR (P207/10/1040, 303/09/0477 a 305/09/H008), MŠMT ČR (1M0505), Univerzity Karlovy (UNCE 204025/2012) a Evropské komise (SPINE2 COMPLEXES: 031220, P-CUBE: 227764). [1] Mrázek H et al., Biotechnol Adv (2012), doi:10.1016/j. biotechadv.2012.03.008 [2] Chang VT et al., Structure 15(3), 267-273 (2007) [3] Reeves PJ et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(21), 13419-13424 (2002) [4] Standfuss J et al., Nature 471, 656-660 (2011)

72

Kořený L., Sobotka R., Kovářová J., Gnipová A., Flegontov P., Horváth A., Oborník M., Lukeš J. Biologické centrum, Parasitologický ústav AVČR a Přírodovědecká fakulta JU, České Budějovice (Budweis), ČR; Mikrobiologický ústav AVČR, Třeboň, ČR; Fakulta prírodných ved, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovensko [email protected] Hem je železem koordinovaný porfyrin, což je kofaktor řady bílkovin účastnících se základních a univerzálních buněčných procesů, jakými jsou přenos elektronů v dýchacím řetězci, redox reakce v metabolických drahách či reakce na oxidativní stres. Bičíkovci řádu Kinetoplastida představují vzácný případ organismů závislých na oxidativním metabolismu, kteří jsou ale zároveň auxotrofy pro hem. Prokázali jsme, že významný parazit rostlin Phytomonas serpens může růst při naprosté absenci hemu. Osekvenovali jsme celý genom tohoto prvoka, identifikovali geny pro hem-vážící bílkoviny a studovali buněčné procesy, pro něž byl dosud hem považován za nepostradatelný. Prokázali jsme, že Phytomonas postrádá většinu hem-vážících bílkovin a nevyžaduje hem pro přenos elektronů v dýchacím řetězci, ochranu proti oxidativnímu stresu a denaturaci mastných kyselin. Ačkoli studovaný bičíkovec stále používá hem pro syntézu ergosterolu, je v případě absence hemu schopen do svých membrán vkládat jeho prekurzor lanosterol. Phytomonas tak představuje prvoka schopného vyrovnat se s absencí hemu a je tudíž prvním případem eukaryota s touto nečekanou adaptací.

INVOLVEMENT OF YEAST ATP-BINDING CASSETTE TRANSPORTERS IN STEROL UTILIZATION Valachovič M., Kohút P., Hronská L., Klein C., Kuchler K., Hapala I. Institute of Animal Biochemistry and Genetics, Moyzesova 61, 90028 Ivanka pri Dunaji, Slovakia; Medical University of Vienna, MFPL, Dr. Bohr-Gasse, A-1030 Vienna, Austria [email protected] The utilization of external sterols in yeast involves passage of sterol molecule through the cell wall, entrance into the plasma membrane and actual internalization (integration into lipid turnover). Two plasma membrane proteins, Aus1 and Pdr11, members of the ATP-binding cassette (ABC) proteins family, are involved in sterol uptake. Simultaneous deletion of AUS1 and PDR11 results in inability to import exogenous sterols, however it is not clear whether sterols are actual substrates of these pumps. Interestingly, while in prokaryotes ABC proteins are widely involved in uptake of nutrients in eukaryotes they are almost exclusively responsible for pumping substrates out of the cell. Putative sterol importers Pdr11 and Aus1 are two of a few eukaryotic exceptions implicated in transport with opposite direction: towards the site of ATP hydrolysis. Pdr11 and Aus1 thus provide an especially lucrative model to study the molecular basis of the transport mechanism of ABC transporters. In order to study the mechanism of action of yeast ABC pumps, we over-produced Aus1 and Pdr11 in yeast. Transport activity and protein properties, like sensitivity to various ABC protein inhibitors were tested in purified plasma membranes with enriched ABC proteins. We applied the fluorescent ergosterol analogue – dehydroergosterol to monitor sterol uptake and showed that Aus1 and Pdr11 are required for the entry of external sterol molecules into the yeast plasma membrane. This work was supported by grants APVT-51029504 and FWF-SFB-035-04.

73

S E KCE 6 – ME MB RÁ NOVÁ B I OC H E M I E A B I OE NE R G E TIK A

EUKARYOTICKÝ ŽIVOT BEZ HEMU: PŘÍPAD AEROBNÍHO BIČÍKOVCE PHYTOMONAS


ANALÝZA PROTEÍNOV Z RODINY BCL-2 V KVASINKÁCH SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Jaká P., Juhásová B., Mentel M., Bhatia I., Polčic P. Katedra biochémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského, Mlynská dolina CH-1, 842 15 Bratislava [email protected] Kľúčovým krokom vedúcim ku aktivácii kaspáz a iniciácii programovanej bunkovej smrti – apoptózy – v cicavčích bunkách je permeabilizácia mitochondriálnych membrán a uvoľňovanie cytochrómu c z mitochondrií do cytosolu. Permeabilizácia mitochondrií je sprostredkovaná proteínovou rodinou Bcl-2. Jej členmi sú pro-apoptotické proteíny, z ktorých dva, Bax a Bak permeabilizujú mitochondriálnu membránu a uvoľňujú cytochróm c, a proti-apoptotické proteíny (Bcl-XL a Bcl-2), ktoré uvoľňovanie inhibujú. Špecifickú skupinu tvorí podskupina pro-apoptotických proteínov označovaných ako „BH3-only“ proteíny, ktoré v odpovedi na bunkové podnety Bax a Bak aktivujú mechanizmom, ktorý nie je zatiaľ pochopený. My sme skúmali mechanizmy zahrnuté v interakciách týchto proteínov navzájom a s mitochondriálnymi membránami v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. I keď kvasinky neobsahujú homológy Bcl-2 proteínov, expresia cicavčích génov v kvasinkách umožňuje analýzu funkcie týchto proteínov za podmienok, ktoré v cicavčích bunkách nie je možné dosiahnuť. Prezentované budú výsledky analýzy myšacích „BH3-only“ proteínov podporujúce hypotézu, že mechanizmom ich účinku je nepriama aktivácia proteínov Bax a Bak, sprostredkovaná inhibíciou protiapoptotických proteínov z rodiny Bcl-2. Táto práca vznikla za podpory grantov Agentúry na podporu vedy a výskumu APVV-0123-10 a grantovej agentúry VEGA 1/0870/11.

ENDONUKLEÁZA G – NOVÁ GENETICKÁ DETERMINANTA HYPERTROFIE LEVÉ SRDEČNÍ KOMORY A MITOCHONDRIÁLNÍCH FUNKCÍ Pravenec M., Kolář F., McDermott-Roe C., Petretto E., Cook S. Fyziologický ústav AV ČR, Praha; Imperial College, London, UK. [email protected] Chronická hypertrofie zvyšuje riziko srdečního selhání a předčasné smrti. Spontánně hypertenzní potkani kmene SHR představují model hypertrofie levé komory srdeční. Pomocí vazebných a sekvenačních analýz bylo u kmene SHR zjištěno, že odpovědným genem je Endog na chromozomu 3, který kóduje endonukleázu G. Sekvenační analýza odhalila u kmene SHR inzerční mutaci v Endog genu, která vedla k posunu čtecího rámce a tím k produkci nefunkčního proteinu. Endonukleáza G je lokalizovaná v mitochondriích, kde se pravděpodobně uplatňuje při apoptóze, avšak zatím nebylo nic známo o možné úloze Endog v regulaci srdeční hmotnosti. Analýza kardiomyocytů, u nichž byla snížena exprese Endog, jednoznačně prokázala, že ztráta funkce endonukleázy G indukuje jejich hypertrofický růst. Tyto výsledky naznačují, že zmutovaná Endog podmiňuje predispozici k srdeční hypertrofii v důsledku snížené mitochondriální respirace. Myši s deletovaným Endog genem mají v srdci nižší počet mitochondrií, takže je možné, že Endog hraje důležitou úlohu v syntéze mitochondriální DNA a v biogenezi mitochondrií. Je známo, že poruchy mitochondriální respirace nebo snížení počtu mitochondrií v srdci způsobují maladaptivní srdeční hypertrofii a zhoršení srdečních funkcí.

74

Mráček T., Holzerová E., Kovářová N., Ješina P., Drahota Z., Houštěk J. Fyziologický ústav AV ČR v.v.i., Vídeňská 1083, 142 20 Praha [email protected] Reaktivní formy kyslíku (ROS) mohou přispívat k poškození buněk a tkání a jsou spoluodpovědné za řadu patologických procesů. Mezi významné producenty ROS patří komplexy mitochondriálního respiračního řetězce, zejména komplex I a III. Tvorba ROS je ale spojena i s flavinovými dehdrogenázami sukcinát dehydrogenázou (SDH) a glycerol-3fosfát dehydrogenázou (mGPDH), která vykazuje unikátní tkáňovou specificitu i hormonální inducibilitu (1). Naše předchozí studie ukázaly, že k produkci ROS dochází u SDH i mGPDH, ale zatímco u SDH se většina ROS produkuje na komplexu III, u mGPDH vzniká významná část ROS i na dehydrogenáze samotné a na úrovni koenzymu Q (CoQ) (2). Dále jsme se tedy zaměřili na detailní mechanismus tvorby ROS těmito dehydrogenázami. Jako experimentální i model jsme využili solubilizaci mitochondriální membrány jemnými detergenty, která umožňuje izolovat jednotlivé enzymové komplexy i jejich přirozeně se vyskytující superkomplexy. Tyto experimenty ukázaly zásadní rozdíly v tvorbě ROS spojenou s SDH a mGPDH a to jak z hlediska intenzity, tak vlastního mechanismu. V případě SDH vede solubilizace enzymu ke ztrátě enzymové aktivity v důsledku deplece akceptoru elektronů, CoQ. Exogenní CoQ vykazoval prooxidační vliv, což ukazuje, že vlastním místem tvorby superoxidového anionu je CoQ a ne SDH. U mGPDH je naopak tvorba ROS několikanásobně vyšší a je dále indukována solubilizací enzymu. CoQ zde má naopak antioxidační efekt, neboť zabraňuje úniku elektronu na kyslík. Tyto rozdíly přímo odrážejí odlišné interakce CoQ s SDH a mGPDH. Pomocí izolace enzymu nativními elektroforézami jsme potvrdili hypotézu, že samotná mGPDH je místem úniku elektronů a vzniku ROS. Ukázali jsme, že mGPDH tvoří homooligomery a je schopná asociovat i do vysokomolekulárního superkomplexu. Všechny tyto formy jsou přitom schopné tvořit ROS. Projekt byl podpořen GAČR P303/10/P227 1. Mracek, T. et al. BBA 1726, 217-223 (2005). 2. Vrbacky, M. et al. BBA 1767, 989-997 (2007).

TMEM70 PROTEIN – LOKALIZACE A ORIENTACE VE VNITŘNÍ MITOCHONDRIÁLNÍ MEMBRÁNĚ Hejzlarová K., Kratochvílová H., Mráček T., Tesařová M., Vrbacká-Čížková A., Vrbacký M., Hartmannová H., Kaplanová V., Nosková L., Buzková J., Havlíčková-Karbanová V., Zeman J., Kmoch S., Houštěk J. Fyziologický ústav Akademie věd České republiky v.v.i., Praha; Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1.LF UK, Praha; Ústav dědičných metabolických poruch VFN a 1.LF UK, Praha [email protected] Počet pacientů s izolovanými defekty mitochondriální ATP synthasy jaderného původu neustále narůstá. Jako nejčastější příčina onemocnění byla v roce 2008 nalezena mutace c.317-2A>G v genu TMEM70, kódujícím protein, který působí jako specifický faktor biogeneze ATP synthasy. Jeho přesná funkce ale není známá [1]. Pro objasnění patogenního mechanismu a biologické funkce TMEM70 proteinu je nutná co nejpřesnější charakterizace jeho vlastností. Cílem naší studie bylo detailně analyzovat biosyntézu a předpokládanou mitochondriální lokalizaci TMEM70 proteinu. Jako experimentální model byly použity buněčné kultury exprimující GFP- a FLAG- značené formy TMEM70 proteinu a kultury pacientů s mutací c.317-2A>G. Zjistili jsme, že gen TMEM70 kóduje protein o velikosti 29 kDa, který je procesován na maturovaný 21 kDa protein. Mitochondrie pacientů, narozdíl od kontrolních mitochondrií, neobsahují detekovatelné množství TMEM70 proteinu. Importní studie přímo ukázala, že TMEM70 protein se procesuje po transportu do matrix mitochondrií, ale množství importovaného proteinu je nízké. Imunocytochemická analýza v kombinaci se subfrakcionací kontrolních mitochondrií potvrdila lokalizaci TMEM70 proteinu ve vnitřní mitochondriální membráně [2]. Proteolytické štěpení značených forem TMEM70 s následnou elektroforetickou či mikroskopickou analýzou naznačují, že oba konce proteinového řetězce TMEM70 směřují do mitochondriální matrix. 1D a 2D analýzy dále ukazují, že TMEM70 protein je schopen buď tvořit oligomery nebo asociovat s dalšími, dosud neznámými proteiny. Tento projekt byl podporován GAČR 303/11/0970, GA UK 370411, 37710 a RVO:67985823. 1. Čížková et al., Nat. Genet. 40 (2008) 1288-1290. 2. Hejzlarová et al., Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 144-149.

75


PRODUKCE REAKTIVNÍCH FOREM KYSLÍKU FLAVINOVÝMI DEHYDROGENÁZAMI MITOCHONDRIÁLNÍHO RESPIRAČNÍHO ŘETĚZCE


KVANTITATIVNÍ A KVALITATIVNÍ ZMĚNY FUNKCE CYTOCHROM C OXIDÁZY VYVOLANÉ ABSENCÍ ASEMBLAČNÍHO FAKTORU SURF1 Pecina P., Nůsková H., Pecinová A., Kovářová N., Houštěk J. Oddělení bioenergetiky, Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i. [email protected] Savčí cytochrom c oxidáza (COX), komplex IV respiračního řetězce mitochondrií, je multipodjednotkovým enzymem o velikosti 200 kDa. Pro biogenezi enzymu, zahrnující asociaci tří mitochondriálně s deseti jaderně kódovanými podjednotkami a vložení hemových a měďnatých kofaktorů, je zapotřebí několik desítek tzv. asemblačních faktorů, které nejsou součástí konečného holoenzymu. Mutace v genu kódujícím faktor Surf1 jsou nejčastější příčinou dědičné deficience COX jaderného původu a projevují se v raném věku jako těžké neurodegenerativní onemocnění Leigh syndrom. Asemblační defekt způsobený absencí Surf1 vede v lidských buňkách k (I) výraznému snížení obsahu COX holoenzymu na cca 20 % kontrolních hodnot. Na rozdíl od kontrolních buněk je většina holoenzymu asociována v superkomplexech společně s komplexy I a III. Akumulace asemblačních intermediátů COX je typickým biochemickým projevem Surf1 defektu. Kromě kvantitativního snížení množství enzymu vede absence Surf1 proteinu i ke kvalitativním změnám ve fungování COX. Jedná se především o (II) snížení poměru protonového a elektronového transportu enzymem. Zatímco respirometrická měření indikují dokonce upregulaci elektronového transportu COX, aktivní protonový transport přes vnitřní mitochondriální membránu je oproti kontrolám výrazně snížen. Důsledkem těchto změn je (III) snížení mitochondriálního membránového potenciálu a mitochondriální ATP produkce, které je možno považovat za primární patogenní mechanismus. Zhoršení dalšího funkčního parametru COX – (IV) snížení afinity ke kyslíku oproti kontrolám – může přispět k prohloubení defektu mitochondriální produkce energie v tkáních s nízkým parciálním tlakem kyslíku nebo v podmínkách zhoršeného zásobování kyslíkem (respirační infekce). Objasnění patogenního mechanismu a korelace funkčních změn se strukturními změnami v enzymu je významné pro odhalení biologické funkce Surf1 a charakterizaci spřažení elektronového a protonového transportu cytochrom c oxidázou.

MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZA YME1L KONTROLUJE AKUMULACI PODJEDNOTEK RESPIRAČNÍHO ŘETĚZCE A JE NEZBYTNÁ PRO MORFOGENEZI KRIST, REZISTENCI VŮČI APOPTÓZE A BUNĚČNOU PROLIFERACI Stiburek L., Cesnekova J., Houstek J., Zeman J. 1. Lékařská fakulta, Univerzita Karlova [email protected] Mitochondriální proteázy AAA (ATPázy asociované s rozličnou buněčnou aktivitou) jsou zodpovědné za kontrolu kvality proteinů ve vnitřní mitochondriální membráně. Zde jsme studovali buněčnou funkci lidského orthologu YME1L podjednotky YME1 kvasinkové ATP-dependentní proteázy i-AAA pomocí RNA interference a expresních experimentů na lidské buněčné linii HEK293. Lidský YME1L je mitochondriální integrální membránový protein s nativní molekulovou hmotností 600-1100 kDa. Stabilní RNA interference YME1L vedla k narušení proliferace a apoptotické resistence takových buněk, změněné morfologii mitochondriálních krist, zvýšené akumulaci některých podjednotek respiračního řetězce (Ndub6, ND1, Cox4) v mitochondriální membráně, zvýšené míře oxidativního poškození mitochondriálních membránových proteinů a snížené respirační aktivitě mitochondriálního komplexu I. Exprese proteolyticky aktivní YME1L v deficientní linii vedla k reverzi akumulace uvedených podjednotek a k obnovení normální morfologie krist. Oproti tomu, exprese proteolyticky inaktivované formy YME1L v těchto buňkách zůstala bez odezvy. Podjednotky Ndub6 a Cox2 specificky koimunoprecipitovaly s proteolyticky inaktivovanou formou YME1L v extraktech z YME1L deficientních buněk. Selektivní radioaktivní značení mitochondriálních translačních produktů ukázalo jejich zvýšenou stabilitu v YME1L RNAi buňkách. Naše výsledky ukazují, že lidská proteáza YME1L je zodpovědná za udržení mitochondriální proteinové homeostázy, a dále podtrhují její důležitost pro mitochondriální a buněčné funkce a integritu.

76

Bolotin D., Mamedov I., Britanova O., Turchaninova M., Zvyagin I., Chudakov D. Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, Moscow, Russia [email protected] We have developed advanced molecular and software technologies to perform quantitative profiling of T cell receptor repertoires using Next Generation Sequencing (NGS) on Illumina, 454 an IonTorrent platforms (Mamedov IZ, et al., EMBO Mol Med. 2011). We demonstrated that advanced platform-specific algorithms allow to remove majority of artificial TCR diversity accumulated due to the PCR and sequencing errors, while preserving most part of sequencing information. As a result, our advanced correction essentially increases the accuracy of T cell diversity interpretation and measurement of low abundant clonotypes concentration (Bolotin DA, et al., under consideration). Using these approaches, we performed the first detailed tracking of the fate of human T cell clones after high dose chemotherapy and autologous hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). We reported the first case of ankylosing spondylitis autoimmunity treatment using autologous HSCT, with a 2 year follow up. Complete clinical remission was observed for the whole period, indicating that HSCT can be an effective treatment for ankylosing spondylitis in those cases where anti-TNF alpha biologics efficiency is low. Basing on the fate of T cell clones tracked by quantitative NGS for 4 years before and for 2 years after the treatment, we suggested basic mechanisms that lead to the protective reconstitution of the immune system after autologous HSCT (Britanova OV, et al., Bone Marrow Transplantation, 2012), further supported by the recent data on the fate of identified herpesvirus-specific T cell clones (Kotlobay AA, et al, under consideration). Our technologies for the correct and quantitative TCR profiling were also tested on practice in a number of ongoing collaborative projects. We believe that our established molecular and software technologies should be useful in a wide range of basic and applied studies of adaptive immunity.

MOLEKULÁRNÍ VLASTNOSTI IMUNOGLOBULINŮ A JEJICH VÝZNAM V KLONÁLNÍ EVOLUCI CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE Plevová K., Skuhrová Francová H., Burčková K., Pavlová Š., Doubek M., Brychtová Y., Darzentas N., Brázdilová K., Juračková L., Kabáthová J., Tichý B., Pospíšilová Š. Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno; Molekulární medicína, Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita [email protected] Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je monoklonální hematoonkologické onemocnění s variabilním průběhem, které nelze vyléčit. Prognózu lze stanovit na základě vyšetření mutačního statusu variabilní oblasti (IGHV) imunoglobulinových genů (IG). Molekulární povaha IG ovlivňuje schopnost nádorové populace proliferovat a interagovat s prostředím, což se může následně odrážet v často nedostatečné odpovědi na léčbu. Sledovali jsme, které vlastnosti imunoglobulinových receptorů jsou v průběhu nemoci upřednostňovány a mají potenciálně význam v patogenezi CLL. Metody: Mutační status IGHV jsme vyšetřili u 1143 CLL pacientů. U vybraných pacientů jsme provedli podrobnou molekulární analýzu všech IG a flow-cytometrická měření povrchových znaků. Výsledky: U 31 pacientů (2,7%) jsme identifikovali vícečetné přestavby IG, které mohou signalizovat koexistenci více maligních klonů. Pomocí flow-cytometrie (CD19/sIGK/sIGL) jsme potvrdili expanzi nejméně dvou nezávislých maligních klonů u 9/31 pacientů. U dalších 16/31 případů s homogenním imunofenotypem lze přítomnost více B-lymfocytárních klonů předpokládat na základě množství identifikovaných IG přestaveb. 23 pacientů bylo vyšetřeno opakovaně s cílem popsat případné změny v proporci klonálních populací během nemoci. Pozorovali jsme expanzi klonů s určitými vlastnostmi IG na úkor jiných. Rozborem molekulárních vlastností IG přestaveb jsme potvrdili, že klony nesoucí nemutované IGHV získaly selekční výhodu, zatímco klony s mutovaným IGHV byly postupně eliminovány. Obdobně byla u expandujících klonů častěji identifikována delší oblast HCDR3 (část IG přestavby), než u mizejících klonů. Obě vlastnosti – nemutované IGHV a delší HCDR3, přítomné v 70% preferovaných klonů, se vyskytují především u pacientů s nepříznivou prognózou. Závěr: Popsali jsme vlastnosti B buněčného receptoru, které pravděpodobně hrají významnou úlohu při evoluci CLL. Podpořeno granty IGA MZČR NT/13493, MUNI/A/0784/2011, GACR204/09/ H058, CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

77

S E KCE 7 – MOLE K UL Á RNÍ G E NE T I K A

QUANTITATIVE PROFILING OF TCR REPERTOIRES


GENETICKÉ ODCHYLKY GENU PRO KARDIÁLNÍ TROPONIN T TYP 2 (TNNT2) U PACIENTŮ S HYPERTROFICKOU A DILATAČNÍ KARDIOMYOPATIÍ. Jáchymová M.1, Muravská A.1, Paleček T.2, Kuchynka P.2, Řeháková H.1, Magage S.2, Král A.2, Zima T.1, Horký K.2, Linhart A.2 1Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze 2II. interní klinika Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze [email protected] Úvod: Kardiomyopatie jsou obecně definovány jako poruchy myokardu, kdy srdeční sval je strukturálně a funkčně abnormální, a to při absenci postižení koronárních tepen, arteriální hypertenze, chlopenní vady a vrozené srdeční vady, jež by byly tak významné, aby mohly vést k dané abnormalitě. Hypertrofická kardiomyopatie (HKM) je multigenně podmíněné srdeční onemocnění s autozomálně-dominantní dědičností a nekompletní penetrací. Komplikací u pacientů s HKM je náhlá smrt. Dilatační kardiomyopatie (DKM) se vyznačuje poruchou systolické funkce, dilatací srdečních oddílů, známkami srdečního selhávání a poruchami srdečního rytmu. Cíl: Mutace v TNNT2 genu hrají u nemocných s HKM a DKM důležitou roli u nově identifikovaných onemocnění zapříčiněných genetickými odchylkami. Cílem práce bylo analyzovat TNNT2 gen u pacientů s HKM a DKM diagnózou pro zdokonalení genetického poradenství v postižených rodinách. Soubory a Metodika: U pacientů s HKM (n=84) a DKM (n=90) byl nejprve prováděn skríning mutací I76N, R92W, R92G a R92L, které se vyskytují na 7 a 8. exonu genu TNNT2, metodou určování délky restrikčních fragmentů (RFLP). Výsledky RFLP metody byly kontrolovány metodou přímého sekvenování. Všech 15 exonů a jejich přilehlé intronové oblasti genu TNNT2 byly analyzovány přímou sekvenací DNA vzorků u stejných souborů pacientů. Výsledky: U 174 vyšetřených jedinců byla nalezena jedna mutace R92W na 8. exonu v souboru pacientů s HKM a jedna mutace A172S (exon 10) TNNT2 genu u pacientů s diagnózou DKM. Závěr: Malá výtěžnost skríningové analýzy není pravděpodobně použitelná pro rutinní testování nemocí zapříčiněných mutacemi u pacientů s HKM a DKM, pouze pro identifikaci jednotlivých případů s pozitivními mutacemi, která může být vodítkem pro genetickou analýzu rodinných příslušníků. Tento přístup nyní reprezentuje pouze dostupnou strategii, z důvodu finančního omezení ve většině kardiocenter. Práce byla podpořena projektem MZ koncepčního rozvoje výz kumné organizace 00064165 (VFN v Praze 2).

PROGNOSTICKÝ A PREDIKTIVNÍ VÝZNAM EXPRESNÍCH HLADIN GENŮ KIF14, PRC1 A CIT U NÁDORŮ PRSU A OVÁRIÍ Brynychová V., Václavíková R., Ehrlichová M., Hlaváč V., Pecha V., Trnková M., Mrhalová M., Rob L., Kubáčková K., Gut I., Souček P. Oddělení toxikogenomiky, Státní zdravotní ústav, Praha; Oddělení onkochirurgie, Medicon, Praha; BIOLAB Praha s.r.o.; Ústav patologie a molekulární medicíny; Gynekologicko-porodnická klinika; Radioterapeuticko-Onkologické oddělení, 2. lékařské fakulty a Fakultní nemocnice v Motole, Praha [email protected] ÚVOD: Chemorezistence je častou a závažnou komplikací protinádorové terapie. Změny v dynamice mikrotubulů způsobené mitotickými kinesiny nebo proteiny s mikrotubuly asociovanými (MAPs), řídící proces cytokinese, by mohly být jednou z možných příčin rezistence nádorů k taxanům. Cílem této studie bylo zhodnocení prognostického a prediktivního významu expresních hladin genů kódujících regulátory buněčného dělení KIF14, PRC1 a CIT u nádorů prsu a ovárií. METODY: Pro studii byly použity vzorky nádorové a okolní nenádorové tkáně odebrané pacientkám s karcinomem prsu před započetím jakékoli protinádorové léčby (n=50), od neadjuvantně předléčených pacientek (n=33), a od pacientek s karcinomem ovarií (n=55). Metodou kvantitativní real-time PCR byly stanoveny hladiny exprese mRNA, které byly následně korelovány s klinicko-patologickými daty a odpovědí na léčbu. VÝSLEDKY: V obou typech nádorů byly detekovány signifikantní upregulace exprese KIF14, PRC1 a CIT v porovnání s okolní nenádorovou tkání. Významně vyšší hladiny exprese KIF14 a CIT byly nalezeny u nádorů s negativní expresí estrogenového receptoru a vysokým gradem u obou souborů pacientek s nádorem prsu. Pacientky před zahájením léčby s vysokými hladinami PRC1 měly navíc signifikantně kratší přežívání bez známek progrese (PFS) oproti pacientkám s nízkou expresí. U karcinomu ovarií vysoké hladiny KIF14 a PRC1 pozitivně korelovaly s nádorovým proliferačním markerem Ki-67. Exprese genu CIT významně asociovala s PFS. ZÁVĚR: V rámci studie byly navrženy dva nové potenciální markery prognózy PRC1 a CIT u karcinomu prsu a ovárií a jejich významnost by měla být dále ověřena na větším souboru pacientek. Práce byla podpořena grantem GA ČR č. 301/09/0362 a grantem IGA MZ č. NT13679-4.

78

Brtko J. Ústav experimentálnej endokrinológie SAV [email protected] Hormón štítnej žľazy (3,5,3´-trijódtyronín, T3), retinoidy, rexinoidy ako aj 1,25-dihydroxyvitamín D3 (D3) zasahujú do metabolických procesov prakticky každého tkaniva a majú významnú úlohu v komplexe biologických procesov zahrňujúcich rast, vývoj a bunkovú diferenciáciu. Nukleárne receptory T3, retinoidov, rexinoidov a D3 patria do špecifickej rodiny onkoproteínov a predstavujú v organizme významnú skupinu ligandom indukovateľných transkripčných faktorov a ich interakcia so špecifickými úsekmi DNA, „hormone responsive elements“ (HRE) reprezentuje jeden z mechanizmov, ktorým je kontrolovaná expresia génov. V súčasnosti sú známe dva základné typy receptorov pre T3. Gény, kódujúce alfa 1 formu receptora pre T3 sú lokalizované na ľudskom chromozóme 17 a druhým typom receptorov pre T3 sú nukleárne receptory beta, ktoré sú kódované génmi, lokalizovanými na ľudskom chromozóme 3. Prvý jadrový receptor pre kyselinu all-trans retinovú dostal označenie RARalfa, neskoršie nasledovali objavy ďalších nukleárnych receptorov RARbeta a RARgama. Následne boli objavené nukleárne receptory, ktoré neboli schopné interakcie s kyselinou all-trans retinovou ale len s jej stereoizomérom, kyselinou 9-cis retinovou a dostali označenie RXRalfa, RXRbeta a RXRgama. TR, RAR, RXR a nukleárny receptor pre 1,25-dihydroxyvitamín D3 (VDR) sa viažu na príslušný HRE ako heterodiméry a to prostredníctvom dvoch identických, za sebou sa opakujúcich sekvencií nukleotidov hexaméru AGGTCA, ktoré sú oddelené definovaným počtom vmedzerených nukleotidov. RXR je heterodimerizačným partnerom TR, RAR a VDR ako aj ďalších nukleárnych receptorov. Nové poznatky o funkcii a úlohe uvedených nukleárnych receptorov poskytujú tak účinný „nástroj“ pre diagnostiku a nové terapeutické postupy mnohých spoločensky závažných ochorení, medzi ktoré patria najmä onkologické ochorenia. Práca vznikla z podpory grantov APVV-290-10, APVV-0160-11, APVV-SK-CZ-0211-11, 7AMB12SK151, „Centre of Excellence grant“ CEMAN a VEGA 2/0008/11.

ANALÝZA MUTACÍ V GENECH PRO MIKRORNA U PACIENTŮ S CHRONICKOU LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIÍ Lochmanová J., Mráz M., Navrkalová V., Pavlová Š., Plevová K., Tichý B., Malčíková J., Šebejová L., Beneš V., Rausch T., Brychtová Y., Doubek M., Trbušek M., Mayer J., Pospíšilová Š. Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika FN Brno a LF MU; Středoevropský technologický institut, Centrum molekulární medicíny, MU; EMBL Heidelberg, Genomics Core Facility, Heidelberg, Germany [email protected] MikroRNA (miRNA) jsou krátké RNA regulující genovou expresi. U pacientů s CLL je expresní profil miRNA asociován s prognostickými markery (IgHV mutační status, abnormality genu TP53) a progresí choroby. Exprese miRNA může být ovlivněna přítomností jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a mutací, jejichž vliv a frekvence nebyla prozatím u CLL pacientů popsána. Cílem práce bylo s využitím resekvenačních mikročipů (Affymetrix) najít nové sekvenční varianty v genech pro 110 miRNA. Dále byly metodou přímého sekvenování analyzovány miR-29b a miR-29c, které již byly s patogenezí CLL asociovány. Pro resekvenační analýzu bylo vybráno 98 vysoce rizikových CLL pacientů. miRNA byly amplifikovány z genomové DNA z periferní krve metodou long-range PCR. Amplikony byly ekvimolárně smíchány, fragmentovány a hybridizovány na mikročipu. Přítomnost mutací byla ověřena klasickým sekvenováním. Stejnou metodikou byly u 213 CLL pacientů analyzovány miR-29b a miR-29c. Somatický nebo germinální původ mutací byl zjišťován sekvenací DNA izolované z bukální sliznice. Resekvenačními mikročipy bylo detekováno 83 polymorfních míst v 53 miRNA (dbSNP135). SNP detekovaný v miR-655 byl somatického původu. Dále bylo objeveno 5 nových záměn (pri-miR-29a; pre-miR-16-1, pre-miR-106b, pre-miR-372; miR 142-3p), z nichž mutace v pre-miR-372 a pre-miR-16-1 byly zárodečné. U miR-29c byly detekovány 2 SNP u 5 pacientů; u miR-29b byla u 2 pacientů detekována nová záměna (A/G-256) a 7 SNP. Metodou real-time PCR byl sledován vliv záměn na expresi miR-29b a miR-29c u 107 CLL pacientů. Exprese miR-29c (p<0.001) i miR-29b (p=0.01) byla nižší u pacientů s nemut. IgHV. Vliv záměn na expresi byl prokázán pouze u miR-29b, kde byla exprese nižší u pacientů s insercí (p=0.046), a to pouze u pacientů s nemut. IgHV (p=0.036). SNP i mutace v miRNA genech se vyskytují u většiny CLL pacientů a mohou být somatického i germinálního původu. U miR-29b koreluje přítomnost SNP s hladinou její exprese u vybraného souboru pacientů.

79


DÔSLEDKY INTERAKCIE NUKLEÁRNYCH RECEPTOROV/TRANSKRIPČNÝCH FAKTOROV S HORMÓNOM ŠTÍTNEJ ŽĽAZY, RETINOVÝMI KYSELINAMI A DIHYDROXYVITAMÍNOM D3


FUNKCIA PDR TRANSPORTÉROV V ZÁSTUPCOCH RODU TRICHODERMA SP. Paceková J., Olejníková P., Vihonská Z., Kryštofová S. Oddelenie biochémie a mikrobiológie FCHPT STU Bratislava [email protected] Molekulárny základ vysokej odolnosti Trichoderma sp. voči množstvu toxických látok súvisí s prítomnosťou ABC (ATP binding cassette) transportérov. Tieto ATP – dependentné permeázy sprostredkujú transport rozličných substrátov cez biologické membrány , čím znižujú akumuláciu toxických látok v bunkách Trichoderma sp. ABC proteíny eukaryotov sú rozdelené do 8. rodín A- H, pričom intenzívne študovaná je rodina G, pretože súvisí s PDR (pleiotropic drug resistance) fenoménom. Mojou úlohou bolo poodhaliť funkciu PDR transportérov TAPDR5 a TAPDR12, ktoré boli navrnuté na základe homológie s ABC transportérmi Saccharomyces cerevisiae v Trichoderma atroviride, Trichoderma viride, Trichoderma sp. BRM (benomyl rezistentný mutant) a fúznom izoláte F4. Fúzny izolát F4 bol pripravený fúziou protoplastov Trichoderma atroviride a Trichoderma sp. BRM. V súvislosti s transportom sekundárnych metabolitov sa sledovala expresia génov pdr po indukcii kyselinou octovou. Oba ABC transportéry boli aktivované po transporte octanu do bunky; vyššia expresia sa pozorovala v prípade tapdr12. V súvislosti s mykoparazitizmom sa sledovala expresia po indukcii bunkovými stenami a mŕtvym mycéliom fytopatogénov Botrytis cinerea, Fusarium culmorum a Alternaria alternata. Na základe dosiahnutých výsledkov možno konštatovať, že vyššiu expresiu vykazoval transportér tapdr5, pričom expresný profil oboch transportérov bol individuálny v rámci druhu.

WHERE DO THE HOLOKINETIC CHROMOSOMES STORE THEIR „JUNK“ DNA? Věchtová P., Dalíková M., Sýkorová M., Žurovcová M., Vítková M. Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic; Institute of Entomology, Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, České Budějovice, Czech Republic [email protected] Holokinetic or holocentric chromosomes are terms referring to chromosomes without a primary constriction, the centromere, which implies a specific structure and behaviour that those chromosomes assume during a cell cycle. Such a feature assigns the chromosomes lots of peculiar qualities. Very typical and conspicuous morphological feature of holokinetic chromosomes is a distribution of heterochromatin, a region frequently targeted by repetitive elements. Unlike monocentric chromosomes, holokinetic chromosomes lack the most distinctive heterochromatic block represented by centromere, therefore they lack an important structural feature. Here, we focused on an isolation of several kinds of repetitive elements from the genome of a codling moth, Cydia pomonella (Lepidoptera), a typical representative of an organism with holokinetic chromosomes. Several approaches were used to isolate satellite DNA from the genome of C. pomonella. A satellite sequence CPSAT-1 was successfully isolated by restriction analysis of genomic DNA of C. pomonella. Mono-, di-, and trinucleotide microsatellite probes in 16 possible combinations and one tetranucleotide probe were synthesised. The acquired sequences were further fluorescently labelled and hybridized on the mitotic chromosomes of the codling moth by means of FISH. Both types of repetitive sequences demonstrated rather evenly distributed pattern. The highly expected accumulation of repetitive DNA on W chromosome of C. pomonella, composed of constitutive heterochromatin, was not confirmed. Interestingly, a large grouping of CPSAT-1 was localized on one pair of medium sized chromosomes, which only evinces for random mechanisms responsible for repetitive DNA distribution within holokinetic systems.

80

Hurba O., Stibůrková B. Ústav dědičných metabolických poruch, 1.LF UK v Praze a VFN v Praze [email protected] Konečným produktem degradace purinů u člověka a vyšších primátů je kyselina močová (KM). Koncentrace urátu je určena rovnováhou mezi tvorbou a odbouráváním. Poruchy rovnováhy vedou ke změně koncentrace sérové hladiny kyseliny močové – hypo/hyperurikémie. Existuje korelace mezi hyperurikémií a řadou závažných onemocnění (hypertenze, kardiovaskulární a renální onemocnění, metabolický syndrom). Majoritními geny ovlivňující hladinu kyseliny močové v séru jsou SLC22A12 a SLC2A9. Cílem projektu je objasnit frekvenci, roli a vliv alelických variant těchto hlavních urátových transportérů na sérovou hladinu kyseliny močové v statisticky významném vzorku české populace. Z retrospektivní kohorty 869 subjektů s klinickou a biochemickou charakterizací bylo vybráno 150 subjektů s normourikémií a 59 subjektů s patologickou hladinou kyseliny močové. Alelické varianty byly identifikovány pomocí PCR a sekvenační analýzy. Sekvenační varianty s dopadem na změnu aminokyselin jsou funkčně charakterizovány pomocí expresního systému v oocytech Xenopus laevis (mutageneze cDNA, příprava cRNA, mikroinjekce, imunocytochemické studie subcelulární lokalizace a dynamiky procesování a transportu včetně kolokalizačních studií s využitím protilátek proti základním buněčným kompartmentům, analýza exprese proteinů, funkční studie transportní aktivity proteinu pomocí 10 μmol 14C-urátu. V dané etapě je ukončená analýza genu SLC2A9 v souboru 150 subjektů s normourikémií: bylo nalezeno 12 sekvenačních variant v kódujících oblastech (6 substitucí, 6 tranzicí). 14 sekvenačních variant bylo nalezeno v intronové oblasti. Bylo připraveno 12 cRNA (6 sekvenačních variant pro obě isoformy GLUT9a a GLUT9b), funkční studie v současnosti probíhají. Výsledky studie přispějí k objasnění genetického podkladu hladiny kyseliny močové v séru, mohou objasnit vztah mezi urátovými transportéry, hyperurikémií a dnou a přispět k nalezení nových postupů v léčbě hypo/hyperurikémie.

81


FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKA ALELICKÝCH VARIANT SLC2A9 A SLC22A12 V ČESKÉ POPULACI

S E KCE 8 – PA TOB I OC HE M I E A K L I NI C K Á B I OC HE M I E

BIOCHEMICKÉ A MOLEKULOVÉ MECHANISMY U HOMOCYSTINURIE: CO VÍME PO 50 LETECH STUDIA METABOLISMU SIRNÝCH AMINOKYSELIN? Kožich V. Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze [email protected] Homocystein je aminokyselina obsahující volnou tiolovou skupinu; poprvé ji v roce 1932 připravil demethylací methioninu v kyselém prostředí de Vigneaud. O tři dekády později byla přítomnost homocysteinu a jeho disulfidu homocystinu poprvé prokázána u člověka- v moči pacientů s dědičnou metabolickou poruchou homocystinurií, onemocněním postihujícím pojivovou tkáň, centrální nervový systém a hemokoagulaci. Další výzkum v následujících třech dekádách ukázal, že homocystein se může v těle akumulovat nejen u deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS) v transsulfurační dráze homocysteinu, ale také u několika geneticky podmíněných enzymopathií v remethylaci homocysteinu a dále velmi běžně při deficitech vitaminů skupiny B a deficitu kyseliny listové. Nejvíce pozornosti bylo homocysteinu věnováno na sklonku minulého století, kdy řada epidemiologických studií prokázala mírnou hyperhomocysteinemii u pacientů s různými formami atherosklerosy. Před dvěma desítkami let byl klasickými metodami molekulové genetiky nalezen a popsán gen pro CBS, kdy mRNA pro cystathionin beta-synthasu byla nalezena pomocí degenerovaných oligonukleotidů navržených na základě znalosti sekvence peptidových štěpů CBS. Znalost sekvence mRNA a genu pro CBS umožnily analýzu mutací u pacientů s deficitem CBS. Ačkoliv výzkum této nemoci od metabolitu přes enzym až po gen však přinesl řadu nových poznatků, k hlubšímu pochopení patogeneze deficitu CBS tyto informace nepostačovaly. V uplynulých dvou dekádách proto vznikla řada studií, které charakterizovaly různé varianty mutantní CBS exprimované v heterologních systémech, byly studovány myší, kvasinkové a nematodní modely deficitu CBS a které ukázal funkční dopady mutací na funkci mRNA, na misfolding mutantní CBS i na toky metabolitů u deficitu CBS. Pouze takovýto komplexní přístup umožňuje pochopit patogenezu nemoci a navrhnout nové léčebné strategie. Podpořeno projekty PRVOUK-P24/LF1/3, UNCE 204011 a RVO-VFN64165/2012.

PORUCHY MITOCHONDRIÁLNÍHO ENERGETICKÉHO METABOLISMU Hansíková H., Veselá K., Stibůrek L., Burská D., Vondráčková A., Wenchich L., Tesařová M., Zeman J. Laboratoř pro studium mitochondriálních poruch, Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. LF UK a VFN v Praze [email protected] Energetické potřeby člověka jsou z 90% zajišťovány systémem oxidativní fosforylace (OXPHOS), který se skládá z více než 80 proteinů umístěných na vnitřní mitochondriální membráně a který je řízen funkčním propojením genů nukleární DNA a mitochondriální DNA (mtDNA). Systém OXPHOS se skládá ze čtyř multipodjednotkových komplexů dýchacího řetězce a ATP syntázy. Poruchy OXPHOS (mitochondriální onemocnění), jejichž incidence je odhadována až na 1:4000, se často manifestují v raném dětství a vedou k závažnému postižení mozku, srdce a svalů, tedy tkání s vysokými energetickými nároky. Mezi nejčastější defekty OXPHOS patří poruchy čtvrtého komplexu dýchacího řetězce – cytochrom c oxidázy (COX). Lidská COX je 13-podjednotkový komplex vnitřní mitochondriální membrány, pro jehož biogenezi a správnou funkci je nezbytná přítomnost řady asemblačních faktorů, kofaktorů a prostetických skupin. Studium metabolicko-patologických souvislostí defektů mitochondriálního energetického metabolismu je založeno především na analýzách dostupného biologického materiálu od pacientů s primárními i sekundárními poruchami OXPHOS. Pouze přesné odhalení a pochopení patogenních mechanismů vycházející z detailní charakterizace deficitu COX v různých tkáních na proteinové úrovni spolu s molekulárně-genetickou analýzou mohou poskytnout správné genetické poradenství v postižených rodinách. Podporováno IGA MZ ČR NT-13114-4/2012

82

Pláteník J., Gáll J. Škrha J.Jr., Buchal R., Sedláčková E., Verébová K. Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF UK a VFN v Praze [email protected] Zajímavý fenomén MPT (Mitochondrial Permeability Transition, mitochondriální megakanál) hraje významnou úlohu v buněčné smrti. MPT je indukováno kalciem, a významně potencováno oxidačním stresem. V podmínkách organismu oxidační stres obvykle závisí na katalýze železem nebo mědí. V naší práci jsme studovali možnost indukce MPT fyziologickou mikromolární koncentrací železa. Izolovali jsme mitochondrie z potkaních jater a před předčasným spontánním MPT jsme je chránili přídavkem EDTA (chelátor kalcia i železa) a hovězího sérového albuminu. Pro vlastní měření byly mitochondrie ředěny do inkubační směsi obsahující sukcinát nebo malát/pyruvát jako respirační substráty. MPT bylo indukováno pomocí 20 uM chloridu vápenatého nebo železnatého. Měřili jsme bobtnání mitochondrií, potenciál vnitřní mitochondriální membrány, redoxní stav mitochondriálního NAD(P)H, koncentraci železnatých a vápenatých iontů v inkubační směsi. Nalezli jsme experimentální podmínky za kterých železo spouštělo MPT s účinností srovnatelnou s kalciem; tento efekt se dal odlišit od nespecifického oxidačního poškození mitochondriálních membrán a vyžadoval určité reziduum EDTA v inkubační směsi. Dle údajů v literatuře jsme předpokládali dva mechanismy působení železa na mitochondrie: 1) oxidace NAD(P)H v důsledku zatížení mitochondriální antioxidační ochrany a 2) import železnatých iontů do mitochondriální matrix pomocí transportního systému pro kalcium (kalciového uniporteru). Oba tyto děje v našich pokusech skutečně nastávaly, ale na indukci MPT železem se podílely jen okrajově. Základním a primárním mechanismem účinku železa v našem experimentálním systému bylo vytěsnění kontaminujícího/endogenního kalcia z reziduální EDTA přidaným železem. Jakkoliv jde o pozorování v umělých podmínkách in vitro, tato interakce mezi kalciem a železem může velmi dobře odrážet situaci in vivo a měla by být zvažována jako nový mechanismus toxicity železa uvnitř buněk.

ROLE MYELOPEROXIDÁZY V CÉVNÍM ZÁNĚTU Kubala L. Inst. of Biophysics, AS CR; ICRC – CBCE, St. Anne‘s University Hosp. Brno [email protected] Myeloperoxidáza (MPO) je hojně se vyskytující peroxidázá v granulích polymorfonukleárních neutrofilů, která byla dlouhodobě považovaná za klíčový enzym v obraně organismu před patogeny. Současné pozorování však ukazují, že MPO se také podílí na modulaci buněčné homeostázy a může hrát ústřední roli v iniciaci a rozvoji akutních a chronických zánětlivých cévních onemocnění. Bylo prokázáno, že MPO se váže na endoteliální buňky a je deponována v cévních stěnách. MPO katabolizuje oxid dusnatý produkovaný endotelem vedoucí k endoteliální dysfunkci a poškození cévních funkcí. MPO také katalyzuje tvorba nitrotyrosinů, což může mít vliv na struktury a funkce proteinů extracelulární matrix. Dále se prokázala interakce MPO s membránou leukocytů, která vede ke zvýšené interakci s endoteliálními buňkami na základě změny povrchového náboje buněk. Stejně tak byly odhaleny interakce MPO s membránou dalších krevních buněk, včetně červených krvinek a krevních destiček spojené s modulací jejich fyziologických funkcí. Celkově lze shrnout, že MPO může významně ovlivňovat vývoj akutních a chronických cévních onemocnění, jak v závislosti, tak nezávisle na její enzymatické aktivitě.

83


OTEVŘENÍ MITOCHONDRIÁLNÍHO MEGAKANÁLU ŽELEZEM: KOMPETICE ŽELEZA S KALCIEM DŮLEŽITĚJŠÍ NEŽ OXIDAČNÍ STRES


BIOCHEMICKÉ A PATOBIOCHEMICKÉ FUNKCE MELANOSOMŮ Borovanský J. Ústav biochemie a experimentální onkologie 1.LF UK Praha [email protected] Melanosomy jsou subcelulární partikule specialisované na synthesu a skladování melaninů. Jak jsme zjistili, jejich koncentrace v pigmentových tkáních je nečekaně obrovská – 2,7- 44,1 vah.% vztaženo na lyofilisovanou tkáň. Biochemické vlastnosti melanosomů jsou determinovány přítomností eu-/phaeomelaninů, jejichž obsah je v rozmezí 20-66% hmotnosti partikule. Hlavní fysiologickou funkcí melanosomů je udržování homeostasy v buňkách, v nichž se nacházejí = cytoprotektivní funkce. Pokud nejsou schopny tomu dostát, aktivně se podílejí na likvidaci buněk = cytotoxická funkce. Melanosomy se účastní volně radikálových reakcí, a fungují jako redox pufry. Tvoří a likvidují cytotoxické molekuly, melanogenese je pro buňku potenciální hrozbou. Prokázali jsme vysoký výskyt membránových defektů melanosomů v nádorových buňkách a tomu odpovídající cytotoxické důsledky. Uniknuvší cytotoxické prekursory melaninu jsou enzymově převáděny na metabolity, které jsou vylučovány jako tzv. močové melanogeny. Melanosomy se chovají jako centra konverse energie – např. foton/fononová konverse je základem fotoprotekce či převod zvuku na teplo omezuje percepci hluku. Melanosomy mají iontoměničové vlastnosti – udržují stálé iontové složení endolymfy, mohou deponovat řadu iontů, např. koncentrace Zn2+ v lidském těle je nejvyšší v melanosomech; radioaktivní nuklidy lze využít pro detekci melanomových ložisek či k therapeutickým účelům. Melanosomy mají afinitu k polycyklickým sloučeninám, což se může mít patologické důsledky (vazba léčiv na basi fenothiazinu na melanosomy retinálního pigmentového epithelu) nebo selhávání chemotherapie (vazba léčiv na melanosomy snižuje průnik účinné látky do jádra). Poznání vlastností melanosomů je cíleně využíváno v experimentální therapii melanomů. Je též rozvíjena imunotherapie s využitím protilátek proti specifickým melanosomálním proteinům, jež mohou být melanogenesí haptenisovány. Financováno z PrvoukP27/LF1/1 a z IGA MZ ČR NT 11229-3.

PROZÁNĚTOVÁ SIGNALIZACE V KANCEROGENEZI Kotyza J. Ústav biochemie, LF UK v Plzni [email protected] Zatímco vliv chronického zánětu na vznik rakoviny byl pozorován již před více než 100 lety, poslední desetiletí potvrdily účast zánětových dějů i v růstu a diseminaci nádorů. Mezi karcinogenní faktory jsou tak zařazovány i klasické mediátory zánětu jako jsou prozánětové cytokiny, prostaglandiny, proteolytické enzymy a reaktivní formy kyslíku a dusíku. Jejich účinky jsou zprostředkovány intracelulárními signálními drahami zapojenými do buněčné proliferace, novotvorby cév, buněčného přežití a tvorby metastas. V kancerogenezi hrají důležitou roli buňky nádorového stromatu, z velké části imunitního charakteru, které se stávají aktivními partnery nádorových buněk. Klíčové údaje při studiu prozánětových faktorů poskytuje zejména studium kultur nádorových buněk, sledování genové exprese imunochemickými metodami, ale také analýzy solubilních faktorů v tělních tekutinách. Významný zdroj informací představují tekutiny, které jsou v kontaktu s nádorem v preformovaných nebo nově vzniklých tělních prostorech. Na našem pracovišti jsme se zaměřili na sledování prozánětových mediátorů u nádorových pleurálních tekutin. Opakovaně je zjišťováno, že u většiny sledovaných ukazatelů není statisticky signifikantní rozdíl mezi tekutinami infekční a maligní etiologie. V paraneoplastických tekutinách je koncentrace některých prozánětových analytů úměrná závažnosti nádorového onemocnění, mají tedy charakter prognostických markerů. Z námi sledovaných mediátorů zánětu vykazoval nejvýznamnější negativní korelaci s dobou přežití interleukin-8 (CXCL-8). Výsledky jsou v souladu s analýzami jiných extravaskulárních tekutin a s kancerogenní rolí IL-8 demonstrovanou molekulárně biologickými metodami. V současné době probíhá vývoj a testování protinádorových léčebných strategií zacílených na IL-8.

84

Pešta M., Kulda V., Topolčan O., Černý R. II. interní klinika FN a LF UK v Plzni a Ústav lékařské chemie a biochemie LF UK v Plzni [email protected] Použití polymerázové řetězové reakce, tak jak ji prezentoval v roce 1983 Kary Mullis, otevřelo možnosti stanovení exprese genetické informace na úrovni RNA. Na konci devadesátých let se očekávalo široké využití kvantifikace exprese na úrovni RNA a to i v klinické praxi, jak o tom svědčí práce řady autorů (Ramachandran a Melnick, 1999; Desjardin et al., 1999; Fairman et al., 1999). V tomto období a dále po roce 2000 vznikly stovky publikací, které využívaly stanovení exprese na úrovni mRNA pro pochopení fyziologických funkcí, tak i patologických procesů. Tato metodika byla také využívána pro hledání nových biomarkerů včetně nádorových markerů a prediktorů odpovědi na léčbu. Avšak vzrůstající poznání postranskripčních úprav spolu s porozuměním epigenetickým dějům do určité míry relativizuje výpovědní hodnotu stanovení mRNA jako biomarkeru, přestože řada studií nalezla signifikantní výsledky. Po objevech Victora Ambrosiho, Andrew Firea a Craig C. Melloa, kdy došlo k otevření bran světa nekódujících RNA (ncRNA) a RNA interference, prožívají metody stanovení exprese RNA návrat a můžeme říci, že opět jsme v podobné situaci jako na přelomu století, kdy jsou vkládána velká očekávání v praktické využití stanovení mikroRNA jako biomarkerů, včetně nádorových markerů a prediktorů léčby, či dokonce cílů pro terapii. Přesto se ještě vraťme ke stanovení mRNA. Je třeba říci, že řada aplikací našla klinické využití, např. stanovení exprese genu DD3/PCA3 pro časný záchyt karcinomu prostaty nebo klinicky používané stanovení minimální reziduální choroby. Tato práce byla podpořena projektem Univerzity Karlovy SVV-2012-264806.

VZÁCNÉ GENETICKÉ VARIANTY U MENDELOVSKÝCH A KOMPLEXNÍCH ONEMOCNĚNÍ Kmoch S. Ústav dědičných metabolických poruch, 1.LF UK [email protected] Dostupnost nových technik analýzy nukleových kyselin (genomové sekvenování, DNA čipy) a stále se zvyšující znalost genetické variability člověka (1000 genomů, ESV, dbSNP, DGV) spolu s výkonnými bioinformatickými nástroji zásadně mění strategii biomedicínského výzkumu, metodologii studia molekulární podstaty všech lidských onemocnění a rozsah a úroveň diagnosticko-preventivních postupů u vzácných i populačně častých onemocnění. Obor se postupně přesouvá od „klasických“ vazebných a asociačních studií k detailní analýze genetické informace jedinců. Tento posun umožňuje efektivní analýzu širokého spektra vzácných mendelovských onemocnění podmíněných unikátními funkčně závažnými mutacemi v jednotlivých genech. U komplexních onemocnění se oproti původnímu předpokladu významného vlivu kombinace populačně běžných genetických variant odhaluje dominantní úloha vzácných funkčně významných genetických variant. Tyto vzácné genetické varianty jsou výsledkem explosivního populačního růstu posledních tisíciletí a jsou nutně populačně specifické. Určení genetické architektury komplexních onemocnění proto vyžaduje sekvenační analýzu lokálních kohort pacientů, znalost genetické variability studované populace a expertizu v molekulárně biologické, buněčně patologické a cílené klinické charakterizaci nalézaných variant. Takto koncipovaný výzkum – společný všem biomedicínským a lékařským oborům – je podmíněn existencí silných multidisciplinárních, patřičně instrumentálně vybavených a experimentálně kompetentních týmů, které jsou dlouhodobě institucionálně podporovány. Tuto vizi by mohl splňovat projekt Národního Centra Lékařské Genomiky.

85


STANOVENÍ EXPRESE KÓDUJÍCÍCH A NEKÓDUJÍCÍCH RNA U NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ – JE VYUŽITELNÉ V KLINICKÉ PRAXI?

S E KCE 9 – PROT E OMI K A A M E T A B OL OM I K A

SLEDOVÁNÍ VLIVU INHIBITORŮ HISTONOVÝCH DEACETYLÁZ NA STAV HISTONOVÝCH ACETYLACÍ Činčárová L., Lochmanová G., Nováková K., Fajkusová L., Fajkus J., Zdráhal Z. Středoevropský technologický institut a Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita, Kamenice 5, Brno; Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno a Lékařská fakulta MU, Černopolní 9, Brno [email protected] Zvýšená exprese histonových deacetyláz (HDAC) s následnou hypoacetylací histonů je spojena s utlumením transkripce supresorových genů rakovinného bujení. Modulace epigenetických značek pomocí inhibitorů HDAC tak představuje perspektivní strategii v léčbě nádorových onemocnění. V naší práci jsme se věnovali optimalizaci vhodných metod pro popis změn stavu acetylací histonů. Soubor technik sestávající se z měření celkové enzymové aktivity HDAC, MALDIMS analýzy N-terminálního fragmentu histonu H4 a separace histonových extraktů pomocí AUT-AU dvourozměrné gelové elektroforézy s následnou LC-MS/MS analýzou 2-D spotů byl použit při sledování změn acetylací histonu H4 vyvolaných aplikací dvou strukturně odlišných inhibitorů, valproátu sodného (VPA) a entinostatu (Enti) v leukemické buněčné linii MEC-1. Získané výsledky ukazují, že VPA a Enti vyvolávají odlišné změny na úrovni jednotlivých acetylovaných forem, zatímco celkové utlumení enzymové aktivity HDAC vyvolané aplikací inhibitorů bylo u obou srovnatelné. Současně bylo prokázáno, že navržený soubor technik umožňuje sledování změn acetylačního stavu histonů a lze ho využít při jejich popisu, resp. k optimalizaci kultivačních podmínek při in vitro aplikaci inhibitorů HDAC. Tato práce vznikla za podpory projektu “CEITEC – Středoevropský technologický institut” (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) z Evropského fondu regionálního rozvoje.

MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY METASTAZOVÁNÍ U LOW-GRADE KARCINOMŮ PRSU: OD PROTEOMICKÉHO PROFILOVÁNÍ K FUNKČNÍ CHARAKTERIZACI Bouchal P., Dvořáková M., Roumeliotis T., Struhárová I., Budinská E., Bortlíček Z., Lenčo J., Garbis S. D., Nenutil R., Vojtěšek B. Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav biochemie, Brno; Masarykův onkologický ústav, Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, Brno; University of Southampton, Southampton, UK; Masarykova univerzita, Institut biostatistiky a analýz, Brno; 5Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Ústav molekulární patologie, Hradec Králové [email protected] V první fázi projektu jsme se zaměřili na vyhledávání prometastatických cílů v souboru 96 charakterizovaných nádorů prsu zahrnujícího stratifikaci vzorků podle grade, exprese hormonálních receptorů a stavu lymfatických uzlin. Primární proteomická studie byla založena na metodice zahrnující štěpení komplexních lyzátů trypsinem, značení peptidů isobarickými značkami (iTRAQ), separaci peptidů dvourozměrnou kapalinovou chromatografií a identifikaci a kvantifikaci proteinů na bázi vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (iTRAQ-2DLC-MS/MS). Soubor 95 vybraných genů pak byl profilován na transkriptové úrovni. Statistika zahrnující Spearmanovu korelaci odhalila dva klastry související se stavem lymfatických uzlin u low garde karcinomů. Sada proteinů, změny jejichž exprese byly potvrzeny na proteinové i transkriptové úrpovni, byla dále validována pomocí imunohostochemie. Naše výsledky potvrzují, že molekulární mechanismy metastazování u low-grade karcinomů prsu zahrnují aktivaci proteolýzy, NFkB dráhy, změny v cytoskeletálních a adhezních proteinech a liší se od mechanismů u high-grade karcinomů. V další fázi výzkumného programu se zaměřujeme na funkční charakterizaci identifikovaných proteinů zejména ve vztahu k buněčné migraci. Exprese cytoskeletálního aktin vážícího souboru transgelinu byla umlčena v buněčné linii BT549 pomocí siRNA, což výrazně snížilo migrační vlastnosti buněk. Analýza protein-protein interakcí pomocí proteomického přístupu odhalila cathepsin D, marker špatné prognózy u karcinomu prsu, jako jeden ze silných interakčních partnerů transgelinu. Rovněž byla studována role methylace promotoru v regulaci genové exprese transgelinu. Zjištěné výsledky poukazují na významnou úlohu transgelinu v metastazování nádorů karcinomu prsu. Práce byla podporována projektem Grantové agentury České republiky č. P304/10/0868 a Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101).

86

Rylová G., Dubák P., Janošťáková A., Frydrych I., Konečný P., Holub D., Oždian T., Doležal D., Soural M., Hlaváč J., Hajduch M. Laboratoř experimentální medicíny, Institut molekulární a translační medicíny, LF UP a FNOL, Puškinova 6, 77520 Olomouc; Katedra organické chemie, Institut molekulární a translační medicíny, PřF UP, tř. 17. listopadu 1192/12, 77146 Olomouc [email protected] Znalost cílů protinádorových léčiv je důležitá zejména pro optimalizaci struktury léčiva a potlačení vedlejších efektů těchto látek. Byla vyvinuta řada proteomických metod k určení molekulárních cílů malých molekul. Jednou z nich je afinitní chromatografie, která byla v této oblasti v mnoha obměnách úspěšně aplikována. Zabýváme se skupinou chinolonových derivátů, u kterých byla popsána antibakteriální, antiprotozoální, cytotoxická a imunosupresivní aktivita. Dlouhodobě testujeme chemické knihovny těchto látek , přičemž byla identifikována řada zajímavých derivátů s cytotoxickými účinky v sub-mikromolárních koncentracích. Látky jsme dále testovali průtokovou cytometrií na analýzu buněčného cyklu a inhibici DNA/RNA syntézy. Deriváty zastavovaly buňky přednostně v G1 fázi buněčného cyklu souběžně s výraznou inhibicí DNA a RNA syntézy. Nejúčinnější derivát byl testován v in vivo nádorovém modelu, kdy byla s výhodou využita metoda „hollow fibres“ (Cellmax). Do myší byly implantovány dutá vlákna s nádorovými buňkami leukemické linie CEM. Myš byla následně léčena testovanou látkou. Dutá vlákna byla po 14 dnech vyjmuta a přežívající buňky byly podrobeny cytotoxickému MTT testu. Účinnost testované látky byla srovnatelná s doxorubicinem. U takto účinných látek je výhodné pro další vývoj znát jejich přesný mechanismus účinku a molekulární cíle. K identifikaci proteinových cílů jsme zvolili metodu afinitní purifikace spojenou s hmotnostní spektrometrií. Purifikace proběhla na streptavidinem pokrytých magnetických kuličkách, na které byl navázán biotinylovaný účinný derivát. Takto vzniklý komplex jsme inkubovali s buněčným lyzátem linie CEM a po odmytí nespecifických proteinů jsme navázané proteiny separovali na 1D SDS PAGE. Jejich identifikace proběhla metodami LC-MS/MS a MALDI. Identifikované potenciální cíle jsou klíčové proteiny metabolismu glukózy, translace a cytoskeletu. Cílové proteiny jsme validovali western blotem a dalšími testy (buněčné modely, kinázové a enzymatické testy, hodnocení in vitro transkripce a translace, studium proteinových interakcí). Tato práce vznikla za podpory grantů LC07017, vnitřní grant lékařské fakulty UP (LF_2012_018), BIOMEDREG C.1.05 /2.1.00 / 01.0030

PROTEOMICKÁ CHARAKTERIZACE MEMBRÁNOVÝCH MIKRODOMÉN LIDSKÝCH NK BUNĚK Kádek A., Pompach P., Bezouška K., Novák P., Man P. Mikrobiologický ústav AV ČR, Praha; Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze [email protected] Přirozené zabíječské (NK) buňky jsou důležitou součástí neadaptivního imunitního systému. Uplatňují se zejména v boji proti nádorovým, virově infikovaným či jinak malformovaným buňkám. Plasmatická membrána NK buněk obsahuje oblasti se specifickým lipidovým složením v porovnání s okolní membránou (tzv. membránové mikrodomény či rafty). Mikrodomény jsou díky odlišné lipidové stavbě místem preferenčního výskytu některých imunologicky zajímavých proteinů a hrají roli v procesech buněčné polarizace a signalizace. Charakteristickou vlastností membránových mikrodomén je částečná rezistence vůči solubilizaci mírnými neionogenními detergenty. V této práci byly v rámci detergentu-rezistentní membránové frakce (DRM) izolovány mikrodomény z lidské buněčné linie NK-92MI a z NK buněk získaných imunomagnetickou separací z periferní krve neleukemických dárců. K izolaci byly využity detergenty Triton X-100 nebo Brij-98 a ultracentrifugace v sacharosovém gradientu. Proteinové složení izolovaných DRM bylo analyzováno hmotnostní spektrometrií metodou LC-MALDI-TOF/TOF. Seznamy identifikovaných proteinů z těchto analýz vykazují některé zajímavé vlastnosti týkající se proteinového složení DRM za různých podmínek solubilizace a měly by najít své uplatnění při výběru kandidátních proteinů pro funkční studie. Tato práce byla finančně podpořena Grantovou Agenturou Akademie věd České republiky (KJB500200612), institucionálním výzkumným záměrem Mikrobiologického ústavu Akademie věd České republiky (AV0Z50200510) a Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (1M0505, LC7017, LC545).

87


PROTEOMICKÉ METODY K IDENTIFIKACI PROTINÁDOROVÝCH CÍLŮ


POUŽITÍ CÍLENÉ METABOLOMIKY V DIAGNOSTICE DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH PORUCH Friedecký D., Janečková H., Wojtowicz P., Hron K., Šťastná V., Zdráhalová M., Hlídková E., Adam T. Laboratoř dědičných metabolických poruch, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc; Katedra matematické analýzy a aplikací matematiky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci [email protected] Cíl studie: Metabolomika si klade za cíl identifikovat, kvantifikovat a interpretovat změny všech metabolitů v daném biologickém systému. Cílem sdělení je podat přehled o jejích nástrojích, získávání a zpracování dat a seznámit posluchače s našimi dosavadními výsledky získanými použitím cílených metabolomických přístupů v diagnostice dědičných metabolických poruch. Metody: Základem analýzy je extrakce metabolitů ze vzorku (moč, sérum, suchá krevní skvrna, fibroblasty), poté následuje analýza metabolitů vhodnými nástroji – využíváme technik tandemové hmotnostní spektrometrie (QTRAP 5500, AB SCIEX, USA), ve spojení s vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií (Ultimate 3000 RS, Dionex, USA) a kompletní dvojrozměrné plynové chromatografie ve spojení s průletovým analyzátorem (LECO Pegasus 4D, USA). Naměřená data jsou statisticky zpracovávána metodami hierarchického shlukování, analýzy hlavních komponent (PCA) a diskriminační funkční analýzy založené na PCA. Výsledky: V naší laboratoři jsme schopni stanovit v moči více než 400 metabolitů, ve fibroblastech 180 metabolitů a v séru 160 metabolitů. Statistickým zpracováním naměřených dat se nám podařilo rozlišit od sebe kontrolní vzorky a vzorky od pacientů s různými metabolickými poruchami (např. poruchy v metabolismu aminokyselin, purinovém metabolismu, organické acidurie či mitochondriální poruchy). Závěr: Metabolomika představuje celistvý pohled na patobiochemické procesy v živém organismu, umožňuje automatizovanou diagnostiku vrozených metabolických poruch. Tato práce vznikla za podpory Studentské grantové soutěže Univerzity Palackého v Olomouci, č. projektu LF_2012_016 a grantu IGA MZČR NT12218. Infrastrukturální část projektu (Ústav molekulární a translační medicíny) byla podpořena Operačním programem Výzkum a vývoj pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/01.0030).

PROFILOVÁNÍ CYTOKININŮ POMOCÍ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ DETEKCÍ Tarkowski P., Novák O. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci; Laboratoř růstových regulátorů, Univerzita Palackého a Ústav experimentální botaniky AV ČR v.v.i. [email protected] Cytokininy tvoří jednu z hlavních skupin rostlinných hormonů. Podílejí se na regulaci velkého počtu biologických procesů v rostlinách v průběhu celého ontogenetického vývoje. Přirozeně se vyskytující cytokininy jsou deriváty adeninu s isoprenoidním či aromatickým postranním řetězcem. Dnes je popsáno více než padesát sloučenin, jež jsou, bez ohledu na jejich biologickou aktivitu, jako cytokininy označovány. Profilování rostlinných hormonů vyžaduje kombinaci intenzivní úpravy vzorků s citlivou a selektivní detekcí. Jen tak je možno analyzovat stopová množství těchto látek v rostlinných pletivech. Předmětem prezentace je přehled metod profilování cytokininů izolovaných z relevantního biologického materiálu. Tyto metody slouží nejen ke kvalitativní a kvantitativní analýze širokého spektr a derivátů cytokininů, ale rovněž k měření rychlosti jejich biosyntézy.

88

Jágr M., Eckhardt A., Pataridis S., Mikšík I. Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, Praha 4, 142 20. [email protected] Mezi významné vědecké úkoly posledních dvou dekád patří výzkum proteomu různých druhů lidských buněk, orgánů či tkání. V tomto projektu jsme se věnovali výzkumu dentinu lidských zubů. Zuby patří mezi nejtvrdší části lidského těla. Vyznačují se specifickou konstrukcí i složením. Vrchní část zubu je tvořena sklovinou, pod ní se nachází zubovina (dentin) a vnitřek zubu je tvořen zubní dření. Tvorba dentinu je komplexním procesem, ve kterém klíčovou roli hrají odontoblasty – vysoce specializované buňky zodpovědné za tvorbu dentinu. Při růstu a tvorbě dentinu se nejprve tvoří mezibuněčná proteinová matrice, na jejímž podkladě je pak zahájena mineralizace dentinu ukládáním krystalů hydroxyapatitu.1 K analýze jsme použili pět zubů moudrosti získaných od stejného počtu osob obojího pohlaví. Proteiny byly z dentinu extrahovány originálním dvoustupňovým procesem. Směs proteinů byla analyzována dvourozměrnou elektroforézou. Separované proteiny pak byly štěpeny trypsinem na jednotlivé peptidy, které byly následně detekovány nano-kapalinovým chromatografem spojeným s tandemovým hmotnostním detektorem. Spolehlivě jsme identifikovali celkem 289 proteinů majících v dentinu širokou škálu biologických funkcí, např. vazba iontů Ca2+, tvorba cytoskeletu, tvorba mezibuněčné matrice, imunitní odezva, transport, včetně proteinů s dosud neznámou funkcí. Největší část z identifikovaných proteinů se podílí na růstu a podpoře buněk dentinu. Některé z nalezených proteinů (celkem 90) zatím dosud nebyly v lidském dentinu detekovány. U devíti z nich (dosud hypotetických) proteinů se domníváme, že jsme je detekovali u lidí poprvé. Jedná se o první studii kde byla použita dvourozměrná elektroforéza ke studiu proteomu lidského zubního dentinu. Naše výsledky mohou přispět k lepšímu pochopení a charakterizaci biologických dějů v lidském chrupu. Tato práce vznikla za podpory grantů GA ČR 203/09/0675 a GA ČR 203/08/1428. LITERATURA 1. Butler W. T., et al.: Connect. Tissue Res. 44, 171 (2003).

HEPCIDIN – KLINICKÝ VÝZNAM A VÝVOJ METODY PRO STANOVENÍ HLADINY V LIDSKÉM SÉRU Holub D., Houda J., Pospíšilová D. Džubák P. Ústav molekulární a translační medicíny LF UP v Olomouci [email protected] Hepcidin je klíčový peptidový hormon ovlivňující homeostázu železa (Fe) v lidském organismu. Je hlavním negativním regulátorem uvolňování Fe z enterocytů duodena, z makrofágů a z hepatocytů. Hepcidin blokuje export Fe z uvedených buněk tím, že se váže na jeho jediný povrchový receptor feroportin. Vzniklý komplex hepcidin-feroportin se následně internalizuje a degraduje a tím ztrácí schopnost exportovat Fe do extracelulárného prostoru. Narušení této osy vede ke vzniku různých patologických stavů (např. anémií). Proto se hepcidin nabízí jako jeden z potencionálních markerů pro diferenciaci různých poruch metabolizmu Fe. Zatím nebyla vyvinuta spolehlivá a validovaná metoda pro stanovení hladiny hepcidinu v lidském séru, která by byla zároveň vhodná pro rutinní použiti. Naše metoda využívá jednostupňovou adsorbci na pevnou fázi. Následná separace extraktu probíhá na koloně s reverzní fázi C18 pomocí kapalinové chromatogragie. Hladina hepcidinu je detekována pomocí monitorování vybraných iontů (SRM) na hmotnostním spektrometru s trojitým kvadrupólem. Výhodou této metody ve srovnání s ELISA metodami je časová nenáročnost a vysoká specificita. Zavedení standardizovaného vyšetření hepcidinu může významě zlepšit a upřesnit diagnostiku metabolických poruch Fe.

89


KOMPLEXNÍ PROTEOMICKÁ ANALÝZA DENTINU LIDSKÝCH ZUBŮ

S E KCE 1 0 – ROS T L I NNÁ B I OC H E M I E

MECHANISMY INTERAKCE AUXINU A CYTOKININU V REGULACI VÝVOJE ROSTLIN Marhavy P., Duclercq J., Bielach A., Moliner C.C., Simaskova M., Benkova E. VIB, Ghent, Belgium; CEITEC, Brno Czech Republic [email protected] Vývoj a růst rostlin je výjimečně flexibilní. Architektura rostlinného těla je ve velké míře výsledkem jejího dynamického a neustálého přizpůsobování měnícím se podmínkám prostředí. Rostliny jsou schopny si trvale udržovat centra kmenových buněk, ale i iniciovat tvorbu nových orgánů z už diferencovaných buněk a tvořit orgány de novo. Tyto vývojové procesy jsou regulovány signálními molekulami zvanými rostlinné hormony. Obyčejně je určitý vývojový proces regulován několika hormony a tak je vzájemná koordinace jejich působení velmi důležitá pro správnou regulaci vývoje. Auxin a cytokinin patří mezi klíčové hormony regulující růst a vývoj rostlinných kořenů, ale molekulární mechanizmy jejich vzájemné interakce jsou jenom málo poznány. Naše výsledky ukazují, že důležitým mechanizmem auxincytokininové interakce je kontrola distribucie auxinu v rostlinných pletivech cytokininy. Cytokinin reguluje hladiny transportérů auxinu na buněčných membránách a tak kontroluje množství auxinu v buňkách, kritické pro organogenesi a vývoj kořenového systému. ( ERC starting independent research grant financuje tento vyzkumny projekt)

TRANSPORT OF PLANT HORMONE AUXIN ON A SINGLE CELLS LEVEL: MATHEMATICAL MODELLING Hoyerová K., Hošek P., Kubeš M., Laňková M., Petrášek J., Jiřina M., Zažímalová E. Institute of Experimental Botany AS CR, Prague; Department of Biomedical Informatics FBE, Czech Technical University in Prague [email protected] Cell-to-cell transport of plant hormone auxin plays a crucial, coordinating and regulatory role in many aspects of plant development. On the level of a single cell, both active and passive, as well as influx and efflux processes contribute to the whole flow of auxin molecules through the cell. Number of auxin transporters was identified so far and their involvement in auxin transport across cell membranes has been confirmed; however, quantitative characterization of auxin transport processes is still incomplete. Using single-cell-based systems it is possible to track the course of auxin accumulation inside cells and to specify and quantify some auxin transport parameters. Measurements of accumulation of radioactively labelled auxins in cells of tobacco (Nicotiana tabacum L, cv. Bright Yellow 2; line BY-2) cultivated in vitro revealed significant differences in metabolic changes of particular auxins in cells, and identified a synthetic auxin 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) as a suitable tool for determining both auxin influx and efflux activities. Based on the 2,4-D accumulation data we have proposed a mathematical model of 2,4-D transport at a single-cell level. Optimization of the model provided estimates of crucial auxin transport parameters and their quantitative relationships, and pointed at the so far unexpected ability of this compound to be translocated across plasma membrane in both directions and also via passive diffusion. This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic, project P305/11/0797.

90

Dopitová R., Degtjarik O., Pühringer S., Kutý M., Weiss M., Nejedlá E., Kutá-Smatanová I., Hejátko J., Janda L. Masaryk University, Central European Institute of Technology (CEITEC), Brno; University of South Bohemia in České Budějovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses and School of complex systems, Nové Hrady; University of South Bohemia in České Budějovice, Faculty of Science; Helmholtz-Zentrum Berlin für Materil [email protected] Histidine-containing phosphotransmitters (HPts) from A. thaliana (AHP1-5) act as signaling intermediates between sensor histidine kinases (HKs) and response regulators (RRs) in a so called multistep phosphorelay (MSP). AHP proteins mediate and potentially integrate various MSP signaling pathways. The molecular basis by which the specificity among cognate partners in MSP is achieved is still not understood. In our previous work we showed interaction of receiver domain (RD) of HK CKI1 (CKI1RD) with specific subset of AHP proteins and we determined the structure of CKI1RD [1]. However, structural information about AHP proteins is missing. In this study, we expressed AHP2 in E.coli and purified it into the homogeneity. To get well-diffracting crystals, we used a thermal shift assay to identify stabilizing buffer conditions for AHP2. Based on these results, we obtained the crystals diffracted up to 2.5 Å, showing however significant anisotropic behavior. The structure was solved using single isomorphous replacement via anomalous scattering protocol with anomalous signal of the lutetium. The structure of AHP2 possesses the conserved core consisting of a four-helix bundle with the phosphorylatable histidine located in the centre of the second helix. To identify the residues responsible for recognition of both partners in MCS, the molecular model of AHP2 and CKIRD interaction was built using computational and bioinformatics approaches. The detailed description of AHP2 structure and determinants of specificity or affinity for AHPs and CKI1RD interaction will be presented. Supported by CEITEC – Central European Institute of Technology CZ.1.05/1.1.00/02.0068, GAČR 521/09/1699, P305/11/0756, ME ČR ME09016, CZ.1.05/2.1.00/01.0024, by the AS ČR AV0Z60870520. 1.Pekarova B, Klumpler T, Triskova O, Horak J, Jansen S, Dopitova R, et al. Structure and binding specificity of the receiver domain of sensor histidine kinase CKI1 from Arabidopsis thaliana. Plant J. 2011 Sep; 67(5):827-39

PROTEOME REGULATION IN ARABIDOPSIS REVEALS SHOOT- AND ROOTSPECIFIC EFFECTS OF CYTOKININS ON HORMONAL HOMEOSTASIS AND CYTOKININ-ETHYLENE SIGNALING CROSSTALK Žďárská M., Zatloukalová M., Benítez M., Šedo O., Dobisová T., Hrdinová V., Potěšil D., Novák O., Svačinová J., Pešek B., Malbeck J., Vašíčková J., Miklánková E., Zdráhal Z., Hejátko J. Functional Genomics and Proteomics of Plants and Core Facility-Proteomics, Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5/A2, CZ-625 00 Brno, Czech Republic; Laboratory of Growth Regulators, Faculty of Science, Palacky University and Institute of Experimental Botany, the Academy of Sciences of the Czech Republic, Šlechtitelů 11, CZ-783 71 Olomouc, Czech Republic; Laboratory of Mass Spectrometry, Institute of Experimental Botany, the Academy of Sciences of the Czech Republic, Rozvojová 263, CZ-165 02 Prague, Czech Republic [email protected] Cytokinins (CK) mediate a large spectrum of developmental and physiological regulations in plants. Shoot and root reveal specific and sometimes even contrary responses to CK. However, the molecular mechanisms underlying the shoot and root specificity of CK-mediated regulations remain mostly unclear. We show that differential CK-mediated proteome regulation underlies the shoot and root specificity of CK response at the hormonal metabolism and signaling levels. Overall, we identified 43/18 differentially regulated proteins in the shoot and 31/21 in the root in the early/ delayed response, respectively. We demonstrate that CK predominantly regulate proteins involved in carbohydrate and energy metabolism in the shoot and in protein synthesis and destination in the root. In the root we identified 3 out of 4 enzymes of the ethylene biosynthetic pathway to be upregulated in an early CK response, suggesting that majority of the ethylene biosynthetic pathway is under strong control of CK in the root. On the other hand, in the shoot we identified several abscisic acid (ABA)-related proteins to be upregulated by CK. To substantiate potential crosstalk of BAP with metabolism of other hormones, we analyzed changes of the endogenous hormone levels after CK application. In a good accordance with our proteomic data, we found prompt upregulation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, the ratelimiting precursor of ethylene biosynthesis in the root, while ABA was upregulated in the early response of the shoot. Furthermore, we show that CK-induced ethylene production contributes to CK response in the root and modulates multistep phosphorelay (MSP) output through the direct interaction of ethylene receptor ETR1 with AHP proteins, the members of the MSP signaling cascade. Finally, we demonstrate that MSP mediates ethylene response, thus integrating both CK and ethylene signaling. Supported by MSM0021622415, LC06034, 204/08/H054, P501/11/0736, GD522/08/ H003 and CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

91


PREPARATION, CRYSTALLIZATION AND STRUCTURAL ANALYSIS OF AHP2 PROTEIN, THE SIGNAL TRANSMITTER FROM ARABIDOPSIS THALIANA


TELOMERES OF ALGAE – INSIGHT TO TELOMERE EVOLUTION Sýkorová E., Fulnečková J., Hasíková T., Wong JTY, Fajkus J., Eliáš M., Lukešová A. Institute of Biophysics ASCR, v.v.i., Brno, Czech Republic; Faculty of Science, and CEITEC, Masaryk University, Czech Republic; Faculty of Science, University of Ostrava, Czech Republic; Department of Biology, Hong Kong University of Science & Technology, China; Institute of Soil Biology, Biology Centre ASCR, v.v.i., České Budějovice, Czech Republic [email protected] Telomeres are ubiquitous and conserved structures at the ends of eukaryotic chromosomes which had to coevolve with linear chromosomes. Basic structural unit of most telomeres, a repeated minisatellite motif of the general consensus sequence TnAmGo, is very conserved in eukaryotic groups, however exceptions to this „rule“ exist, e.g. in plants or insects. Interestingly in plant order Asparagales, the Arabidopsis-type of telomeric sequence TTTAGGG was replaced by the TTAGGG motif common in vertebrates (including human) and later it was lost in genus Allium. These changes in telomere sequence motif were found to be evolutionary switchpoints and it gives rise the question about ancestry of telomere sequences. Widespread distribution of algae in different branches of a tree of life offers unique chance to study telomere evolution. We detected telomerase activity in algae searching a collection of more than 200 algal species including major groups, e.g. green algae, dinoflagellates, euglenophytes. Our studies of algae revealed that green algae exhibit at least two groups where the ancestral TTTAGGG telomeric sequence was replaced by the Chlamydomonas type TTTTAGGG. We also found a more complex structure of telomeric repeats including a mix of ancestral TTTAGGG motifs and derived motifs identical to the human-type telomeric repeats TTAGGG in two other Chlamydomonadalean clades. Building of the 18S rRNA gene phylogeny enabled us to define telomere switchpoints related to evolution of algal telomeres. Our results indicate that telomere evolution in green algae is far more dynamics and complex than thought before. Presence of alternative TTAGGG sequence in plants, green algae and other groups evoke question how much it is a coincidence driven by similarity among basic telomeric types. Implications of our findings for the general mode of telomere evolution and maintenance will be presented. This work is supported by the Grant Agency of the Czech Republic (GACR 521/09/1912).

INSTABILITY IN CHROMATIN ASSEMBLY – LOSS OF RIBOSOMAL DNA AND TELOMERIC REPEATS IN ARABIDOPSIS THALIANA Muchová V., Dvořáčková M., Mozgová I., Fajkus J. Laboratory of Chromatin Molecular Complexes – Mendel Centre for Plant Genomics and Proteomics, CEITEC, Masaryk University, Brno, Czech Republic; Institute of Biophysics, Czech Academy of Sciences, Brno, Czech Republic [email protected] The biology of telomerases and telomeres in plants involving studies of mechanism of their regulation are the main topics in the Laboratory for Molecular Complexes of Chromatin. We are especially interested in Chromatin Assembly Factor 1 (CAF 1) – histone chaperone mediating replication-dependent nucleosome assembly. This three-subunit protein complex is well conserved and it is formed by FASCIATA 1, FASCIATA 2 and MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 subunits participating in DNA replication, double strand break repair, non-homologous end joining, homologous recombination and nucleotide excision. It was shown that the dysfunction in FAS 1 and FAS 2 genes leads to a severe loss of 45S rDNA copies and also to telomere shortening. However, it is not known which mechanism leads to this phenomenon. Because the increased level of homologous recombination was proven in fas mutant lines, we decided to add another mutation in this function and observe effects on the selected double mutant plants. The protein of our choice was RAD51B, the homolog of bacterial recombinase RecA, involved in repair of double strand DNA breaks via homologous recombination particulary in somatic cells. We observed the telomere lengths and rDNA copy number using the Terminal Restriction Fragment (TRF) analysis and Q-PCR. To assess reliably the behaviour of telomeres and rDNA another propagation of all 4 genotypes in both cases of FAS 1 and FAS 2 mutations will be needed at least to generation F4.

92

Ogrocká A., Fajkus J., Fojtová M. Faculty of Science MU; CEITEC MU; Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic [email protected] Telomeres are nucleoprotein structures located at the ends of chromosomes that perform a capping function to maintain chromosome stability and integrity. Telomeres can be maintained by the action of telomerase, a reverse transcriptase that adds telomeric repeats to the ends of chromosomes. Plant telomerase is precisely regulated during the development. In animals, involvement of epigenetic state of the telomerase reverse transcriptase (TERT) gene in the complex telomerase activity regulation was reported. Aim of this study was to elucidate if epigenetic mechanisms participate in the regulation of plant telomerase. Telomerase transcription and activity in samples of A. thaliana tissues were correlated to the AtTERT upstream region methylation and histone modifications. Gradual decrease of telomerase activity and AtTERT transcription during leaf maturation was observed. Analysis of DNA methylation in the AtTERT upstream region showed low levels of methylated cytosines without significant differences between telomerase positive and negative wild type tissues. Interestingly, high level of CG methylation was found in the AtTERT coding region, although this type of methylation is a characteristic for constitutively expressed genes. Analysis of chromatin modifications in the AtTERT upstream region revealed slightly increased loading of the H3K27me3 mark in the telomerase negative tissue compared to telomerase positive tissue, while H3K4me3, H3K9Ac and H3K9me2 were approximately of the same range. General chromatin structure of the AtTERT gene was maintained. These data indicate interesting differences between animal and plant cells in the mechanisms involved in developmental regulation of TERT which may reflect a unique attribute of plants – their totipotency. This is consistent with a reversible and dynamic character of telomerase silencing. This work was supported by the Czech Science Foundation, Grant Agency of the AS CR, institutional funding and CEITEC.

S-NITROSOGLUTATHIONREDUKTASA – KLÍČOVÝ ENZYM REGULACE S-NITROSYLACE V ODPOVĚDI ROSTLIN NA STRESOVÉ PODMÍNKY Jahnová J., Kubienová L., Piterková J., Tichá T., Kopečný D., Tylichová M., Luhová L., Petřivalský M. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci [email protected] S-nitrosoglutathionreduktasa (GSNOR), známá také jako S-(hydroxymethyl)glutathiondehydrogenasa (EC 1.1.1.284), patří do rodiny alkoholdehydrogenas třídy 3. GSNOR katalyzuje NADH-dependentní redukci S-nitrosoglutathionu a účastní se tak udržování homeostázy S-nitrosothiolů a regulace proteinové S-nitrosylace. Provedli jsem detailní biochemickou a strukturní charakterizaci rostlinné GSNOR z rajčete (Solanum lycopersicum) exprimované v E. coli. Byly určeny kinetické parametry purifikovaného enzymu, včetně pH a teplotního optima, substrátové specifity a inhibičních vlastností. Byly určeny krystalové struktury apoenzymu a enzymu v komplexu s NAD+ a s NADH a glutathionem v rozlišení 1,9 Å. Bylo potvrzeno, že vazba koenzymu je spojena s pohybem atomu zinku v aktivním místě enzymu a změnou jeho koordinace. Ve srovnání s lidskou GSNOR, rostlinná GSNOR vykazuje odlišné složení anionvazebné kapsy, což snižuje afinitu ke karboxylu omega-hydroxymastných kyselin. Byla studována genová exprese, enzymová aktivita a hladina proteinu GSNOR během vývoje rostlin a jejich odpovědi na abiotické a biotické stresové podmínky, včetně lokální a systémové odpovědi na infekci biotrofním patogenem Oidium neolycopersici. Tento výzkum byl podpořen granty MŠMT ČR LH11013 a IGA 2012_012 Univerzity Palackého.

93


DEVELOPMENTAL MAINTENANCE OF GENERAL EPIGENETIC PATTERN OF THE ARABIDOPSIS THALIANA TERT (TELOMERASE PROTEIN SUBUNIT) CHROMATIN

S E KCE 1 1 – S TRUK T URA A F UNK C E B I OM OL E KUL

STRUCTURAL INSIGHT INTO THE MOLECULAR MACHINERY MEDIATING ENDOPLASMIC RETICULUM-ASSOCIATED DEGRADATION OF PROTEINS Arumughan A., Hanna J., Heinemann U., Horn S., Jarosch E., Roske Y., Schütz A., Sommer T., Wanker E., Zimmermann F. Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Berlin-Buch, Germany [email protected] Up to one in two protein chains reaching the lumen of the endoplasmic reticulum turn out to be incompetent in acquiring their native folding state. These dysfunctional proteins are recognized by endoplasmic reticulum-associated protein degradation machineries centered around the membrane-bound ubiquitin ligases Hrd1 and Doa1. The lectin Yos9 is involved in identifying misfolded protein chains in the ER lumen of yeast. The crystal structure of a central domain of Yos9 provided evidence for the dimeric organization of the lectin which was supported by site-directed mutagenesis and analytic ultracentrifugation (1). Earlier work on the Usa1 subunit of the HRD ligase complex had demonstrated homotypic protein-protein interactions on the cytoplasmic side of the complex (2). Taken together, these results provide evidence for a dimeric or higher oligomeric structural organization of the HRD ligase complex. The AAA ATPase (ATPase associated with various cellular activities) Cdc48 (p97 in humans) co-operates with the HRD ligase by delivering poly-ubiquitinated proteins to the proteasome for degradation. In addition, p97 serves a multitude of additional cellular functions. The functional selection is mediated by adaptor proteins containing ubiquitin regulatory-X (UBX) domains that bind in various stoichiometries to p97 hexamers. We have identified the ASPL (alveolar soft part lymphoma locus) protein as a unique UBX adaptor that binds p97 with high affinity and promotes the disassembly of p97 hexamers. ASPL binding results in a heterotetrameric p97-ASPL complex and in a functional inactivation of the AAA ATPase. References (1) Hanna et al. (2012) J Biol Chem 287, 8633-8640 (2) Horn et al. (2009) Mol Cell 36, 782-793

ROLE OF 14-3-3 PROTEINS IN THE REGULATION OF G-PROTEIN SIGNALING Obšil T. Charles University in Prague, Faculty of Science [email protected] In response to specific agonist signals, G protein-coupled receptors (GPCR) act as guanine nucleotide exchange factors and promote the exchange of GDP for GTP on the G-alpha subunit of heterotrimeric G proteins. This process is followed by a dissociation of GTP-bound G-alpha from the G-beta/gamma complex. Both G-alpha and G-beta/gamma are thus activated and can propagate downstream signaling via effectors and second messengers. The amplitude and duration of G protein signaling are regulated at the G protein level by two different mechanisms. The first one involves the inhibition of G-beta/gamma interactions with G-alpha-GDP and downstream effectors, whereas the second one is based on the enhancement of the low intrinsic GTPase activity of the G-alpha subunit. The first mechanism is carried out by phosducin while the second one by a regulator of G protein signaling (RGS). The function of both phosducin and RGS proteins is tightly regulated through various mechanisms including posttranslational modifications and interactions with other proteins including the 14-3-3 proteins. The 14-3-3 proteins are a family of regulatory proteins that function as molecular scaffolds. To elucidate the mechanism of the 14-3-3 protein-dependent regulation of both phosducin and RGS function, we performed a biophysical characterization of their complexes with the 14-3-3 protein. Our results show that the 14-3-3 protein affects the structure of both phosducin and RGS3 protein as well as sterically blocks their G-protein binding surfaces. Thus, our results can explain the observed 14-3-3 protein-dependent inhibition of both phosducin and RGS3 function. Acknowledgements: This work was funded by Grant IAA501110801 of the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic.

94

Kubicek K., Cerna H., Holub P., Hrossova D., Jasnovidova O., Pasulka J., Hofr C., Loehr F., Vanacova S., Stefl R . CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5/A4, CZ-62500 Brno [email protected] RNA polymerase II (RNAPII) is not only the key enzyme of gene expression but also the central coordinator of cotranscriptional processing. It associates with a few dozens of protein factors. The recruitment of specific factors is dictated by different modification patterns in the C-terminal domain (CTD) of RNAPII, creating the concept of a CTD code. Despite the fact that the concept has been presented about a decade ago it remains, however, unclear how the CTD recruits, activates, and displaces the appropriate processing factors in coordination with the transcription cycle. Association of specific factors with the CTD is dictated by different post-translational modification patterns and conformational changes in the CTD that consists of tandem repeats of the heptapeptide consensus Y1-S2-P3-T4S5-P6-S7, up to 26 and 52 repeats in yeast and humans, respectively. In the presentation, our approach towards the understanding of the structural basis of the CTD code employing combination of NMR, small-angle X-ray scattering (SAXS), fluorescent anisotropy (FA) and other complementary methods will be presented.

STRUCTURE AND REACTION MECHANISM OF PLANT MULTIFUNCTIONAL PHOSPHODIESTERASE Kovaľ T., Lipovová P., Podzimek T., Matoušek J., Stránský J., Dušková J., Skálová T., Hašek J., Dohnálek J. Institute of Macromolecular Chemistry, AS CR,v.v.i., Prague; Institute of Chemical Technology, Prague; Institute of Plant Molecular Biology, Biology Centre, AS CR,v.v.i., Ceske Budejovice [email protected] TBN1 from Solanum lycopersicum (277 amino acids, 37 kDa) is a Zn-dependent plant phosphodiesterase, nuclease unspecific to sugar component of nucleic acids with 3’ nucleotidase and phospholipase activities. TBN1 plays an important role in specific apoptotic functions and also exhibits anticancerogenic properties [1].Recombinant TBN1 was produced in N. benthamiana leaves. Crystals were obtained using a combination of salt and polymer. Datasets for structural analysis were collected at BESSY II (Helmholtz-Zentrum Berlin) [2, 3]. The final model was built and refined using data with 2.15 Å resolution. Three oligosaccharides bonded on the surface serve as a shielding of the hydrophobic regions and therefore contribute to solubility of the enzyme. Oligomerization of TBN1 is mediated by binding of peptide chain into the active site of neighboring molecule and can be induced by phosphate ions. The catalytic Zn2+ cluster is coordinated at the bottom of the active site cleft. Hydrolysis of the phosphodiester bond is caused by a nucleophilic attack of the activated water (hydroxide) molecule followed by formation of pentacoordinated transition state and its breakup into the products. Based on the distribution of surface residues the possible binding sites for nucleic acids with secondary structure were identified. The work on this project was supported by the Czech Science Foundation, projects no. 310/09/1407, P302/11/0855, 202/06/0757 and 521/09/1214. We also acknowledge support from the Ministry of Education, Youth and Education of the Czech Republic, project BIOPOL, no. CZ.1.07/2.3.00/30.0029. References 1. J. Matousek, T. Podzimek, P. Pouckova, J. Stehlik, J. Skvor, P. Lipovova, J. Matousek, Neoplasma, 57, (2010), 339-348. 2. T. Koval, P. Lipovova, T. Podzimek, J. Matousek, J. Duskova, T. Skalova, A. Stepankova, J. Hasek, J. Dohnalek, Acta. Cryst. F67, (2011), 124-128. 3. J. Dohnalek, T. Koval, P. Lipovova, T. Podzimek, J. Matousek, J. Synch. Rad., 18, (2011), 29-30.

95


TOWARDS UNDERSTANDING OF THE CTD CODE


STRUCTURE OF THE EFFECTOR-BINDING DOMAIN OF ARABINOSE REPRESSOR ARAR FROM BACILLUS SUBTILIS Procházková K., Čermáková K., Pachl P., Sieglová I., Fábry M., Řezáčová P. Institute of Organic Chemistry and Biochemisty, Academy of Sciences of the Czech Republic, Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic; Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Videnska 1083, Prague 4, Czech Republic [email protected] Abstract Arabinose repressor AraR in Bacillus subtilis negatively controls expression of genes in the metabolic pathway of arabinose containing polysaccharides. The protein is composed of two domains of different phylogenetic origin and function: the N-terminal DNA binding domain belonging to GntR family and the C-terminal effector binding domain, a GalR/LacI family member. We determined the crystal structure of the C-terminal effector-binding domain of AraR in complex with the effector L-arabinose at 2.2 Å resolution. The L-arabinose binding affinity was characterized by isothermal titration calorimetry and differential scanning fluorimetry, the Kd value was 8.4 ± 0.4 mM. Effect of L-arabinose on the protein oligomeric state and stability was investigated in a solution by gel filtration and differential scnning fluorimetry, respectively. Detailed analysis of crystal identified dimer organization distinctive from other members of the GalR/LacI family.

STRUCTURE-FUNCTION STUDY ON MAIZE ENZYMES CONNECTED TO CYTOKININ METABOLISM – NUCLEOSIDE N-RIBOHYDROLASES AND ALDEHYDE DEHYDROGENASES Tylichová M., Kopečný D., Vigouroux A., Končitíková R., Blaschke H., von Schwartzenberg K., Moréra S. Department of Protein Biochemistry and Proteomics, CRH, Palacký University, Olomouc, Czech Republic; Laboratoire d‘Enzymologie et Biochimie Structurales, CNRS, Gif-sur-Yvette, France; Biozentrum Klein Flottbek, Universität Hamburg, Germany [email protected] Cytokinins are the plant hormones and consist of an adenine/adenosine moiety carrying an N6-isoprenoid or aromatic side chain. Their irreversible inactivation by cytokinin oxidase/dehydrogenase (CKO) leads to adenosine/adenine and corresponding aldehyde. Up to now, the fate reaction products remains unclear. This work focuses on two enzyme groups possibly involved in their metabolism – nucleoside N-ribohydrolases (NRHs) catalyzing conversion of adenosine to adenine and aldehyde dehydrogenases (ALDHs) oxidizing aldehydes to corresponding acids. NRHs are glycosidases that catalyze the excision of the N-glycosidic bond in nucleosides to allow recycling of the nitrogenous bases and ribose. NRHs belong to metalloproteins. We analyzed several NRHs from two model plants – moss (Physcomitrella patens) and maize (Zea mays) and solved crystal structures of both representatives. The enzyme comprises four Asp residues in a conserved sequence motif DXDXXXDD at the N terminus involved in catalysis and coordination of a calcium ion at the active site. The binding of ribose moiety is highly conserved but the residues interacting with nucleobase highly vary. Therefore all NRHs characterized so far impose a strict specificity for the ribose moiety, but they exhibit variability in their preferences for the nucleobase (pyrimidine/purine). The substrate specificity is determined by flexible loops over the active site. The interacting residues positioned on a major loop were identified by site-directed mutagenesis. ALDHs comprise a protein superfamily of NAD(P)+-dependent enzymes and eliminate biogenic and xenobiotic aldehydes to the corresponding carboxylic acids. We analyzed several ALDHs from maize belonging to families 2, 3, 7 and 10. As a result, we identified enzymes from family 2, which are able to oxidize both aliphatic and aromatic aldehydes produced during cytokinin degradation. This work was supported by grant P501/11/1591 from the Czech Science Foundation.

96

MoFlo® Astrios™ Cell Sorter

Biomek®

Laboratory Automation

OptimaTM XE/XPN New Generation of Ultracentrifuges

www.beckman.com www.coulterﬂow.com

Novinka: Muse™ Chytrá analýza buněk v miniaturním formátu Vskutku revoluční řešení analýzy buněk, které nezabere více než 20 × 22 × 28 cm Vašeho pracovního prostoru, ale umožní Vám analyzovat životnost buněk, apoptózu a buněčný cyklus ve velkém stylu. Analyzátor buněk Muse™ má integrovanou miniaturní průtokovou celu, laserovou a dvojitou fluorescenční optiku pro současné měření tří parametrů na každé buňce a velkou dotykovou obrazovku pro snadné ovládání a průběžné zobrazování výsledků Vašich měření. Muse™ není jen malý a šikovný ale i skvěle vypadá! Důkazem je ocenění prestižní designovou cenou red dot Product Design 2012 Award v kategorii Life Science and Medicine.

Dostupné kity: – Muse Count & Viability – Muse Annexin V & Cell Death – Muse Caspase 3/7 – Muse MultiCaspase – Muse MitoPotential – Muse Cell Cycle Zaujal Vás nový analyzátor buněk Muse™? Máte zájem o uspořádání mini semináře na toto téma nebo o předevdení přístroje přímo u Vás v laboratoři? Potom neváhejte a kontaktujte nás! www.millipore.com/muse www.merckmillipore.cz

Adam: „Skladování senzorů a vzorků na různých místech může mít vliv na výsledné pH.”

Tereza: eza: „Teplota Vašich rukou může ovlivnit výsledky pipetování.”

František: „I sluneční světlo může mít negativní účinek na výsledky vážení.”

Chcete vědět proč? Navštivte www.mt.com/LifeScience , registrujte se a získejte cenné tipy a triky od našich odborníků

Bařinka C. Institute of Biotechnology AS CR [email protected] Studies focused on glutamate carboxypeptidase II (GCPII) show that this zinc-dependent membrane-bound metalloprotease can serve as a target for the imaging and treatment of prostate cancer and neurologic disorders. Consequently, the enzyme attracts broad interest from both academic and industrial laboratories aimed at the design and development of GCPII-specific inhibitors. To identify novel small-molecule ligands targeting GCPII we used three complementary approaches including in silico screening, high-throughput in vitro testing and finally a structure-based design approach. Combined results allowed us to identify several novel GCPII-specific inhibitory scaffolds that can further be optimized to achieve required biophysical and biological properties.

ANALYSIS OF BIOMOLECULAR INTERACTIONS BY SURFACE PLASMON RESONANCE Bumba L. Institute of Microbiology, Videnska 1083, 14220 Prague [email protected] Surface Plasmon Resonance (SPR) is a physical process that can occur when plane-polarized light hits a metal film under total internal reflection conditions. This phenomenon is employed as an excellent technique to measure biomolecular interactions in real-time in a label free environment. In this method, one of the interacting partners (ligand) is immobilized to the sensor surface, while the other (analyte) is free in solution and passed over the surface. The kinetic parameters of the interactions are further calculated from association and dissociation curves. This lecture will introduce a SPR optical biosensor “ProteOn XPR36 protein interaction array system“ recently installed at the Institute of Microbiology in Prague. This system generates a 6 x 6 interaction array for the simultaneous analysis of up to six ligands with up to six analytes which enables analysis of up to 36 different protein interactions in a single run on a single chip. Few examples, such as protein-protein interaction of adenylate cyclase toxin (CyaA) with integrin receptor CD11b/CD18, lipid-protein interaction of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) with membrane channel TrpV1, or DNA-protein interaction of transcription factor FoxO4 with target DNA, will be presented to show the throughput, flexibility and versatility of this instrument.

97


TOWARDS NOVEL INHIBITORS OF HUMAN GLUTAMATE CARBOXYPEPTIDASE II – FROM HIGH THROUGHPUT SCREENING TO STRUCTURE-BASED DESIGN


STRUCTURAL INSIGHT INTO BINDING VARIABILITY OF ASPERGILLUS FUMIGATUS LECTIN Houser J., Komárek J., Kostlánová N., Cioci G., Imberty A., Wimmerová M. Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno; National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno; ESRF, Grenoble (FR); CERMAVCNRS, Grenoble (FR) [email protected] Lectins are carbohydrate binding proteins that usually contain more than one binding sites per structural unit. In many cases their multivalency is achieved by homooligomerization and binding sites are therefore equivalent. However, members of some lectin families contain more binding sites per monomer. These sites differ not only in binding affinities but also in specificity. Unfortunately, determining of exact properties of single binding site is complicated in such cases and sometimes even impossible. Aspergillus fumigatus is well known allergen and opportunistic pathogen as well. We have identified one lectin that is present on conidia surface and thus can be involved in host tissue binding. The binding experiments clearly showed presence of more than one type of binding sites. By preparing protein crystals and solving the 3D structure by X-ray diffraction, we were able to identify six binding sites per monomer. The more complex analysis of structures with different ligands distinguished different binding pattern of each binding site that results in variable specificity and can be correlated with other experimental data. The combination of protein X-ray crystallography and functional studies of lectin-ligand interactions proved itself to be a useful tool for further research in antiadhesive drugs development and/or mutant lectins design for specific use in biotechnology. This work was supported by Ministry of Education of the Czech Republic (ME08008), Grant Agency of the Czech Republic (303/09/1168), the European Community‘s Seventh Framework Program under the „Capacities“ specific programme (Contract No. 286154) and CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund.

98

Zbořil P. Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta MU, Brno [email protected] Výuka biochemie je úzce spjata se vznikem a rozvojem samotného oboru. Ten lze datovat do konce 20. let minulého století a je spjat se jmény V. Úlehly a V. Morávka. Tak lze za prvotní zdroj nové discipliny označit fysiologii, když snahy ustavit ji jako chemickou disciplinu nebyly akceptovány. Výuka biochemie pak byla zprvu součástí jiných předmětů a jako samostatně vyučovaná se konstituuje až po válce a to nejprve na farmaceutické fakultě. Na fakultě přírodovědecké se začíná samostatně přednášet počátkem 50. let. Základní přednášky z biochemie jsou posupně doplňovány speciálními předměty souvisejícími jak s rozvojem oboru tak odborným zaměřením katedry – biochemické metody, klinická biochemie, enzymologie a bioenergetika. Důležitou součástí výuky jsou i praktická laboratorní cvičení. Významným impulzem pro rozvoj výuky biochemie jsou akreditace v 80. letech, kdy se objevují temata biotechnologií a problematiky životního prostředí. Tehdy také dochází k postupnému osamostatňování biochemie jako interdisciplinárního svébytného oboru. Další etapu rozvoje pak představuje období 90. let, kdy dochází ke změně koncepce studia. Kreditový systém a variabilní tvorba učebních plánů přináší jednak nové možnosti i potřeby speciálních přednášek, které jsou studentům nabízeny, současně také modifikaci stávajících. Do této etapy spadá též období výstavby nového univerzitního kampusu, kam se katedra stěhuje a organizačně se mění na Ústav biochemie. Nové prostory dávají možnost vzniku specializovaných pracovišť a též dochází ke vzniku dalších ústavů zabývajících se příbuznou tematikou. Jiným projevem možností současné etapy je kvantitativní nárůst posluchačů a možnosti jejich interdisciplinární výchovy. To klade opět požadavky na rozsahovou i obsahovou optimalizaci výuky, kde značnou roli hrají aktivity řešitelských skupin podílejících se na Operačních programech Evropských sociálních fondů.

TRADÍCÍA ODOVZDÁVANIA INFORMÁCIÍ O VÝUČBE LEKÁRSKEJ CHÉMIE A BIOCHÉMIE NA LEKÁRSKYCH FAKULTÁCH V SR A ČR (VÝZNAM OSOBNOSTI UČITEĽA PRE ZAUJATIE ŠTUDENTA) Ďuračková Z., Országhová Z. a Muchová J. Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie LF UK v Bratislave, Slovensko [email protected] Už 60 rokov sa uskutočňujú pravidelné stretávania učiteľov lekárskej chémie, biochémie a v ostatných rokoch aj klinickej biochémie na lekárskych fakultách v SR a ČR. Prvé stretnutie sa uskutočnilo v Prahe v roku 1952 a zorganizoval ho prof. A.F. Richter. Na začiatku sa tieto stretnutia zaoberali len problémami výučby chémie a biochémie. Neskôr k tejto problematike pribudli aj diskusie o prijímacích pohovoroch na lekárske fakulty z chémie, ako aj o úrovni budúcich študentov. V súčasnosti tieto témy dopĺňa záujem o doktorandské štúdium a využitie moderných technológií pri výučbe a vyhodnocovaní vedomostí študentov (e-learning, testové elektronické skúšanie, atď). V posledných rokoch pedagogické aktivity dopĺňa prezentácia vedecko-výskumného zamerania jednotlivých ústavov lekárskej chémie a biochémie najmä mladými spolupracovníkmi a doktorandmi, čo vytvára podmienky aj na budovanie vedeckej spolupráce medzi kolegami z jednotlivých lekárskych fakúlt a medzi ústavmi. Posledné stretnutie sa uskutočnilo 15. – 16. 9. 2011 v Hradci Králové. Na tomto stretnutí dominovali otázky, či lekársku chémiu vyučovať, alebo ju opakovať v rámci lekárskej biochémie. Bohatú diskusiu vyvolal problém výučby lekárskej biochémie zahraničných študentov a jeho osobitosti. V súvislosti s využívaním IT technológií sa do popredia dostáva otázka týkajúca sa účasti učiteľa najmä na prednáškach z lekárskej chémie a biochémie a význam osobnosti učiteľa pre zaujatie študenta. Posledne spomínané otázky budú diskutované na prednáške.

99

S E KCE 1 2 – VÝUK A B I OC H E M I E

VÝUKA BIOCHEMIE NA PŘÍRODOVĚDECKÉ FAKULTĚ MU, HISTORIE A SOUČASNOST


VYUŽITÍ MULTIMEDIÁLNÍCH TECHNIK A INTERAKTIVNÍCH PŘÍSTUPŮ VE VÝUCE BIOCHEMIE NA LÉKAŘSKÉ FAKULTĚ MASARYKOVY UNIVERZITY Paulová H., Tomandl J., Táborská E. Biochemický ústav LF MU [email protected] V současné době se ve všech vědních oborech výrazně projevuje trend obsahující nové interaktivní metody ve výuce. Soudobé vzdělávání se dynamicky vyvíjí a nevyhnutelně zahrnuje propojování tradičních metod s novými přístupy k výuce. Multimediální technologie umožňují zefektivnit a obohatit výuku a učinit ji více názornější i atraktivnější. Při výuce biochemie na Biochemickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity (LF MU) jsme se zaměřili mimo jiné na vytváření našich vlastních multimediálních pomůcek. Pro potřeby konkrétních témat probíraných v seminářích a praktických cvičeních si vytváříme vlastní spoty, animace biochemických dějů a natáčíme videozáznamy metodických postupů. Tyto produkty jsou prezentovány ve výuce a současně jsou studentům zpřístupněny v interaktivních osnovách daného předmětu v informačním systému MU. Vybavení našich učeben, které průběžně modernizujeme v rámci grantů, nám umožňuje plně využívat možnosti soudobých multimediálních technologií. Seminární forma výuky je vedena jako diskuze k danému tématu a pro vyšší aktivizaci studentů jsme zavedli použití aplikace Turning Point. Jedná se o interaktivní systém, který umožňuje okamžité zapojení všech studentů pomocí hlasovacích zařízení, jimiž studenti odpovídají na položenou otázku. Aplikace Turning Point poskytuje okamžité vyhodnocení a tím bezprostřední zpětnou vazbu. Zároveň umožňuje rychlé testování znalostí jednotlivých studentů a současně také dovoluje vyhodnocovat výsledky v rámci předem stanovených skupin studentů, čímž se výrazně stimuluje aktivita a přirozená soutěživost studentů. Na konci semestru si formou dobrovolného dotazníku zpětně analyzujeme odezvu studentů na tyto nové formy.

INOVACE PŘEDMĚTŮ BIOCHEMIE A KLINICKÉ BIOCHEMIE V RÁMCI SPEKTRA OBORŮ LÉKAŘSKÉ FAKULTY A FAKULTY ZDRAVOTNICKÝCH VĚD SMĚREM K LEPŠÍMU UPLATNĚNÍ ABSOLVENTŮ V OBLASTI VĚDY, VÝZKUMU I PRAXE Ulrichová J., Kosina P. Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc [email protected] Hlavním cílem projektu je profilace absolventů studia vybraných oborů na Lékařské fakultě a Fakultě zdravotnických věd směřující k jejich větší flexibilitě s ohledem na budoucí uplatnění v praxi. Projekt vycházel z požadavků a zájmu studentů o praktické využití znalostí a je zaměřen na inovaci výuky předmětů biochemie, klinické biochemie a patobiochemie s důrazem na moderní výukové metody s využitím e-learningu a progresivních informačních technologií. Klíčovými aktivitami jsou inovace obsahu přednášek, praktických cvičení a seminářů a jejich rozšíření o aktuální poznatky a metodiky z biomedicínských věd. Součástí modernizované výuky jsou např. nově vytvořené e-learningové moduly; populárními se staly přednášky zahraničních odborníků a specialistů zaměřené především na schopnost využít a interpretovat získané teoretické poznatky a metodické postupy v klinické a výzkumné práci. V rámci prezentace řešeného projektu budou uvedeny příklady inovovaných výukových opor, ukázky vytvořených výukových videozáznamů, modelové zkušební testy a fotodokumentace z průběhu řešení projektu i z pořádaného „Dne vědy“. Zhodnocena bude také zpětná vazba provedených změn výuky, získaná od studentů i vyučujících. Poděkování: Tento příspěvek byl podpořen projektem OPVK MŠMT Reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0293 .

100

Rajdl D., Racek J., Klečková M., Pikner R., Dastych M., Šafarčík K., Průša R., Zima T. Ústav klinické biochemie a hematologie, UK v Praze, Lékařská fakulta v Plzni a FN v Plzni; Oddělení klinické biochemie, MU v Brně a FN Brno; Ústavu klinické biochemie a patobiochemie, UK v Praze – 2. lékařská fakulta a FN v Motole; Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, UK v Praze – 1. lékařská fakulta a VFN v Praze; Oddělení klinických laboratoří, Nemocnice Klatovy, a.s. [email protected] Cílem prezentace je shrnout naše zkušenosti ze 3 e-learningových projektů, které aktuálně rozvíjíme. Posluchačům chceme nabídnout inspiraci pro jejich vlastní vzdělávací projekty nebo i participaci na těchto projektech (chronologicky dle vzniku) : CEVA (Centrum Edukace a Vzdělávání Abbott, od 2008) – http://www.ceva-edu.cz, E-klinická biochemie (č. projektu: CZ.1.07/2.2.00/15.0048, od 2011) – http://ebio.biochemik.org a BioHema (č. projektu: CZ.1.07/3.2.02/02.0003, od 2011) – http://www.biohema.cz. CEVA je věnována postgraduální výuce laboratorní medicíny, cílovým publikem jsou tedy lékaři, bioanalytici, zdravotní laboranti i sestry. Portál publikuje každý týden 1 odborný článek a k dispozici jsou edukační kurzy s kredity celoživotního vzdělávání. CEVA pořádá i videokonference na zajímavá aktuální témata laboratorní medicíny. E-klinická biochemie je tříletý projekt (začátek 1. 2. 2011) zaměřený na pregraduální výuku klinické biochemie na lékařských fakultách. Projekt má několik cílů: – vzdělávání autorů v nových možnostech, způsobech a nástrojích pro tvorbu e-learningu – vytvoření společné e-learningové učebnice klinické biochemie (zejména jako podpory prezenční výuky) – navázání dlouhodobé spolupráce a tvorba pedagogických týmů napříč univerzitami Pracovní stránky (určené převážně pro řízení projektu) najdete na http://ebio.biochemik.org , vlastní obsah je tvořen v Google Dokumentech a v další fázi i v Moodle MEFANETu (https://moodlemefanet.cuni.cz/). BioHema – je tříletý projekt (začátek řešení 1.1.2011) zaměřený na postgraduální vzdělávání nelékařských zdravotnických pracovníků (zejména zdravotních laborantů a všeobecných sester) v klinické biochemii a hematologii. Cílem projektu je vytvoření komplexní soustavy distančních kurzů z témat klinické biochemie a hematologie, které budou mít přiděleny kredity celoživotního vzdělávání. Výukové materiály budou kombinovat hypertext, prezentace s mluveným komentářem a testy.

BIOCHEMIE VE VZDĚLÁVÁNÍ UČITELŮ NA PŘÍRODOVĚDECKÉ FAKULTĚ UNIVERZITY KARLOVY V PRAZE Klímová H., Teplá M., Martínek V. Katedra učitelství a didaktiky chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze [email protected] Biochemie je součástí chemie ve studijních plánech chemického vzdělávání na všech jeho úrovních. Na gymnáziích je zařazena do vzdělávacího oboru Chemie, který společně Fyzikou, Biologií, Geografií a Geologií spadá do vzdělávací oblasti Člověk a příroda. Z výzkumů, které jsme prováděli na středních školách vyplynulo, že biochemie je zařazována na závěr studia, často je z časových důvodů nedostatečně probírána, opomíjen je její experimentální charakter a je chápána jako nejobtížnější učivo. Proto jsme zařadili na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy v Praze biochemii do všech stupňů studia učitelství chemie pro střední školy a snažíme se vést studenty k chápání biochemie jako atraktivního, prospěšného a experimentálně zajímavého oboru provázaného s ostatními chemickými disciplínami a s biologií. V bakalářském stupni je biochemie povinná v rozsahu 8 hodin a 8 kreditů, včetně biochemického praktika a je zařazena jako povinný předmět státní bakalářské zkoušky. V navazujícím magisterském stupni je biochemie povinně volitelná v rozsahu 3 hodin a 3 kreditů v dvouoborovém studiu a povinná ve stejném rozsahu v jednooborovém studiu. Navazuje na základní přednášku z biochemie v bakalářském stupni, doplňuje, shrnuje a opakuje témata biochemie v kontextu požadavků ke státní magisterské zkoušce, kde je povinně volitelným předmětem. Součástí učitelského studia v magisterském stupni jsou oborové didaktiky. Didaktika biochemie je povinný předmět jehož s cílem je orientovat studenty učitelství především na obsahové problémy výuky biochemie na středních školách, na tvorbu biochemických didaktických materiálů a na hodnocení výukových biochemických prezentací a dynamických animací na našich i zahraničních webových stránkách. K tomuto předmětu vytváříme biochemický webový portál jako komunikační prostředí mezi studenty a pedagogy, který plánujeme zpřístupnit učitelům i žákům středních škol s cílem iniciovat odbornou a didaktickou komunikaci mezi středními školami a fakultou.

101


E-LEARNING V KLINICKÉ BIOCHEMII – SPÁSA NEBO CESTA DO ZÁHUBY?


VOLITELNÉ PŘEDMĚTY VE VÝUCE LÉKAŘSKÉ CHEMIE A BIOCHEMIE NA 1. LF UK V PRAZE Malbohan,I.M., Klenerová,V., Štípek,S., Vejražka,M. Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN v Praze [email protected] Vzhledem k absenci výuky lékařské chemie v prvním ročníku jsme zavedli volitelný předmět Základy lékařské chemie, o který je mezi studenty velký zájem. Je určen zejména pro studenty prvního ročníku lékařství a v jeho syllabu jsou zdůrazněny partie z obecné, fyzikální a organické chemie potřebné pro studium biochemie. Pro studenty třetích a vyšších ročníků jsou určeny dva specializované volitelné předměty: 1) Aplikace biochemie v klinické medicině, která navazuje na výuku biochemie a patobiochemie a předchází výuce klinické biochemie. Je určena pro omezený počet studentů a výuky je prováděna seminární formou, při které se probírají reálné kasuistiky a interpretují se laboratorní projevy onemocnění včetně komorbidit. 2) Neurobiologie poruch chování. Tento předmět je věnován neurobiochemii a základům neurofarmakologie s ohledem na patologické stavy v uvedené oblasti mediciny. Výuky je realisována formou přednášek, o které je mezi studenty vyšších ročníků také značný zájem. Uvedený přehled je možno doplnit ještě o volitelný předmět Biochemie volných radikálů, který je však vyučován na Ústavu biochemie a experimentální onkologie naší fakulty.

INOVACE PRAKTICKÉ VÝUKY V RÁMCI STUDIA BIOCHEMIE NA UP V OLOMOUCI Petřivalský M., Luhová L. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci [email protected] V r. 2001 byl na PřF UP v Olomouci otevřen studijní obor Biochemie. Prof. P. Peč, zakladatel Kat. biochemie, zpracoval v projektu „Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu“ výukové materiály pro předmět Biochemie doprovázené videozáznamy přednášek. Moderní zpracování výukových podkladů bylo pozitivně hodnoceno studenty. Na tento projekt navazuje e-learningové zpracování výukových materiálů pro předmět Laboratorní cvičení z biochemie, cvičení z Klinické biochemie a z Imunologie vypracované v projektu OpVK „ImBio“. Texty úloh jsou doprovázeny fotodokumentací a videozáznamy z jejich provedení. Pro potřeby studentů bakalářského, magisterského a doktorského studia byly v projektu OpVK „AescuLab“ zpracovány ve formě 110 modulů základní i pokročilé metody biochemie, imunologie a molekulární a buněčné biologie. Metody jsou doplněny názornou fotodokumentací, videozáznamy, ukázkami vyhodnocení výsledků a řešení problémů. Studenti si metody během 350 workshopů prakticky vyzkoušeli. Vzhledem k pozitivnímu ohlasu u studentů budou vypracovány v rámci dalšího projektu OpVK „FytoChem“ e-learningové studijní materiály také pro předměty Rostlinná biochemie, Fytopatologie, Biotechnologie a Metabolické regulace. Projekty OpVK umožnily zvýšit úroveň studia biochemie nejen moderním zpracováním výukových materiálů, ale také realizací praxí, zahraničních stáží a odborných workshopů a seminářů v projektu OpVK „BioLink“. Inovace výuky je podpořena granty OpVK AescuLab – systematické laboratorní vzdělávání studentů a pracovníků VaV v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu; ImBio – Tvorba obsahu vzdělávacích modulů předmětu Laboratorní cvičení z biochemie, BioLink – Podpora spolupráce mezi akademickou sférou a praxí v oblasti biochemieckých oborů, FytoChem – mezioborová integrace výuky zaměřená na rostlinnou biochemii a Fytopatologii, BiochemNet – Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi.

102

Breier A., Gibalova L., Seres M., Barancik M., Sulova Z. Institute of Molecular Physiology and Genetics, SAS, Bratislava; Institute for heart research, SAS, Bratislava [email protected] Multidrug resistance (MDR) of cancer tissue is a phenomenon in which cancer cells exhibit reduced sensitivity to a large group of unrelated drugs with different mechanisms of pharmacological activity. Mechanisms that reduce cell sensitivity to damage induced by a variety of chemicals were found to be caused by diverse, albeit well-defined, phenotypic alterations. The molecular basis of MDR commonly involves overexpression of the plasma membrane drug efflux pump – P-glycoprotein (P-gp) a ABCB1 member of the ABC transporter family. Drugs that are potential inducers of P-gp are often substrates of this transporter. However, several substances that have been proven to not be transportable by P-gp (such as cisplatin or all-trans retinoic acid) could induce minor improvements in P-gp overexpression. It is generally accepted that the drug efflux activity of P-gp is a major cause of reduced cell sensitivity to several chemicals. However, P-gp may have side effects that are independent of its drug efflux activity. Several authors have described a direct influence of P-gp on the function of proteins involved in regulatory pathways, including apoptotic progression (such as p53, caspase-3 and pokemon). Moreover, alterations of cell regulatory pathways, including protein expression, glycosylation and phosphorylation, have been demonstrated in cells overexpressing P-gp, which may consequently induce changes in cell sensitivity to substances that are not P-gp substrates or modulators. Thus, P-gp-mediated MDR represents a more complex process than was expected, and the unintended effects of P-gp overexpression should be considered when describing this phenotype. The present contribution aims to provide the most current information about P-gp-mediated MDR while paying particular attention to the possible dual function of this protein as a drug efflux pump and a regulatory protein that influences diverse cell processes.

CYTOCHROMY P450 – OD STRUKTUR K INTERAKCÍM S LÁTKAMI NEJRŮZNĚJŠÍHO PŮVODU Anzenbacher P., Anzenbacherová E. Ústav farmakologie; a Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta University Palackého v Olomouci, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc [email protected] Přes padesát let uplynulo od objevu cytochromu P450, látky označené, jak bylo zvykem, podle polohy absorpčního maxima (v nanometrech) pro charakteristickou formu této látky – zde číslicí 450, protože absorpční maximum při 450 nm vykazoval redukovaný komplex onoho pigmentu (odtud P) s oxidem uhelnatým. V přírodě, od archebakterií po člověka je známo dnes okolo dvanácti tisíc sekvencí pro jednotlivé formy tohoto hemového enzymu, zase nešťastně nazvaného „cytochrom“, i když alespoň tento název ukazuje na přítomnost hemu jako koenzymu. V současnosti je rovněž známo již desítky krystalových struktur a především struktury všech forem, které u člověka nejčastěji metabolizují xenobiotika. K určitému překvapení nepřinesly vyřešené struktury automaticky odpovědi na mnoho otázek, spojených se strukturou a funkcí těchto enzymů. V přednášce budou uvedeny příklady forem CYP3A4 a CYP2D6. Pozornost se v současné době zaměřuje spíše na funkci těchto enzymů a na regulaci jejich proteosyntézy. Jsou to totiž otázky spojené s účinkem látek, které s cytochromy P450 interagují a jsou jimi často metabolizovány. Tyto látky – buď samy, nebo jejich metabolity – mohou být samy účinné nebo mohou ovlivňovat hladiny a tedy i účinnost léčiv a dalších látek, které přijímáme ve stravě nebo cíleně jako nutraceutika. Složitost a často nepřehlednost této problematiky lze předpokládat. Proto se v současnosti pracoviště autorů zabývá některými látkami této povahy a jejich interakcemi s cytochromy P450. V přednášce pak budou ukázány příklady z nedávných a aktuálně prováděných studií v našich laboratořích. Dedikováno projektu GAČR P303/12/G163.

103

S E KCE 1 3 – XE NOB I OC HE M I E A T OXI K OL OG I E

NEW INSIGHT INTO P-GLYCOPROTEIN AS A DRUG TARGET.


STUDIUM MEMBRÁNOVÉ TOPOLOGIE SYSTÉMU CYTOCHROMU P450 POMOCÍ FOTO-CYTOCHROMU B5 Hodek P., Koberová M., Ječmen T., Šulc M., Černá V., Hudeček J., Stiborová M. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze [email protected] Katalytická aktivita mikrosomálního systému cytochromu P450 (CYP) je často ovlivněna přítomností cytochromu b5 (b5). V závislosti na formě CYP, může b5 stimulovat nebo inhibovat metabolismus určitého substrátu nebo dokonce měnit zastoupení jednotlivých metabolitů. Předpokládá se, že stimulační efekt b5 souvisí s přenosem elektronů z b5 na CYP a/nebo konformační změnou CYP vyvolanou b5, zatímco kompetice b5 a NADPH-cytochrom P450 reduktasy o vazné místo na CYP způsobuje inhibici aktivity. Ke studiu role b5 v systému CYP byl použit foto-b5, tj. b5, jehož methionin (Met) je nahrazen fotolabilním derivátem (diazirinový analog). Met byl vybrán proto, že se v sekvenci b5 vyskytuje jen v úseku, který kotví b5 v membráně. Rekombinantní foto-b5 byl exprimován v E. coli v mediu suplementovaném foto-Met. Purifikovaný vzorek b5 obsahující >30% foto-b5 byl použit pro mapování membránové topologie králičího jaterního CYP2B4. Po rekonstituci CYP2B4 s foto-b5 v arteficiální fosfolipidové membráně byla reakční směs fotolyticky aktivována. Za těchto podmínek mohly vzniklé reaktivní intermediáty (karbeny) vytvořit kovalentní adukty s molekulami ve své blízkosti (lipidy, aminokyseliny). Reakční směs byla následně separována na SDS-PAGE, proteinové zóny vyříznuty, štěpeny trypsinem a analyzovány hmotnostní spektrometrií (LC-FT-ICR). Analýzou byl prokázán vznik tří kovalentních oligomerů CYP-b5 obsahujících CYP2B4 a b5 v molárních poměrech 1:1, 1:2 a 2:1. V souladu s představou, že přítomnost substrátu CYP zvyšuje vaznou afinitu CYP pro b5, došlo v přítomnosti diamantanu (substrát CYP2B4) k významnému zvýšení tvorby oligomerních aduktů CYP-b5. Nalezené propojení CYP2B4 a b5 dokazuje, že oba hemoproteiny vedle interakcí v cytosolu, interagují též svými membránovými kotvami. Získané výsledky ve spojení s daty z chemického síťování umožní vytvořit a zpřesnit in silico modely interakcí CYP a b5. Práce je podporována granty 305/09/H008, P301/10/0356, P207/12/0627 a 303/09/0472 GAČR

LIDSKÉ MIKROSOMÁLNÍ KARBONYL REDUKUJÍCÍ ENZYMY V METABOLISMU XENOBIOTIK Z NADRODINY SDR Wsól V., Škarydová L. Farmaceutická fakulta UK [email protected] Nejznámějším a nejvíce studovaným enzymovým systémem v první fázi biotransformace xenobiotik je cytochrom P450 (CYP), jehož isoformy se účastní metabolismu devíti z deseti současně užívaných léčiv. Jednotlivé isoformy CYP jsou asociovány s membránou endoplasmatického retikula. Jinou aktivní skupinou enzymů v první fázi biotransformace jsou karbonyl redukující enzymy. Relativně hodně je známo o cytosolických formách těchto reduktas, ale jejich mikrosomální formy byly dosud studovány jen okrajově. 11beta-hydroxysteroiddehydrogenasa typu I je jediným membránově vázaným karbonyl redukujícím enzymem z nadrodiny SDR, u kterého je účast v metabolismu xenobiotik dostatečně popsána. Dílčí informace o účasti na metabolismu nenasycených aldehydů existuje také u retinoldehydrogenasy 12. Slibnou skupinu mikrosomálních karbonyl redukujících enzymů tvoří také některé 17beta-hydroxysteroiddehydrogenasy, které by mohly sloužit jako terapeutické cíle v léčbě některých závažných onemocnění. This project was supported by the Charles University in Prague (the SVV 265 004) and the project UNCE No. (17/2012).

104

Machala M., Hulinková P., Krčková S., Pálková L., Krčmář P., Pěnčíková K., Slavík J., Neča J., Umannová L., Procházková J., Kabátková M., Vondráček J. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno; Biofyzikální ústav AV ČR, Brno [email protected] Aktivace aryluhlovodíkového receptoru (AhR) 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxinem (TCDD) a řadou polycyklických aromatických uhlovodíků, vedoucí k indukci AhR-dependentní genové exprese CYP1 a dalších biotransformačních enzymů, stejně jako následná genotoxicita způsobená metabolickou aktivací polyaromátů je známa již řadu let. Aktivace AhR však vede také k celé řadě dalších, negenotoxických efektů, které mohou přispívat jak k nádorové promoci, tak dalším negativním účinkům na zdraví. Modulace genové exprese a procesy spojené s chemickou karcinogenezí nebo nádorovou promocí byly studovány v jaterních a plicních buněčných modelech in vitro. Studium změn globální genové exprese, spolu s analýzou exprese identifikovaných cílových genů AhR pomocí RT-PCR a Western blotting analýzy, poukázalo na možnou existenci AhR-dependentních mechanismů, které vedou k nádorové promoci a progresi . TCDD, stejně jako další AhR agonisté, ovlivňují mezibuněčnou komunikaci, adherentní spoje a aktivitu specifických signálních drah (Wnt, TGF-beta). Řada genů zapojených v regulaci nádorové promoce může být kontrolována aktivovaným AhR. AhR ligandy mají také významný dopad na metabolismus lipidů, včetně lipidních signálních molekul (ceramidy, prostaglandin E2) a produkci cytokinů ve specifických cílových buněčných populacích. Naše výsledky ukazují, že indukce biotransformačních enzymů představuje relativně malou část širokého spektra účinků toxických AhR ligandů na genovou expresi. [Podpořeno grantem GAČR P503/11/0142.]

HUMAN ENZYMES METABOLIZING CARCINOGENIC ARISTOLOCHIC ACID I: CHARACTERIZATION OF THEIR MECHANISMS OF ACTION WITH EXPERIMENTAL AND THEORETICAL APPROACHES Stiborová M., Levová K., Bárta F., Martínek V., Jeřábek P., Frei E., Nebert D.H., Arlt V.M., Phillips D.H., Schmeiser H.H. Department of Biochemistry, Faculty of Natural Sciences, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, Czech Republic [email protected] Exposure to aristolochic acid (AA) is associated with human nephropathies (Aristolochic acid nephropathy, AAN, and Balkan endemic nephropathy, BEN) and urothelial cancer. Exposure to AA was demonstrated by the identification of specific DNA adducts in urothelial tissue of AAN and BEN patients. The most abundant DNA adduct detected in patients is dA-AAI, which leads to ATTA mutations observed in the TP53 tumor suppressor gene in tumors from patients. Individual susceptibility to AA-induced disease likely reflects individual differences in enzymes that metabolize AAI. While AAI reduction leads to bioactivation to a cyclic acylnitrenium ion forming DNA adducts, oxidation of AAI to AAIa is a detoxication reaction. Using combination of numerous in-vitro experiments, in-vivo studies and computational approaches, we identified human enzymes that both activate AAI to AAI-DNA adducts and detoxicate AAI to AAIa and explained the mechanisms of such reactions. Human hepatic and renal microsomes and cytosols and human recombinant enzymes [i.e. NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthine oxidase, cytochrome P450 (CYP) and NADPH:CYP reductase] were used for in-vitro studies, whereas several transgenic mouse models for in-vivo experiments. Of them, two humanized mouse lines carrying functional human CYP1A1 and CYP1A2 genes brought the results resolving contribution of individual enzymes to AAI activation and detoxication. NQO1 is the most efficient cytosolic enzyme reducing AAI, while CYP1A1 and 1A2 are most effective both in AAI detoxication and activation in human microsomes. Using in silico docking employing the soft-soft (flexible) docking procedure, we explain mechanisms of NQO1-mediated AAI reduction and those of reduction or oxidation of AAI by human CYP1A2. AAI activation and detoxication are dictated mainly by AAI binding affinity to CYP1A2 or NQO1, by their turnover and by the balance between oxidation and reduction of AAI by CYP1A. Supported by GACR (303/09/0472).

105


POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY A DIOXINY – MECHANISMY TOXICKÝCH ÚČINKŮ GENOTOXICKÝCH A NEGENOTOXICKÝCH LIGANDŮ AHR IN VITRO


REZISTENCE NÁDOROVÝCH BUNĚK K CYTOSTATIKŮM A MECHANIZMY JEJÍHO VZNIKU Eckschlager T, Hraběta J, Poljaková J, Stiborová M, Kizek R Klinika dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol, Praha; Ústav biochemie, UK PřF, Praha; Ústav chemie a biochemie, AF, MZLU, Brno, ČR [email protected] Jednou z komplikací protinádorové chemoterapie a příčinou jejího selhání je schopnost nádorových buněk odolávat účinkům cytostatik. Maligní buněčné populace mohou být vůči chemoterapii rezistentní již při první léčbě – rezistence primární. Získaná (sekundární) rezistence vzniká v průběhu cytostatické léčby, kdy se původně citlivé buňky stávají rezistentními a účinnost chemoterapie klesá. Při ztrátě citlivosti k určitému cytostatiku může být zachována citlivost k jiným lékům. Pokud při ztrátě citlivosti k jednomu léku vzniká současně rezistence k jiným strukturálně příbuzným cytostatikům- zkřížená rezistence. Jsou známé případy rezistence k cytostatikům lišícím se strukturou i mechanismem účinku- mnohočetná léková rezistence (multidrug resistance, MDR). MDR vysvětluje případy necitlivosti některých nádorů k alternativním léčebným režimům, obsahujících jiná cytostatika původně nepoužitá. Mechanismy vzniku rezistence nádorových buněk k protinádorové léčbě jsou komplexní. Mechanismy rezistence jsou: 1. změny farmakokinetiky: snížená resorpce, urychlení biotransformace, rychlejší inaktivace nebo vylučování; 2. změny cytokinetiky: přechod větší části nádorových buněk do fáze G0, v němž je snížena citlivost k řadě cytostatik; 3. strukturální a funkční změny buňky zahrnují snížení nebo zvýšení aktivity enzymů, porušení intracelulární distribuce cytostatika, ovlivnění transportu cytostatika buněčnou membránou, zvýšenou intenzitu oprav DNA, změny proteinů ovlivňujících apoptózu. S přibývající nádorovou masou vznikají mutace buněk, které zakládají klony s odlišnou citlivostí k léčbě. Léčba ničí pouze citlivou frakci buněk a selektuje rezistentní populace. Diskutujeme mechanismy chemorezistence zjištěné u linií s navozenou rezistencí k různým cytostatikům i ve vzorcích nádorů. Zmiňujeme rezistenci indukovanou hypoxií, která je vzhledem k insuficientní angiogenezi v nádorech velmi častá, a rezistenci nádorových kmenových buněk. Podpořeno grantem GAČR P301/10/0356

PROČ MÁ REDUKTASA CYTOCHROMU P450 TAK SILNĚ KONZERVOVANOU SEKVENCI? Hudeček J., Kubíčková B., Hodek P., Šulc M. Katedra biochemistry, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze [email protected] NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa (CPR) je klíčovou složkou systému savčích mikrosomálních monooxygenas. Její funkcí je přenos dvou elektronů z NADPH na cytochrom P450 (CYP). CPR je flavoprotein s dosti silně konzervovanou sekvencí, obsahující jak FMN, tak FAD. Na jeho konzervativnost ukazují také naše experimentální výsledky, podle nichž přídavek králičí CPR zvyšuje hydroxylační aktivitu mikrosomálního CYP sladkovodního raka (Orconectes limosus Raffinesque), bez ohledu na velkou evoluční vzdálenost mezi savci a korýši. Navíc lze domény typu CPR s analogickou sekvencí nalézt také jako součást tzv. „fúzních enzymů“, jako je NO-synthasa (NOS) a bakteriální CYP 102. Tato situace může na první pohled upomínat na velmi dobře známý „učebnicový“ příklad evoluční „rigidity“ cytochromu c z mitochondriálního dýchacího řetězce, která se obvykle vykládá potřebou souběžného vývoje všech redoxních partnerů, která působí jako další, vnější omezení mutability. K podobným závěrům by mohl vést v literatuře obvyklý model interakce CPR s CYP založený na prostorové komplementaritě nabitých postranních řetězců na povrchu obou těchto redoxních partnerů. Protože ale CPR dokáže redukovat tak odlišné enzymy (různé P450, NOS), a navíc, jak ukazují naše současné experimenty s kovalentním propojováním, mohou v interakci CYP/CPR hrát roli i neelektrostatické interakce, nezdá se tento model plně přijatelný. V příspěvku bude tato otázka diskutována na základě dostupných literárních dat (vč. nedávno publikovaných krystalografických dat o reduktasové doméně NOS). Možný důvod pro konzervovanost CPR vidíme v nutnosti zachovat v rámci tohoto enzymu efektivní spolupráci FMNdomény (přijímající elektron od NADPH) a FAD-domény (přenášející jej na CYP nebo hemovou doménu NOS). Evoluční stabilita CPR může tedy být dána nutností zachovat vnitřní strukturu tohoto proteinu, nikoliv „zvnějšku“ působícími požadavky na interakci s příslušným redoxním partnerem. Podporováno z grantu GACR P207/12/0627.

106

Martínková M., Stiborová M., Kitanishi K., Igarashi J., Shimizu T. Department of biochemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, Albertov 2030, Prague 2, Czech Republic; Institute of Multidisciplinary Research for Advanced Materials, Tohoku University, Sendai 980-8577, Japan; Fukushima Medical University, Fukushima 960-1295, Japan [email protected] The heme-containing sensor proteins, a novel group of hemoproteins, are generally composed of two domains: a sensor domain (heme sensing or heme-based gas sensing) and a functional domain. The sensor proteins regulate various functions, including transcription, translation, protein kinases and a diguanylate cyclase in response to gas or heme availability. The sensor proteins are involved in important physiological functions of clinical significance (e.g. cancer development). We are interested in structural changes upon exposure to various signal molecules of the sensor domain, their modulation of activities in the functional domain and interactions between sensor and functional domains. In order to address still unsettled questions regarding the molecular mechanisms of signal transduction, action and function of heme-containing sensor proteins three representatives of them were selected for further studies: (1) a hemeregulated eukaryotic initiation factor 2 aplha kinase (a heme-regulated inhibitor), (2) a globin-coupled histidine kinase and (3) a globin-coupled diguanylate cyclase. Heme-regulated inhibitor belongs to heme-responsive sensor proteins, while the other two proteins are heme-based oxygen sensors. We generated various sensor domain truncated mutants of the heme regulated inhibitor to examine the role of the sensor domain in the oligomeric state, heme binding, substrate interactions, and inhibition by heme derivatives. Our study was focused on the role of the correspondent sensor domain in the structure and function relationship of the selected heme-containing sensor protein. We discuss the molecular mechanism of action and function of all selected model proteins. (This work was in part supported by the Japan Society for the Promotion of Science Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers to M.M., by the Charles University Prague – project UNCE number 42 and by the Grant Agency of the Czech Republic – project number P301/10/0356).

107


MOLECULAR MECHANISM OF INTRAPROTEIN/INTERDOMAIN SIGNAL TRANSDUCTION IN NOVEL HEME-CONTAINING SENSOR PROTEINS

108

POSTERY

109

POS TE RY

P001 DEVELOPMENT OF UNIVERSAL AFFINITY MATRIX FOR ISOLATION OF CARBONYL REDUCING ENZYMES FROM NATURAL SAMPLES Andrýs R., Škarydová L., Holubová L., Bílková Z., Wsól V. Department Of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague; Department of Biological and Biochemical Sciences, University of Pardubice [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Carbonyl reducing enzymes play an important role in metabolic pathways of various eobiotics and xenobiotics e.g. steroids, prostaglandins, doxorubicin, daunorubicin etc. Moreover, they contribute to development of some diseases like hormone-dependent cancers, metabolic syndrome or Cushing’s syndrome. In spite of this fact there is still little known about them. Some of these enzymes have been only poorly characterized or totally uncharacterized yet. Due to their importance, it is necessary to make further studies on their activity, properties and distribution. Unfortunately, carbonyl reducing enzymes are in tissues usually in quite low concentrations so their isolation with classical techniques is complicated. It is difficult to obtain fraction with sufficient purity and amount of desired enzyme. The aim of the study is the preparation of an affinity matrix for selective isolation of carbonyl reducing enzymes from natural samples. Oracin is a potential anticancer drug that has been shown as a substrate for many well known carbonyl reducing enzymes so it seems to be universal ligand for development of the affinity matrix. Four types of magnetic microparticles, SiMAG-NH2, SiMAG-COOH, SiMAG-PGL and magnetic macroporous bead cellulose have been used as carriers. The molecule of oracin have been modified and bound in different ways to carriers. Optimal binding method and carrier was chosen for further studies. The ability of prepared affinity matrix to capture carbonyl reducing enzymes was tested on model enzymes AKR1C3 and CBR1. Enzymes were selectively bound on affinity matrix and then eluted. It is clear that the new affinity matrix is well working with reductases AKR1C3 and CBR1 and it is ready for use in isolation process of carbonyl reducing enzymes from natural samples. This project was supported by the Grant Agency of Charles University (Grant no. 71710/C/2010) and also by the Charles University in Prague (the SVV 265 004) and the project UNCE No. (17/2012).

P002 TETRASPANIN WEB ON BOVINE SPERM MEMBRANES Antalíková J., Cupperová P., Simon M., Michalková K., Horovská Ľ. Institute of Animal Biochemistry and Genetics, Slovak Academy of Sciences, Ivanka pri Dunaji, Slovak Republic. [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika The tetraspanins are four transmembrane region molecules implicated in many cellular functions such as adhesion, migration, co-stimulation, signal transduction and sperm egg fusion. A unique property of these molecules is their ability to associate with many other cell surface molecules and form complexes within a network of molecular interactions called “tetraspanin web”. A protein found on mammalian egg surface that is known to be required for gamete fusion is CD9 which also belongs to the tetraspanin family. Within the tetraspanin web on the oolema, CD9 and CD81 may interact with each other and also with integrins that are able to bind CD46. CD9 molecules in the inner acrosomal membrane and also on the plasma membrane covering the equatorial segment of mouse sperm have been detected; therefore the existence of a tetraspanin web on sperm may be envisaged. We assume that the proteins like IZUMO as well as CD46 are part of it. Using monoclonal antibodies (mAb) detecting CD9 on the blood cells we detected expression of CD9 tetraspanin on bovine sperm, too. By immunoprecipitation the various detergent sperm lysates (NP40, TX100, Brij 97, Brij 98 and CHAPS) maintaining secondary (tetraspanin-tetraspanin) and tertiary (tetraspaninadditional proteins) interactions with anti CD9 mAb we obtained different spectra of proteins coprecipitated with CD9. Using mAb IVA-520 (anti CD46) in western blot analysis as well as in reimunoprecipitation experiment we suggested the presence of CD46 molecule in complexes of precipitated proteins. CD46 molecule is probably one of the members of potential tetraspanin web on bovine sperm membranes. This work was supported by grants VEGA 2/0006/12 and APVV-0137-10.

110

Barančík M., Barteková M., Ivanová M., Okruhlicová Ľ., Gibalová L., Šereš M., Dovinová I., Sulová Z. Ústav pre výskum srdca SAV; Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV; Ústav normálnej a patologickej fyziológie SAV, Bratislava, Slovenská republika [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Antracyklín doxorubicín (DOX) je liečivo často používané pri chemoterapii nádorových ochorení. Komplikáciou pri podávaní DOX sú jeho toxické účinky na srdce spojené s vývinom kardiomyopatií, ktoré často vedú až k zlyhaniu srdca. Cieľom štúdie bolo charakterizovať mechanizmy zahrnuté v realizácii účinkov vyvolaných dlhodobým podávaním DOX na srdce potkana a skúmať možnosti ovplyvnenia srdca po účinkoch DOX pomocou flavonoidu kvercetínu (KVE). Zistili sme, že 8 týždňov po aplikácii DOX (kumulatívna dávka 15mg/kg) dochádza k subcelulárnym zmenám a štrukturálnej disorganizácii extracelulárneho priestoru v ľavej komore (ĽK). Tieto zmeny pravdepodobne súvisia so zvýšenou aktivitou matrixovej metaloproteinázy-2 (MMP-2), zníženou aktivitou superoxiddismutázy, zvýšenými hladinami superoxidu a aktiváciou kaspázy-3. Zistili sme tiež, že v ĽK sŕdc zvierat ovplyvnených DOX dochádza k zvýšeniu obsahu mRNA kódujúcej P-glykoproteín (P-gp) a podávanie KVE počas aplikácie DOX malo za následok ďalšie zvýšenie hladín mRNA. Pri sledovaní odpovedí srdca na akútny stresový podnet (ischémia/reperfúzia, I/R) sme pozorovali, že KVE zvyšoval ischemickú toleranciu (IT) sŕdc, a to hlavne u potkanov ovplyvnených DOX. Zmeny v IT boli spojené so zvýšením aktivácie Akt kinázy a znížením proteínových hladín a aktivít MMP-2. Výsledky poukazujú na to, že v nami sledovanom modeli pôsobenia DOX na srdce potkanov môže mať aplikácia KVE pozitívne účinky, ktoré sa však vo väčšej miere prejavujú až po vystavení sŕdc akútnej I/R záťaži. Mechanizmy zodpovedné za tento ochranný účinok môžu zahŕňať aktiváciu signálnej dráhy Akt kinázy, potláčanie MMP-2 a moduláciu ABC transportérov (P-gp). Podporené projektami: VEGA 2/0169/12, 2/0108/10, SAS-NSC-JRP 2010/01

P004 ULTRATENKÉ TKÁŇOVÉ ŘEZY JAKO DŮLEŽITÝ IN VITRO MODEL Bártíková H., Lněničková K., Skálová L. a Szotáková B. Katedra biochemických věd, Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy, Hradec Králové, Česká republika [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Orgánové řezy představují důležitý in vitro model pro studium metabolismu a toxicity cizorodých látek (xenobiotik) a pro zhodnocení vlivu xenobiotik na metabolické pochody. Výhodou in vitro systémů je v ideálním případě jejich snadné zavedení, poměrně rychlé získání výsledků, nízká cena a jednoduché provedení. Navíc umožňují redukovat počty experimentálních zvířat. Hlavní myšlenkou, která vedla k využití orgánových řezů v biomedicínském výzkumu, je předpoklad, že buňky zkoumané in vitro budou optimálně fungovat v prostředí, které se podobá přirozeným podmínkám in vivo. Abychom mohli testovat vliv xenobiotik na biotransformační enzymy, bylo nejprve nutné zavést a optimalizovat techniku řezů. Řezy byly připravovány pomocí tkáňového kráječe Krumdieck Tissue Slicer, který umožňuje přípravu ultratenkých řezů o různé tloušťce (100-500 mm) a o průměru 3, 5 či 8 mm. Technika řezů může být využita pro řadu orgánů (játra, plíce, ledviny, srdce, mozek, slinivka). Na našem pracovišti jsme se doposud věnovali řezům z jater a tenkého střeva potkana. Ačkoli střevo přispívá k biotransformaci xenobiotik díky přítomnosti enzymů metabolizujících léčiva, střevní řezy nejsou dosud tak hojně využívány jako řezy z jater, zřejmě pro jejich obtížnější přípravu. Střevní řezy byly připravovány agarózovou metodou. Části střev o délce 10-15 cm byly vyplněny 3% agarózou. Střevo bylo posléze zalito do agarózy i zvenku tak, aby šířka agarózového válečku se střevem uvnitř odpovídala průměru pro největší řezy. Tloušťka řezů byla 200-220 mm pro játra a 400 mm pro střeva. Řezy byly následně inkubovány v živném médiu bez testovaných látek (kontrola), nebo v médiu s testovanými potravními doplňky. Zavedení techniky pro přípravu ultratenkých orgánových řezů nám umožnilo sledovat vliv potravních doplňků na aktivitu biotransformačních enzymů a jejich expresi při zachování fyziologických podmínek. Projekt je finančně podporován Grantovou agenturou České republiky (CENTRUM EXCELENCE P303/12/G163).

111

POS TE RY

P003 MECHANIZMY ZAHRNUTÉ V CHRONICKÝCH ÚČINKOCH DOXORUBICÍNU NA SRDCE POTKANA

POS TE RY

P005 BASE SUBSTITUTION CONTROLLED FORMATION OF INTRA END INTERMOLECULAR G-QUADRUPLEXES FROM THE HUMAN TELOMERIC SEQUENCE Bauer Ľ., Tlučková K., Tóthová P., Víglaský V. University of P.J. Šafárik, Faculty of Science, Institute of Chemistry, Department of Biochemistry [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul DNA sequences that contain one or more closely spaced G-tracts are able to fold into intra/inter molecular G-quadruplex structures based on the participation of one (intramolecular) or two or four (intermolecular) DNA strands. These noncanonical DNA structures are composed of at least two stacked guanine tetrads which are stabilized by Hoogsteentype hydrogen bonds between the guanines and by interactions with cations located between the tetrads [1]. The nucleotide linkers intervening the G-tracts usually stand for the loops of the folded G-quadruplex structure. Doubtlessly, the most extensively studied quadruplex forming sequences are those located at the ends of telomeres. Telomeres are specialized nucleoprotein complexes that cap the ends of linear chromosomes and are essential for chromosomal stability and genomic integrity. Human and vertebrate telomere DNA is composed of 5-10 kb d(TTAGGG) n•d(CCCTAA)n tandem repeats terminating in a ~150 nt. long single stranded 3‘ overhang [2], providing excellent opportunity to fold into one or more G-quadruplexes under physiological conditions. Since guanines are essential for the formation of G-quadruplexes, we have systematically substituted each of the three adenines for guanines in the TTA loops of the four repeat quadruplex forming human telomeric DNA sequence G3(T2AG3)3. We have applied circular dichroism spectroscopy (CD), polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and temperature gra dient electrophoresis (TGGE) to determine the effect of substitutions on the formation, thermal stability and conformation of quadruplexes. The measurements were performed in the presence of both Na+ and K+ ions at different temperatures. References 1. Burge, S., et al., Quadruplex DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Res, 2006. 34(19): p. 5402-15. 2. Blackburn, E.H., Telomere states and cell fates. Nature, 2000. 408(6808): p. 53-6. Funding: This study was supported by VVGS 35/12-13, VVGS-PF-2012-30 and VEGA 1/0504/12

P006 ULTRACITLIVÁ DETEKCIA SIALYLOVANÝCH GLYKOPROTEÍNOV S VYUŽITÍM NANOŠTRUKTÚROVANÝCH BIOSENZOROV ZALOŽENÝCH NA LEKTÍNOVOM BIOROZPOZNÁVANÍ Bertók T., Mislovičová D., Gemeiner P., Tkáč J. Oddelenie glykobiotechnológie, Chemický ústav Slovenskej akadémie vied, Dúbravská cesta 9, Bratislava 845 38, Slovenská republika [email protected] Sekce: Bioelektrochemie a bioanalytika Detekcia najrôznejších látok, vrátane biomolekúl ako nukleové kyseliny či proteíny, dosiahla v mnohých oblastiach analytickej biochémie obrovský rozmach v súvislosti s tzv. „label-free“ detekčným konceptom. Zrejme najvyužívanejšou technikou pre analýzu vzoriek bez ich predchádzajúceho značenia je elektrochemická impedančná spektroskopia, založená na meraní zmien impedancie pri aplikácii striedavého prúdu / napätia na fyzikálny prevodník biosenzora, v tomto prípade zlaté elektródy. Pre svoju schopnosť pomerne špecificky viazať určité sacharidické štruktúry sa pre biosenzory na detekciu glykoproteínov stali užitočné práve lektíny. Pre skutočne citlivú detekciu (v tomto prípade femto- až attomolárne koncentrácie analytu) sa optimalizovali viaceré parametre, ako napr. kontrola hustoty biorozpoznávacích elementov na povrchu, optimalizácia zloženia samo-usporiadaných monovrstiev pre imobilizáciu, spôsob využitia zlatých nanočastíc v procese prípravy biosenzora a blokovanie nešpecifických interakcií na povrchu. Pre zvolený glykoproteín (fetuín, Mr = 48 400 Da, s obsahom až 8,7% kyseliny sialovej viazanej terminálne na O- aj N-glykánových štruktúrach) bol zvolený lektín SNA I (Sambucus nigra agglutinin I so špecificitou na Neu5Ac-alfa(2-6) Gal). Ako kontrola pre vyšetrovanie nešpecifických interakcií sa použil asialofetuín (s obsahom kyseliny sialovej ≤0,5%). Pripravený biosenzor vykazoval vysoký stupeň reprodukovateľnosti, stability a citlivosť od 1 fM (približne 48 pg/L) po približne 1 nM v lineárnej oblasti. Úroveň nešpecifických interakcií nepresiahla hodnotu 25%. Citlivosť takto pripraveného senzora je možné ešte ďalej zvýšiť, napr. aplikáciou zlatých nanočastíc s presne definovaným priemerom na vopred modifikovaný povrch zlatej elektródy. Poďakovanie: Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: Centrum excelentnosti pre Glykomiku, ITMS 26240120031, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

112

Bocánová L., Pleška M., Krahulec J., Stuchlík S., Levarskí Z., Dianovská D.,Jirickova K.,Turňa J. Katedra Molekularnej Biologie, PriF UK v Bratislave [email protected] Sekce: Biotechnologie Napriek množstvu moderných expresných systémov zostáva gramnegatívna baktéria Escherichia coli stále najčastejšie využívaným organizmom slúžiacim na produkciu rekombinantných proteínov pre priemyselné a terapeutické účely, ale aj na metabolické inžinierstvo. Za toto prvenstvo vďačí svojej nenáročnosti na kultiváciu, relatívne jednoduchú transformáciu, rýchly rast a ďalším mnohým dostupným poznatkom získaných za dlhú dobu podrobného štúdia tejto baktérie. S produkciou rekombinantných proteínov v tomto kmeni sa spája aj niekoľko problémov, ako je produkcia acetátu pri vysokých bunkových hustotách, tvorba inklúznych teliesok a silné redukčné prostredie vo vnútri buniek znemožňujúce produkciu proteínov obsahujúcich disulfidické väzby a žiadna glykozylácia proteínov. Úlohou projektu je príprava hostiteľského kmeňa E.coli majúceho také vlastnosti, aby bol ľahko regulovateľný na niekoľkých úrovniach, a produkcia rekombinantného proteínu bola čo najefektívnejšia. V tomto nami pripravenom systéme by prvou úrovňou regulácie mala byť tradičná kontrola transkripcie a druhou úrovňou je regulácia počtu kópií expresného vektora. V expresnom systéme je tak možné minimalizovať nežiaduce účinky bazálnej expresie bez zaťaženia hostiteľskej bunky. Nakoľko hladina bazálnej expresie je priamoúmerná počtu kópií génu, je potrebné aby plazmid počas rastu bol v bunkách prítomný v minimálnom počte kópií a naopak, tesne pred indukciou expresie je potrebné počet kópií zvýšiť, a tým pádom aj maximalizovať génovú dávku. Takto dôjde k výraznému zvýšeniu produkcie rekombinantných proteínov v E.coli. Poďakovanie: Tento projekt je výsledkom implementácie projektu: „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov (ITMS 26240220048) podporeného Operačným programom výskumu a vývoja financovaného z ERDF.

P008 OVPLYVNENIE MULTIDRUG REZISTENCIE V L1210/VCR BUNKÁCH PENTOXIFYLÍNOM. Boháčová V., Barančík M., Gibalová L., Sedlák J., Sulová Z., Breier A. Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava; Ústav pre výskum srdca SAV, Bratislava; Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Viaclieková (multidrug) rezistencia predstavuje fenomén, vďaka ktorému sa neoplastické bunky stávajú rezistentné voči pôsobeniu nielen jedného liečiva, ale širokej škále liečiv s rôznou štruktúrou, farmakologickými vlastnosťami a mechanizmom účinku. Jednou z najčastejších príčin je zvýšená expresia integrálneho proteínu, nachádzajúceho sa v plazmatickej membráne: P-glykoproteínu (P-gp). Transportnú funkciu Pgp možno ovplyvniť skupinou látok, nazvaných chemosenzitizéry, medzi ktoré patria aj deriváty xantínov. V predchádzajúcich prácach bola zistená schopnosť metylxantínu – pentoxifylínu (PTX) potláčať rezistenciu u P-gp pozitívnej L1210/VCR bunkovej línie. Pre lepšie objasnenie účinku PTX sme sledovali jeho vplyv na enzýmy zohrávajúce dôležitú úlohu v regulácii apoptotických odpovedí bunky na modeli leukemických buniek L1210 (senzitívna, P-gp negatívna línia) a L1210/VCR (rezistentná, P-gp pozitívna línia). Zistili sme, že pôsobenie PTX (0.1 mmol/l) vyvoláva downreguláciu P-gp v L1210/ VCR na proteínovej úrovni, zvyšuje citlivosť P-gp pozitívnej línie na vinkristín. Tento fakt koreluje so stimuláciou apoptózy (detegovaná Annexin V-FITC Apoptosis kitom) a proteolytickou aktiváciou kaspázy-3 a kaspázy-9 (určená Western blot analýzou). Zistili sme, že prítomnosť PTX ovplyvňuje aktiváciu Akt kinázy. Počas 24 h došlo k výraznému zvýšeniu fosforylovanej formy Akt kinázy, čo sa však nepotvrdilo, ak bol v médiu prítomný aj vinkristín. U rezistentných buniek bolo pozorované väčšie uvoľňovanie matrixových metaloproteináz, hlavne MMP-2, v porovnaní so senzitívnymi bunkami. Pôsobením PTX došlo k jeho zníženiu, čo sme potvrdili pomocou zymografie a elektroforézy. Uvedené údaje naznačujú, že PTX ovplyvňuje citlivosť rezistentnej línie L1210/VCR na vincristín downreguláciou P-gp, stimuláciou apoptózy a moduláciou uvoľňovania MMP. Práca bola podporená projektami: APVV-0290-10 a VEGA 2/0123/10, 2/0155/09.

113

POS TE RY

P007 PRÍPRAVA HOSTITEĽSKÉHO KMEŇA ESCHERICHIA COLI S DVOJITOU REGULÁCIOU EXPRESIE REKOMBINANTNÝCH PROTEÍNOV

POS TE RY

P009 EXPRESIA P-GLYKOPROTEÍNU V MYŠÍCH LEUKEMICKÝCH BUNKÁCH L1210 INDUKUJE ZMENY V EXPRESII GLYKOPROTEÍNOV OBSAHUJÚCICH KYSELINU SIALOVÚ Bubenčíková T., Cholujová D., Breier A., Sedlák J., Sulová Z. Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky, Slovenská akadémia vied, Bratislava [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Multidrug rezistencia (MDR) neoplastických buniek je závažným problémom pri chemoterapii nádorových ochorení. Častou príčinou rozvoja MDR je expresia P-glykoproteínu (P-gp). P-gp je membránový proteín, transportujúci cytostatiká von z bunky, čím znižuje koncentráciu liečiv v bunke a tým spôsobuje zlyhávanie chemoterapie. Našim modelom P-gp sprostredkovanej MDR je myšia leukemická línia L1210/VCR získaná postupnou adaptáciou na vinkristín (R) a línia získaná stabilnou transfekciou plazmidom nesúcim gén pre ľudský P-gp (T).V Predchádzajúcich prácach sme zistili pokles hlavného substrátu transglykozylačných reakcií, UDP- sacharidov, v rezistentných bunkách. Pozorovali sme aj zmeny v spektre a hladinách glykoproteínov na povrchu buniek. V tejto práci sme sa zamerali na študovanie interakcie lektínov so špecifickou väzbou na kyselinu sialovú na povrch buniek L1210. Testovali sme tri lektíny– WGA (Triticum vulgaris lektín), MAA (Maackia amurensis lektín) a SNA (Sambucus nigra lektín). Zo všetkých testovaných lektínov len WGA mal výraznejší toxický efekt a to hlavne na P-gp pozitívne bunky (R,T). Výraznejšiu aglutináciu pozorujeme u R a T buniek v porovnaní s parentálnou líniou buniek, ktorá neexprimuje P-gp (S) a to všetkými troma lektínmi. Pomocou lektín blotov s príslušnými lektínmi sme zaznamenali zmeny v hladinách a tiež spektre glykoproteínov v membránových frakciách izolovaných z S, R a T buniek. Zistili sme výraznejšiu väzbu WGA lektínu na R a T bunky v porovaní s S bunkami, výraznejšie rozdiely vo väzbe MAA a SNA sme nepozorovali. Desialidácia intaktných buniek neuraminidázou z Vibrio cholerae ovplyvnila väzbu lektínov len minimálne. Predinkubácia buniek so sialyl laktózou znížila interakciu lektínov s povrchom buniek podstatne výraznejšie ako predinkubácia s kyselinou sialovou (obidve spomínane látky sú prirodzené ligandy testovaných lektínov). Táto práca bola podporená: APVV-0290-10, VEGA 2/0123/10, VEGA 2/0155/09

P010 OPTIMIZATION OF AFL1 EXPRESSION IN AMINO ACID SELECTIVE MEDIU Bystrický P., Klišová M., Pokorná M., Wimmerová M. Central European Intstitute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Carbohydrate interactions with lectins (class of proteins) take an important part in many biological processes like cell recognition, signalling, differentiation, carcinogenesis and others. In case of fungal lectins they are also involved in the pathogenic adhesion and invasion. Aspergillus fumigatus is such one of the pathogens. It is responsible for invasive aspergillosis in severely immunocompromised individuals. In order to understand the interactions between lectins and carbohydrates, the structural details of such have to be known. They are best studied by various NMR techniques that are already currently or becoming available. The results of such NMR studies are complementary to surface plasmon resonance and microcalorimetry methods. They give details on the binding site(s), the identities of lectin‘s amino acids involved, functional groups of carbohydrate ligand involved in the interaction etc. This current study involves one of the lectins from aforementioned Aspergillus fumigatus, designated as AFL1 which predominantly binds fucose among monosaccharides. In order to study the lectin by NMR techniques that give the identities of lectin‘s amino acids, the lectin needs to be amino acid selectively labelled by 15N. Then the assignment of such key amino acids for the binding can be readily achieved by use of single point mutants of amino acids in question. Here we present optimization of recombinant AFL1 lectin over-expression in E.coli. The expression is performed in 15N Trp selective M9 minimal medium supplemented with the rest of unlabelled amino acids. Optimized or semi-optimized parameters were E.coli strain type, concentration of antibiotic, concentration of IPTG for induc programme which received funding from EC Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) under the grant agreement no. 229603 and is co-financed by South Moravian region.

114

Čech P., Svozil D., Kukal J., Schneider B., Černý J. Laboratoř informatiky a chemie, VŠCHT Praha [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie V tomto příspěvku budou prezentovány výsledky projektu, ve kterém byly aplikovány metody strojového učení na problém klasifikace lokálních konformací DNA. Zatímco globální dvoušroubovicová architektura molekuly DNA je de facto stále stejná, jemné strukturní variace na lokální úrovni garantují schopnost proteinů rozpoznávat důležitá vazebná místa. Pro tyto konformace, které lze zcela popsat a rozlišit na základě sady torzních úhlů, byl již dříve vypracován systém klasifikující lokální konformace na dinukleotidové úrovni. Tento systém je ale založen na komplikované a zdlouhavé manuální proceduře. Z tohoto důvodu byl celý proces klasifikace zautomatizován za použití metod strojového učení. Jednotlivé metody (neuronové sítě typu vícevrstvého perceptronu (MLP) a radiálních bázových funkcí (RBF), metoda k nejbližších sousedů (k-NN) a metoda regularizované regrese) byly důkladně otestovány a porovnány. Jako nejvhodnější metoda pro klasifikaci DNA konformerů se jeví být k-NN, která umožňuje nejen klasifikaci do již známých tříd, ale též snadnou identifikaci doposud neznámého konformeru.

P012 DIFFERENT TOPOLOGY OF HETEROLOGOUS EPITOPES IN POTATO VIRUS X BASED VIRAL VECTOR – IMPACT ON THEIR EXPRESSION LEVELS IN PLANTS Cerovska N., Plchova H., Moravec T., Hoffmeisterova H., Vaculik P. Institute of Experimental Botany AS CR, v.v.i., Na Karlovce 1a, 160 00 Prague 6, Czech Republic; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Hlavova 2030, 128 40 Prague 2, Czech Republic [email protected] Sekce: Rostlinná biochemie The production of vaccine antigens in plants is a safe and cost effective alternative to traditional expression systems, especially the plant virus-based transient expression system could produce large quantities of desired proteins in a relatively short time. Chimeric plant viruses are emerging as promising vectors for use in vaccination strategies. The production of plant-derived vectors is a novel and particularly up-and-coming approach to the creation of vaccines. Viral replication rapidly amplifies genes that are engineered into a suitable position of the viral genome. Several viral vectors were constructed using the full-length cDNA of Potato virus X (PVX) coupled to different strong promoters (T7 or CaMV 35S) and to the ”nos ter” region, the transcriptional terminator from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens. Compared to many other plant virus vector systems, the PVX genome can accommodate large heterologous sequence insertions without inhibition of PVX assembly. As a model antigen we choose the immunodominant Human papillomavirus type 16 (HPV16) E7 epitope. We produce this epitope situated in four different locations in the loops connecting a-helices and β-strands which are assumed to be located on the exterior part of PVX coat protein (CP) particles. We would like to develop the conditions that will lead to higher expression level and stability of transiently expressed heterologous antigens, in our case HPV16 E7 epitope. Our results provide a benefit for further development of PVX-based epitope presentation system for the production of other animal virusderived peptides in plants. Selecting different positions in the PVX CP for the fusion of an epitope increases possibility of obtaining an ideal recombinant virion for subsequent animal immunization. As a host system we will use transgenic and non-transgenic N. benthamiana, a nonfood and nonfeed plant.

115

POS TE RY

P011 METODY STROJOVÉHO UČENÍ PRO KLASIFIKACI KONFORMACÍ DNA

POS TE RY

P013 ROLE LIDSKÉ MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY YME1L V BIOGENEZI SYSTÉMU OXIDAČNÍ FOSFORYLACE Cesnekova J., Houstek J., Zeman J., Stiburek L. 1. Lekarska fakulta, Univerzita Karlova [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Mitochondrie jsou dynamické organely přítomné v převážné většině eukaryotických buněk, kde mezi jejich hlavní funkce patří produkce ATP pomocí systému oxidativní fosforylace (OxPhos). Systém OxPhos se skládá z jaderně a mitochondriálně kódovaných proteinových podjednotek, jejichž kvalita musí být neustále kontrolována, protože u nich může docházet k defektním změnám. Za rozpoznání a odstranění poškozených mitochondriálních proteinů jsou zodpovědné specifické mitochondriální ATP-dependentní AAA proteázy (ATPases associated with diverse cellular activities). Ve vnitřní mitochondriální membráně (IMM) byly identifikovány dva takovéto komplexy i-AAA a m-AAA. Zatímco proteáza i-AAA je aktivní v mezimembránovém prostoru, tak m-AAA proteáza funguje na straně mitochondriální matrix. Cílem naší práce bylo charakterizovat buněčnou funkci YME1L, lidského orthologu Yme1 podjednotky kvasinkového i-AAA komplexu, v biogenezi komplexů systému OxPhos použitím stabilní RNA interference (RNAi) a expresních studií na linii lidských embryonálních ledvinných 293 buněk (HEK293). Zjistili jsme, že lidský YME1L je integrální membránový protein, který existuje v několika komplexech s molekulovou hmotností 600-1100 kDa a jehož karboxylový konec vyčnívá do mitochondriálního mezimembránového prostoru. Připravená stabilní buněčná linie HEK293 buněk s RNAi sníženou expresí YME1L na 10% kontrol. hodnot vykazovala výrazně zvýšenou akumulaci membránově vázaných podjednotek Ndufb6 a ND1 částečně složeného komplexu I a také zvýšenou stabilitu podjednotky Cox4 komplexu IV. Selektivní radioaktivní značení mitochondriálních translačních produktů potvrdilo stabilizaci vybraných podjednotek komplexu I v těchto buňkách. Respirační analýza ukázala sníženou aktivitu komplexu I v těchto buňkách a indukce peroxidem vodíku zase zvýšenou míru oxidativního poškození mitochondriálních membránových proteinů. Naše výsledky tedy ukazují, že lidská proteáza YME1L se podílí na biogenezi komplexu I respiračního řetězce.

P014 MALDI-BASED INTACT SPORE MASS SPECTROMETRY OF DOWNY AND POWDERY MILDEWS Chalupová J., Sedlářová M., Helmel M., Řehulka P., Marchetti-Deschmann M., Allmaier G., Šebela M. I. Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, Czech Republic; II. Faculty of Military Health Sciences, University of Defence, Hradec Králové, Czech Republic (Řehulka P.); III. Institute of Chemical Technologies and Analytics, Vienna University of Technology, Vienna, Austria (Helmel M., Marchetti-Deschmann M., Allmaier G.) [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Fast and easy identification of fungal phytopathogens is of great importance in agriculture. In this context, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has emerged as a powerful tool for analyzing microorganisms. This study deals with a methodology for MALDI-TOF MS-based identification of downy and powdery mildews representing obligate biotrophic parasites of crop plants. Experimental approaches for the MS analyses were optimized using Bremia lactucae, cause of lettuce downy mildew, and Oidium neolycopersici, cause of tomato powdery mildew. This involved determining a suitable concentration of spores in the sample, selection of a proper MALDI matrix, looking for the optimal solvent composition and evaluation of different sample preparation methods. Furthermore, using different MALDI target materials and surfaces (stainless steel vs. polymer-based) and applying various conditions for sample exposure to the acidic MALDI matrix system were investigated. The dried droplet method involving solvent evaporation at room temperature was found to be the most suitable for the deposition of spores and MALDI matrix on the target and the subsequent crystallization. The concentration of spore suspension was optimal between 2 and 5 x 10 to 9 spores per mL. The best peptide/protein profiles (in terms of signal-to-noise ratio and number of peaks) were obtained by combining ferulic and sinapinic acids as a mixed MALDI matrix. A pretreatment of the spore cell wall with hydrolases was successfully introduced prior to MS measurements to get more pronounced signals. Finally, a novel procedure was developed for direct mass spectra acquisition from infected plant leaves. Acknowledgements: This work was supported by grants no. KONTAKT MEB061003 (student and academic staff mobilities within the Austria-Czech Republic exchange program AKTION) and MSM 6198959215 from the Ministry of Education, Youth and Sports, Czech Republic.

116

Chomova M., Jezovicova M., Tatarkova Z., Racay P. Institute of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia; Institute of Medical Biochemistry, Jessenius Faculty of Medicine, Comenius University, Martin, Slovakia [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Mitochondria are responsible for aerobic respiration and ATP synthesis by oxidative phosphorylation. In addition to being crucial for energy production and metabolic pathways, they also play a key role in cellular signaling. In this study we have examined the effect of global brain ischemia/reperfusion (I/R) on biochemical properties of the mitochondrial respiratory complexes I (CI) and IV (CIV) in rat hippocampus and cortex. We have performed the comparative analysis of two permeabilization methods (sonication, detergent) and several electron acceptors (decylubiquinone, potassium ferricyanide, nitrotetrazolium blue) and their impact on CI enzymatic activities under global brain ischemic-reperfusion conditions. We have observed that ischemia led to significant decrease of CI activities using both permeabilization methods in both brain areas. However, significant differencies in enzymatic activities were noticed during reperfusion intervals in connection with used permeabilization method. Based on our results we assume that the critical site where ischemia affects CI activities is electron transfer to electron acceptor. Further, the observed mitochondrial dysfunction was analyzed by means of BN PAGE/SDS PAGE with the focus on 3-nitrotyrosine immunodetection (3-NT) as a marker of oxidative damage to proteins. The noticed 3-NT spots showed changed dynamics during I/R, with decline in spot intensities under ischemia followed by restoration under reperfusion in both brain regions. Add to this, initialization of p53 mitochondrial apoptosis through p53, Bax, Bcl-XL proteins and a possible involvement of GRIM-19, the CI structural subunit, in apoptotic processes were also studied.

P016 MEMBRÁNOVÁ MOLEKULA CD9 V SAMČOM A SAMIČOM REPRODUKČNOM TRAKTE HOVÄDZIEHO DOBYTKA Cupperová P., Antalíková J., Simon M., Michalková K., Horovská Ľ. Ústav biochémie a genetiky živočíchov, Slovenská akadémia vied, Ivanka pri Dunaji [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika CD9 molekula je známa ako membránový antigén trombocytov o veľkosti 24 – 27 kDa, ktorý patrí do superrodiny teraspanínov. Doposiaľ bola detegovaná na plazmatickej membráne oocytov u myší, prasiat a hovädzieho dobytka, na blastocystách u myší a na endometriu epiteliánych buniek myších, ľudských a bovinných. Na spermiách bola CD9 detegovaná len u myší a ošípaných. Predošlé štúdie ukázali, že CD9 má kľúčovú úlohu v procese oplodnenia. Konkrétne vo fúzii spermie a vajíčka, alebo vo väzbe a fúzii spermie s vajíčkom. V tejto práci sme sa zamerali na expresiu CD9 na tkanivách v samčom a samičom reprodukčnom trakte hovädzieho dobytka a spermiách z jednotlivých segmentov prísemenníka býka a ejakulovaných spermií pomocou metód SDS-PAGE a western blot. Pomocou monoklonovej protilátky IVA-50 (anti-CD9) sme detegovali molekulu CD9 vo všetkých častiach ako samčích, tak aj samičích tkanív reprodukčného traktu, na spermiách z jednotlivých častí prísemenníka a ejakulovaných spermiách. Molekulová hmotnosť detegovaného proteínu na tkanivách býčích reprodukčných orgánov sa pohybuje v rozmedzí 24-26 kDa, okrem rete testis, v ktorom je molekulová hmotnosť 22-24 kDa. Molekulová hmotnosť CD9 v tkanivách samičieho reprodukčného traktu je 24 kDa, rovnako aj pri ejakulovaných spermiách a spermiách z jednotlivých častí prísemenníka. Realizácia projektu bola finančne podporená grantami VEGA 2/0006/12 a APVV-0137-10.

117

POS TE RY

P015 ISCHEMIA – INDUCED DYSFUNCTION OF MITOCHONDRIAL RESPIRATORY COMPLEXES IN RAT HIPPOCAMPUS AND CORTEX

POS TE RY

P017 ANALYSIS OF BEE ANTIMICROBIAL PEPTIDES BY MASS SPECTROMETRY METHODS Danihlík J., Lenobel R., Šebela M., Petřivalský M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University in Olomouc; Department of Protein Biochemistry and Proteomics, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Olomouc [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Recent important losses of bee colonies, which generate economical and ecological problems worldwide, highlight the actual needs for research advances in bee immunity. Bee immunity is composed of three levels of interactions with pathogens – physical barriers, cellular immunity and humoral immunity; moreover bees as social insects evolved special type of immunity – social immunity. Our research is focused to the humoral part of immunity, namely to bee antimicrobial peptides. Antimicrobial peptides are small molecules produced by haemocytes and fat body to haemolymph and are responsible for the major part of antimicrobial activity in bee haemolymph, royal jelly and venom. Nowadays, methods combining mass spectrometry and liquid chromatography are generally used for the detection and qualitative and quantitative analysis of peptides and proteins. These methods facilitate direct determination of peptide levels related to their antimicrobial function, unlike PCR-based methods which detect and quantify changes on mRNA level. We are focused to specific bee antimicrobial peptides, apidaecins and abaecin, which have been identified in bee haemolymph. The developed analytical method consists of several steps which combine the purification of basic peptides from bee bodies extracts on solid phase strong cation exchange and reverse phase matrices and their chemical modification for more reproducible and robust detection. The final detection and quantification of peptide levels in purified sample are performed by nanocapillary liquid chromatography connected on-line with mass spectrometry (nanoLC-MS). Our sensitive method brings possibility to follow and quantify levels of apidaecins and abaecin in a single bee and can be used for the comparison of immune responses to pathogens on individual and population level.

P018 EXPRESSION OF HYPOTHETICAL LECTIN FROM PISUM SATIVUM – COMPARISON OF TWO EUKARYOTIC EXPRESSION SYSTEMS Dejmková E., Šebela M., Wimmerová M. National Centre for Biomolecular Research , Faculty of Science MU Brno; Department of Biochemistry, Faculty of Science MU Brno; Department of Biochemistry, Faculty of Science Palacky University Olomouc; CEITEC MU Brno [email protected] Sekce: Glykobiochemie Lectins represent a diverse group of carbohydrate binding proteins that can be found in all organisms including animals, plants, bacteria and viruses. The biggest class – plant lectins – may not play only a role inside the plant but also interact with glycoconjugates of other organisms. Plant lectins serve not only as storage proteins (in seeds), they participate even in plant defense against microbes, insects, fungi and can play an important role in symbiotic interactions between host plant and symbiotic microorganism. Several legume seed lectins are supposed to establish the symbiosis between plant roots and rhizobial bacteria. Research in the field of plant lectins can yield a deep understanding of the plant lectins function in symbiosis and defense. We have identified a new putative lectin from Pisum sativum using SDSPAGE and MS analysis of highly purified pea amine oxidase where it was present as an impurity. This study was aimed at the production of this protein in a eucaryotic expression system and its structure-function characterization. As production of the native protein was found very low, we have compared two yeast expression systems – Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. Advantages/disadvantages of both approaches will be discussed in detail. The work is supported by Czech Science Foundation (GA522/08/0555) and CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund.

118

Dianovská D., Levarski Z., Krahulec J., Jiríčková K., Bocánová L., Stuchlík S., Turňa J. Katedra molekulárnej biológie PriF UK [email protected] Sekce: Biotechnologie Pri ochoreniach ako deficiencia ľudského rastového faktoru u detí, Turnerov syndróm, katabolizmu asociovaný s AIDS sa využívajú preparáty vychádzajúce z ľudského rastového faktoru. Takéto preparáty sú pripravené biotechnologickými metódami. Výťažky produkcie sa dajú zvýšiť uplatneným najnovších poznatkov o probléme a racionálnym dizajnom expresného systému. Tým bude dosiahnutý úžitok nielen pre firmy zaoberajúce sa produkciou rekombinantného somatotropínu, ale aj pre samotných pacientov. Metylotrofná kvasinka Pichia pastoris je jeden z najefektívnejších a najvšestrannejších systémov na produkciu heterologických proteínov. O čom svedčí aj fakt, že sa využila na produkciu viac ako 500 rozdielnych rekombinantých proteínov. Vlastnosti vďaka ktorým je často využívaná sú: silne ovládateľný inducibilný promótor pre alkohol oxidázu 1, dostupnosť iných alternatívnych promótorov, schopnosť posttranslačných modifikácií a rastu do vysokých bunkových hustôt. V predkladanej práci bolo cieľom navrhnúť a vytvoriť expresný plazmid vhodný pre produkciu ľudského rastového faktoru v Pichii pastoris. Konštrukty sa líšia v promótore, pod ktorý je gén rastového faktoru umiestnený. Jedným je konštitutívny promótor, druhým promótor inducibilný. Kvôli uľahčeniu purifikácie bola zvolená produkcia do média. Čo je zabezpečené spojeným cieľového génu s fúznym partnerom. Od pripravených konštruktov sa očakáva expresia ľudského rastového faktoru, ktorá bude následne optimalizovaná pre získanie čo najpresnejších dát, ktoré umožnia úspešne uskutočniť pilotné expresie vo vysokých objemoch – vo fermentoroch. Príspevok je výsledkom realizácie projektu: “Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov (BIOREKPROT, ITMS 26240220048)“ na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

P020 CARBONIC ANHYDRASE IX MEDIATED ACIDIFICATION OF EXTRACELLULAR ENVIRONMENT IN HYPOXIA IS CONTROLED BY PROTEIN KINASE A Ditte P., Hulikova A., Svastova E., Zatovicova M., Kopacek J., Pastorekova S., Pastorek J.; Dequiedt F.; Supuran C. T. Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 9, 84505 Bratislava, Slovak Republic; University of Liege, Cellular and Molecular Biology Unit, Gembloux Agro-Bio Tech, B-5030 Gembloux, Belgium; Universita degli Studi di Firenze, Via della Lastruccia 3, I-50019, Sesto Fiorentino (Firenze), Italy [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Hypoxia-induced carbonic anhydrase IX (CA IX) is an important component of pH-regulating machinery in tumor cells, where it participates in bicarbonate transport metabolon (Svastova et al, 2004, Svastova et al, 2012). Its role is to catalyze conversion of pericellular CO2 to bicarbonate ions for facilitated import leading to intracellular neutralization, and to protons contributing to extracellular acidification. Proper CA IX functioning requires both extracellular enzyme domain and intact intracellular tail (IC). Here we show that phosphorylation of Thr443 in IC region is critical for activation of CA IX capacity to regulate pH in hypoxic cells and that full CA IX performance also requires simultaneous dephosphorylation of Ser448. We bring the evidence that Thr443 is a phosphorylation substrate for hypoxia activated cAMP-dependent protein kinase A and that the expression of PKA dominant-negative mutant perturbs CA IX-mediated extracellular acidification. This finding sheds new light on CA IX as the active mediator of signal transduction from hypoxia-cAMP-PKA axis and provides insight into molecular mechanisms regulating its function in hypoxic microenvironment. Grant Support: 7th Framework program of EU (Collaborative project METOXIA), Research and Development Support Agency (APVV-DORP-0017-09), Research & Development Operational Program funded by the ERDF (project ITMS 26240220062).

119

POS TE RY

P019 KONŠTRUKCIA EXPRESNÉHO PLAZMIDU PRE GÉN ĽUDSKÉHO RASTOVÉHO FAKTORU S VYUŽITÍM V EXPRESNÝCH SYSTÉMOCH PICHIE PASTORIS

POS TE RY

P021 ALL THAT GLITTERS IS NOT GOLD … OR GLYCAN. (DETECTION OF GLYCANS IN IXODES RICINUS TICK CELL CULTURES AND TISSUES USING BIOORTHOGONAL CHEMISTRY) Dupejova J., Sterba J., Tykalova H., Vancova M., Zavadilova H, Strnad M., Bell-Sakyi L., Grubhoffer L. Faculty of Science, University of South Bohemia, Ceske Budejovice, Czech Republic; Institute of Parasitology, Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Ceske Budejovice, Czech Republic; The Roslin Wellcome Trust Tick Cell Biobank, The Roslin Institute and R(D)SVS, University of Edinburgh, Scotland, UK [email protected] Sekce: Glykobiochemie The presence of N-glycosylated glycans containing core-fucose or sialic acid in ticks, blood-feeding parasites transmitting diseases of humans and livestock, has been shown previously . For both glycan types, their specific localization has been shown in tick tissues. Host proteins from the blood meal were shown to survive the molting of ticks into the next lifestage and thus, the origin of the observed glycans cannot be attributed to ticks based simply on their presence. Moreover, sialylated glycans probably originate in the host. For this reason, we employed two bioorthogonally modified saccharides in the growth medium of Ixodes ricinus tick cell lines and in the blood used for in vitro feeding of adult I. ricinus females: fucose-alkyne directly incorporated into glycans and mannose-azide metabolized into N-azido-acetylneuraminic acid (NeuNAz). Both azide and alkyne groups can be further reacted using Click chemistry (with biotin) and detected with an appropriate system (streptavidin). Using bioorthogonal chemistry, we could detect the fucosylated and sialylated glycans which are produced by the tick cells or tick tissues and not the host glycans. We detected strong staining of bioorthogonally labeled fucosylated glycans in both cultured tick cells and tick tissues, confirming that ticks, like other arthropods, produce fucosylated glycoproteins. On the other hand, we did not detect any structures containing NeuNAz, which suggests that either sialylated glycans in ticks are of host origin, or that ticks produce undetectably low amounts of sialylated glycoproteins. Additionally, we observed nonspecific binding of streptavidin to specific structures in cultured tick I. ricinus cells, but not to the tissues from in vitro fed ticks. This observation is important for researchers using any streptavidin detection system tick cell lines, and the blocking of biotin/streptavidin binding sites is suggested.

P022 PŘÍPRAVA A STRUKTURNÍ STUDIUM PROTEINU CLRB, LIGANDU POTKANÍHO NK BUNĚČNÉHO RECEPTORU NKR-P1B Dvorská A., Vaněk O., Novák P., Skálová T., Dohnálek J., Bezouška K. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Hlavova 2030, Praha 2, 12840; Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, Praha 4, 14220; Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i., Heyrovského nám. 2/1888, Praha 6, 16206 [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Tato práce se zabývá přirozenými zabíječi nebo-li NK buňkami (Natural Killer cells), které hrají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich jedinečnou schopností je zabíjet některé nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Hlavním tématem byla příprava a studium potkaního receptoru Clrb (C-type lectin-related ligand b), který je znám jako ligand inhibičního NK buněčného receptoru NKR-P1B. Tyto receptory se účastní antivirové imunitní odpovědi: Clrb je rychle odstraněno z povrchu buněk napadených virem, avšak v případě potkaního cytomegaloviru je nahrazováno virovým falešným ligandem RCTL, imitujícím Clrb, kterým se virus snaží uniknout NK buněčné cytotoxické odpovědi [1]. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy receptoru Clrb byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI-, [2,3]). Nativní forma receptoru – disulfidicky vázaný homodimer – byla připravena jednak samostatně jako expresní konstrukt s histidinovou kotvou, a také jako několik různých typů fúzních konstruktů s IgG Fc (s pomocí vektorů jako pHLsec-FcHis či pYD5), které po odštěpení proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části receptoru Clrb bez afinitní kotvy. Postupnou optimalizací krystalizačních parametrů a složení srážedla se podařilo pro konstrukt Clrb s histidinovou kotvou nalézt krystalizační podmínky jak pro nativní protein s jednoduchou glykosylací, tak i pro deglykosylovaný protein. Krystalizační podmínky pro dimerní proteiny připravené z fúzních konstruktů Clrb jsou dále optimalizovány. Podpořeno projekty GAČR (P207/10/1040, 303/09/0477 a 305/09/H008), MŠMT ČR (1M0505), Univerzity Karlovy (UNCE 204025/2012) a Evropské komise (SPINE2 COMPLEXES: 031220, P CUBE: 227764). [1] Voigt, S. et al., Immunity 26, 617-627 (2007) [2] Aricescu, A. R. et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 1243-1250 (2006) [3] Chang, V. T. et al., Structure 15(3), 267-273 (2007).

120

Feckova L., Novakova R., Rehakova A., Farkasovsky M., Sevcikova B., Kormanec J. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Bacteria of the genus Streptomyces belong to the main producers of bioactive natural products. A large number of secondary metabolites produced by Streptomyces belong to polyketides, which represent one of the most relevant classes of natural products and are synthesized by a repeated decarboxylative condensation from acyl-CoA precursors by a polyketide synthase (PKS). Biosynthetic genes of secondary metabolites are physically clustered and are located in large linear chromosomes characteristic of streptomycetes. However, in several cases, antibiotic clusters have been identified in large linear plasmids that may ensure efficient spreading of these genes in population of soil bacteria via a horizontal gene transfer. Like Streptomyces chromosomes, the linear plasmids replicate bidirectionally from a centrally located replication origin towards both ends. The terminal telomere regions of the linear plasmids contain long inverted repeats (TIR), which are capped by specific TIR-binding Tap/Tpg proteins. Distribution of linear plasmids in dividing cells usually involves specific partitioning system encoded by parAB genes. We previously identified a type II polyketide synthase gene cluster, aur1, responsible for production of the angucycline polyketide antibiotic auricin in Streptomyces aureofaciens CCM 3239. Sequence analysis of the aur1 flanking regions revealed presence of several genes, encoding proteins highly similar to ParAB partitioning system and the telomere-binding Tap/Tpg proteins of the streptomycetes linear plasmids. The results indicated that auricin cluster aur1 should be located in such a large linear plasmid. We actually detected the 220-kb plasmid pSA3239 in S. aureofaciens CCM3239 and confirmed that the auricin gene cluster is located in the plasmid. This work was supported by the Slovak Research and Development Agency under the contracts No. APVV-0017-07 and No. APVV-0203-11.

P024 POLYANION-INDUCED CIRCULAR DICHROISM STUDY OF THIOFLAVIN T Fedunova D., Huba P., Bagelova J., Antalik M. Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, Watsonova 47, 040 01 Košice, Slovakia; Department of Biochemistry, PF UPJŠ, Moyzesova 11, 040 01 Košice, Slovakia [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Thioflavin T (ThT) is a fluorescence dye with a high selectivity for amyloid fibrils. The most predominate model of ThT binding mechanism and fluorescence enhancement observed in the presence of amyloids suggests β-sheets cavities as a possible ThT binding sites [1]. The restraint of free rotation of benzothiazole and benzaminic rings around shared C-C bond as well as planarization of the conformation after binding to amyloid moiety is needed for occurrence of fluorescent signal. This entrapment of ThT molecules in amyloid fibrils also leads to formation of optically active conformers. The induced optical activity was also found after binding to α-helical polygutamic acid lacking the β-sheet structure or aromatic side-chains [2]. We have studied the complexes of ThT with polyanions other than polypetides (heparin (HPR), polyadenylate). Interaction of ThT with HPR and polyadenylate results in entrapment of ThT molecules in uniformly twisted-chiral molecule and possessing the induced circular dichroism, but no fluorescence signal occurs at the same conditions. Stepwise addition of HPR leads to occurrence of intensive positive band at 408 nm and negative band at 382 nm. However, at higher HPR concentration the sequential vanishing of signals intensities occurs, which can be attributed to the increase spacing between HPR-bound chromophore molecules [3]. Similar results were obtained for polyadenylate. We suggest that ThT may be more unspecific in interactions with not only proteins but also with polymers without regular polypeptide structure. [1] H. Naiki et al., Anal. Biochem. 177 (1989) 244. [2] V. Babenko et al., Chem. Commun. 47 (2011) 10686 [3]F. Zsila et.al., Bioche. Biophys. Res. Commun. 388, (2009) 28 This work was supported by the Slovak Grant Agency VEGA, projects 0025, 0079, 0155, by the Slovak Research and Development Agency under the contract No. APVV-0171-10 and ESF projects 26220220061 and 2622012003.

121

POS TE RY

P023 A GENE CLUSTER FOR THE ANGUCYCLINE ANTIBIOTIC AURICIN IS LOCATED ON A LARGE LINEAR PLASMID PSA3239 IN STREPTOMYCES AUREOFACIENS CCM3239

POS TE RY

P025 ANALYSIS OF N-GLYCOSYLATION IN PEA SEEDLINGS DIAMINE OXIDASE USING MICROGRADIENT CHROMATOGRAPHY COUPLED OFFLINE TO MALDI-TOF/TOF MASS SPECTROMETRY Franc V., Řehulka P., Šebela M. I. Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research – Department of Protein Biochemistry and Proteomics, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, Czech Republic; II. Institute of Molecular Pathology, Faculty of Military Health Sciences, University of Defence, Hradec Králové, Czech Republic (Pavel Řehulka) [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Plant diamine oxidases (EC 1.4.3.22) catalyze the oxidative deamination of diamines and polyamines which function as ubiquitous regulators in crucial physiological events such as cell differentiation and growth, wound healing, detoxification and signaling [1]. From this point of view, it is obvious that pathways and reactions affected by diamine oxidase are rather multiple and insights to the structure of this enzyme could significantly improve understanding of them. The dimeric enzyme from pea seedlings (PSAO) has been investigated for a long time as a typical member of the group. PSAO monomer has four potential N-glycosylation sites. Previous data from X-ray crystallography showed that two of them (Asn131, Asn558) were occupied and suggested that there might be a glycan chain bound at Asn334 in one of the two subunits of the enzyme. There was no evidence obtained for the presence of sugar residues at Asn364 [2]. For a direct determination of sugar binding and glycan structure determination, we implemented a standard procedure which includes enzymatic digestion of purified native PSAO, fractionation of digests, reversed-phase chromatography using a manual microgradient device for glycopeptide separation and mass spectrometric analysis of the separated glycopeptides. Glycopeptide sequencing by MALDI-TOF/TOF MS/MS clearly demonstrated N-glycosylation at Asn558. Manual spectra interpretation revealed the attachment of hybrid N-glycan chains that contain beta(1,2)-xylose bound at the branching point of the tri-mannose N-glycan core. Such a glycosylation type has been reported for many plant proteins [3]. Acknowledgement: This work was supported by grant no. 522/08/0555 from the Czech Science Foundation. [1] Cona A., Rea G., Angelini R., et al., Trends Plant Sci. 2006, 11 (2), 80-8. [2] Kumar V., Dooley D. M., Freeman H. C., et al., Structure 1996, 4 (8), 943-55. [3] Lerouge P., Cabenes-Macheteau M., Rayon C., et al., Plant Mol. Biol. 1998, 38 (1-2), 31-48.

P026 SIMPLE ANALYTICAL TECHNIQUE FOR UDP-SUGARS DETERMINATION IN HYALURONIC ACID PRODUCING STREPTOCCOCUS EQUI SUBSP. ZOOEPIDEMICUS Franke L., Čožíková D., Procházková E., Smirnou D., Velebný V. Contipro Biotech s.r.o., Dolní Dobrouč [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Hyaluronic acid (HA) is a linear, unbranched glycosaminoglycan composed of disaccharides of glucuronic acid and N-acetylglucosamine joined alternately by β-1-3 and β-1-4 glycosidic bonds. HA is a highly valued biopolymer with commercial applications in medicine, cosmetics and health specialty foods. To research biochemical processes of HA biosynthesis metabolomic studies can be applied. In HA biosynthetic pathway phosphorylated and UDP sugars are involved. Phosphorylated sugars occur at the beginning of the HA synthesis pathway and are often redirected to other products formation. The UDP-N-acetylglucosamine and UDP-glucuronic acid are the final precursors of HA biosynthesis. From this point of view, UDP-sugars seem to be better indicators of HA synthesis than phosphorylated sugars. Therefore a simple method for UDP-N-acetylglucosamine, UDP-glucuronic acid and UDP-glucose determination was developed. The method is based on anion exchange chromatography with UV detection. The chromatographic separation was performed by gradient elution. The sample preparation process was optimized by using short time centrifugation and hot ethanol extraction combined with ultrasonic treatment. Concentrations of intracellular UDPsugars involved in HA biosynthesis were measured. Since UDP-glucuronic acid was found in the lowest concentration it seems to be the possible limiting metabolite in HA synthesis.

122

Gajdova S., Kolarova H., Adam M., Klinke A., Pekarova M., Baldus S., Kubala L. Institute of Biophysics, AS CR, Brno; Dep. of Biochemistry and Dep. of Animal Physiology, Faculty of Science, MU, Brno; ICRC – CBCE, St. Anne‘s University Hospital Brno; Dep. of Cardiology, University Hospital Eppendorf, Hamburg, Germany [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Myeloperoxidase (MPO) is the most abundant enzyme in granules of neutrophil granulocytes that is released upon their activation during degranulation process. MPO has long been viewed to function primarily as a bactericidal enzyme centrally linked to innate host defense. Current studies suggest that MPO is profoundly involved in the development of vascular inflammatory diseases. Interestingly MPO, a highly cationic protein, has been shown to not only bind to endothelial cells but also binds to the membrane of leukocytes. Given the anionic surface charge of red blood cells we investigated the affinity of MPO to the erythrocyte´s membrane. The binding of MPO to surface of both human and mouse erythrocytes was detected employing various methods including the determination of MPO presence in erythrocyte lysate by ELISA, the determination of MPO on surface of erythrocytes by flowcytometry and by three dimensional analysis by confocal microscopy. The electrostatic character of the interaction between MPO and erythrocytes surface was suggested from data showing an elimination of this bond with an excess of negative charge glycosaminoglycan heparin in the cells suspension. Finally, from the physiological perspective the sedimentation of erythrocytes pre-incubated with MPO was faster than untreated erythrocytes. Overall, it can be assumed that MPO on the erythrocyte’s surface may play significant role in erythrocytes circulation in vessels, especially in the capillaries.

P028

STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY SLIN. Galandáková A., Anzenbacherová E., Dvořáčková S., Ulrichová J. Ústav lékařské chemie a biochemie, LF UP Olomouc [email protected] Sekce: Výuka biochemie Periodontální onemocnění (gingivitis a periodontitis) patří mezi choroby postihující značnou část populace v celosvětovém měřítku. Na etiologii těchto onemocnění se podílí velkou měrou bakterie Porphyromonas gingivalis, která v ústech zvyšuje produkci prozánětlivých cytokinů a aktivaci polymorfonukleárních neutrofilů. Tyto buňky pak produkují reaktivní kyslíkové radikály, které mají za úkol destruovat patogen, ale zároveň ničí i tkáň hostitelského organismu. Sliny představují první obrannou linii proti volným kyslíkovým radikálům. Nižší hladiny antioxidantů ve slinách jsou spojovány se zpomalením hojícího procesu v dutině ústní. Pro zvýšení atraktivnosti výuky biochemie pro obor Zubní lékařství jsme se proto rozhodli zavést do praktické výuky předmětu Biochemie nové úlohy orientované na biochemické pochody probíhající v dutině ústní. Jedno z nových témat, které bylo do výuky zařazeno díky získaným finančním prostředkům na nákup nových přístrojů z FRVŠ, se zabývá stanovením antioxidační kapacity slin. Úlohou studentů v praktickém cvičení bylo změřit antioxidační kapacitu vlastní sliny a zjištěnou hodnotu porovnat s publikovanými daty. Pro stanovení byla použita metoda FRAP, která je založena na schopnosti redukovat železitý komplex (FeIII– 2,4,6-tris(2pyridyl-1,3,5-triazin)). Měření se zúčastnili studenti 2. ročníku oboru Zubního lékařství (59 žen; 31 mužů; průměrný věk 21 ± 2). Statisticky vyhodnoceny byly výsledky získané od zdravých studentů. Hodnota naměřené antioxidační aktivity u žen byla 219 ± 124 μmol.l-1 a u mužů 229 ± 134 μmol.l-1. Úloha „Stanovení antioxidační kapacity slin“ a další podobně zaměřené úlohy zvýšily u studentů zájem o výuku biochemie (podle evaluačních dotazníků). Kromě získání praktických dovedností splnilo zavedení nových metodických přístupů další cíl, ukázalo studentům význam stanovení vybraných biochemických parametrů v dutině ústní pro medicínskou praxi. Poděkování: Nákup přístrojů byl podpořen grantem FRVŠ 1500/2012.

123

POS TE RY

P027 MYELOPEROXIDASE INTERACTION WITH ERYTHROCYTES

POS TE RY

P029

EXPRESIA P-GLYKOPROTEÍNU INHIBUJE AKTIVÁCIU KASPÁZY 3 INDUKOVANÚ CISPLATINOU V L1210 BUNKÁCH Gibalová L., Šereš M., Labudová M., Sedlák J., Rusnák A., Breier A., Sulová Z. Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava, Slovensko; Virologický ústav SAV, Bratislava, Slovensko; Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava, Slovensko [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Multidrug rezistencia (MDR) je jav, kedy sa bunky stanú odolné nielen voči látke, ktorá túto rezistenciu vyvolala, ale aj voči iným, štruktúrne a funkčne odlišným substanciám (substrátom). Jedným z najčastejšie študovaných mechanizmov MDR je transportná pumpa, P-glykoproteín (P-gp), ktorého expresia a aktivita predstavuje reálnu prekážku pri účinnej chemoterapii. Zamerali sme sa na sledovanie prípadných rozdielov v apoptóze indukovanej cisplatinou (CisPt, nie je substrátom pre P-gp) medzi P-gp pozitívnymi a P-gp negatívnymi L1210 bunkami. P-gp pozitívne bunky sme získali dlhodobou adaptáciou parentálnych L1210 buniek na cytostatikum vinkristín (R bunky) alebo transfekciou parentálnych buniek génom pre ľudský P-gp (T bunky). P-gp pozitívne bunky sa vo viacerých biochemických aspektoch líšia od parentálnych (S) buniek. Zistili sme, že R a T bunky sú rezistentnejšie na prítomnosť CisPt, a táto rezistencia nie je ovplyvnená inhibítorom P-gp, verapamilom. Bunky po aplikácii CisPt vstupujú do apoptózy, jej typické prejavy ako napr. DNA fragmentácia a ultraštrukturálne zmeny sme pozorovali vo všetkých typoch buniek, avšak cisPt indukuje rýchlejší a výraznejší vstup do apoptózy práve v P-gp negatívnych bunkách, než v P-gp pozitívnych. CisPt vyvoláva výraznejšiu aktiváciu kaspázy 3 v S bunkách, než v R a T bunkách. CisPt neindukuje zmeny v hladine P-gp. Porovnateľné množstvo proapoptotického proteínu Bax a antiapoptotického proteínu Bcl-2 sme pozorovali v S, R a T bunkách, avšak v prítomnosti CisPt nastalo výraznejšie zníženie proteínu Bcl-2 v S bunkách, na rozdiel od R a T buniek. Všetky vyššie spomenuté zistenia nám indikujú, že P-gp, nezávisle od jeho transportnej aktivity, vyvoláva zmenu v regulačných dráhach buniek, čo vyvolá čiastočnú stratu citlivosti na cisplatinu. Podporené: APVV-0290-10 a VEGA 2/0123/10, 2/0155/09

P030 VPLYV OXIDAČNÉHO STRESU U PACIENTOV S DIABETES MELLITUS 2. TYPU Glejtková M., Jakuš V., Šándorová E., Mojto V. Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; III. Interná klinika vo fakultnej nemocnici s poliklinikou Kramáre, Bratislava [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Sprievodným javom nedostatočnej metabolickej kontroly u pacientov s diabetes mellitus patrí aj zvýšený systémový a lokálny oxidačný stres. Oxidačný stres sa môže následne podieľať na rozvoji mikro- a makrovaskulárnych komplikácií u pacientov s diabetes mellitus 2. typu. Krv a krvné plazmy od pacientov sme získali od III. Internej kliniky vo fakultnej nemocnici s poliklinikou Kramáre v Bratislave. Pacienti (n=57) vo veku od 24-82 rokov s dĺžkou trvania diabetu od 1-32 rokov boli rozdelení podľa glykemickej kompenzácie na zle kompenzovaných (ZK) (n=41) a dobre kompenzovaných (DK) (n=16). Do skupiny ZK, sme zaradili pacientov, ktorých priemerná hodnota glykovaného hemoglobínu (HbA1c) za posledné dva roky presiahla hodnotu 6%. Zdravú kontrolnú skupinu tvorili nediabetickí pacienti (n=13). Z klinických parametrov sme stanovili vek, trvanie diabetu a BMI u všetkých diabetických pacientov. HbA1c bol stanovený (kalibrované podľa normy IFCC) na princípe iónomeničovej HPLC metódy (DiaSTAT, BioRAD, USA). Lipoperoxidy (LP) boli stanovené v plazme spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 365 nm (El- Saadani a kol (1989)). Z markerov oxidačného stresu sme stanovili LP u všetkých diabetických pacientov (n=57) v porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou (n=13). Zistili sme signifikantne zvýšené hladiny cirkulujúcich LP u všetkých diabetických pacientov (67,87±23,49 nmol/ml), (p<0,0001) v porovnaní s DK diabetickými pacientmi (31,48±4,47 nmol/ml), (p<0,0001) a kontrolnou skupinou (28,35±7,03 nmol/ml). Ďalej sme zistili signifikantne zvýšené hladiny LP u ZK diabetikov (57,66±25,91 nmol/ml), (p<0,0001) v porovnaní s DK diabetikmi, (31,48±4,47 nmol/ml), (p<0,0001). HbA1c signifikantne koreloval s LP u všetkých diabetických pacientov (r=0,84; p<0,0001), u ZK diabetických pacientov (r=0,73; p<0,0001) ako aj u DK diabetických pacientov (r=0,89; p<0,0001). Signifikantne zvýšené hladiny cirkulujúcich LP v plazme u všetkých diabetických pacientov v porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou poukazujú na zvýšený oxidačný stres. Dobrá metabolická kompenzácia vedie k signifikantnému zníženiu hladín LP v porovnaní so ZK diabetikmi. Táto štúdia bola podporená grantom VEGA 1/0451/12 a GUK 492/2012.

124

Göselová S., Javůrková B., Fukal L., Rauch P., Blažková M. Ústav biochemie a mikrobiologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze [email protected] Sekce: Molekulární genetika V roce 2008 byl bakteriální druh Enterobacter sakazakii překlasifikován na nový rod Cronobacter. Jedná se o patogenní mikroorganismus, který způsobuje závažná onemocnění u imunodeficientních novorozenců nebo u dětí narozených s nízkou porodní váhou. Podrobná charakterizace jednotlivých zástupců tohoto rodu umožní pochopení podstaty jejich virulence, potažmo vývoj rychlých a účinných metod ať už na jejich detekci či likvidaci. Lipopolysacharidy jsou důležitou součástí buněčné membrány u gramnegativních bakterií a podílejí se výraznou měrou na jejich virulenci. V této práci jsme se zabývali určením sérotypu O:1 a O:2 u kmenů Cronobacter sakazakii. Vybrané kmeny byly analyzovány prostřednictvím sérotypově specifické PCR*. Primery byly orientovány vůči genům pro glykosyltransferasy podílejících se na syntéze O-antigenů: gen wehC v případě sérotypu O:1 a wehI pro sérotyp O:2. Jelikož u některých testovaných kmenů Cronobacter spp. nebyly získány jednoznačné výsledky, byly výsledky potvrzeny či upřesněny na základě restrikčních profilů O-antigen genového klastru rfb získaných metodou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Celkem se podařilo zařadit kolem 90 % analyzovaných kmenů. Oba sledované sérotypy O:1 a O:2 byly mezi identifikovanými kmeny rovnoměrně zastoupeny. Nezařazené kmeny budou dále analyzovány. *Mullane N., O‘Gaora P., Nally J. E., Iversen C., Whyte P., Wall P. G., Fanning S.: Molecular analysis of the Enterobacter sakazakii O-antigen gene locus. Appl Environ Microbiol. 74, 3783-3794 (2008). Finanční podpora Grantové agentury ČR projekt P503/12/P704 a Učelová podpora na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT (Rozhodnutí č. 21/2012).

P032 PREPARATION OF SOLUBLE NKP30, A HUMAN NATURAL CYTOTOXICITY RECEPTOR EXPRESSED ON NK CELLS, FOR STRUCTURAL STUDIES Grave L., Tůmová L., Mrázek H., Kavan D., Chmelík J., Vaněk O., Novák P., Bezouška K. Katedra biochemie UK PřF Praha; Hannover Medical School, Hannover, Germany; Mikrobiologický ústav AV ČR Praha [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul NKp46 (NCR1, CD335), NKp44 (NCR2, CD336), and NKp30 (NCR3, CD337) are natural cytotoxicity receptors (NCR) of human natural killer (NK) cells that play a major role in recognition and lysis of malignantly transformed, virally infected or stress damaged target cells. In order to study molecular details of interaction of NKp30 with its ligands, NMR titration experiments would be an obvious choice. Thus, we have tried to adopt the published expression protcols and constructs to prepare labeled proteins for NMR experiments. The expression construct was synthesized at Generay (Shanghai, China), and supplied in pET-30a expression vector. E. coli BL-21 Gold (Stratagene) proved to be the best producer. Production in rich LB medium was low contrasting with high expression levels achieved using M9 minimal medium with 2 g/L of glucose. This finding opened the way for the production of 15N labeled or 15N/13C double labeled NKp30 proteins with yields exceeding 100 mg of protein per 1L. Using the published refolding conditions the folded protein was concentrated by membrane filtration, and applied onto Superdex 75 HR column (1 x 30 cm) equilibrated and eluted in 10 mM Hepes pH 8.0 with 150 mM NaCl and 1 mM NaN3. Several protein peaks could be detected of which the penultimate prominent peak eluting just before the salt peak represented the monomeric NKp30 protein. After concentration of the purified protein, a stable preparation was produced up to 20 mg/ml. The identity of the protein was confirmed using N-terminal sequencing, in gel protein mapping, and high resolution FT-MS. 1H/15N-HSQC measurements confirmed good folding of the protein, as well as the possible flexibility of some of its parts. Both 15N labeled and 15N/13C labeled proteins are now available for NMR titration experiments using specific ligand and their structural parts. Supported by Charles University Prague (UNCE #42, and 265214/2012), and by Czech Science Foundation (303/09/0477 and 305/09/H008).

125

POS TE RY

P031 STUDIUM KMENŮ CRONOBACTER SAKAZAKII PŘÍSLUŠEJÍCÍCH K SÉROTYPU O:1 A O:2

POS TE RY

P033 ANALÝZA SÚBORU NEPATOGÉNNYCH KLOSTRÍDIÍ MOLEKULÁRNE BIOLOGICKÝMI METÓDAMI Gregušová B., Chroboková M., Španová A., Rittich B. Fakulta chemická, Vysoké učení technologické v Brně [email protected] Sekce: Molekulární genetika Rod Clostridium patrí medzi významné bakteriálne rody a v potravinárstve slúži ako indikátor nedostatočného ošetrenia potravín. Niektorí zástupcovia majú potenciál pre biologickú výrobu vodíka z odpadových substrátov. Tým sa stávajú zaujímavými z biotechnologického hľadiska, pričom jednou z dôležitých otázok je druhové zastúpenie baktérií. V našej práci sme sa zamerali na identifikáciu súboru nepatogénnych baktérií rodu Clostridium izolovaných z mlieka a syrov s defektom neskorého durenia. Na analýzu kmeňov na úrovni DNA boli využité molekulárne biologické metódy, ako polymerázová reťazová reakcia (PCR) s druhovo špecifickými primermi a PCR nasledovaná denaturačnou gradientovou gélovou elektroforézou (PCR-DGGE). Príbuznosť kmeňov so zbierkovými a typovými kmeňmi bola testovaná pomocou molekulárne typizačných metód a zhlukovej analýzy. Pri druhovej identifikácii pomocou PCRDGGE bola DNA amplifikovaná pomocou primerov špecifických pre rod Clostridium a ako referenčné vzorky boli použité DNA zbierkových kmeňov C. butyricum DSM10702 a C. tyrobutyricum DSM2637T. Zo súboru 45 kmeňov bolo 28 zaradených do druhu C. tyrobutyricum a 3 kmene do druhu C. butyricum. Identifikácia druhov porovnaním migračných vzdialeností PCR produktov terénnych kmeňov so zbierkovými v denaturačnom gradientovom géle je lacnejšou a rýchlejšou alternatívou k sekvenovaniu amplikonov. Výsledky PCR-DGGE sa plne zhodovali s výsledkami druhovej identifikácie na základe PCR s druhovo špecifickými primermi pre druhy C. tyrobutyricum a C. butyricum. Výhodou použitia DGGE je jednak možnosť identifikovať rôzne druhy zároveň a jednak analyzovať zmiešané kultúry a sledovať zmeny v ich mikrobiálnom zastúpení. Ďalej bol súbor kmeňov analyzovaný pomocou interrepetitívnej PCR (rep-PCR) s primerom (GTG)5 a náhodnou amplifikáciou polymorfnej DNA (RAPD). Fingerprintové profily boli porovnané medzi sebou a na ich základe bol zostrojený súhrnný dendrogram vyjadrujúci vzájomný stupeň príbuznosti jednotlivých kmeňov.

P034 MECHANISMUS VLIVU INHIBITORŮ HISTONDEACETYLAS NA NEUROBLASTOMY Groh T., Poljaková J., Hraběta J., Eckschlager T., Stiborová M. Katedra biochemie, PřF UK, Albertov 2030, 128 40 Praha; Klinika dětské hematologie a onkologie, 2. LF a FN v Motole, UK, V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Neuroblastom (NBL) je nejčastějším extrakraniálním solidním nádorem dětí a některé jeho formy jsou stále obtížně léčitelné. V této práci sledujeme mechanismy působení inhibitorů histondeacetylas (HDACi) na NBL buněčné linie. HDACi indukují apoptózu i v buňkách s defektní apoptotickou drahou a zastavují buněčný cyklus transformovaných buněk, přičemž normální lidské buňky jsou vůči jejich působení méně citlivé. Účinnost inhibitorů HDAC jsme sledovali za standardních kultivačních podmínek i v hypoxii (1 % O2). Neadekvátní zásobení nádorů kyslíkem je pro tumory charakteristické a podílí se na chemorezistenci. Proto je testování protinádorových látek v hypoxii nutné. U chemorezistence nádorových buněk indukované hypoxií se předpokládá vliv HIF-1α. Některé HDACi snižují v hypoxii množství HIF-1α a tím aktivitu transkripčního faktoru HIF. Hledáme vhodné podmínky experimentu zaměřeného na HDACi indukované buněčné smrti u lidských NBL buněčných linií SK-N-AS a UKF-NB-3. Buněčná smrt byla detekovatelná již po 24 hodinové kultivaci. Jako kontrola bylo použito konvenčně používané cytostatikum, cisplatina. V NBL liniích jsme sledovali vliv hypoxie na indukci buněčné smrti cisplatinou a třemi HDACi (kyselinou valproovou – VPA, trichostatinem A a butyrátem sodným) a prokázali, že VPA na rozdíl od cisplatiny, indukovala buněčnou smrt i v přítomnosti pancaspasového inhibitoru Z-VAD-fmk jak v normoxii tak v hypoxii. Mezi alternativní apoptotické dráhy podílející se na protinádorovém účinku inhibitorů HDAC může patřit i uvolnění AIF či Endo G z mitochondrií. Imunofluorescencí jsme detekovali translokaci AIF a nalezli morfologické změny odpovídající autofagii – tvorbu vakuol. Výsledky experimentů prokazují indukci neapoptotických typů buněčné smrti HDACi, nejspíše indukci autofagie. Z toho vyplývá, že některé HDACi vykazují protinádorové účinky i v nádorových buňkách, které neexprimují caspasy i za hypoxických podmínek. Podporováno GAČR (P301/10/0356) a MŠMT ČR (UNCE #42)

126

Gudernová I., Procházková J. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Brno [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Maligní melanomy vznikají z buněk melanocytů, které na rozdíl od jiných typů nádorů obsahují melanosomy, které mají schopnost syntetizovat melanin. Proces tvorby melaninu se obecně nazývá melanogeneze, která kromě biogeneze melanosomů, syntézy melaninu, zahrnuje také detoxikace endogenních cytotoxických látek prostřednictvím melaninu. Melanomy často bývají rezistentní ke konvenční léčbě, jako je chemoterapie. Dalším důvodem může být jejich schopnost detoxifikace látek prostřednictvím melaninu nebo zamezení průniku látek zvýšeným exportem zprostředkovaným membránovými transportéry rodiny ABC B, konkrétně MDR1/Pgp/ABC B1 a ABC B5. Exprese transportéru ABC B5 je hojná na melanosomech i povrchu melanocytů. Melanomy rezistentními k chemoterapeutikám mají expresi ABC B5 vysokou a je také zvýšena u CD133+ progenitorů melanocytů i nádorových kmenových buněk melanomů. Studie na buňkách melanomů, které postrádaly schopnost syntézy melaninu, prokázaly nepřítomnost ABC B5 transportéru, z čehož lze usuzovat zapojení tohoto transportéru do melanogeneze. ABC B5 se tak stává novým molekulárním markerem pro subset chemorezistentních buněk s charakteristikou nádorových kmenových buněk. Studium transkripční regulace tohoto proteinu tak může vést k nalezení potenciálních cílů genové terapie a také objasnit roli ABC B5 transportéru v melanogenezi. Cílem tohoto projektu bylo určit roli ABC B5 transportéru v melanogenezi indukované UV zářením. Jako modelové linie byly použity buňky nádorové linie melanomu Mel4M (dar prof. Polakowske, INSERM, Lille, France), A375, Mel-Juso a IPC298 (dar Dr. Uldriana, LF MU, Brno). Pomocí imunocytochemie, Western blottingu a qRT-PCR byla testována exprese ABC B5 na těchto liniích. Další experimenty byly prováděny na buněčné linii Mel4M a IPC298, které exprimují ABC B5 nejvíce. Indukce melanogeneze pomocí UV záření vedla ke změně hladiny ABC B5, pod vlivem drah PI3K/Akt, MAPK a STAT. Tento projekt je podporován granty MUNI/C/0829/2011 a MUNI/A/0975/2009.

P036 NOVEL DICATIONIC COMPOUNDS AS DNA G-QUADRUPLEX BINDING LIGANDS Hájek M., Teplý F., Vávra J., Jirásek M., Joshi V. D. Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, v.v.i., Prague, Czech Republic [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie The vascular endothelial growth factor (VEGF) is the most important proangiogenic cytokine and its expression is usually elevated in many types of solid tumors. Therefore, VEGF is an attractive target for cancer therapy. The proximal promoter region of the VEGF gene contains a guanine-rich strand that has the capacity to form a stable G-quadruplex structure both in vitro and in vivo. Thus, G-quadruplex interacting agents may suppress VEGF expression, primarily by transcriptional inhibition through G-quadruplex formation and/or stabilization. We tested a series of in-house synthesized dicationic compounds for their ability to stabilize G-quadruplex in the VEGF promoter using DNA polymerase stop assay. The obtained results revealed dication-based lead structures that can arrest primer extension prior to the G-quadruplex motif of the VEGF gene promoter sequence at low micromolar concentrations. Furthermore, one of the enantiomers of the most effective molecule stabilizes VEGF G-quadruplex more potently, suggesting pronounced enantio-preferential binding. Concerning G-quadruplex formation, we compared the studied dicationic compounds with the porphyrin derivative TmPyP4 and the natural product berberine, which are well-known G-quadruplex binders. The results provide the foundation for the development of new dicationic derivatives effective as VEGF inhibitors with regard to their potential use as anti-angiogenesis agents in cancer therapy. Supported by the Research project of the IOCB #RVO: 61388963

127

POS TE RY

P035 VLIV MELANOGENEZE INDUKOVANÉ UV ZÁŘENÍM NA HLADINU ABC B5 TRANSPORTÉRU

POS TE RY

P037 PRÍPRAVA PRODUKČNÉHO KMEŇA PICHIA PASTORIS PRE HETEROLOGICKÚ EXPRESIU REKOMBINANTNÉHO EKARINU Halászová H., Kandričáková M., Krahulec J., Stuchlík S., Turňa J. Katedra molekulárnej biológie PriF UK [email protected] Sekce: Biotechnologie Ekarin, metaloproteáza hadieho jedu Echis carinatus, vďaka svojim prokoagulačným účinkom nachádza uplatnenie vo farmaceutickom priemysle a využíva sa tiež ako špecifická proteáza na aktiváciu rekombinantného prekurzora trombínu. Heterologická epresia je prostriedkom na zvýšenie jeho dostupnosti a zabezpečenie vyššej čistoty v porovnaní s ekarinom získaným izoláciou z hadieho jedu. Vzhľadom na to, že kvasinkový expresný systém Pichia pastoris patrí medzi eukaryotické organizmy, postranslačný proces skladania by nemal byť zásadne narušený a mala by byť dosiahnutá autentická konformácia proteínu s charakteristikami porovnateľnými s natívnym ekarinom. Prvým krokom pre úspešnú expresiu ekarinu bola optimalizácia kodónov sekvencie génu pre ekarin za účelom zníženia výskytu nízkofrekvenčných tripletov. Z dôvodu efektívnej aktivácie enzýmu opracovaním octanom p-aminofenylortuťnatým (APMA) sme na syntézu génu pre ekarin zvolili sekvenciu poddruhu Echis carinatus leucogaster. Sekvenciu syntetického génu sme klonovali do expresného vektora pGAPZαC za príslušný sekrečný signál pre zabezpečenie sekrécie exprimovaného ekarinu do kultivačného média, z ktorého je izolácia cieľového produktu značne zjednodušená. Navyše bola na C-terminálny koniec proteínu pridaná histidínová kotva pre uľahčenie chromatografickej purifikácie enzýmu. Týmto konštruktom sme transformovali produkčný kmeň Pichia pastoris Y114 30. Expresia rekombinantného ekarinu bola stanovená na základe schopnosti konverzie komerčného substrátu, protrombínu. Práca vznikla na základe podpory z projektu „Priemyselný výskum nových liečiv na báze rekombinantných proteínov“ (ITMS 26240220034) podporeného Operačným programom Výskum a vývoj finacovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

P038 GP41 OF CORYNEPHAGE BFK20 – PUTATIVE HELICASE FROM DEAD BOX FAMILY Halgašová N., Matúšková R., Bukovská G. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovak Republic [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Gp41 is a gene product of orf41 from the genome of corynephage BFK20. By former bioinformatics analysis the orf41 was found as a part of a gene cluster coding BFK20 putative replication proteins. Gp41 was identified as a helicase from DEAD-box protein family. In addition to putative replicative helicase from F4 family encoded in the C-terminal region of BFK20 gp43 protein, the gp41 represents a second protein with potential helicase activity of this corynephage. Main aim of this study was isolation and experimental characterization of recombinant protein gp41. We cloned orf41 into pET expression system and prepared two expression plasmids pET28/41HN and pET28/41HC. The cloning strategy resulted in synthesis of two recombinant proteins, gp41HN and gp41HC, with a His-Tag sequence on the N- or C-terminus. We isolated gp41HN and gp41HC from soluble fraction of the cell lysate by immobilized metal ion affinity chromatography. The presence of His-Tag sequences on the expressed proteins was verified by Western blot analysis. We tested oligomerization state of the proteins using gel filtration on a Superose 12 column. Enzyme activities of gp41HN and gp41HC were tested by several methods. NTP-ase assays demonstrated that both proteins are active in NTP or dNTP hydrolysis reactions. This activity showed the highest level with ATP or dATP and was strongly dependent on the presence of DNA in the reaction mixture. The ATP-ase activity of the tested proteins was affected also by the presence of a His-Tag sequence on the N- or C-terminus of the proteins. Acknowledgement: This work was supported by the VEGA Grant 2/0110/11 and APVV-0098-10.

128

Hároniková A., Čačková K., Petrik S., Márová I. Faculty of Chemistry, Brno University of Technology, Materials Research Centre [email protected] Sekce: Biotechnologie In this work random mutagenesis followed by adaptation to processed waste substrates was used to selection of pigment overproducing mutants capable to utilize selected wastes. Red yeast strains (Sporobolomyces, Rhodotorula, Cystofilobasidium sp.) were cultivated in production medium exposed to ethyl methanesulfonate. After mutagenesis cultures were inoculated to agar media containing several wastes. Potential overproducers were selected visually, transferred into liquid medium with different carbon source (glucose and waste, respectively) and cultivated at 28°C under permanent lighting and stirring. Carotenoids, ergosterol and coenzyme Q were analyzed by HPLC/PDA/MS/ESI. Mutations were analyzed by PCR/DGGE. Genes of 26S ribosome subunit were amplified using nested PCR, DGGE was performed in 8% polyacrylamide gel (19:1), denaturation gradient 30–45% was used. Separation was performed at 120 V and 60°C for 4 hours. Randomly selected mutants were adapted to glycerol, pasta and hydrolyzed pasta. In some mutants slightly higher growth was observed. Mutants adapted to glycerol were able to produce more pigments not only in glycerol media, but also on glucose. In some strains several times higher carotenoids production was observed on glucose as well as waste glycerol media (1.4–1.7 mg/g). Increased production of β-carotene was achieved in a mutant strain of S. roseus growing on glycerol, pasta and hydrolyzed pasta. Mutants of C. capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by Fusarium solani enzymes. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of negative effects on environment. This work was supported by projects FR2322/G4/2012 and CZ.1.05/2.1.00/01.0012/ERDF.

P040 S-NITROSOGLUTATHIONE AFFECTS HUMAN CARBONYL REDUCTASE 1 ACTIVITY Hartmanová T., Maser E., Wsól V. Department of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy, Charles University, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Czech Republic; Institute of Toxicology and Pharmacology for Natural Scientists, University Medical School Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Brunswiker Str. 10, 24105 Kiel, Germany [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Carbonyl reduction contributes significantly to the phase I metabolism where reactive carbonyls are detoxified and excreted. Human carbonyl reductase 1 (CBR1 or SDR21C1) belongs to the short chain dehydrogenase/reductase superfamily and plays a protective role in oxidative stress, cancer or neurodegeneration. Broad substrate spectrum includes both xenobiotics and endogenous substances. The best substrates known are o- and p- quinones (represented by menadione), anthracyclines, prostaglandins, steroids, endogenous indol isatin or the latest substrate described, S-nitrosoglutathione (GSNO). Just the GSNO breakdown represents different mechanism of reduction, which was not known for CBR1 before. Moreover, recently it was detected, that GSNO causes covalent modification of CBR1, resulting in the CBR1 inhibition. To investigate the role of the modification towards other substrates of CBR1, we cloned CBR1 into the pET-28b(+) vector, overexpressed in E.coli and purified. Next, the recombinant enzyme was incubated with 2 mM GSNO for 2 h to perform the modification. After the buffer exchange, the steady state kinetics with various substrates were measured spectrophotometrically at 340 nm and compared to the CBR1 wild type (wt) as a control. The results obtained showed, that the CBR1 wt had about 2 – 5 times higher kcat with menadione, 4-benzoylpyridine, 2,3-hexandione, daunorubicin and 1,4-naphtoquinone compared to the “inactivated” form. In contrast, surprisingly substrates which contained ortho keto group in the structure showed 2-3 times lower kcat with CBR1 wt when compared to the “inactivated” form. Those substrates include 1,2-naphtoquinone, 9,10-phenathrenequinone and isatin . Based on those results, there is an indication for some yet unknown relationship between the covalently modified residue of CBR1 and substrate structure. This project was supported by the Grant Agency of Charles University (Grant No. 347211/C/2011) and by Charles University project SVV 265 004.

129

POS TE RY

P039 USE OF RANDOM CHEMICAL MUTAGENESIS TO SELECTION OF OVERPRODUCING RED YEAST MUTANTS

POS TE RY

P041 MIKROVISKOZIMETRICKÉ SLEDOVÁNÍ INTERAKCE MPO S GLYKOSAMINGLYKANY Hnyluchová Z., Víteček J., Mravec F., Pekař M., Kubala L. Centrum materiálového výzkumu, Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně, Brno, Česká republika; Oddělení patofyziologie volných radikálů, Biofyzikální ústav AV ČR v.v.i., Brno, Česká republika; Mezinárodní centrum klinického výzkumu – Centrum biomolekulárního a buněčného inženýrství, Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně, Brno, Česká republika [email protected] Sekce: Glykobiochemie Myeloperoxidáza (MPO), kationický protein patřící do skupiny hemových peroxidáz, představuje jednu ze základních nespecifických komponent obrany obratlovců proti mikrobiálním patogenům. V poslední době se ukazuje, že MPO může působit i jako mediátor patologických stavů kardiovaskulárního systému. Jedním z navržených mechanizmů tohoto působení je elektrostatická interakce MPO s endoteliálním glykokalix vedoucí ke ztrátě jeho funkce. Tato interakce je podmíněná přítomností záporně nabitých glykosaminglykanů (GAG) v endoteliálním glykokalix. Cílem naší práce bylo vyvinout metodický přístup pro studium interakce MPO a GAG in vitro. Jako vhodná metoda se jevila mikroviskozimetrie, založená na sledování Brownova pohybu částic, vzhledem k malým nárokům na objemy vzorků. Pro studium interakce MPO a GAG byly vybrány dva modelové GAG: hyaluronan a chondroitin sulfát. Vzhledem k rozměrům potenciálních sekundárních struktur těchto biopolymerů byl sledován Brownův pohyb částic o průměru 1 mikrometr. Pohyb jednotlivých částic byl vyhodnocen pomocí obrazové analýzy a byla získána průměrná závislost střední hodnoty čtverce posunu na čase. Střední hodnota viskozity prostředí byla vypočtena z této závislosti pomocí aplikace Stokes-Einsteinovy rovnice. Mikroviskozimetrická metoda poskytla experimentálně nenáročný nástroj pro studium interakce biopolymerů s MPO in vitro. Interakce MPO s hyaluronanem a chondroitin sulfátem vyvolávala zvýšení viskozity roztoků těchto biopolymerů, což naznačuje, že vazba MPO na GAG v endoteliálním glykokalyx může vyvolávat ztrátu jeho flexibility. Tato práce byla financována z grantů GAČR: P305/12/J038, Centrum materiálového výzkumu (No. CZ.1.05/2.1.00/01.0012), FNUSA-ICRC (No. CZ.1.05/1.1.00/02.0123)

P042 VPLYV PODÁVANIA POLYFENOLOVÉHO EXTRAKTU NA MARKERY OXIDAČNÉHO STRESU A AKTIVITU ANTIOXIDAČNÝCH ENZÝMOV Horváthová M., Országhová Z., Muchová J., Ďuračková Z. Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie LF UK, Bratislava [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Rastlinné polyfenolové zlúčeniny tvoria veľkú skupinu rozmanitých chemických štruktúr od fenolových kyselín až po vysoko polymerizované zlúčeniny kondenzovaných tanínov. Viaceré štúdie dokázali, že konzumácia stravy bohatej na polyfenoly výrazne znižuje riziko vzniku infarktu myokardu, mozgovej mŕtvice, rakoviny a viacerých chronických ochorení. V našej štúdií sme sledovali vplyv podávania polyfenolového extraktu (PE) na markery oxidačného poškodenia lipidov (lipidové hydroperoxidy -LP) a proteínov (pokročilé produkty oxidácie proteínov – AOPP), celkovú antioxidačnú kapacitu plazmy (TEAC) a aktivitu antioxidačných enzýmov superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT) v erytrocytoch zdravých dobrovoľníkov (ZD; n = 20; priemerný vek 54,2 roka). 8-týždňový projekt bol rozdelený na 3 fázy, na konci každej fázy sa odobrali vzorky krvi a moču na stanovenie vybraných parametrov. Prípravná fáza (úprava stravy) trvala 2 týždne, druhá fáza trvala 4 týždne, počas ktorých sa dobrovoľníkom 3x denne podával PE v množstve 100 mg a tretia – prečisťovacia fáza trvala 2 týždne. Po 4-týždňovom podávaní PE sme zistili: 1. významne zníženú hladinu AOPP (57,97 na 33,62 mmol/l, p < 0,05) a LP (43,96 na 32,86 nmol/ml, p < 0,05), ktorá pretrvávala aj po skončení prečisťovacej fázy (AOPP = 34,74 mmol/l; LP = 33,40 nmol/ml). 2. významne zvýšenú aktivitu SOD (42,42 na 47,41 U/mg Hb, p < 0,05) a CAT (5,22 na 6,73 mkat/g Hb, p < 0,05). Aktivita SOD bola významne zvýšená (p < 0,05) aj po skončení prečisťovacej fázy (48,03 U/mg Hb). Na základe získaných výsledkov môžeme usúdiť, že PE významne znižuje mieru oxidačného poškodenia lipidov a proteínov, čo pravdepodobne súvisí so zvýšením aktivít sledovaných antioxidačných enzýmov. Poďakovanie: grant MŠ SR VEGA 1/1133/11

130

Hraběta J., Uhlík J., Stiborová M., Kizek R., Eckschlager T. Klinika dětské hematologie a onkologie a Katedra histologie a embryologie, 2.LF UK a FN Motol; Katedra biochemie, PřF UK; Ústav chemie a biochemie, AF, MZLU, Brno [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) (EL) je alkaloid izolovaný z rostlin čeledě toješťovitých. U některých derivátů EL byly prokázány významné protinádorové účinky. EL zastavuje buněčný cyklus, indukuje buněčnou smrt tvorbou volných radikálů, aktivací systému Fas/Fas ligand a iniciací mitochondriální apoptotické dráhy. Zvyšuje expresi nemutovaného p53 a obnovuje funkci mutovaného p53. Předpokládáme, že hlavním mechanismem jeho protinádorového účinku je interkalce do DNA, inhibice aktivity topoisomerázy II a zvláště tvorba kovalentních DNA aduktů. K tvorbě DNA aduktů je nezbytná aktivace cytochromy P450 nebo peroxidázami. Cytotoxický a genotoxický účinek závisí na obsahu těchto enzymů v buňkách.Vakuolární H+-ATPáza (v-ATPáza) je enzymový komplex, který acidifikuje některé intracelulární kompartmenty jako jsou endozomy, lyzozomy, sekreční granula, trans- Golgiho aparát. Některé látky mohou být na základě své konstanty acidity (pKa) koncentrovány (sekvestrovány) v buněných organelách s nižším pH. Sekvestrace protonovatelných látek v subcelulárních kompartmentech může ovlivňovat jejich účinnost a tím se podílet na chemorezistenci. Role v-ATPáza a lyzozomů v metabolizmu a protinádorovém účinku EL není dosud známa. Prokázali jsme, že EL způsobuje signifikantní cytoplazmatickou vakuolizaci buněk neuroblastomu. V elektonovou a konfokální mikroskopií jsme zjistili, že se jedná o dilatované pozdní endozomy a lyzozomy a že, EL a LysoTracker (fluorescenční proba značicí lysosomy) kolokalizují v těchto subcelulárních strukturách. U rezistentní buněčné linie k EL jsme zjistili pomocí RT-qPCR vyšší expresi v-ATPázy. Inhibice v-ATPazy bafilomycinem A u senzitivní a rezistentní linie eliminuje vstup EL do lyzozomů a výrazně zvyšuje cytotoxicitu. Elektrochemicky jsme prokázali zvýšení interkalace EL do DNA. Zvýšení účinosti EL pravděpodobně nesouvisí s inhibicí autofágie indukované bafilomycinem A, ale s inhibicí sekvestrace EL. Podpořeno grantem GAČR P301/10/0356

P044 STUDY OF CORYNEPHAGE BFK20 DNA POLYMERASE I Hromadová L., Bukovská G. Institute of Molecular Biology SAS Bratislava [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika We have previously determined on the genome of corynephage BFK20 the DNA replication region which involves genes ORF29-ORF46. Using a bioinformatic approach analyses we indicated quite extensive homology between bacteriophage BFK20 and other bacteriophages. The most notable similarities were determined between ORF40– ORF44 and DNA replication genes of mycobacteriophage Rosebush. In our study we have focused on isolation and characterisation of gene orf44. It was identified as a putative DNA polymeraseI (gp44) with domain structure comprising an N-terminal 3´-5‘ exonuclease region and a C-terminal 5‘-3‘ polymerase region. In general – Pol I uses its 3´-5‘ exonuclease activity to remove the ribonucleotide portion of newly synthesized Okazaki fragments and the 5‘-3‘ polymerase activity to fill in the resulting gap. The whole DNA polymerase gene of 1907 bp and the sequences of its N-terminal (798 bp) and C-terminal (1104 bp) region were separately cloned. The recombinant proteins in fusion with His.Tag at the N terminus (gp44ExoN and gp44PolN) and at the C terminus (gp44, gp44ExoC and gp44PolC) were expressed in the host Escherichia coli BL21(DE3). We tested optimal conditions for protein expression (temperature, IPTG, time of expression) to prepare soluble proteins. Protein purifications were performed using metal-ion affinity chromatography on HIS-Select Cobalt Affinity Gel. DNA binding properties of gp44 were tested with different DNA substrates and detected by gel shift on agarose gel electrophoresis. We examined exonuclease and polymerase enzyme activities of gp44 using several assay methods. Acknowledgements: This work was supported by VEGA grant 2/0110/11 from Slovak Academy of Sciences and APVV-0098-10 grant from Slovak Research and Development Agency.

131

POS TE RY

P043 VÝZNAM VAKUOLÁRNÍ (H+)-ATPÁZY V INTRACELULÁRNI SEKVESTRACI ELLPTICINU

POS TE RY

P045 GLUCONOBACTER OXYDANS AKO CELOBUNKOVÝ BIOKATALYZÁTOR PRE PRODUKCIU PRÍRODNÝCH ARÓM Illésová A., Bučko M., Gemeiner P. Slovenská akadémia vied, Chemický ústav, Oddelenie glykobiotechnológie, Dúbravská cesta 9, 84538 Bratislava, Slovenská Republika [email protected] Sekce: Biotechnologie Gluconobacter oxydans je gram-negatívna, striktne aeróbna baktéria, ktorá našla široké uplatnenie v biotechnológiách. Prednostne sa využíva jeho schopnosť neúplnej oxidácie rôznych cukrov, alkoholov a kyselín. Kmene Gluconobacter sp. nepredstavujú žiadne riziko pre človeka ani pre zvieratá, aj preto sú výbornými producentami prírodných aróm. Extrakcia chuťových a vonných látok z prírodných zdrojov sa stáva čoraz komplikovanejšou, pritom na trhu je stale väčší záujem o prírodné arómy. Biotechnologická produkcia pomocou baktérií ponúka skvelú alternatívu namiesto chemickej syntézy, nezaťažuje životné prostredie a ponúka finančnú výhodu oproti extrakcii priamo z prírodných zdrojov. Kyselina fenyloctová ako cieľová látka biokonverzie z 2-fenyletanolu sa uplatňuje ako vôňa medu, a je žiadaná v potravinárskom a kozmetickom priemysle. Na dosiahnutie vysokého výťažku produkcie je potrebné optimalizovať podmienky na kultiváciu a biokonverziu. Nakoľko 2-fenyletanol ako alkohol môže byť vo vyššej koncentrácii pre bunky toxický, prípadne inhibovať rast a znižovať viabilitu a aktivitu voľných buniek, zefektívnenie celého procesu poskytuje imobilizácia baktérii do polyelektrolytových kapsúl. Po optimalizácii výživových nárokov, rastových podmienok (aerácia, pH) a produkčného kmeňa sa pristúpilo k namnoženiu biomasy v laboratórnom fermentore a následne enkapsulácii buniek pomocou laboratórneho enkapsulátora. Priemer kapsúl 0,8-1,2 mm v kombinácii s použitým materiálom zabezpečili výrazné zlepšenie procesných parametrov. Poďakovanie: Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-0302-10.

P046 ACTIVITY OF HUMAN CYTOCHROME P450 1A1 EXPRESSED IN EUKARYOTIC AND PROKARYOTIC SYSTEMS Indra R., Stiborová M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Cytochromes P450 are important enzymes of xenobiotics biotransformation. Cytochrome P450 might be recombinantly produced in different expression systems (bacteria, yeast, insect cells). In this study we used human cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) expressed in a membrane fraction of E. colli (a prokaryotic system) or in insect cells transfected by Baculovirus (an eukaryotic system). Two CYP1A1 expressed in prokaryotic systems were used containing two different concentrations of NADPH:cytochrome P450 reductase. Four different substrates of CYP1A1 were examined for their capabilities to be oxidized by the enzymes in expresion systems. CYP1A1 expressed in a prokaryotic system with a higher level of reductase was the most effective to deethylate a 7-ethoxyresorufine (a marker substrate). Its affectivity was three times higher than the enzyme expressed in the system with a lower level of reductase. Activity of CYP1A1 expressed in an eukaryotic system was much lower. Another CYP1A1 substrate, ellipticine, is oxidized to five metabolites, whose pattern depends on the presence of cytochrome b5 in the system. All expressed systems metabolize ellipticine to the same metabolites. Again, CYP1A1 expressed in a prokaryotic system with higher expression of reductase is most effective. Additional CYP1A1 substrate, benzo[a]pyren is metabolized by the enzyme expressed in an eukaryotic system to 7 metabolites, whereas CYP1A1 expressed in a prokaryotic system produces 8 metabolites. The structure of two from these metabolites is still unknown. CYP1A1 also oxidizes its futher specific substrate, Sudan I, into four metabolites. The most effective system was that where CYP1A1 was expressed in a prokaryotic system containing a higher level of reductase. Activity of CYP1A1 expressed in an eukaryotic system to oxidize Sudan I was nearly the same as that of CYP1A1 expressed in a prokaryotic system with a lower level of reductase. Supported by GAČR (P301/10/0356) and MŠMT ČR (UNCE#42).

132

Ionescu C-M., Klimová Z., Sehnal D., Svobodová Vařeková R., Koča J. National Centre for Biomolecular Research and CEITEC – Central European Institute for Technology, Masaryk University, Brno [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie Disfunctions in the mechanism of programmed cell death (apoptosis) are directly related to cancer, neurodegenerative and auto-immune diseases. Apoptosis is highly regulated by the interplay of BH3-only proteins [1,2]. How these proteins perform their function at the molecular level is not yet understood, which makes it very hard to develop medical treatment. We recently developed SiteBinder, an effective tool for comparing the 3D structure of multiple protein motifs [3]. Using this tool, we performed a brief structural comparison of the BH3 domain of several BH3-only proteins known to promote cell death. The preliminary results showed that there is a detectable structural trend which correlates with the type of mechanism of action (direct versus indirect) of these proteins. We present here our results of an extensive structural comparison analysis comprising all BH3-only proteins whose structure is known. Our investigations were ultimately meant to determine whether the measures of 3D structural similarity correlate with specificity of binding. The results of our analysis can be useful in studies focused on modulating apoptosis and related diseases. [1] Letai A, Bassik MC, Walensky LD, Sorcinelli MD, Weiler S, et al. (2002) Cancer Cell 2: 183-192 [2] Marsden VS, Strasser A (2003) Annu Rev Immunol 21: 71-105 [3] Sehnal D, Vařeková RS, Huber HJ, Geidl S, Ionescu CM, Wimmerová M, Koča J. (2012) J Chem Inf Model 52:343-59

P048 EVALUATION OF SUGAR ANNOTATIONS IN PDB Jaiswal D., Svobodová Vařeková R., Ionescu Maria C., Koča J. National Centre for Biomolecular Research, Fac of Science and CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic, 625 00, CZ [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie Sugars coat the cell surface, and cell-cell recognition by sugar specific interactions is important in phenomena such as infection by bacteria and viruses, communication among cells of lower eukaryotes, binding of sperm to egg, etc. [1]. Consequently, there is a lot of research in the field of carbohydrate structure and interactions, both experimental and theoretical. Studies which involve molecular modeling of sugars and sugar-specific receptors necessarily rely on structural information obtained by various experimental techniques like crystallography and nuclear magnetic resonance. These structures are available in the Protein Databank (PDB) [2], a structural repository maintained by the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). This structural database is widely used, and it is expected that the structure files are complete and correctly annotated. We attempted to find out precisely how many of the sugars whose structure was deposited in PDB are indeed complete and correctly annotated. For this purpose we collected all sugar structures which appear as ligands in PDB entries, and compared them to model structures determined by crystallography and available in Ligand Expo [3], a curated repository of ligand chemical and structural information. We report on our findings regarding the number of complete and correctly annotated sugar structures in PDB. [1] Cell-surface carbohydrates in cell recognition and response. Brandley BK, Schnaar RL. J Leukoc Biol. 1986 Jul;40(1):97-111 [2] http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do [3] Ligand Depot: a data warehouse for ligands bound to macromolecules. Feng Z, Chen L, Maddula H, Akcan O, Oughtred R, Berman HM, Westbrook J. Bioinformatics. 2004 Sep 1;20(13):2153-5

133

POS TE RY

P047 BH3-ONLY PROTEINS – FROM STRUCTURE TO FUNCTION

POS TE RY

P049 THE IMPACT OF OSCILLATING MIN SYSTEM ON ASYMMETRIC CELL DIVISION IN BACILLUS SUBTILIS Jamroškovič J., Pavlendová N., Muchová K., Wilkinson A. J., Barák I. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace The Min system plays an important role in ensuring cell division occurs at mid-cell in rod shaped bacteria which multiply by binary fission. In Escherichia coli Min system consists of three proteins, MinC, MinD and MinE and pole-to-pole oscillation of the Min proteins specifically inhibits polar septation. The Min system in Bacillus subtilis consists of four proteins, MinC, MinD, MinJ and DivIVA and also prevents polar division during vegetative growth but the Min proteins do not oscillate in this organism. We show that oscillation of the E. coli Min proteins can be reproduced following their introduction into B. subtilis cells. We show protein interactions among E. coli and B. subtilis Min proteins by bacterial two hybrid system what explains the effect of heterologous Min proteins on cell length during vegetative growth. Moreover, we present evidence that the oscillatory behaviour of the Min system in B. subtilis inhibits processes at the early stages of spore formation. Initiation of sporulation is not affected in signalling as an activation of the response regulator Spo0A occurs normally. Instead it appears that the cells are unable to overcome the inhibition of polar septation that is required for sporulation’s hallmark asymmetric septation. Acknowledgements: This work was supported by Grants VEGA 2/0016/10, by APVV-00335-10 and by the Wellcome Trust Project Grant 082829.

P050 NOVÉ BIS-TAKRÍNOVÉ DERIVÁTY AKO INHIBÍTORY TOPOIZOMERÁZY I Janočková J., Korabečný J., Hamuľaková S., Kuča K., Kožurková M. Katedra biochémie, Katedra organickej chémie, Ústav chemických vied, PF-UPJŠ , Košice; Katedra toxikológie, Centrum pokročilých štúdií, Fakulta vojenského zdravotníctva, Univerzita obrany, Hradec Králové; [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Topoizomerázy sú esenciálne enzýmy, ktoré regulujú konformačné zmeny v topológii DNA a zohrávajú dôležitú úlohu pri procesoch replikácie, transkripcie a rekombinácie. Vystupujú ako dôležitý cieľ pre chemoterapeutické liečivá, ktoré cielene inhibujú topoizomerázy a priamo s nimi interagujú, alebo vytvárajú s DNA prechodné ternárne komplexy, ktoré bránia religácii. Proces interkalácie sa často spája s topoizomerázovou inhibíciou. Bolo publikovaných niekoľko prác, ktoré popisujú nové DNA interkalátory, u ktorých sa planárna časť molekuly interkaluje medzi bázové páry DNA a bočné reťazce sa viažu do jej žliabkov [1,2]. Takrín a jeho deriváty sú charakterizované silnými interkalačnými schopnosťami [3]. Bisinterkalátory v porovnaní s monointerkalátormi sa vyznačujú vyššími DNA väzbovými konštantami a nižšou rýchlosťou disociácie. Naviazanie dvoch interkalačných chromofórov, môže spôsobiť zvýšenie väzbovej afinity a selektivity [4]. Práca je zameraná na analýzu väzbových interakcií ctDNA s novosyntetizovanými bis-takrínovými derivátmi (1-(x-(7-metoxy-1,2,3,4-tetrahydroakridín-9-yl-amino)alkyl)-3-(1,2,3,4-tetrahydroakridín-9-yl) tiomočoviny), ktoré boli syntetizované na Katedre organickej chémie, PF-UPJŠ. Použitím spektroskopických metód (UV-Vis, fluorescenčná spektroskopia, CD) bol stanovený ich spôsob interakcie s DNA. Väzbové konštanty komplexov bistakrínových derivátov s DNA boli vypočítané z UV-Vis titrácií. Metódou kruhového dichroizmu bolo dokázané, že študované bis-takrínové deriváty sa viažu do žliabku molekuly DNA. Schopnosť derivátov inhibovať topoizomerázu I bola sledovaná elektroforetickými metódami. Práca podporovaná grantami VVGS 40/12-13, VVGS-PF-2012-16. [1] Topcu Z., J Clin. Pharm. Ther. 2001, 26, 405-416. [2] Webb M.R., Ebeler E.S., Anal. Biochem. 2003, 321, 22-30. [3] Mansouri A. et al. Hepatology 2003, 38, 715-725. [4] Lorente A., Vázquez Y.G., Fernández M-J., Ferrández A., Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 4307-4312.

134

Janoš P., Kříž Z., Koča J., Paleček J. Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic; Institute of Experimental Bilogy, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie Human MAGE protein family consist of number of proteins containing conserved MAGE-homology domain. Based on their expression patter MAGE proteins are divided in to two classes. Type I proteins are expressed only in highly proliferating cells. Type II proteins are ubiquitously expressed in most tissue. Their functions are rather poorly understood, though it has been shown that type I proteins are involved in cancerogenesis and several type II proteins play roles in various cell processes[1]. All MAGE proteins are evolutionary related to NSE3 subunit of SMC56 complex. MAGE-G1 is the human ortholog of this subunit. This complex is presented in all eukaryotic organisms and is involved in chromatin responses to DNA damage. NSE4, another SMC5-6 subunit that binds to NSE3, is a member of EID protein family[2]. In our work we focused on study MAGE-C2/EID2 interaction. As there is no structure available for either of these proteins, they had to be modeled. The structure of MAGE-C2 protein was constructed by homology modeling using MODELLER via Chimera software. Crystal structures of MAGE-A4 (PDB entry 2WA0) and MAGE-G1 (PDB entry 3NW0) proteins were used as templates. MAGE-binding domain of EID2 protein was created using I-TASSER server. Different conformations of this peptide were obtained by simulated annealing procedure, these were then used for docking into MAGE-C2 structure. Five best scoring complexes were then subject to 10 ns long MD simulations in explicit solvent using AMBER software. Binding free energies were calculated by MM/PB(GB)SA approach. Alanine scanning analysis of chosen models was performed to identify residues important for the interaction and to check agreement of the models with biological data[3]. 1. Barker PA, Salehi A (2002) J Neurosci Res 67: 705– 712. 2. Hudson JJR, Bednarova K, Kozakova L, Liao C, Guerineau M, et al. (2011) PLOS One 6: e17270. 3. Guerineau M, Kriz Z, Kozakova L, Bednarova K, Janos P, et al. (2012) PLoS ONE 7(4): e35813.

P052 ISOLATION AND SUB-FRACTIONATION OF CRONOBACTER SAKAZAKII CELL MEMBRANE. Javůrková B., Junková P., Rauch P., Fukal L., Blažková M. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Members of the genus Cronobacter are gram-negative rods belonging to the family Enterobacteriaceae. These foodborne pathogens can cause severe illnesses with high mortality rate among neonates. Based on the recommendations of the World Health Organization issued in 2008 are all members of the genus Cronobacter considered to be pathogenic. Epidemiological studies, however, indicate that some species may not be for some populations pathogenic and can cause only asymptomatic colonization. Absolutely, the most frequently associated species with infection in neonates is Cronobacter sakazakii. Nowadays, studies which could elucidate virulence factors and contribute to the explanation of their pathogenicity are at the most interest. This study is focused on the isolation and moreover on sub-fractionation of cell membrane of highly pathogenic strain from Cronobacter sakazakii. The protocols for the sub-fractionation have been established and the distinct membrane fractions were confirmed via commercial antibodies raised against membrane marker proteins. The sub-fraction protein content was studied using mass spectrometry approaches and the immunogenic properties of isolated proteins were tested via polyclonal antibodies prepared against whole Cronobacter sakazakii cells. This work was supported by the Czech Grant Agency (project no. P503/12/P704) and Specific University Research (MSMT No.21/2012).

135

POS TE RY

P051 MODELING MAGE-C2 – EID2 PROTEIN INTERACTION

POS TE RY

P053 THE PROTECTIVE EFFECT OF PLANT POLYPHENOL EXTRACT ON 60CO g – RAYS INDUCED OXIDATIVE DNA DAMAGE IN HUMAN LYMPHOCYTES AND ANTIPROLIFERATIVE EFFECT ON HUMAN COLON CARCINOMA CELL LINE HT -29. Ježovičová M., Koňarikova K., Králik G., Žitňanová I., Muchová J., Ďuračková Z. 1Institute of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia, 2Radiotherapy department of St. Elisabeth Cancer Institut, Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie We studied the protective effect of the polyphenol extract against the formation of DNA strand breaks, induced by 60Co gamma-rays (2Gy). Treatment of lymphocytes cells before irradiation with increasing concentrations of plant polyphenol extract resulted in gradualy increase in DNA protective effect up to 17,6% at a concentration 25μg/ml of extract. The protective effect of plant polyphenol extract was influenced by the duration of incubation. The maximum effect was seen when incubation lasted 60 minutes after irradiation (2Gy) at a concentration 25μg/ml (24,3%), whereas the effect was smaller during 30 minutes incubation in concentration 50 μg/ml (22%). We also studied the cytotoxic effect of the polyphenol extract (0.00078-5 μg/ml) on the human colon cancer cells HT-29 after 72 h (one-time administration of the polyphenol extract) and 216 h (repeated administration of the polyphenol extract every day) of incubation and type of cell death induced by the polyphenol extract. HT-29 cells incubated with the polyphenol extract (0.00078-5μg/ml; one-time administration) for 72 h showed a cytotoxic effect after 24 h of incubation at its two highest concentrations (5; 0.025 μg/ml). The IC50 value of the polyphenol extract for HT-29 was <0.00078 μg/ml (72h) but cells acquired resistance to the polyphenol extract and we observed necrotic cell death. During 216 h incubation with the polyphenol extract (0.00078-5 μg/ml; repeated administration of the polyphenol extract every day) the polyphenol extract showed a cytotoxic effect on HT-29 after 144 h of incubation at the highest concentrations of the polyphenol extract (5; 0.025 μg/ml) and percentage of growth inhibition effect rise with time of incubation. The IC50 value of the polyphenol extract for HT-29 was 0.015 μg/ml (144 h) and we observed apoptotic cell death. Acknowledgement: This study was funded by the Ministry of Education VEGA 1/1133/11.

P054 PRODUKCIA ĽAHKÉHO REŤAZCA ĽUDSKEJ ENTEROKINÁZY V BUNKÁCH PICHIA PASTORIS Jiríčková K., Krahulec J., Levarski Z., Bocánová L., Dianovská D., S. Stuchlík S., Turňa J. Katedra molekularnej biológie PriF UK [email protected] Sekce: Biotechnologie Ľudská enterokináza predstavuje jednu z najčastejšie využívaných proteáz v procese proteolytického štiepenie fúzneho proteínu. Jej atraktívnosť spočíva vo vysokej miere špecificity pri rozoznávani konzervatívnej sekvencie (štyroch asparágových kyselín a jedného lyzínu) a taktiež schopnosti odštiepenia N-koncovej časti peptidu bez aminokyselinových zvyškov. Enterokináza ako serín proteáza sa v maturovanej forme vyskytuje vo forme heterodiméru zloženého z ľahkého a ťažkého reťazca prepojených disulfidickými väzbami. Ľahký reťazec predstavuje katalitickú podjednotku tohto enzýmu obsahuje doménu podobnú serínovej proteáze chymotrypsínu. V našej práci sme sa venovali expresie rekombinantného ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy v bunkách metylotrofnej kvasinky Pichia pastoris v baničkách aj vo fermentore. Pomocou tohto expresného systému je možné produkovať niekoľkonásobne viac enzýmu ako pomocou prokaryotického organizmu Escherichia coli. Aktivitu tejto rekombinantnej proteázy sme sledovali prostredníctvom enzymatickej reakcie, kedy dochádzalo k štiepenia antimikrobiálneho peptidu dermcidínu s rozoznavacím miestom pre ľahký reťazec ľudskej enterokinázy, kedy dochádzalo k odštiepeniu fúzneho partnera tioredoxínu. Našou hlavnou úlohou bolo tiež optimalizovať podmienky tejto štiepnej reakcie. Pre porovnanie aktivity ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy exprimovaného v bunkách Pichia pastoris sme použili komerčnú hovädziu enterokinázu EKMax (Invitrogen). Táto práca je výsledkom realizácie projektu: “Produkcia biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov(BIORECPROT, ITMS 26240220048)” na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

136

Karelová K., Harichová J., Remenár M., Ferianc P. Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislkava [email protected] Sekce: Biotechnologie Pôda pravdepodobne predstavuje obrovský potenciál informácií stále ukrytých v genómoch mikroorganizmov a nové metódy založené na analýze DNA umožňujú skúmať tento potenciál. Bakteriálne spoločenstvo v pôde znečistenej ťažkými kovmi bolo podrobené fylogenetickej analýze s použitím 16S rRNA (16S rDNA) a génov s rezistenciou voči ťažkým kovom. Porovnávanie štruktúr kultivovateľnej a nekultivovateľnej frakcie bakteriálneho spoločenstva v takto znečistenom prostredí ukázalo, že zástupcovia Actinobacteria predstavujú dominantnú skupinu baktérií a zástupcovia Proteobacteria reprezentujú len malú frakciu z celkovo žijúcich baktérií, hoci zástupcovia tejto skupiny, predovšetkým gama-Proteobacteria, dominujú v rámci kultivovateľnej frakcie bakteriálneho spoločenstva. Rozdiely v štruktúre medzi izolátmi a klonmi boli ešte viac zvýraznené rozdielmi v najpríbuznejších génoch 16S rRNA medzi týmito dvomi frakciami. Ani jeden izolát alebo klon nebol zatriedený k rovnakému taxónu v rámci tej istej taxonomickej skupiny. Rozdiely boli nájdené aj medzi najpríbuznejšími produktmi génov rezistencie voči ťažkým kovom izolátov a klonov. Produkty determinantov rezistencie tak izolátov ako aj klonov tvorili autonómne skupiny spoločného fylogenetického stromu. Medzi produktmi génov rezistencie izolátov a klonov nebola zistená žiadna signifikantná podobnosť, hoci dokonca pôvod produktov týchto génov, tak z izolátov ako aj z klonov, bol rovnaký, pochádzali z Gram-negatívnych baktérií. Získané výsledky poukazujú tak na relatívne vysokú úroveň bakteriálnej diverzity a variability medzi produktmi determinantov rezistencie nesenými Gram-negatívnymi baktériami ako aj na skutočnosť, že pôda znečistená ťažkými kovmi predstavuje veľmi významný rezervoár nových a doteraz neznámych tak baktérií ako aj génov rezistencie voči ťažkým kovom a ich produktov.

P056 IDENTIFICATION AND PREPARATION OF NOVEL LECTIN FROM A. BISPORUS Kavková E., Komárek J., Wimmerová M. Department of Biochemistry and National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University; CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University [email protected] Sekce: Glykobiochemie Lectins are proteins or glycoproteins which contain at least one non-catalytic domain that exhibits reversible binding to specific monosaccharides or oligosaccharides [1]. Lectins act as recognition determinants in diverse biological processes including adhesion of infectious agents to host cells, cell interactions in immune system, establishment of symbiosis between nitrogen-fixing bacteria and leguminous plants. Lectins have many useful properties. They are able to mediate targeted drug delivery and can be used in biotechnology. Some of them exhibit promising antiproliferative and/or antitumour effect which could be applied in medicine e.g. in cancer therapy [2]. Lectins have been found and characterized in different organisms. In contrast to lectins from plants or animals, fungal lectins are not so well explored and could possess unique structural or biochemical features. This study is focused on searching and characterization of novel lectins from fungi. The attention is paid to a potential lectin AB2L from Agaricus bisporus which was found through the affinity interactions with immobilized saccharides and identified by mass spectrometry. Because of presence of introns in the gene, total RNA was isolated from A. bisporus and cDNA of this protein was obtained using reverse transcription PCR and amplified. The gene was cloned into plasmid vector. E. coli cells were transformed with prepared construct and suitable expression conditions were found. The new lectin from A. bisporus will be characterized and its binding properties will be studied. [1] Lam, S. K., Ng, T. B. (2011). Lectins: Production and practical application. Appl Microbiol Biotechnol 89, 45-55. [2] Sharon, N. (2009). Lectins. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. DOI: 10.1002/9780470015902.a0000708.pub2. This work has been supported by the Czech Science Foundation (GA303/09/1168, GD/305/09/H008)

137

POS TE RY

P055 BAKTERIÁLNE SPOLOČENSTVO V PÔDE ZNEČISTENEJ ŤAŽKÝMI KOVMI Z POHĽADU NA KULTIVÁCII ZÁVISLÝCH A NEZÁVISLÝCH PRÍSTUPOV

POS TE RY

P057 OXIDAČNÝ STRES PRI CROHNOVEJ CHOROBE A MOŽNOSTI JEHO OVPLYVNENIA PRÍRODNÝMI POLYFENOLMI (PYCNOGENOL) Koláček M., Muchová J., Ďuračková Z., Dvořáková M., Paduchová Z., Čierna I., Szekyová D., Žitňanová I. a Kovács L. Ústav lekárskej chémie a biochémie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave; Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 2. pediatrická klinika Lekárskej fakulty a Detskej fakultnej nemocnice v Bratislave [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Úvod: V súčasnosti sa predpokladá, že jedným z faktorov prispievajúcim k patogenéze Crohnovej choroby je i oxidačný stres. Pycnogenol (Pyc) je štandardizovaný extrakt z kôry francúzskej prímorskej borovice Pinus pinaster. Je to zmes rôznych polyfenolov, najmä katechínov, epikatechínov, taxifolínov a prokyanidínov. Má antioxidačné aj biomodulačné účinky. Materiál a metódy: Do štúdie bolo zaradených 15 detských pacientov v remisii ochorenia, ktorým bol podávaný Pyc v dávke 2 mg/kg po dobu 10 týždňov. Krv a stolica sa im odoberali pred podaním Pyc, v 5. a 10. týždni podávania a 2 týždne po ukončení podávania Pyc. Do kontrolnej skupiny bolo zaradených 15 zdravých detí. V plazme sme stanovili základné biochemické parametre, markery oxidačného stresu a v stolici zápalový marker kalprotektín. Výsledky: Pacienti s Crohnovou chorobou mali oproti kontrolnej skupine signifikantne zvýšený CRP v plazme a kalprotektín v stolici a signifikantne zníženú aktivitu superoxiddismutázy. Podávanie Pyc po dobu 5 týždňov vyvolalo zníženie lipidových hydroperoxidov v plazme a 8-izoprostánov v moči. Podávanie Pyc po dobu 10 týždňov zvýšilo aktivitu superoxiddismutázy a glutatiónperoxidázy. Ďalšie parametre oxidačného stresu neboli ovplyvnené. Záver: Podávanie Pycnogenolu znížilo oxidačný stres ale neovplynilo sledované zápalové parametre. Poďakovanie: Štúdia bola realizovaná za finančnej podpory grantu Ministerstva zdravotníctva SR 2007/16-UK-01 a občianskeho združenia Rozum a zdravie. Pyc poskytla firma Horphag Res. Ltd., Geneva, Švajčiarsko.

P058 OVLIVNĚNÍ EXPRESE MIR-29 U CHRONICKÉ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Kollinerová S., Dostál Z., Divoká M., Jarošová M., Modrianský M. Ústav lékařské chemie a biochemie, LF UP v Olomouci; Hemato-onkologická klinika FN a LF UP v Olomouci [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Mikro RNA jsou krátké nekódující RNA, které ovlivňují expresi cílových proteinů na post-transkripční úrovni a mohou tak působit jako onkogeny nebo naopak antionkogeny. MiR-29 se v lidském genomu vyskytuje ve třech isoformách. Mezi cílové geny miR-29 patří myeloid cell leukemia 1 protein (Mcl-1), T cell lymphoma 1 protein (Tcl-1) a DNA methyl transferasy (DNMT). Změny exprese miR-29 jsou spojovány s chronickou lymfoidní leukémií (CLL) a akutní myeloidní leukémií (AML). Obnovení/navýšení exprese miR-29 je považováno za možnost alternativní terapie těchto onemocnění. Cílem studie bylo na základě kvantitativní real-time PCR určit hladinu exprese miR-29 u souboru 28 nemocných s chronickou myeloidní leukemií (CML) a zjistit, existuje-li souvislost s aktivitou Bcr-Abl kinasy. Expresi miR-29 isoforem jsme nejprve sledovali u pacientů CLL, kde jsme v porovnání s literárními daty nepozorovali signifikantní změny v expresi miR-29 bez ohledu na průběh onemocnění. Naopak u pacientů s CML jsme zaznamenali signifikantní pokles exprese všech tří isoforem miR-29. Stejně nízkou expresi miR-29 jsme detekovali u buněčné linie K562, která je považována za model CML díky přítomnosti tzv. chromosomu Philadelphia. Protože v dalších buněčných liniích jsme pozorovali pokles exprese miR-29 vlivem all-trans retinové kyseliny, vznikla hypotéza o možné korelaci mezi aktivitou tyrosinové kinasy Bcr-Abl a transkripční aktivitou retinoidního receptoru. Buněčná linie K562 však neexprimuje retinoidní receptor. Navíc u pacientů léčených imatinibem, což je inhibitor tyrosinové kinasy Bcr-Abl, jsme nepozorovali signifikantní navýšení nebo alespoň normalizaci exprese miR-29. Odpovědnou za snížení exprese je pravděpodobně signální dráha nezávislá na aktivitě Bcr-Abl či retinoidním receptoru. Identifikace signální dráhy nebo transkripčního faktoru odpovědného za snížení exprese miR-29 u CML může přinést důležité poznatky pro terapii tohoto onemocnění. (Podpořeno granty 303/09/H048 a LF_2012_010)

138

Kopál M., Ondrejovičová I., Muchová J., Ďuračková Z. Institute of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, Comenius University in Bratislava [email protected] Sekce: Glykobiochemie Diabetes mellitus is a metabolic disease characterised by the loss of glucose homeostasis and is connected to oxidative stress (OS). The detrimental effects of OS on these molecules can be moderated by intake of PUFAs, which are known to regulate metabolism of glucose and lipids by transcription of genes involved in lipid synthesis and by changes of membranes fluidity. The aim of our experiment was to compare the influence of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFA) on overall antioxidative state, activity of antioxidant enzymes: superoxiddismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), paraoxonase 1 (PON 1), selected biochemical parameters: (glucose) and oxidative and glycooxidative markers of lipids: lipohydroperoxides (LP) and proteins: advanced oxidation protein products (AOPP), protein carbonyls (CP), advanced glycooxidation end products (AGEs). Hyperglycemia is significantly decreased only after intake of n-3 PUFAs. The levels of LP, AOPP, AGEs and CP after intake n-3 PUFAs were lowered significantly whereas n-6 PUFAs increased these parameters. The activity of SOD was increased significantly only after intake of n-6 PUFAs. However, n-3 PUFAs increased significantly the activity of GPx. The activities of other antioxidant enzymes (PON1, CAT) were not significantly increased at both PUFAs. These results confirm the antioxidative and antihyperglycemic effect of n-3 PUFAs in diabetic rats contrary to n-6 PUFAs, which was also supported by decreased antioxidative state of plasma. Thanks to: This project has been supported by MŠ VEGA 1/1133/11 and by international project DIAPLANT N00039.

P060 TRANSFORMATION OF CHELERYTHRINE IN HUMAN HEPATOCYTE Kosina P., Vacek J., Papoušková B., Šimánek V., Ulrichová J. Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacký University, 775 15 Olomouc, Czech Republic; Regional Centre of Advanced Technologies and Materials, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Palacký University, 771 46 Olomouc [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Chelerythrine (CHE) is known to mediate a variety of biological responses by interaction of iminium bond with active sites of various target molecules in mammalian cells. However, there is still insufficient information on CHE biotransformation. In this study, human hepatocytes in suspension were incubated for 2 hrs with CHE, to predict in vivo metabolism in mammals. Reversed-phase liquid chromatography and electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry were used for identification and quantification of CHE metabolites. We optimized a method for targeted analysis of conjugated and non-conjugated metabolites of different polarity. We found primarily dihydrochelerythrine (DHCHE) and metabolites derived from phase I enzymes identified as demethylenation, demethylation and hydroxylation derivatives of CHE and DHCHE. Among metabolites derived from phase II enzymes, demethylenated, demethylated and hydroxylated glucuronides of CHE and DHCHE were predominant. The results complement our knowledge of the biotransformation of quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids and provide a base for further metabolic studies of these compounds. Acknowledgements: This work was supported by the Czech Science Foundation (grant P503/11/P312) and Operational Program Research and Development for Innovations – European Social Fund (project CZ.1.05/2.1.00/03.0058). The authors are indebted to the University Hospital Olomouc (Prof. Petr Bachleda) for the donation of liver samples.

139

POS TE RY

P059 THE COMPARISON OF EFFECT OF N-3 AND N-6 POLYUNSATURATED FATTY ACIDS AT THE LEVEL OF GLUCOSE AND SELECTED MARKERS OF OXIDATIVE AND GLYCOOXIDATIVE STRESS IN DIABETIC RATS

POS TE RY

P061 STUDIUM INHIBIČNÍ AKTIVITY PROLÉČIV 9-[2-(FOSFONOMETHOXY)ETHYL] ADENINU VŮČI ADENYLÁTCYKLASOVÉMU TOXINU BORDETELLA PERTUSSIS Kostinová A., Votruba I., Česnek M., Janeba Z., Günterová J., Mertlíková-Kaiserová H. Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd České republiky, v.v.i., Praha [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Bordetella pertussis je bakterie vyvolávající černý kašel. Navzdory plošnému očkování obyvatelstva se onemocnění stává celosvětovým problémem. B. pertussis produkuje adenylátcyklasový toxin (ACT), který funkčně poškozuje buňky imunitního systému a usnadňuje tak bakteriální invazi. Katalyzuje konverzi adenosintrifosfátu na cyklický adenosinmonofosfát a způsobuje nefyziologický nárůst jeho intracelulárních hladin. Cílem studie byla optimalizace metodiky stanovení adenylátcyklasové aktivity a identifikace látek inhibujících vliv ACT na buňky imunitního systému. Východiskem byl poznatek, že acyklický nukleosidfosfonát 9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]adenin (PMEA) inhibuje savčí adenylátcyklasu in vitro [1] a jeho bis(pivaloyloxymethyl)ester (bis(POM)PMEA) je účinným inhibitorem ACT izolovaného z Bacillus anthracis [2]. Byla proto navržena série nových proléčiv PMEA s cílem zvýšit inhibiční účinek proti ACT za současného potlačení cytotoxicity. Schopnost látek inhibovat ACT v makrofágové buněčné linii J774A.1 byla stanovena ELISA testem. Byl sledován také přímý cytotoxický vliv látek na danou kulturu. Dále byla porovnána biologická dostupnost látek permeačním testem přes monovrstvu epiteliálních buněk Caco-2 a stanoven vliv inhibitorů na apoptózu buněk a hladinu intracelulárního vápníku v přítomnosti ACT. Inhibiční účinnost proléčiv PMEA vůči ACT klesala v řadě: Fenyl(isopropyl fenylalaninyl)- > fenyl(isobutyl fenylalaninyl)- > bis(isobutyl fenylalaninyl)- > bis(isopropyl fenylalaninyl)- > bis(ethyl fenylalaninyl)- > bis(ethyl alaninyl)PMEA. Žádný z testovaných analogů sice nedosáhl inhibiční účinnosti bis(POM)PMEA, nicméně výhodou fenyl(isopropyl fenylalaninyl)PMEA proti bis(POM) PMEA je absence cytotoxického účinku při zachování dobré ACT inhibiční aktivity. [1] Shoshani, I.; et al. J. Biol. Chem. 1999, 274 (49), 34742–34744. [2] Shen, Y.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101 (9), 3242–3247. Tato práce byla hrazena z grantů MVČR VG20102015046 a RVO: 61388963.

P062 DEFEKT CYTOCHROM C OXIDASY A ZMĚNY V ORGANIZACI RESPIRAČNÍHO ŘETĚZCE JAKO NÁSLEDEK MUTACÍ V SURF1 GENU Kovářová N., Čížková-Vrbacká A., Pecina P., Stránecký V., Pronicka E., Kmoch S., Houštěk J. Fyziologický ústav AV ČR v.v.i., Oddělení bioenergetiky, Praha, Česká republika; Ústav dědičných metabolických poruch, 1. Lékařská fakulta, Karlova univerzita, Praha, Česká republika; Oddělení metabolických chorob, endokrinologie a diabetologie, „Children Memorial Health Institute", Varšava, Polsko. [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Častou příčinou vážných defektů cytochrom c oxidasy (COX) jsou mutace SURF1 genu vedoucí ke ztrátě Surf1 asemblačního proteinu COX. Klinicky se projevují jako fatální neurodegenerativní onemocnění – Leighův syndrom (LS). Surf1 protein se účastní v první fázi COX asemblace, jeho přesná role však není známá. V naší studii poruch asemblace COX v důsledku SURF1 mutací jsme se zaměřili na možné kompenzační změny v obsahu ostatních komplexů oxidační fosforylace a na rozdíly ve formování respiračních superkomplexů (SC) při sníženém obsahu COX, která je jednou z hlavních komponent SC. Studovali jsme buněčné linie fibroblastů od 9 pacientů s mutacemi SURF1 genu a pro analýzu proteinů solubilizovaných z vnitřní mitochondriální membrány neiontovými detergenty (digitonin, n-Dodecyl beta-D-maltosid) jsme využili nativní elektroforetické metody v kombinaci s denaturační SDS elektroforézou a western blot detekcí [1]. Snížená hladina COX (30%) byla v mitochondriích pacientů doprovázena upregulací komplexů I, III a V (130%-150%) a akumulací Cox5a podjednotky. Plně asemblovaná, funkční COX byla přítomna převážně v I-III2-IV SC, zatímco u kontrol bylo množství COX v SC srovnatelné s volným COX monomerem. Nedostatek COX u pacientů byl spojen s akumulací základní formy I-III2 superkomplexu, dimeru komplexu III, COX asemblačních intermediátů a volných COX podjednotek, převážně Cox5a. Pomocí 2D elektroforetické analýzy jsme přesně identifikovali COX asemblační intermediáty o velikosti 80-130 kDa. Kromě již dříve popsaného S2 intermediátu dochází v mitochondriích pacientů k akumulaci dalšího, doposud nepopsaného, intermediátu s dominantním obsahem Cox1 podjednotek. Může se jednat o dimer Cox1, nebo komplex Cox1 s dalším neznámým proteinem, který nevstupuje do větších struktur s komplexem I nebo III. 1. N. Kovářová, et al., Adaptation of respiratory chain biogenesis to cytochrome c oxidase deficiency caused by SURF1gene mutations, Biochim. Biophys. Acta (2012)

140

Krajňáková L., Kováčová K., Wagnerová A., Paulíková H., Imrich J., Drajna L. Oddelenie biochémie a mikrobiológie, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, FCHPT STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava; Katedra organickej chémie UPJŠ, Šrobárova 2, 041 54 Košice [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Acetylcholínesterázové inhibítory (AChE-I) sú využívané ako liečivá pri Alzheimerovej chorobe (AD). Náš výskum sa zameriava na štúdium bioaktivít novosyntetizovaných derivátov takrínu s rôznymi sacharidovými zložkami (NDT) a sekundárnych metabolitov vláknitých húb. Od nových AChEI sa očakáva, že zlepšia cholinergnú transmisiu a súčasne budú mať neuroprotektívne vlastnosti. Kinetické merania inhibície AChE potvrdili, že 16 NDT má inhibičný potenciál podobný takrínu. Inhibičné konštanty sú v rozmedzí 0,99 – 0,31 μM. Podobne ako takrín, NDT spôsobujú zmiešaný typ inhibície. Zistili sme, že schopnosť emodínu (Emo) a jeho derivátu (Emo-C) inhibovať AChE je nízka, IC50= 70 μM. Podmienkou pre aplikácie nových AChEI je ich nízka toxicita. Skríning cytotoxicity NDT pre ľudské neuroblastómové bunky SH-SY5Y a SK-N-SH ukázal, že len 4-(2,3,4,6-tetra-tetra-O-acetyl-β-manopyranozyl)-1-(1,2,3,4-tetrahydroakridín9-yl) tiosemikarbazid (LD2) je necytotoxický, dokonca 5 μM LD2 zvýšil viabilitu buniek (cca o 20%). Miernu toxicitu malo ešte päť NDT, ktoré znížili viabilitu SH-SY5Y buniek maximálne o 20 % (25 μM NDT). Cytotoxicita Emo a jeho derivátu (50 μM) bola nízka (15% pokles viability). Hodnoty toxicity testovaných derivátov pre SK-N-SH bunky boli cca o 20% vyššie. Niektoré AChE-I používané pri liečbe AD majú neuroprotektívne účinky, redukujú smrť neuronálnych buniek indukovanú napr., oxidačným stresom. Podobne pôsobil LD2, eliminoval oxidačný stres a potlačil apoptózu SH-SY5Y buniek indukovanú 1,5 mM H2O2. Emodín takéto schopnosti nemal. Podporené projektom APVV-0282-10

P064 VPLY HYPERTENZIE NA OXIDAČNÝ STRES U JEDINCOV VYSTAVENÝCH SOCIÁLNEMU STRESU Kralovičová Z., Laubertová L., Ondrejovičová I., Muchová J., Ďuračková Z., Bernátová I., Andrezálová L., Žitňanová I.Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, Lekárska fakulta UK; Ústav normálnej a patologickej fyziológie SAV [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Predpokladá sa, že oxidačný stres zohráva úlohu v patogenéze a komplikáciách hypertenzie. Cieľom nášho projektu bolo sledovať vplyv hypertenzie na oxidačný stres u normotenzných (WKY), hypertenziou dedične zaťažených (sBHR) a chronicky hypertenzných (SHR) potkanov vystavených sociálnemu stresu. Modelom sociálneho stresu pôsobiaceho na mladé potkany bol crowding stres – potkany boli chované v prehustených klietkach. WKY, sBHR a SHR boli rozdelené do dvoch skupín: kontrola a stresové. Stresové potkany boli od 35. dňa veku po dobu 2 týždňov vystavené sociálnemu stresu. Nestresové kontroly sBHR a SHR mali signifikantne zvýšené hladiny lipoperoxidov v plazme oproti WKY. Stresové potkany mali signifikantne zvýšené lipoperoxidy len u SHR skupiny oproti WKY. U kontrol antioxidačná kapacita plazmy bola najvyššia u normotenzných WKY. V skupine stresových potkanov antioxidačná kapacita klesla len u sBHR. Naše výsledky naznačujú, že hypertenzia zvyšuje oxidačný stres u kontrol, pričom u stresových potkanov sme potvrdili zvýšený oxidačný stres len v skupine spontánne hypertenzných.

141

POS TE RY

P063 NOVOSYNTETIZOVANÉ ACETYLCHOLÍNESTERÁZOVÉ INHIBÍTORY A ICH CYTOPROTEKTÍVNY EFEKT NA NEUROBLASTÓMOVÉ BUNKY

POS TE RY

P065 DOPAD IZOLOVANÉHO DEFICITU F1FO-ATPSYNTÁZY NA KOMPLEXY SYSTÉMU OXPHOS A MITOCHONDRIÁLNÍ ULTRASTRUKTURU Kratochvílová H., Tesařová M., Honzík T., Hájková Z., Sládková J., Hůlková H., Elleder M., Hansíková H., Zeman J. Laboratoř pro studium mitochondriálních poruch, Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzita Karlova v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Úvod: TMEM70 je specifický asemblační faktor lidské mitochondriální F1Fo-ATPsyntázy (komplex V). Homozygotní mutace c.317-2A>G v genu TMEM70 byla nalezena u skupiny pacientů s těžkou mitochondriální encefalokardiomyopatií a izolovaným deficitem ATPsyntázy (ATP-hydrolytická i ATP-syntetická aktivita <30%). Do dnešní dne byly identifikovány i další patogenní mutace v genu TMEM70. Cíl: Cílem studie bylo analyzovat dopad izolovaného deficitu F1FO-ATPsyntázy na množství a aktivitu komplexů systému OXPHOS a mitochondriální ultrastrukturu v kultivovaných fibroblastech a bioptických/autoptických tkáních. Výsledky: Spektrofotometrické měření enzymových aktivit komplexů systému OXPHOS v izolovaných mitochondriích z kultivovaných fibroblastů ukázalo výrazné navýšení aktivit komplexů II, III a IV. Ve fibroblastech, srdeční a svalové tkáni bylo pozorováno navýšení množství vybraných podjednotek komplexů II a IV. Srovnání nativního množství komplexů OXPHOS v izolovaných mitochondriích ze srdeční a svalové tkáně prokázala mírné navýšení množství komplexu IV. Zvýšenou aktivitu komplexu II a IV potvrdila i histochemická analýza ve vzorcích srdeční tkáně. Fibroblasty obsahovaly heterogenní směs abnormálních mitochondrií s velmi nízkým počtem krist. V srdeční tkáni i ve fibroblastech byly pozorovány ojediněle i případy mitochondrií s kristami orientovanými do soustředných kruhů („onion-like“). Závěr: Izolovaný deficit F1Fo-ATPsyntázy způsobený mutací v genu TMEM70 má za následek vznik kompenzačního efektu, který je nejvíce patrný v kultivovaných fibroblastech. Mitochondriální ultrastruktura ve fibroblastech a srdeční tkáni nevykazuje žádné specifické znaky charakteristické pro izolovaný deficit F1Fo-ATPsyntázy. Tato práce vznikla za podpory grantů GA UK 37710, SVV 264502, IGA MZ ČR NT13114-4 a PRVOUK P24/LF1/3.

P066 BINDING OF MYELOPEROXIDASE TO EXTRACELLULAR MATRIX Kubala L., Kolářová H., Gajdová S., Víteček J., Klinke A., Lau D., Baldus S., Eiserich J.P. Inst. of Biophysics, AS CR; ICRC – CBCE, St. Anne‘s University Hosp. Brno; Dep. of Biochemistry and Dep. of Animal Physiology, Faculty of Sci., MU; Dep. of Cardiology, University Hosp. Eppendorf, Hamburg, Germany; Dep. of Internal Medicine, UC Davis, USA [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Myeloperoxidase (MPO) is an abundant hemoprotein expressed by polymorphonuclear neutrophils that plays an important role in acute and chronic vascular diseases. Upon degranulation from systemic neutrophils during inflammation, MPO binds to endothelial cells and undergoes transcytosis from the vascular lumen to the underlying extracellular matrix glycosaminoglycans and proteins. However, the molecular mechanisms governing the binding of MPO to extracellular matrix and whether this modulates its enzymatic functions remains unknown. In this study interaction of MPO with isolate extracellular matrix and purified glycosaminoglycans and proteins in vitro and subendothelial extracellular matrix ex vivo was determined based on combination of ELISA, determination of MPO enzymatic activity, and immunohistochemistry. Results revealed that MPO binds to the extracellular matrix proteins fibronectin and collagen, and its association with these proteins is enhanced by pre-incubation of extracellular matrix proteins with glycosaminoglycans. However, excess of glycosaminoglycans inhibits binding of MPO to extracellular matrix proteins. These observations were confirmed with extracellular matrix proteins derived from cultured aortic smooth muscle cells, fibroblasts and aortic endothelial cells. The oxidizing and chlorinating potential of MPO, but not its nitric oxide oxidase activity, is preserved upon binding extracellular matrix proteins. It can be conclude that MPO binds to extracellular matrix proteins in a glycosaminoglycan-dependent manner, and the chlorinating and oxidizing activity of MPO is preserved upon association with these proteins.

142

Kubienová L., Wünschová A., Piterková J., Jahnová J., Luhová L., Navrátil M., Mieslerová B., Barroso J.B., Petřivalský M. Departments of Biochemistry, Botany and Cell Biology and Genetics, Faculty of Science, Palacký University in Olomouc; Grupo de Seňalización Molecular y Sistemas Antioxidantes en Plantas, Universidad de Jaén, Spain [email protected] Sekce: Rostlinná biochemie Nitric oxide (NO) is an important signalling molecule in physiological processes in plants and defence response to pathogen infection. However, little is known on the sources and metabolism of NO and reactive nitrogen species (RNS) in plants under biotic stress. Our previous results confirmed the key role of NO in the pathogen penetration into the plant cells and the initiation of hypersensitive response, using model pathosystem of three Solanum spp. genotypes which show different levels of resistance to tomato powdery mildew. In this study, parameters of the RNS metabolism were studied in control and infected tomato plants by the mildew causative agent, fungus Oidium neolycopersici. NO content, cellular level and localization of peroxynitrite, protein tyrosine nitration, activities of L-arginine-dependent NO synthase and S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) and activity and expression of nitrate reductase (NR) were analysed. Expression profile of NR in response to biotic stress in tomato leaves was determined by qPCR and immunoblot analysis. We demonstrated pathogen infection markedly increased NR accumulation and gene expression in S. habrochaites and decreased in tomatoes susceptible to pathogen infection (S. lycopersicum cv. Amateur). The results showed a down-regulation of the GSNOR activity in infected tomato plants. The cellular localization of peroxynitrite was analysed in plant cross-sections by confocal laser microscopy. Our results show peroxinitrite, which mediate protein-tyrosine nitration, is present mainly in vascular tissue of S. habrochaites. This tomato species has the highly resistant response to biotic stress caused by O. neolycopersici. All these data indicate protein nitration could be used as an indicator of nitrosative stress in plants under biotic stress conditions. This work was supported by grants LH11013 from Ministry of Education, Youth and Sports of Czech Republic and IGA 2012_012 of Palacký University in Olomouc.

P068 REACTION MODELLING OF ANAEROBIC ELEMENTAL SULFUR OXIDATION IN BIOMINING BACTERIA Kučera J., Zeman J., Mandl M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno; Department of Geological Sciences, Faculty of Science, Masaryk University, Brno [email protected] Sekce: Biotechnologie The conventional stoichiometry of the anaerobic oxidation of elemental sulfur by ferric iron in sulfur-oxidizing bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans was not in agreement with our experimental data in terms of ferrous iron and proton formation. Reaction modelling under the actual conditions of bacterial activity resulted in a different stoichiometry, where additional iron species participate in the process to affect the number of released protons. The suggested reaction equation may more accurately predict the intensity of acidification in biomining processes under anaerobic conditions.

143

POS TE RY

P067 INVOLVEMENT OF REACTIVE NITROGEN SPECIES IN THE DEFENCE MECHANISMS OF SOLANUM SPP. TO BIOTROFIC PATHOGEN OIDIUM NEOLYCOPERSICI

POS TE RY

P069 COMPUTATIONAL STUDY OF ION TRANSFER IN G4-WIRES Kulhánek P., Střelcová Z., Koča J. CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie G4-wires are guanine quadruple helices of various lengths studied both experimentally and theoretically. In this work, we present results of molecular dynamics simulation of infinitively long G4-wires. The infinitive length is achieved by a periodic boundary condition applied on 12-steps long G4-fragment, which is covalently bound to its neighboring images. This setup enables us to disable possible penetration of interior channel by water or cations from bulk solution. Under these well defined conditions, the transfers of cations in various scenarios through the channel were studied by the means of potential of mean force calculations using the Adaptive Biasing Force method. Obtained results indicate that the ion transfer is not favorable if the channel is fully occupied by ions. Lower energy barrier was found for the situation, in which the occupied channel contains a single ion gap. The gap transfer barrier is even lower than the transfer of single ion in otherwise empty channel. The impact of G4-wire surrounding counter ions on the transfer will be presented too. Acknowledgments. This work was realized in CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 financed from European Regional Development Fund (P.K., J.K.). The work has been supported by the Grant Agency of Czech Republic (GD301/09/ H0040) (Z.S.). The access to the MetaCentrum computing facilities provided under the program „Projects of Large Infrastructure for Research, Development, and Innovations“ LM2010005 funded by the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic is acknowledged.

P070 STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDIES OF LECTIN RS20L FROM PHYTOPATHOGEN RALSTONIA SOLANACEARUM Kysel P., Kostlanova N., Sulak O., Wimmerova M. National Centre for Biomolecular Research, Masaryk University, Kotlářská 2, 611-37 Brno, CZ; Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, CZ; Molecular Glycobiology, CERMAVCNRS, BP53, 38041 Grenoble Cedex 9, France; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 611-37 Brno, CZ [email protected] Sekce: Glykobiochemie R. solanacearum is a Gram-negative β-protobacterium, inhabiting water and soil and causing wilt in more than 200 plants. Plant pathogens use protein-carbohydrate interactions in their strategy for host recognition, attachment, and invasion. Lectins are non-enzymatic carbohydrate binding proteins of non-immunoglobulin nature.(1) Lectin RS20L (Ralstonia solanacearum 20 kDa lectin) was found in the cell lysate of R. solanacerarum. RS20L has no sequence similarity to any known lectin amino acid sequence. 3D structure solved from crystals of native RS20L is structurally similar to animal galectins, but it does not display sugar specifity to D-galactose.(1) Analytical ultracentrifugation confirmed the predominantly trimeric form in solution. Beside the expected 20 kDa band, a higher molecular weight form of this protein appears on the SDS-PAGE coresponding to trimer. The mechanism for this very stable trimerization is currently unknown. Mass spectrometry experiments were initiated to elucidate eventual covalent bonds between the subunits of the trimer. The studies of sugar-RS20L interactions make it advisible to purify RS20L without eluting step with a free sugar in solution. Therefore alternative scheme for purification of RS20L was suggested. Maltose binding protein (MBP) has proven to be a fusion protein usefull for affinity purification and increasing solubility of difficult expression targets. Widely applied N-terminal His-tag allows additional purification step. Tabacco etch virus (TEV) protease is an enzyme with stringent specificity for specific cleavage site.(2) Expression of N-terminal His-tag, MBP, TEV cleavage site and RS20L in one polypeptide chain led to successfull purification of RS20L. Literature: (1) Šulák O., Kostlánová N., Adam J., Mitchell E., Imberty A., Wimmerová M.: In 14th European Carbohydrate Symposium, EUROCARB 14, 147-296 (2007). (2) Nallamsetty S. and Waugh D.S.: Nature protocols, 2, 383-391 (2007).

144

Lajdová I., Kaderjáková Z., Chorvát D. Jr., Okša A., Spustová V. Slovenská zdravotnícka univerzita, Lekárska fakulta; Univerzita Komenského, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky; Medzinárodné laserové centrum; Bratislava, Slovenská Republika [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace P2X7 receptory sú bifunkčné receptory, ktoré po aktivácii otvárajú katiónový kanál a následne neselektívny cytolytický pór. Po aktivácii P2X7 receptora dochádza k depolarizácii bunkovej membrány, vtoku katiónov (Na+, Ca2+) do bunky a K+ do extracelulárneho priestoru, zvyšuje sa koncentrácia voľného cytosolového vápnika ([Ca2+]i), čím spúšťa intracelulárnu signalizačnú kaskádu. Chronické ochorenie obličiek (CKD) je stav bunkovej vápnikovej toxicity, kedy [Ca2+]i aj intracelulárne rezervy sú zvýšené. Cieľom štúdie bolo zistiť účasť P2X7 receptorov na vstupe Ca2+ do bunky u pacientov v skorých štádiách CKD, sledovať zmeny funkčnosti a expresie P2X7 receptorov pri tomto ochorení. Do štúdie bolo zaradených 20 zdravých dobrovoľníkov a 20 pacientov s CKD stupeň 2-3. Na stanovenie funkčnosti P2X7 receptorov bol použitý agonista (BzATP) a antagonista (KN-62) P2X7 receptorov. Funkčnosť katiónového kanála bola stanovená meraním zmien [Ca2+]i fluorescenčnou spektroskopiou s použitím fluorescenčného indikátora Fluo-3 AM. Meraním fluorescencie etídia bromidu konfokálnou mikroskopiou bola sledovaná funkčnosť P2X7 póru. Expresia P2X7 receptorov bola kvantifikovaná prietokovou cytometriou použitím značenej protilátky anti-P2X7(extracellular). Na vizualizáciu expresie membránových receptorov bola použitá konfokálna mikrokopia. Funkčnosť P2X7 katiónových kanálov ako aj ich pórov bola v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi zmenená. Priepustnosť plazmatickej membrány prostredníctvom pórov P2X7 receptorov bola signifikantne zvýšená. V pokojovom stave boli tieto receptory v PBMCs CKD pacientov čiastočne otvorené. Expresia membránových P2X7 receptorov bola u CKD pacientov 1,3-násobne zvýšená. Prezentované výsledky demonštrujú: 1) zvýšený vstup Ca2+ prostredníctvom P2X7 receptorov, 2) zmenenú funkčnosť „pore-forming“ P2X7 receptorov, 3) zvýšenú expresiu P2X7 receptorov plazmatickej membrány u CKD pacientov. Podporené grantom: VG SZU 19-90-07, „NanoNet 2“ (ITMS 26240120018)

P072 VPLYV PRÍRODNÝCH OLEJOV NA GLYKOOXIDAČNÝ STRES ĽUDSKÝCH MONOCYTOV INKUBOVANÝCH V HYPERGLYKEMICKÝCH PODMIENKACH Laubertová L., Koňariková K., Gbelcová H., Ďuračková Z., Žitňanová I. Ústav lekárskej biochémie, JLF UK, Martin; Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, LF UK, Bratislava; Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky, LF UK, Bratislava; Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, LF UK, Bratislava; Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, LF UK, Bratislava [email protected] Sekce: Glykobiochemie Oxidačný stres je považovaný za hlavný rizikový faktor pri vzniku a progresii diabetes mellitus, ako aj následného rozvoja diabetických komplikácií, kardiovaskulárnych ochorení a cievnych zápalov. Dôsledkom oxidačného stresu nie je len tvorba voľných kyslíkatých radikálov, ale tiež neenzýmová glykácia proteínov, autooxidácia glukózy, poruchy metabolizmu glutatiónu, zmeny v antioxidačnom statuse, peroxidácia lipidov a zníženie hladiny kyseliny askorbovej. Mnohé štúdie sledovali vzájomné vzťahy medzi potravou bohatou na polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA), membránovými lipidmi a inzulínovou rezistenciou. Konzumáciou ω-3 a ω-6 polynenasýtených mastných kyselín sa podarilo zabrániť rozvoju inzulínovej rezistencie u testovaných zvierat. Cieľom našej práce bolo sledovať vplyv prírodných olejov (olej z vlašských orechov a rybí olej) na proliferáciu bunkovej línie ľudských monocytov a oxidačné poškodenie biomakromolekúl spôsobené glykooxidačným stresom vplyvom vysokej hladiny glukózy. Sledované oleje sú bohaté zdroje antioxidačných látok, ω-3 a ω-6 polynenasýtených mastných kyselín (PUFA). V rámci primárneho skríningu sme metódou priameho počítania buniek sledovali vplyv prírodných olejov na proliferáciu buniek. Antioxidačnú kapacitu bunkovej línie sme stanovili metódou TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity). Oxidačné poškodenie DNA ľudských monocytov v podmienkach in vitro sme sledovali pomocou kométovej metódy. Vybrané prírodne oleje neprejavili výrazný vplyv na proliferáciu ani oxidačné poškodenie DNA ľudských monocytov v normálnom a hyperglykemickom prostredí. Na druhej strane, prírodné oleje zvyšovali antioxidačnú kapacitu buniek počas 72h kultivácie buniek. Poďakovanie: Táto práca bola financovaná z prostriedkov projektu Diaplant N00039 z programu cezhraničnej spolupráce AT-SK.

145

POS TE RY

P071 FUNKČNOSŤ A EXPRESIA P2X7 RECEPTOROV V PERIFÉRNYCH MONONUKLEÁRNYCH BUNKÁCH PACIENTOV S CHRONICKÝM OCHORENÍM OBLIČIEK

POS TE RY

P073 ROSIGLITAZONE-MEDIATED ENHANCEMENT OF LA-12-INDUCED COLON CANCER CELL APOPTOSIS WAS ASSOCIATED WITH STIMULATION OF MITOCHONDRIAL PATHWAY Lauková J., Jelinková I., Straková N., Hofmanová J., Sova P., Kozubík A., Hyršlová Vaculová A. Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Brno, Czech Republic; Platinum Pharmaceuticals, a.s., Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace One of the strategies for colon cancer treatment is the application of platinum-based chemotherapeutic drugs. Previously we showed that a platinum (IV) complex LA-12 exerts higher cytotoxic/cytostatic effects in colon cancer cell lines compared to cisplatin or oxaliplatin. In order to boost its anticancer effectiveness, we used LA-12 in combination with sensitizers affecting the signalling pathways involved in regulation of cytokinetics. Rosiglitazone is a synthetic ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma), a nuclear hormone receptor highly expressed in colon cancer cells. This ligand could suppress proliferation and metastasis, and stimulate death of colon cancer cells. We showed that pretreatment with subtoxic doses of rosiglitazone resulted in enhancement of LA-12-induced apoptosis in HCT116 human colon adenocarcinoma cells, as demonstrated by significant increase in effector caspase activity, and their substrate cleavage. Potentiation of apoptosis following combined treatment with rosiglitazone and LA-12 was associated with drop of mitochondrial membrane potential, and stimulation of mitochondrial pathway. We explored the molecular mechanisms involved in cooperative effects of the two drugs, focused on involvement of Bcl-2 family proteins, important regulators at the level of mitochondria, and reactive oxygen species. These results will be presented in our contribution. This work was supported by the IGA of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT 11201-5/2010).

P074 UTILIZING OF GENETICALLY MODIFIED MOUSE MODELS HELPS TO IDENTIFY ENZYMES METABOLIZING CARCINOGENIC ARISTOLOCHIC ACID I Levová K., Bárta F., Frei E., Schmeiser H.H., Arlt V.M., Phillips D.H., Nebert D.W., Shi Z., Stiborová M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Prague; Department of Environmental Health, University of Cincinnati Medical Center, USA; Cancer Research UK Molecular Pharmacology Unit, Biomedical Research Institute, Dundee, UK [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Aristolochic acids (AA) are the major alkaloid of Aristolochia species and causes the development of Aristolochic acid nephropathy (AAN). It is a unique type of rapidly progressive renal fibrosis which leads to a total renal failure. AAI also causes a similar type of kidney fibrosis with malignant transformation of the urothelium, Balkan endemic nephropathy (BEN). One of the common features of AAN and BEN is that not all individuals exposed to AA suffer from nephropathy and tumor development. One possible explanation for these different responses could be individual differences in the activities of the enzymes catalyzing the biotransformation of AAI. Thus, the identification of enzymes principally involved in the metabolism of AAI, and detailed knowledge of their catalytic specificities is of a major importace. Aristolochic acid I is oxidized by demethylation to form AAIa. This metabolic pathway is known as detoxication. The most important enzymes involved in these reactions are cytochromes P450 1A1 and 1A2. AAI can also be activated by cytochromes P450, leading to formation of AAI-DNA adducts. Therefore, the present studies has been designed to evaluate the the cytochrome P450 (CYP)-mediated metabolism of AAI using several mouse models. The first model has deleted gene for NADPH:cytochrome P450 reductase in the liver (HRN), which is essential for the function of cytochromes P450. In another study, we observed oxidative activation and detoxication by CYP1A1 and 1A2 in these mouse models: Cyp1a1(-/-), Cyp1a2(-/-) and Cyp1a1/1a2(-/-). To study the metabolism of AAI by human cytochromes P450 1A1 and 1A2, were also used two lines of humanized mice carrying functional human form of CYP1A1 and CYP1A2 genes instead of mouse orthologs Cyp1a1/1a2. Our results demonstrate the role of human CYP1A1 and 1A2 in the oxidative detoxication of AAI in the human organism. Supported by GACR (grants 303/09/0472, 305/09/H008) and Charles University in Prague (grant UNCE 42).

146

Lišková P., Fišer R., Bumba L., Konopásek I. Department of Genetics and Microbiology, Faculty of Science, Charles University in Prague; Laboratory of Molecular Biology of Bacterial Pathogens, Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul SPM (self-processing module) is 177 amino acids long segment of FrpC protein (ferrum-regulated protein) produced by Neisseria meningitidis. FrpC possesses a unique calcium-dependent autocatalytic cleavage activity (Osička, et al., 2004) localized in its SPM module. While the enzymatic activity of SPM has been already characterized, the structure and the biological role of FrpC protein is still a mystery. We employed NMR and circular dichroism to solve the tertiary structure of the SPM functional catalytic unit. However, this approach resulted only in partial characterization of SPM. Using NMR, the existence of an unstructured loop together with a close interaction between individual amino acids and the bounded Eu3+, a Ca2+ analogue, was proved. CD spectroscopy did not reveal any clearly described secondary structures in calcium-bound folded SPM state due to predominating exciton coupling peak (Ohmae, et al., 2001) caused by the two perpendicularly oriented unique tryptophan residues W451 and W519 shared their pi electrons. To prove this very rare structural phenomenon, we prepared both single Trp mutants of SPM (W451F, W519F) and we used them together with the wild-type SPM for structural studies of SPM in frozen solution by employing lifetime- and timeresolved fluorescence anisotropy measurements of SPM tryptophans.

P076 HODNOCENÍ CYTOTOXICITY BENZONITRILOVÝCH HERBICIDŮ PRO ADHERENTNÍ SAVČÍ BUŇKY SYSTÉMEM RTCA ANALYZER Lovecká P., Thimová M., Grznárová P., Macková M., Demnerová K. Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Systém RTCA DP Analyzer (Real-Time Cell Analyzer) umožňuje sledování celé řady buněčných procesů včetně cytotoxicity, proliferace a viability savčích buněk v reálném čase a bez nutnosti předchozího značení buněk či testovaných látek. Jedná se o neinvazivní metodu určenou pro adherentně rostoucí buňky a založenou na detekci míry adherence těchto buněk k povrchu. Adherentně rostoucí buňky se v případě smrti nebo ve stresových podmínkách (např. vystavení toxickému působení) uvolňují z podkladu, což se projeví jako změna impedance. Cytotoxické účinky benzonitrilových herbicidů a jejich mikrobiálních metabolitů byly studovány na dvou liniích lidských tkáňových kultur HepG2 a HEK 293T. Měření na tkáňových kulturách ukázala herbicidy bromoxynil, chloroxynil a ioxynil jako výrazně cytotoxické. Zbylé testované látky (dichlobenil a mikrobiální metabolity) vykazovaly mírnou inhibici růstu buněk. Mikroskopicky byly pozorovány změny v morfologii buněk vlivem přítomnosti testovaných látek. Míra cytotoxicity a buněčné lyse byla stanovena LDH testem. MTT testem byl sledován pokles viability a proliferace buněk způsobený sledovanými látkami. Tato práce je finančně podporována granty MSM 6046137305 a ME 09024

147

POS TE RY

P075 THE EXCITON COUPLING INTERACTION BETWEEN TWO TRYPTOPHANS IN SELF-PROCESSING MODULE STUDIED BY FLUORESCENCE TECHNIQUES

POS TE RY

P077 CHARACTERIZATION OF A NEW HUMAN MEMBRANE-BOUND DEHYDROGENASE/REDUCTASE (SDR FAMILY) MEMBER 3 (DHRS3) Lundová T., Štambergová H., Škarydová L., Wsól V., Opperman U., Dunfort J.E. Department of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy, Charles University; Structural Genomics Consortium, Botnar Research Centre, University of Oxford, United Kingdom [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Carbonyl reducing enzymes belong to two superfamilies Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) and Aldo-keto reductases (AKR). These enzymes are involved in the biotransformation of xenobiotics and eobiotics and play a role in some diseases such as cancer, diabetes mellitus or metabolic syndrome. Members of the SDR superfamily are found in the cytoplasm, mitochondria, peroxisomes and endoplasmic reticulum whereas AKR enzymes are found only in cytosol. Generally knowledge of membrane-bound enzymes is quite poor due to difficulties linked with their handling. Recently, a few microsomal SDRs have been characterized but only one microsomal SDR, 11b-HSD1, has been described in biotransformation of xenobiotics so far. The aim of this study is characterization of dehydrogenase/reductase (SDR family) member 3 (DHRS3), also known as retinal short-chain dehydrogenase/reductase retSDR1 which was identified as an all-trans-retinal dehydrogenase in cone photoreceptors. Tissue distribution has been studied at the level of mRNA. A transcript has been found in placenta, liver, lung, kidney and retina. All-trans-retinal has been described as only one substrate so far. DHRS3 is localized in the membrane of endoplasmic reticulum. DHRS3 was cloned in insect Sf9 cells by Bac-to-Bac Baculovirus expression system. Protease protection assay, endoglycosidase H treatment and alkaline respective detergent extraction were used for the determination of DHRS3 topology in microsomal membrane. All results were analyzed by SDS-PAGE and western blotting. Our results suggest that DHRS3 is an integral protein which is oriented into the cytosol. Activity of the microsomal fraction with overexpressed DHRS3 from Sf9 cells was verified by all-trans-retinol. Further, catalytic activity of this enzyme was tested against several xenobiotics and eobiotics. This project was supported by the Grant Agency of Charles University (Grant No. 677012/C/2012) and by Charles University project SVV 265 004.

P078 CHARACTERIZATION OF LECTINS FROM OPPORTUNISTIC PATHOGENS BY FLUORESCENCE MICROSCOPY Malinovská L., Adamová L., Wimmerová M. Central European Institute of Technology, Masaryk University,Brno; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno; National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, Brno [email protected] Sekce: Glykobiochemie Lectins are sugar-binding proteins of non-immune origin occurring in all organisms and executing various functions. Microbial lectins can recognize carbohydrates on host cells (glycoproteins or glycolipides) and mediate adhesion to host cells or mucosal surfaces. Therefore, bacterial lectins are usually located on flagella or fimbriae. However, some bacterial lectins could be present directly on bacterial surface. Burkholderia cenocepacia and Pseudomonas aeruginosa are opportunistic human pathogens that infect especially cystic fibrosis (CF) patients. Both B. cenocepacia and P. aeruginosa produce several soluble lectins located in cytoplasm but significant part of lectins is exported and attached to bacterial surface by unknown mechanisms. Lectins PA-IL and PA-IIL from P. aeruginosa are proved virulence factors. Soluble lectins from B. cenocepacia are homologues of PA-IIL and are also considered as virulence factors. Lectins differ in fine carbohydrate specificity but all of them could bind heptose and heptose derivatives. Thus, lipopolysaccharides (LPS) from B. cenocepacia could be suitable targets for lectins and anchor them directly on the bacterial surface. We used several lectins labelled with FITC to examine their ability to bind to surfaces of B. cenocepacia (single cells and biofilm) using fluorescence microscopy, which is a useful and sensitive method used in biology and the biomedical sciences. After incubation with lectins-FITC conjugates, both cells and biofilm provided visible fluorescence signal compared to negative controls. Binding to LPS could therefore serve as direct attachment of lectins on microbial surfaces, which is necessary for adhesion functions. This work is supported by Ministry of Education (ME08008) and Grant Agency of Czech Republic (GD301/09/H004, GA/303/09/1168)

148

Martínek V., Frei E., Stiborová M. katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Pharmacological efficiency of antineoplastic pro-drug ellipticine is dependent on cytochrome P450 (CYP)- and/or peroxidase-mediated activation. CYPs oxidize ellipticine to five metabolites, two of them 12- and 13-hydroxyellipticine (12-/13-OH-elli) are proximate mutagens. They are generated predominantly by CYP1A and 3A subfamilies and their formation is strongly stimulated by presence of cytochrome b51,2. 12-OH-elli is the major metabolite produced when considering oxidation of ellipticine by the most efficient system – CYP1A1/2 in presence of holo-cytochrome b5. While 13-OH-elli formation rate is significantly lower, varying from 10-60% of the 12-OH-elli formation rate, depending on CYP:reductase:cytochrome b5 ratio. The enzymatically formed 12- and 13-OH-elli are proposed to be responsible for formation of ellipticine-12-ylium and ellipticine-13-ylium ions that generate covalent DNA adducts. In contrast to the results obtained from metabolic studies, the experiments focused on genotoxicity of ellipticine metabolites found that the major DNA adduct originates from the 13-OH-elli that is formed in lower amounts than 12-OH-elli1,2. Present study therefore focuses on elucidation of differences in genotoxicity of 12- vs. 13-OH-elli, using computational approaches. We considered 3 reaction paths leading to ultimate carcinogens, evaluated effects of solvation model and electron correlation on equilibrium reaction free energy differences in dissociative reactions leading to the ultimate species. The higher susceptibility of 13-hydroxyellipticine toward heterolytic dissociation in comparison to dissociation of 12-hydroxyellipticine determined by quantum chemical calculations helps to explain this phenomenon. This work was supported by the GACR (P301/10/0356), Charles Univ. (UNCE#42) and MetaCentrum facilities (LM2010005). 1. Kotrbová V., et al.: Biochem. Pharmacol. 2011, 82, 669–680 2. Stiborová M., et al.: Chem. Res. Toxicol. 2012, in press. doi: 10.1021/tx3000335

P080 UTILIZÁCIA POLYMÉRNYCH SUBSTRÁTOV NA SYNTÉZU PROTEÁZ POČAS SUBMERZNEJ KULTIVÁCIE HÚB Z RODU TRICHODERMA Maťaťa M., Varečka Ľ., Šimkovič M. Oddelenie biochémie a mikrobiológie, FChPT STU Bratislava [email protected] Sekce: Biotechnologie Zvyšujúci sa celosvetový záujem o využívanie enzýmov v rôznych oblastiach života je jedným z hlavných dôvodov, prečo sa v súčasnosti hľadajú nové zdroje a spôsoby prípravy týchto látok. Najpočetnejšou skupinou sú hydrolázy, pričom z komerčného hľadiska práve proteázy predstavujú nadpolovičnú väčšinu z týchto enzýmov. Proteolytická aktivita je základom pre širokú škálu priemyselných aplikácií a úžitok z nej sa využíva napr. v kožiarenskom, potravinárskom a farmaceutickom priemysle, pri spracovávaní odpadov atď. Mikroskopické vláknité huby predstavujú širokú skupinu mikroorganizmov schopných sa adaptovať aj na nepriaznivé prostredie. Podstatou adaptácie je tvorba širokého spektra hydroláz degradujúcich komplexné substráty v prostredí na jednoduchšie produkty, ktoré slúžia na zabezpečenie vlastných nutričných požiadaviek, polarizovaný rast, metabolickú obnovu opotrebovaných bunkových zložiek atď. Príkladom univerzálnosti a prispôsobivosti je celulolytický enzýmový systém produkovaný rôznymi kmeňmi Trichoderma spp., ktorý hubám uľahčuje saprofytický a mykoparazitický spôsob života. Rod Trichoderma je vďaka týmto schopnostiam sľubným kandidátom na vyhľadávanie nových proteáz. Tento projekt sa venuje charakterizácii schopnosti vybraných kmeňov húb z rodu Trichoderma utilizovať polymérne látky prírodného pôvodu na syntézu a sekréciu proteáz. Štúdium ukázalo, že kmene z rodu Trichoderma dokážu zužitkovať pre rast a indukovanú tvorbu proteáz štruktúrne rozmanitú skupinu polymérnych látok, pričom proteolytický profil sekretovaných enzýmov sa líšil v závislosti od typu polyméru a rastovej fázy huby. Táto práca bola podporená grantovými agentúrami VEGA (1/0854/11), APVV (APVV-0642-07) a spolufinancovaná z zo zdrojov EÚ (ITMS 26240120016).

149

POS TE RY

P079 PREDICTION OF SUSCEPTIBILITY OF 12-/13-HYDROXYELLIPTICINE TOWARD THEIR HYDROLYSIS TO GENOTOXIC SPECIES

POS TE RY

P081 METABOLISM OF 9-NORBORNYL-6-CHLOROPURINE – A NOVEL CARBOCYCLIC NUCLEOSIDE ANALOGUE WITH ANTIVIRAL ACTIVITY Mertlíková-Kaiserová H., Plačková P., Rozumová N., Šála M., Nencka R., Votruba I. Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd České Republiky, v.v.i. [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie 6-Chloropurines substituted at the position 9 with variously modified bicyclic skeletons have been recently reported as anti-enterovirus compounds [1]. 9-[(1R*,2R*,4S*)-Bicyclo[2.2.1]hept-2-yl]-6-chloro-9H-purine (9-norbornyl-6chloropurine, NCP) represents the most active compound of the series and thus served as a model compound for biochemical studies. In this work we explored several putative metabolic pathways of NCP aiming to understand its mechanism of action. Metabolism was studied at the level of whole cells as well as purified enzymes. In order to reach maximal sensitivity, [3H]-labeled NCP was used in most assays. Unlike 6-chloropurine [2] or its ribonucleoside [3] NCP was metabolized be neither xanthine oxidase nor adenosine deaminase, respectively. Our data also suggest that it is not a substrate for microsomal monooxygenases. A major metabolite of NCP was identified as a glutathione conjugate (NCP-GS). Buthionine sulfoximine-pretreated cells prevented the metabolite formation and increased cytotoxicity of NCP. NCP-GS was formed both in the microsomal and cytosolic fraction of rat liver homogenate as well as in the cells (CCRF-CEM, HepG2). Non-enzymatic conjugation with GSH occured only marginally, majority of the metabolite can be attributed to the activity of glutathione-S-transferase (GST). Purified human GST was used to assess kinetic parameters for NCP conjugation, which were 1.9 mM (Km) and 1.2 µmol.mg-1.min-1 (Vmax). The effects of NCP on cellular GSH/GSSG ratio and on the activity of some GSH-dependent enzymes suggest that NCP does not induce oxidative stress, on the contrary, it likely induces cellular antioxidant defense. [1] Šála M et al. (2011) Bioorg Med Chem Lett. 21(14):4271-5 [2] Duggan DE and Titus E (1959) J Biol Chem. 234(8):2100-4 [3] Cory JG and Suhadolnik RJ (1965) Biochemistry 4(9):1733–1735 The project was supported by the Grant Agency of the Czech Republic #P303/11/1297 and the Research Project of the IOCB #RVO:61388963

P082 PROTECTIVE ROLE OF MAGNETIC FLUID AGAINST CYTOTOXIC EFFECT INDUCED BY AMYLOID FIBRILS Mocanu M. M., Siposova K., Zavisova V., Koneracka M., Ganea C., Baran I., Antosova A., Kopcansky P., Muckova M., Lazova J., Gazova Z. Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, Watsonova 47, 040 01 Kosice, Slovakia; Biophysics Department, Faculty of Medicine, UMF „Carola Davila“, 050474 Bucharest, Romania; Hameln rds, a.s., Horna 36, Modra, Slovakia [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Protein misfolding and the accumulation of amyloid aggregates are prominent features in a vast array of human diseases including Alzheimer‘s disease, systemic amyloidosis or diabetes type II. A growing body of evidence suggests that amyloid aggregates have toxic consequence to various cell types leading to their dysfunction or death. Currently, the precise mechanism of toxicity is not fully elucidated; however, there are evidences that prevention or reversion of the amyloid aggregation is beneficial. Recently, we have observed that colloidal suspension of magnetite Fe3O4 nanoparticles (magnetic fluid MF) has ability to reduce amyloid aggregation of lysozyme and insulin in vitro (Bellova, 2010; Siposova, 2012). This made us deal with the investigation of magnetite Fe3O4 nanoparticles protective effect in the cell affected by amyloid fibrils. We investigated the effect of insulin/lysozyme amyloid fibrils and MF on the growth curves of V79 and LLC-PK1 cells. Our experiments shown that protein amyloid fibrils inhibit cell proliferation and affect the cell grown curves. The results reveal that fibrils are toxic to the cells and inhibit proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner. Interestingly, the cell viability was significantly improved when the MF was added into cell culture media. It has been noted that Fe3O4 nanoparticles alone caused no significant changes in cell viability at studied concentrations. The obtained results indicate that MF is able to alleviate negative effect of amyloid fibrils on the cells. We assume that MF has the ability to decrease the amount of fibrils in correlation with the reduction of amyloid cytotoxicity. Acknowledgement: This work was supported within the projects SF of EU 2622012033, CEX of SAS Nanofluid, PN-II-RU-TE-2011-3-0204, VEGA 0079, APVV 0171-10, SK-RO 00-12-10 and VVGS 38/12-13. References: Bellova et al. Nanotechnology (2010) 21, 065103 Siposova et al. Nanotechnology (2012) 23, 055101

150

Mocanu M. M., Siposova K., Zavisova V., Koneracka M., Ganea C., Baran I., Antosova A., Kopcansky P., Muckova M., Lazova J., Gazova Y. Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, Kosice [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Protein misfolding and the accumulation of amyloid aggregates are prominent features in a vast array of human diseases including Alzheimer‘s disease, systemic amyloidosis or diabetes type II. A growing body of evidence suggests that amyloid aggregates have toxic consequence to various cell types leading to their dysfunction or death. Currently, the precise mechanism of toxicity is not fully elucidated; however, there are evidences that prevention or reversion of the amyloid aggregation is beneficial. Recently, we have observed that colloidal suspension of magnetite Fe3O4 nanoparticles (magnetic fluid MF) has ability to reduce amyloid aggregation of lysozyme and insulin in vitro (Bellova, 2010; Siposova, 2012). This made us deal with the investigation of magnetite Fe3O4 nanoparticles protective effect in the cell affected by amyloid fibrils. We investigated the effect of insulin/lysozyme amyloid fibrils and MF on the growth curves of V79 and LLC-PK1 cells. Our experiments shown that protein amyloid fibrils inhibit cell proliferation and affect the cell grown curves. The results reveal that fibrils are toxic to the cells and inhibit proliferation in a dosedependent and time-dependent manner. Interestingly, the cell viability was significantly improved when the MF was added into cell culture media. It has been noted that Fe3O4 nanoparticles alone caused no significant changes in cell viability at studied concentrations. The obtained results indicate that MF is able to alleviate negative effect of amyloid fibrils on the cells. We assume that MF has the ability to decrease the amount of fibrils in correlation with the reduction of amyloid cytotoxicity. Acknowledgement: This work was supported within the projects SF of EU 2622012033, CEX of SAS Nanofluid, PN-II-RU-TE-2011-3-0204, VEGA 0079, APVV 0171-10, SK-RO 00-12-10 and VVGS 38/12-13. References: Bellova et al. Nanotechnology (2010) 21, 065103 Siposova et al. Nanotechnology (2012) 23, 055101

P084 INTERAKCE ELICITINŮ S PATOSYSTÉMEM SOLANUM SPP. – OIDIUM NEOLYCOPERSISI Moricová P., Piterková J., Luhová L., Kašparovský T., Lochman J., Petřivalský M. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci; Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno [email protected] Sekce: Rostlinná biochemie Obranná reakce rostlin je spouštěna pomocí molekul nazývaných elicitory. Mezi tyto elicitory patří specifická skupina proteinů nazývaná elicitiny, které jsou produkované fytopatogenními oomycetami rodu Phytophthora a Pythium. V rámci této studie byly použity elicitiny oligandrin a kryptogein produkované oomycetami Pythium oligandrum a Phytophthora cryptogea. V případě elicitinu kryptogeinu byly použity i mutantní formy L41F, V84F/L41F a V80F/ L41F se změněnou vazebnou afinitou ke sterolům a mastným kyselinám, vedoucí ke změněným schopnostem indukovat resistenci prostřednictvím hypersensitivní reakce a nekrózy hostitelských buněk. Cílem této studie bylo porovnání biologické aktivity oligandrinu a kryptogeinu, včetně jeho mutantních forem, na modelovém patosystému tří genotypů Solanum spp. (S. lycopersicum, S. habrochaites, S. chmielewskii) lišících se rezistencí vůči biotrofnímu patogenu Oidium neolycopersici. Vliv elicitinů na změnu rezistence hostitelské rostliny byl sledován 48 h po současné inokulaci patogenem a aplikaci roztoků elicitinů. Byly kvantifikovány parametry vývoje patogenu (klíčivost, délka klíčních vláken a relativní zastoupení konidií s 1-3 vlákny) a rostlinné odpovědi (buněčná smrt, aktivita peroxidázy a lipidická peroxidace). Kryptogein a jeho mutantní forma V84F výrazně zvýšily rezistenci zejména u odolného genotypu S. habrochaites. Výsledky u dalších mutantních forem kryptogeinu ukazují, že snížená schopnost vazby sterolů a mastných kyselin je spojena se snížením indukce obranných reakcí u středně a vysoce rezistentního genotypu Solanum spp. Oligandrin vykazoval silné inhibiční účinky na vývoj patogenu, které však byly spojeny s odlišnými odpověďmi na úrovni hostitelské buňky ve srovnání s kryptogeinem a jeho mutantními formami. Tento výzkum byl podpořen grantem GAČR P501/12/0590 a vnitřním grantem Univerzity Palackého IGA 2012_012.

151

POS TE RY

P083 PROTECTIVE ROLE OF MAGNETIC FLUID AGAINST CYTOTOXIC EFFECT INDUCED BY AMYLOID FIBRILS

POS TE RY

P085 THE ANTICANCER AGENT ELLIPTICINE IS AN INDUCER OF CYTOCHROME B5 AND CYTOCHROMES P450 1A1, 1A2 AND 3A IN RATS Moserová M., Vranová I., Černá V., Hodek P., Frei E., Stiborová M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, Czech Republic; Division of Preventive Oncology, National Center for Tumour Diseases, German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie The plant alkaloid ellipticine is an anticancer prodrug, whose pharmacological efficiency and/or genotoxic effects are dependent on its cytochrome P450 (CYP)- and/or peroxidase-mediated activation in target tissues. Of the CYP enzymes investigated, human CYP3A4 and rat CYP3A1 are the most active enzymes oxidizing ellipticine to 13-hydroxy- and 12-hydroxyellipticine, the reactive metabolites that dissociate to ellipticine-13-ylium and ellipticine-12-ylium which bind to DNA, while the CYP1A isoforms preferentially form the other ellipticine metabolites, 9-hydroxy- and 7-hydroxyellipticine, which are the detoxication products. We have also found that cytochrome b5 alters the ratio of ellipticine metabolites formed by CYP1A1, 1A2 and 3A4. Ellipticine was found to induce expression of cytochrome b5, CYP1A1, 1A2 and 3A proteins and their enzymatic activities (determined with marker reactions such as ethoxyresorufin-O-deethylation for CYP1A1/2, methoxyresorufin-O-demethylation for CYP1A2 and 6-beta-hydroxylation of testosterone for CYP3A) in livers, lungs and kidneys of rats treated (i.p.) with 4 and 40 mg ellipticine per kg of body weight. In addition, induction of these proteins resulted in an increase in ellipticine oxidation to 7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 13-hydroxy- and 12-hydroxyellipticine, the metabolites that are both detoxication products (7-hydroxy-, 9-hydroxyellipticine) and metabolites responsible for generation ellipticinederived DNA adducts (12-hydroxy- and 13-hydroxyellipticine). The results demonstrate that by inducing CYP1A1/2, 3A and cytochrome b5, ellipticine increases its own metabolism leading both to an activation of this drug to reactive species forming DNA adducts and to detoxication metabolites, thereby modulating its own pharmacological and/or genotoxic potential. Supported by GACR (P301/10/0356 and 305/09/H008) and Charles University in Prague (UNCE #42).

P086 CRYSTALLIZATION OF C-TERMINAL DOMAIN ESSENTIAL FOR FOLDING OF ADENYLATE CYCLASE TOXIN FROM BORDETELLA PERTUSSIS. Motlová L., Bumba L., Ptáček J., Fišer R., Konopásek I. Department of Genetics and Microbiology, Faculty of Science, Charles University in Prague; Institute of Microbiology, Czech Academy of Sciences, Prague; Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, Prague [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella pertussis is a member of Repeats-in-toxin (RTX) protein family of Gram negative bacteria. RTX proteins bind calcium ions by their nonapeptide glycine- and aspartate-rich repeats which subsequently create a typical secondary beta roll structure crucial for folding and proper function of CyaA. We produced, purified and crystallized C-terminal segment (CyaA 1530-1680) of CyaA which contains about 8 putative RTX motifs together with a C-terminal flanking region. In this region, a Block A with 15 amino acids was earlier found to be crucial for an initiation of calciumdependent CyaA folding. Escherichia coli BL21 was transformed with plasmid pET42b-CyaA1530-1680. The cyaA1530-1680 bore an N-terminal fusion with genes coding Glutathione-S-transferase and His Tag. Recombinant CyaA 1530-1680 was isolated by the two-step purification using Glutathione Sepharose and Nickel Sepharose columns, respectively. Gel filtration (TSKgel G2000SW ) was used for further purification. For our crystallization, we used commercial crystallization screens JCSG Core I-IV employing the sitting-drop vapour-diffusion method. From a wide range of conditions for crystallization used, we chose crystals growing in three of them which included polyethylene glycol 3350 or 2000 and inorganic salts or TrisHCl. X-ray diffraction confirmed that these crystals were really formed by CyaA 1530-1680 and are suitable for subsequent diffraction analysis.

152

Mrazek H., Weignerova L., Man P., Benada O., Vanek O., Kren V., Bezouska K. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, Prague, Czech Republic [email protected] Sekce: Glykobiochemie Alpha-N-acetylgalactosaminidases (α-NAGA) are exoglycosidases specific for the hydrolysis of terminal α-linked N-acetylgalactosamine in various sugar chains. They occur widely in microorganisms, plants and animals, and have considerable potential in various industrial applications. Stability and activity at high temperatures are important properties of α-NAGA. A large screening study of extracellular α-NAGA activity in a library of filamentous fungi (42 strains), led to the identification of the best constitutive producer, Aspergillus niger CCIM K2. The enzyme from A.niger has certain unique properties, therefore it was chosen for further investigations. These properties can find a use for the enzymatic synthesis of various carbohydrate structures and for transformation of the red blood cell group A to the group of H (0), the universal donor. The wild type and recombinant α-NAGA produced in nonglycoengineered and humanized S.cerevisiae W303 exhibited value Km to be 0.5588mmol/l in 50mM citrate-phosphate buffer (pH=3.5) at 37˚C. The purified enzymes have different optimal pH (wildtype α-NAGA pH=1.8, α-NAGA expressed in S.cerevisiae W303 pH=2.4 and α-NAGA produced in humanized S.cerevisiae pH=2.0). Different optimal temperature and temperature stability of individual α-NAGAs were found. The N-glycosylation sites of wild type and recombinant enzymes were investigated by mass spectrometry. Conclusion: The α-NAGA from A.niger CCIM K2 was expressed in different glycoengineered strains of S. cerevisiae. The optimal conditions for production and purification were found. The basic biochemical and enzymatic properties of individual α-NAGAs were investigated. The analysis of α-NAGAs with mutated N glycosylation sites is now a work in progress. The method for transformation of erythrocytes type A to the type H(0) is also currently being investigated. This work was supported by Charles University Prague (project UNCE #42).

P088 INFLUENCE OF TARGETED AMINO ACID SUBSTITUTION ON SPECIFICITY AND AFFINITY OF LECTINS FROM PATHOGENIC BACTERIA Mrázková J., Pokorná M., Dejmková E., Malinovská L. and Wimmerová M. National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno; CEITEC – Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Glykobiochemie Pseudomonas aeruginosa, Chromobacterium violaceum, Burkholderia cenocepacia and Ralstonia solanacearum are saprophytic bacteria found in soil, water and vegetation. The first three bacteria occasionally become aggressive opportunistic animal and human pathogens which attack mainly immunocompromised patients, e.g. patients suffering from cystic fibrosis. The fourth bacterium is economically important plant pathogen. All these bacteria produce lectins. Lectins are proteins which are capable of binding diverse carbohydrates with varying specificity. This fact is very important especially in host pathogen interactions, where lectins help pathogen in adhesion to sugar moieties presented on host cells. Foregoing bacteria produce lectins belonging to a so-called “PA IIL family”, namely PA-IIL[1] (P. aeruginosa), CV-IIL[2] (C. violaceum), BC2L-A[3] (B. cenocepacia) and RS-IIL[4] (R. solanacearum). These lectins are orthologues with significant sequential and structural similarities. Although they bind similar saccharides, they differ in preferences towards these saccharides. RS-IIL and BC2L-A prefer D-mannose, while PA-IIL and CV-IIL prefer L-fucose. The aim of this work was preparation of mutated variants of these lectins with the amino acid substitution corresponding to the position Thr98 (in PA-IIL), which participates on sugar binding. Changes in affinities/ specificities of the mutants were measured by sothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon resonance (SPR). 1) Mitchell, E. et al. (2002) Nat. struct. biol. 9(12), 918-921 2) Pokorna, M. et al. (2006) Biochemistry. 45(24), 7501-7510 3) Lameignere, E. et al. (2008) Biochem. J. 411, 307-318 4) Sudakevitz, D. et al. (2004) Mol. Microb. 52(3), 691-700 This work has been supported by GACR (P207/11/P185, GD/305/09/H008) and CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund.

153

POS TE RY

P087 PROTEOMIC AND GLYCOPROTEOMIC RESEARCH OF RECOMBINANT FUNGAL α-N-ACETYLGALACTOSAMINIDASE FROM ASPERGILLUS NIGER

POS TE RY

P089 POLYMORFIZMY GENU PAPP-A U PATOLOGICKÝCH STAVŮ V TĚHOTENSTVÍ Muravská A., Jáchymová M., Germanová A., Hájek Z., Švarcová J., Zima T., Kalousová M. Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice a 1.lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze; Gynekologicko-porodnická klinika Všeobecné fakultní nemocnice a 1.lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze [email protected] Sekce: Molekulární genetika Východisko: Těhotenský protein PAPP-A (pregnancy-associated plasma protein A), metalloproteinasa vázající zinek, je rutinně používán pro screening Downova syndromu v 1.trimestru gravidity a je zvýšen u preeklampsie. V koncentracích 100-1000krát nižších než v 1. trimestru gravidity je novým markerem akutního koronárního syndromu a prognostickým markerem u pacientů se selháním ledvin. Cílem práce bylo studium vybraných polymorfizmů genu PAPP-A u patologických stavů v porodnictví a stanovení tohoto proteinu v séru. Metody: Do studie bylo zahrnuto celkem 165 pacientek (98 žen s hrozícím předčasným porodem, 35 žen s preeklampsií, 34 žen s růstovou retardací plodu, 15 žen s hepatopatií) ve 3. trimestru těhotenství. Jako kontroly sloužilo 114 zdravých těhotných a 55 netěhotných žen. Pomocí přímého sekvenování DNA byly vyšetřeny celkem 4 exony (resp. části intronů) genu PAPP-A, které čítají celkem 10 polymorfizmů. Výsledky: Z celkového počtu deseti polymorfizmů jsme v naší studované skupině zachytili pouze dva – Cys327Cys na exonu 2 (rs12375498) a C/G na intronu 6 (rs13290387). Vyšší výskyt mutované alely T (p=0.056) a signifikantně častější výskyt (p<0.01) genotypu TT polymorfizmu Cys327Cys byl prokázán u pacientek s preeklampsií v porovnání s kontrolami. Pacientky s preeklampsií v 3.trimestru mají zvýšené (p<0.05) sérové koncentrace PAPP-A, naopak u žen s hrozícím předčasným porodem je tendence k nižším hladinám v porovnání s kontrolami. U pacientek s růstovou retardací plodu hodnoty PAPP-A korelují s hodnotami C-reaktivního proteinu (r=0.49, p= 0.007). Závěry: Naše první výsledky ukazují na vztah TT genotypu polymorfizmu Cys327Cys genu PAPP-A k preeklampsii. Tyto výsledky však mohou být ovlivněny relativně malým souborem pacientek. Nalezené genetické odchylky je potřeba ještě potvrdit na větším souboru pacientek s preeklampsií. Práce byla podpořena projektem (Ministerstva zdravotnictví) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064165 (VFN v Praze 2).

P090 STRUKTURNÍ INTERAKCE KOMPONENT MITOCHONDRIÁLNÍHO ATP SYNTHASOMU Nůsková H., Mikulová T., Vrbacký M., Mráček T., Houštěk J. Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i., Praha [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Mitochondriální fosforylační aparát funkčně tvoří tři komponenty katalyzující vzájemně provázané procesy. Jedná se o ADP/ATP přenašeč (AAC), který zajišťuje vzájemnou výměnu ADP a ATP přes vnitřní mitochondriální membránu, a fosfátový přenašeč (PiC), který umožňuje import anorganického fosfátu pro fosforylaci ADP v mitochondriální matrix v procesu katalyzovaném F1Fo-ATP synthasou. Existují experimentální důkazy, že tyto komponenty vnitřní mitochondriální membrány by mohly interagovat také strukturně a vytvářet superkomplex, tzv. ATP synthasom, což by zvýšilo efektivitu jejich vzájemné funkční interakce. Pro charakterizaci obsahu jednotlivých komponent fosforylačního aparátu v savčích buňkách a identifikaci případných změn v obsahu přenašečů AAC a PiC v závislosti na sníženém množství ATP synthasy jsme využili dva modely selektivního snížení tohoto enzymu – fyziologický model hnědého tuku potkana a patologický model buněčných kultur fibroblastů pacientů s deficiencí ATP synthasy vyvolanou mutací asemblačního faktoru TMEM70. Zjistili jsme, že v rámci potkaních tkání je nejvyšší obsah přenašečů ve tkáních s vysokou energetickou náročností, tj. v srdci, svalu a hnědém tuku. Ve fibroblastech pacientů s defektním TMEM70 pak dochází k nárůstu obsahu přenašečů oproti kontrolním buňkám. To je v souladu s nálezem kompenzačního zvýšení obsahu komplexů dýchacího řetězce v buňkách s deficiencí ATP synthasy. Paralelně jsme studovali vzájemné strukturní vztahy mezi přenašeči AAC a PiC a ATP synthasou s využitím různých metod – imunoprecipitací a nativních a vícerozměrných gelových elektroforéz v kombinaci s imunodetekcí specifickými protilátkami a/nebo s MS analýzou. Souhrnně tyto experimenty ukazují, že oba přenašeče strukturně interagují s ATP synthasou ve formě monomeru i vyšších oligomerů, ale většina přenašečů je přítomná mimo ATP synthasom, zřejmě v dimerických formách. Tento projekt byl podporován GAČR 303/10/0P227 a MŠMT ČR AV0Z50110509, RVO:67985823.

154

Ondrušková N., Hansíková H., Horová E., Baxová A., Kytnarová J., Honzík T., Zeman J. Laboratoř pro studium mitochondriálních poruch, Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Úvod: Pro screening dědičných poruch glykosylace (CDG) se standardně využívá kombinovaná analýza N-glykosylovaného transferinu (Tf) a O-glykosylovaného apolipoproteinu C-III (Apo C-III). Oba proteiny mají navázány větvené glykany s kyselinou sialovou v terminální poloze, jejíž obsah umožňuje rozlišovat glykosylované isoformy (asialo- až hexasialoTf a asialo- až disialoApo C-III). U pacientů s různými typy CDG byly popsány patologické profily Tf a Apo C-III definované variabilně zvýšeným podílem hypoglykosylovaných forem. Cílem studie bylo vyhodnotit odchylky v relativním zastoupení jednotlivých sialovaných isoforem Tf a Apo C-III od stanoveného referenčního rozmezí a analyzovat případy s patologickým profilem sekundární etiologie. Materiál a metody: sérum od pacientů s podezřením na CDG bylo analyzováno pomocí 1.) isoelektrické fokusace (IEF) s imunofixací Tf a 2.) IEF s Western blotem Apo C-III. Kvantifikace získaných profilů byla provedena v programech AlfaDigiDoc (Alpha Innotech) a Quantity One (Bio-Rad). Výsledky: Hypoglykosylace Tf (profil typu I) byla detekována u pacientů s galaktosémií (6x) a s hereditární fruktózovou intolerancí (3x). Patologický protil Tf typu II byl zjištěn v případě alfa-manosidózy (1x), syndromu SilverRussell (2x), Noonanova syndromu (1x) a hepatopatie (1x). Patologický profil zapříčiněný přítomností vzácných genetických polymorfizmů byl nalezen v 5 případech. Sekundární zvýšení hyposialovaných isoforem Apo C-III jsme zaznamenali u 1 pacienta s nefropatií a u 3 jedinců se syndromem Prader-Willi. Speciální skupinou s atypickým profilem Tf a Apo C-III byly i děti s velmi nízkým věkem. Odlišení sekundární hypoglykosylace má význam pro správné stanovení diagnózy a sledování charakteru profilů může pomoci nastavit vhodnou terapii (např. u galaktosémie). Podporováno: GAUK 638512, IGA MZ NT12166, PRVOUK P24/LF1/3, SVV 264502

P092 HISTONE ACETYLTRANSFERASES P-300/CBP-ASSOCIATED FACTOR AND HUMAN GENERAL CONTROL NONREPRESIBLE-RELATED 5 INHIBIT ACTIVITY OF THE MELANOCYTE-SPECIFIC MICROPHTHALMIA-ASSOCIATED TRANSCRIPTION FACTOR. Ondrušová L., Vachtenheim J., Réda J., Žáková P. Oddělení transkripce a buněčné signalizace, Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF, Univerzita Karlova v Praze [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Several cell lineages express microphthalmia-associated transcription factor (MITF), a transcriptional activator containing basic-helix-loop-helix (bHLH) domain. Melanocyte-specific isoform of MITF is critical for differentiation, proliferation, and survival of both normal melanocytes and melanoma cells. Numerous genes have been identified as targets of MITF in malignant melanocytes. We demonstrate that histone acetyltransferases (HATs) PCAF (p-300/CBPassociated factor) and hGCN5 (human general control nonrepresible-related 5) interact with MITF in vitro and in cells, and the transactivation domain and bHLH region of MITF are essential for this interaction. The binding is direct and does not involve the complex formation with p300 coactivator, a known MITF-interacting protein. Overexpression of PCAF or hGCN5 resulted in inhibition of activity of several MITF responsive promoter-reporters, and siRNA directed to PCAF activated the MITF target melastatin promoter in 501mel melanoma cells, indicating that endogenous level of PCAF is inhibitory. Further, the HAT-defective mutants of PCAF and hGCN5 which still effectively bound to MITF inhibited the target promoter-reporters as strongly as the wild types, indicating that acetyltransferase activity is not necessary for inhibition. These results suggest that the two HATs, PCAF and hGCN5, may modulate MITF activity independently of their acetyltransferase function. Grant support: NT/11229-3/2010, IGA MH, Czech Rep.

155

POS TE RY

P091 ISOELEKTRICKÁ FOKUSACE TRANSFERINU A APOLIPOPROTEINU C-III – ANALÝZA PROFILŮ SEKUNDÁRNÍ ETIOLOGIE

POS TE RY

P093 ŠTÚDIUM GENOMICKÉHO OSTROVA TERMOREZISTENCIE KMEŇOV CRONOBACTER SPP. Oriešková M., Gajdošová J., Kaclíková E., Turňa J., Drahovská H. Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava; Výskumný ústav potravinársky, Bratislava [email protected] Sekce: Molekulární genetika Cronobacter spp., predtým známy ako Enterobacter sakazakii, je oportunistický patogén, infikujúci prevažne novorodencov a dojčatá, spôsobujúci závažné ochorenia (meningitídy, enterokolitídy, sepsy, bakterémie a i.). Sušená dojčenská mliečna výživa je často predpokladaným zdrojom infekcie. Cronobacter spp. je čiastočne tolerantný k osmotickému stresu a vysušovaniu a niektoré kmene sú dokonca tolerantné k vyššej teplote. To predstavuje značné riziko pri rekonštitúcii detskej výživy. Predmetom našej práce bolo štúdium genomického ostrova, ktorého prítomnosť zabezpečuje zvýšenú termotoleranciu kmeňov Cronobacter. V práci sme testovali schopnosť súboru kmeňov Cronobacter spp. prežívať pri zvýšenej teplote. Zistili sme, že kmene je možné rozdeliť do dvoch skupín – termosenzitívne a termotolerantné, pričom termotolerancia korelovala s prítomnosťou markera termorezistencie orfI. Stanovili sme DNA sekvenciu okolia orfI v referenčnom kmeni C. sakazakii ATCC 29544 v celkovej dĺžke 18 kbp a v tejto oblasti sme detekovali genomický ostrov obsahujúci orf homologické s bakteriálnymi génmi zúčastňujúcimi sa odpovede na rôzne druhy stresu. Prítomnosť ostrova termotolerancie sme zistili u vybraných kmeňov zaradených do rodov Cronobacter, Enterobacter, Citrobacter a Escherichia. Funkciu ostrova termotolerancie sme potvrdili prípravou mutantého kmeňa C. sakazakii ATCC 29544 s deléciou ostrova termotolerancie. Zistili sme, že delečný kmeň mal rovnakú schopnosť rastu v štandardnom LB médiu pri teplote 37°C, ale mal zníženú schopnosť prežívania pri 50 – 58°C. Zároveň tento kmeň prejavoval zníženú toleranciu voči hyperostmotickému prostrediu. Poďakovanie: Príspevok je výsledkom realizácie projektu: “ Rozvoj Centra excelentnosti pre využitie informačných biomakromolekúl na zlepšenie kvality života. (BIOMAKRO II, ITMS 26240120027)“ na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a projektu VEGA 1/0709/12.

P094 ŠTÚDIUM BAKTERIOFÁGOV INFIKUJÚCICH KMENE SALMONELLA A CRONOBACTER Oslanecová L., Kajsík M., Turňa J., Drahovská H. Prírodovedecká fakulta UK Bratislava [email protected] Sekce: Biotechnologie Bakteriálne infekcie prenášané potravinami sú aj v súčasnej dobe príčinou početných ochorení a úmrtí. Jedným z problémov pri liečbe je aj vzrastajúci počet kmeňov rezistentných na antibiotiká. Bakteriofágy sú perspektívnou alternatívou voči antibiotikám pri zabezpečení mikrobiologickej nezávadnosti potravín. Cieľom práce bolo izolovať a charakterizovať súbor bakteriofágov špecifických pre patogény rodu Salmonella a Cronobacter. Z odpadovej vody sme pomocou indikátorových kmeňov izolovali tri bakteriofágy. Bakteriofág Dev2 bol izolovaný na hostiteľskom kmeni C. turicensis 290708/07, z 31 testovaných kmeňov rodu Cronobacter bol Dev2 citlivý len na dva kmene C. turicensis, okrem toho infikoval aj dva z piatich kmeňov E. coli a osem zo 16 kmeňov salmonel. Na základe DNA sekvencie bol tento fág zaradený do skupiny T7-podobných fágov s najvyššou príbuznosťou s bakteriofágmi EcoDS a K1F infikujúcimi E. coli. Bakteriofág Pet-SB1 bol izolovaný na hostiteľskom kmeni Salmonella Bredeney 4583, infikoval šesť zo 16 testovaných kmeňov salmonel ako aj kmene Cronobacter, Enterobacter a E. coli. Na základe DNA sekvencie kapsidového génu bol tento bakteriofág vysokopodobný k fágu EPS7 zo skupiny T5-podobných fágov. Bakteriofág Pet-SE1 bol izolovaný na indikátorovom kmeni Salmonella Enteritidis 5028 a bol schopný infikovať kmene sérotypov Enteritidis, Dublin a Typhimurium ako aj niektoré kmene Cronobacter, Enterobacter a E. coli. Rôzne úseky genómu fága Pet-SE1 boli homologické k DNA z bakteriofágov SE2, SS3e a EPS7 z čeľade Siphoviridae. Izolované fakteriofágy sú vhodnými kandidátmi pre využitie v ochrane potravín pred kontamináciou patogénnymi baktériami. Poďakovanie: Príspevok je výsledkom realizácie projektu: “Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov (BIOREKPROT, ITMS 26240220048)“ na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a projektu APVV-0098-10 Agentúry na podporu vedy a výskumu SR.

156

ATP MEASUREMENTS IN ACIDOPHILIC BACTERIA OXIDIZING IRON(II) AND ELEMENTAL SULFUR Pakostová E., Mandl M., Omesová Pokorná B. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Conditions under which biomass growth could be monitored by an ATP assay to study activities of acidophilic iron- and sulfur-oxidizing bacteria were defined. Inhibitory effects of acidity and inorganic substrates and products on luciferase used in the assay were eliminated by appropriate dilution. The ATP extraction efficiency, determination limits and experimental errors were also evaluated. Iron- and elemental sulfur-oxidizing A. ferrooxidans cultures had a linear relationship between the cellular ATP and the rates of cell growth and substrate oxidation up to the beginning of the stationary phase. In contrast to the iron-oxidizing culture, the ATP content of sulfur-grown cells decreased anomalously when the stationary phase culture pH was adjusted. Although the rates of growth and sulfur oxidation reached the original levels, the ATP content of the culture remained constant because of gradual decrease in the cellular ATP. The maximum ATP levels in A. ferrooxidans grown on Fe(II) and elemental sulfur were 1.16 and 0.33 amol per cell, respectively. The ATP assay is a useful tool to study biogeochemical and environmental activities of acidophilic ironand sulfur-oxidizing bacteria. However, the different cellular metabolic mode induced by a sulfur culture pH increase resulted in limitation of the bioluminescence method. The result should be considered for other organisms before application of the ATP kit. Supported by Grant No. 525/08/0697 from the Czech Science Foundation.

P096 VPLYV IÓNOVÝCH KVAPALÍN NA ŠTRUKTÚRU A STABILITU PROTEÍNOV Parnica J., Antalík M. Katedra biochémie, Prírodovedecká fakulta UPJŠ, Košice; Ústav experimentálnej fyziky, SAV, Košice [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Iónové kvapaliny (IL), získané kombináciou prevažne organických katiónov s rôznymi aniónmi, predstavujú rad vlastností (vysoká teplotná stabilita, zanedbateľný tlak pár a nehorľavosť), ktoré z nich robia atraktívne rozpúšťadlá pre biomateriály. Dostali sa do pozornosti ako „zelená“ alternatíva konvenčných organických rozpúšťadiel. Starostlivým výberom vhodných katiónov a aniónov je možné meniť fyzikálne vlastnosti IL, a tak môžu byť tieto systémy prispôsobené, aby spĺňali kritéria konkrétnej aplikácie. Najbežnejšie IL obsahujú ako katión imidazolium, pyridinium alebo kvartérnu amónnu soľ a ako anión napr. Cl, Br, I, PF6, BF4. Alternatívou k použitiu IL sú „Deep Eutectic Solvents“ (DES) rozpúšťadlá. Termín DES bol vytvorený ako prostriedok na ich rozlíšenie od pravých IL a tiež aby odrážal veľké poklesy v bode tuhnutia (niekoľko sto stupňov celzia) eutektickej zmesi. Dajú sa ľahko pripraviť v čistej podobe z lacných východiskových materiálov (zmes kvartérnej amónnej soli s organickým donorom vodíka, napr. amín, amid, alkohol, alebo karboxylová kyselina). Klasickým príkladom je kombinácia cholín chloridu (Tt 302 °C) s močovinou (Tt 132 °C), ktoré tvoria DES s teplotou topenia 12 °C. Táto prvá generácia DES je schopná rozpušťať oxidy kovov. V súčasnosti sa problematika DES rozšírila o skúmanie ich stabilizačných účinkov na štruktúry biomakromolekúl. Zložkami pripravovaných DES ako organického donora vodíka sú okrem iných (močovina, kys. malonová) aj glukóza, sorbitol a glycerol, v prípade ktorých už bol dokázaný stabilizačný účinok na proteínové štruktúry. Naším hlavným cieľom je príprava nových jedinečných kombinácii DES s čo najlepšími stabilizačnými vlastnosťami v kombinácii s biomakromolekulami, či už obmenou kvartérnej amónnej soli za jej derivát s podobnými vlastnosťami, alebo obmenou organického donora vodíka. Príspevok bol vypracovaný v rámci projektov č. 26220120021 a 26220220061 zo ŠF EU, projektu CEX NANOFLUIDS SAV, VEGA 2/0025/12 a APVV-0171-10.

157

POS TE RY

P095

POS TE RY

P097 SLEDOVÁNÍ ÚČINKU NEOSTIGMINU NA MYŠÍM MODELU BALB/C PŘI PROBÍHAJÍCÍ INFEKCI ZPŮSOBENÉ FRANCISELLA TULARENSIS Pavliš O., Pikula J., Pohanka M. Ústřední vojenský zdravotní ústav, Centrum biologické ochrany Těchonín; Katedra toxikologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Kralové; Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Neostigmin je pseudoireverzibilní inhibitor acetylcholinesterasy (AChE), který se svým mechanismem účinku (zvýšení hladiny acetylcholinu v krvi i v centrální nervové soustavě po inhibici a následná aktivace nikotinových receptorů) prokazatelně podílí na protizánětlivé odpovědi organismu. S ohledem na tuto skutečnost jsme sledovali účinky podání neostigminu na živý organismus při probíhající infekci způsobené Francisella tularensis. Pro experiment byla zvolena inbrední myší linie BALB/c. Po aplikaci suspenze živých buněk F. tularensis LVS (Live Vaccine Strain), byly podány dávky neostigminu 8, 40 a 200 μg/kg hmotnosti pokusného zvířete. Následně byl proveden test smrtnosti. Odebraná krev byla zpracována a ve vzorcích plazmy byly stanoveny hladiny interferonu γ (IFN γ) a interleukinu 6 (IL-6). Podání neostigminu vedlo zvýšení smrtnosti. Byl také zjištěn signifikantní pokles hladin obou sledovaných cytokinů v závislosti na dávce podané látky. Výsledky našeho experimentu dokládají případné život ohrožující účinky podání inhibitorů AChE u pacientů s tularemickou či obdobnou mikrobiální infekcí.

P098 BUNĚČNÝ TRANSPORT ANALOGU KARBOCYKLICKÉHO NUKLEOSIDU – 9 NORBONYL-6-CHLORPURINU Plačková P., Šála M., Nencka R., Kostinová A., Votruba I. a Mertlíková-Kaiserová H. Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd České Republiky, v.v.i. [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie 9-[(1R*,2R*,4S*)-Bicyklo[2.2.1]hept-2-yl]-6-chlor-9H-purin (9-norbornyl-6-chlorpurin, NCP) se řadí do skupiny analogů karbocyklických nukleosidů s norbornanovým skeletem. Tyto sloučeniny vykazují antivirotický účinek proti virům Coxsackie [1]. U NCP byl navíc zjištěn i cytotoxický účinek na leukemické buňky (IC50 = 17,67 ± 1,79 μmol/l). NCP byla jakožto nejaktivnější látka z celé skupiny zvolena jako modelová sloučenina, u které je nutno objasnit mechanismus účinku, jehož nedílnou součástí je také membránový transport a metabolismus. Tyto údaje jsou potřebné pro specifikaci terapeutického využití v klinické praxi a pro syntézu další generace účinných látek s modifikacemi na purinové nebo norbornanové části. V této práci byla objasněna první část projektu – membránový transport za využití radiometrické metody s detekcí scintilace. Jako radionuklid bylo u všech pokusů aplikováno tritium ve formě [3H]NCP. Buněčný příjem NCP v závislosti na vnějším množství látky vykazoval koncentrativní, saturační charakter. V závislosti na čase docházelo k zvyšování intracelulární koncentrace NCP, přičemž maximální hodnoty (okolo 0,6 mmol/l) bylo dosaženo po deseti minutách a poté koncentrace látky v buňce klesala. Zablokováním membránových effluxních proteinů došlo k zvrácení tohoto efektu a k ustálení intracelulární hladiny NCP. Z hlediska energie byl příjem NCP buňkou ATP-independentní. Dále bylo zjištěno, že buněčný příjem není ovlivněn teplotou a strukturně podobnými látkami. Působením látek ovlivňující cytoskelet docházelo k snížení buněčného příjmu NCP. Tyto výsledky naznačují, že se jedná o zprostředkovanou difusi či symport/antiport. V neposlední řadě byla zjištěna i velmi dobrá permeabilita přes monovrstvu epiteálních buněk Caco-2, což signalizuje dobré vstřebávání NCP gastrointestinálním traktem. [1] Šála M. et al. (2011) Bioorg Med Chem Lett. 21(14):4271-5 Tento projekt byl hrazen z prostředků grantu GAČR č. P303/11/1297 a výzkumného projektu ÚOCHB: RVO č. 61388963.

158

Plšíková J., Štěpánková J., Kašpárková J., Brabec V., Kožurková M. Department of Biochemistry UPJŠ Košice; Department of Molecular Biophysics and Pharmacology, Institute of Biophysic Brno [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Topoisomerases are nuclear enzymes that regulate DNA topology, participate in cellular genetic processes, such as DNA replication, transcription, recombination and chromosome segregation. Certain topoisomerase inhibitors have been adopted into cancer clinics as potent anticancer drugs, including camptothecin derivatives inhibiting Topo I and anthracyclines targeting Topo II. Lichens and the cytotoxicity of their secondary metabolites have already been studied for more than three decades but the mechanisms of their biological action are still almost entirely unknown. We have identified secondary metabolites of lichen (parietin, atranorin, usnic acid and gyrophoric acid) that have anti-proliferative and/or pro-apoptotic potential. In light of the potential importance of the anticancer activity of these metabolites, we have determined the effect of these compounds on human topoisomerase II. The ability of tested metabolites to inhibit topoisomerase activity was examined by measuring the decatenation of kinetoplast DNA by Topo II. All substances showed Topo II inhibitory activity and were more effective as a know Topo II inhibitor m-AMSA. Topo II poisons are known to stabilize the cleavage complex that leads to DNA strand breaks, while catalytic inhibitors can protect cells against Topo II poison-induced DNA damage. We tested whether our substances could act as a poison and stimulate formation of DNA cleavage complexes of Topo II, using the Topo II cleavage assay, with 100µM m-AMSA as a positive control. In contrast to m-AMSA, which stimulated formation of cleavage complexes as indicated by the band of linearised plasmid DNA, our substances had no effect on Topo II cleavage activity even at a concentration of 100µM. Therefore, these compounds were identified as a topoisomerase catalytic inhibitor, which inhibits the catalytic activity of topoisomerase rather than inducing the formation of a cleavage complex. This work was supported by VVGS 40/12-13, VVGS-PF-2012-16.

P100 2-AMINO-4,6-DICHLOROPYRIMIDINE DERIVATIVES AS PROSPECTIVE ANGIOGENESIS INHIBITORS Pohlová L., Jansa P., Kolman V., Janeba Z., Günterová J., Hájek M. Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, v.v.i., Prague, Czech Republic [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie The demand of growing tumor for nutrients and oxygen is provided by passive diffusion up to the tumor size of 1-2 mm. Its further enlargement is allowed by the formation of new blood vessels in a process termed tumor angiogenesis. Therefore, angiogenesis plays an essential role in tumor growth and metastasis and appears to be a promising target in cancer therapy. We studied the effects of a series of novel 2-amino-4,6-dichloropyrimidine analogs on the key steps of the angiogenic process: proliferation, differentiation and migration of endothelial cells (ECs). The analysis was performed by using two in vitro angiogenic assays: a) Tube formation assay, which mimics in vivo capillary development and b) Wound healing assay to observe the influence of the studied compounds on migration of ECs. Cytotoxic effects were assessed using the XTT test and apoptosis detection. All compounds tested inhibited tube formation in lower concentrations than their cytotoxic IC50. The antiangiogenic activity of the most potent compound PJ-24 was apparent from 5 μmol/l on. 10 μM solution of PJ-24 reduced tube formation by >90% as determined by the measurement of tubular network complexity. The natural product sulforaphane, a well-known isothiocyanate derivative with antiangiogenic properties, served as a positive control. Its effect on tube formation was comparable to that of PJ24. The results provide an in vitro evidence for the dose-dependent antiangiogenic effects of the tested polysubstituted pyrimidine derivatives at physiologically relevant concentrations that could contribute to their therapeutic potential. We suggest that the mechanism of their antiangiogenic effect might be partly caused by induction of apoptosis in ECs. However, the detailed mechanism remains to be elucidated. Finally, the obtained results ensure an immediate feedback to chemical synthesis and thus can also provide the structure-activity optimization. Supported by the Research project of the IOCB #RVO: 61388963

159

POS TE RY

P099 LICHEN SECONDARY METABOLITES AS CATALYTIC INHIBITORS OF TOPOISOMERASE II

POS TE RY

P101 MUTATION STUDY OF SPECIFICITY BINDING LOOP IN PA-IIL LIKE FAMILY LECTINS Pokorná M., Dejmková E., Adamová L., Mrázková M., Wimmerová M. National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Masaryk University, Faculty of Research, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic, Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Glykobiochemie Protein engineering is a very useful method to modify binding properties of proteins and to finely tune their specificity and/or affinity. We have performed experimental study in order to understand the molecular basis of different specificity of lectins from the PA-IIL like family for monosaccharides. Three single point mutants of the PA-IIL lectin from P. aeruginosa in position 22-23-24 were prepared and structure-functionally characterized. The in vitro mutagenesis in combination with computational methods allowed to define that these three amino acids form the “specificity-binding loop” in the whole family. [1, 2] In this study, we have focused on mutagenesis in the binding loop of other members of PA-IIL like lectin family[3-5]. We have prepared these lectins with mutations corresponding to the position 22 in PA IIL, which is decisive for the specificity of the lectins. All mutants were prepared with a good yield for functional characterization. Changes in specificity and affinity properties are studied by isothermal titration calorimetry and surface plasmon resonance. [1] J. Adam, M. Pokorná, C. Sabin, E.P. Mitchell, A. Imberty, M. Wimmerová, BMC Struct Biol. 7 (2007)36-48 [2] J. Adam, Z. Kříž, M. P. Prokop, M. Wimmerová, J. Koča,, J. Chem Inf Model. 48 (2008)223442 [3] M. Pokorná, G. Cioci, S. Perret, E. Rebuffet, J., N. Kostlánová, J. Adam, N. Gilboa-Garber, E. P. Mitchell, A. Imberty’, M. Wimmerová, Biochemistry (2006)45,7501 [4] E. Lameignere, L. Malinovská, M. Sláviková, E. Duchaud, E. P. Mitchell, A.Varrot., O. Šedo, A. Imberty, M. Wimmerová, Biochemical J. (2008)411,307 [5] D. Sudakevitz, N. Kotlánová, G. Blatman-Jan, E. P. Mitchel, B. Lerrer, M. Wimmerová, D. J. Katcoff, A. Imberty, N. Gilboa-Garber, Mol Microbiol. (2004)52, 691 This work has been supported by GACR (P207/11/P185, GD/305/09/H008) and CEITEC – Central European Institute of Technology with research infrastructure supported by the project CZ.1.05/1.1.00/02.0068 from European Regional Development Fund.

P102 OPTIMALIZACE EXPRESNÍHO SYSTÉMU HEK293 BUNĚČNÉ LINIE POMOCÍ REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU A APOPTOSY Poláchová E., Vaněk O., Bezouška K. Katedra biochemie PřF UK, Praha [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Tranzientní transfekce savčích buněčných linií je známa jako užitečná technika pro přípravu rekombinantních proteinů, kterou lze získat miligramy až gramy proteinů za pouhé dva týdny od klonování korespondující cDNA. Takto připravené nativní glykosylované proteiny mohou být využity pro různé účely v molekulární biologii, imunologii či farmaceutickém průmyslu, např. pro počáteční fáze pre-klinického výzkumu terapeutických proteinů. Jednou z nejvíce používaných je v tomto ohledu linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 (HEK293), kterou lze dobře kultivovat a snadno se chemicky transfekuje [1]. Produkce proteinů v tranzientně transfekovaných HEK293 buňkách přitom může být zvýšena celou řadou faktorů, např. přídavkem kys. valproové (inhibitor histon-deacetylas) [2], koexpresí kyselého růstového hormonu fibroblastů (aFGF) [3], anebo koexpresí proteinů regulujících buněčný cyklus [4]. Byl připraven pTT5 expresní plazmid [1] modifikovaný vložením post-transkripční regulační sekvence WPRE (woodchuck hepatitis virus post-regulatory element) zvyšující stabilitu mRNA vloženého genu [3]. Do tohoto plazmidu byly vloženy geny pro aFGF, regulátory buněčného cyklu p18, p21, p27 (inhibitory cyklin-dependentních kináz) a regulátory apoptosy Bcl-2 a Bcl-X. Tyto plazmidy lze s pomocí zeleného fluorescenčního proteinu a sekretované alkalické fosfatázy jako reportérových proteinů využít ke sledování vlivu jednotlivých regulátorů exprese jak jednotlivě, tak v kombinaci, včetně dosud nepopsaného současného působení regulátorů buněčného cyklu a apoptosy. Podpořeno projekty GAČR (P207/10/1040, 303/09/0477 a 305/09/H008), MŠMT ČR (1M0505), Univerzity Karlovy (UNCE 204025/2012) a Evropské komise (SPINE2 COMPLEXES: 031220, P CUBE: 227764). [1] Durocher Y. et al., Nucleic Acids Res 30(2), E9 (2002) [2] Backliwal G. et al., Biotechnol Bioeng 101(1), 182-189 (2008) [3] Backliwal G. et al., Nucleic Acids Res 36(15), E96 (2008) [4] Backliwal G. et al., N Biotechnol 25(2-3), 162-166 (2008)

160

Polek B., Godočíková J., Bučková M., Zámocký M. Ústav molekulárnej biológie SAV, Laboratórium molekulárnej mikrobiológie [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Mnohé polutanty v pôdach podliehajú oxidačným procesom, výsledkom ktorých sú reaktívne intermediáty, hlavne radikály reagujúce s kyslíkom za vzniku reaktívných oxidačných druhov (ROS). Vo všeobecnosti, mikroorganizmy sú chránené voči poškodeniu ROS enzýmami, medzi ktoré patria katalázy. Modelové mikroorganizmy, bakteriálne izoláty rodu Comamonas sú známe svojou širokou katabolickou diverzitou pri degradáciach rozličných xenobiotík. Ukázalo sa, že pre prežitie izolátov Comamonas testosteroni K3, Comamonas terrigena N3H alebo N1C v prostredí znečistenom ropnými látkami bola dôležitá zvýšená produkcia katalázy a o-dianisidin-peroxidázovej aktivity. Elektroforetické rozlíšenie bezbunkových extraktov jednotlivých mikrobiálnych izolátov pestovaných v aerobných podmienkach v Luria-Bertani médiu odhalilo odlišnú expresiu katalázových a peroxidázových aktivít ako i ich izozýmov. Odpoveď jednotlivých kmeňov na účinok stresu (20 a 40 mM H2O2) bola charakterizovaná značnou diverzitou expresie kataláz indikujúcej selektívny tlak prostredia. Dlhodobý účinok oxidačnému stresu prostredia na mikrobiálne kmene odhalil zmeny na primárnej štruktúre kat-1 génu konštitutívne exprimovanej katalázy-1 izolátu C. terrigena N3H ako i génu katG kódujúceho syntézu katalázy-peroxidázy izolátu C.testosteroni. Vyhodnotili sme vzťahy medzi štruktúrou uvedených génov a enzymatickou aktivitou produkovaných enzýmov. Práca bola finančne podporená Slovenskou Grantovou Agentúrou VEGA (Grant č. 2/0149/11)

P104 COMPARISON OF CISPLATIN, DOXORUBICIN AND ELLIPTICINE CYTOTOXIC EFECTS ON HUMAN NEUROBLASTOMA CELL LINES Poljaková J., Hřebačková J., Hraběta J., Eckschlager T., Cipro Š., Stiborová M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague; Department of Pediatric Hematology and Oncology, 2nd Medical School, Charles University in Prague [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Cisplatin (CDDP) and doxorubicin (DOXO) are two effective antineoplastic agents frequently used for the treatment of various cancer diseases. However, their use is limited mainly by the resistance they induce in cancer cells and also by a number of side effects. Another agent with an antineoplastic activity, whose side effects are rather limited, is ellipticine (ELLI). The mechanism of action of all these anticancer agents is mainly associated with DNA damage such as intercalation and/or DNA adduct formation. Here, the cytotoxic effects of CDDP, DOXO and ELLI to human UKF-NB-3 and UKF-NB-4 neuroblastoma cancer cell lines were compared. Furthermore, the effect of hypoxic conditions on their toxicity to these cells was also examined. Generally, cytotoxicity of studied anticancer agents was decreased in neuroblastoma cells cultivated under lack of oxygen (1%). The only exception was exposure of UKF-NB-3 to CDDP under hypoxia, when CDDP was observed to be more cytotoxic to these cells than under normoxia. Human neuroblastoma cell line UKF-NB-3 is more sensitive to all tested agents in comparison to UKF-NB-4. Cytotoxicity of DOXO and ELLI to UKF-NB-3 is comparable (IC50 of ~0.5 uM) in contrast to CDDP (IC50 of ~1 uM). The other tested human neuroblastoma cell line, UKF-NB-4, was more sensitive to ELLI, than to DOXO and CDDP. Supported by GACR (P301/10/0356), Czech Ministry of Education (MSM0021620813) and Charles University (UNCE#42).

161

POS TE RY

P103 ODPOVEĎ MIKROORGANIZMOV VOČI OXIDAČNÉMU STRESU ZNEČISTENÝCH PÔD PROSTREDNÍCTVOM KATALÁZ

POS TE RY

P105 VLIV ROSTLIN A PŘÍRODNÍCH LÁTEK NA BAKTERIÁLNÍ POPULACE V KONTAMINOVANÉ ZEMINĚ Prouzová P., Hoskovcová E., Bedrlíková E., Musilová L., Strejček M., Uhlík O., Demnerová K. a Macková M. Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha, Technická 3, Praha 6, 16628, Česká Republika [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Jednou z šetrných dekontaminačních metod je rhizoremediace, která k odstranění xenobiotik využívá bohatou rhizosférní mikroflóru rostlin. Mnoho látek uvolňovaných rostlinami podporuje mikroorganismy při biodegradaci xenobiotik nebo přímo slouží jako induktory při bioremediačních procesech v kontaminované zemině. Tato práce je zaměřena na studium vlivu rostlin – tabáku viržinského (Nicotiana tabacum), křene selského (Armoracia rusticana) a sekundárních metabolitů – kyseliny kávové, naringinu a směsi těchto látek na mikrobiální populace v zemině kontaminované PCB. Po 4- měsíční kultivaci byly stanovovány celkové počty kultivovatelných mikroorganismů a počty mikroorganismů využívajících bifenyl jako jediný zdroj uhlíku a také byl sledován úbytek PCB v jednotlivých paralelách. Vliv na růst mikrobiální populace i úbytky koncentrace PCB vykazovaly především vzorky osázené rostlinami, především křenem, u tabáku pak vzorky s příměsí naringinu a směsi přírodních látek. Úbytky PCB koncentrace byly měřeny pomocí plynové chromatografie. U tabáku nastal pokles o průměrně 20 mg/kg, u křene o 30 mg/kg. Kultivovatelné mikroorganismy byly identifikovány pomocí MALDI-TOF MS. 9 různých bakteriálních druhů bylo určeno v rhizosféře tabáku a 11 druhů v rhizosféře křene. U obou rostlin byla nejčastěji zastoupena bakterie rodu Arthrobacter, která byla identifikována ve všech vzorcích a bakterie Pseudomonas obsažená ve většině vzorků. Ze vzorků kontaminované zeminy byla po kultivaci isolována DNA a byly připraveny amplikony 16S rRNA genů pro pyrosekvenaci, která byla použita pro charakterizaci bakteriální komunity u daných vzorků. Poděkování: Tato práce byla sponzorována z projektu EU MINOTAURUS (7th FP, č. pr: 265946) a ME-100 41, poděkování Miluši Hroudové a Jakubovi Rídlovi za pyrosekvenaci vzorků.

P106 PŘÍPRAVA DIMERNÍ ROZPUSTNÉ FORMY MYŠÍHO NK BUNĚČNÉHO RECEPTORU NKR-P1C Pucholtová H., Vaněk O., Adámek D., Bezouška K. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul NK buňky jsou buňky imunitního systému, které zprostředkovávají vrozenou imunitu proti patogenům a nádorům, aniž by musely být předem vystaveny antigenu. Mohou tak zastávat okamžitou protivirovou obranu již během počáteční fáze před zahájením tvorby protilátek a před vývojem specifických cytotoxických T-lymfocytů [1]. NK buňky mají na svém povrchu širokou škálu inhibičních a aktivačních receptorů, z nichž významnou rodinu tvoří receptory C lektinového typu, z nichž byla první objevena právě rodina NKR-P1. Už dlouho předtím však byly myší NK buňky charakterizovány pomocí vazby protilátky PK136 na tzv. NK1.1 antigen. Jak se později ukázalo, tímto antigenem byl myší NK buněčný aktivační receptor NKR-P1C a některé formy inhibičních receptorů NKR-P1B/D [2]. Přestože biologická funkce myších inhibičních NKR-P1 receptorů je již poměrně dobře prozkoumána, fyziologický ligand hojně exprimovaného aktivačního receptoru NKR P1C dosud nebyl objeven. Zatímco příprava rozpustné monomerní formy NKR P1C již byla popsána [3], nativní formu receptoru – disulfidicky vázaný homodimer – se dosud připravit nepodařilo. Dimerní rozpustná forma NKR-P1C byla připravena rekombinantní expresí nejprve pomocí tranzietní transfekce buněčné linie HEK293 (human embryonic kidney 293) jako IgG Fc fúzní protein z nějž bylo možno po afinitní purifikaci, štěpení TEV proteasou a následnou HPLC chromatografií získat čistý dimer NKR P1C. Posléze byla optimalizována i bakteriální exprese v buňkách E. coli kmene BL-21 Gold v LB i v ZYP-5052 autoindukčním médiu, následná izolace inkluzních tělísek, renaturace a purifikace dimerního proteinu. Podpořeno projekty GAČR (P207/10/1040, 303/09/0477 a 305/09/ H008), MŠMT ČR (1M0505), Univerzity Karlovy (UNCE 204025/2012) a Evropské komise (SPINE2 COMPLEXES: 031220, P CUBE: 227764). [1] Wodarz, D. et al., J. R. Soc. Interface 4, 533-543 (2007) [2] Carlyle, J. R. et al., J Immunol 176(12), 7511-7524 (2006) [3] Rozbesky, D. et al., Protein Expr Purif 77(2), 178-184 (2011)

162

Rauchová H., Vokurková M., Drahota Z. Institute of Physiology AS CR in Prague [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Digitonin (glycoside and mild non-ionic detergent) solubilize mitochondrial membranes, breaks the integrity of respiratory chain and releases individual respiratory complexes. Under these conditions both coenzyme Q (CoQ) and cytochrome c are not able to maintain connection between particular complexes and to participate in electron transfer to cytochrome c oxidase. We aimed to find to what extent the oxidation of glycerol-3-phosphate (GP) and succinate (SUC) is inhibited by digitonin and to estimate to which extent cytochrome c and idebenone (less hydrophobic synthetic analog of CoQ with a 10-carbon side chain ending by a hydroxyl group) supplements are able to restore enzyme activities. We showed the inhibition of GP and SUC-dependent oxygen consumption rates by digitonin treatment. In the presence of 5 mg digitonin/mg mitochondrial protein both enzyme activities were inhibited to 15 and 25 % of original values of GP and SUC oxygen consumption rate, respectively. The inhibition of GP oxidation was recovered to 148 %, whereas SUC was recovered only to 68 % by cytochrome c and idebenone. In our experiments we also evaluated the activating effect of idebenone on GP and SUC cytochrome c oxidoreductase. In agreement with previous data on oxygen consumption rate, GP cytochrome c oxidoreductase was more sensitive to digitonin action in comparison with SUC cytochrome c oxidoreductase. Similarly, idebenone recovery was better in the case of GP cytochrome c oxidoreductase in comparison with SUC cytochrome c oxidoreductase. In conclusion, our findings might indicate the different mechanism of the electron transfer from two flavoprotein-dependent dehydrogenases localized on the outer (GP dehydrogenase; EC 1.1.99.5) and inner (SUC dehydrogenase; EC 1.3.99.1) face of the inner mitochondrial membrane, respectively. This work was supported by the GA CR (304/12/0259) and the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic (AV0Z 50110509).

P108 FLUORESCENČNÍ ZOBRAZOVÁNÍ MITOCHONDRIÍ V REÁLNÉM ČASE POMOCÍ PENTAMETHINIOVÝCH SOLÍ Rimpelová S., Bříza T., Králová J., Záruba K., Kejík Z., Martásek P., Ruml T. & Král V. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze; Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha; 1. lékařská fakulta University Karlovy v Praze; Zentiva Group (část skupiny Sanofi-aventis), Praha [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Mitochondrie hrají v buňce nezbytnou roli v beta-oxidaci, citrátovém cyklu, degradaci aminokyselin, biosyntéze hemu, metabolismu steroidů či v močovinovém cyklu. V posledních letech byl prokázán přímý vztah fyziologie mitochondrií se stárnutím organismu a s řadou degenerativních onemocnění. Studium změn mitochondriální morfologie, dynamiky a fyziologie vyžaduje vysoce specifické fluorescenční sondy, a to i pro klinické účely. Vyvinuli jsme nové sensory mitochondrií odvozené od látek z rodiny gama-aryl substituovaných pentamethiniových solí, které vykazují excelentní fluorescenční vlastnosti, fotostabilitu a nízkou fototoxicitu. Lokalizují se v mitochondriích buněk jak nádorových, tak primárních linií, a na rozdíl od komerčně dostupných markerů je možné je využívat jak pro fluorescenční mikroskopii v reálném čase, tak pro fixované preparáty a izolované mitochondrie. Naše nové sensory otevírají unikátní možnosti nejen v dalším výzkumu mitochondrií, ale i v diagnostice. Financováno z účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT č. 21/2012) a z grantu KAN200200651.

163

POS TE RY

P107 DIGITONIN INHIBITION AND IDEBENONE RECOVERY OF GLYCEROL-3PHOSPHATE AND SUCCINATE OXIDATION

POS TE RY

P109 COMPARISON OF THE EFFECT OF DIFFERENT MOLECULAR WEIGHT HYALURONAN FROM TWO DIFFERENT SOURCES ON MOUSE IMMUNE CELLS ACTIVATION Šafránková B., Kubeš M., Hermannová M., Velebný V., Kubala L. Institute of Biophysics, AS CR, Brno; Department of Animal Physiology, Faculty of Science, MU, Brno; ICRC – CBCE, St. Anne‘s University Hospital Brno; Contipro-Biotech s.r.o., Dolní Dobrouč [email protected] Sekce: Glykobiochemie Glycosaminoglycan hyaluronan (HA) is an abundant component of the extracellular matrix. Current studies suggest that the direct effects of HA on cells are dependent on its molecular weight (MW). The low MW HA should exhibit immunostimulatory activity, whereas the high MW should possess inhibitory activity. However, differences in observed HA activity could also be connected with the quality of HA preparation, particularly with its purity and origin. Thus, we compared a modulation of mouse immune cell activity by HA preparation from rooster comb (100 kDa, 500 kDa, 997 kDa) and Streptococcus equi biotechnological origin (71 kDa, 500 kDa, 1000 kDa) of well-defined MW with very narrow polydispersity. Interestingly, low MW HA not high MW HA prepared from microbial origin induced weak, however, significant production of tumor necrosis factor alpha after incubation with mouse macrophage cell line RAW 264.7, but not with bone marrow-derived macrophages and in the whole blood, which dependent on HA dose. In contrast, the most effective HA preparation from animal source to activate different type of mouse immune cells was the HMW HA with significantly higher potential compered to HA of microbial origin. In contrast to tumor necrosis factor alpha production, any tested HA samples did not induce expression neither cyclooxygenase-2 nor inducible nitric oxide synthase and nitric oxide production in selected cell types. Thus we can suggest significant differences among the effects of animal and microbial origin HA on mouse immune cells in vitro.

P110 OXIDAČNÝ STRES A ZÁPAL U PACIENTOV S DIABETES MELLITUS 2. TYPU S A BEZ DIABETICKÝCH KOMPLIKÁCIÍ Šándorová E., Jakuš V., Kalninová J., Glejtková M., Krahulec B. Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; II. Interná klinika, Univerzitná nemocnica, Bratislava [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie V súčasnosti je stále aktuálny výskum úlohy oxidačného stresu a zápalových cytokínov vo vývoji chronických diabetických vaskulárnych komplikácií. Cieľom našej práce bolo sledovanie zápalových cytokínov a úrovne antioxidačnej ochrany vzhľadom na rozvoj chronických diabetických mikro- a makrovaskulárnych komplikácií u pacientov s DM2. Krv a krvné plazmy boli získané od pacientov, ktorí navštevovali diabetologickú ambulanciu II. internej kliniky vo FNsP v Bratislave. Pacienti (n=71) vo veku 64,97±rokov s dĺžkou trvania diabetu 12,49±7,44 rokov boli rozdelení podľa výskytu diabetických komplikácií na pacientov s komplikáciami (n=48) a bez komplikácií (n=33). Kontrolnú skupinu tvorili zdraví jedinci (n=12). Interleukín-6 (IL-6) bol stanovený v plazme na prístroji Athena Multi-LyteTM Luminex 100 na báze xMAP (multi-analyte profiling) technológie. Aktivita glutatiónperoxidázy (GPx) v erytrocytoch bola stanovená nepriamou metódou spektrofotometricky, aktivita katalázy (kat) v erytrocytoch bola stanovená podľa metódy Aebi a kol. (1999). Lipidový profil bol stanovený štandardnou enzymatickou metódou. Zistili sme signifikantne zníženú aktivitu kat 1,08±0,31 μkat/g Hb a GPx 0,27±0,07 U/g Hb u pacientov s komplikáciami v porovnaní s pacientmi bez komplikácií (1,33±0,47μkat/g Hb; 0,35±0,09 U/g Hb). Našli sme signifikantný rozdiel v hladinách IL-6 u diabetických pacientov s ICHS voči kontrole. U pacientov s komplikáciami sme zistili signifikantnú pozitívnu koreláciu medzi aktivitou kat a HDL (r=0,41; p=0,0043). U pacientov bez komplikácií sme zistili signifikantnú pozitívnu koreláciu medzi aktivitou GPx a HDL (r=0,68; p=0,039). Antioxidačná ochrana u pacientov s chronickými diabetickými komplikáciami je znížená. Znížené hladiny antioxidačných enzýmov a pretrvávajúci systémový zápal u týchto diabetikov zrejme poukazujú na nedostatočnú antioxidačnú, farmakologickú a nefarmakologickú terapiu. Táto štúdia bola podporená grantom VEGA 1/0451/12 a GUK 492/2012.

164

Šedivá A., Gemeiner P., Katrlík J. Oddělení glykobiotechnologie, Chemický ústav Slovenské akademie věd, Dúbravská cesta 9, Bratislava 845 38, Slovenská republika [email protected] Sekce: Glykobiochemie Lektinové biosenzory a biočipy se využívají na detekci sacharidových struktur vázaných na různé molekuly a substráty jako jsou například proteiny, lipidy, buněčné stěny a tím i na studium glykoprofilu biologického materiálu jako jsou buňky včetně kmenových, tkáně, viry, mikroorganismy, séra a podobně. Odhaduje se, že víc jak polovina proteinů u eukaryot je glykosylovaná a mnohé fyziologické a patofyziologické změny souvisí se změnami v glykosylaci proteinů, jak je tomu u mnohých onemocnění včetně rakoviny, revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, Alzheimerovy choroby, tuberkulózy, AIDS, zánětových onemocněních, a mnoha jiných. Lektiny je tedy možné využít i na sledování onemocnění a detekci biomarkrů onemocnění sledováním změn. Studium glykosylace je také významné pro imunologii například při vývoji a testování nových vakcín. Naším cílem je příprava lektinových biosenzorů a biočipů využívajících techniku povrchové plasmonové rezonance (SPR) a jejich použití pro detekci glykokonjugátů, interakcí glykanových struktur s lektinami a sledování glykosylačních změn se zřetelem na využití v biologickém a medicinském výzkumu a pro klinickou diagnostiku. Poděkování: Tento příspěvek byl vytvořený realizací projektu “Centrum pre Materiály, vrstvy a systémy pre Aplikácia a ChemIcké procesy v extrémNych podmienkAch – Etapa II“ , na základě podpory operačního programu Výzkum a vývoj financovaného z Evropského fondu regionálního rozvoje.

P112 RECONSTITUTION STUDY OF APOFLAVOPROTEIN rFerB WITH FLAVINS Sedláček V., Kučera I. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul rFerB, the recombinant form of ferric reductase B firstly isolated from Paracoccus denitrificans, is a flavoprotein with a C-terminal hexahistidine tag and a flavin as the cofactor. The modified His-tag based immobilization method of preparing the apoprotein of rFerB was used. The recombinant holoprotein was bound to a metal affinity column and the flavin was released by buffer containing 4 M KBr and 4 M urea. The flavin was analysed on a HPLC reverse phase C-18 column. FMN was determined as the cofactor of rFerB. For reconstitution study, absolutely pure FAD, FMN, riboflavin and lumichrome were prepared from standard commercial chemicals by the same method used for the flavin analysis. The stoichiometry and kinetic parameters of flavins binding to the apoenzyme were determined by fluorescence quenching of the protein upon flavins titration. Only reconstitution of the apoenzyme with FMN gave quantitative yields with the 1:1 binding of FMN by a monomer. Flavins without a phosphate group but also FAD were bind less effectively by the apoprotein. Acknowledgement: This work was supported by grants from the Czech Science Foundation (P503/10/P217).

165

POS TE RY

P111 DETEKCE GLYKANOVÝCH STRUKTUR S VYUŽITÍM SPR BIOSENZORŮ ZALOŽENÝCH NA LEKTINOVÉM ROZPOZNÁVÁNÍ

POS TE RY

P113 TUNIKAMYCÍN ZNIŽUJE GLYKOZYLÁCIU P-GLYKOPROTEÍNU BEZ OVPLYVNENIA JEHO TRANSPORTNEJ AKTIVITY V LEUKEMICKÝCH BUNKÁCH L1210 Šereš M., Cholujová D., Bubenčíková T., Breier A., Sulová Z. Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava, Slovensko; Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava, Slovensko [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Multidrug rezistencia (MDR) umožňuje bunkám stať sa rezistentnými voči toxickému vplyvu rôznych látok, líšiacich sa od seba ako štruktúrou, tak i funkciou. P-glykoproteín (P-gp) je ATP závislá transportná pumpa, ktorá keď je lokalizovaná v plazmatickej membráne buniek, transportuje látky z intracelulárneho do extracelulárneho prostredia, a tak zabezpečuje multidrug rezistenciu v neoplastických bunkách. P-gp je 140 kDa polypeptid, po glykozylácii je jeho relatívna molekulárna hmotnosť až okolo 170 kDa. Našim experimentálnym modelom sú P-gp negatívne myšie leukemické bunky L1210 (S), z nich sme získali P-gp pozitívne bunky buď postupnou dlhodobou adaptáciou na cytostatikum vinkristín (R) alebo transfekciou génom pre ľudský P-gp (T). Expresia P-gp v membránach R a T buniek indukuje výrazné zmeny v zložení sacharidov v porovnaní so S bunkami (Sulová a kol., 2010). V tejto práci sme sledovali vplyv tunikamycínu na glykozyláciu, transportnú aktivitu a bunkovú lokalizáciu P-gp v R a T bunkách. Kultivácia buniek s tunikamycínom (inhibítor N-glykozylácie) ovplyvnila viabilitu buniek koncentračne závislým spôsobom, avšak v R a T bunkách vo výrazne menšej miere ako v S bunkách. Tunikamycín inhiboval N-glykozyláciu P-glykoproteínu v R a T bunkách. Zaujímavé bolo, že kultivácia buniek s tunikamycínom neovplyvnila lokalizáciu P-gp v plazmatickej membráne buniek a ani jeho transportnú aktivitu. Zistili sme, že v P-gp pozitívnych L1210 bunkách, nezávisle od spôsobu, akým k expresii P-gp došlo (selekcia s liečivom alebo transfekcia génom pre P-gp), tunikamycín indukuje inhibíciu N-glykozylácie P-glykoproteínu bez ovplyvnenia jeho funkcie ako transportnej ATP-ázy v plazmatickej membráne buniek. Podporené grantami: APVV-0290-10 a VEGA 2/0123/10, 2/0155/09. Lit.: Sulova Z. a kol. The presence of P-glycoprotein in L1210 cells directly induces down-regulation of cell surface saccharide targets of Concanvalin A. Anticancer Res 30: 3661-3668. 2010.

P114 THE COMPLEX REGULATORY NETWORK IN THE REGULATION OF STRESSRESPONSE SIGMA FACTORS IN STREPTOMYCES COELICOLOR A3(2) Sevcikova B., Homerova D., Rezuchova B., Mingyar E., Feckova L., Novakova R., Kormanec, J. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace In natural habitats, bacteria are exposed to various stresses, and the stress response is regulated mainly by stressresponse sigma factors of RNA polymerase, which govern expression of genes essential to overcome the adverse conditions. In Gram-positive bacterium Bacillus subtilis and other close bacteria, the activity of such sigma factor SigB is regulated by a “partner-switching” phoshorylation mechanism by the anti-sigma factor RsbW, anti-anti-sigma factor RsbV, and by two PP2C phosphatases, RsbP and RsbU. The regulation of stress response in Gram-positive soil bacteria Streptomyces is different to that one in B. subtilis. The genome of Streptomyces coelicolor contains genes encoding 65 sigma factors including 9 homologues of SigB (SigB, F, G, H, I, K, L, M, N), 60 homologues of anti-sigma factor RsbW, 18 homologues of anti-anti-sigma factor RsbV, and 44 homologues of PP2C phosphatases RsbU/RsbP that indicate rather complex picture of regulation comparing to B. subtilis. Several approaches were used to investigate and characterize interactions between nine known homologues SigB and suggested anti-sigma factors, and between these anti-sigma factors and anti-anti sigma factors. Moreover, several anti-sigma factors were found to phosphorylate (by which to inhibit) several anti-anti-sigma factors. The results revealed very complex way of regulation, where several sigma factors interact with different anti-sigma factors that additionally interact with several subclasses of anti-sigma factor antagonists. This work was supported by the VEGA grant 2/0028/12 from Slovak Academy of Sciences. This contribution is also the result of the project implementation TRANSMED 2 (ITMS: 26240120030), supported by the Research & Development Operational Programme funded by the ERDF.

166

Siposova K., Kozar T., Kutschy P., Antosova A., Bagelova J., Fedunova D., Gazova Z. Institute of Experimental Physics in Kosice [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul The conversion of normally soluble protein into fibrillar aggregates is of central importance for several diseases, including Alzheimer’s, Parkinson’s or type II diabetes. Understanding the nature, mechanism and inhibition of amyloid fibril formation is of key importance for drug design. Insulin amyloid deposits have been reported in patient with diabetes undergoing long-term injection treatment with this drug. Consequently, it is important to diminish or decrease the occurrence of such aggregates. Accordingly, we were interested in molecular screening for lead compounds for amyloid aggregate inhibition. Phytoalexins were shown to exhibit anti-microbial, anti-tumor effects and according to recent studies also affect amyloid aggregation. The inhibition potential of available proprietary-synthesized indole-based phytoalexin molecules for insulin amyloid aggregation we tested in vitro. High-throughput virtual screening tools were used then in order to support the lead selection. Insulin amyloid fibrils were formed by incubation of soluble protein in presence of NaCl at acidic pH and high temperature under constant stirring. The inhibiting activity of phytoalexins was determined by IC50 values. In addition, possible binding modes of the studied phytoalexins were analyzed by molecular modeling tools. Two compounds, benzocamalexin and cyclobrassinin were identified to strongly inhibit amyloid aggregation. Benzocamalexin was identified by both, experimental and computational approaches, as the most efficient inhibitory molecule of insulin aggregation in the studied set of compounds. Accordingly, benzocamalexin was selected as the lead molecule for further refinement. Acknowledgement: This work was supported within the projects SF of EU 2622012033, CEX of SAS Nanofluid, VEGA 0073, VEGA 0079, APVV projects 0171-10 and SK-RO 00-1210, VVGS 38/12-13 and SAS-NSC.

P116 THE ROLE OF CARBONYL REDUCING ENZYMES IN THE PHASE I BIOTRANSFORMATION OF NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUG NABUMETONE Škarydová L., Nobilis M., Wsól V. Department of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague; Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Nabumetone is a non-steroidal anti-inflammatory drug that belongs to widely prescribed medicines in world today. It is clinically used mainly for management of osteoartritis, rheumatoid artritis and also other rheumatoid diseases. Nabumetone is a prodrug that undergoes an extensive metabolism to the pharmacologically active product 6-methoxy-2-naphtylacetic acid (6-MNA). Besides 6-MNA also other phase I metabolites with lower activity were identified. One of such metabolites is 4-(6-methoxy-2-naphtyl)-2butanol (reduced nabumetone) that has no pharmacological activity [1]. Even though nabumetone was synthetized in 1978 and probably first metabolic study was made by 1984 [2], very little information about enzymes that participate in its biotransformation has been published so far. The aim of this study was to elucidate a role of particular human liver subcellular fractions with regard to reductive metabolism of nabumetone and also describe activities and stereospecifities of particular carbonyl reducing enzymes in deactivation of nabumetone. For these purpose, chiral and achiral HPLC methods for determination of nabumetone and its metabolites were utilized. Human liver cytosol and microsomes and eight recombinant purified carbonyl reducing enzymes (CBR1, CBR3, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1-4) were tested for their ability to reduce nabumetone. Except of CBR3 all tested enzymes have an activity towards nabumetone. Stereospecificity and kinetic parameters were determined for all active carbonyl reducing enzymes. It is surprizing that 6-MNA is not the major metabolite formed in human liver microsomes. Results suggest that, at least in vitro, reductive biotransformation of nabumetone is approximately ten times more extensive that oxidative one that does not correspond with a situation in vivo. This study was supported by Project UNCE no.17/2012. [1] Nobilis M. et al. (2003) J Pharm Biomed Anal 32, 641-656. [2] Haddock R.E. et al. (1984) Xenobiotica 14(4), 327-337.

167

POS TE RY

P115 EFFICIENCY OF PHYTOALEXINS FOR INHIBITION OF AMYLOID AGGREGATION

POS TE RY

P117 DIFFERENTIAL SCANNING FLUORIMETRY AS A TOOL FOR CHARACTERIZATION OF PROTEINS Škarydová L., Tomanová R., Wsól V. Department of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul In the postgenomic era it is important to characterize orphan proteins with unknown function and structure. A simple method that may help in this effort is differential scanning fluorimetry (DSF). It enables to determine optimal conditions for stabilization of proteins so improve e.g. purification or crystallization and also discover their ligands. DSF monitors thermal unfolding of a protein in the presence of fluorescent dye (e.g. SYPRO Orange). A melting temperature (Tm) that reflects stability of protein can be established from fluorescence plot. Ligand screening relies upon the fact that protein stability is enhanced upon ligand binding [1]. Carbonyl reducing enzymes participate in metabolism of endogenic substrates and xenobiotics. Some of them are well-characterized but others only to limited extent or totally uncharacterized. The aim of this study was to utilize the new method for characterization of carbonyl reductase 1 (CBR1) that belong to described carbonyl reducing enzymes allowing a verification of the DSF results and point out to the possibility of using DSF method in characterization of orphan proteins. The group of buffers with or without additives were tested to choose an optimal environment for ligand screening of CBR1 that was performed with the group of potential substrates and inhibitors. Their influence on stability of CBR1 was determined by DSF and results were compared with independent method. DSF method proved that some substances from a group of potential substrates and inhibitors stabilize CBR1 so they are good ligands of CBR1. These results were, in almost all cases, in good correlation with methods for measuring an activity of CBR1. DSF method seems to be an important tool for decrypting of function of uncharacterized proteins or drug discovery and may be widely utilized as a screening method. This project was supported by Project UNCE No.17/2012. [1] Niesen F.H., Berglund H., Vedadi M. (2007), Nature protocols, 2(9), 2212-2221.

P118 DATA MINING OF HTS DATA OF STEROID COMPOUNDS AND DISCOVERY OF RELATIONS BETWEEN THEIR CHEMICAL STRUCTURE AND BIOLOGICAL ACTIVITY Škuta C., Svozil D., Sedlák D., Bartůněk P. Laboratoř informatiky a chemie VŠCHT Praha [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie High-throughput screening (HTS) as a principal experimental method of chemical biology produces a vast amount of data. To process such a data it is necessary to use methods of an advanced statistical analysis and of a data mining. In the presented work we focus at the application of a cluster analysis to discover the relations between chemical and biological properties of steroid compounds. The analysis is based upon the profiling of the library of 3000+ steroid compounds on six steroid nuclear receptors. A clustering of chemical data uses the fragment analysis of steroid compounds including the differences in their molecular skeletons.

168

Slavkovský R., Pavlík V., Kučera J., Klein P., Velebný V. Group of Cell Physiology, R&D, Contipro Biotech, 561 02 Dolní Dobrouč, Czech Republic; Group of Wound Repair, R&D, Contipro Biotech, 561 02, Dolní Dobrouč, Czech Republic [email protected] Sekce: Molekulární genetika Cutaneous wound healing is a complex process that leads to restoration of skin barrier function. It involves several overlapping phases – inflammation, granulation tissue formation, epithelization and scar maturation. These events require altered gene expression compared to intact skin. Investigating the changes was aim of this study. We used a minipig for a wound healing model. Experimental excisional wounds were made and wound biopsies were harvested 3, 7, 14, 21, 35 and 70 days after wounding. Gene expression was analyzed initially with a custom designed microarray. More than 5 thousands transcripts had significantly changed expression (by more than two-fold) in day 7 when compared to uninjured skin. This number decreased as the wound healing progressed. In the open wound (days 3 to 14), inflammatory-related genes prevailed in the group of significantly changed transcripts. Later (days 21 – 70), there was a major elevation of extracellular matrix and structural proteins. The transcripts with the most differentially regulated expression were selected for a validation of the expression pattern with quantitative polymerase chain reaction (qPCR). This comparison revealed high correlation between the data obtained with the microarray and qPCR. The genes with altered expression provide better insight into the process of cutaneous wound healing. In addition, the significantly regulated genes may become markers of wound healing progression. Aberrant expression of the marker genes may indicate wound healing complications. Alternatively, beneficial effects of a particular treatment may be observed from the expression profiles of the marker genes and these results may serve in development of wound healing preparations.

P120 CHARACTERIZATION OF NOVEL XANTHINE OXIDOREDUCTASE INHIBITORS Šmídková M., Jansa P., Janeba Z., Votruba I., Mertlíková-Kaiserová H. Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Xanthine oxidoreductase (XOR) is a key enzyme of purine catabolism, which is involved in the pathogenesis of hyperuricemia, gout, and oxidative stress-related cardiovascular diseases. Currently, allopurinol is a drug of the first choice in the treatment or prevention of these conditions. Although effective in many patients, some of them experience sensitivity to allopurinol, which is attributed to the fact that this drug is phosphoribosylated to the corresponding nucleotide [1]. Therefore, the search for new XOR inhibitors continues. Here we report an in vitro investigation of three purine derivatives for their ability to inhibit XOR. Cytotoxicity, as well as the extent of their phosphoribosylation, were also in the scope of our research. 8-Aza-2,6-diaminopurine was found to be an excellent inhibitor (IC50=0.65 μM) of the enzyme, even stronger than allopurinol (IC50=1.12 μM) used as a positive control. However, it exhibited cytotoxic effect (IC50=3 μM, 72 h) on human T-cell tumor line. Analysis of inhibition data using GOSA equations indicated a mixed competitive-noncompetitive type of inhibition. 8-Mercaptoadenine (IC50=5.8 μM) and 8-bromoguanine (IC50=3.2 μM) showed to be weaker inhibitors than allopurinol, with the competitive and mixed type of inhibition, respectively. Cytotoxicity was not observed in their cases. Contrary to allopurinol, none of the tested compounds was found to be a substrate for phosphoribosyl transferases. In the future, improved analogs will be designed and their structure-activity relationships will be explored. [1] McInnes GT, Lawson DH, Jick H (1981) Acute adverse reactions attributed to allopurinol in hospitalised patients. Ann Rheum Dis, 40:245–249 Supported by the Research project of the IOCB #RVO: 61388963

169

POS TE RY

P119 EXPRESSION ANALYSIS OF MINIPIG WOUNDS – POTENTIAL MARKERS OF WOUND HEALING

POS TE RY

P121 SEARCHING FOR THE MINIMAL REGION NEEDED FOR THE PRIMASE AND POLYMERASE ACTIVITY OF THE BFK20 GP43 Šoltészová B., Halgašová N., Bukovská G. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovak Republic [email protected] Sekce: Proteomika a metabolomika Gp43 is a member of proteins encoded by corynephage BFK20 replication cassette. This protein insures more functions during the replication mechanism of the phage with his N-terminal domain resembling the primase-polymerase (primpol) domain from some archaeal proteins and C-terminal domain similar to F4-type helicases. By former experimental analysis of a recombinant protein carrying the gp43 N-terminal region it was found that this protein can operate both as a primase and as a polymerase. It was proven that both reactions use only deoxyribonucleotides. In this study we searched for minimal region comprising the full primase and polymerase activity. In the first step we prepared expression plasmid pET28/43PP by cloning the DNA fragment with the prim-pol domain (amino acid residues 6 – 245 from the gp43 sequence) into the expression vector pET28a+. This cloning strategy resulted in synthesis of recombinant protein gp43PP with both N- and C-terminal His-Tag sequences. In next step we successfully expressed the protein gp43PP in the expression host Escherichia coli BL21 (DE3) and isolated it from soluble fraction of the cell lysate by IMAC – immobilized metal ion affinity chromatography using cobalt affinity gel. Finally we tested the enzyme activities of gp43PP using simple method based on the determination of inorganic pyrophosphate released during DNA synthesis reaction. The products of primase and polymerase reactions were demonstrated also by polyacrylamide and agarose gel electrophoresis. We concluded that protein gp43PP as the minimal region possesses both primase and polymerase activities. Acknowledgement: This work was supported by the VEGA Grant 2/0110/11 and APVV-0098-10.

P122 DOPAD SNÍŽENÍ MNOŽSTVÍ KOENZYMU Q10 NA METABOLISMUS BUŇKY – MODEL DEFICIENCE KOENZYMU Q10 NA KULTIVOVANÝCH BUŇKÁCH Spáčilová J., Veselá K., Sládková J., Hansíková H., Zeman J. Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta UK a VFN, Praha [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Koenzym Q10 (CoQ10) je lipofilní molekula, která má v buňce funkci antioxidantu, regulátoru růstu, hraje roli v proliferaci buňky i v programované buněčné smrti. Nejdůležitější funkcí je přenos elektronů v dýchacím řetězci mitochondrií z komplexu I a II na komplex III. Je tedy esenciální pro produkci ATP. Poruchy v syntéze CoQ10 vedou ke snížení jeho koncentrace. Dysfunkce syntézy CoQ10 má za následek závažné heterogenní klinické příznaky s postižením funkce zejména svalů a mozku (primární deficience CoQ10). Cílem práce bylo vytvořit a charakterizovat model primární deficience CoQ10 pomocí 4-aminobenzoové kyseliny (PABA) – kompetitivním inhibitorem polyprenyl-4-hydroxybenzoát transferázy (Coq2p), která je klíčovým enzymem biosyntézy CoQ10. Materiálem byly kultury lidských kožních fibroblastů (HSF) a imortalizovaná linie HEK293. Po 4 dnech kultivace HSF, resp. HEK293 v médiu s přídavkem PABA (1 mM) došlo ke snížení koncentrace CoQ10 na 60 %, resp. 40 % oproti kontrole. U CoQ10-depletovaných buněk nebyla snížena životaschopnost a nebylo detekováno poškození mitochondriální sítě ani změny ultrastruktury mitochondriií. V CoQ10-depletovaných buňkách došlo k významnému poškození funkce dýchacího řetězce – aktivita NADH:cytochrom c reduktázy a sukcinát:cytochrom c reduktázy se snížila na 70 % ve srovnání s kontrolou. Pomocí značení fluorescenčními sondami (dihydroethidium) bylo detekováno zvýšení přítomnosti reaktivních forem kyslíku (ROS). Přídavkem dodecylubichinonu (6µM) nedošlo po 24 hodinách kultivace k významnému zvýšení obsahu CoQ10, produkce ROS byla oproti CoQ10-depletovaným buňkám snížena. Byl vytvořen model deficience CoQ10 na lidských kulturách kožních fibroblastů, který je vhodný pro studium funkčního dopadu defektů syntézy CoQ10 a diagnostiku a léčbu poruch syntézy CoQ10 u člověka. Finančně podporováno projekty PRVOUK P24/LF1/3 a GAUK č. 667612.

170

Štambergová H., Škarydová L., Dunford J.E., Oppermann U., Wsól V. Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Biochemical Sciences; Structural Genomics Consortium, Botnar Research Centre, University of Oxford, United Kingdom [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Short-chain dehydrogenase/reductase superfamily (SDR) is a large group of enzymes with more than 47 000 members in all forms of life. So far, 77 SDR proteins have been identified in humans (according Swiss-Prot database). Some of them are well characterised, for others there is an evidence just on DNA or mRNA levels. SDR proteins are involved in the metabolism of diverse range of compounds, including steroid hormones, retinoids, prostaglandines, lipids and xenobiotics and play an important role in several serious diseases such as cancer or metabolic syndrome. Carbonyl reduction is one of the catalytic activities of SDR members (formation of hydroxy function out of keto or aldehyde group). There are several SDR enzymes exhibiting carbonyl reducing activity towards different xenobiotics. These ones are mainly cytosolic. On the other hand there is not too much known about the microsomal enzymes. They create more than 1/3 of SDRs according data from human genome. Membrane-bound enzymes participate in a number of metabolic pathways in organism, but working with them brings many difficulties. Human dehydrogenase/reductase (SDR family) member 7 (DHRS7) belongs among poor characterised members of SDR superfamily. It is predicted as membrane-bound enzyme, but any other information about its properties or its function in human body is missing. Several SDR enzymes are known to have important functions in biotransformation or in some diseases and there is assumption that so far uncharacterised members could be involved in those metabolic pathways as well. Our research group prepared recombinant form of human DHRS7 that have been produced using the baculovirus system and Sf9 cells. We established its basic characteristics such as transmembrane orientation and examined catalytic efficiency of DHRS7 towards selected eobiotics and xenobiotic substrates. This project was supported by the Grant Agency of Charles University (Grant No.71710/C/2010 and 677012/C/2012) and SVV 265004.

P124 PREPARATION OF A WILD TYPE AND A PROTEOLYTICALLY STABLE MUTANT OF NADPH:CYTOCHROME P450 REDUCTASE VIA HETEROLOGOUS EXPRESSION Stráňava M., Černá V., Stiborová M. Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie NADPH:cytochrome P450 reductase (CPR) is a 78 kDa flavoprotein, which is together with cytochrome P450 a component of monooxygenase system located in the membrane of the endoplasmic reticulum. A monooxygenase system is involved in the metabolism of a wide range of organic substances, including drugs or various pollutants present in the environment (polycyclic aromatic hydrocarbons, aromatic amines, etc.). CPR works as a transporter of electrons from NADPH to cytochromes P450. For proper interaction with cytochromes P450, intact N-terminal hydrophobic domain anchoring protein in the membrane, is needed. Removing this domain, e.g. during trypsin proteolysis, gives rise in soluble CPR (72 kDa) and causes loss of catalytic activity towards cytochrome P450. During heterologous expression in E. coli, proteolytically sensitive site of CPR (Lys56 – Ile57) is cleaved by intracellular trypsin-like proteases that may negatively affect the yields of the native 78 kDa protein. This study describes the gene manipulations, heterologous expression, purification and characterization of two forms of rat CPR. WtCPR is a protein naturally occurring in rats (Wistar strain), while mCPR contains one amino acid substitution (K56Q) in the site of proteolytic degradation, which results in proteolytically stable CPR, resistant to proteases with trypsin activity. Using the expression vector pET22b, both forms of CPR were expressed in E. coli BL21 (DE3) RIL cells. Employing ion exchange (DEAE Sepharose) and affinity (2‘5‘ ADP Sepharose) chromatography, the recombinant proteins were purified to homogeneity. Enzyme activity of wtCPR and mCPR was verified. Rat CYP1A1 reconstituted with wtCPR and mCPR was capable to oxidize Sudan I, a marker substrate of this CYP. Furthermore, both forms of CPR were capable of reducing cytochrome b5. Supported by GACR (P207/12/0627, P301/10/0356) and Charles University (UNCE #42)

171

POS TE RY

P123 PROPERITIES OF HUMAN DEHYDROGENASE/REDUCTASE (SDR FAMILY) MEMBER 7: ITS ORIENTATION IN THE MICROSOMAL MEMBRANE AND POSSIBLE ROLE IN BIOTRANSFORMATION OF DRUGS

POS TE RY

P125 LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY IDENTIFICATION OF MONEPANTEL METABOLITES FORMED IN VITRO AND IN VIVO BY SHEEP (OVIS SPECIES) Stuchlíková L., Vokřál I., Lamka J., Szotáková B., Bártíková H., Valát M., Skálová L. Department of Biochemical Sciences, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Monepantel, belonging to a new class of anthelmintic drugs known as amino-acetonitrile derivatives, was approved for use in veterinary practise in Czech Republic last year. So far, metabolism and transport of monepantel in targeted animals have been studied insufficiently, although the study of metabolic pathways of anthelmintics is very important for efficacy and safety of therapy and evaluation of risk of drug-resistance development in helminths. Therefore, the aim of our project was the identification of metabolic pathways of monepantel in lamb in vitro and in vivo. For in vitro study, primary culture of ovine hepatocytes was used. The hepatocytes, isolated by two-step collagenase perfusion of liver were immobilized in Petri dishes coated with collagen and incubated with monepantel (10µM). Medium samples and homogenates of hepatocytes were extracted separately using solid-phase extraction (SPE). The extracts were analysed using liquid chromatography- mass spectrometry (LC-MS) with electrospray ionization (ESI) in negative mode. In the in vivo study, monepantel (200mg/one animal) was administered orally to lambs. Urine was collected 8 and 48 hours after administration. Faeces were collected 48, 48-60, 60-72 hours after administration. The samples were homogenizated, centrifuged and extracted separately using SPE. The extracts were analysed using LC-MS with ESI in negative mode. The results showed that enzymatic systems in hepatocytes are capable to oxidize monepantel. Detected phase I metabolite comprised monepantel sulfone. From phase II metabolite, monepantel glucuronide was identified. Several metabolites of monepantel were also found in urine as well as in feaces. Based on obtained results, scheme of metabolic pathway of monepantel in sheep was proposed. This project was supported by Czech Science Foundation, grant No P502/10/0217 and by Grant Agency of Charles University, grant No 673612/B-CH/2012.

P126 INTERDELTA-PCR IDENTIFICATION OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAINS AND SCREENING OF THEIR OENOLOGICAL CHARACTERISTICS Šuranská H., Vránová D., Omelková J., Vadkertiová R. Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Institute of Food Science and Biotechnology, Purkyňova464/118, 612 00 Brno, Czech Republic; Institute of Chemistry, SAS, Dúbravskácesta 9, 845 38 Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Biotechnologie Many studies have shown that yeast strains have a great impact on the chemical complexity of wines. One of the most important technological advances in winemaking is the inoculation of grape must with selected cultures of Saccharomyces cerevisiae. Use of S. cerevisiae strains with distinct enological properties as a starter culture during production of commercialand homemade wine can improve wine complexity, quality and regional character. The aim of this study was to isolate autochthonous wine yeasts from distinct Moravian wine region (Czech Republic), to select Saccharomyces genus by application of PCR-based methods and to screen oenological character of different S. cerevisiae strains. For taxonomic identification of S. cerevisiae strains, we used ITS-PCR-RFLP method by application of HaeIII enzyme and interdelta-PCR by using δ1-δ2 primers. Total we isolated 119 strains and by interdelta analysis we distinguished 40 different S. cerevisiae strains. Furthermore, we determined oenological character of these strains – potential yeast properties that may influence the sensorial or technological properties of wine. We screened resistance to ethanol and SO2, osmotolerance, ability of utilize (degrade) malic and acetic acid. In addition we tested H2S production, flocculation and killer activity.Finally, based on our results the selected SEB1-09 strain with good properties will be used as a starter culture instead of commercial strain. By this way we can improve wine quality and keep regional character of the final product. Acknowledgements: This work has been supported bya FRVŠ project IS1793/2012 and FCH-S-11-7 project.

172

Svobodova B., Pekarova M. Oddělení Biochemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita, Kotlářská 267/2, 611 37 Brno, Česká Republika; Biofyzikální Ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká Republika [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Caveolae tvoří malé invaginace plasmatické membrány, které tvoří speciální skupinu lipidových raftů, bohatých na cholesterol a sfingolipidy a současně molekuly caveolinů. Jejich unikátní funkce spočívá zejména v přenosu signálů, které přicházejí k povrchu plasmatické membrány. Caveolae tudíž hrají nezastupitelnou úlohu v regulaci téměř všech buněčných procesů. Caveolae jsou bohaté na proteiny, které se nazývají caveoliny a slouží jako jejich základní strukturní jednotky. Do dnešní doby jsou známé tři geny kódující tři izoformy caveolinů: caveolin-1, -2, a -3. Zatímco caveolin-1 a -2 se hojně vyskytují zejména na adipocytech, endotelových buňkách, fibroblastech a buňkách hladké svaloviny, caveolin-3 se exprimuje zejména na příčně pruhované svalovině. Ačkoli je jejich funkce zkoumána již řadu let, doposud nebyl objasněn jejich vztah k rozvoji jak lokálního, tak systémového zánětu a s ním spojených onemocnění. Proto je tato práce zaměřena na zkoumání regulace exprese caveolinů u různých typů buněk (a to zejména v in vivo a ex vivo systémech). Data, která byla doposud naměřena ukazují, že exprese caveolinů se výrazně liší u jednotlivých buněčných typů izolovaných při peritoneálního zánětu indukovaném u myší in vivo. Zatímco u endoteliálních buněk se exprese caveolinu-1 zvyšuje, u makrofágů izolovaných z peritonea byl zaznamenán obrácený trend. U myších aort bylo také zjistěno, že caveolin-1 se přednostně exprimuje u endoteliálních buněk, které jsou v lumen cévy. U ostatních typů imunitních buněk byla zaznamenána různá exprese caveolinů, přičemž se všechny tři izoformy se podařilo potvrdit jen u peritoneálních makrofágů izolovaných z myší, přičemž aktivace buněk vedla dále ke změnám jejich exprese. Tyto data naznačují potenciální unikátní roli caveolinů v regulaci zánětlivé odpovědi organizmu.

P128 EVALUATION OF CLINICAL SIGNIFICANCE OF CARBONIC ANHYDRASE IX AS A TUMOR TISSUE VERSUS CIRCULATING BLOOD BIOMARKER Takáčová M., Bartošová M., Škvarková L., Zaťovičová M., Vidličková I., Breza J. Sr., Pastorek J., Pastoreková S. Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences; Center for Molecular Medicine, Slovak Academy of Sciences; Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University; Department of Urology, Derer‘s University Hospital, Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Carbonic anhydrase IX (CA IX) is expressed in tumor cells with hypoxic phenotype induced by low oxygen supply or by genetic modification(s) leading to activation of hypoxia-inducible factor 1 pathway. Since renal cell carcinomas (RCCs) are often associated with inactivating mutations in VHL tumor suppressor gene, expression of CA IX is strongly associated with RCC. The main goal of this study is to improve the understanding of CA IX that is strongly linked with kidney tumors and to elucidate its usefulness as a conclusive diagnostic and prognostic biomarker. CA IX expression was determined in blood and tissue samples from 74 kidney cancer patients using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting (WB) and immunohistochemistry (IHC). The CA IX status was related to RCC type and tumor stage. IHC and WB revealed significantly higher expression of CA IX in clear cell RCC (CCRCC) specimens than in other RCCs. In RT-PCR assay, 32.42% of all RCC patients possess CA9-positive cells in peripheral blood and three-quarters of CA9-positive patients were diagnosed with CCRCC. Decreased CA IX-positivity was observed with higher tumor stage (50% in T1 vs 17% in T3). Serum CA IX levels determined by ELISA were significantly higher in CCRCC patients than in non-CCRCC. Significant association between s-CA IX and CCRCC tumor stage was also determined (T1-87.51 vs T3-341.98 pg/ml, p=0.046). We demonstrated that the CA IX expression profiles in blood and tissue samples from 74 kidney cancer patients closely correlated with their histological subtypes. This is the first study reporting on CA IX expression in blood and tissue samples from kidney cancer patients determined by four different methods. Grant Support: Slovak Scientific Grant Agency VEGA (2/0152/12), Research & Development Operational Program funded by the ERDF (project ITMS 26240220062), 7th Framework program of EU (Collaborative project METOXIA).

173

POS TE RY

P127 ROLE CAVEOLAE A CAVEOLINŮ V REGULACI ZÁNĚTU

POS TE RY

P129 FUNKČNÍ VYŠETŘENÍ LEDVIN INOVACE ÚLOHY PRAKTICKÉHO CVIČENÍ STUDIJNÍHO PROGRAMU VŠEOBECNÉ LÉKAŘSTVÍ Teslová P., Zatloukalová M., Kosina P., Ulrichová J.,Vostálová J. Ústav lékařské chemie a biochemie LF UP, Olomouc [email protected] Sekce: Výuka biochemie Nezbytnou součástí výuky biochemie studijního programu Všeobecné lékařství na Lékařské fakultě Univerzity Palackého v Olomouci jsou praktická cvičení. Studenti jsou v těchto hodinách mimo jiné informováni o současných postupech v klinické biochemii, které jsou využívány k diagnostice zdravotního stavu pacientů. Rozhodli jsme se inovovat cvičení zaměřené na vyšetření funkce ledvin. Cílem bylo seznámit studenty s parametry, které se využívají k vyšetření funkce ledvin a k zjištění hodnoty glomerulární filtrace (GF) přímými a nepřímými metodami. Pro zjištění GF byla stanovena hladina kreatininu v plazmě a moči a hladina cystatinu C v plazmě. Ke stanovení hladiny kreatininu byla využita enzymatická metoda, která nahradila doposud používanou nespecifickou metodu založenou na Jaffého reakci. Cystatin C byl stanoven imunochemicky. Získané hodnoty byly použity jak k výpočtu GF, tak i k odhadu GF s využitím vybraných empirických rovnic. Dále bylo provedeno stanovení mikroalbuminurie, která je rychlým a citlivým parametrem časného poškození ledvin. Studenti měli možnost porovnat hodnoty GF získané přímou metodou (ze znalosti koncentrace kreatininu v plazmě a moči a objemu moči, která byla sbírána určité časové období) a nepřímou metodou (znalost koncentrace kreatininu či cystatinu C v plazmě). Studenti byli informováni o výhodách a nevýhodách stanovení GF oběma metodami a jejich současném využití v laboratorní medicíně. Úloha zaměřená na „Funkční vyšetření ledvin“ zvýšila informovanost studentů o současném stavu laboratorní diagnostiky onemocnění ledvin. Studenti budou moci využít získané vědomosti ve studiu a v praxi. Poděkování: Inovace praktických cvičení byla provedena díky finanční podpoře projektu FRVŠ 933/2012/G3.

P130 DETERMINATION OF CELL WALL BINDING DOMAIN OF ENDOLYSIN LYT µ1/6 ENCODED BY STREPTOMYCES AUREOFACIENS PHAGE µ1/6 Tišáková L., Farkašovská J., Godány A. Institute of Molecular Biology, SAS, Bratislava, Slovak Republic [email protected] Sekce: Biotechnologie Most phage endolysins targeting Gram-positive bacteria are reported as modular structures with at least two distinct functional domains, an N-terminal catalytic domain and a C-terminal cell wall binding domain. On the genome of actinophage µ1/6 a gene product of ORF50 was identified as a putative phage endolysin. The protein of endolysin Lyt µ1/6 (gp50) has a modular structure and consists of N-terminal enzymatically active domain (EAD) and C-terminal cell wall binding domain (CBD). A fusion between CBD and green fluorescent protein (GFP) is supposed to use fluorescence in order to visualize binding action of C-terminal domain on bacterial cell wall surface. The sequence of CBD in fusion with GFP will be cloned and expressed in E. coli. Its protein product will be purified to homogeneity by chromatographic procedures. Subsequently, the binding activity of CBD fusion product (LytCBD-GFP) will be demonstrated by specific binding assays to the cell wall surface of µ1/6 host Streptomyces aureofaciens. The results will provide the evidence on ability of CBD to sufficiently direct endolysin Lyt μ1/6 to the peptidoglycan of host cell surface, when applied exogenously. Acknowledgements: This work was supported by funding from the Scientific grant agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic and of Slovak Academy of Sciences (VEGA, grant no. 2/0140/11) and from the Slovak Research and Development Agency (grant no. APVV-0098-10).

174

Tóthová V., Kopáček J., Pastorek J., Pastoreková S. and Gibadulinová A. Deparment of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 9, 84505 Bratislava, Slovak Republic [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace S100P is a member of S100 proteins functioning as extracellular and/or intracellular regulators of diverse cellular processes and contributing to various human pathologies. S100P was originally identified in placenta and later linked to cancer. Its expression was detected in a range of human tumor cell lines and tissues, where it was connected with malignant phenotype, hormone independence and resistance to chemotherapy. Molecular mechanisms regulating expression of S100P in cancer cells are just starting to emerge. Association of S100P with outcome of tumor treatment and our preliminary data from S100P promoter analysis prompted us to study regulation of S100P expression by glucocorticoids, which are implicated in tumor response to chemotherapy. In this work we showed that dexamethasone (DX), a representative glucocorticoid, was capable to induce activity of S100P promoter by means of increased expression, nuclear translocation and transactivation properties of the glucocorticoid receptor (GR). Moreover, DX treatment led to decreased phosphorylation of ERK1/2, reduced transcriptional activity of AP-1, and modulated activity of some additional transcription factors. We identified a promoter region responsible for DX-mediated transactivation and proved GR binding to S100P promoter. We found that the effect of DX was enhanced by partial but not complete inhibition of the MAPK/ERK pathway, supporting an active crosstalk between GR and MAPK/ ERK signal transduction in control of S100P expression. The role of GR activation in S100P regulation was supported by co-expression of GR with S100P in cells treated with dexamethasone. These data suggest that S100P is a direct transcriptional target of glucocorticoid-mediated signaling in tumor cells that is activated through the interplay of GR and MAPK pathways. This work was supported by Research & Development Operational Program funded by the ERDF (ITMS 26240120027) and Slovak Scientific Grant Agency (VEGA 2/0172/11).

P132 ELECTROCHEMISTRY OF OSMIUM(VI)-MODIFIED CARBOHYDRATES Trefulka M., Bartošík M., Paleček E. Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic [email protected] Sekce: Glykobiochemie Compounds containing 1,2-diol groups, including oligo- and polysaccharides (Sachs) and 3‘-end of RNAs [1], were modified with complexes of sixvalent osmium with nitrogen ligands [Os(VI)L]. The most tested ligands were N,N,N´,N´tetramethylethylenediamine (temed) and 2,2´-bipyridine (bipy). We studied voltammetric behavior of Sachs-Os(VI)L aducts at hanging mercury drop electrode (HMDE) and pyrolytic graphite electrode (PGE) [2-4]. At HMDE, cyclic voltammograms (CVs) of Sachs-Os(VI)L showed three cathodic peaks Ic-IIIc and their anodic counterparts Ia-IIIa. Potential (Ep) of these peaks appeared in Ep range from 0 V to -1.1 V. In addition to these redox couples, peak IVc and peaks Vc and Va were observed by Sachs-Os(VI)L, using some ligands, e.g. bipy [5]. Both peaks V (Ep -1.2 V against Ag/AgCl/3 M KCl electrode) were assigned to the catalytic hydrogen evolution. These peaks were much higher than other less negative peaks. To improve the sensitivity of the determination, square wave (SWV) and differential pulse (DPV) techniques were used. Using AdS-SWV, peak Ic of dextran-Os(VI)temed was detectable down to 20 nM. With electrocatalytic peak Vc, using AdS-DPV, dextran-Os(VI)bipy and 3α,6α-mannopentaose-Os(VI)bipy were detectable down to 250 pM and 20 pM respectively (expressed as monosaccharide units content). CVs of Sachs-Os(VI)L at PGE differed from those at HMDE by absence of an equivalent of sharp peak Ic and catalytic peaks V, otherwise they were similar [2-4]. Acknowledgments GACR 301/10/P548 (MT), GACR P301/11/2055 and MEYS CR 09038 (EP) are gratefully acknowledged. References: [1] M. Trefulka, M. Bartosik, E. Palecek, Electrochem. Commun. 2010, 12, 17601763. [2] M. Trefulka, E. Palecek, Electroanalysis 2009, 21, 1763-1766. [3] M. Trefulka, E. Palecek, Electroanalysis 2010, 22, 1837-1845. [4] M. Trefulka, E. Palecek, Bioelectrochemistry 2012, DOI: 10.1016/j.bioelechem.2012.04.005. [5] E. Palecek, M. Trefulka, Analyst 2011, 136, 321-326.

175

POS TE RY

P131 GLUCOCORTICOID RECEPTOR – MEDIATED TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF CANCER RELATED PROTEIN S100P

POS TE RY

P133 STUDY OF THE PPGALNACT2 GLYCOSYLTRANSFERASE CATALYTIC MECHANISM BY QM/MM METHODS Trnka T., Kozmon S., Tvaroška I., Koča J. Masaryk University, CEITEC MU, Brno; Slovak Academy of Sciences, Institute of chemistry, Bratislava [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie Protein glycosylation is thought to be main means of cell recognition. Misregulation of the cascade of glycosyltransferases is related to many diseases with the most prominent example being cancer. There is thus significant scientific interest in the reaction mechanisms of glycosyltransferases because knowledge of transition state structures would enable targeted design of selective inhibitors usable as potential drugs. A retaining glycosyltransferase – polypeptide UDP-GalNAc transferase (ppGalNAcT) catalyses the transfer of N-acetylgalactosamine moiety onto protein serine or threonine hydroxyls, forming the first bond of the so-called O-linked glycosylation pathway. Increased activity of this enzyme has been found to enable metastasis of breast and colorectal cancer. Thanks to the availability of high-resolution X-ray structures of three members of the ppGalNAcT family (human transferases 2 and 10, murine transferase 1) we have been able to successfully mount a quantum chemistry study of the human ppGalNAcT2, leveraging information on substrate positioning in active site from the ppGalNAcT10. We are using a hybrid quantum mechanics/molecular mechanics approach using density functional theory on the BP86/TZP level for the important part of the active site. Structures in reactant and product energy minima have been successfully obtained, enabling a potential energy surface scan to find the locations of transition state candidates.

P134 REDIRECTED IMMUNOTHERAPY AS A NEW ANTITUMOUR STRATEGY Trnková K., Petrík J. Virologický ústav SAV, Bratislava [email protected] Sekce: Molekulární genetika Tumour therapy often shows limited effectiveness due to its low response to conventional treatments. A suitable strategy could be the development of brand new approaches based on different mechanisms of action. Immunotherapy is became an extremely important area of clinical therapeutics and recently has found its place also in cancer therapy. There are new possibilities that has been opened by identification of cancer antigens as suitable targets for immunotherapy. An alternative concept of the antitumour therapy might demonstrate a novel strategy called ReDIT (Re-Directed ImmunoTherapy), which is based on re-orienting existing long-lasting immune responses to widespread infections (e.g. induced by vaccination against measles virus) towards selected target molecules on the surface of malignant cells (e.g. tumor-associated antigens). The point of this idea is to redirected the existing immunity against measles virus to a new target with the help of bi-functional recombinant proteins. These constructs contain an antigen carrier part and a re-directing fragment. The antigen carrier part consists of the ectodomain of the measles hemagglutinin that can be recognized by antibodies and memory cells generated during previous infection or vaccination. The re-directing part can contain virus or tumor antigen-binding fragment. The fusion constructs are expected to boost existing anti-measles immunity and re-direct it against a new target. This study contributes to the important area of cancer immunotherapy – finding new approaches in the anticancer treatment. From our recent studies Re-DIT seems to be really perspective method in the therapy of cancer.

176

Turáková K., Lakatoš B., Berkeš D., Ďuriš A. Oddelenie biochémie a mikrobiológie FCHPT STU v Bratislave; Oddelenie organickej chémie FCHPT STU v Bratislave [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Akékoľvek narušenie precízne regulovanej homeostázy vápnika v bunkách vedie k rozličným odpovediam, bunkovú smrť nevynímajúc. Spôsob smrti je taktiež úzko spätý so zmenou cytosolovej koncentrácie Ca iónov. K zmenám v bunkovej homeostáze vápnika môže dochádzať aj pri hromadení niektorých komplexných lipidov. Typickým príkladom sú niektoré poruchy v metabolizme glykosfingolipidov, napr. Gaucherova choroba (hromadenie glukozylceramidu, GlcCer). GlcCer1 je prekurzor stovky rôznych glykosfingolipidov. Tento cerebrozid vzniká z UDP-glukózy a ceramidu za pomoci glukozyltransferázy, GlcCer syntázy (GCS). Takto vzniknuté sfingolipidy hrajú dôležitú úlohu v rôznych funkciách bunky, ako sú proliferácia, diferenciácia, vývoj a „cell-cell“ rozpoznávanie. Cieľom tejto práce bolo študovať účinok desiatich nových derivátov 1-fenyl-2-dekanoylamino-3-morfolino-1-propanolu (PDMP), známeho inhibítora GCS. Ich efekt na transport vápnika, viabilitu buniek a súčasne typ bunkovej smrti bol sledovaný na ľudských lymfocytoch a myšacích tymocytoch. Vtok Ca iónov bol sledovaný pomocou Fluo 3-AM, cytotoxický efekt bol určený MTT testom a typ bunkovej smrti bol charakterizovaný fluorescenčnou mikroskopiou. Zároveň bol testovaný ich účinok na aktivitu GCS in vitro. Získané výsledky ukázali, že sledované deriváty pôsobili odlišným spôsobom v závislosti od ich štruktúry a použitého typu buniek. Transport vápnika aj viabilita buniek boli výraznejšie ovplyvnené v ľudských lymfocytoch. Tento efekt bol závislý aj na koncentrácii jednotlivých derivátov, avšak nie vždy bol lineárny. Tymocyty boli voči pôsobeniu sledovaných látok odolnejšie, hoci aj v ich prípade dochádzalo k ovplyvneniu sledovaných parametrov. Typ bunkovej smrti vyvolanej pôsobením sledovaných derivátov bol porovnávaný s účinkom známych látok. Vo väčšine prípadov pôsobenie sledovaných derivátov viedlo ku nekróze, ale ich efekt nebol spojený so zmenami v transporte vápnika. Projekt bol podporený grantovou agentúrou VEGA č. 1/0471/11

P136 VYUŽITÍ DNA AMPLIFIKAČNÍCH METOD PRO DETEKCI GENŮ PRO HISTIDINDEKARBOXYLÁZU, TYROSIN-DEKARBOXYLÁZU A HYDROLÁZU ŽLUČOVÝCH SOLÍ U KMENŮ RODU LACTOBACILLUS Turková K., Rittich B., Španová A. Ústav chemie potravin a biotechnologií, Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně, Purkyňova 118, 61200, Brno [email protected] Sekce: Molekulární genetika Bakterie rodu Lactobacillus jsou často využívány v potravinářském průmyslu. Mezi významné probiotické vlastnosti kmenů patří produkce hydroláz štěpících žlučové soli. Mezi méně žádoucí vlastnosti patří produkce histidindekarboxylázy a tyrosin-dekarboxylázy, protože jejich činností dochází v potravinách k dekarboxylaci aminokyselin a ke tvorbě biogenních aminů (histaminu a tyraminu). Cílem práce byl screening kmenů rodu Lactobacillus, izolovaných z různých zdrojů, na přítomnost genů pro produkci hydrolázy žlučových solí (bsh), histidin-dekarboxylázy (hdc) a tyrosindekarboxylázy (tdc). DNA izolovaná ze 77 kmenů byla testována na přítomnost kompletního genu bsh o velikosti 975 bp pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a specifických primerů (Kaushik a kol. 2009), a na přítomnost fragmentu genů hdc o velikosti 440 bp a tdc o velikosti 1100 bp (Coton a Coton 2005). Produkty PCR byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy. Specifický PCR produkt o velikosti 975 bp byl detekován u 3 kmenů (L. plantarum CCM 7039T, L. plantarum RL26P a Lactobacillus sp. RL27P); specifický PCR produkt o velikosti 440 bp byl detekován u 5 kmenů (L. fermentum RL12PB, L. fermentum RL12, L. fermentum RL16, L. sp. RL7 a L. sp. RL7P) a specifický PCR produkt o velikosti 1100 bp byl detekován v DNA izolované z buněk kmene Lactobacillus sp. RL6P. Všechny specifické PCR produkty byly sekvenovány a jejich sekvence byla analyzována s použitím databáze BLAST. Sekvence byly přiřazeny k sekvencím genů v databázi s vysokou pravděpodobností. Produkce funkčních enzymů kódovaných geny pro histidin-dekarboxylázu, tyrosin-dekarboxylázu a hydrolázu žlučových solí je předmětem dalších testů.

177

POS TE RY

P135 OSUD BUNIEK VYSTAVENÝCH PÔSOBENIU NOVÝCH DERIVÁTOV INHIBÍTOROV GLUKOZYLCERAMID SYNTÁZY

POS TE RY

P137 FATTY ACID INDUCED METABOLIC CHANGES IN COLON CANCER CELLS Tylichová Z., Hofmanová J., Straková N., Kozubík A. Laboratory of Cytokinetics, Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Brno; Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, MU, Brno [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Colorectal cancer (CRC) is significantly influenced by the diet, especially by specific fatty acids. Our research was focused on metabolic changes induced by short-chain fatty acid sodium butyrate (NaBt), essential polyunsaturated ω-3 docosahexaenoic acid (DHA) and their combination in colon cancer cells with different grade of malignancy – human colon fetal (FHC) and adenocarcinoma (HT-29). Using fluorimetry and western blotting methods we investigated various cytokinetic parameters and found that NaBt decreased cell proliferation (CyQUANT), induced differentiation (alkaline phosphatase activity) and/or apoptosis (caspase-3 and PARP cleavage). Membrane lipid structure changes – lipid unpacking (Merocyanine 540), lipid droplet accumulation (Nile red) and oxidative metabolism (DHR-123) detected by flow cytometry were highly enhanced by combined NaBt/DHA treatment especially in FHC cells. Moreover, NaBt and NaBt/DHA decreased expression of Fatty Acid Synthase (FASN), which is often overexpressed in colon cancer cells, and increased activation (Luciferase assay), but decreased expression of peroxisome proliferatoractivated receptor γ (PPARγ), nuclear receptor mediating the effects of fatty acids on transcription level. Interestingly, activation of PPARγ correlates with increased caveolin-1 expression. In summary, our results suggest that fatty acids induced antiproliferative, differentiation and/or apoptotic effects are associated with specific cellular lipid alterations and metabolic changes in colon cancer cells. Supported by grants Nos. 303/09/H048 and P301/11/1730 of Czech Science Foundation and IGAMZ CR NT/11201-5.

P138 USING OF BFK20 ORIGIN REPLICATION FOR CONSTRUCTION OF PHAGE RESISTANCE CORYNEBACTERIAL STRAIN Ugorcakova J., Dubovecka L., Bukovska G. Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 21, 845 51 Bratislava, Slovak Republic [email protected] Sekce: Biotechnologie The predicted sequence of phage BFK20 origin of replication was used in study of PER phenotype of host strain Brevibacterium flavum CCM 251. The region with phage replication origin was cloned into the tetracycline resistance gene of E.coli vector pBR328. Strains B. flavum CCM 251 and Corynebacterium glutamicum RM3 were transformed by the recombinant plasmid pBOS1. The functionality of “shuttle” plasmid was approved by isolation of plasmid from corynebacteria and by the retransformation into E. coli. The presence of cloned segment on plasmid was verified by PCR reaction and by Southern hybridization. We have prepared two deletion derivatives pBOSdBM and pBOSdMS of plasmid pBOS1 to determine the minimal sequence of replication origin. We also tested the stability of plasmid pBOS1 in strains B. flavum CCM 251 and C. glutamicum RM3. The segregational stability of plasmid was nearly to 100% by passaging up to 20th generation in C. glutamicum RM3 and up to 16th generation in B. flavum CCM 251. The strains with plasmid were cultivated without the antibiotic selection pressure. Finally, the phage resistance of constructed corynebacterial strain of B. flavum CCM 251 against BFK20 infection was determined. The corynebacterial strains containing plasmid pBOS1 proved PER phenotype. Acknowledgement: This work was supported by the VEGA Grant 2/0110/11 and APVV-0098-10.

178

Vantová Z., Čižeková L., Grolmusová A., Paulíková H., Barbieriková Z. Oddelenie chemického a biochemického inžinierstva, ÚCHEI ; Oddelenie biochémie a mikrobiológie, ÚBVOZ; Oddelenie fyzikálnej chémie, ÚFCHCHF; FCHPT STU v Bratislave [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Fotodynamická terapia (PDT) je jednou z metód pre liečbu nádorových ochorení, ktorá spočíva v liečebnom použití svetla vhodnej vlnovej dĺžky a fotosenzibilizátora (PS), ktorý v prítomnosti kyslíka vedie k deštrukcii tkanív. Okrem klasických porfyrínových PS sa upriamuje pozornosť aj iné PS ako sú napr.: antrachinóny, xantíny, akridíny a ďalšie. V našom laboratóriu študujeme fotocytostatický potenciál skupiny 1´,1´´-(akridín-3,6-diyl)-3´,3´´-dialkylditiomočovín (AcrDTU). EPR metódou bolo zistené, že AcrDTU po ožiarení UV-svetlom produkujú voľné kyslíkové radikály (ROS). Fotocytostatický efekt AcrDTU sme testovali na myšacej leukemickej línii L1210. Zvýšenie cytotoxicity AcrDTU po ožiarení bolo potvrdené MTT testom: 0,5 μM propyl-AcrDTU (netoxická koncentrácia bez ožiarenia) znížil viabilitu ožiarených (5 min, λ= 365 nm) buniek na asi 65 % (48 h). Fotocytostatický efekt bol spojený aj s indukciou apoptózy v bunkách L1210 (detekcia DNA-rebríka po 4 h od ožiarenia). Hľadali sme možnosti ďalšieho zvýšenia fotocytostatického účinku týchto látok. Jednou z altenatív senzibilizácie nádorových buniek je inhibícia glykolýzy. Preto sme pre zvýšenie fotocytostatického efektu AcrDTU zvolili predinkubáciu L1210 buniek s inhibítorom hexokinázy 2-deoxy-D-glukózou (2-DG). Viabilita buniek predinkubovaných s netoxickou koncentráciou 2-DG (2,5 mM) po fotodynamickom efekte AkrDTU poklesla až na 10 %. Negatívne ovplyvnenie glykolýzy L1210 buniek sa ukázalo ako efektívny spôsob zvyšovanie fotodynamického účinku AkrDTU derivátov. Táto práca bola podporovaná projektom ŠF EÚ: 26240220071.

P140 PREPARATION OF CARBONIC ANHYDRASE IX RECOMBINANT ECTODOMAIN Vidlickova I., Zatovicova M., Tothova V., Levarski Z., Stuchlik S., Pastorekova S. Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Mlynska dolina 84215 Bratislava, Slovakia; Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 9, 84505 Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Biotechnologie Carbonic anhydrase IX (CA IX) is a transmembrane, tumor-associated, strongly hypoxia-inducible protein that catalyzes the reversible conversion of carbon dioxide to bicarbonate and proton. Extracellular CA IX domain (ECD) is shed from the cell surface in proteolytic manner by a regulated process responding to physiological factors and is detectable in body fluids of cancer patients. To investigate the unknown biological functions and the target structure of ECD, as well as for producing ECD CA IX standard required for the detection platform, the preparation of recombinant equivalent was necessary. Here, we describe the preparation procedure of recombinant DNA and stable eukaryotic cell lines (NS0), capable of producing recombinant ECD CA IX in the culture medium, as well as protein purification procedure. Accurate concentration of CA IX soluble form can be measured by sandwich ELISA. Conditioned media will be used in research of ECD CA IX functions in intercellular interactions. Grant Support: 7th Framework program of EU (Collaborative project METOXIA), Research and Development Support Agency (APVV-DORP-0017-09), Research & Development Operational Program funded by the ERDF (ITMS 26240220062), Slovak Scientific Grant Agency (VEGA 2/0134/12).

179

POS TE RY

P139 ZVÝŠENIE FOTODYNAMICKÉHO EFEKTU AKRIDÍNOVÝCH DERIVÁTOV OVPLYVNENÍM ENERGETICKÉHO METABOLIZMU NÁDOROVÝCH BUNIEK

POS TE RY

P141 IN SILICO ANALYSIS OF DOMAIN ARRANGEMENTS TYPICAL FOR AVAILABLE ENDOLYSIN SEQUENCES Vidová B., Farkašovská J., Godány A. Institute of Molecular Biology SAS, Bratislava, Slovakia [email protected] Sekce: Bioinformatika a výpočetní biochemie Bacteriophages, viruses that infect bacteria, have evolved a lytic system to disrupt the bacterial cell wall, resulting in bacterial lysis. Enzymes that participate on this lysis, endolysins, are a class of anti-infective agents with very high potential for control bacteria in different environments, where multiresistant pathogens are a serious problem. The targeted designing of endolysins is therefore hold a challenge in. These enzymes are composed of domain or combination of domains, that could be improved by mutagenesis, domain swapping of gene shuffling. The domain organization of endolysins differ in dependance of Gram-type of bacteria. Endolysins of Gram-negative origin generally consist of an enzymatic domain alone. While Gram-positive ones are modular and combine an N-terminal lytic domain, with catalytic activity, and a C-terminal binding domain that can recognize various epitopes within the target cell envelope. In this work we have focused to in silico characterization of domains present in sequences of endolysins, as well as the variety of combinations that compose individual endolysins up to date. The multiple sequence alignment of here tested set of endolysin sequences revealed in recognition of sequence types with typical domains arrangement, divided according to target substrate in bacterial cell walls. Interestingly, five protein families of catalytic domains are occuring in dependance of bacterial Gram-type. The presence of binding motifs within endolysin sequences was also studied. Obtained observations could be helpful for potential directed design of endolysins with the desired properties. This work was supported by funding from the Scientific Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic and of Slovak Academy of Sciences (VEGA, grant no. 2/0140/11) and from the Slovak Research and Development Agency (grant no. APVV-0098-10).

P142 AKTIVITA H(+)-PUMPY KONTROLUJE TRANSPORT ŽIVÍN POČAS KLÍČENIA VLÁKNITEJ HUBY TRICHODERMA ATROVIRIDE Vilímová V., Maťaťa M., Olejníková P., Hudecová D., Varečka Ľ., Šimkovič M. Oddelenie biochémie a mikrobiológie, FChPT STU Bratislava [email protected] Sekce: Membránová biochemie a bioenergetika Konídie sú asexuálne spóry, ktoré sa tvoria v špecializovaných bunkách a u väčšiny vláknitých húb (VH) predstavujú dôležitú časť životného/reprodukčného cyklu. Okrem toho, že konídie chránia genóm VH počas nepriaznivých podmienok prostredia, zároveň vďaka ich povrchovým vlastnostiam slúžia tieto dormantné bunkové formy na ich účinne rozptýlenie do širokého prostredia. Za optimálnych podmienok prostredia dochádza ku klíčeniu konídií, prechodu z dormatného stavu, pre ktorý je typický znížený metabolizmus, do stavu plnej metabolickej aktivity charakteristickej pre vegetatívne VH. Proces klíčenia iniciuje široké spektrum metabolických aktivít a morfologických zmien, z ktorých najvýraznejšou je tvorba zárodočnej hýfy. Tieto biochemické zmeny si v dôsledku metabolického obratu látok vyžadujú zvýšený prísun čerstvých živín. VH z rodu Trichoderma patria medzi deuteromycéty, ktoré sa v praxi využívajú v poľnohospodárstve na ochranu biologicky významných plodín pred negatívnymi účinkami fytopatogénnych húb a hrčkotvorných nematód. Štúdium homeostázy Ca(2+) iónov a aktivity H(+)-pumpy u T. atroviride ukázali, že transport Ca(2+) je úzko spätý s homeostázou H(+) a závisí od vývojového štádia huby. Prezentovaný projekt sa venuje charakterizácii transportu živín počas klíčenia T. atriviride. Merania transportu rádioaktívne značených prekurzorov esenciálnych pre syntézu biopolymérov ukázali, že transport živín do mycélia divého a PMA1 mutantného kmeňa T. atroviride je závislý od aktivity H(+)-pumpy v cytoplazmovej membráne a mení sa v závislosti od štádia klíčenia huby. Táto práca bola podporená grantovými agentúrami VEGA (1/0854/11), APVV (APVV-0642-07) a spolufinancovaná z zo zdrojov EÚ (ITMS 26240120016).

180

Vokurková M., H. Rauchová H., Pavelka S., Behuliak M., Soukup T., Tribulová N. Institute of Physiology AS CR in Prague; Institute for Heart Research SAS in Bratislava [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Epidemiological studies demonstrate that n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) consumption is associated with a reduced risk of atherosclerosis and hyperlipidemia. It is also known that thyroid hormones influence lipid metabolism and oxidative stress. The aim of our study was to test if n-3 PUFA supplementation (200 mg/kg of body weight/day for 6 weeks) can affect lipid metabolism and parameters of oxidative stress in the liver in Lewis rats with different thyroid status. Euthyroid, hyperthyroid and hypothyroid status of experimental groups was defined by the levels of the thyroid hormones and by the activity of a marker enzyme of the thyroid status, i.e. liver mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5). We found that the hypothyroid rats displayed significantly increased serum levels of total cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol in comparison with the euthyroid or hyperthyroid rats. Hypothyroidism was also associated with increased liver content of reduced glutathione and hyperthyroidism with decreased content indicating difference in antioxidant potential. In conclusion, our data suggest that 6-week 200 mg/kg PUFA administration in the adult male Lewis strain rats has not any effect on the analyzed parameters of lipid metabolism and of the oxidative stress regardless of the thyroid status. None the less, even if our protocol did not lead to significant changes of analyzed parameters, the effect of PUFA on lipid metabolism and the oxidative stress in rat livers cannot be excluded if higher doses and/or longer administration will be used. This work was supported by the GACR 304/08/0256, 304/12/0259 and Ministry of Education, Youth and Sport APVV-SK-CZ-0027-11 and by the Research project AV0Z 50110509.

P144 VLIV STÁRNUTÍ NA AKTIVITU A EXPRESI VYBRANÝCH BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ V JÁTRECH POTKANA Vyskočilová E., Boušová I., Szotáková B. Katedra biochemických věd, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta, Hradec Králové [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Aktivita biotransformačních enzymů [např. cytochromu P450 (CYP), glutathion-S-transferasy (GST)] se v průběhu života mění, zpravidla je u velmi mladých a starých jedinců aktivita nižší než v období dospělosti. Na snížení aktivity ve stáří se podílí fyziologické změny, jako snížený průtok krve játry a ledvinami, snížená hmotnost jater a zvýšené zásoby tuku v těle. Ke zhoršování funkcí mnoha tkání a orgánů během stárnutí dochází také díky kumulaci reaktivních forem kyslíku (ROS). Zvýšená aktivita antioxidačních enzymů (např. peroxidasy, katalasy) v průběhu stárnutí tedy souvisí se zvýšenou produkcí ROS. Cílem práce bylo sledovat změny v aktivitě a expresi několika jaterních biotransformačních a antioxidačních enzymů u potkanů v souvislosti s věkem. Potkaní samci kmene Wistar byli utraceni ve věku 6 týdnů a 20 měsíců (6 jedinců v každé skupině) a jejich játra byla zpracována na subcelulární frakce (mikrosomy a cytosol), v nichž byly stanoveny specifické aktivity GST, CYP1A, CYP2B a CYP3A, peroxidasy a katalasy a také exprese GSTA. Ke stanovení aktivity enzymů jsme využily spektrofotometrické (GST, katalasa, peroxidasa) a spektrofluorimetrické metody (CYP). Exprese GST byla sledována pomocí imunoblotingu se specifickou protilátkou proti GSTA a normalizována na množství β-aktinu. Specifická aktivita GST byla u 20-ti měsíčních potkanů téměř šestinásobně zvýšená, což bylo provázeno také zvýšením exprese tohoto enzymu. Naproti tomu specifické aktivity CYP a katalasy se s rostoucím věkem snižovaly (např. specifická aktivita CYP2B klesla 4,5x). V aktivitě peroxidasy v průběhu stárnutí nebyly pozorovány statisticky významné změny. Získané výsledky mohou přispět k pochopení změn v metabolismu xenobiotik v průběhu stárnutí, které mohou být vyvolány změnami v aktivitě a expresi biotransformačních a antioxidačních enzymů. Poděkování: Práce byla realizována s finanční podporou Grantové agentury ČR (grant P303/12/G163).

181

POS TE RY

P143 DOES N-3 POLYUNSATURATED FATTY ACIDS SUPPLEMENTATION CHANGE LIPID METABOLISM AND/OR OXIDATIVE STRESS IN RATS WITH DIFFERENT THYROID STATUS?

POS TE RY

P145 PROBING OF INTERACTIONS BETWEEN AMELOBLASTIN AND AMELOGENIN, TWO INTRINSICALLY DISORDERED EXTRACELLULAR MATRIX PROTEINS FORMING TOOTH ENAMEL Wald T., Osickova A., Sulc M., Bumba L., Rezabkova L., Slaby I., Vondrasek J., Osicka R. Institute of Microbiology of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Videnska 1083, CZ-142 20 Prague, Czech Republic; Institute of Biotechnology of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Videnska 1083, CZ-142 20 Prague, Czech Republic; Faculty of Science, Charles University, Hlavova 2030, CZ-128 43 Prague, Czech Republic [email protected] Sekce: Struktura a funkce biomolekul Tooth enamel, the hardest substance in the body, is formed by the highly conserved biomineralization process that is controlled by extracellular matrix proteins. It was suggested that these component proteins must have specific protein–protein interactions to assemble an organic matrix competent to undergo mineral replacement and to form the highly ordered three-dimensional structure of the hydroxyapatite crystallites. All the proteinaceous components are individually essential for correct enamel formation, but how they interact together at the molecular level to form the highly organized and mineralized enamel structure is unknown. Amelogenin and ameloblastin, belonging to the intrinsically disordered protein family, are the most abundant proteins of the developing enamel. Amelogenin plays an essential role in the structural organization and mineralization of the enamel by stabilization the mineral prenucleation clusters. Ameloblastin is well conserved among species and constantly present throughout evolution and ontogenesis of mineralized tissues. Using ameloblastin-null mice it was suggested that ameloblastin is a cell adhesion molecule, which is required for maintaining the differentiation state of secretory stage ameloblasts by binding to ameloblasts and inhibiting proliferation. Using different biophysical and biochemical approaches, we revealed that ameloblastin, similarly to amelogenin, undergoes a self-assembly process to generate high molecular weight structures. Deletion mutagenesis identified the ameloblastin oligomerization region localized in the N-terminal domain of the molecule. Moreover, the recombinant ameloblastin was shown to interact with amelogenin, using surface plasmon resonance, microscale thermophoresis and chemical cross-linking. These experiments confirmed mutual interaction between ameloblastin and amelogenin that was suggested to occur in the developing enamel, but controversial results were obtained in this area in past two decades.

P146 NOVEL RECOMBINANT THERMOPHILIC α-L-RHAMNOSIDASE Weignerová L., Gerstorferová D., Marhol P., Křen V. Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic [email protected] Sekce: Biotechnologie α-L-Rhamnosidase (EC 3.2.1.40) is a biotechnologically important enzyme used for derhamnosylation of many natural compounds. The extracellular α-L-rhamnosidase was purified from the culture of Aspergillus terreus grown on α-L-rhamnose-rich medium. This enzyme was found to be thermo- and alkali-tolerant, able to operate at 70°C and pH 8.0. The α-L-rhamnosidase cDNA was cloned from A. terreus, sequenced, and expressed in the yeast Pichia pastoris as a fully functional protein. The recombinant protein was purified to apparent homogeneity and biochemically characterized. Both the native and the recombinant α-L-rhamnosidase catalyzed the conversion of rutin into quercetin3-glucopyranoside (isoquercitrin), a pharmacologically significant flavonoid usable in nutraceutics. This procedure has high volumetric productivity (up to 300 g/L) and yields the product void of unwanted quercetin. The significant advantage of our expression system consists in shorter production times, up to fourfold increase in enzyme yields and the absence of unwanted β-D-glucosidase as compared to the native production system. Thanks to its unique properties, this enzyme is applicable in a selective synthesis/hydrolysis of various rhamnose containing structures. This project was supported by EU project FP7-KBBE-2010-4 BIONEXGEN – grant agreement No. 266025 (MSMT 7E11010), and by the Institute's research concept RVO61388971.

182

Zapletalová M., Fojtíková M., Matušková Z., Špičáková A., Anzenbacher P.; Anzenbacherová E. Ústav farmakologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci, Hněvotínská 3, 775 15, Česká republika; Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci, Hněvotínská 3, 775 15, Česká republika [email protected] Sekce: Xenobiochemie a toxikologie Řada látek přírodního původu se používá jako nutraceutika. Jedná se o cizorodé látky, u kterých se předpokládá pozitivní vliv na lidské zdraví. Anthokyanidiny patří mezi flavonoidy s významnými antioxidačními vlastnostmi. Vzhledem k příznivým účinkům anthokyanidinů na stav organismu je třeba znát obsah účinných látek v přípravcích a perspektivně studovat jejich vliv na metabolismus léčiv a zejména možnost vzniku lékových interakcí. Byla zavedena metoda ke stanovení šesti nejběžněji se vyskytujících anthokyanidinů – delfinidinu, kyanidinu, malvidinu, petunidinu, peonidinu a pelargonidinu. Metoda vychází z práce Dursta a Wrolstada (Durst, RW, Wrolstad RE, Curr Protocols Food Anal Chem, 2001). Stanovení anthokyanidinů bylo provedeno ve vzorcích extraktů vinné révy (Vitis vinifera) a brusinek velkoplodých (Vaccinium macrocarpon). Vzorky byly analyzovány za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). V extraktu z Vaccinium macrocarpon byly stanoveny anthokyanidiny kyanidin a peonidin, v extraktu vzorku Vitis vinifera anthokyanidiny delfinidin, kyanidin, petunidin, peonidin a malvidin. Metoda je spolehlivá a umožňuje stanovení anthokyanidinů ve vzorcích běžně dostupných extraktů anthokyanidinů. V dalších krocích pak byl studován vliv extraktu z Vaccinium macrocarpon na metabolické přeměny modelové látky (warfarin) prostřednictvím různých forem jaterního cytochromu P450 u potkana. Autoři děkují za finanční podporu grantům GAČR P303/12/G163, GAČR 303/09/H048 a grantu LF UP LF_2012_004.

P148 INDUCTION OF TUMOR CELL DEATH BY CYTOTOXIC COMPOUNDS IS ASSOCIATED WITH SHEDDING OF THE HYPOXIA-RELATED CARBONIC ANHYDRASE IX Zatovicova M., Vidlickova I., Supalova L., Dequiedt F., Ditte P., Pastorek J., Pastorekova S. Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dubravska cesta 9, 84505 Bratislava, Slovak Republic; Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University, Mlynska dolina, 84215, Bratislava, Slovak Republic; University of Liege, Cellular and Molecular Biology Unit, Gembloux Agro-Bio Tech, B-5030 Gembloux, Belgium [email protected] Sekce: Buněčná signalizace a regulace Carbonic anhydrase IX (CA IX) is a tumor-associated, highly active carbonic anhydrase isoform that is regulated by hypoxia and functionally involved in pH regulation and in cell adhesion. We have previously shown that extracellular domain (ECD) of this transmembrane glycoprotein can be shed to extracellular space in a metalloproteinase-dependent manner and identified TACE/ADAM17 as an enzyme responsible for induced cleavage of CA IX ECD. Here we analyzed shedding of CA IX ECD in cells undergoing cell death in response to inhibition of macromolecular synthesis by cycloheximide and to chemotherapeutic drug doxorubicin using flow cytometry and immunoblotting to correlate expression of CA IX with the extent of cell death. We found that CA IX-positive CGL3 cell subpopulation was less vulnerable to induction of cell death than CA IX-negative subpopulation. On the other hand, expression of CA IX showed a tendency to decrease and this decrease preceded or accompanied progression of the cell death process suggesting involvement of ECD shedding. This was confirmed by treatment with metalloproteinase inhibitor batimastat, which resulted in reduced level of CA IX ECD in culture medium when compared to non-treated cells. Similar effect could be observed using monoclonal antibody V/10 specific for the extracellular catalytic domain of CA IX. However, inhibition of CA IX ECD release affected neither time course, nor extent of cells death suggesting that induced CA IX ECD shedding is a consequence of cell death, possibly due to global activation of cell surface proteases, but does not directly contribute to its control in this experimental setting. Grant Support: 7th Framework program of EU (Collaborative project METOXIA), Research and Development Support Agency (APVV-DORP-0017-09), Research & Development Operational Program funded by the ERDF (ITMS 26240220062), Slovak Scientific Grant Agency (VEGA 2/0134/12).

183

POS TE RY

P147 STANOVENÍ ANTHOKYANIDINŮ V NUTRACEUTICÍCH

POS TE RY

P149 CELLULASE IMMOBILIZED BY ADSORPTION ON POROUS POLYETHYLENE TEREPHTHALATE Zichová M., Omelková J., Stuchlíková O. Faculty of Chemistry, Brno University of Technology [email protected] Sekce: Biotechnologie Cellulase from Trichoderma reesei was irreversibly adsorbed on polyethylene terephthalate in a 0.1 M acetate buffer solution of pH 4,8. Immobilization of the enzyme resulted in lowering of its activity, the measure of which depended on the amount of the enzyme fixed on the carrier. The highest relative activity had the preparation containing 0.04 ml of the enzyme per 1 g of the carrier. The pH optimum, temperature optimum, thermal stability and pH stability of the immobilized preparation were determined. Cellulase immobilized in a 0.1 M acetate buffer was characteristic of its high stability during a long-lasting storage at 4 °C and of its operational stability.

P150 DETEKCE A CHARAKTERIZACE CIRKULUJÍCÍCH NÁDOROVÝCH BUNĚK U PACIENTŮ S KASTRAČNĚ REZISTENTNÍM KARCINOMEM PROSTATY Zima T., Mikulová V., Soukup V., Čapoun O., Hanuš T., Honová H., Šírová M. Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, Všeobecná fakultní nemocnice v Praze a 1. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy Praha; Urologická klinika Všeobecné fakultní nemocnice v Praze a 1. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy Praha; Onkologická klinika Všeobecné fakultní nemocnice v Praze a 1. Lékařská fakulta Univerzity Karlovy Praha; Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky [email protected] Sekce: Patobiochemie a klinická biochemie Cirkulující nádorové buňky (CTC) jsou nedílnou součástí metastatického procesu. Právě přítomnost metastáz je jednou z charakteristik kastračně rezistentního karcinomu prostaty (CRPC) a důvodem, proč u těchto pacientů CTC studujeme. Kvantifikace CTC v krvi pacientů může sloužit jako prognostický marker a ukazatel účinnosti terapie. Zjištění dalších charakteristik CTC pak může být využito k personalizaci terapie, která je u nádorových onemocnění velmi podstatná. Metodou imunomagnetické separace (AdnaGen) jsme z periferní krve pacientů získali obohacenou frakci CTC, ze které jsme izolovali mRNA. Pomocí PCR metod jsme zjišťovali přítomnost vybraných epiteliálních a tumor-asociovaných markerů, které znamenají přítomnost CTC ve vzorku. Toto vyšetření jsme prováděli před zahájením léčby i v jejím průběhu. Z periferní krve jsme také izolovali frakci mononukleárních buněk, ve které by měly být CTC přítomny. Frakci jsme kultivovali, abychom získali větší množství buněk pocházejících z CTC. Pro takové buňky se nabízí mnoho možností jejich dalšího zkoumání např. imunofluorescenční metody. Vyšetření CTC jsme doposud provedli u 7 pacientů, jejichž věk byl v rozpětí 71 – 80 let. Pacienti měli přítomny metastázy v kostech a hladina prostatického specifického antigenu (PSA) před počátkem chemoterapie byla v rozsahu 26 – 223 ng/μl. U všech pacientů byla zjištěna přítomnost CTC v krvi. Ze sledovaných markerů byla ve všech vzorcích naměřena vysoká míra exprese PSA. Další markery byly exprimovány v menší míře a jen u některých pacientů. Kultivované CTC v médiu pravděpodobně přežívají, ale vykazují jen velmi slabé známky růstu. Výsledky genové exprese u CTC potvrdily heterogenitu CTC, která by mohla být klíčem k cílené léčbě a personalizaci terapie u pacientů. Při opakovaných odběrech se také potvrdilo, že množství CTC v periferní krvi se v průběhu terapie mění. K úspěšné kultivaci CTC využijeme podpůrné buňky či kultivaci na podkladu imitujícím mezibuněčnou hmotu.

184

POS TE RY

185

AUTORSKÝ POS TE RYREJSTŘÍK

AUTORSKÝ REJSTŘÍK V autorském rejstříku jsou uvedeni pouze první autoři všech sdělení. Andrýs R.

110

Dejmková E.

118

Antalíková J.

110

Demo G.

Anzenbacher P.

103

Dianovská D.

119

Arumughan A.

94

Ditte P.

119

Banáš P.

54

Dopitová R.

91

Barák I.

68

Dupejova J.

120

58

Barančík M.

111

Ďuračková Z.

Bártíková H.

111

Dvorská A.

120

Bartošík M.

53

Eckschlager T.

106

97

Feckova L.

121

Fedunova D.

121

Bařinka C. Bauer Ľ. Bednářová K.

112

99

38

Foret F.

50

Bertók T.

112

Franc V.

122

Bláha J.

46

Franke L.

122

Bocánová L.

113

Bocková M.

62

Friedecký D.

88

Friml J.

30

Boháčová V.

113

Frnková K.

38

Bolotin D.

77

Fučíková J.

33

Borovanský J.

84

Fulneček J.

52

Bouchal P.

86

Gajdova S.

123

Brabec V.

51

Galandáková A.

123

Breier A.

103

Gibalová L.

124

Brtko J.

79

Glejtková M.

124

Brychtová V.

64

Göselová S.

125

Brynychová V.

78

Grave L.

125

Bubenčíková T.

114

Gregušová B.

126

Groh T.

126 127

Bumba L.

97

Bystrický P.

114

Gudernová I.

Cerovska N.

115

Hájek M.

127

Cesnekova J.

116

Halászová H

128

Coufalová L.

41

Halgašová N.

128

Crhová M.

42

Hansíková H.

82

Cupperová P.

117

Hároniková A.

129

Čech P.

115

Hartmanová T.

129

Činčárová L. Danihlík J. Darmostuk M.

86

Hegyi H.

56

118

Hejzlarová K.

75

47

Hnyluchová Z.

130

186

Hodek P.

104

Kořený L.

73

Holub D.

89

Kosina P.

139

Homola J.

49

Kostinová A.

140

Horváthová M. Houser J. Hoyerová K.

130

Kotyza J.

84

98

Kovaľ T.

95

90

Kovářová N.

140

Hraběta J.

131

Kožich V.

Hromadová L.

131

Krajňáková L.

Hudeček J.

106

Kralovičová Z.

141

Kratochvílová H.

142

Hurba O. Chalupová J.

81

82 141

116

Kříž M.

39

Chomova M.

117

Kubala L.

83

Illésová A.

132

Kubala L.

142

Indra R.

132

Kubicek K.

95

Ionescu C-M.

57

Kubienová L.

143

Ionescu C-M.

133

Kučera J.

143

Jágr M.

89

Kuchař M.

62

Jahnová J.

93

Kulhánek P.

144

Jáchymová M.

78

Kunická T.

44

Jaiswal D. Jaká P. Jamroškovič J. Jančaříková G.

133 74 134

Kysel P.

144

Lajdová I.

145

Laubertová L.

145

43

Lauková J.

146

Janočková J.

134

Levarski, Z.

60

Janoš P.

135

Levová K.

146

Javůrková B.

135

Lišková P.

147

Ježovičová M.

136

Lochmanová J.

Jiríčková K.

136

Lounková A.

Kádek A.

79 45

87

Lovecká P.

147

Karelová K.

137

Lundová T.

148

Kavková E.

137

Machala M.

105

Klímová H.

101

Malbohan, I. M.

102

Kmoch S.

85

Malinovská L.

70

56

Malinovská L.

148

Koča, J. Koláček M.

138

Marhavy P.

Kollinerová S.

138

Maršálová L.

41

44

Martínek V.

149

Martínková M.

107

Komárek J. Kopál M. Kormanec J.

139 67

Mašín J.

187

90

66


AUTORSKÝ REJSTŘÍK

AUTORSKÝ POS TE RY REJSTŘÍK

AUTORSKÝ REJSTŘÍK Maťaťa M.

149

Petřivalský M.

Mertlíková-Kaiserová H.

150

Písačková J.

47

61

Plačková P.

158

Mocanu M. M.

151

Pláteník J

83

Mocanu M. M.

150

Plevová K.

77

Moricová P.

151

Plšíková J.

159

Moserová M.

152

Pohlová L.

159

Motlová L.

152

Pokorná M.

160

Mráček T.

75

Poláchová E.

160

Mrazek H.

153

Polanská E.

45

Mrázková J.

153

Polek B.

161

Mikulecký P.

102

Muchová V.

92

Poljaková J.

161

Muravská A.

154

Pompach P.

69

Nahálka J.

72

Pravenec M.

74

Nečasová I.

42

Procházková K.

Nižnanský L.

66

Prouzová P.

162

Nosková L.

34

Pucholtová H

162

Nováček J.

43

Radvák P. P.

65

Novotná Š.

39

Rajdl D.

101

31

Rauchová H.

163

154

Rimpelová S.

163

Novotny M. V. Nůsková H. Obšil T. Ogrocká A.

94

Rylová G.

93

Sedlackova H.

96

87 48

Ondrušková N.

155

Sedláček V.

165

Ondrušová L.

155

Sevcikova B.

166

Oriešková M.

156

Siposova K.

167

Oslanecová L.

156

Skládal P.

Paceková J.

80

Pakostová E.

157

50

Slavkovský R.

169

Spáčilová J.

170

Paleček E.

49

Spiwok V.

55

Parnica J.

157

Staněk O.

63

64

Sterba J.

70

Pastorekova S. Paulová H.

100

Stiborová M.

Pavliš O.

158

Stiburek L.

76

Pecina P.

76

Stráňava M.

171

Pekarova M.

67

Střelcová Z.

Pešta M.

85

Stuchlíková L.

172

Petrik S.

40

Sulimenko V.

51

Petříčková K.

59

Sulová Z.

71

188

105

46

Svobodova B.

173

Vaněk O.

72

Svobodová Vařeková R.

57

Vantová Z.

179

Sýkorová E.

92

Věchtová P.

80

Šafránková B.

164

Vidlickova I.

179

Šándorová E.

164

Vidová B.

180

Šedivá A.

165

Vilímová V.

180

Šereš M.

166

Vokurková M.

181

Škarydová L.

167

Vyskočilová E.

181

Škarydová L.

168

Wald T.

182

Škuta C.

168

Weignerová L.

59

Šmídková M.

169

Weignerová L.

182

Šoltészová B.

170

Woods Roberts J.

Šponer, J. Štambergová H. Šulák O. Šuranská H. Takáč T.

54

Wsól V.

171

Zábrady M.

32

Zapletalová M.

183

Zatovicova M.

183

35 173

Tarkowski P.

88

Zbořil P.

184

Zima T.

184

174

Žďárská M.

Tišáková L.

174

71

Tóthová V.

175

Trefulka M.

175

Trnka T.

176

Trnková K.

176

Trnková L.

52

Tuháčková Z.

65

Turáková K.

177

Turková K.

177

Turňa J.

60

Tvaroška I.

69

Tylichová M.

96

Tylichová Z.

178

Ugorcakova J.

178

Ulrichová J.

61 100

Vacha R.

55

Valachovič M.

73

189

99

Zichová M.

Teslová P.

Ulbrich P.

40

172

Takáčová M.

Tkac J.

30 104

91


AUTORSKÝ REJSTŘÍK

POS TE RY POZNÁMKY

190

POZNÁMKY POS TE RY

191

POS TE RY ISBN 978-80-86313-34-4 Název: Sborník přednášek a posterů, program Autoři: doc. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. Mgr. Veronika Papoušková doc. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D. Mgr. Martina Pokorná, Ph.D. Vydavatel: JPM Tisk s.r.o. Vazba: V2 Vydání: 1 Měsíc a rok vydání: srpen 2012 192

SPONZOŘI SEKCÍ BIOTECHNOLOGIE

BUNĚČNÁ SIGNALIZACE A REGULACE

GLYKOBIOCHEMIE

MOLEKULÁRNÍ GENETIKA

PROTEOMIKA A METABOLOMIKA

STRUKTURA A FUNKCE BIOMOLEKUL

VÝUKA BIOCHEMIE

DALŠÍ SPONZOŘI SPONZOR SPOLEČENSKÉHO VEČERA

SPONZOR CENY ZA NEJLEPŠÍ POSTER

SPONZOR ZASEDÁNÍ VÝBORU ČSBMB A SSBMB

SEZNAM VYSTAVUJÍCÍCH FIREM

www.absciex.com

www.beckman.cz

www.bio-port.cz

www.bio-rad.com

www.biotech.cz

www.biovendor.cz

www.caymanpharma.com

www.chromservis.eu

DONAU LAB PRAGUE

www.clonestar.cz

www.dialab.cz

www.dispolab.cz

www.donaulab.com

www.englisheditorialservices.com

www.eppendorf.com

www.eurexmedica.cz

www.genetica.cz

www.gryf.eu

www.karolinaexpress.cz

www.krd.cz

www.labmark.cz

www.lifetechnologies.com

www.medesa.cz

www.megabooks.cz

www.merckmillipore.cz

www.mt.com

www.mgp.cz

www.pragolab.cz

www.roche-diagnostics.cz

...řešení pro vaši laboratoř

www.schoeller.cz

www.sigmaaldrich.com

www.sipoch.cz

www.trigon-plus.cz

www.unimed.cz

www.vitrum.cz

www.waters.com

www.csbmb.cz

ORGANIZAČNÍ SEKRETARIÁT SJEZDU Congress Business Travel, s.r.o.; Lidická 43/66, 150 00 Praha 5 – Anděl e- mail: [email protected]; web: www.csbmb2012.cz tel.: +420 224 224 646, +420 224 942 575/579; fax: +420 224 942 550

XXIII. SBORNÍK PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ PROGRAM BIOCHEMICKÝ SJEZD BRNO

Recommend Documents