XVIII. ZDRAVOTNÍ LABORANTI – I - přednášky 90. ZAVÁDĚNÍ SYSTÉMU MANAGEMENTU JAKOSTI DLE ISO 9001:2000 – POHLED LABORANTŮ Hoblová J., Mičánková S., Buliková A., Matýšková M., Bourková L., Penka M. OKH – FN Brno Mezinárodní normy řady ISO 9000 jsou zaměřeny na jakost systému a na z toho vyplývající jakost produktu/služby a tím i na dosažení spokojenosti zákazníka. Systém managementu jakosti dle normy ISO 9001:2000 (ČSN EN ISO 9001:2001) zahrnuje všechny činnosti v organizaci, které mají vliv na jakost produktů nebo služeb, včetně způsobů práce. Může ho zavést jakákoliv organizace v jakémkoliv oboru činnosti, která chce dosáhnout dlouhodobé spokojenosti svých zákazníků / klientů (tedy i zdravotnické pracoviště). Předpokládá se, a dlouhodobé zkušenosti tento předpoklad potvrzují, že organizace s efektivním systémem managementu jakosti (SMJ) bude dosahovat i dobrých ekonomických výsledků. V laboratoři by řádně zavedený SMJ měl na jedné straně zvýšit důvěru pacientů, zdravotníků (tj. zákazníků) v práci laboratoře, ve výsledky laboratoří vydávané, na druhé straně dát pracovníkům jistotu, že za plnění předepsaných podmínek jsou jimi vydávané výsledky správné, být používán v běžném provozu - ne jen na papíře v konečném efektu usnadnit a zjednodušit práci, nesmí provoz zdržovat. Na OKH FN Brno jsme se již dlouhodobě snažili dodržovat zásady správné laboratorní praxe. SMJ dle normy ISO 9001:2000 zavádět na jaře roku 2002. Vzhledem k rozsahu a různorodosti naší práce jsme věděli, že zavedení systému a dosažení certifikace nebude zcela snadné. V našem sdělení bychom se rádi podělili o zkušenosti, které jsme v průběhu zavádění SMJ získali. 91. DODRŽOVÁNÍ BEZPEČNOSTI PRÁCE NA HEMATOLOGICKÉ LABORATOŘI V SOUVISLOSTI S IMPLEMENTACÍ SYSTÉMU ŘÍZENÍ JAKOSTI ISO 9001:2000 Vidláková P., Bourková L., Buliková A., Matýšková M., Penka M. Oddělení klinické hematologie FN Brno Bezpečnost a ochrana zdraví při práci je nezbytnou součástí práce na každé laboratoři. Daná problematika by měla být na odděleních popsána v dokumentech, které stanovují obecné provozní zásady v laboratoři a preventivní hygienicko epidemiologické režimy, které jsou bezpečné pro zdravotnický personál. Dokumenty mají také sjednocovat a stanovovat povinnosti zaměstnanců ve všech oblastech jejich činnosti i na jednotlivých stupních řízení. Dokumenty musí být v souladu se zákonnými předpisy, s celonemocničmi předpisy a směrnicemi a musí být závazné pro všechny zaměstnance daného oddělení. S vytvořením těchto dokumentů máme vlastní zkušenosti v souvislosti se zaváděním systému řízení jakosti ISO 9001:2000. Přesto, že vytváření těchto dokumentů je práce náročná, tak se vyplácí a vede ke správnému, systematickému a důslednému dodržování potřebných pravidel. 92. DIFERENCIÁLNÍ DIAGNOSTIKA STERNÁLNÍCH PUNKCÍ NA HOK Gregůrková J., Lapčíková A., Juráňová J., Indráková J.
Hemato-onkologická klinika FN a LF UP Olomouc Tato přednáška je zaměřena na diferenciální diagnostiku sternálních punkcí – teorii a praxi, spolupráci laborantek s lékaři a spolupráci se specializovanými laboratořemi. Pokrok se jeví v komplexním nazírání na potvrzení diagnózy u pacientů. Závěrem jsou uvedeny zajímavé kazuistiky. 93. CHYBNÝ ODBĚR A JEHO VLIV NA HEMOKOAGULAČNÍ VYŠETŘENÍ Homolková H., Čábelková P., Drábková D., Malíková I. CHL I.interní klinika VFN, Praha 2 Předpokladem pro získání správných výsledků hemokoagulačního vyšetření je správný odběr krve do protisrážlivého činidla. V naší nemocnici používáme uzavřený odběrový systém Vacutainer firmy Becton Dickinson, USA. Jako protisrážlivé činidlo je použit citrát sodný v koncentraci 0,129 mol/l. Cílem naší práce bylo ověřit, jak chybný poměr krve a protisrážlivého činidla ovlivňuje jednotlivá hemokoagulační vyšetření. Výsledky studie: Do studie bylo zařazeno 20 zdravých jedinců, u kterých byl proveden správný odběr a simulovaně chybný odběr.
Poměr protisrážlivého činidla a krve
PT (INR)
1 : 10
normální
1:7
mírně mírně prodlouže prodlouže ný ný
1:5 1:3
AT III (%)
D-dim. (ug/l)
normální
normální
mírně prodlouže snížený ný
snížený
normální
prodlouže prodlouže ný ný
prodlouže snížený ný
snížený
normální
silně silně prodlouže prodlouže ný ný
silně prodlouže snížený ný
snížený
normální
(sec)
TT (sec)
normální
normální
APTT
Fbg (g/l) normál ní
Závěr: Z výsledků v tabulce je patrné, že nedodržení správného poměru citrátu sodného a krve vede ke zkreslení výsledků hemokoagulačního vyšetření směrem k patologickým hodnotám. Chybně nabrané vzorky krve nelze přijmout pro analýzu. Studie proběhla v rámci výzkumu VZ 64 165. 94. STANOVENÍ INHIBITORŮ VNITŘNÍHO KOAGULAČNÍHO SYSTÉMU Sečkařová M., Sýkorová M., Ježáková J., Novák P., Krčová V., Slavík L. Hemato-onkologická klinika FN Olomouc Vnitřní koagulační systém představuje složitou kaskádu jednotlivých aktivačních reakcí, které na sebe vzájemně kaskádovitě navazují. K monitorování celého tohoto systému je už dlouhou dobu využíváno aktivovaného parciálního tromboplastinového času (aPTT).
Stanovení aPTT prošlo v posledních letech poměrně rychlým vývojem zejména s ohledem na citlivost diagnostik k inhibitorům koagulace a to zejména lupoidního typu, což bylo umožněno zejména použitím nových typů aktivátorů na bázi syntetických fosfolipidů, které nahradily dříve používanou siliku. Tento vývoj nastolil některé nové problémy v diagnostice aPTT patologií, které jsou způsobeny inhibitory koagulace, jelikož současné vysoce citlivé reagencie nám zachytí, jak patologie nespecifických inhibitorů, tak zejména patologie způsobené lupoidními antikoagulancii. Z tohoto důvodu je třeba pro stanovení typu inhibitoru použít naopak reagencie necitlivé k lupoidním antikoagulanciím, pokud je test založen na bázi aPTT (stanovení jednotlivých faktorů). V našem sdělení bychom rádi ukázali naše vyšetřovací schéma patologického aPTT testu na vybraných pacientech, u kterých jsme identifikovali defekty faktorů vnitřního koagulačního systému nebo přítomnost inhibitorů tohoto systému. 95. CYTOLOGICKÉ ZPRACOVÁNÍ A HODNOCENÍ TĚLNÍCH TEKUTIN Vlčková A., Daňová V., Maisnar V. II. interní klinika – Oddělení klinické hematologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové Lymfom plášťové zóny (MCL) patří do velké skupiny maligních lymfoproliferativních onemocnění. Je to nehodgkinský lymfom (NHL) a mezi všemi NHL tvoří 5-10%. Cytogeneticky je MCL charakterizován chromozomální translokací t(11;14)(q13;q32) zahrnující gen CCND1 na chromozómu 11 (11q13) a gen pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgH) na chromozómu 14 (14q32). Určení translokace t(11;14) je tedy významným diagnostickým markerem onemocnění. Přestavbu můžeme určit klasickou cytogenetickou analýzou a metodou molekulární cytogenetiky fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s lokus specifickou sondou (LSI IGH/CCND1 – Vysis) na buňkách po cytogenetickém zpracování, na otiskových preparátech nebo histologických řezech. Změna genů CCND1 a IgH vede k nadměrné expresi cyklinu D1, jež se podílí na patogenezi onemocnění pravděpodobně deregulací buněčného cyklu. Expresi cyklinu D1 můžeme detekovat na molekulárně genetické úrovni. Avšak až 70% nemocných s MCL má v karyotypu pozorovány sekundární chromozómové změny. Jejich detekce je velmi důležitá, protože současně s jejich nálezem byl potvrzen nepříznivý prognostický význam. Práce prezentuje některé příklady detekce sekundárních chromozómových přestaveb, které jsou součástí komplexních chromozómových změn karyotypu u nemocných s MCL metodami kasické cytogenetiky, FISH a M-FISH (mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace).
XXI. ZDRAVOTNÍ LABORANTI – II – přednášky 107. VYŠETŘOVACÍ METODY PŘI PODEZŘENÍ NA HEMOGLOBINOPATIE PROVÁDĚNÉ NA HOK OLOMOUC Jiruchová Z., Vlachová Š., Divoká M., Divoký V., Indráková J., Indrák K. Hemato-onkologická klinika FN a LF UP Olomouc, ČR Laboratoř HOK provádí screeningová vyšetření pro záchyt vrozených patologických stavů erytrocytů. Detailně se zabýváme vyšetřováním talasemií a hemoglobinopatií, u kterých provádíme i molekulárně genetické vyšetření. Vzorky nemocných, u kterých je vysloveno
podezření na hemoglobinopatii, jsou na HOK Olomouc zasílány z hematologických center celé ČR i SR. Diagnostika všech hematologických chorob začíná analýzou základních parametrů krevního obrazu a vyšetření retikulocytů. Na nosičství talasemie, které je u nás poměrně časté, pomýšlíme u nemocných s familiární mikrocytární anémií nebo výraznou mikrocytózou, které není provázené sideropenií. K potvrzení diagnózy β talasemie slouží vyšetření hladiny hemoglobinu A2 a F. Pro nestabilní hemoglobinovou variantu svědčí pozitivita izopropanolového testu nebo testu tepelné stability hemoglobinu. K přesnému stanovení nejčastějších mutací používáme metody RFLP a sekvenační analýzu. V našem sdělení budou prezentovány jednotlivé vyšetřovací testy a jejich diagnostický význam. Práce je podporována grantem IGA NM-6739-3. 108. PŘESTAVBY MLL GENU U AKUTNÍCH LEUKEMIÍ Divoká M.1, Jarošová M.1, Takáčová S.2, Priwitzerová M.2, Zápražná K.2, Holzerová M.1, Indrák K.1, Divoký V.2 1 Hemato-onkologická klinika FN Olomouc, 2Ústav biologie LF UP Olomouc MLL (mixed lineage leukemia) gen je lokalizovaný na chromozomu 11q23. Leukémie asociované s 11q23 translokací mají MLL gen fúzovaný s různými partnery a tvoří skupinu leukémií se špatnou prognózou. Přestavby MLL genu se vyskytují jak u dětských, tak u dospělých AML i ALL. V naší laboratoři jsme vyšetřili 17 dětských i dospělých pacientů s akutní leukémií na přestavbu MLL genu. Všichni pacienti byli vyšetřeni klasickou cytogenetikou. U 12 pacientů byla metodou FISH potvrzena přestavba MLL lokusu. Byly použity sondy celochromozomové i genově specifické. Pomocí metod molekulární genetiky byly zjištěny přestavby MLL na DNA úrovni (Southern blot) i na úrovni transkriptu (RT-PCR). Southern blot analýza byla provedena u všech 17 pacientů, u 9 z nich byla potvrzena genová přestavba MLL v oblasti „breakpoint cluster region“. U jednoho pacienta byla zjištěna kvalitativně nová přestavba MLL, v současné době probíhá její přesná analýza. Pomocí RT-PCR bylo vyšetřeno 7 pacientů a u 6 byl potvrzen MLL fúzní transkript. U 3 pacientů jsme detekovali fúzní gen MLL/AF4, dále byly zjištěny fúzní geny MLL/AF6, MLL/AF9 a MLL/ELL. Kombinace metod cytogenetických a molekulárně genetických nám umožňuje stanovit jednotlivé změny MLL genu u akutních leukémií a tím jejich přesné diagnostické zařazení. Pomocí metod FISH a RT-PCR pak můžeme sledovat odpověď pacientů na léčbu a monitorovat minimální reziduální chorobu u transplantovaných pacientů. Tato práce je podporována grantem GAČR 301/01/0489. 109. SCREENING VÝSKYTU MUTACÍ FLT3 GENU U AML A MDS MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝMI METODAMI Novosadová A., Vlachová Š., Kubaláková R., Divoká M., Škranc S., Jiruchová Z., Jarošová M., Hubáček J., Heczko M., Indrák K., Indráková J. Hemato-onkologická klinika FN a LF UP, Olomouc FLT3 gen (syn. STK1, FLK2, CD135) je lokalizován na chromozomu 13q12. Jedná se o receptor tyrozin kinázy III. třídy, který je přednostně exprimován na povrchu myeloidních a
lymfoidních prekursorech hemopoetického systému. Jako antiapoptotický a mitogenní faktor přispívá k buněčné proliferaci, diferenciaci a apoptóze. FLT3 gen je jedním z nejčastěji mutovaných genů u akutních myeloidních leukémií (AML) dospělých i dětí a u myelodysplastického syndromu (MDS). Až 35% nemocných s AML vykazuje vnitřní tandemovou duplikaci (ITD) anebo mutaci, postihující oblast exonu 11, popřípadě intronu 11 a exonu 12 označenou jako D835. Mutace je pozorována ve všech podskupinách AML včetně APL, klinicky je nejčastěji spojena s leukocytózou. Retrospektivní studie mutací FLT3 receptoru ukazují, že konstitutivní aktivace ITD/FLT3 a D835/FLT3 má prognostický význam neboť nemocní mají horší odpověď na chemoterapii, časné relapsy a celkově horší prognózu onemocnění. Obě mutace je možné určit pomocí klasické jednokolové PCR jak na úrovni DNA, tak i RNA (u ITD/FLT3) izolované z periferní krve nebo aspirátu kostní dřeně. Určení mutací FLT3 je důležité nejen z hlediska prognózy nemocných, ale tato stanovení je možné využít jako markeru pro sledování minimální reziduální nemoci. Ve svém sdělení prezentujeme princip metody a výsledky studie provedené na Hematoonkologické klinice FN v Olomouci. 110. ZÁCHYT PCIENTŮ S LYMFOPROLIFERATIVNÍMI ONEMOCNĚNÍMI V RÁMCI RUTINNÍHO IMUNOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ Ouvinová H., Zídková M., Decastelová A., Vaňková L.*, Šauerová R.*, Vondráčková B.*. Imunologické centrum Praha, * Centrální hematologická laboratoř, I. int. klinika VFN Praha V průběhu roku 2002 bylo mezi pacienty, kteří byli odesláni na běžné imunologické vyšetření, zachyceno 9 pacientů s podezřením na lymfoproliferativní onemocnění. 1) pacienti vyšetřeni pro recidivující respirační infekty: - u 7 z nich bylo zjištěno zvýšené procentuální zastoupení B lymfocytů s normální expresí CD 19 a s výrazně sníženou expresí znaku CD20, U 3 pacientů byla zjištěna leukocytóza (11,3 – 13,2 x 109/l) a lymfocytóza (4,7 – 7,3 x 109/l), u zbývajících 4 pacientů hodnota leukocytů byla v rozmezí 5 – 9,9 x 109/1 a lymfocytů 1,9 – 3,9 x 10910/1. U všech těchto pacientů bylo podezření na CLL-B. - u 1 pacientky bylo opakoveně vysoké zastoupení B lymfocytů v periferní krvi (CD20+ - 49%, CD19+ - 42%, CD5-) při hodnotě leukocytů 7,9 x 109/l a lymfocytů 5 x 109/l. V nátěru byly nalezeny 3 prolymfocyty a 3 lmfocyty v mitóze. 2) pacientaka s diagnózou atopické dermatitidy. Při laboratorním vyšetření bylo zjištěno vysoké procentuální zastoupení CD4 pozitivních T lymfocytů (CD3+/CD4+ -84%). I když hodnoty krevního obrazu byly v normě (leukocyty 7,8 + 109/l, lymfocyty 3,1 x 109/l) a hematologický analyzátor neavizoval morfologické změny, vzhledem k nálezu imunofenotypizace, byl proveden nátěr z periferní krve. V diferenciálu byly zjištěny atypické tzv. Cerebriformní lymfocyty, které jsou charakteristické pro Sézaryho syndrom. Konečná diagnóza pacientů byla provedena na hematologickém oddělení. Lze se domnívat, že bez imunofenotypizace, by tito pacienti byli diagnostikováni v pokročilejším stádiu onemocnení. 111. LYMFOM PLÁŠŤOVÉ ZÓNY (MCL). UŽITÍ CYTOGENETICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÝCH VYŠETŘOVACÍCH METOD PŘI DETEKCI CHROMOZÓMOVÝCH ZMĚN U MCL
Lakomá I. , Jarošová M., Holzerová M., Pikalová Z., Pospíšilová H., Prekopová I., Hanzlíková J., Indráková J., Indrák K. Hemato-onkologická klinika FN a LF UP Olomouc Od 1.1.2003 do 1.4.2003 jsem na našem pracovišti vyšetřili 15 pacientů: 6 se sclerosis multiplex a 9 s neuralgií. Na lymfocytech periferní krve se srovnával procentuální počet CD3, CD4, CD8 ze vzorků připravených 2 lyzačními metodami Optilyse C a chloridem amonným. Metody: analýzu krevního obrazu a diferenciálního rozpočtu leukocytů jsme stanovili na hematologickém analyzátoru Gen S (Coulter). Vzorky byly označeny protilátkou CD8 FITC/CD4 PE/CD3 ECD (Immunotech). Po značení protilátkou byly vzorky připravovány současně oběma lyzačními činidly: a/Chlorid amonný (připravený ústavní lékárnou), b/ Optilyse C (Immunotech). Po následné centrifugaci a resuspenodování byly vzorky změřeny na průtokovém cytometru EPICS XL (Beckman Coulter). Hodnocení: 1. Procentuální počty lymfocytů z hematologického analyzátoru jsou srovnatelné s počty lymfocytů z průtokového cytometru, připravenými pomocí Optilyse C. Vzorky připravené s chloridem amonným měly výrazně nižší počty lymfocytů. 2. Procentuální počty lymfocytů CD3, CD4, CD8 byly ve většině vzorků připravených s chloridem amonným nižší než ve vzorcích připravených s Optilyse C. Závěr: Z naší zkušenosti je na vyšetření znaků CD3, CD4, CD8 z periferní krve vhodnější použít lyzační činidlo Optilyse C než chlorid amonný. 112. SROVNÁNÍ LYZAČNÍCH ČINIDEL PŘI VYŠETŘOVÁNÍ LYMFOCYTŮ PERIFERNÍ KRVE PRŮTOKOVOU CYTOMETRIÍ Hončíková M., Šubrtová H., Mociková H., Kozák T. Oddělení klinické hematologie, FNKV Praha Cytologické vyšetření je dnes poměrně častou součástí pracovní náplně hematologické laboratoře. Ročně vyšetříme zhruba 450-500 punktátů tělních tekutin. Zpracovávají se nejčastěji punktáty hrudních a pohrudničních výpotků a ascitů, dále se zpracovávají tzv. punkce jiné (kolene, různé cysty, apod.) Je důležité dodržet stanovené podmínky při odběru výpotku, tzn. použít správné odběrové materiály, aby mohl být v laboratoři kvalitně zpracován. Po přijetí materiálu laboratoří, změření analyzátorem krvinek a po následné centrifugaci se zhotoví preparáty, které se následně obarví a odečítají. Diagnosticky více než polovina z vyšetřených vzorků tvoří transudáty. V současné době jsou cytologická vyšetření důležitá i pro záchyt tumorozních buněk. Specifický problém v rámci cytologických vyšetření tvoří diagnostika postižení CNS v rámci hematologických malignit. Jedná se o zpracování likvoru sedimentační metodou pomocí komůrky sestrojené na Saykově principu kontrolované difuze. I když se jedná o metodu poměrně zastaralou, ale levnou, tak často konkuruje i novým diagnostickým postupům, které jsou cenově nesrovnatelně vyšší (imunofenotypizace, PCR metody) V současné době je cytologické vyšetření, které je poměrně jednoduché a přitom diagnosticky významné, nedílnou součástí diferenciálně diagnostických postupů.
