Vztah nocicepce a anxiety u laboratorních potkanů a jejich ovlivnění N-feruloylserotoninem The Effect of N-Feruloylserotonin on Nociception and Anxiety in Rats Anna Yamamotová, Marie Pometlová, Šimon Vaculín, Juraj Harmatha1, Richard Rokyta Ústav normální, patologické a klinické fyziologie 3. LF UK Praha, 1Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Praha
SOUHRN Testovali jsme analgetické účinky N-feruloylserotoninu v dávce 10 mg/kg (extrakt ze semen parchy saflorové) v plantar a tail-flick testu před a po plovacím stresu (3 min, voda 32 °C) a anxiolytické účinky ve zvýšeném křížovém bludišti u potkanů kmene Wistar. N-feruloylserotonin významněji neovlivnil klidovou nocicepci ani stresem navozenou analgezii, avšak po rozdělení zvířat na nízkoprahová a vysokoprahová se projevily jeho selektivní účinky především u více úzkostných zvířat s vyšším klidovým prahem bolesti, u kterých N-feruloylserotonin oslaboval anxietu zvyšováním explorační aktivity. Po akutním stresu snižoval u těchto zvířat stresovou analgezii, čímž opět přibližuje podle charakteru reakce úzkostnější zvířata s vyšším prahem ke zvířatům méně úzkostným. Klíčová slova: nocicepce, úzkost, N-feruloylserotonin SUMMARY Analgesic as well as anxiolytic effect of N-feruloylserotonin, a substance isolated from the seeds of Leuzea carthamoides, has been tested in Wistar rats. Nociceptive responses were tested using the plantar and the tail-flick tests applied before and after the swimming stress (3 minutes, 32 °C), anxiety was evaluated in the elevated plus maze. Neither the basal nociception nor the stress-induced analgesia were influenced significantly, however, after the selection of animals according to their basal nociceptive sensitivity into the high- and the low-threshold rats, N-feruloylserotonin had selective effects especially in the high-pain threshold rats. In these animals, it decreased anxiety by increasing exploratory activity and reduced stress-induced analgesia after the acute stress. Key words: nociception, anxiety, N-feruloylserotonin
Yamamotová A, Pometlová M, Vaculín Š, Harmatha J, Rokyta R. Vztah nocicepce a anxiety u laboratorních potkanů a jejich ovlivnění N-feruloylserotoninem. Psychiatrie 2003;7(Suppl.3):55–59.
Úvod Studium vztahu stresu a bolesti stojí dlouhodobě v popředí odborného zájmu. Stres aktivuje endogenní analgetické systémy, ale zároveň některá analgetika mohou být při stresu méně účinná. Tak jako koncepce stresu prošla během posledních let vývojem od nespecifického k specifickému, obdobnou změnu můžeme pravděpodobně očekávat i ve vysvětlení činnosti antinocicepčních mechanizmů neboť specifické stresory mohou zřejmě aktivovat rozdílné neuronální okruhy tlumení bolesti. Stresové reakce a bolest jsou ovlivňovány několika neurotransmiterovými systémy, včetně serotoninového. Možnost ovlivnění serotonergní transmise bioaktivnímí látkami léčivých rostlin bylo zkoumáno např. v souvislosti s třezalkou (Hypericum perforatum), u které byly prokázány u potkanů anxiolytické a antidepresivní účinky zprostředkované upregulací 5-HT2A receptorů (Kumar et al., 2002). U myší vyvolalo podání alkoholového extraktu H. caprifoliatum nebo H. polyanthemum antinocicepční účinky, způsobené pravděpodobně aktivací opioidního systému (Viana et al., 2003). Jinou rostlinou, sloužící jako adaptogen nebo roborans je Leuzea carthamoides (maralový kořen, parcha saflorová). Její extrakt se používá pro prevenci kardiovaskulárních a gastrointestinálních onemocnění, ale také jako prevence proti stresu obecně, neboť zvyšuje odolnost a výkonnost organizmu. Ze semen rostliny byl izolován N-feruloylserotonin, jenž má strukturní podobnost se serotoninem nebo melatoninem (Pavlík et al., 2002). V pilotní studii se ukázalo, že látka antagonizovala etanolem vyvolanou analgezii a v open field testu měla slabě stimulační účinky na explorační aktivitu (Yamamotová et al., 2001). Cílem pokusů bylo ověřit účinky N-feruloylserotoninu na nocicepční odpovědi potkanů, jak v klidu tak po aktivaci stresem (experiment I) a testovat jeho vliv na anxietu (experiment II).
Experiment I Metodika Pokusy byly provedeny na samcích kmene Wistar (hmotnost 306 ± 12 g). 12 zvířatům byl i.p. aplikován N-feruloylserotonin v dávce 10 mg/kg rozpuštěný v 0,1 ml 98% etanolu, kontrolní skupině (N = 12) bylo aplikováno rozpouštědlo. Jako model stresu byl použit Porsoltův plovací stres – tříminutové plavání ve vodě teplé 32 °C. Přestože studená voda je silnější stresor, záměrně jsme volili teplou vodu, při které se nesnižuje povrchová teplota, která by mohla ovlivnit velikost analgetické odpovědi na termickou stimulaci. Práh bolesti byl měřen opakovaně v 5 sériích. První kontrolní měření před aplikací látky, druhé 30 minut po jejím podání, třetí 5 minut po plavání a po usušení zvířat, čtvrté 15 minut po plavání a poslední 2,5 hodiny po stresu. Práh bolesti byl měřen metodou plantar test (Ugo Basile, Comerio, Italy) a tail-flick test (Analgesia Meter IITC, Model 33, Life Sciences, USA). Při plantar testu jsou zvířata umístěna do plexisklových boxů o velikosti 27 × 17 × 14 cm, které jim umožňují volný pohyb. Po 5 min adaptaci a po odeznění explorační aktivity je externí zdroj infračerveného záření posunut pod jednu z testovaných končetin a spuštěn. V okamžiku, kdy tepelná stimulace nabývá nociceptivního charakteru, se aktivuje obranný flexní reflex a odtažením končetiny od podlážky se stimulace přeruší. Nejdříve se měřil práh bolesti na předních, pak na zadních končetinách. Při tail-flick testu je vysokointenzitním tepelným paprskem stimulován konec ocasu. Stimulace se prováděla čtyřikrát, od distální části ocasu (nejvíce citlivé místo) proximálním směrem. Intervaly mezi stimulacemi byly půl až jednominutové, vždy po zklidnění zvířete po předchozí stimulaci. Při tomto testu byla zvířata umístěna v plexisklovém boxu, který zcela omezil jejich pohyb. Tím se liší tail-flick test od plantar testu a nelze vyloučit, že imobilizace, byť i krátkodobá, může ovlivňovat naměřené hodnoty. Z tohoto důvodu se nocicepce v tail-flick testu měřila ve všech sériích jako druhá v pořadí. Data byla hodnocena analýzou variance pro opakovaná měření. V obou testech meziskupinovou variabilitu tvořil faktor skupina (kontroly a experimentální skupina), vnitroskupinovou variabilitu tvořilo 5 opakovaných sérií měření (faktor série). V případě plantar testu další vnitroskupinovou variabilitu tvořilo měření prahu bolesti na předních a zadních končetinách (faktor končetiny) a pořadí jejich měření (pravá a
levá, faktor pořadí stimulace). U tail flick testu zahrnoval faktor pořadí čtyři opakovaná měření v každé sérii. Po rozdělení zvířat do skupin s nízkým a vysokým prahem byl zaveden další faktor práh. Výsledky V plantar testu se nelišil práh bolesti u zvířat s aplikovaným N-feruloylserotoninem od kontrolních zvířat (F(1,22) = 0,65; p = 0,428). Práh bolesti byl významně ovlivněn stresem (F(4,88) = 44,85; p < 0,0001), a to u obou skupin shodně (skupina x série F(4,88) =2,13 p = 0,084). Skutečnost, že interakce faktorů se blíží významnosti, byla zřejmě způsobena výběrem zvířat do skupin. Kontrolní skupina měla sice nevýznamný, ale přesto vyšší jak klidový práh bolesti, tak i práh po aplikaci. Z tohoto hlediska byl nárůst prahu bolesti po stresu u zvířat experimentální skupiny absolutně větší, ale nelze určit, zda vlivem podané látky nebo větší aktivací endogenního analgetického systému. Z tohoto důvodu byla jak kontrolní, tak i experimentální skupina dodatečně rozdělena podle velikosti klidového prahu bolesti předních končetin na zvířata s nízkým a vysokým klidovým prahem a porovnávána u nich velikost stresové analgezie. Rozdíly v analgezii u nízkoprahových a vysokoprahových zvířat v jednotlivých sériích byly statisticky významné (F(4,80) = 2,72; p = 0,0351) (obr. 1). U zvířat s vysokým prahem pouze plavání vyvolalo analgezii, kdežto u skupiny s nízkým prahem, bez ohledu na aplikovanou látku se práh bolesti zvyšoval už po vpichu. Zvířata s nízkým prahem reagovala v plantar testu na kumulující se stresy graduovanou analgetickou odpovědí.
V tail-flick testu N-feruloylserotonin neovlivnil nocicepci, skupiny se nelišily prahem bolesti (F(1,22) = 1,59; p = 0,219). Práh bolesti byl významně ovlivněn stresem (F(4,88) = 28,25; p < 0,0001) a to u obou skupin shodně (skupina x série F(4,88) = 0,57; p = 0,682). Po rozdělení zvířat podle velikosti prahu bolesti byly zjištěny dvě významné interakce; interakce faktorů série x pořadí x práh (F(12,240) = 2,01, p = 0,0237) a série x pořadí x práh x dávka (F(12,240) = 2,40; p = 0,0059), což znamená, že dynamika prahu bolesti v opakovaných měřeních v jednotlivých sériích se liší u nízkoprahových a vysokoprahových potkanů a že může být modifikována podaným N-ferulylserotoninem. Kontrolní zvířata s vyšším prahem bolesti habituovala po plovacím stresu pomaleji a vyšší analgezie přetrvávala ještě ve dvou následných sériích měřených 15 min a 2,5 hodiny po plavání (obr. 2). N-feruloylserotonin, zrychlil habituační odpověď prahu bolesti po stresu, ale pouze u zvířat s vysokým prahem.
Závěr N-feruloylserotonin neovlivnil klidovou nocicepci v tail flick testu, oslabil stresovou analgezii po plavání, která přetrvávala ještě asi 2 hodiny, ale pouze u zvířat s vyšším prahem bolesti. U zvířat s nižším prahem byl bez efektu.
Experiment II Vzhledem k rozdílné reaktivitě zvířat s nízkým a vysokým prahem bolesti jsme provedli selekci už den před pokusem. Stejně jako v první sérii byla zvířata roztříděna podle latence plantar testu předních končetin a do experimentálních skupin byla rozdělena tak, aby se klidové prahy budoucích skupin, které dostanou fyziologický roztok (N = 6), rozpouštědlo (N = 6) nebo N-feruloylserotonin (N = 12) nelišily a aby bylo zastoupení jak vysokoprahových tak i nízkoprahových zvířat v každé experimentální skupině rovnoměrné. Test na anxietu předcházel testům na měření nocicepce. Zvířata byla 1,5 hodiny adaptovaná na prostředí laboratoře, 30 minut po i.p. aplikaci byla vložena do křížového bludiště na dobu 5 minut. Fotobuňky umístěné ve stěnách otevřených a uzavřených ramen zaznamenávaly přechody mezi jednotlivými rameny. Automaticky se vyhodnocovala celková doba pobytu a frekvence návštěv v otevřených a uzavřených ramenech bludiště a v jeho centrální části. Testování prahu bolesti plantar testem a tail flick testem se provádělo ve třech sériích, 10 minut po testu v křížovém bludišti, 5 a 15 minut po plavání. Ostatní podmínky pokusu byly stejné jako v experimentu I. Všechny analýzy dat se prováděly ANOVou pro opakovaná měření, u tail-flick testu se hodnotily tři série
se čtyřmi měřeními, u plantar testu čtyři série (včetně kontrolního měření, podle kterého se provádělo třídění). U anxiety se porovnávala frekvence návštěv a celková doba pobytu v uzavřeném a otevřeném rameni a v centru bludiště (faktor ramena). Meziskupinovou variabilitu tvořily dvě úrovně faktoru práh a tři úrovně faktoru skupina (fyziologický roztok, rozpouštědlo a N-feruloylserotonin). Plantar test Práh bolesti se mezi skupinami nelišil (F(2,18) = 0,6; p = 0,559). Stres významně zvyšoval práh bolesti (F(3,54) = 8,20; P = 0,0001) a to u všech skupin shodně, bez ohledu na aplikovanou látku (F(6,54) = 0,481; p = 0,819) nebo klidovou výši prahu (F(3,54) = 1,41; p = 0,2487). Jak se dalo očekávat lišily se skupiny tříděné podle úrovně klidové nocicepce (F(1,18) = 11,57; p = 0,00317). Tail-flick Ani v tomto testu se skupiny významně nelišily (F(2,18) = 1,88; p = 0,180). Podobně jako u plantar testu, měla skupina s aplikovaným N-feruloylsetrotoninem nejmenší rozptyl, což mohlo být ovlivněno větším počtem zvířat ve skupině. V tail-flick testu se nelišila nízkoprahová a vysokoprahová zvířata (F(1,18) = 0,039; p = 0,845) ani v interakci s faktorem skupina (F(2,18) = 0,1; p = 0,9045). Významné byly pouze nárůsty prahu bolesti po plavání (F(2,36) = 7,96; p = 0,0013) a zkracování latence odpovědi v každé sérii měření (faktor pořadí F(3,54) = 58,51; p < 0,0001). Na hranici významnosti byla interakce faktorů pořadí x skupina (F(6,54) = 2,025; p = 0,0780), což odráží pomalejší odeznívání stresové analgezie u skupiny s fyziologickým roztokem v porovnání se skupinou s N-feruloylserotoninem. Anxieta Skupiny s aplikovanými látkami se nelišily ani celkovou dobou pobytu v jednotlivých ramenech bludiště (F(4,36) = 1; p = 0,4017) ani frekvencí jejich návštěv (F(4,36) = 1,08; p = 0,3776). Významně se však lišila nízkoprahová a vysokoprahová zvířata a to jak dobou pobytu v ramenech bludiště (F(2,36) = 3; p = 0,0415), tak i frekvencí jejich návštěv (F(2,36) = 5,11; p = 0,0111). Zvířata s nízkým prahem navštěvují častěji otevřená ramena a pobývají v nich déle. Na hranici významnosti byla interakce faktorů ramena x skupina x práh (F(4,36) = 2,26; p = 0,0812), ale pouze u frekvence návštěv, což znamená, že anxiolytický účinek N-feruloylserotoninu se projevil především zvýšenou explorací a to pouze u zvířat s vyšším prahem bolesti, jejichž vzorec chování ve zvýšeném bludišti se přiblížil k chování méně úzkostných zvířat s nižším prahem bolesti (obr. 3).
Diskuze Oba experimenty ukázaly, že N-feruloylserotonin ovlivnil nocicepci a anxietu především u potkanů
s vyšším klidovým prahem bolesti. Stresová analgezie vyvolaná plaváním přetrvávala u těchto zvířat déle než u zvířat s nízkým prahem. Anxiolytický účinek se projevil zvýšenou frekvencí návštěv otevřených ramen a celkově zvýšenou pohybovou aktivitou především v centrální části bludiště. Vyšší klidový práh bolesti se pozoroval současně s větší úzkostí, menší explorační aktivitou a pomalejší habituací prahu bolesti po stresu. Podobná pozorování, avšak na rozdíl od nás provedená na myších selektovaných podle velikosti analgezie po plavání, ukázala na souvislost mezi vyšší stresovou analgezií, větší úzkostí, menší explorační aktivitou v open field testu a větší úlekovou reakcí (Błaszczyk et al., 2000). Shodná kombinace behaviorálních vzorců byla popsána i u potkanů, ale ve vztahu k potravové preferenci, kde vysokoproteinovou dietu upřednostňovala zvířata méně úzkostná, více explorující v open field testu a reagující hyperalgezií v tail flick-testu (Onaivi et al., 1992). V modelu úzkosti vyvolané CCK měli potkani se sníženou explorační aktivitou, a tedy více úzkostní zvýšený počet serotonergních 5-HT2 receptorů ve striatu (Kőks et al., 1999). Experimenty s použitím mikrodialýzy u volně se pohybujících potkanů ukázaly, že se po plavání mění extracelulární koncentrace serotoninu v různých strukturách mozku rozdílně – zvyšuje se ve striatu, ale snižuje se v amygdale a v septu (Lucki 1998). Protože tyto změny přetrvávají až několik hodin, mohou ovlivňovat i ostatní neurotransmiterové systémy, včetně noradrenergního, který je se serotonergním systémem v recipročních vztazích. Aktivace a1 adrenergních receptorů nebo jejich agonisté potencují úzkost a zvyšují výdej serotoninu, kdežto aktivace a2 receptorů nebo podání jejich agonistů má anxiolytické účinky a množství serotoninu se může snižovat (Ninan, 1999). Pravděpodobně primární funkcí serotonergního systému je stimulovat generátor pohybové aktivity a facilitovat motorické funkce za současné inhibice funkcí senzorických (Jacobs a Fornal, 1999). Kdybychom sem řadili i nocicepci, potom v našich pokusech byli v klidových podmínkách senzoricky vnímavější potkani méně úzkostní, ale naopak po plavání přetrvávala analgezie déle u potkanů více úzkostných. Pouze u této skupiny N-feruloylserotonin stresovou analgezii oslaboval a působil také anxiolyticky. V tomto typu experimentu těžko odlišíme strach od úzkosti. U lidí vyvolává úzkost, na rozdíl od strachu, hyperalgezii (Rhudy a Meagher, 2000). Strach je okamžitá reakce na přítomné ohrožení, kdežto úzkost je naproti tomu emoce spojovaná s anticipací potenciálního ohrožení, doprovázená stavem hypervigilance a somatickou tenzí (např. svalovou). Strach mobilizuje k reakci „figh or flight“, kdežto úzkost facilituje senzorickou vnímavost. Na druhou stranu ohrožení, před kterým není úniku, bývá spojováno s opioidním typem analgezie a často je doprovázeno imobilitou, zatímco ohrožení, se kterým lze aktivně bojovat, je spojováno s neopioidní analgezií. Můžeme předpokládat, že zvířata s vyšším klidovým prahem bolesti mohou mít vyšší bazální opioidní tonus, ale méně výkonný systém neopioidní analgezie, který se aktivuje působením silnějších stresorů a který je součástí aktivního zvládání stresů. Např. potkani kmene Wistar selektovaní podle anxiety se významně lišili strategií chování v plovacím stresu. Vysoce úzkostná zvířata plavala méně intenzivně, víc se ve vodě vznášela a byla více imobilní (Liebsch et al., 1998).
Závěr Serotonergní systém moduluje bolest i úzkost, avšak vzhledem k jeho komplexnosti nelze získané výsledky jednoznačně interpretovat pro nedostatek informací o účincích N-feruloylserotoninu na tento systém. N-feruloylserotonin významněji neovlivnil klidovou nocicepci ani stresem navozenou analgezii, avšak po rozdělení zvířat na nízkoprahová a vysokoprahová se projevily jeho selektivní účinky především u více úzkostných zvířat s vyšším klidovým prahem bolesti. N-feruloylserotonin oslabil anxietu zvyšováním explorační aktivity, čímž přiblížil více úzkostná zvířata zvířatům méně úzkostným, která měla zároveň i nižší práh bolesti. Po akutním stresu snížil stresem vyvolanou analgezii, čím opět podle charakteru reakce přiblížil úzkostnější zvířata s vyšším prahem bolesti ke zvířatům méně úzkostným.
Tato práce byla podpořena projektem LN00B122 MŠMT ČR.
doc. RNDr. Anna Yamamotová, CSc. Ústav normální, patologické a klinické fyziologie 3. LF UK Ke Karlovu 4 120 00 Praha 2
LITERATURA Błaszczyk JW, Tajchert K, Łapo I, Sadowski B. Acoustic startle and open-field behavior in mice bred for magnitude of swim analgesia. Physiol Behav 2000;70:471–476. Jacobs BL, Fornal CA. Activity of serotonergic neurons in behaving animals. Neuropsychopharmacology 1999;21:9S–15S. Kőks S, Männistö PT, Bourin M, Shlik J, Vasar V, Vasar E. Cholecystokinin-induced anxiety in rats: relevance of pre-experimental stress and seasonal variations. J Psychiatry Neurosci 2000;25:33–42. Kumar V, Khanna VK, Seth PK, Singh PN, Bhattacharya SK. Brain neurotransmitter receptor binding and nootropic studies on Indian Hypericum perforatum Linn. Phytother Res 2002;16:210–216. Liebsch G, Montkowski A, Holsboer F, Landgraf R. Behavioural profiles of two Wistar rat lines selectively bred for high or low anxiety-related behaviour. Behav Brain Res 1998;94:301–310. Lucki I. The spectrum of behaviors influenced by serotonin. Biol Psych 1998;44:151–162. Ninan PT. The functional anatomy, neurochemistry, and pharmacology of anxiety. J Clin Psychiatry 1999;60:12–17. Onaivi ES, Brock JV, Prasad C. Dietary protein levels alter rat behavior. Nutrition Res 1992;12:1025–1039. Pavlík M, Laudová V, Grűner K, Vokáč K, Harmatha J. High-performance liquid chromatographic analysis and separation of N-feruloylserotonin isomers. J Chromatography B 2002;770:291–295. Rhudy JL, Meagher W. Fear and anxiety: divergent effects on human pain thresholds. Pain 2000;84:65–75. Viana AF, Heckler AP, Fenner R, Rates SMK. Antinociceptive activity of Hypericum caprifoliatum and Hypericum polyanthemum (Guttiferae). Braz J Med Biol Res 2003;36:631–634. Yamamotová A, Pometlová M, Rokyta R. Společné mechanizmy bolesti a stresu. Psychiatrie 2001;5(Suppl. 3):18–22.
