Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č Autor: Ing

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha – Ruzyně

Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW–podjednotek gluteninů pšenice Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602

Autor: Ing. Jana Bradová

Prosinec 2006

OPTIMALIZOVANÁ METODIKA SDS-PAGE PRO ANALÝZU LMW-PODJEDNOTEK GLUTENINŮ PŠENICE Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602

Ing. Jana Bradová [email protected] Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2006 http://www.vurv.cz

Text: ©2006 J. Bradová Foto: ©2006 J. Bradová, S. Sýkorová Grafická úprava: ©2006 M. Sýkora Vydáno bez jazykové úpravy ISBN 80-86555-98-4

Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW – podjednotek gluteninů pšenice

OPTIMALIZOVANÁ METODIKA SDS-PAGE PRO ANALÝZU LMW – PODJEDNOTEK GLUTENINŮ PŠENICE

Obsah: 1.

2.

3.

Úvod

…………….

4

Metodika

…………….

4

2. 1.

Technické vybavení

……………….

4

2. 2.

Chemikálie

……………….

5

2. 3.

Roztoky

……………….

6

2. 4.

Pracovní postup

……………….

7

2.5.

Vyhodnocení experimentálních dat

……………….

10

…………….

12

Literatura

J. Bradová – VÚRV Praha


1. Úvod Podjednotky gluteninů s nízkou molekulovou hmotností (LMW-GS) zaujímají asi jednu třetinu celkového semenného proteinu pšenice a představují po gliadinech druhou největší skupinu zásobních bílkovin. LMW gluteniny podobně jako gliadiny a HMWgluteniny tvoří alelické kombinace, na jejichž základě mohou být charakterizovány. Z literatury je známo, že LMW- gluteniny mohou hrát důležitou roli v určování některých významných vlastností pšeničné mouky. HMW- gluteniny jsou velmi dobře prostudovány. Důvodem je velká molekulová hmotnost, která je příčinou jejich nižší elektroforetické pohyblivosti ve srovnání s ostatními endospermálními proteiny. Naproti tomu LMW - gluteniny mají stejnou pohyblivost jako některé těžší gliadiny, a proto získání čistých gluteninových preparátů (např. gelovou filtrací), které by neobsahovaly interferující proteiny, je poněkud složitější. Proto je kladen tak velký důraz na výběr a pečlivost provedení extrakčního postupu LMW-GS, který je sestaven tak, aby byla pokud možno bezezbytku odstraněna gliadinová frakce.

2. Metodika 2.1. Technické vybavení 2.1.1. Přístroje a zařízení • • • • • • • • • • •

Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů (doporučená tloušťka gelu maximálně 1,5 mm) Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí) Chladicí termostat Laboratorní centrifuga Prosvětlovací panel Analytické váhy Laboratorní předvážky Třepačka Vortex Vodní lázeň Ultrazvuková lázeň Laboratorní digestoř

2.1.2. Sklo, laboratorní pomůcky Běžné laboratorní sklo, nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 2 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatické pipety, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice!


4


2.2. Chemikálie Všechny chemikálie stupně „analytical reagent“ (p.a.) nebo lepší

2.2.1. Chemikálie pro extrakci proteinů • • • • • • • • • •

Ethanol 2-Propanol Tris(hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) Kyselina chlorovodíková (HCl) Dodecylsulfát sodný (SDS) Glycerol Bromfenolová modř 2-merkaptoethanol 1,4-dithiothreitol (DTT) 4-vinylpyridin(VP)

2.2.2. Chemikálie pro elektroforézu • • • • • • • • •

Akrylamid (AA) Bisakrylamid (BIS) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Kyselina chlorovodíková (HCl) Bromfenolová modř Dodecylsulfát sodný (SDS) Persíran amonný (APS) TEMED (NNN'N' - tetramethylethylendiamin) Glycin

2.2.3. Chemikálie pro fixaci, barvení a sušení gelů • • • • •

Kyselina trichloroctová (TCA) Ledová kyselina octová Glycerol Methanol Coomassie Brilliant Blue R-250


5


2.3. Roztoky 2.3.1. Extrakční roztoky č.

Roztok

Složky

Množství

poznámka

3.1.1.

Roztok A (60% Ethanol) Roztok B: 50% 2-Propanol v 0,08M Tris-HCl pH 8,0 0,08M Tris-HCl pH 8,0

96% Ethanol Destilovaná voda 2-Propanol 0,08M Tris-HCl (pH 8,0) – viz 3.1.3

60ml 36ml 50ml 50ml

lze skladovat v chladničce lze skladovat v chladničce

Tris Destilovaná voda

4,844g do 500ml

3.1.4.

Vzorkový pufr

3.1.5

Roztok B + DTT

3.1.6

Roztok B + VP

SDS Glycerol Bromfenolová modř 2-Merkaptoetanol 0,08M Tris-HCl (pH 8,0) DTT Roztok B VP Roztok B

2g 40ml 0,02g 1ml do 100ml 40mg 4ml 60µl 4ml

-upravit pH na 8,0 přidáním HCl -lze skladovat v chladničce lze skladovat v chladničce

3.1.2.

3.1.3.

používat vždy čerstvý používat vždy čerstvý

2.3.2. Zásobní roztoky pro elektroforézu č.

Roztok

Složky

Množství

poznámka

3.2.1.

Gelový pufr 8,8: 0,75 M Tris-HCl pH 8,8

Tris Destilovaná voda

45,5 g Tris do 500ml

3.2.2.

Gelový pufr 6,8: 0,25M Tris-HCl pH 6,8

Tris Bromfenolová modř Destilovaná voda

6,1 g špetka do 200ml

3.2.3.

AA a BIS

3.2.4.

10 % roztok SDS

3.2.5

10% roztok APS

3.2.6

Zásobní elektrodový pufr: 0,25M Tris; 1,92M glycin pH 8,3 Provozní pufr

Akrylamid Bisakrylamid Destilovaná voda SDS Destilovaná voda APS Destilovaná voda Tris Glycin SDS Destilovaná voda Zásobní elektrodový pufr Destilovaná voda

150 g 4g do 500ml 5g do 50 ml 0,5g do 5 ml 30,3 g 144 g 10 g do 1000ml 100ml

-upravit pH na 8,8 přidáním HCl -skladovat v chladničce -upravit pH na 6,8 přidáním HCl -skladovat v chladničce skladovat za lab. teploty

3.2.7.


skladovat za lab. teploty připravovat vždy čerstvý skladovat za lab. teploty

připravovat vždy čerstvý

9000ml

6


2.3.3. Roztoky pro fixaci, barvení a sušení gelů č.

Roztok

Složky

Množství

poznámka

3.3.1. 3.3.2.

Fixační činidlo: 20 % TCA Směsný roztok

200 g do 1000 ml 250 ml 100 ml 650 ml

skladovat za lab. teploty skladovat za lab. teploty

3.3.3.

Barvicí roztok

TCA Destilovaná voda Methanol Kyselina octová Destilovaná voda Commassie Brilliant Blue R 250 Směsný roztok Glycerol Destilovaná voda

3.3.4.

2% roztok glycerolu

0,25 g do 500 ml 20ml do 1000 ml

skladovat za lab. teploty skladovat v chladničce

2.4. Pracovní postup 2.4.1. Příprava vzorků - extrakce(N.K. Singh at al.,1991) První den: 1) Jednotlivá zrna roztlouci pečlivě kladívkem a převést do centrifugačních kyvet (2ml) 2) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 3) zamíchat na vortexu 4) nechat stát ve tmě přes noc Druhý den: 5) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 6) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 7) 5min centrifugovat (12 000 ot/min) 8) supernatant odstranit 9) k pevnému zbytku (peletě) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 10) peletu dobře promíchat jehlou 11) krátce zamíchat na vortexu 12) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 13) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 14) 5min centrifugovat (12 000 ot/min) 15) supernatant odstranit 16) k pevnému zbytku (peletě) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 17) peletu dobře promíchat jehlou 18) krátce zamíchat na vortexu 19) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 20) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 21) 5min centrifugovat (12 000 ot/min) 22) supernatant úplně odebrat a odstranit 23) přidat 100 µl roztoku B + DTT (3.1.5) 24) peletu dobře promíchat jehlou 25) krátce zamíchat na vortexu 26) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 27) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 28) přidat 100 µl roztoku B + VP (3.1.6)


7


29) 30) 31) 32) 33) 34) 35)

krátce zamíchat na vortexu 15min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 3min centrifugovat (12 000 ot/min) 100 µl supernatantu přenést do nové centrifugační kyvety přidat100 µl vzorkového pufru 15min inkubovat ve vodní lázni při 65°C 3min centrifugovat (12 000 ot/min)

Takto připravené extrakty lze skladovat několik týdnů v chladničce.

2.4.2. Příprava gelu -

Sestavit suché a čisté gelové kazety (dle typu přístroje) Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu

Příprava 10% dělicího gelu Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) – Uvedená množství - pro přístroj OWL Pinguin 14x16 – 42 ml 3.2.3.(AA a BIS) – 63 ml 3.2.1.(gelový pufr 8,8) – 1,26 ml 3.2.4. (SDS) – 21 ml vody Polymerace se nastartuje přidáním: – 75 µl TEMEDu – 1,26 ml 3.2.5.(APS) Gel se pečlivě nalije mezi skla tak, aby se netvořily vzduchové bublinky. Gelové kazety se naplní 30 mm pod okraj (prostor pro 30 mm vrstvu zaostřovacího gelu). Povrch gelu se převrství opatrně vodou (injekční stříkačkou), nechá se cca 30 minut polymerovat. Po skončení polymerace se voda slije, povrch gelu se osuší filtračním papírem a kazety se až po okraj naplní zaostřovacím gelem. Příprava 4,6 % zaostřovacího gelu: Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) – – – –

6 ml 3.2.3.(AA a BIS) 20 ml 3.2.2. (gelový pufr 6,8) 0,4 ml 3.2.4. (SDS) 21 ml vody

Polymerace se nastartuje přidáním: – 16 µl TEMEDu – 0,4 ml 3.2.5.(APS) Gel se pečlivě nalije na spodní gel tak, aby se netvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek. Polymerace probíhá cca 30 minut. Potom se hřebeny opatrně


8


vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem 3.2.7. Doporučuje se připravit si gely den předem před vlastní elektroforézou a skladovat je v chladničce.

2.4.3. Nanášení vzorků Do každé jamky se nanáší 15µl extraktu (Postup dle 4.1.) .

2.4.4. Elektroforéza Podmínky SDS PAGE pro LMW-GS 3.2.7. 0,2 mA/ mm2 gelu (1gel- 14 cm šířka;1mm tloušťka = 28mA) max. 300 V 8° C od katody (-) k anodě (+)

Elektrodový pufr Proud Napětí Teplota Směr migrace

Doba dělení: Čelo markerovací barvy se nechá dojít na konec gelu a doba dělení se prodlouží cca o 30 minut. 2.4.5. Fixace, barvení, odbarvení, sušení Fixace: – –

Skleněné desky s gelem se vyjmou z přístroje, gel se sejme a ponechá cca 30 minut ve fixačním roztoku 3.3.1. Roztok 3.3.1. se slije a gel se přelije roztokem 3.3.2 a ponechá se cca 30 minut.

Barvení: –

Slít roztok 3.3.2. a přelít barvicím roztokem 3.3.3. Ponechá se barvit přes noc (bez třepání).

Odbarvení: – Slít roztok 3.3.3. a přelít roztokem 3.3.2., ponechat cca 30 minut. – Slít roztok 3.3.2.(odbarvit jej aktivním uhlím a lze jej znovu použít) a nakonec přelít gely destilovanou vodou. Sušení Připraví se skleněná deska (rozměry desky musí být větší než velikost výsledného PAGE gelu). Dále je nutno připravit dva obdélníky z celofánu (rozměry 1. obdélníku se rovnají rozměrům skleněné desky; (strany 2. obdélníku jsou cca o 2cm delší než strany skleněné desky). Takto připravený celofán a PAGE gel se ponoří do 3.3.4. (cca 2 hodiny). Poté se 1. celofánový obdélník položí na skleněnou desku, na něj se umístí PAGE gel a přikryje se 2. celofánovým obdélníkem. Okraje celofánu se přehnou pod skleněnou desku a plocha se


9


eventuelně vyhladí plastovým válečkem (odstranění vzduchových bublin). Ponechá se sušit při laboratorní teplotě v dostatečné vzdálenosti od zdrojů tepla a světla.

2.5. Vyhodnocení experimentálních dat Na výsledném gelu lze současně identifikovat jak LMW-GS, tak HMW-GS alely Obrázek 1: Schématické znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých LMW-GS alel kodovaných lokusem Glu-3(SDS PAGE), (Branlard et al. 2003)

Glu - A3

Glu – B3

Glu – D4

Obrázek 2: Schématické znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých HMW-GS alel kodovaných lokusem Glu-3 (Payne,Lawrence;1983)

Glu - A1

Glu - A1

Glu - A1

Obrázek 3: Příklad výsledku SDS PAGE LMW GS a HMW GS


10


1.Chinese Spring, 2.Clarus, 3.Gabo, 4. Ebi, 5.Jabiru, 6.Orca, 7.Clarus, 8.Kite, 9.Ebi, 10.Jufy

Tabulka I: Alely HMW-GS a LMW-GS odrůd pšenice publikované Singhem et al. (1991) Alela Odrůda Chinese Spring Gabo Jabiru Orca Kite Jufy I

Glu-1A c (0) b (2*) a (1) c (0) b (2*) c (0)

HMW-GS Glu-1B b (7+8) i (17+18) ? a (7) i (17+18) d (6+8)

Glu-1D a (2+12) a (2+12) d (5+10) a (2+12) a (2+12) d (5+10)

Glu-3A a b c d e e

LMW-GS Glu-3B a b c d b i

Glu-3D a b c e b d

TabulkaII: Alely HMW-GS a LMW-GS odrůd pšenice registrovaných v ČR

Alela Odrůda Clarus Ebi

Glu-1A c (0) c (0)

HMW-GS Glu-1B d (6+8) b (7+8)

Glu-1D a (2+12) d (5+10)

Glu-3A d d


LMW-GS Glu-3B a f

Glu-3D c c

11


3. Literatura G. Branlard, M. Dardevet, N. Amiour, G. Igrejas: Allelic Diversity of HMW and LMW Glutenin Subunits and Omega-Gliadins in French Bread Wheat (Triticum aestivum L.) Genetic Resources and Crop Evolution 50, 2003: 669-679 P. I. Payne, G.J.Lawrence: Catalogue of A1leles for the Complex Gene Loci, Glu-A1, Glu-Bl, and Glu-D1, which code for High-Molecular-Weight Subunits of Glutenin in hexaploid Wheat. Cereal. Res. Commun.,11,1983: 29-43 N.K. Singh, K.W. Shepherd, G.B. Cornish: A simplified SDS.PAGE Procedure for Separating LMW Subunits of Glutenin. Journal of Cereal Science 14,1991:203-208


12

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č Autor: Ing

Recommend Documents