10.3.2013
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí
Milada Vávrová, Martin Hroch, Ludmila Mravcová, Petr Lacina, Petra Dvořáková Praha, 1. 2. 2013
Téze přednášky
2
1
10.3.2013
3
Princip SEC
POŽADAVKY NA STACIONÁRNÍ FÁZI Matrice gelu musí ► být inertní k analyzované látce i k mobilní fázi, ► odolávat zvýšené pracovní teplotě. Gel se nesmí během separace rozkládat a uvolňovat produkty rozkladu. 4
2
10.3.2013
Volba gelu Hydrofilní gely (Sephadex) ► pro látky ve vodě rozpustné ► mobilní fáze je voda s přídavkem organického rozpouštědla
Hydrofobní gely (kopolymery styrenu a divinylbenzenu) ► pro látky nerozpustné ve vodě ► mobilní fáze: aromatické, chlorované, heterocyklické uhlovodíky
Univerzální gely – výroba na bázi silikagelu a porézních skel
5
Aplikace ► Stanovení molekulové hmotnosti systému a polydisperzity
Gelový permeační chromatograf Agilent 1100 Series 6
3
10.3.2013
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) Charakterizace ► polyestery bakteriálního původu ► akumulovány jako zásobní forma energie a uhlíku Zástupce ► homopolymer poly(3-hydroxybutyrát) (PHB) (mechanickými vlastnostmi podobný polypropylenu, je však plně biodegradabilní a biokompatibilní)
► kopolymer poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerát) (PHBV) (vzniká inkorporací 3-hydroxyvalerátu do struktury PHB za účelem vylepšení mechanických vlastností)
Využití ► průmysl obalových materiálů (biodegradabilní obaly) ► medicínské aplikace (implantáty, transportní systémy, kryty ran…)
7
Triblokový kopolymer ITA-PLGA-PEG-PLGA-ITA Charakterizace
H
► Poly(mléčná kyselina)
H3C C
O D,L – mléčná kyselina
C OH
HO
► Poly(glykolová kyselina)
H kyselina glykolová
► Poly(ethylenglykol) ► Itakonová kyselina
O CH C
HO
OH
O C
HO
2-methylen-butandiová kyselina
C
CH2
CH2
OH C O
Poly(ethylenglykol)
8
4
10.3.2013
Polyestery
PGA
PLA
PEG
PLA
PGA
9
Příprava vzorku
mrazící box
chladicí box lyofilizace HPLC
GPC kyselina mléčná
pokles molekulové hmotnosti kopolymeru
kyselina glykolová
10
5
10.3.2013
Kvantifikace poklesu molekulové hmotnosti PLGA-PEG-PLGA KolonaPLgel Předkolona Mobilní fáze Nástřik Teplota kolony Průtok Teplota detektoru Doba analýzy
miniMix-E (250×4,6 mm; 3 µm) (50×4,6 mm; 3 µm) tetrahydrofuran 10 µl 30 °C 0,300 ml.min-1 30 °C 30 minut
Tabulka Přehled Mn čerstvě syntetizovaných kopolymerů 11
Porovnání vzorku č.2 a č.3
5. den degradace
10. den degradace 60
40
52,8
34,4
35
50
46,1
30,7 30
45,1
41,1
p o k les M n (% )
p o k les M n (% )
40
23,8
25
20
15
13,7
15,1 12,7
31,6 28,9
30
20
10 10 5
0
0 pH 4,2
pH 7,4
5.den degradace 20% vzorku č. 2
pH 9,2
5.den degradace 20% vzorku č.3
pH 4,2
pH 7,4
10.den degradace 20% vzorku č. 2
pH 9,2 10.den degradace 20% vzorku č.3
Obr. č. 8 Porovnání 20% vzorku č. 2 a 3 po pěti Obr. č. 9 Porovnání 20% vzorků č. 2 a 3 po dnech degradace deseti dnech degradace 12
6
10.3.2013
Závěr Metodou GPC bylo zjištěno: ► největší procentický pokles Mn kopolymerů při pH 9,2 ► nejnižší procentický pokles Mn při pH 4,2 ► kopolymer modifikován kyselinou itakonovou degradoval více ve srovnání s nemodifikovaným kopolymerem
13
14
7
10.3.2013
Pesticidy ► organofosfáty chlorpyrifos, diazinon, parathion, dimethoate, phosmet ► karbamáty carbofuran, aldicarb, methiocarb, pirimicarb, propamocarb ► látky toxické, zdraví škodlivé, nebezpečné pro ŽP
15
Stanovení ► stanovení vybraných pesticidů ve vzorcích odpadní vody a povrchové vody ► odpadní voda - velkokapacitní ČOV v Brně-Modřicích, (14 dní, přítok i odtok) ► extrakce (solid phase extraction) ► vlastní analýza GC/TOF-MS na přístroji Pegasus IV D GC/ECD na přístroji Agilent 6890 N
16
8
10.3.2013
Optimalizace postupu SPE ► 2 druhy sorbentů - Oasis HLB a ENVI-18 ► několik elučních činidel sorbent
eluční činidla
C18
Met-DCM (1:1)
Met-EtAC (1:1)
AC
Met
AC-Met (1:1)
AC-Met (2:1)
Met-AC (2:1)
HLB
-
-
-
-
-
AC-Met (2:1)
Met-AC (2:1)
► výtěžnost se pohybovala v rozmezí 65 – 105 % ► u propamocarbu dosahovala 42 % 17
GC-ECD ► kolony HT-8 (50 m×0,22 mm×0,25 µm) DB-17 MS (60 m×0,25 mm×0,25 µm)
► nástřik 1 µl, 65 °C, splitless ► teplotní program počáteční teplota 45 °C, počáteční izoterma 2 min; rychlost ohřevu 40 °C/min do 220 °C; a následně 5 °C/min do 270 °C, finální izoterma 4 min
► celková doba analýzy
20,38 min 18
9
10.3.2013
ECD2 B, (MB\SIG10001.D) Hz
17500
15000
12500
10000
7500
5000
p ho
2500
sm
et
zi d ia
n on
d im
eth
o at
o rp chl
e
y ri f
os
par
a th
io n
0 10
11
12
13
14
15
16
min
Chromatogram směsi standardů o koncentraci 1 000 ng∙ml-1, (GC/ECD, kolona DB-17 MS) 19
GCxGC-TOFMS ► primární kolona Rxi-5Sil MS (29 m x 0,25 mm, 0,25mm vrstva filmu) ► sekundární kolona BPX-50 (1,4 m x 0,1 mm, 0,1 mm vrstva filmu) ► nástřik
1 µl, 250 °C, splitless
► teplotní program počáteční teplota 45 °C, počáteční izoterma 2 min; rychlost ohřevu 40 °C/min do 220 °C; a následně 5 °C/min do 260°C ► celková doba analýzy
20,38 min 20
10
10.3.2013
Fragmentogram směsi standardů o koncentraci 1 000 ng∙ml-1 Pozn. 1-aldicarb, 2-propamocarb, 3-carbofuran, 4-methiocarb, 5-dimethoate, 6-diazinon, 7-phosmet, 8-pirimicarb, 9-chlorpyrifos, 10-parathion
21
Reálné vzorky – odpadní voda ► koncentrace sledovaných pesticidů na přítoku i na odtoku - řádově v desetinách µg∙l-1 (u methiocarbu v desítkách) ► aldicarb, phosmet, propamocarb a dimethoate – koncentrace často pod mezí detekce nebo kvantifikace ► nejvyšší účinnost odstranění byla prokázána u pesticidu chlorpyrifos (70 %) ► methiocarb a propamocarb - na odtoku zaznamenány vyšší koncentrace než na přítoku (u methiocarbu o 22 %, u propamocarbu o 32 %) 22
11
10.3.2013
Změna koncentrace chlorpyrifosu na přítoku a na odtoku; stanovované pomocí GC/MS-TOF 23
Reálné vzorky – povrchová voda
► ověření, zda se pesticidy dostávají z vyčištěných odpadních vod vypouštěných z ČOV do povrchových vod ► odběrová místa před ČOV, za ČOV, přímo na odtoku z ČOV (řeka Svratka) ► zjištěny vyšší koncentrace sledovaných pesticidů za ČOV než před ČOV (v desetinách nebo setinách µg∙l-1) ► přímo na odtoku byly koncentrace daných pesticidů nejvyšší 24
12
10.3.2013
porovnání koncentrací sledovaných pesticidů ve vzorcích povrchové vody 25
Dvoudimenzionální GC ► separace látek dvěma odlišnými mechanismy → vyšší účinnost separace → lepší identifikace sloučenin než v 1D ► výhody → větší kapacita píků → zvýšení poměru signál/šum → zisk strukturovaného 2D chromatogramu ► pirimicarb a phosmet – vzájemná koeluce v 1D, ve 2D nedochází k překrývání píků
26
13
10.3.2013
pirimicarb a phosmet, koncentrace 500 ng·ml-1
27
Studium distribuce halogenovaných difenyletherů do složek životního prostředí
28
14
10.3.2013
Bromované retardátory hoření
Zdroj: Boer de, K., Boom, J. P.: Polybrominated biphenyls and diphenyl ethers. The handbook of environmental chemistry 3, New types of persistent halogenated compound. 29
30
15
10.3.2013
PBDE - vlastnosti
Zdroj: Donald, M.: Handbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals. Database MSDS: Material safety data sheets
31
Vlastnosti PBDE
Skupina BDE
Mr (g/mol)
Hlavní kongenery
Log Kow
Rozpustnost ve vodě*
Bod varu (°C)
Bod rozkladu (°C) –
Mono-BDE
249,1
3
4,28
4,8
310
Di-BDE
328,1
15
5,03
~2
338 – 340
–
Tri-BDE
406,9
28
5,17–5,58
0,1
–
–
Tetra-BDE
485,8
47, 49
5,87–6,16
~ 0,01
–
–
Penta-BDE
564,7
66, 85, 99, 100
6,64–6,97
~ 0,01
> 300
> 200
Hexa-BDE
643,6
153, 154
6,86–7,92
~ 0,04
–
–
Hepta-BDE
722,5
183, 190
7,05–8,0
~ 8,5 × 10-7
–
–
Okta-BDE
801,4
–
8,35–8,9
~ 9 × 10-7
–
> 232
Nona-BDE
880,3
–
≈9
~ 1,2 × 10-6
–
–
Deka-BDE
959,2
209
9,97
4,17 × 10-9
–
425
Zdroj: Donald, M.: Handbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals. Database MSDS: Material safety data sheets
32
16
10.3.2013
33
PBDE - použití
Zdroj: Donald, M.: Handbook of physical-chemical properties and environmental fate for organic chemicals. Database MSDS: Material safety data sheets
34
17
10.3.2013
35
Zdroje PBDE
36
18
10.3.2013
37
Zpracování, extrakce a přečištění vzorků ► zpracování – pro každou matrici odlišné ► extrakce byla prováděna sonikací 3 x 20 minut ► následně byly extrakty přefiltrovány přes bezv. Na2SO4 a zakoncentrovány na objem 2 ml na vakuové odparce ► extrakt (2 ml) byl vložen na skleněnou kolonu (450 × 20 mm) 2 cm bezv. Na2SO4 / 5 cm akt. Al2O3 / 5 cm akt. Florisil / 2 cm bezv. Na2SO4 ► před použitím kolona promyta 5 ml n-hexanu ► vzorek promýván 90 ml směsi n-hexanu:diethyletheru (94:6) ► po odpaření roztoku do sucha na vakuové odparce rozpuštění v 500 µl isooktanu ► v případě živočišné matrice byla přidána konc. H2SO4 ► k odstranění znečištění bylo nakonec použito mikrofiltru ► finální roztok byl převeden do vialek k následné analýze na GC(ECD)
38
19
10.3.2013
39
Analýza vzorků ► 10 kongenerů v isooktanu → kalibrační řada roztoků o různých koncentracích: Rostlinná matrice Živočišná matrice
0,5 – 1 – 5 – 10 – 25 – 50 ng/ml 0,5 – 1 – 5 – 10 – 25 – 50 – 100 – 500 ng/ml
► samotná analýza → GC-ECD Pracovní podmínky Teplotní program PTV injektoru Teplota detektoru Nastřikované množství Teplotní program pece
Nosný plyn Make-up Celková doba analýzy
90°C (zádrž 0,1 min); 720°C/min do 350°C (5 min); 10°C/min do 220°C 300°C 2 µl 100°C (zádrž 2 min); 30°C/min do 200°C (3 min); 3°C/min do 230°C (15); 5°C/min do 270°C (15 min); 10°C/min do 300°C (20 min) H2 (konstantní průtok: 1,5 ml/min, průtoková rychlost: 31 cm/s) N2 (10 ml/min) 79,33 min 40
20
10.3.2013
41
Rostlinné bioindikátory I ► akumulační bioindikátory ► využívány v rámci monitoringu a kontroly reziduální kontaminace ► zmapování kontaminace a kumulace PBDE u vybraných druhů jehličnanů z různých lokalit ČR Druh
Lokalita
Počet vzorků
Borovice lesní (Pinus sylvestris) Borovice vejmutovka (Pinus strobus)
Praha 8, Radňoves, Moravský Krumlov, Zastávka u Brna, Vranov, Hlubočany
7
Praha 8
1
Jedle bělokorá (Albies alba)
Praha 8, Hrabětice, Vranov, Pohořelice u Zlína, Jelšava (SK)
6
Smrk pichlavý (Picea pungens)
Praha 8, Radňoves, Hrabětice, Česká Třebová, Vranov, Hlubočany, Prostějov, Šelešovice
9
42
21
10.3.2013
Rostlinné bioindikátory II ► používají se pro sledování koncentrací → těžkých kovů (Cd, Pb, Hg) → chlorovaných organických látek (PCB, OCP, DDT) → polycyklických aromatických uhlovodíků ► ověření transportu z půdy do rostlin a možné kumulace také u PBDE
Lokalita
Nový Jičín
Analyzovaná matrice
Počet vzorků
Pšenice obecná (Triticum aestivum)
7
Ječmen (Hordeum)
4
Vojtěška setá (Medicago sativa)
2
Jetel luční (Trifolium pratense)
5
Řepka olejka (Brassica napus)
4
43
Živočišné bioindikátory I (ryby) Lokalita
Počet jedinců
Analyzovaná tkáň
Záhlinické rybníky
3
S, K
8
S, K, V
21
S, K, V
2
S, K, V, J
2
S, K, V
Plotice obecná (Rutilus rutilus)
Záhlinické rybníky, Staré Město pod Landštejnem Brněnská přehrada, Záhlinické rybníky, Vírská přehrada Brněnská přehrada, Vírská přehrada Brněnská přehrada, Záhlinické rybníky Brněnská přehrada, Vírská přehrada, Staré Město pod Landštejnem
3
S, K, V, J
Cejnek malý (Blicca bjoerkna)
Záhlinické rybníky
1
S
Druh Kapr obecný (Cyprinus Carpio) Karas obecný (Carassius Carrasius) Cejn velký (Abramis brama) Bolen dravý (Aspius aspius) Lín obecný (Tinca tinca)
S – sval
K – kůže
V – vnitřnosti
J – játra
44
22
10.3.2013
Živočišné bioindikátory II (ryby) Lokalita
Počet jedinců
Analyzovaná tkáň
Záhlinické rybníky
1
S
Záhlinické rybníky
1
S, K
Brněnská přehrada
2
S, K, V
Brněnská přehrada
1
S, K, V
Záhlinické rybníky, Vírská přehrada
4
S, K, J
Záhlinické rybníky
1
S, K
Záhlinické rybníky
1
S, K
Modřice a Rajhradice
40
S, K, V
Druh Perlín ostrobřichatý (Scardinius erythrophtalmus) Amur bílý (Ctenopharyngodon idella) Okoun říční (Perca fluviatilis) Candát obecný (Sander lucioperca) Štika obecná (Esox Lucius) Úhoř říční (Anguilla anguilla) Sumec velký (Silurus glanis) Jelec Tloušť (Leuciscus cephalus) S – sval
K – kůže
V – vnitřnosti
J – játra
45
Živočišné bioindikátory III (ptáci) ► stanovení obsahů a distribuce jednotlivých kongenerů PBDE v tkáních ► odlov jedinců zajistila dle platné legislativy ČR Ornitologická stanice v Přerově → káně lesní (Buteo buteo), káně rousná (Buteo lagopus) → volavka popelavá (Ardea cinerea), kormorán velký (Phalacrocorax carbo) Datum úhynu
Druh
Lokalita
2003
Káně lesní
Záhlinické rybníky
n=3
3×♀
S*, J, Sr+L
2003
Káně rousná
Záhlinické rybníky
n=1
S*, J, Sr+L
11/2004
Kormorán velký
Hustopeče nad Bečvou
n=4
♀ 2×♂ 2×♀ 2×♂ 2×♀ 4×♀ 5×♀ 3×♂ 2×♀ 1×♂ 1×♀ 5×♀
Počet jedinců Pohlaví
11/2004
Káně lesní
Bartošovice
n=4
12/2004 -/2004
Káně lesní Volavka popelavá
Bartošovice Záhlinické rybníky
n=4 n=5
09/2005
Kormorán velký
Záhlinické rybníky
n=5
09/2005 2007
Volavka popelavá Hustopeče nad Bečvou Kormorán velký
Hustopeče nad Bečvou
n=2 n=5
Analyzovaná tkáň
S*, J S*, J S*, J, Sr+L S*, J, Sr+L S*, J, Sr+L S*, J S, J, Sr, L, M, P, SO, K
S* – prsní sval, S – svaly (prsní + stehenní), J – játra, Sr – srdce, L – ledviny, M – mozek, P – peří, SO – střevní obsah, K – kůže 46
23
10.3.2013
47
Výsledky I – jehličí borovice Lokalita Praha 8 (1) Praha 8 (2) Praha 8 (3) ● Radňoves Moravský Krumlov Zastávka u Brna Vranov Hlubočany
Σ10PBDE (ng/g sušiny) 1,8 1,16 2,09 0,42 0,47 0,85 0,42 0,97
► vzorky Praha 8 vykazují zvýšené celkové koncentrace ► rozdíl v distribuci jednotlivých kongenerů u obou druhů borovic → odlišný zdroj v bezprostřední blízkosti nebo různé složení terpentýnového balzámu Lokalita SV Španělsko Čína
Druh borovice Borovice halepská - Pinus halepensis, Borovice pinie - Pinus pinea Borovice černá - Pinus nigra Borovice černá - Pinus nigra
Analyzovaná matrice
ΣPBDE (ng/g sušiny)
Jehličí
0,027 – 13,04
Kůra
0,65 – 34,5
► Čína: nejvíce zastoupené kongenery BDE-209 (56,9-87,2 %), BDE-47, BDE-99, BDE-183 a BDE-153 → odpovídá složení technických směsích
48
24
10.3.2013
Výsledky I – jehličí jedle Lokalita Praha 8 (1) Praha 8 (2) Hrabětice Vranov Pohořelice u Zlína Jelšava
Σ10PBDE (ng/g sušiny) < LOD < LOD 0,99 0,93 1,01 0,73
Lokalita
Druh jedle
Ottawa
Jedle Frazerova - Abies fraseri
Analyzovaná matrice Jehličí
Σ11PBDE (ng/g sušiny) 0,05 – 2,6
► lokální zdroj úložiště a zpracovací místo OEEZ
49
Výsledky I – jehličí smrk Lokalita Praha 8 Radňoves Hrabětice Česká Třebová (1) Česká Třebová (2) Vranov Hlubočany Prostějov Šelešovice
Σ10PBDE (ng/g sušiny) 4,85 < LOD 1,41 < LOD < LOD 1,01 1,09 0,52 1,63
► nejvyšší obsah PBDE u vzorku Prahy 8 ► identifikovány pouze výšebromované kongenery (# 99>118>153>154>100)
Lokalita
Druh smrku
Ontario
Smrk ztepilý – Picea abies
Analyzovaná matrice Jehličí
ΣPBDE (ng/g sušiny) 0,13 – 6,92
► sledovaná lokalita okolí řízené skládky odpadů v kanadském Ontariu ► pozitivní nálezy → zahřívání plastových spotřebičů při jejich likvidaci → uvolňování PBDE
50
25
10.3.2013
Výsledky II – ekosystém Záhlinice
► nejčastěji detekované kongenery v jednotlivých tkáních BDE-28 a BDE-47 ► závislost mezi obsahem BDE-47 a ΣPBDE → získaná hodnota (R2=0,804) ► hexa- a heptabromované kongenery (BDE-153, BDE-154 a BDE-183) detekovány u více než 93 % tkání°; dohromady tvořily až 79 % podíl z celkové kontaminace
51
Výsledky II – ekosystém Záhlinice ► po analýzách tkání kormoránů byla, až na tři vzorky, zjištěna úplná absence kongenerů PBDE ► nalezené hodnoty Σ10PBDE dosahovaly hladin od 65,4 do 199,3 µg/kg tkáně (max. 3 kongenery) kormoráni
káňata
► u volavek byly pouze 2 vzorky negativní ► u ostatních hladiny od 52,4 do 501,2 µg/kg tkáně (játra), 31,3-549,3 µg/kg tkáně (sval) a 71,9-289,2 µg/kg tkáně (srdce+ledviny) ► káně rousná 183,9 µg/kg tkáně (játra) a 132,2 µg/kg tkáně (sval) ► káně lesní 66 -285,9 µg/kg tkáně (játra), 51,1 - 66 µg/kg tkáně (sval) a 45,1 – 308,9 µg/kg tkáně (srdce+ledviny)
volavky
?Výsledky? → analýzy rybích tkání … kontaminace PBDE minimálně srovnatelná → porovnání nálezů u obou druhů vodních ptáků
52
26
10.3.2013
Výsledky II – ekosystém Záhlinice
► přes kolísavé hodnoty kontaminace patrný proces bioakumulace ► přítomnost PBDE v organismech a jejich transport v rámci potravního řetězce treska – tuleň – lední medvěd – běluha v Severním ledovém oceánu ► v oblasti Baltského moře byl realizován také výzkum kumulace PBDE v řadě sleď – losos – tuleň – rybí olej – člověk
53
Výsledky III – Vírská a Brněnská přehrada ► monitoring PBDE v rybách odlovených ve Vírské a Brněnské přehradě ► hlavní úkol: zjistit kontaminaci rybích jedinců PBDE v obou nádržích v závislosti na délce toku řeky ► další důvody → rozloha resp. význam přehrad → podobné spektrum vyskytujících se druhů ryb → často diskutovaný stav Brněnské přehrady
► bylo odloveno celkem 29 kusů malých a větších ryb ► pilotním druhem se stal cejn velký, kterého bylo analyzováno 20 jedinců ► ze všech druhů ryb byly shodně izolovány vzorky svalu a kůže 54
27
10.3.2013
55
Výsledky III – Vírská a Brněnská přehrada ► porovnání s výsledky monitoringu 40 kongenerů PBDE v 23 jedincích parmy Graellsovy žijících v řece Cinca v severním Španělsku ► ryby byly odloveny ve čtyřech lokalitách ► mezi prvním a posledním odběrovým místem se nacházel zásadní zdroj znečištění průmyslová zóna Monzón zaměřená na chemický a těžký průmysl
vzdálenost 60 km vzdálenost 58 km
56
28
10.3.2013
Výsledky IV – Bartošovice a Hustopeče n/Bečvou ► monitoring zaměřený na → do jaké míry dochází v tělech ptáků ke kumulaci kongenerů PBDE → jak závažné jsou nalezené hladiny v porovnání se zahraničními ► dohromady odloveno celkem 11 vodních a 8 suchozemských ptáků ► z těl ptáků (4x kormorán, 2x volavka, 4x káně) byly izolovány vzorky jater a prsního svalu ► z těl zbývajících 4 káňat bylo separováno srdce a ledviny (směsný vzorek) ► z těl 5 kormoránů byl izolován soubor celkem 8 vzorků → prsní sval, játra, srdce, ledviny, mozek, peří, střevní obsah, kůže
57
Výsledky IV – Bartošovice a Hustopeče n/Bečvou ► získané výsledky jsou až na jednu výjimku prakticky srovnatelné ► výrazně vyšší obsahy PBDE u káněte č. 3 → 443,6 µg/kg (játra) → 507,7 (sval) → 392,1 (srdce+ledviny) ► největší zastoupení BDE-47 a BDE-153 (19,9 resp. 19,7 %) ► nejméně se vyskytovaly nížebromované # 3,15 a 28
► první monitoring na území Polska se v letech 2007 až 2008 ► analýza jater přirozeně uhynulých ptáků ► nejvyšší koncentrace 89,3 - 1.359 ng/g tuku byly zjištěny u káňat a jestřábů ► majoritní kongenery BDE-47 > BDE-153 > BDE-99 58
29
10.3.2013
Výsledky V – Bartošovice a Hustopeče n/Bečvou Σ10PBDE od 65,4 do 199,3 µg/kg tkáně (max. 3 kongenery) 52,4-501,2 µg/kg tkáně (játra) 31,3-549,3 µg/kg tkáně (sval) 71,9-289,2 µg/kg tkáně (srdce+ledviny)
Z porovnání nálezů Σ10PBDE z lokalit Hustopeče a Záhlinice jsou patrné:
a) až 3x vyšší koncentrace u kormoránů z lokality Hustopeče n/Bečvou b) vyšší hodnoty u volavek c) ve 10 vzorcích z Hn/B bylo detekováno všech 10 kongenerů PBDE d) profil kongenerů, dominantní jsou BDE # 47, 99, 100, 153 a 183
59
► ve všech tkáních byla stanovena přítomnost PBDE ► nejnižší obsahy u → peří 0,1 - 1,1 µg/kg (1,9±1,8%) → mozkové tkáně 1,9 - 8,9 µg/kg (6,7±1,5%) → srdce 9,1 - 26,5 µg/kg (2,4±1,3%) ► nejvyšší ve → svalech 232,5 – 544,9 µg/kg (2,6±3,1%) → játrech 236,8 – 527,9 µg/kg (1,6±0,9%) → kůži 214,3 – 523,5 µg/kg (20,3±14,8%) ► BDE-47, BDE-100 a BDE-153 60
30
10.3.2013
Závěr I – rostlinné bioindikátory ► vzorky jehličí v letech 2006 – 2007 z různých regionů ČR
► sledováno 10 kongenerů PBDE a výsledné koncentrace byly vztaženy na sušinu ► nejvyšší obsah sumy majoritních kongenerů PBDE: → 2,09 ng/g borovice vejmutovka (Praha 8) → 1,8 ng/g borovice lesní (Praha 8) → 1,01 ng/g jedle bělokorá (Pohořelice u Zlína) → 4,85 ng/g smrk pichlavý (Praha 8) ► získané výsledky stanovené ve všech druzích jehličí v ČR byly nižší nebo srovnatelné s nálezy publikovanými ve světové literatuře ► ověření vhodnosti použití při monitoringu PBDE → objemná krmiva a olejniny → všechny získané výsledky negativní
61
Závěr II – ekosystém Záhlinice ► v rámci výzkumu bylo odloveno celkem 17 kusů malých a větších ryb (10 druhů) a 14 ptáků (4 druhy) Hlavní cíl ► posoudit míru kontaminace u ryb a ptáků jako dvou na sebe navazujících článků potravinové pyramidy ► výsledky indikují variabilitu mezi různými druhy ryb v závislosti na → obsahu tuku v těle → věku → skladbě potravy analyzovaných jedinců ► nejčastěji detekované kongenery BDE-28 a především BDE-47 (R2=0,804) ► na základě analýz tkání ptáků byly zjištěny výrazné odlišnosti ► napříč trofickými úrovněmi potravního řetězce dochází ke zvyšování koncentrace bromovaných látek v organismu a tím k jejich bioakumulaci Hlavní zdroj kontaminace ► okolní průmyslová výroba, především společnost Fatra a.s. (závody Napajedla a Chropyně) 62
31
10.3.2013
Závěr III – Vírská a Brněnská přehrada ► vodní nádrže na řece Svratce
► přítomnost PBDE ve 49 jedincích malých a středních ryb odlovených (cejn velký tvořil více než 50 % vzorků)
► jedním z úkolů bylo zjistit kontaminaci ryb v obou nádržích v závislosti na délce toku řeky
► mírný nárůst kontaminace u ryb odlovených na dolním toku řeky Svratky
► distribuce jednotlivých kongenerů PBDE v analyzovaných jedincích srovnatelná
► dominantní složku tvořily nížebromované BDE-3, BDE-15, BDE-28 a BDE-47
63
Závěr IV – Bartošovice a Hustopeče n/Bečvou ► káně lesní – lokalita Bartošovice 2004-2007 ► získány srovnatelné výsledky (! 443,6 µg/kg játra, 507,7 sval a 392,1 srdce+ledviny) ► z kongenerů měly největší zastoupení BDE-47 a BDE-153 (19,9 resp. 19,7 %) ► 4 kormoráni a 2 volavky – oblast Hustopečí nad Bečvou ► koncentrace v rozmezí K 254 - 512,5 µg/kg (sval) V 366,8 - 627,3 µg/kg (sval)
232,4 - 517,3 µg/kg (játra) 271,8 - 445,9 µg/kg (játra)
► 5 jedinců kormorána → ve všech tkáních byla stanovena přítomnost PBDE (výrazné rozdíly) → peří 0,1 - 1,1 µg/kg (obsah tuku 1,94 ± 1,76 %) a v mozkové tkáni 1,9 - 8,9 µg/kg (6,71 ± 1,46 %) → svaly 232,5 – 544,9 µg/kg (2,63 ± 3,06 %), játra 236,8 – 527,9 µg/kg (1,55 ± 0,88 %) a kůže 214,3 – 523,5 µg/kg (20,29 ± 14,8 %). ► nejvýrazněji zastoupeny BDE-47, -100 a -153. ► zásadní zdroj PBDE pro obě lokality: vysoce průmyslově orientovaný region Ostravska
64
32
10.3.2013
Využití plynové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí pro posouzení kontaminace odpadních a povrchových vod rezidui léčiv
65
Proč léčiva? ► „Nové“ kontaminanty ŽP ► Vysoká produkce a spotřeba léčiv ► Jen částečné využití organismem (20 %) ► Kontinuální vstup do ŽP ► Ovlivnění přírodních ekosystémů (necílové organismy) ► Zatížení vodních ekosystémů → odpadní voda → povrchová voda → podzemní voda → pitná voda 66
33
10.3.2013
Proč NSAID?
16 6,60
17 6,50
18 6,24
19 5,48 1 46,45
15 6,94 14 7,09 13 7,18 12 7,29
2 17,74
11 7,90 10 7,95
3 11,51
9 8,04 8 8,28
7 9,24
6 9,87
5 11,37
4 11,43
Spotřeba 19 nejpoužívanějších skupin léčiv v ČR za rok 2010 (počet balení v mil)
1
Analgetika a nesteroidní protizánětlivé látky
2
Léčiva ovlivňující renin-angiotenzinový systém
3
Krevní náhrady, infuzní a perfuzní roztoky
4
Antibakteriální léčiva pro systémovou aplikaci
5
Psycholeptika
6
Léčiva proti nachlazení a kašli
7
Beta-blokátory
8
Vazoprotektiva, venofarmaka
9
Léčiva ovlivňující hladinu lipidů
10
Nosní léčiva
11
Léčiva k terapii diabetu
12
Blokátory kalciových kanálů
13
Diuretika
14
Léčiva k terapii onemocnění spojených s poruchou acidity
15
Psychoanaleptika
16
Antikoagulancia, antitrombotika
17
Oftalmologika
18
Léčiva k terapii onemocnění spojených s obstrukcí dýchacích cest
19
Fytofarmaka a živočišné produkty
67
Proč NSAID?
Ketoprofen 0,91
Diklofenak 4,09
Ostatní 2,98
K. salicylová 0,04
K. acetylsalicylová 7,96
Naproxen 0,46
Ibuprofen 10,81
Paracetamol 19,20
Spotřeba vybraných léčiv ze skupin analgetik a NSAID za rok 2010 (počet balení v mil) 68
34
10.3.2013
Proč NSAID? β2-sympathomimetika 3% radioaktivní kontrastní látky 3%
antineoplastika 4%
perorální antidiabetika 3%
veterinární léčiva 3%
antipsychotika 1%
NSAID 16%
antacida 3%
antihypersensitiva 4% antidepresiva 4%
antibiotika 15%
anxyolitika 4% betablokátory 8% antiepileptika 8%
hormonální léky 9%
látky snižující obsah tuků v krvi 12%
Relativní zastoupení farmaceutických látek detekovaných v životním prostředí; Data byla sesbírána ze 134 článků publikovaných v letech 1997 – 2009 [1] 69
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
70
35
10.3.2013
Proč GC-MS? ↑ separační účinnost díky kapilárním kolonám ☺ ↑ citlivost ☺ Tvrdé ionizační techniky – snadná identifikace sloučenin ☺ Orthogonální komprehensivní dvoj-dimenzionální plynová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí Time-of-Flight (GCxGC-TOF MS) ↑ ↑ separační účinnost – dělení na dvou různých kolonách ☺ ☺ ↑ ↑ citlivost - zvýšení poměru signálu k šumu ☺ ☺ ↑ kapacita píků ☺ ☺ Snadná identifikace sloučenin (výběr jakékoliv m/z) ☺ ☺ 71
Optimalizace navržené metody ► Optimalizace derivatizace Výběr vhodného derivatizačního činidla Nalezení optimálních podmínek derivatizace ► Optimalizace SPE Účel - co nejvyšší výtěžnost pH vzorku Koncentrace vzorku (2 koncentrační hladiny) Objem vzorku Detekční limity, vliv matrice, opakovatelnost, výtěžnost
72
36
10.3.2013
Podmínky analýzy ► Nosný plyn He, 1 ml/min (konstantní průtok) ► Teplotní programy Primární kolona: 80 °C po 1 min, 15 °C/min, 300 °C, po 2 min Sekundární kolona: + 5 °C offset Teplota nástřiku: 280 °C ► Modulátor Modulační perioda: 2 s Hot pulse: 0,4 s Cool time: 0,6 s
► MS detekce Ionizace: EI, 70 eV Teplota iontového zdroje: 250 °C Frekvence: 100 spekter/s v rozsahu 50 – 600 amu 73
Návrh metody
✓
SPE (Oasis HLB, 60 mg, 3 ml): 6 ml MeOH 3 ml MILLI-Q vody (pH 2) 250 ml odpadní vody (400 ml povrchové vody), pH 2 3 ml MILLI-Q vody sušení cca 15 min proudem vzduchu 6 ml MeOH → 0,5 ml - odpařeno
✓ DERIVATIZACE: MSTFA + pyridin (200 µl + 200 µl) 70 °C 90 min
74
37
10.3.2013
Analýza pomocí GCxGC-TOF MS 1 – k. salicylová, 2 – k. acetylsalicylová, 3 – k. klofibrová, 4 – ibuprofen, 5 – paracetamol, 6 – kofein, 7 – naproxen, 8 – k. mefenamová, 9 – ketoprofen, 10 - diklofenak
75
Analýza pomocí GCxGC-TOF MS
1 – k. salicylová, 2 – k. acetylsalicylová, 3 – k. klofibrová, 4 – ibuprofen, 5 – paracetamol, 6 – kofein, 7 – naproxen, 8 – k. mefenamová, 9 – ketoprofen, 10 - diklofenak 76
38
10.3.2013
Detekční limity Tabulka 1 detekční a kvantifikační limity Odpadní voda
Povrchová voda
Trimethylislyl deriváty léčiv LOD (ng/l)
LOQ (ng/l)
LOD (ng/l)
LOQ (ng/l)
Kyselina salicylová
0,23
0,78
0,15
0,49
Kyselina acetylsalicylová
0,48
1,59
0,30
0,99
Kyselina klofibrová
1,33
4,42
0,83
2,76
Ibuprofen
5,06
16,7
3,16
10,54
Paracetamol
6,03
20,1
3,77
12,55
Kofein
0,98
3,25
0,61
2,03
Naproxen
0,82
2,74
0,51
1,71
Kyselina mefenamová
0,68
2,26
0,42
1,41
Ketoprofen
1,13
3,78
0,71
2,36
Diklofenak
2,88
9,59
1,80
6,00
77
Výtěžnost metody Tabulka 2 Výtěžnost metody pro jednotlivé analyty (modelové vzorky) Léčiva
Výtěžnost (%) * 250 ml **
400 ml ***
kyselina salicylová
92,2 ± 8,4
85,5 ± 6,2
kyselina acetylsalicylová
95,1 ± 4,1
92,0 ± 4,2
kyselina klofibrová
90,2 ± 5,3
87,6 ± 3,4
ibuprofen
94,3 ± 2,9
90,6 ± 2,7
paracetamol
46,4 ± 4,2
35,0 ± 6,8
kofein
98,3 ± 4,7
94,6 ± 3,0
naproxen
96,5 ± 8,7
95,6 ± 3,8
kyselina mefenamová
97,8 ± 3,5
95,5 ± 3,9
ketoprofen
97,2 ± 8,6
93,9 ± 8,3
diklofenak
98,1 ± 2,4
92,6 ± 2,1
* průměrná hodnota vypočítaná z hodnot pěti paralelních měření ± směrodatná odchylka ** reprezentující vzorek odpadní vody *** reprezentující vzorek povrchové vody
78
39
10.3.2013
Opakovatelnost metody Tabulka 3
Opakovatelnost metody pro jednotlivé analyty a vybrané matrice RSD (%) * Léčivo
odpadní voda modelový vzorek
přítok
odtok
povrchová voda
kyselina salicylová
4,1
7,6
9,0
9,9
kyselina acetylsalicylová
4,8
10,6
-
-
kyselina klofibrová
3,5
-
-
-
ibuprofen
5,2
6,6
9,4
10,9
paracetamol
6,1
6,7
-
-
kofein
4,3
5,7
14,7
12,1
naproxen
4,2
6,6
4,4
8,3
kyselina mefenamová
6,9
-
-
-
ketoprofen
4,5
9,6
6,2
10,5
diklofenak
5,1
5,6
5,0
8,7
* určeno z devíti paralelních měření
79
APLIKACE NA REÁLNÝCH VZORCÍCH ODPADNÍCH A POVRCHOVÝCH VOD
80
40
10.3.2013
Odběry vzorků – odpadní voda ► Velkokapacitní ČOV Brno – Modřice ✓ přítok & odtok ✓ směsné vzorky ✓ dvouhodinový interval ✓ 2.11. – 1.12. 2010
81
Odběry vzorků – povrchová voda ► Řeka Svratka ✓ 4.10. 2010 ✓ 11 míst, celá délka toku ✓ celkem 19 vzorků ✓ tmavé 2,5 l lahve vymyté kyselinou chromsírovou a destilovanou vodou
82
41
10.3.2013
Odběry vzorků – povrchová voda ► Řeka Svitava ✓ 23.10. 2010 ✓ 7 míst po celé délce toku ✓ celkem 12 vzorků ✓ tmavé 2,5 l lahve vymyté kyselinou chromsírovou a destilovanou vodou
83
Úprava vzorků ► FILTRACE – filtry ze skleněných mikrovláken ► SPE:
6 ml MeOH 3 ml MILLI-Q vody (pH 2) 250 ml odpadní vody (400 ml povrchové vody), pH 2 3 ml MILLI-Q vody sušení cca 15 min proudem vzduchu 6 ml MeOH → 0,5 ml - odpařeno
► DERIVATIZACE:
MSTFA + pyridin 70 °C 90 min
84
42
10.3.2013
VÝSLEDKY
85
Výsledky – odpadní voda
86
43
c (µ µ g/l)
2. 1 1. 3. 1 1. 4. 1 1. 5. 1 1. 6. 1 1. 7. 1 1. 8. 1 1. 9. 1 1. 10 .11 . 11 .11 . 12 .11 . 13 .11 . 14 .11 . 15 .11 . 16 .11 . 17 .11 . 18 .11 . 19 .11 . 20 .11 . 21 .11 . 22 .11 . 23 .11 . 24 .11 . 25 .11 . 26 .11 . 27 .11 . 28 .11 . 29 .11 . 30 .11 . 1. 1 2.
10.3.2013
Výsledky – odpadní voda
87
Výsledky – odpadní voda
Kyselina acetylsalicylová
3,0
2,5
2,0
1,5
Přítok
1,0
0,5
0,0
datum
88
44
.
.
.11
.11
.
.
.11
2.
.
.11
.
.
.11
.11
.
.11
.
.
.11
.11
.11
.
.
.11
.11
.
.11
.
.
.11
.11
.
.11
.
.
.11
.
.11
.
.11
.11
.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
.11
1 .1
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9 .1
8 .1
7 .1
6 .1
5 .1
4 .1
3 .1
2 .1
2.1 1. 3.1 1. 4.1 1. 5.1 1. 6.1 1. 7.1 1. 8.1 1. 9.1 1. 10 .11 . 11 .11 . 12 .11 . 13 .11 . 14 .11 . 15 .11 . 16 .11 . 17 .11 . 18 .11 . 19 .11 . 20 .11 . 21 .11 . 22 .11 . 23 .11 . 24 .11 . 25 .11 . 26 .11 . 27 .11 . 28 .11 . 29 .11 . 30 .11 . 1.1 2.
10.3.2013
Výsledky – odpadní voda Ibuprofen
50
45
40
35
c (µ µ g/l) 25 30
Přítok Odtok
20
15
10
5
0
datum
89
Výsledky – odpadní voda Paracetamol
25
20
c (µ µ g/l) 15
10
Přítok
5
0
datum
90
45
2.1 1. 3.1 1. 4.1 1. 5.1 1. 6.1 1. 7.1 1. 8.1 1. 9.1 1. 10 .11 . 11 .11 . 12 .11 . 13 .11 . 14 .11 . 15 .11 . 16 .11 . 17 .11 . 18 .11 . 19 .11 . 20 .11 . 21 .11 . 22 .11 . 23 .11 . 24 .11 . 25 .11 . 26 .11 . 27 .11 . 28 .11 . 29 .11 . 30 .11 . 1.1 2.
2.1 1. 3.1 1. 4.1 1. 5.1 1. 6.1 1. 7.1 1. 8.1 1. 9.1 1. 10 .11 . 11 .11 . 12 .11 . 13 .11 . 14 .11 . 15 .11 . 16 .11 . 17 .11 . 18 .11 . 19 .11 . 20 .11 . 21 .11 . 22 .11 . 23 .11 . 24 .11 . 25 .11 . 26 .11 . 27 .11 . 28 .11 . 29 .11 . 30 .11 . 1.1 2.
10.3.2013
Výsledky – odpadní voda Naproxen
4,0
3,5
3,0
µ g/l) 2,0 c (µ 2,5 Přítok
1,5 Odtok
1,0
0,5
0,0
datum
91
Výsledky – odpadní voda Ketoprofen
6,0
5,0
c (µ µ g/l) 3,0 4,0
Přítok Odtok
2,0
1,0
0,0
datum
92
46
K. a
al icy lo vá
ik lo fe na k
en
81,16 %
D
Ke to pr of
100,00 %
xe n
100
N ap ro
97,90 %
Ko fe in
100,00 %
Pa ra ce ta m ol
účinnost odstraňování (%)
99,83 %
Ib up ro fe n
ce ty ls al icy lo vá
K. s
. . . . . . .
.11 .11 .11 .11 .11 .11 .11
2.
.
.11
.
.11
.
.
.11
.
.
.11
.11
.
.11
.11
. .
.11
.
.11
.11
. .
.11
.
.11
.
.11
1.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
1.
.11
1.1
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9.1
8.1
7.1
6.1
5.1
4.1
3.1
2.1
10.3.2013
Výsledky – odpadní voda Diklofenak
20,0
18,0
16,0
c (µ µ g/l) 10,0 14,0
12,0
8,0 Přítok Odtok
6,0
4,0
2,0
0,0
datum
93
Výsledky – povrchová voda
120
97,37 %
80 72,44 %
60 45,30 %
40
20
0
léčiva
k. klofibrová a k. mefenamová - nedetekovány
94
47
no
-s
ou
to k
S
a
1
2
1
2
1
2
1
2
1
tky
no
ov
ra
Br
am
Sv
Ad
ov
sk o
sk o
am
an
Ad
Bl
an
to vi ce
e
S.
S.
2
Br no
Svratka
Bl
Le
n.
n.
to vic
á
á
Le
ez ov
ez ov
-s ou
ev
Žid ch
ch
ov i
e
ce
ce
ic
e
řic
2
1
2
1
e
S. ..
ic
ov i
ra d
2
1
2
1
dr ov
a
a
ov
ov
od
ra d
ír 2
S. 2
šk
a
2
1
S. 1
šk
un
-M
a
-J
Bi tý
Bi tý
Ti šn
aj h
lo
n.
n.
V
Ti šn
ov
ov
2
1
Ví r1
am
ov
aj h
lo
R
R
ra tk a
ra m ov
ar
ta v
rn o
vi
Žid
B
ká
ká
án
án
m
m
rn o
S
B
er s
ve rs
tě p
tě p
to k
V
Ve
Š
Š
Ji
Ji
Sv
ra tk a
Svitava
vit av a
Bř
Bř
1
Sv
Br n
o
-s
ou
to k
Sv
a
m
m
Sv ra
1
2
1
2
1
tk y
o
ov
ov
sk o
sk o
2
1
S. 2
Br n
Ad a
Ad a
Bl an
2
1
S. 1
to vi ce
Bl an
Le
n.
n.
to vic e
vá
vá
Le
zo
zo
ita va
Bř e
Bř e
vy
av y
Sv ita
Sv it
Svratka
Br
Svitava
vy
vy
c (ng/ml)
ita
ita
Br no
-s
ou
S
ká
ká
án
án
Ži dl
oc
oc
ra
ra
řic
ho vi
ce
ce
di ce
di ce
ho vi
aj h
aj h
Ži dl
R
R
2
1
2
1
2
1
2
1
e
S. .. od
a
a
a
v
v
dr ov
šk
šk
un
-M
a
-J
Bi tý
Bi tý
no
no
S. 2
S. 1
Ví r2
n.
Tiš
2
1
2
1
Ví r1
n.
Tiš
ov
ov
ta v no
vi Br
to k
ra m ov
ra tk a
ra tk a
m ar am ov
Br no
ve rs
ev er s Ve
V
Št ěp
Št ěp
Ji
Ji m
Sv
Sv
c (ng/ml)
Sv
Sv
10.3.2013
Výsledky – povrchová voda 100
Ibuprofen
80
60
40
20
0
místo odběru
1200
Ibuprofen
1000
800
600
400
200
0
místo odběru
95
Výsledky – povrchová voda
350 300 250 200 c (ng/ml) 150 100 50 0
Ketoprofen
místo odběru
100
Ketoprofen
c (ng/ml)
80
60
40
20
0
místo odbě ru
96
48
10.3.2013
Výsledky – povrchová voda Diklofenak 1200
c (ng/ml)
1000 800 600
2
1
ce
ce
di ce
ov i lo
Ži dl
oc
ch
ra aj h
Žid
R
ho vi
1
2
e R
aj h
ra
od
a va
-M o
ita
rn
to k
B
Sv
di ce
řic
S. ..
dr ov
2 it ý
-J
B
Br no Br no
-s
ou
V
Ve
un
šk
ka ýš Bit
ká
ká
ev er s
ve rs
tě p
a
1
2
1
ov
ov
án
Ti šn
n. ov
ov án tě p
Š
Š
Ti šn
S. 1
S. 2
ír 2 V
n.
2
Ví r1
1
m ar am ov
Ji
Ji m
ra m ov
ra tk a Sv
Sv
ra tk a
2
1
400 200 0
Svratka
místo odběru
Diklofenak 500 400 300 c (ng/ml) 200 100
Sv ra
Br n
o
-s ou
to k
S
Bř e
vi ta va
a
Ad a
m
Br n
o
ov
tk y
1
2
1 ov m Ad a
sk o Bl an
ns
2
1 ko
2 to vi ce
Bla
Le
zo v
Le
to vi ce
n. á
á zo v Bř e
1
S. 2
S. 1 n.
vy Sv ita
Sv ita
vy
2
1
0
Svitava
místo odběru
97
Výsledky Tabulka 4: Porovnání rozsahu koncentrací léčiv v jednotlivých matricích trimethylsilyl deriváty léčiv
Odpadní voda (ng/l)
Povrchová voda (ng/l)
přítok
odtok
Svratka
Svitava
20 000 - 55 000
5 - 550
6 - 140
1 -130
400 - 2100
< LOD
ND
ND
ND
ND
ND
ND
13 000 – 46 000
170 – 1 200
10 - 70
30 - 1060
Paracetamol
1 000 - 20 000
< LOD
ND
ND
Kofein
10 000 - 36 000
80 - 1 200
80 - 170
320 - 2300
500 - 3500
80 - 750
3 - 150
3 - 70
ND
ND
ND
ND
Kyselina salicylová Kyselina acetylsalicylová Kyselina klofibrová Ibuprofen
Naproxen Kyselna mefenamová Ketoprofen
400 - 4 000
200 - 1 300
10 - 310
4 - 70
Diklofenak
4 000 - 17 500
1 500 - 10 500
20 - 500
120 - 260
98
49
10.3.2013
Závěr ► GCxGC-TOF MS – výborná technika pro stopovou a ultrastopovou environmentální analýzu Výhody ✓ vysoká separační účinnost ✓ snadná identifikace sloučenin ✓ vysoká citlivost ✓ snadná kvalitativní i kvantitativní analýza Nevýhody ✓ nutnost derivatizace netěkavých látek ✓ poměrně vysoká spotřeba plynného a kapalného dusíku ✓ dražší a instrumentálně náročnější
99
Výsledky – povrchová voda
Nikoliv porovnání technik, ale porovnání studií prováděných na ÚCHTOŽP, během kterých byly využity uvedené instrumentální techniky. 100
50
10.3.2013
101
Diklofenak Zástupce léčiv ► protizánětlivý a antipyretický účinek ► spotřeba v ČR činí asi 20 tun za rok, přibližně 70 % se používá jako masti (volně prodejné) ► účinnost odstranění na ČOV se pohybuje pouze kolem 45 %
102
51
10.3.2013
Acetochlor, metazachlor ► herbicidy (skupina chloracetanilidů) ► na potlačení jednoletých trav a jednoletých dvouděložných plevelů především v kukuřici resp. řepce olejné ozimé ► vysoce toxické pro vodní organismy resp. pro pstruhy a zelené řasy
103
Průběh pokusu ► skleněný reaktor, UV lampa s vodním chlazením, opatřen vrstvou alobalu ► roztok nalit do reaktoru, přívod vzduchu - promíchávání a molekulární kyslík potřebný k reakci ► v časových intervalech odebírány vzorky na analýzu (kinetika, degradační produkty)
104
52
10.3.2013
Identifikace analytů Diklofenak
Acetochlor
Metazachlor
Nástřik vzorku
3 μl
3 μl
3 μl
Kolona
XDB Eclipse C8 150 × 21 mm částice 3,5 μm
XDB Eclipse C18 150 × 21 mm částice 3,5 μm
XDB Eclipse C18 150 × 21 mm částice 3,5 μm
Teplota kolony
30 °C
30 °C
30 °C
MF
MeOH:10 mM amoniumacetát (60:40)
ACN:Milli-Q voda (60:40)
ACN:Milli- Q voda (50:50)
Průtok mobilní fáze
0,2 ml·min-1
0,2 ml·min-1
0,2 ml·min-1
Detekce
282 nm
220 nm
225 nm
Doba analýzy
9 min
9,5 min
9 min
Ionizační mód
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Cílová hmotnost
290
270
278
105
Kvantifikace analytů ► metoda externí kalibrace
Diklofenak
Acetochlor
Metazachlor
LOQ
(μg·ml-1)
0,066
0,070
0,046
LOD
(μg·ml-1)
0,020
0,021
0,013
106
53
10.3.2013
Chromatogramy vzorků odebraných mezi 0 a 40. min. při fotolýze Intens. x105
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
1
2
009-0901.D: TIC -All MS 014-1401.D: TIC -All MS
3
4
010-1001.D: TIC -All MS
5
6
011-1101.D: TIC -All MS
7
8
012-1201.D: TIC -All MS
Time [min]
013-1301.D: TIC -All MS
107
Diklofenak – pravděpodobný průběh degradace O
O
O
5.-10. min HO
Cl
HO
HO H N
-HCl
NH
H N
-Cl Cl
10.-30. min
+H Cl
295,0
225,1
259,0 O
-Cl
-HCl +O2
O
-H2O
+ OHO
HO N
10.-40. min
OH
H N
O
255,1
H N
HO OH
207,1 10.-30. min
241,1
108
54
10.3.2013
Závěr ► Testovány dva fotokatalyzátory práškový (Degussa P25) TiO2 natištěný na nosiči ► Fotokatalyzátor ve formě suspenze má vyšší účinnost ► Diklofenak – úplná degradace je způsobena přímou fotolýzou ► Acetochlor – po 40 min snížení koncentrace o 15%, samovolný rozklad ► Metazachlor – nejrychlejší reakce s práškovým TiO2 – úbytek látky o 15 % – identifikace meziproduktů potvrzuje útok •OH radikálů na molekulu 109
Využití kapalinové chromatografie pro stanovení rezidui léčiv
110
55
10.3.2013
Léčiva ► léčivé látky nebo jejich směsi, případně léčivé přípravky určené k podávání lidem nebo zvířatům
Léčiva v organismu
Léčiva v životním prostředí
V ŽP se vyskytují především tato léčiva: antibiotika, analgetika, anestetika, hormony, antiepileptika 111
Antibiotika ► jedna z nejdůležitějších a nejpoužívanějších skupina léčiv ► přírodní produkována mikroorganismy nebo uměle syntetizovaná ► schopnost inhibovat růst a množení jiných mikroorganismů ► negativní efekty: toxicita, ovlivnění imunity, vznik rezistence, porucha ekologické rovnováhy bakteriální flóry
112
56
10.3.2013
Antibiotika Výskyt antibiotik v ŽP Matrice Léčiva
Odpadní voda
Povrchová voda
Sedimenty
Kal z ČOV
tetracykliny beta-laktamová antibiotika sulfonamidy makrolidy chinolony
113
113
Sulfonamidová antibiotika ► patří mezi nejdéle známá protiinfekční chemoterapeutika ► látky amfoterního charakteru, hodnot a pH se pohybuje v rozmezí hodnot 4,5 - 9; N-H vazba => chovají se spíše jako slabé kyseliny, které jsou polární a dobře rozpustné ve vodě ► vybraná sulfonamidová antibiotika SULFATHIAZOL, SULFAPYRIDIN, SULFAMETHAZIN, SULFAMERAZIN, SULFAMETHOXAZOL, SULFADIAZIN, SULFACETAMID ► Použití při léčbě infekcí močových cest, dýchacích cest ► Léčivé přípravky kotrimoxazol, biseptol, sulfasalazin, sulphacetamid, ialugen, sumetrolim, hypotylin
114
57
10.3.2013
Metody stanovení léčiv
POVRCHOVÁ VODA
SEDIMENT, KAL
115
Analýza reálných vzorků - vzorkování ► Povrchová voda (jaro 2011)
řeky Svratka, Svitava celkem 31 odběrových míst
► Sediment (podzim 2011) ► Vysušený kal z ČOV Brno-Modřice (jaro 2012)
116
58
10.3.2013
Optimalizace metod Ověřované extrakční techniky pro jednotlivé matrice Extrakce Matrice
Extrakce na tuhou fázi
Extrakce za zvýšeného tlaku
Mikrovlnná extrakce
Ultrazvuková extrakce
Povrchová voda Sediment Kal
117
Optimalizace metod VODA
Jaké množství vzorku povrchové vody lze na kolonku nanést, aby získané výtěžnosti byly přijatelné?
Extrakce na tuhou fázi Typ SPE kolonky
ENVI–18 SPE Tubes; 0,5 g sorbentu ENVI–18 SPE Tubes; 1 g sorbentu
Kondicionace kolonky
2 ml 0,1 M kyseliny mravenčí v methanolu 2 ml 5% methanolu
Aplikace vzorku
300 ml povrchová voda, 5 ml extrakt
Sušení proudem vzduchu
5 minut
Promytí sorbentu
2 ml 5% methanolu
Eluce analytu
4 ml 0,1 M kyseliny mravenčí v methanolu Zahuštění pod dusíkem na 0,5 ml
118
59
10.3.2013
Optimalizace metod – přehled optimálních metod Povrchová voda
Matrice Zvolená metoda
SPE ENVI C-18, 1 g
Optimální podmínky extrakce
bez úpravy pH 0,1 M HCOOH v methanolu 5% methanol
HPLC kolona
Sediment
Extrakce za zvýšeného tlaku MeOH; 2 cykly; doba stat. fáze 5 min; sušení 1min. tlak 6 MPa
Literatura
C8
35 – 94 % 1–7%
53 – 73 % 5–7%
34 – 90 % [Hartig]
V (%) =
52 – 80 % 5 – 14 %
55 – 100 % [Lillenberg] 74 – 87 % [Nieto] 39 – 67 % [Díaz-Cruz]
55–100 % [Raich-Montiu],
* 200 ng standardu ve vzorku, vypočteno podle vzorce: ** n = 10
tlak 14 MPa
teplota 40 °C
C18
Účinnost metody* Opakovatelnost (RSD) **
Kal
X ⋅100 R
119
Optimalizace metod – extrakce Mikrovlnná extrakce
SEDIMENT Extrakce za zvýšeného tlaku Množství vzorku
15 g
Extrakční rozpouštědlo
methanol
Teplota
40 – 60°C
Tlak
6 – 14 MPa
Doba statické fáze
7 minut
Proplach rozpouštědlem
2 min
Počet cyklů
2
Množství vzorku
2g
Extrakční rozpouštědlo
methanol
Objem rozpouštědla
15 ml
acetonitril Výkon
800 W
Teplota
115 °C
Doba nahřívání Doba statické fáze Doba chlazení
10 minut 10 minut 40 minut
Ultrazvuková extrakce Množství vzorku
15 g
Extrakční rozpouštědlo
methanol
Objem rozpouštědla
20 ml
Doba extrakce
20 minut
acetonitril
120
60
10.3.2013
Optimalizace metod – extrakce SEDIMENT
Mikrovlnná extrakce
Extrakce za zvýšeného tlaku
Ultrazvuková extrakce
121
Optimalizace metod – extrakce KAL
Extrakce za zvýšeného tlaku Množství vzorku
15 g
Extrakční rozpouštědlo
methanol
Teplota
40 – 60°C
Tlak
6 – 14 MPa
Doba statické fáze
7 minut
Proplach rozpouštědlem
2 min
Počet cyklů
2
Mikrovlnná extrakce Množství vzorku
2g
Extrakční rozpouštědlo
methanol
Objem rozpouštědla
15 ml
acetonitril Výkon
800 W
Teplota
115 °C
Doba nahřívání Doba statické fáze Doba chlazení
10 minut 10 minut 40 minut
122
61
10.3.2013
Optimalizace metod – extrakce KAL
Mikrovlnná extrakce
Extrakce za zvýšeného tlaku, filtrační papír
Extrakce za zvýšeného tlaku, filtrace přes aktivní uhlí
123
Optimalizace metod – HPLC/MS ► HPLC Agilent 1100 Series ► DAD 1024 bit diode array, 190-950 nm ► MS Agilent 6320 Series, Ion Trap Analytické kolony ZORBAX Eclipse XDB-C18; 2,1 x 150 mm; 3,5 mm ZORBAX Eclipse XDB-C8; 2,1 x 150 mm; 3,5 mm Optimální podmínky Mobilní fáze
0,01 M kyselina mravenčí, methanol
Průtok mobilní fáze
0,15 ml/min pro C18; 0,2 ml/min pro C8
Gradient mobilní fáze
t0 = 30 % methanolu, t3 = 40 % methanolu, t6 = 80 % methanolu, t10 = 100 % methanolu
Teplota kolony
20 °C
Vlnová délka detekce
270 nm
Celková délka analýzy
25 minut pro C18; 20 minut pro C8 124
62
10.3.2013
Optimalizace metod – HPLC/MS Retenční čas (min) Kolona C18
Kolona C8
Charakteristické m/z
Sulfacetamid (SAA)
3,6
3,3
215
Sulfadiazin (SDI)
4,4
3,6
251
Sulfathiazol (STA)
4,6
4,2
256
Sulfapyridin (SPY)
5,1
4,6
250
Sulfamerazin (SMR)
5,9
4,9
265
Sulfamethazin (SMZ)
8,4
6,6
279
Sulfamethoxazol (SMX)
11,5
9,3
254
Léčivo
Chromatogram za optimálních podmínek
125
Analýza reálných vzorků Detekována byla léčiva sulfamethoxazol, sulfapyridin, sulfamethazin a sulfamerazin
VODA Koncentrace (ng.l-1)
Země
Lit. zdroj
Sulfonamidy Sulfamethoxazol
820 – 3780 až 1050
ČR
Dizertace Petra Dvořáková
Sulfamethoxazol
až 480
Německo
[Hirsh;1999]
Sulfamethoxazol
až 52
Německo
[Christian; 2003]
Sulfonamidy
až 80
Lucembursko
[Pailler; 2009]
54
Švýcarsko
[Alder; 2001]
Sulfamethoxazol
8 – 2000
Austrálie
[Watkinson; 2009]
Sulfamethoxazol
až 1900
USA
[Kolpin; 2004]
Sulfamethoxazol
až 450
USA
[Batt; 2006]
Sulfamethoxazol Sulfathiazol
až 1000 až 80
USA
[Lindsey; 2001]
Antibiotikum
Sulfamethazin
Reálný chromatogram pro odběrové místo Brno Jundrov (řeka Svratka)
126
63
10.3.2013
Analýza reálných vzorků Řeka Svratka
SEDIMENT Detekována byla všechna sledovaná léčiva; 0,2 −7,3 µg/kg µ
Řeka Svitava
127
Analýza reálných vzorků KAL
Koncentrace (mg.kg-1)(d.w.)
Země
Lit. zdroj
0,89 – 16,5
ČR
[Dizertace; 2012]
< LOQ
Španělsko
[Nieto; 2007]
Sulfonamidy
0,1 – 0,2
Španělsko
[Díaz-Cruz; 2006]
Sulfamethoxazol
0,6 – 21
Španělsko
[Radjenović; 2009]
Sulfamethoxazol Sulfapyridin
34 – 113 24 – 197
Švýcarsko Německo
[Göbel; 2005 ]
Antibiotikum
Detekovaná léčiva sulfacetamid, sulfadiazin, sulfathiazol
Chromatogram reálného vzorku odebraného 8.3.2012
Sulfonamidy Sulfadiazin Sulfapyridin Sulfathiazol Sulfamethoxazol
128
64
10.3.2013
Analýza reálných vzorků – LOD, LOQ Povrchová voda Léčiva sulfacetamid sulfadiazin sulfathiazol sulfapyridin sulfamerazin sulfamethazin sulfamethoxazol
R2 0,9961 0,9999 0,9994 0,9964 0,9986 0,9997 0,9998
LOD = 3.
LOD LOQ (mg.l-1) (mg.l-1) 2,55 8,50 1,09 3,64 1,79 5,98 0,72 2,41 0,92 3,06 0,76 2,52 0,24 0,81
c ( A / As )
Sediment R2 0,9989 0,9988 0,9991 0,9990 0,9998 0,9994 0,9995
LOD (ng.kg-1) 390 70,8 97,9 54,4 47,9 29,9 50,9
Kal LOQ LOD LOQ (ng.kg-1) (ng.kg-1) (ng.kg-1) 1300 627,3 2090 236 114,0 379,8 326 157,7 525,6 181 87,53 291,8 160 77,06 256,9 100 48,07 160,2 170 82,02 273,4
LOQ = 10.
c ( A / As)
129
Závěrečné zhodnocení Maximální hodnoty koncentrací sulfonamidových antibiotik stanovené v reálných vzorcích
130
65
10.3.2013
Závěrečné zhodnocení Výskyt sulfonamidových antibiotik v životním prostředí
Matrice Léčivo Sulfacetamid
Povrch. voda (mg.l-1)
Sediment Kal (mg.(d.w.)kg-1) (mg.(d.w.)kg-1)
Přítok
Odtok
-
-
3,56 - 6,98
< LOD
4,93 - 7,63
4,95 - 5,25
ND
< LOD
< LOD
ND
5,45 - 7,29
< LOD
ND
8,37 - 26,09
< LOD
1,35 - 4,14
5,30 - 16,49
Sulfadiazin
ND
0,34 - 1,28
2,62 - 6,77
Sulfathiazol
0,39 - 5,50
0,89 - 8,77
Sulfapyridin
až 3,78
0,20 - 7,30
ND
Sulfamerazin
až 3,59
0,30 - 2,81
Sulfamethazin
2,72
0,15 - 1,65
až 1,05
0,17 - 2,93
Sulfamethoxazol
Odpadní voda * (mg.l-1)
* Data jsou převzata z dizertační práce Ing. Hana Lisá, PhD.
131
Hormony Chemické povahy ► Hormony peptidové a bílkovinné – vázání na memb. receptory ► Hormony odvozené od aminokyselin – hormony štítné žlázy a dřeně nadledvin ► Hormony odvozené od mastných kyselin – hormony kůry nadledvin a pohlavních žláz ► Hormony steroidní, lipofilní ► Hormony povahy nízkomolekulárních látek Biologického mechanismu ► Biologicky aktivní látky pro mezibuněčnou komunikaci ► Produkovány žlázami s vnitřní sekrecí = endokrinní žlázy)
132
66
10.3.2013
Steroidní hormony ► Odvozeny ze struktury cholesterol 17-14 (Isoprenoid vznikající cyklizací triploidu, skvalenu) ► Ve struktuře obsažen tetracyklický skelet, gonan HC 17-15 3
12
17
11 1 2 A 3
4
C
9 10 5
13
B
8
16
15
7
6 17-15 gonan
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3 H
CH3 CH3 CH3
D
14
H H
HO
CH3 Skvalen
17-14 cholesterol
133
Steroidní hormony ► Lipofilní povaha ► Vylučovány pohlavními žlázami lidmi, zvířaty Dělí se: Ženské hormony – gestageny (estradiol, estron, estriol) ► Kůra nadledvin, vaječníky ► Funkce: příprava pohl. hormonů na těhotenství, příprava mléčných žláz k produkci mléka Mužské hormony – androgeny (např. testosteron) ► Nadledvinky, varlata ► Funkce: ovlivňuje primární i sekundární znaky pohl. orgánů 134
67
10.3.2013
Steroidní hormony ► Městské odpadní vody – lidé Moč: ► Možné koncentrace okolo 10 až 20 ng∙l-1 ► Skutečné koncentrace závisí na antikoncepci, stáří, etapě menstruace, těhotenství, rase ► Zemědělská zvířata – ovce, krávy, prasata, drůbež Stolice, moč: ► Zvířata zpravidla vyloučí 300 – 500 mg∙den-1 ► Množství závisí na druhu zvířat, rase, pohlaví, stáří jedince, reprodukční stav
135
Příprava a zpracování vzorků odpadní vody Čistírna odpadních vod Břeclav ► Odběr vzorků: 15. – 29. 2. 2012 ► Odběr – v 8 hodin ráno ► Vzorkovnice – 1 litrové, tmavé skleněné láhve ► Vzorky – skladovány v lednici při teplotě 5 °C ČOV v areálu Veterinární a farmaceutické univerzity Brno ► Odběr vzorků: 10. – 23. 4. 2012 ► Odběr – v 7 hodin ráno ► Vzorkovnice – 1 litrové, tmavé skleněné láhve ► Vzorky – skladovány v lednici při teplotě 5 °C Odběr směsného 24 hod vzorku o objemu 2 litry na přítoku a odtoku Filtrace vzorku přes skleněná vlákna Extrakce - SPE kolonky (HLB, 60 mg), 250 ml vzorku LC-MS ► Ionizační technika elektrosprej, analyzátor iontová past 136
68
10.3.2013
Experimentální část ► Optimální podmínky LC-DAD Mobilní fáze Průtok mobilní fáze Nástřik Teplota kolony Vlnové délky detekce Celková doba analýzy Gradient mobilní fáze
Acetonitril:Milli-Q voda 0,2 ml∙min-1 2 μl 30 °C 210, 254 nm 23,7 minut (16 minut vlastní analýza; 7,7 minut promývání) Čas [min]
Milli-Q [%]
ACN [%]
0
58
42
16
20
72
137
Experimentální část ► Podmínky MS Tlak zmlžovacího plynu Teplota sušícího plynu Průtok sušícího plynu Rozsah skenovaných hmot (m/z) Detekční mód Napětí na kapiláře Sledované hmoty
25,0 psi 350°C 10 l∙min-1 50 − 400 negativní 3500 V Sledované ionty Léčivo
MS (m/z)
MS2 (m/z)
Estriol E3
287,0
268,8
Estradiol E2
271,0
252,8
Ethynylestradiol EE2
295,0
266,8
Estron E1
269,0
144,8
Diethylstilbestrol DES
267,0
237,8 138
69
10.3.2013
Výsledky – Břeclav Estriol E3 kalibrační závislost Přítok 307,5 – 1409
y = 1289,3x; R2 = 0,9994
ng∙l-1
Odtok 43,16 – 162,0 ng∙l-1
Přítok Odtok
99 8, 9
1200
43 6, 9 43 ,1
44 1, 6 60 ,9
81 ,8
59 ,9
57 ,6
16 2,2
98 ,2
o .P .2 20
t .Č .2 23
á .P .2 17
t .S .2 22
t .Č .2 16
200
76 ,6
400
30 8, 5
600
15 8,2
57 7, 1
800
57 1, 8
74 8, 4
1000
53 ,8
Koncentrace [ng/l]
1400
12 96 ,1
13 73 ,9
1600
14 08 ,4
Koncentrace E3 v reálných vzorcích Břeclav
0
t .S .2 29
t .Ú .2 28
o .P .2 27
á .P .2 24
t .Ú .2 21
139
Výsledky – VFU Brno Estriol E3 y = 13,787x; R2 = 0,9977
kalibrační závislost Přítok 152,5 – 1142
ng∙l-1
Odtok 23,59 – 102,4 ng∙l-1
0
1000
800 Přítok
38 0, 9
23 ,6
26 0, 2 10 2,4
92 ,0
52 ,0
65 ,7
76 ,3
35, 5
15 4, 9 38 ,9
15 2, 5
86 ,9
200
29 5, 1
400
39 3, 9
Odtok
47 1, 7
600
60 ,3
Koncentrace [ng/l]
10 39 ,
97 6, 4
1200
11 41 ,
6
Koncentrace E3 v reálných vzorcích VFU Brno
0 o .P .4 23
á .P .4 20
t .Č .4 19
t .S .4 18
t .Ú .4 17
o .P .4 16
á .P .4 13
t .Č .4 12
t .S .4 11
t .Ú .4 10
140
70
10.3.2013
Srovnání Srovnání účinnosti čistíren odpadních vod
100 90
Účinnost [%]
80 70 60 50 40 30 20 10 0 E3
E2
EE2
Léčiva
ČOV VFU Brno
E1
DES
ČOV Břeclav
141
Závěr ► na ČOV nedochází k úplnému odstranění → hormonální léčiva
představují na ČOV závažné kontaminanty ► Vzhledem k jejich fyzikálně-chemickým vlastnostem lze konstatovat, že
se mohou kumulovat v sedimentu a následně potom i v ostatních biotických i abiotických složkách vodního ekosystému. ► Je známo, že tyto látky mohou svojí přítomností ovlivňovat vodní
živočichy a může dokonce docházet až k feminizaci ryb ► Hormony MES, NOR a PROG nebyly v odpadní vodě detekovány
142
71
10.3.2013
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí
Na řešení se dále podílely studentky DSP Zuzana Olejníčková, Monika Bukáčková, Veronika Pišťková a Lenka Jurasová
v Brně 23. 3. 2012
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí
Děkuji za pozornost
v Brně 23. 3. 2012
72
