BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

VYUŽITÍ GC/MS PŘI ANALÝZE LÉČIV THE USE OF GC/MS FOR THE ANALYSIS OF DRUGS

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS

AUTOR PRÁCE

Bc. RICHARD SÝKORA

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2011

prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-DIP0543/2010 Akademický rok: 2010/2011 Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí Bc. Richard Sýkora Chemie a technologie ochrany životního prostředí (N2805) Chemie a technologie ochrany životního prostředí (2805T002) prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

Název diplomové práce: Využití GC/MS při analýze léčiv

Zadání diplomové práce: 1. Vypracovat literární rešerši na dané téma 2. Na základě zpracované rešerše provést výběr analytů a vhodné metody na bázi plynové chromatografie 3. Optimalizovat metodu pro stanovení vybraných léčiv 4. Stanovení vybraných léčiv ve vodách pomocí optimalizované metody 5. Zhodnocení získaných výsledků a jejich interpretace

Termín odevzdání diplomové práce: 13.5.2011 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.

----------------------Bc. Richard Sýkora Student(ka)

V Brně, dne 15.1.2011

----------------------prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato diplomová práce vychází z aktuální problematiky pĜítomnosti léþiv v rĤzných složkách životního prostĜedí. Nejvíce zatížené prostĜedí z pohledu kontaminace rezidui léþiv je prostĜedí vodné, do kterého se tyto látky dostávají pĜedevším z þistíren odpadních vod, ve kterých dochází jen k jejich þásteþné eliminaci bČhem þistících procesĤ. PĜedkládaná práce je zamČĜena na stanovení vybraných léþiv ze skupiny nesteroidních protizánČtlivých látek (kyselina salicylová, ibuprofen, kofein, naproxen, ketoprofen, diklofenak) v odpadní vodČ. Pro úþely analýzy byly použity a porovnány dva druhy vzorkování: konvenþní bodové odbČry odpadní vody a pasivní vzorkování za použití vzorkovaþe POCIS. Vzorkování probíhalo na pĜítoku a odtoku z ýOV v BrnČ ModĜicích. Jako extrakþní metoda byla použita extrace tuhou fází (SPE) s použitím HLB Oasis kolonek. Vyextrahovaný vzorek byl následnČ derivatizován. Derivatizaþními þinidly byly: MSTFA (Nmethyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid) a BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid). Finální analýza byla provedena pomocí plynové chromatografie s hmotnostnČ spektrometrickou detekcí Time-of-Flight (GC/TOF-MS).

ABSTRACT This thesis is based on the current issue of the presence of drugs in various parts of the environment. The most affected enviroment from the environmental contamination point of wiev with residues of pharmaceuticals is the aqueous environment into which these substances are leaked mainly from sewage treatment plants, which eliminate them during the cleaning process only partially. This work is focused on the selected group of pharmaceutical, non-steroidal antiinflammatory drugs (salicylic acid, ibuprofen, caffeine, naproxen, ketoprofen, diclofenac) in waste water. For analysis purposes two types of sampling were used and compared: the conventional spot sampling of water and wastewater sampling using passive samplers POCIS. Sampling took place at the inflow and outflow from a wastewater treatment plant in Brno ModĜice. As the extraction method was used the solid phase extraction (SPE) using Oasis HLB columns. Extracted sample was derivatized. Derivatization agents were: MSTFA (Nmethyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid) and BSTFA (N, O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid). The final analysis was performed using gas chromatography with mass spectrometric detection time-of-Flight (GC / TOF-MS).

KLÍýOVÁ SLOVA plynová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, léþiva, rezidua léþiv, derivatizace, analgetika, SPE, odpadní voda, vzorkování

KEYWORDS gas chromatography, mass spectrometry, pharmaceuticals, pharmaceutical residues, derivatization, analgetics, SPE, waste water, sampling

3

SÝKORA, R. Využití GC/MS pĜi analýze léþiv. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, Fakulta chemická, 2011. 69 s. Vedoucí diplomové práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc..

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatnČ a že všechny použité literární zdroje jsem správnČ a úplnČ citoval. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v BrnČ a mĤže být využita ke komerþním úþelĤm jen se souhlasem vedoucího práce a dČkana FCH VUT. …………………………. podpis studenta

PODċKOVÁNÍ Velmi rád bych na tomto místČ podČkoval vedoucí práce prof. RNDr. MiladČ Vávrové, CSc. za odborné vedení této diplomové práce a pĜipomínkování. Dále bych chtČl velice podČkovat Ing. Ludmile Mravcové, PhD. a Ing. Petru Lacinovi za jejich pomoc, odborné rady a vstĜícnost.

4

OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 7 2. TEORETICKÁ ýÁST............................................................................................................ 8 2.1. Léþiva .............................................................................................................................. 8 2.1.1. Léþivá látka .............................................................................................................. 8 2.1.2. Léþivý pĜípravek ...................................................................................................... 8 2.1.3. Pomocné látky .......................................................................................................... 8 2.1.4. Léková forma ........................................................................................................... 8 2.1.5. RozdČlení léþiv......................................................................................................... 9 2.2. Analgetika ..................................................................................................................... 11 2.2.1. Historie analgetik ................................................................................................... 11 2.2.2. Narkotická analgetika............................................................................................. 12 2.2.2.1. Mechanismus úþinku narkotických analgetik ................................................. 12 2.2.2.2. RozdČlení narkotických analgetik ................................................................... 12 2.2.3 Nenarkotická analgetika (NSAID) .......................................................................... 12 2.2.3.1. Mechanismus úþinku NSAID.......................................................................... 12 2.2.3.2. Klasifikace NSAID podle chemické struktury................................................ 13 2.3. Vlastnosti vybraných léþiv ............................................................................................ 13 2.3.1. Ibuprofen ................................................................................................................ 13 2.3.2. Deriváty kyseliny salicylové .................................................................................. 14 2.3.3. Ketoprofen.............................................................................................................. 15 2.3.4. Naproxen ................................................................................................................ 16 2.3.5. Diklofenak .............................................................................................................. 17 2.3.6. Kofein..................................................................................................................... 18 2.4. Léþiva v životním prostĜedí........................................................................................... 19 2.4.1. RozšíĜení léþiv v prostĜedí...................................................................................... 20 2.4.2. Léþiva v ýOV a vodním prostĜedí ......................................................................... 21 2.5. Stanovení léþiv ve vodách............................................................................................. 21 2.5.1. Vzorkování ............................................................................................................. 21 2.5.1.1. Konvenþní vzorkování odpadních vod............................................................ 22 2.5.1.2. Vzorkování odpadních vod pasivním vzorkovaþem POCIS........................... 23 2.5.2. Konzervace, doprava a skladování vzorkĤ............................................................. 24 2.5.3. Úprava vzorkĤ pĜed extrakcí .................................................................................. 24 2.5.4. Extrakce.................................................................................................................. 24 2.5.4.1. Extrakce tuhou fází - SPE ............................................................................... 25 2.5.5. Derivatizace............................................................................................................ 26 2.5.5.1. Silylace ............................................................................................................ 26 2.5.6. Chromatografie....................................................................................................... 27 2.5.6.1. Plynová chromatografie - GC ......................................................................... 29 2.5.7. Hmotnostní spektrometrie - MS............................................................................. 31 2.5.7. GC-MS ................................................................................................................... 34 3. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST................................................................................................ 35 3.1. Chemikálie .................................................................................................................... 35 3.2. PĜístroje ......................................................................................................................... 35 3.3. OdbČry vzorkĤ odpadní vody........................................................................................ 35 3.3.1. Konvenþní odbČry vzorkĤ ...................................................................................... 35 5

3.3.2. Pasivní vzorkování ................................................................................................. 35 3.4. PĜíprava vzorkĤ a SPE................................................................................................... 35 3.4.1. PĜíprava a SPE konvenþnČ odebraných vzorkĤ...................................................... 35 3.4.2. PĜíprava vzorkĤ odebraných vzorkovaþem POCIS................................................ 36 3.5. Derivatizace................................................................................................................... 36 3.5.1. Derivatizace MSTFA ............................................................................................. 36 3.5.2. Derivatizace BSTFA .............................................................................................. 36 3.5.3. Retenþní þasy a hmotnostní spektra ....................................................................... 36 3.6. Analýza vzorkĤ ............................................................................................................. 37 4. VÝSLEDKY A DISKUSE................................................................................................... 39 4.1. Koncentrace léþiv v reálných vzorcích ......................................................................... 39 4.1.1. Koncentrace léþiv ve vzorcích odebíraných konvenþním zpĤsobem..................... 51 4.1.2. Množství léþiv zachycených pasivními vzorkovaþi POCIS .................................. 59 5. ZÁVċR................................................................................................................................. 60 6. POUŽITÁ LITERATURA................................................................................................... 62 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLģ.......................................................... 68

6

1. ÚVOD Z literatury je známo, že celosvČtovČ vzrĤstá výroba i spotĜeba humánních i veterinárních léþiv, vyznaþujících se rozdílnou strukturou. Vzhledem k tomu, že tyto látky nebývají vždy kompletnČ eliminovány v lidském ani zvíĜecím tČle, dostávají se následnČ do životního prostĜedí, kde dochází k nepĜíznivému ovlivnČní nČkterých složek pĜírodních ekosystémĤ. Jejich nejvČtší zastoupení je v odpadní vodČ. Bylo však prokázáno, že vČtšina z nich je pĜi procesu þištČní velmi tČžko odbouratelná. Z þistíren odpadních vod se pak tyto látky dostávají do povrchových vod, kde mĤže docházet k intoxikaci vodních organismĤ. ObecnČ se léþiva nacházejí ve vodách ve stopových množstvích, která nemusí zpĤsobovat akutní rizika, avšak se stávají nebezpeþná pĜi dlouhodobé expozici. V dnešní dobČ jsou v humánní i veterinární medicínČ aplikována a v odpadních vodách pĜednostnČ sledována pĜedevším antibiotika a hormonální léþiva, která narušují pĜirozenou mikroflóru v þistírnách odpadních vod a ty pak vykazují menší úþinnost pĜi þištČní vod. Bakterie používané pĜi biologickém þištČní se þasto stávají rezistentní. Avšak už ménČ se berou v úvahu analgetika a nesteroidní antiflogistika, která nejsou sice tak nebezpeþná, ale ve vodách se vyskytují v koncentracích stejných, pĜípadnČ i vyšších. Ke stanovení léþiv bývá nejþastČji používána kapalinová a plynová chromatografie obvykle s hmotnostní detekcí (LC-MS, HPLC-MS, GC-MS), které umožĖují i stanovení degradaþních a metabolických produktĤ. Pokud pro stanovení léþiv ve vodách použijeme plynovou chromatografii, je nezbytné provádČt i derivatizaci; produkty derivatizace jsou potom snadno a rychle stanovitelné. Cílem pĜedložené diplomové práce bylo stanovení vybraných léþiv (kyselina salicylová, ibuprofen, kofein, naproxen, ketoprofen a diklofenak) v odpadních vodách, které byly odebrány na pĜítoku a na odtoku z þistírny odpadních vod v BrnČ – ModĜicích. Pro stanovení byla použita metoda plynové chromatografie s hmotnostnČ spektrometrickou detekcí Time-ofFlight (GC/TOF-MS). Ke vzorkování bylo použito metody aktivního vzorkování, kdy voda byla odebírána jako 24 hodinový slévaný vzorek a také metody pasivního vzorkování za použití vzorkovaþe typu POCIS. Pro izolaci analytĤ z vodné matrice byla použita metoda extrakce tuhou fází (SPE); vzorky byly pĜed vlastním stanovením derivatizovány silylaþními þinidly.

7

2. TEORETICKÁ ýÁST 2.1. Léþiva Za léþiva se považují léþivé látky nebo jejich smČsi, pĜípadnČ léþivé pĜípravky urþené k aplikaci lidem nebo zvíĜatĤm za úþelem prevence chorob, léþení chorob a mírnČní jejich pĜíznakĤ, k diagnostice a k ovlivĖování fyziologických funkcí [1, 2]. 2.1.1. Léþivá látka Pod pojmem léþivá látka se rozumČjí látky pĜírodní nebo syntetické s farmakologickým nebo imunologickým úþinkem, pĜípadnČ látky, které ovlivĖují metabolismus. Celá Ĝada léþivých látek nebo jejich prekurzorĤ se dnes také získává fermentaþními procesy. Tyto látky slouží k prevenci, k léþení a mírnČní chorob, k diagnostice a k ovlivĖování fyziologických funkcí. Ve farmaceutické literatuĜe se dnes velmi þasto používá k oznaþení léþivých látek zkratka API (z angl. Active Pharmaceutical Ingredient) [1]. Léþivými látkami jsou nejþastČji chemické substance s pĜesnČ definovanou strukturou (chemická individua), avšak mohou to být i složité smČsi rĤzných látek, jejichž struktura nemusí být zcela pĜesnČ vymezena. Léþivými látkami jsou napĜíklad pĜedepsaným zpĤsobem upravené suroviny pĜírodního pĤvodu, napĜ. sušené þásti rostlin, silice, výtažky z rĤzných þástí rostlin apod. Relativní hmotnost léþivých látek se pohybuje v rozmezí nČkolika ĜádĤ, od jednotek až do desítek tisíc [1, 3, 4, 5]. 2.1.2. Léþivý pĜípravek Léþivými pĜípravky jsou oznaþeny jakékoliv samostatné léþivé látky nebo produkty získané technologickým zpracováním léþivých látek a látek pomocných do urþité lékové formy, urþené k léþení nebo pĜedcházení nemoci u lidí nebo zvíĜat. Za léþivý pĜípravek se rovnČž považuje jakákoliv látka nebo kombinace látek, které lze podat lidem nebo zvíĜatĤm za úþelem stanovení lékaĜské diagnózy nebo k obnovČ, úpravČ nebo ovlivnČní jejich fyziologických funkcí [1, 2]. 2.1.3. Pomocné látky Tímto termínem oznaþujeme složky léþivých pĜípravkĤ, které samy nemají léþebný úþinek, avšak umožĖují a usnadĖují výrobu, pĜípravu, uchování a aplikaci léþivých pĜípravkĤ. NČkdy mohou pĜíznivČ ovlivĖovat také farmakokinetické vlastnosti pĜítomných léþivých látek [1]. 2.1.4. Léková forma Léková forma pĜedstavuje zpĤsob úpravy léþiva do formy vhodné pro léþebné použití. Musí být pĜizpĤsobena požadované cestČ pĜívodu léþiva do organismu a musí respektovat jeho fyzikálnČ-chemické vlastnosti. Podle zpĤsobu podání ji dČlíme na: enterální - podávané prostĜednictvím trávící trubice parenterální - podávané mimo trávící trubici topické - aplikované lokálnČ na místa dostupná vČtšinou z povrchu organismu. Z hlediska fyzikálnČ-chemických vlastností dČlíme lékové formy na: tuhé - tablety, želatinové tobolky, obdukety a þípky kapalné - injekce, infúze, kapky a roztoky polotuhé - masti, krémy a gely

8

2.1.5. RozdČlení léþiv Tabulka þ. 1: RozdČlení léþiv podle vlastností a použití [1] Analgetika Nenarkotická analgetika deriváty anilinu, deriváty kyseliny salicylové, deriváty anthranilové kyseliny, arylalkanové deriváty, deriváty pyrazolonu a pyrazolidindionu, oxikamy, inhibitory COX-2 Narkotická analgetika Léþiva ovlivĖující centrální nervový systém Celková anestetika inhalaþní a intravenózní anestetika Sedativa a hypnotika Psychofarmaka neuroleptika, antidepresiva, anxiolytika, psychostimulancia, nootropika a léþiva Alzheimrovy choroby, psychodysleptika Antiepileptika Antiparkinsonika Antimigrenika Léþiva ovlivĖující vegetativní nervový systém Adrenergika Į-Adrenergika, Į2-Adrenergika, ȕ1-Adrenergika, ȕ2 Adrenergika a nepĜímá adrenergika Antiadrenergika Cholinergika pĜímá a nepĜímá cholinergika, ireverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy Anticholinergika Myotropní spasmolytika Lokální anestetika a myorelaxancia Lokální anestetika Myorelaxancia periferní a centrální myorelaxancia Antialergika a antihistaminika Antialergika hypostaminika, H1-Antihistaminika H2-Antihistaminika Léþiva obČhové soustavy Hypolipidemika pryskyĜice vážící žluþové kyseliny, léþiva ovlivĖující syntézu lipoproteidĤ, deriváty Į-aryloxyalkanových kyselin, inhibitory HMG-CoA reduktasy, léþiva ovlivĖující vstĜebávání cholesterolu, ostatní hypolipidemika Perorální antidiabetika deriváty sulfonylmoþoviny, deriváty biguanidu, thiazolidindiony, ostatní antidiabetika Léþiva ovlivĖující srážlivost antitrombotika, hemostatika krve Vasodilatacia estery kyseliny dusité a dusiþné, antagonisté iontĤ vápníku, periferní vasodilatacia, léþiva erektilních poruch Antihypertenziva látky blokující sympatikus, pĜímá antihypertenziva, inhibitory angiotensin-konvertujícího enzymu a antagonisté angiotensinu II

9

Léþiva ovlivĖující þinnost kardiotonika, antidysrytmika srdeþního svalu Léþiva trávící a vyluþovací soustavy Antacida, antiulceróza a cytoprotektiva Léþiva používaná k terapii cholagoga, hepatoprotektiva jaterních poruch diuretika, a saluretika, deriváty thiadiazolu, ochlorbenzensulfonamidy, deriváty benzothiadiazinu, ostatní Léþiva ovlivĖující diuretika, léþiva urinární inkontinence, laxativa, prostĜedky vyluþování zmČkþující, objemová þinidla, laxativa dráždící stĜevní stČnu, antidiaroika Antitusika a expektorancia Antitusika antitusika opioidního a neopioidního typu Expektorancia Látky používané k prevenci a terapii infekþních a parazitárních chorob oxidaþní þinidla, halogeny a látky uvolĖující „aktivní Dezinfekþní látky a halogeny“, slouþeniny kovĤ, alkoholy, fenoly, ethery, antiseptika aldehydy a kyseliny, povrchovČ aktivní látky, trifenylmethanová barviva Antibakteriální sulfonamidy, deriváty chinolonĤ, ostatní antibakteriální látky chemoterapeutika karboxylové kyseliny a jejich deriváty, deriváty imidazolu a Antimikotika triazolu, ostatní antimikotika Antimykobakteriální léþiva Antiprotozoární léþiva antimalarika, ostatní antiprotozoika Ǻ-Laktamová antibiotika, tetracykliny a anthracykliny, Antibiotika aminoglykosidy, makrolidy, peptidová antibiotika, ostatní antibiotika Antivirotika Cytostatika Antimetabolity, alkylaþní þinidla a ostatní protinádorová léþiva Vitaminy Vitamíny rozpustné v tucích vitaminy skupin A, D, E, K vitaminy skupiny B - B1 (thiamin), B2 (riboflamin), B3 (nikotinamid), B5 (pantothenová kyselina), B6 (pyridoxin), B12 Vitamíny rozpustné ve vodČ (kobalamid); listová kyselina - vitamin M; vitamin C askorbová kyselina; vitamin H - biotin; ostatní slouþeniny s úþinky vitaminĤ Hormony Hormony - aminokyseliny Peptidové hormony hormony hypotalamu a hypofýzy, hormony slinivky bĜišní estrogeny, inhibitory estrogenĤ, vestaveny, androgeny a Steroidní hormony anabolika, hormony kĤry nadledvin 10

2.2. Analgetika Analgetika jsou látky snižující až potlaþující pocit bolesti, aniž by však výraznČ ovlivĖovaly smyslové vnímání a vČdomí. Mnohá analgetika vykazují také protizánČtlivý (antiflogistický) a antipyretický úþinek. Analgetika neléþí pĜíþinu onemocnČní, ale používají se k napomáhání vlastního léþení tím, že snižují zátČž a stres organismu zpĤsobený bolestí, zánČtem a zvýšenou teplotou. Analgetika dČlíme podle úþinku na analgetika narkotická (anodyna, opioidní analgetika) a na analgetika-antipyretická spolu s nesteroidními protizánČtlivými látkami (NSAID - Non-steroidal Anti-Inflammatory Drugs) [1]. 2.2.1. Historie analgetik Historie léþby bolesti je snad stejnČ stará jako lidstvo samo. Usuzuje se, že þlovČk již v dobČ kamenné používal rybích kostí ke stimulaci nČkterých míst na tČle. StaĜí ýíĖané používali ke tlumení bolesti techniku akupunktury a staĜí ěekové zase používali ke tlumení bolesti elektroléþbu. Prvními léky proti bolesti byly rĤzné výtažky z rostlin a alkoholické nápoje. Prvním používaným lékem proti bolesti vĤbec byla maková šĢáva rozšíĜená z oblasti Sýrie. Do Evropy se opium dostalo v období Renesance a na jeho rozšíĜení mČl velký podíl švýcarský lékaĜ Paracelsus, který vynalezl opiovou tinkturu. V 18. a 19. století bylo opium dodáváno lékárníkĤm a lékaĜĤm jako lék proti bolesti a sedativum. Již od 16. století však opium bylo stále þastČji zneužíváno jako droga. V roce 1805 nČmecký lékárník Serturner izoloval z opia bílý prášek, který nazval morphin. Dalším významným zlomem v tišení bolesti bylo použití etheru jako anestetika pĜi extrakci stoliþek roku 1846 zubním lékaĜem Wiliamem Mortonem v Bostonu [6]. Prvním lékem ze skupiny NSAID, který byl vyrábČn, je kyselina acetylsalicylová. S její výrobou pĜišla v roce 1898 firma Bayer pod názvem Aspirin. V roce 1952 bylo vyrobeno druhé antiflogistikum fenylbutazon, který byl však pro þasté a závažné vedlejší nežádoucí úþinky postupnČ vytlaþen novČjšími, výhodnČjšími látkami. V roce 1969 pĜibyl k již vyrábČným nenarkotickým analgetikĤm ibuprofen, který mČl ve srovnání s pĜedchozími látkami podstatnČ lepší snášenlivost. V souþasné dobČ je v ĜadČ zemí nejþastČji pĜedepisovaným antirevmatikem [7]. Tabulka þ. 2: Srovnání nenarkotických analgetik podle let jejich vzniku 1898 kyselina acetylsalicylová 1952 fenylbutazon 1963 indometacin 1969 ibuprofen 70. léta diklofenak, naproxen 80. léta piroxikam, ketoprofen 90. léta nabumeton, aceklofenak 1995-2000 inhibitory COX II

11

2.2.2. Narkotická analgetika Tyto analgetika se používají ke zvládnutí silné bolesti. Název „narkotická“ vyplynul ze skuteþnosti, že tyto látky vyvolávají ve vyšších dávkách kromČ analgezie (potlaþení bolesti) také spánek nebo ztrátu vČdomí, tj. mají narkotické úþinky [1]. 2.2.2.1. Mechanismus úþinku narkotických analgetik Anodyna jsou analgetika interagující jako antagonisté s opioidními receptory, jejichž pĜítomnost byla prokázána v centrálním a v poslední dobČ i v periferním nervovém systému. PĜirozenými ligandy opioidních receptorĤ jsou endorfiny. Tyto látky zvyšují práh pro vnímání bolesti, jejich pĤsobení je však selektivní a neovlivĖuje vnímání ostatních podnČtĤ [1, 6]. 2.2.2.2. RozdČlení narkotických analgetik Anodyna se dČlí na slabá a silná. Do skupiny slabých anodyn patĜí tramadol, dihydrocodein a kodein. Silná anodyna se podle selektivity dČlí na þisté µ-agonisty (morphin, hydromorphon, oxycodon, pethidin, piritramid, fentanyl, sufentanil), parciální agonisty (buprenorphin) a agonisty-antagonisty (pentazocin, nalbuphin). 2.2.3 Nenarkotická analgetika (NSAID) Tato skupina zahrnuje analgetika-antipyretika spolu s nesteroidními antiflogistiky. Uvedená léþiva se používají k potlaþení mírnČjších bolestí, horeþky a rĤzných zánČtĤ [8]. Vzhledem k tomu, že þastou indikací NSAID bývá revmatismus, jejich dalším a velmi frekventovaným synonymem je název nesteroidní antirevmatika [1]. NSAID mají v porovnání s narkotickými analgetiky tu výhodu, že nejsou návykové a neovlivĖují dechové centrum. Nemají také žádné vedlejší nežádoucí úþinky hormonální povahy, pozorované pĜi antiflogistické terapii kortikosteroidy (odtud název „nesteroidní“). Pro zvýšení úþinku se þasto nenarkotická analgetika kombinují s jinými látkami, napĜíklad s kofeinem. Hlavními zástupci jsou Ibuprofen, Aspirin a Naproxen. K nežádoucím úþinkĤm tČchto látek patĜí gastrointestinální krvácení, ulcerace a performace, které mohou být až smrtelné. Riziko tČchto pĜíhod se zvyšuje s velikostí podané dávky. K dalším nežádoucím úþinkĤm tČchto léþiv se Ĝadí nauzea, zvracení, prĤjem, flatulence, zácpa, dyspepsie, bolest bĜicha, melena (krev ve stolici), hematemeza (zvracení krve) a ulcerativní stomatitis. MénČ þasto gastritis (zánČt žaludku) [8]. 2.2.3.1. Mechanismus úþinku NSAID NSAID inhibují cyklooxygenázu, enzym zodpovČdný za syntézu prostaglandinĤ, které jsou vytváĜeny v ohnisku zánČtu a jsou zdrojem lokálních projevĤ zánČtu, jako je hyperemie, otok, zvýšená teplota, bolestivost apod. Mimo to však prostaglandiny plní celou Ĝadu fyziologických funkcí (napĜ. ochrana žaludeþní sliznice, regulace mikrocirkulace v ledvinách, regulace funkce destiþek atd.). Deplece tČchto tzv. konstituþních prostaglandinĤ potom vede k nežádoucím projevĤm léþby NSAID (NSA gastropatie, nefropatie aj.) [7]. V 90. letech 20. století bylo zjištČno, že existují dvČ formy cyklooxygenasy, které se oznaþují COX-1 a COX-2. Tento objev znamenal velký pokrok v léþení zánČtlivých

12

onemocnČní. Forma COX-2 je inducibilní, tj. aktivuje se a syntetizuje eikosanoidy, odpovČdné za vznik zánČtlivé reakce pouze v místČ poškození organismu. Podle afinity k cyklooxygenasam se NSAID dČlí do tĜí skupin, a to na neselektivní inhibitory COX, preferenþní a selektivní inhibitory COX-2 [1]. Skupina neselektivních inhibitorĤ COX je zastoupena celou Ĝadou léþiv, z nichž nČkterá jsou dostupná i bez lékaĜského pĜedpisu (ibuprofen, diclofenac, naproxen). Tyto léky jsou vhodné pro krátkodobou léþbu bolesti u osob bez rizikových faktorĤ, tj. osob bez poruch krevní srážlivosti nebo krvetvorby, s normální funkcí ledvin a bez anamnézy peptického vĜedu [6]. Tato antirevmatika inhibují v podstatČ oba isoenzymy [1]. Preferenþní inhibitory COX-2 (napĜ. nimesulid, meloxikam) inhibují COX-2 ve vyšší míĜe než COX-1. Novou generací v antirevmatikách jsou tzv. coxiby þili selektivní inhibitory COX-2. Coxiby blokují prakticky výhradnČ COX-2. Tím potom vykazují vysoký protizánČtlivý úþinek s minimálními vedlejšími úþinky na gastrointestinální trakt, neboĢ pĤsobí pouze lokálnČ a cílenČ. Bohužel se však u Ĝady coxibĤ nedávno objevily sice Ĝídké, zato velice závažné vedlejší úþinky na srdeþní sval [1]. 2.2.3.2. Klasifikace NSAID podle chemické struktury Z hlediska chemické struktury lze NSAID rozdČlit na: • deriváty anilinu (acetanilid, paracetamol, fenacetin…) • deriváty kyseliny salicylové (kyselina acetylsalicylová, aloxipirin, diflunisal…) • deriváty anthranilové kyseliny (kyselina mefenamová, meklofenamová, flufenamovátolfenamová…) • deriváty 2-arylalkanových kyselin (indometacin, diklofenak, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, pirprofen…) • deriváty pyrazolonu a pyrazolidinu (fenazon, propyfenazon, metamizolkebuzon…) • oxikamy (piroxikam, isoxikam, meloxikam…) • inhibitory COX-2 (nimesulid, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib…) [1, 7].

2.3. Vlastnosti vybraných léþiv Ke stanovení bylo vybráno šest léþiv: ibuprofen, kyselina salicylová, ketoprofen, naproxen, diklofenak a kofein. Prvních pČt patĜí do skupiny NSAID. Kofein je alkaloid s psychostimulaþními úþinky a je pĜidáván do velkého množství léþiv ne pĜímo jako léþivá látka, ale pĜedevším jako látka pomocná. 2.3.1. Ibuprofen • (2RS)-2-(4-isobuthylfenyl)propanová kyselina • Mr = 206,28 • Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Prakticky je nerozpustný ve vodČ, snadno rozpustný v acetonu, v methanolu a v dichlormethanu. Rozpustný je ve zĜedČných roztocích alkalických hydroxidĤ a uhliþitanĤ [9]. Ibuprofen patĜí mezi neselektivní inhibitory COX skupiny NSAID. Užívá se pĜi mírných a stĜedních bolestech rĤzného pĤvodu (pĜedevším bolesti kloubĤ, svalĤ, zubĤ, hlavy a menstruaþní bolesti), pĜi zvýšené teplotČ a pĜi zánČtech [1,8]. Poprvé byl uveden na trh firmou Boots v 60. letech minulého století pod názvem Brufen.

13

Ibuprofen je díky své nízké toxicitČ a minimálním nežádoucím úþinkĤm na gastrointestinální trakt volnČ použitelným léþivem. Nežádoucím úþinkem mĤže být ojedinČle poškození žaludeþní stČny, a tím pak mĤže docházet k tvorbČ žaludeþních vĜedĤ. Tento stav se vyskytuje pouze u dlouhodobého užívání. Komerþními názvy jsou napĜ.: Apo-Ibuprofen, Brufen, Dolgit, Ibalgin, Ibumax, Nurofen, aj. [1, 8, 10]. Jedna z možností výroby Ibuprofenu je jeho syntetizace z isobutylbenzenu (obr.þ. 1).

Obr.þ.1: Syntéza Ibuprofenu

2.3.2. Deriváty kyseliny salicylové Kyselina salicylová • 2-hydroxybenzoová kyselina • Mr = 138,12 • Bílý krystalický prášek, bílé nebo bezbarvé jehlicovité krystalky. Je tČžce rozpustná ve vodČ, snadno rozpustná v 96% ethanolu a v etheru, mírnČ rozpustná v dichlormethanu [9]. Kyselina salicylová a její deriváty jsou úþinná antipyretika s mírnými analgetickými a protizánČtlivými úþinky. Je obsažena ve vrbové kĤĜe ve formČ glykosidu salicinu. Vrbová kĤra byla již odedávna používána v lidovém léþitelství k potlaþení horeþky. Širší využití kyseliny salicylové a jejich derivátĤ umožnila až Kolbeho-Schmittova syntéza (obr. þ. 2). Samotná kyselina salicylová se nyní používá jen v omezené míĜe. NejrozšíĜenČjším derivátem kyseliny salicylové je kyselina acetylsalicylová - první vyrábČné NSAID (1898 firma Bayer pod názvem Aspirin). Je to volnČ dostupné antipyretikum a analgetikum. Ve vyšších dávkách se stává i protizánČtlivým léþivem. Díky tČmto úþinkĤm je þasto používána na léþení revmatoidních arthritid rĤzného typu. Kyselina acetylsalicylová snižuje agregaþní schopnost krevních destiþek v dĤsledku inhibice syntézy tromboxanu A2. TČchto úþinkĤ se využívá napĜ. k prevenci srdeþního infarktu a mozkové mrtvice. Nežádoucími vedlejšími úþinky mohou být až žaludeþní nebo dvanáctníkové vĜedy, které vznikají pĜi dlouhodobém užívání. Dalším nežádoucím úþinkem mĤže být zvýšená krvácivost vyvolaná vyššími dávkami. U dČtí mladších 12 let hrozí riziko vzniku Reyova syndromu, což

14

je onemocnČní jater a mozku, které mĤže konþit až smrtí. Možností, jak se vyvarovat tČchto nežádoucích úþinkĤ, je užití ibuprofenu, který je stejnČ úþinný, ale bezpeþnČjší. Kyselina acetylsalicylová se získá acetylací kyseliny salicylové acetanhydridem. Jejími komerþními názvy jsou napĜ.: Aspirin, Acylpyrin, Anopyrin, aj. [1, 8, 11].

Obr.þ.2: Kolbeho-Schmittova syntéza kyseliny salicylové

Obr.þ.3: Syntéza kyseliny acetylsalicylová

2.3.3. Ketoprofen • (2RS)-2-(3-benzoylfenyl)propanová kyselina • Mr = 254,28 • Ketoprofen se vyskytuje jako bílý nebo témČĜ bílý krystalický prášek, který je špatnČ rozpustný ve vodČ, snadno rozpustný v acetonu, v ethanolu a v dichlormethanu, jeho teplota tání je okolo 94 °C [9, 11, 13]. Ketoprofen je nesteroidní antirevmatikum ze skupiny derivátĤ kyseliny propionové se silným antiflogistickým, analgetickým a antipyretickým úþinkem. Inhibuje syntézu prostaglandinĤ a leukotrienĤ, které se podílejí na vzniku bolesti a zánČtu, má antibradykininovou aktivitu a stabilizující úþinky na lysozomální membránu [12]. Poprvé byl syntetizován koncem 60. letech 20. století; je to racemická látka, má pravotoþivý optický enantiomer, nazývaný dexketoprofen [13]. Ketoprofen se aplikuje u chronických a degenerativních onemocnČní pohybového ústrojí, zejména u revmatoidní artritidy, ankylozující spondylitidy (BechtČrevova nemoc) a u dekompenzované osteoartrózy. Indikací jsou také projevy mimokloubního revmatismu, drobné poúrazové a pooperaþní stavy, záchvat dny, bolest v nadbĜišku pĜi menstruaci (primární dysmenorea) a bolesti nádorového pĤvodu [14, 15]. NejþastČjšími nežádoucími úþinky bývají gastrointestinální potíže, napĜ. chronické bolesti bĜicha (dyspepsie), nauzea, zvracení, bolesti v nadbĜišku, anorexie, pálení žáhy, prĤjem nebo zácpa. VýjimeþnČ se mohou objevit bolesti hlavy, závratČ, deprese, nervozita, poruchy jaterních funkcí a poruchy zraku [12, 14, 15]. KomerþnČ je ketoprofen prodáván pod názvy: Ketofen, Meprofen, Orudis, Fastum Gel, Ketonal, Profenid, aj. [1, 12, 14]. Ketoprofen se pĜipravuje z kyseliny benzoové (obr. þ. 4) [16].

15

Obr.þ.4: Schéma syntézy ketoprofenu [16]

2.3.4. Naproxen • (2S)-2-(6-methoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina • Mr = 230,26 • Bílý nebo témČĜ bílý krystalický prášek, který je špatnČ rozpustný ve vodČ, dobĜe rozpustný v ethanolu a methanolu a mírnČ rozpustný v etheru. Naproxen je v souþasnosti jediné nesteroidní protizánČtlivé léþivo, které se prodává pouze jako jeden izomer. Jeho teplota tání je 153 °C [9, 13]. Naproxen je derivátem kyseliny propionové a má také analgetické, antiflogistické a antirevmatické úþinky jako ostatní léþiva z této skupiny. Je to hojnČ využívané léþivo v USA, Skandinávii a Velké Británii. Používá se pĜedevším pĜi léþbČ chronických zánČtlivých revmatických chorob [5, 17]. Jeho použití je analogické k použití ibuprofenu, tzn. že se používá nejen ke zmírnČní bolesti hlavy, zubĤ, svalĤ, bolestí zad, menstruaþních bolestí, ale také ke snížení horeþky pĜi nachlazení a zmírnČní bolestí. Jestliže je naproxen dodáván ve formČ potahovaných tablet, je jeho užívání možné až od dvanácti let. RelativnČ þastými nežádoucími úþinky bývají gastrointestinální potíže (nauzea, pálení žáhy, bolesti v nadbĜišku aj.). MénČ þasto se mohou vyskytnout otoky obliþeje, krvácení z trávicího ústrojí, kopĜivka, astmatický záchvat, ztráta vČdomí, þerná stolice obsahující krev, zvracení krve, zánČt žaludku, nový nástup zánČtu tlustého stĜeva a Crohnovy choroby, vĜedový zánČt sliznice ústní dutiny. Tyto úþinky jsou však závažné a vyžadují okamžitou lékaĜskou pomoc [15 ,17]. Naproxen se prodává pod komerþními názvy: Naprosyn, Naxen, Nalgesin S, Emoxen Gel, Aleve, aj. [1, 17].

16

PrĤmyslová výroba naproxenu se skládá z pČti krokĤ a jako výchozí látka se používá 2naftol (Obr. þ. 5) [18].

Obr. þ. 5: Schéma syntézy naproxenu [18]

2.3.5. Diklofenak • 2-[2-(2,6-dichlorofenylamino)fenyl]octová kyselina • Mr = 296,148 • Diklofenak se nejþastČji vyskytuje jako sodná sĤl, potom se jedná o bílý nebo slabČ nažloutlý krystalický prášek, který je slabČ hygroskopický. Diklofenak je mírnČ rozpustný ve vodČ, snadno v methanolu, dobĜe rozpustný v ethanolu, tČžce se rozpouští v acetonu a v etheru je témČĜ nerozpustný. Taje pĜi asi 280 °C za rozkladu [9]. Diklofenak je dalším ze skupiny analgetik, antipyretik a nesteroidních antiflogistik. Je derivátem kyseliny aryloctové; poprvé byl syntetizován v 60. letech a obvykle je dostupný jako diklofenak sodný, draselný nebo diklofenak diethylamin. Diklofenak epolamin je nová sĤl diklofenaku, která byla pĜipravena za pomoci hydroxyethylpyrolidinu [1, 19]. Diklofenak se používá u zánČtlivých a degenerativních revmatických onemocnČní: revmatoidní artritida, ankylozující spondylitida, osteoartróza, spondylóza, mimokloubní revmatismus, akutní dna, posttraumatické a pooperaþní otoky a zánČty, bolestivá a zánČtlivá onemocnČní v gynekologii, napĜ. dysmenorea a adnexitis (zánČt vejcovodĤ a vajeþníkĤ) [15, 20]. PĜi užívání diklofenaku mohou vzniknout tyto vedlejší úþinky: stĜevní a žaludeþní potíže jako nevolnost, zvracení, prĤjem; nČkdy mĤže dojít k poruchám trávení, nadýmání, žaludeþním kĜeþím a nechutenství. VzácnČ se vyskytují bolesti hlavy, poruchy soustĜedČní, nespavost, trombocytopenie, kožní reakce a gastrointestinální vĜedovatČní. [15, 21]. Diklofenak se prodává pod komerþními názvy: Voltaren, Dolmina, Diclofenac AL 25, Veral, aj. [1, 20, 21].

17

Diklofenak se vyrábí syntézou z N-(2,6-dichlorfenyl)fenylaminu. (obr. þ. 6) [1].

Obr.þ.6: Syntéza diklofenaku [1]

2.3.6. Kofein • 1,3,7-trimethylxanthin • Mr = 194.19 • TvoĜí jehlicovité krystalky, hedvábnČ lesklé, lehké zpravidla plstnatČ sdružené, nebo se vyskytuje jako bílý krystalický prášek. Kofein je látka bez zápachu slabČ hoĜké chuti. Je snadno rozpustný v chloroformu, mírnČ ve vodČ a acetonu, v ethanolu (95%) špatnČ a v etheru je témČĜ nerozpustný. Jeho bod tání je 238 °C [22]. Alkaloid kofein byl známý již v 6. století pĜed naším letopoþtem a pro jeho úþinky byl považován za zázraþný lék. Tato látka je obsažena v listech, semenech a plodech kávovníku, ale i v þajovníku, kakaovníku a dalších zhruba šedesáti plodech (maté, yerba, Guayana…). Kofein se nyní nachází ve spoustČ potravinách a nápojích (þokoláda, coca-cola, energetické nápoje, oĜíšky…), ale také je velice þasto pĜidáván jako pomocná látka do spousty léþiv (paralen, panadol, ibufein, neo-cephyl) a rĤzných pĜípravkĤ na hubnutí [23, 24, 25, 26, 27]. Farmaceuticky patĜí kofein mezi psychotronika, což jsou látky stimulující CNS. Udržuje organismus ve stavu bdČlosti, zvyšuje psychickou a fyzickou odolnost, a tak nepĜímo zlepšuje náladu [1]. Nežádoucí úþinky kofeinu mohou být krátkodobé i dlouhodobé. Krátkodobé jsou dobĜe popsány a patĜí mezi nČ zhoršení žaludeþních vĜedĤ, a to díky zvýšené produkci žaludeþních kyselin, kterou kofein zpĤsobuje. Dalšími úþinky mohou být únava, neklid a potíže se spaním. Pravidelné pití kávy pĜed spaním mĤže vyústit v nespavost, ztrátu energie a únavu. Z dlouhodobého hlediska by mohl kofein zvyšovat riziko onemocnČní srdce [28]. Jak již bylo Ĝeþeno kofein se získává pĜírodní cestou z listĤ, semen i plodĤ rĤzných rostlin, ale existuje i jeho syntetická výroba. Jednou z možností je výroba z uracilu (obr. þ. 7) [29].

18

Obr.þ.7: Syntéza kofeinu [29]

2.4. Léþiva v životním prostĜedí S rostoucí spotĜebou léþiv užívaných jak v humánní tak veterinární medicínČ vznikl „nový“ environmentální problém. Pod tímto pojmem se rozumí, že se lidé zaþínají zajímat o osud urþitého polutantu v životním prostĜedí (zde léþiva), který byl do pĜírody ĜádovČ desítky let uvolĖován témČĜ bez povšimnutí [30]. PĜi užívání léþiv jsou z tČla vyluþovány aktivní látky farmak buć v nezmČnČné formČ (30 - 90%) [31], pĜípadnČ ve formČ jejich metabolitĤ, a to prostĜednictvím výkalĤ a moþi. Ty se potom dostávají spolu s odpadní vodou až na þistírny odpadních vod (ýOV). VČtšina z tČchto látek nebývá kompletnČ odstranČna bČhem þistících procesĤ a dostávají se tak do povrchových vod, ze kterých se dále mohou rozšíĜit do vod podzemních nebo i do zdrojĤ pitné vody. Používáním stabilizovaných þistírenských kalĤ jako druhotného hnojiva se mohou léþiva sekundárním zdrojem kontaminace a kontaminovat pĤdy; následnČ se mohou dostat i do potravních ĜetČzcĤ [30, 32]. Dalším významným zdrojem kontaminace životního prostĜedí jsou léþiva s prošlou trvanlivostí, která se mohou dostat do kolobČhu prĤsaky ze skládek, nebo díky spláchnutí do odpadu. Na obr. þ. 8 je znázornČno schéma pĜechodu léþiv do povrchových vod, odkud se mohou dostávat dále do životního prostĜedí [30].

19

Obr. þ. 8: Osud léþiv v životním prostĜedí [30]

2.4.1. RozšíĜení léþiv v prostĜedí Na otázce posouzení rozšíĜení léþiv ve složkách životního prostĜedí nejvíce pracují v USA a v zemích západní Evropy (NČmecko, Švýcarsko…). Z databáze sestavené za úþelem posouzení rizik farmak na životní prostĜedí (spravovaná americkým National Center for Coastal Ocean Science - NCCOS) vyplývá, že aktivní substance byly nalezeny prakticky ve všech složkách životního prostĜedí v koncentracích pohybujících se od 1 ng/l až po 1 mg/l. RĤzné druhy léþiv a jejich rezidua byla detekována témČĜ na všech místech planety. Dále bylo zjištČno, že výskyt tČchto látek v odpadních vodách je pĜímo úmČrný množství prodaných léþiv na daném území. Nejvíce exponovanou složkou životního prostĜedí bývají povrchové vody, a to hlavnČ jejich stĜední a dolní toky. V podzemních vodách se léþiva nacházejí jen ojedinČle, ve velmi nízkých koncentracích, což je vČtšinou zpĤsobeno blízkostí skládek nebo ýOV, pĜípadnČ jiných bodových zdrojĤ. Bylo však rovnČž prokázáno, že diklofenak a kyselina klofibrová byly v podzemních

20

vodách detekovány v nČkolika pĜípadech, aniž by mČly vztah ke konkrétnímu zdroji kontaminace [30, 33]. V pitné vodČ byla poprvé, asi pĜed patnácti lety, zjištČna kyselina klofibrová, a to v NČmecku. U nás byla prokázána kontaminace hlavního zdroje pitné vody pro Prahu (nádrž Želivka) estrogenem v koncentraci pĜes 2 ng/l [30]. PĤdy bývají kontaminovány léþivy hlavnČ v dĤsledku aplikací stabilizovaných þistírenských kalĤ jako druhotných prostĜedkĤ používaných ke hnojení. Na základČ vlastností jednotlivých látek mĤže docházet buć k jejich sorpci na þástice pĤdy nebo k prĤchodu látek do dalších þástí krajiny díky zavlažování nebo srážkám. Jestliže se léþiva sorbují, mĤže u nich následnČ docházet k biodegradaci [30, 36]. 2.4.2. Léþiva v ýOV a vodním prostĜedí Léþiva se do vodního prostĜedí dostávají pĜevážnČ z odtokĤ ýOV, kde nedochází k jejich úplné eliminaci. Konvenþní komunální ýOV nebyly konstruovány na odstranČní léþiv z odpadních vod. Základní metody využívané na ýOV k odstranČní organického zneþištČní, jako je koagulace a flokulace, jsou až na pár výjimek nedostateþné. ObecnČ se léþiva na ýOV odstraĖují z 60-90% [5, 30, 37]. NamČĜené koncentrace léþiv v povrchových vodách se pohybují v Ĝádech ng/l až ȝg/l. Tyto koncentrace nezpĤsobují prakticky žádné akutní riziko, ale mohou být nebezpeþné z pohledu chronické toxicity [34]. V životním prostĜedí pak zpĤsobují závažné problémy v pĜírodních ekosystémech [35]. Nejvíce nebezpeþnými látkami jsou antibiotika a hormonální léþiva, která narušují bakteriální mikroflóru ýOV, která pak vykazuje horší efektivitu þištČní. Menší pozornost je zamČĜena na analgetika, která sice nemají takový vliv na zhoršení procesu þištČní jako již zmiĖovaná antibiotika nebo hormonální léþiva, ale nacházejí se ve vodách v koncentracích minimálnČ srovnatelných [8].

2.5. Stanovení léþiv ve vodách Samotné stanovení léþiv se dá rozdČlit do nČkolika þástí: odbČr vzorku, zakonzervování, pĜeprava, uchování, úprava, extrakce a analýza vzorku. NejþastČjšími metodami pro stanovení léþiv ve vodách jsou v dnešní dobČ kapalinová chromatografie (LC) a plynová chromatografie (GC). Z kapalinové chromatografie se nejþastČji používá vysokoúþinná kapalinová chromatografie (HPLC) a to vČtšinou ve spojení s hmotnostním spektrometrem (HPLC-MS). Dalšími možnostmi je spojení s detektorem diodového pole (HPLC-DAD) nebo UV detektorem (HPLC-UV). Plynová chromatografie se používá ve spojení s hmotnostním spektrometrem (GC-MS) nebo s atomovým emisním spektrometrem (GC-AED) [38, 39, 40, 41, 42, 43]. 2.5.1. Vzorkování Vzorkování je nejslabším þlánkem analytického postupu. Chyby vzniklé nesprávným odbČrem nebo skladováním vzorku nelze již napravit. Analyzovaný vzorek musí reprezentovat jakost vody v místČ, v bodu i v dobČ odbČru [44]. NejþastČjším zpĤsobem vzorkování je bodový (aktivní) odbČr vzorku. Problémem zde je, že odebraný vzorek by mČl reprezentovat vzorkovanou oblast jako celek, ale ve skuteþnosti reprezentuje pouze složení vody v momentČ odbČru. PĜi konvenþním monitoringu vod se odebírá vČtší množství vody, které se v laboratoĜi rĤznými extrakþními metodami zakoncentruje na malý objem, vhodný ke stanovení.

21

Další možností vzorkování je použití pasivního vzorkovaþe. Tyto vzorkovaþe fungují ve vodním prostĜedí na itegrativním principu, tj. po dobu expozice dochází ke kontinuální extrakci sledovaných látek z vody bez toho, aby se dosáhlo termodynamické rovnováhy mezi organickou fází ve vzorkovaþi a vodou. Rychlost akumulování látky je pĜímo úmČrná její koncentraci ve vodČ. Výhody pasivních vzorkovaþĤ jsou napĜ. zachycení výkyvĤ koncentrací kontaminantĤ ve vodách, zjednodušení analytických postupĤ, pĜípadnČ také detekce ultrastopových množství látek [45]. 2.5.1.1. Konvenþní vzorkování odpadních vod Odpadní vody se vyznaþují znaþným kolísáním jakosti. Splaškové vody závisí na používání vodovodĤ koupelen atd., prĤmyslové odpadní vody na technologickém procesu. Z tohoto dĤvodu nestaþí pro posouzení kvality vody jednorázový odbČr vzorku. Odebírají se proto vzorky smČsné v závislosti na þase (za hodinu, za smČnu, za 24 hodin) [46]. To se v dnešní dobČ provádí þasto automatickými vzorkovaþi. Typickými místy odbČrĤ jsou pĜítok a odtok z ýOV [47]. Vzorkování na pĜítoku ýOV Odpadní voda na pĜítoku je znaþnČ nehomogenní médium. DĤležitý je správný výbČr místa pro odbČr vzorku, zvláštČ je-li více pĜítokĤ rĤzné kvality. To platí pro ruþní i automatické vzorkování, které se v dnešní dobČ uplatĖuje stále více. Výhodou využití automatických vzorkovaþĤ je jejich opakovatelnost a také možnost odebírat jimi vzorky nepĜetržitČ a v pĜesnČ daných intervalech. PĜi použití automatického vzorkovaþe se musí dbát na to, že sací koš musí být umístČn uprostĜed toku a ve vhodné hloubce tak, aby nedocházelo k nasávání sedimentĤ ze dna ani plovoucího materiálu z povrchu toku. Tak by totiž došlo k tomu, že odebraný vzorek by nereprezentoval skuteþnou kvalitu pĜítoku [47]. Vzorkování na odtoku z ýOV Z pohledu kvality zde nejsou takové problémy jako na pĜítoku, protože voda je zde þistá a proto neexistují výše uvedené problémy. Problémem však mĤže být, a to hlavnČ u malých þistíren, nízký objem vypouštČné vody nebo její vypouštČní diskontinuálnČ. Tak by mohlo dojít k tomu, že vzorky nebudou odebrány vĤbec. PĜi použití pĜístroje bez záznamu prĤbČhu vzorkování ani nemĤžeme zjistit, co bylo pĜíþinou neodebraného vzorku. Dnes již existují i pĜístroje, vzorkující na základČ události, to znamená, že událostí bude aktuální odtok vody. Program se spustí a vzorek odebere, po zastavení odtoku vody se program opČt pozastaví [47]. OdbČrové láhve NejþastČji se pro odbČr vzorkĤ používají sklenČné a plastové vzorkovnice. Existují i jednorázové vaky, vhodné zejména pro odbČr vzorkĤ obsahujících prioritní polutanty, kde by byla dekontaminace þasovČ i finanþnČ nároþná. U sklenČných vzorkovnic je zapotĜebí dbát na kvalitu skla, protože ne všechny „sklenČné“ nádoby lze použít pro laboratorní úþely.

22

2.5.1.2. Vzorkování odpadních vod pasivním vzorkovaþem POCIS Pasivní vzorkování Pasivní vzorkovaþe fungují ve vodném prostĜedí na integrativním principu, což znamená, že po þas expozice dochází ke kontinuální extrakci sledovaných látek z vody bez toho, aby se dosáhla termodynamická rovnováha mezi organickou fází ve vzorkovaþi a vodou. Rychlost akumulace látky ve vzorkovaþi je pĜímo úmČrná její koncentraci ve vodČ. Pomocí akumulaþní rychlosti je možné odhadnout, a to po ukonþení expozice, hodnotu þasovČ váženého prĤmČru vodné koncentrace analytu (TWA - time-weighted average concentration) i periodicky se opakující zneþištČní po þas expozice. Tímto zpĤsobem je možné snížit nutný interval vzorkování a tak dosáhnout snížení nákladĤ. Dalšími výhodami pasivního vzorkování oproti konvenþnímu jsou napĜíklad zachycení výkyvĤ koncentrací kontaminantĤ ve vodČ, zjednodušení analytického postupu, nebo detekce ultrastopového množství kontaminantĤ, které by nebylo možné bČžnými zpĤsoby detekovat. Další výhodou je i monitorování biodostupné frakce, která je relevantní pro predikci osudu látek v životním prostĜedí. Akumulaþní vlastnosti jsou podobné jako u vodních živoþichĤ, proto se tento model vzorkování þasto oznaþuje jako „virtual fish“ [45, 48]. Technika pasivního vzorkování umožĖuje pĜepoþet koncentrace kontaminantĤ na základČ kalibraþních dat a tím i stanovení koncentrace sledovaných polutantĤ ve vodČ [45]. Kontaminanty jsou pĜi pasivním vzorkování zachyceny a vázány do vhodného media obsaženého ve vzorkovaþi, oznaþovaného jako pĜijímající fáze. Tou mĤže být rozpouštČdlo, chemické þinidlo nebo porézní adsorbent. Koncentrace kontaminantu ve vodném prostĜedí se nemČní vlivem extrakþního procesu. Principem extrakce je pĜestup analyzované látky do pĜijímající fáze z vodného prostĜedí pĜes fázové rozhraní. Limitující vrstvou pĜestupu bývá membrána a þasto i laminární difúzní vrstva vody na povrchu membrány. PrĤbČh akumulace látek z prostĜedí do pĜijímající fáze se dá rozdČlit na dva režimy - kinetický (lineární) a rovnovážný. Z poþátku vzorkování funguje vzorkovaþ v lineárním režimu [45]. Pasivní vzorkování má ale i své nevýhody. Tato technologie je stále ve vývoji a doposud nebyly schváleny referenþní standardizované soustavy a chybí i zakotvení v legislativČ. Monitorování pasivními vzorkovaþi vyžaduje rozsáhlý systém kalibraþních dat a problematickým zĤstává i porovnání s výsledky získanými konvenþním zpĤsobem vzorkování. Specifickým problémem je zneþištČní vzorkovaþe mikroflórou pĜi dlouhodobČjším vzorkování a vytváĜí tak dodateþnou barieru vĤþi pĜestupu látek pĜes fázové rozhraní. Dalším problémem mĤže být i odcizení vzorkovaþe po þas expozice [45]. Pasivní vzorkovaþ POCIS Polární organické chemické integraþní vzorkovaþe (POCIS) se používají k monitorování hydrofilních kontaminantĤ jako jsou pesticidy, léþiva, steroidní hormony, herbicidy… [45, 49]. Tyto slouþeniny se dostávají do vodného prostĜedí celosvČtovČ a u mnohých z nich byl pozorován efekt chronické toxicity. Vzorkovaþ POCIS se skládá z pĜijímající fáze (sorbetu), obklopené z obou stran hydrofilní mikroporézní polyethersulfonovou membránou. To je upevnČno mezi dvČma podpornými kovovými kruhy. Složení sorbetu se volí podle charakteru látek, které chceme monitorovat. Efektivní vzorkovací plocha standardnČ používaného systému POCIS pĜedstavuje 41 cm2 na jeden vzorkovaþ [45, 49]. Vzorkování probíhá pouze z rozpustné fáze a umožĖuje zjištČní skuteþnČ biologicky dostupného podílu. Tyto vzorkovaþe pracují na principu integrativního

23

vzorkování, jsou v prostĜedí exponovány po více týdnĤ a poskytují informaci o þasovČ prĤmČrné koncentraci kontaminantu ve vodném prostĜedí [45]. Na obrázku þ. 9 je znázornČno schéma pasivního vzorkovaþe POCIS.

Obr. þ. 9: Schéma vzorkovaþe POCIS; 1 - podporný kovový kruh, 2 - otvor na šroub, 3 - membrána, 4 - sorbent, 5- otvor na uchycení do držáku

Vzorkování na ýOV Pasivní vzorkovaþe POCIS se umísĢují na pĜítok a odtok z ýOV. 2.5.2. Konzervace, doprava a skladování vzorkĤ Doba, která ubČhne mezi odbČrem vzorku a jeho zpracováním by mČla být co nejkratší, u stanovení organických látek do 24 hodin [50]. Skladování tČchto vzorkĤ by mČlo probíhat pĜi teplotČ 3-4 °C [46, 50]. Po odbČru vzorkĤ by mČla být každá vzorkovnice opatĜena štítkem, aby nemohlo dojít k zámČnČ. Po oznaþení se pĜemístí do transportního koše, kde lahve zĤstanou ve stejné pozici jako pĜi odbČru. Koše mívají þíselnČ oznaþené pozice lahví. Transport tČchto vzorkĤ by mČl trvat co nejkratší dobu [47]. 2.5.3. Úprava vzorkĤ pĜed extrakcí Vzorky odebrané na ýOV, a to zvláštČ na pĜítoku, obsahují velké množství neþistot, a proto je musíme pĜed samotnou extrakcí upravit filtrací. Nejprve se vČtší þástice odstraní na sklenČném vláknitém filtru o velikosti pórĤ 1 ȝm a následnČ se filtrát pĜefiltruje na sklenČném vláknitém filtru o velikosti pórĤ 0,45 ȝm [51]. PĜed samotnou extrakcí se pĜidá do vzorku kyselina (konc. H2SO4 [52], 1 M HCL [51]), aby se pH upravilo na hodnotu 2. 2.5.4. Extrakce VČtšinou není možné pĜímo stanovovat jednu složku ve složitČjším vzorku pĜevedeném do roztoku. Obvykle je nutné oddČlit extrakcí stanovovanou složku od ostatních a vytvoĜit tak analytický vzorek [5]. Z hlediska fyzikální chemie je chápán proces extrakce jako pĜechod složky fázovým rozhraním mezi dvČma vzájemnČ nemísitelnými kapalinami [53]. V našem pĜípadČ se jedná o léþiva, která mají být pĜevedena z kapalného vzorku do jiné fáze. Z této fáze pĜipravíme vhodnými postupy (promývání rĤznými rozpouštČdly) vzorek analytický. 24

NejpoužívanČjší metodou pro extrakci léþiv je extrakce na tuhou fázi (SPE) [43, 51, 52, 54]. Další používanou metodou je extrakce kapalina-kapalina [55]. 2.5.4.1. Extrakce tuhou fází - SPE Extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction - SPE) je v dnešní dobČ nejvýkonnČjší technika dostupná pro rychlou a selektivní pĜípravu vzorku. Její podstatou je zachycení molekul látky na tuhém sorbetu, pĜes který protéká vzorek. PĜi extrakci se využívá chemických vlastností molekul, které v dĤsledku mezimolekulových interakcí ulpívají na sorbentu [53]. SPE má oproti tradiþní extrakci kapalina-kapalina Ĝadu výhod. Tou nejdĤležitČjší je snížení spotĜeby organických rozpouštČdel, která jsou þasto Ĝazena mezi látky jedovaté, niþící ozonovou vrstvu, ale i jinak nebezpeþné. SPE se nejþastČji používá pĜi zpracování kapalných vzorkĤ, pĜedevším pro extrakci stĜednČ tČkavých a netČkavých látek, jejich zakoncentrování a k odstranČní nežádoucích látek, rušících následná analytická stanovení. Princip sorbce u SPE je podobný jako u kapalinové chromatografie. Široká je i nabídka sorbetĤ. Metoda je rychlá, pĜesná a reprodukovatelná. PĜi SPE se analyt sorbuje na tuhou fázi z fáze kapalné. Analyt je rozpuštČn v kapalné fázi, proto musí být jeho interakce s tuhou fází silnČjší než s fází kapalnou. Sorbent je uložen v trubiþkách z polypropylenu nebo ze skla (obr. þ. 10).

Obr. þ. 10: SPE kolonky

Jak již bylo Ĝeþeno, SPE se používá pro izolaci, þištČní a zkoncentrování analytu. Po skonþení SPE je analyt obsažen v roztoku, obsahuje minimum interferujících látek a je v dostateþné koncentraci. Sorbenty v SPE jsou velice podobné sorbentĤm v kapalinové chromatografii. Používají se chemicky obrácené vázané fáze na bázi silikagelu, normální fáze a iontovČ výmČnné fáze, ale i celá Ĝada dalších sorbentĤ [56]. NejþastČji používanými SPE kolonkami pro stanovení léþiv jsou Oasis HLB [34, 38, 57]. Použitelnými jsou i kolonky Oasis MCX [57] a StrataTM X [58].

25

2.5.5. Derivatizace Derivatizace je proces, pĜi kterém je pĤvodní slouþenina chemicky pĜemČnČna tak, aby vzniklá nová slouþenina, která by již mČla vhodné vlastnosti pro stanovení konkrétní analytickou metodou. Vzorky analyzované plynovou chromatografií musí být tČkavé. U málo volatilních a tepelnČ nestabilních látek, stanovovaných plynovou chromatografií, musí vlastnímu mČĜení pĜedcházet právČ derivatizace. Bez pĜedchozí derivatizace by tyto látky mČly nereproduktivní oblast, výšku a tvar píku. NČkteré slouþeniny mohou špatnČ reagovat na urþitý detektor, a proto se takové slouþeniny derivatizací „oznaþují“ pro zlepšení detekce. Derivatizace také mĤže zlepšit rozlišení pĜi koeluci slouþenin a pĜekrývání píkĤ, které je v plynové chromatografii nežádoucí [59, 60]. Použitím správného þinidla a derivatizaþního postupu by mČla vzniknout požadovaná zmČna v chemické slouþeninČ (slouþeninách), která nás zajímá. Základními typy derivatizaþních reakcí používaných pro plynovou chromatografii jsou silylace, acylace a alkylace. NejþastČji používaným typem þinidel jsou þinidla silylaþní, reagující se všemi slouþeninami obsahujícími ve své funkþní skupinČ aktivní vodík, napĜ. -COOH, -OH, -NH a -SH. Acylaþní þinidla reagují s vysoce polárními funkþními skupinami jako jsou aminokyseliny a sacharidy. Alkylaþní þinidla jsou zacílena na aktivní vodík na aminech a na kyselých hydroxylových skupinách [59]. K derivatizaci léþiv se nejvíce používají tato þinidla: • N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (BSTFA) [8] • N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) [8] • N-terc-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (MTBSTFA) [8] • pentafluorbenzylbromid [63] • diazomethan [64] • methanol / BF3 [65] • hydrogensíran tetrabutylamonia [61] Negativní stránkou derivatizace je její pracnost, þasová nároþnost a možný vznik vedlejších derivatizaþních produktĤ. Mezi nevýhody patĜí i nebezpeþné vlastnosti vČtšiny derivatizaþních þinidel, protože mnohá z nich jsou explozivní, jedovatá nebo karcinogenní [61, 62]. 2.5.5.1. Silylace NejpoužívanČjším postupem derivatizace vzorkĤ pro plynovou chromatografii je silylace. Silylaþní þinidla jsou oblíbená pro svou snadnou použitelnost a „þitelnost“ forem jejich derivátĤ. PĜi silylaci je aktivní vodík nahrazen alkylsilyl skupinami, jako jsou trimethylsilyl (TMS) nebo t-butyldimethylsilyl (t-BDMS). Ve srovnání s jejich mateĜskými slouþeninami jsou jejich silyl deriváty tČkavé, ménČ polární a více tepelnČ stabilní. Výsledkem je lepší separace pomocí plynové chromatografie a posílení detekce. Silylaþní þinidla jsou vČtšinou citlivá na vlhkost a je zapotĜebí je zapeþetit pod dusíkem, aby se zabránilo jejich deaktivaci. Deriváty TMS jsou také citlivé na vlhkost, a proto byly zavedeny t-BDMS þinidla, jejichž deriváty jsou 10000krát více hydrolyticky stabilní než TMS deriváty. ObČ þinidla, TMS i t-BDMS, jsou vhodná pro širokou škálu látek; nabízejí vynikající tepelnou stabilitu a mohou být použita za rĤzných podmínek a pĜi rĤzných aplikacích v plynové chromatografii [59]. Pro derivatizaci vybraných léþiv byla v této práci použita silylaþní þinidla: MSTFA a BSTFA . 26

MSTFA (N-Methyl-N-trifluoroacetamid) Toto þinidlo nahrazuje pĜi reakci labilní vodíkový atom a tvoĜí nejvíce tČkavé deriváty, které jsou tepelnČ stabilní a nejpoužitelnČjší k analýze tČkavých stopových materiálĤ, kde mohou mít deriváty píky blízko þinidlĤm nebo vedlejším produktĤm [66].

Obr. þ. 11: Mechanismus reakce MSTFA

BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid) Je to úþinný trimethylsilylový dárce, který reaguje s celou Ĝadou polárních slouþenin a nahrazuje jejich labilní vodíkový atom TMS skupinou. TMS deriváty BSTFA jsou tČkavé a tepelnČ stabilní, a proto se bČžnČ používají v plynové chromatografii s hmotnostní spektrometrií. BSTFA se používá k analyzování zneužívání drog, jako jsou THC metabolity, Morfin a PCP [67, 68].

Obr. þ. 12: Mechanismus reakce BSTFA

2.5.6. Chromatografie Chromatografické metody pĜedstavují nejdĤležitČjší þást všech separaþních metod [69]. Tyto metody jsou pĜedevším metody kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku [53]. Chromatografie využívá dČlení mezi dvČ fáze. Jedna fáze je pohyblivá a je oznaþována jako mobilní fáze, tou bývá plyn nebo kapalina, druhá je nepohyblivá a je oznaþovaná jako stacionární fáze. Ta v chromatografii nabývá nejrĤznČjších forem. ObecnČ je jakákoliv forma stacionární fáze nazývána sorbent. Tímto sorbentem je naplnČna kolona, pĜes kterou postupuje mobilní fáze. SmČs látek k rozdČlení je oznaþován jako vzorek a látky v nČm obsažené jsou složky [69]. Vzorek je pomocí mobilní fáze unášen soustavou pĜes stacionární fázi. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány, a proto se pĜi pohybu zdržují. Více se zdržují složky, které jsou stacionární fází poutány silnČji. Tím se postupnČ složky od sebe separují a na konec stacionární fáze se dostávají dĜíve složky ménČ zadržované [53]. Chromatografické metody mĤžeme dČlit podle nČkolika hledisek. ZĜejmČ nejdĤležitČjším je rozdČlení podle skupenství mobilní fáze a podle fáze stacionární (tabulka þ. 3).

27

Tabulka þ. 3: PĜehled nejdĤležitČjších chromatografických technik [69] Chromatografická Mobilní fáze Stacionární fáze technika Plynová rozdČlovací Kapalina na nosiþi Plyn (plynová chromatografie chromatografie) Plynová adsorpþní Tuhá látka chromatografie Kapalina (polymer) Kapalinová rozdČlovací vázaná na nosiþi chromatografie Kapalina (kapalinová Kapalina v pórech Gelová permeaþní chromatografie) sorbentu chromatografie IontovČ výmČnná Tuhá látka chromatografie Chromatografie Tekutina Kapalina (polymer) s mobilní fází v nadkritickém stavu vázaná na nosiþi v nadkritickém stavu

Užívaný symbol GLC GSC LLC GPC LSC SFC

Dalším možným rozdČlením je podle : • UspoĜádání stacionární fáze o Kolonová chromatografie – stacionární fáze je umístČna v trubici (kolonČ) o Plošné techniky: Papírová chromatografie (Paper Chromatography – PC) – stacionární fáze je souþástí chromatografického papíru. Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography – TLC) – stacionární fáze je umístČna na pevném plochém podkladu (napĜ. sklenČné desce nebo hliníkové fólii). • DČje, který pĜevládají pĜi separaci Obvykle se pĜi separaci uplatĖuje nČkolik fyzikálnČ-chemických dČjĤ souþasnČ, ale jeden z nich pĜevládá. o RozdČlovací chromatografie – o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku ve stacionární fázi (kapalina) a mobilní fázi (kapalina nebo plyn). o Adsorpþní chromatografie – o separaci rozhoduje rĤzná schopnost složek poutat se (adsorbovat se) na povrch stacionární fáze (tuhá látka). o IontovČ-výmČnná chromatografie – o separaci rozhodují rĤznČ velké elektrostatické pĜitažlivé síly mezi funkþními skupinami stacionární fáze (iontomČniþ) a ionty vzorku. o Gelová chromatografie – složky se separují podle velikosti na pórovité stacionární fázi (gelu); menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdržují déle (molekulovČ sítový efekt). o Afinitní chromatografie – stacionární fáze je schopna vázat ze vzorku právČ urþité složky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu) [53].

28

2.5.6.1. Plynová chromatografie - GC V analýze tČkavých látek má plynová chromatografie výsadní postavení mezi separaþními metodami. Hlavními výhodami této techniky jsou jednoduché a rychlé provedení analýzy, úþinná separace látek a malé množství vzorku potĜebného k analýze. Plynová chromatografie má mnoho variant, v praxi nejpoužívanČjšími jsou plynové chromatografy s kapilárními kolonami [70]. Na obrázku þ. 13 je zjednodušené schéma plynového chromatografu.

Obr. þ. 13: Zjednodušené schéma plynového chromatografu [70]

Stacionární fáze v plynové chromatografii Obvykle dČlíme plynovou chromatografii na chromatografii v systému plyn - pevná látka (GSC) a na chromatografii plyn - kapalina (GLC). U GSC je distribuce analytu mezi fázemi založena na adsorpci; zde je však nevýhodou úzká oblast linearity adsorpþní isotermy. NejpoužívanČjšími adsorbenty jsou silikagel, aktivní uhlí a alumina. GLC je pĜíkladem rozdČlovací chromatografie; v tomto pĜípadČ dochází k rozpuštČní látky v obou fázích. Kapalná fáze je v kolonČ ukotvena, musí mít nízkou tenzi par a musí být chemicky stabilní i pĜi vysoké pracovní teplotČ. NejpoužívanČjšími kapalnými stacionárními fázemi jsou polyethylenglykoly, polyestery nebo polysiloxany [69, 70]. Mobilní fáze - nosný plyn Mobilní fází je v plynové chromatografii nosný plyn. Úlohou nosného plynu je transportovat složky vzorku kolonou a pĜitom se neúþastnit separaþního procesu. NejþastČji používanými plyny jsou vodík, dusík, helium a argon. PĜi volbČ nosného plynu uvažujeme pĜedevším tyto faktory: viskozita, úþinnost, þistota, reaktivita, typ použitého detektoru a cena plynu. PrĤtok mobilní fáze musí být optimalizován tak, aby se dosáhlo co nejlepšího rozdČlení látek na kolonČ, tj. nejmenšího rozšíĜení zón separovaných látek. ýtyĜi hlavní dČje, podílející se na rozšiĜování zón bČhem prĤchodu kolonou, jsou víĜivá difúze, podélná molekulární difúze, odpor proti pĜenosu hmoty ve stacionární fázi a odpor proti pĜenosu hmoty v mobilní fázi [69, 70]. PĜi stanovování léþiv se nejþastČji používá jako nosný plyn helium [52, 77].

29

Plynový chromatograf se skládá z regulátoru tlaku a prĤtoku, injektoru, kolony, detektoru a vyhodnocovacího zaĜízení, kterým bývá poþítaþ. Regulátory tlaku a prĤtoku Jsou to elektronické regulaþní zaĜízení sloužící k ovládání prĤtoku a tlaku nosného plynu. Regulátor prĤtoku zaruþuje konstantní prĤtok plynu kolonou a detektorem bez ohledu na typ nosného plynu, teplotu a rozmČry kolony. PromČnnou veliþinou je zde tlak, který se nastaví automaticky podle viskozity plynu, vnitĜního prĤmČru kolony a délky kolony tak, aby prĤtok kolonou byl konstantní [70]. Injektor Analyzovaná látka se do plynového chromatografu dostává injektorem. Látka je nastĜíknuta pomocí speciální injekþní stĜíkaþky pĜes septum, které oddČluje vnitĜek injektoru od vnČjšího prostoru. K rychlému odpaĜení vzorku vysokou teplotou a ke správnému promíchání par vzorku s nosným plynem dochází ve sklenČné vložce tzv. lineru, jenž je souþástí injektoru. Mezi injektorem a kolonou se nachází dČliþ toku (splitter) umožĖující vést jen þást odpaĜeného vzorku na kolonu (splitovací pomČr - split ratio). Pro stopovou analýzu nebo analýzu smČsí látek, které mají výrazný rozdíl v bodu varu, se používá technika nástĜiku bez splitu (splitless injection) [70]. Kolona Používanými kolonami v plynové chromatografii jsou buć náplĖové nebo kapilární kolony. Vzhledem k vyšší úþinnosti se pĜevážnČ používají kapilární kolony. NáplĖové kolony jsou trubice vyrobené ze skla nebo nerezové oceli dlouhé 0,5-4 m o prĤmČru 2-5 mm. Obsahují adsorbent nebo nosiþ se zakotvenou kapalnou fází. Kapilární kolony jsou otevĜené kapiláry, kde funkci nosiþe zastávají vnitĜní stČny kapiláry, které jsou pokryty kapalnou stacionární fází. Kapilární kolony jsou vyrobeny z taveného kĜemene, jejich délka se pohybuje od desítek do stovek metrĤ a prĤmČr mají 0,2-0,7 mm. Kolona je umístČna v termostatu temperovaném na urþitou teplotu. Teplota je dĤležitá promČnná v plynové chromatografii. Pokud je teplota kolony bČhem analýzy konstantní, jedná se o isotermální analýzu. Pro analýzu vzorkĤ multikomponentních smČsí látek s rozdílnými body varu je vhodné použít teplotního gradientu. Zde se teplota kolony bČhem analýzy mČní podle vytvoĜeného teplotního programu. Výhodou použití teplotního gradientu je zlepšení tvaru chromatografických píkĤ a výrazné zkrácení doby analýzy [69, 70] Pro stanovení léþiv se nejþastČji používají kapilární kolony o délce 30 m s prĤmČrem 0,25 mm a tloušĢkou sorbentu 0,25 ȝm [43, 52, 77]. Detektor Úkolem detektoru je rozlišit prĤchod samotného nosného plynu a nosného plynu s obsahem eluované složky a poskytnout tak rozdílné signály. Prvním pĜedpokladem úspČšné detekce je dobré rozdČlení analyzované smČsi na kolonČ. Je-li toto rozdČlení nedokonalé, nepomĤže k dosažení dobrého výsledku sebelepší detektor. Charakteristikou dobrého detektoru je dobrá stabilita signálu, velká citlivost a dostateþnČ rychlá reakce na zmČnu složení procházejícího eluentu. Teplota detektoru by mČla být vyšší než je teplota plynĤ vycházejících z kolony, aby se zabránilo kondenzaci látek na stČnách detektoru. V plynové chromatografii se využívá nČkolik typĤ detektorĤ: • TepelnČ vodivostní detektor (TCD, katarometr): Podstatnou þástí TCD je tenké odporové vlákno umístČné uvnitĜ kovového bloku. Vláknem prochází konstantní elektrický proud a zahĜívá je na urþitou teplotu. Jestliže detektorem prochází nosný plyn, je teplota vlákna konstantní. Obsahuje-li plyn eluovanou složku s jinou tepelnou vodivostí než má nosný plyn, zmČní se teplota vlákna a tím i jeho elektrický odpor. Vhodnými nosnými plyny jsou vodík nebo helium. V praxi se vedle sebe zapojují dva TCD detektory, do jedné z mČrných cel se pĜivádí þistý nosný plyn, do druhé plyn

30

•

•

•

•

•

•

vycházející z kolony. TCD je univerzální detektor. Má široký lineární dynamický rozsah, ale je málo citlivý. Používá se omezenČ, hlavnČ pro analýzy neuhlovodíkových plynĤ. Plamenový ionizaþní detektor (FID): Plyn z chromatografické kolony je zavádČn do kyslíko-vodíkového plamene, kde probíhají chemionizaþní reakce vedoucí ke vzniku nabitých þástic. Podstatnou þástí detektoru je hoĜáþek, opatĜený na spodní þásti pĜívodem nosného plynu a vodíku. Ionty a elektrony vytvoĜené spálením složek v nosném plynu, umožĖují elektrický tok mezi elektrodami, na které je vloženo stabilizované stejnosmČrné napČtí. Vzduch jako pomocný plyn se pĜivádí do spodní þásti detektoru. FID poskytuje odezvu témČĜ na všechny organické látky. Odezvu nedává vČtšina anorganických plynu a par a nČkteré organické látky (formaldehyd, chlorid uhliþitý). Nastavení prĤtoku vodíku a vzduchu je velmi dĤležité a musí být provedeno i s ohledem na nosný plyn. Maximální linearity a citlivosti se dosahuje pĜi optimálním pomČru doplĖkový plyn/vodík. Odchylky od optimálního pomČru mají za následek nestabilní plamen a velký šum. Plamenový ionizaþní detektor s alkalickým kovem (AFID): Jedná se o modifikaci FID, kde je k ústí trysky umístČna peleta soli alkalického kovu (CsBr, KCl) používaná zejména ke stanovení fosforu, dusíku a síry v organických látkách. Detektor elektronového záchytu (ECD): Je to selektivní ionizaþní detektor citlivý na elektronegativní atomy, zejména halogeny. Nosným plynem je zde þasto dusík, který je vlivem ȕ záĜení v detektoru ionizován, þímž vzniká konstantní proud. Atomy halogenĤ jsou elektronegativní a zachytávají pomalé elektrony, þímž dochází ke snížení ionizaþního proudu. Zdrojem ionizace je v ECD 3H nebo 63Ni, emitující þástice β. Nejmenší detekované množství je o nČkolik rádu nižší než u plamenového ionizaþního detektoru. ECD je velmi vhodný pro stopovou analýzu pesticidu v životním prostĜedí. Plamenový fotometrický detektor (FPD): Tento detektor je selektivní pro látky obsahující síru a fosfor. Funguje na principu mČĜení intenzity chemiluminiscence. MČĜí se emise záĜení pĜi spalování složek ve vodíkovém plameni. SvČtelná kvanta jsou zaznamenána fotoelektrickým násobiþem, pĜed který je pĜedĜazen interferenþní filtr propouštČjící záĜení o urþité vlnové délce. Maximum emise pro fosfor je pĜi 525 a 565 nm a pro síru 390 nm. Heliový ionizaþní detektor (HeD): PatĜí k univerzálním detektorĤm a je citlivý na organické i anorganické slouþeniny vþetnČ permanentních plynĤ. Pracuje na principu ionizace heliovými atomy vzbuzenými do metastabilního stavu s vysokým ionizaþním potenciálem. Nestabilního stavu heliových atomĤ je dosahováno absorpcí elektronĤ emitovaných z radioaktivního zdroje pĜi souþasném pĤsobení elektrického pole o velké intenzitČ. Všechny slouþeniny s nižším ionizaþním potenciálem jsou ionizovány a poskytují signál úmČrný jejich množství. Jako nosný plyn je potĜeba používat helium. HmotnostnČ spektrometrický detektor (MS) – UmožĖuje nejen detekci pĜítomnosti analytu, ale také jeho identifikaci na základČ hmotnostního spektra [69, 70, 71]. Hmotnostní spektrometrie je zároveĖ nejpoužívanČjší metodou detekce pĜi stanovování léþiv [42, 43, 52, 77].

2.5.7. Hmotnostní spektrometrie - MS Je to fyzikálnČ-chemická metoda urþující hmotnosti atomĤ, molekul a molekulových fragmentĤ po jejich pĜevedení na ionty. Hmotnostní spektrometrie je velmi úþinná identifikaþní technika široce používaná k Ĝešení analytických problémĤ v organické chemii, biochemii i pĜi analýze anorganických materiálĤ a povrchĤ tuhých látek. Hmotnostní spektrometrie umožĖuje urþit izotopový pomČr prvku ve vzorku (13C/12C, 2H/1H, 18 16 17 O/ O, O/16O, 15N/14N, 34S/32S, 33S/32S).

31

Hmotnostní spektrometr se skládá z tČchto hlavních þástí: vstupu, iontového zdroje, analyzátoru, detektoru se zesilovaþem a záznamovým zaĜízením, vakuového systému [69, 73]. Na obrázku þ. 14 je zobrazeno schéma hmotnostního spektrometru.

Obr. þ. 14: Schéma hmotnostního spektrometru [8]

Vstup Zde se vzorek zavádí do hmotnostního spektrometru. Obvykle bývá vstupem zásobník o objemu 1-2 l, kde se nastĜíknutý vzorek vypaĜí a poté je pĜeveden malým otvorem do iontového zdroje. U málo tČkavých látek se vzorek zavádí pĜímo do iontového zdroje. PĜi spojení s plynovou chromatografií (GC-MS) se používá tzv. chromatografický vstup [69]. Iontový zdroj Zde nevratným odštČpením valenþních elektronĤ vznikají z molekul vzorku ionty. Iontové zdroje dČlíme na dva druhy: 1. Tvrdé - vysoce energetická ionizace, molekuly se rozpadají na fragmenty, sem patĜí elektronová ionizace (EI). 2. MČkké - málo energetické, vznikají hlavnČ molekulární adukty, minimální fragmentace. Sem patĜí: chemická ionizace (CI), elektrosprej (ESI), MALDI (desorpce/ionizace laserem za úþasti matrice), chemická ionizace za atmosférického tlaku (APPI), indukþnČ vázané plazma (ICP) [69, 72]. Analyzátor V analyzátoru se dČlí ionty na základČ jejich pomČru hmotnosti ku náboji (m/z). Existuje nČkolik druhĤ analyzátorĤ: • Sektorové separátory - jsou tvoĜeny magnetickými a elektrostatickými poli. Vzhledem k pomalým zmČnám bývají oznaþovány jako statické. Sektorové analyzátory mají dvČ funkce, a to dČlení iontĤ podle úþinných hmot a fokusaci iontĤ stejných úþinných hmot.

32

•

o Magnetický analyzátor (B) – je to nejstarší analyzátor, avšak z hlediska rozlišení a hmotnostního rozsahu to je nejdokonalejší disperzní prvek. UmožĖuje prostorové rozdČlení monoenergetického svazku iontĤ podle hodnoty m/z. KonstrukþnČ je magnetický hmotnostní analyzátor elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci procházejí ionty. Ionty, které jsou urychleny v iontovém zdroji mají kinetickou m ⋅ v2 = z ⋅V energii danou vztahem: E K = 2 o Elektrostatický analyzátor (ESA) – je to pomocný disperzní prvek umožĖující energeticky sjednotit proud iontĤ vycházejících z iontového zdroje nezávisle na jejich hodnotách m/z. Analyzátor doby letu (TOF) - Je to nejjednodušší analyzátor, který je tvoĜen pouze prázdnou trubicí. K þasovému rozdČlení iontĤ podle m/z dochází na základČ jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru. HmotnČjší ionty se pohybují pomaleji než ionty lehþí a doráží proto do detektoru pozdČji. Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v prĤletovém analyzátoru urazí. PrĤletový analyzátor vyžaduje použití iontového zdroje pracujícího v pulzním režimu napĜ. EI, MALDI.

Obr. þ. 15: Schéma hmotnostního spektrometru na principu TOF [75]

•

•

Kvadrupolový analyzátor - bývá souþástí hmotnostních spektrometrĤ s nízkým rozlišením, vhodných pro spojení s plynovou nebo kapalinovou chromatografií. KonstrukþnČ se jedná o þtyĜi kovové tyþe hyperbolického nebo kruhového prĤĜezu, do nichž je pĜivádČno stejnosmČrné a stĜídavé napČtí. Ionty vlétávající do prostoru mezi tyþemi se dostanou do stĜídavého elektrického pole a zaþínají oscilovat. PĜi vhodném pomČru stejnosmČrné a stĜídavé složky napČtí a dané hodnotČ tČchto napČtí projdou kvadrupolem jenom ionty o urþitém pomČru m/z. ZaĜízení se tak chová vlastnČ jako filtr nastavený na urþitou hodnotu m/z. ZmČnou vkládaných napČtí je možné nechat projít filtrem postupnČ ionty v celém rozsahu hodnot m/z. Iontová past - je to pomocné zaĜízení, které umožĖuje úþinkem elektrického pole uzavĜít ionty v ohraniþeném prostoru. Je složena ze vstupní a výstupní elektrody kruhového prĤĜezu a z prstencové stĜedové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemnČny a na stĜedovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenþní napČtí s promČnnou amplitudou. Ionty jsou nuceny se uvnitĜ iontové pasti pohybovat po uzavĜených kruhových drahách. S rostoucí amplitudou napČtí se ionty s rostoucím m/z dostávají 33

na nestabilní trajektorie a opouštČjí prostor iontové pasti smČrem do detektoru [69, 74]. Detektor Detektory v hmotnostní spektrometrii dČlíme do dvou skupin: 1. Detektory pro pĜímá mČĜení – detekují elektrický proud vznikající pĜímým dopadem stanovovaných iontĤ. Detektory pro pĜímá mČĜení jsou nezbytné pro urþení pĜesného izotopového zastoupení prvkĤ, napĜíklad pĜi zjišĢování stáĜí hornin. Jsou také obvykle souþástí specializovaných zakázkových systémĤ. 2. Násobiþové detektory – využívají efekt násobení elektronĤ uvolnČných z první konverzní dynody po dopadu iontĤ. Násobiþové detektory jsou nejþastČji používaným typem detektorĤ užívaných v metodČ hmotnostní spektrometrie. Jsou také schopny poskytnout mČĜitelný signál pro jednotlivé ionty [73]. 2.5.7. GC-MS Spojení metod plynové chromatografie (GC) a hmotnostní spektrometrie (MS) vytvoĜilo zatím nejefektivnČjší techniku pro analýzu složitČjších smČsí organických látek. Skloubila se zde jak vynikající separaþní vlastnost plynového chromatografu, tak také skvČlé identifikaþní vlastnosti hmotnostního spektrometru. Spojem mezi GC a MS je tzv. chromatografický vstup, což je vyhĜívaná spojka mezi kolonou GC a iontovým zdrojem MS. U kapilárních kolon je možné pĜímé spojení s iontovým zdrojem. Jako iontový zdroj tak mĤže být použita elektronová ionizace. Tato tvrdá ionizaþní technika zpĤsobuje charakteristické fragmentace a umožĖuje tak využití knihoven spekter pro snadnou identifikaci slouþenin. To je obrovská výhoda propojení GC s MS [69].

Obr. þ. 16: Plynový chromatograf s hmotnostním spektrometrem [76]

34

3. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST 3.1. Chemikálie • • • • • • • • •

Methanol, pro HPLC, Lach-Ner, s.r.o., ýeská republika Pyridin, Lach-Ner, s.r.o., ýeská Republika Kyselina salicylová, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko Ibuprofen sodná sĤl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko Naproxen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko Ketoprofen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko Diclofenac sodná sĤl, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko MSTFA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko BSTFA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, NČmecko

3.2. PĜístroje • • • • • • • •

Analytické váhy HR-120, A&D Instruments, Japonsko PĜístroj EVATERM pro sušení dusíkem a zahĜívání vzorkĤ, LABICOM, ýR Filtry ze sklenČných mikrovláken, typ Z-4, 55 mm, Papírna Pernštejn s.r.o., ýR SPE kolonka typu Oasis® HLB Cartridge, Waters, USA SPE extraktor Baker, model spe - 12G, s vakuovou pumpou Barmany, Co., USA Pasivní vzorkovaþ POCIS - 200 mg sorbentu Oasis HLB urþený ke vzorkování léþiv BČžné laboratorní vybavení Plynový chromatograf Pegasus IV D, LECO®, USA

3.3. OdbČry vzorkĤ odpadní vody 3.3.1. Konvenþní odbČry vzorkĤ Od 17. 11. 2010 do 1. 12. 2010 byly odebírány vzorky na pĜítoku a odtoku z ýOV v BrnČ ModĜicích. OdbČr byl 24 hodinový a matrice byla umístČna do tmavých litrových sklenČných lahví, pĜedem vymytých kyselinou chromsírovou a deionizovanou vodou. 3.3.2. Pasivní vzorkování Od 19. 11. 2010 do 17. 12. 2010 byly na pĜítok a na odtok vody z ýOV v BrnČ ModĜicích umístČny pasivní vzorkovaþe typu POCIS. Ke stanovení léþiv byly urþeny dva disky POCIS na pĜítoku a tĜi na odtoku.

3.4. PĜíprava vzorkĤ a SPE 3.4.1. PĜíprava a SPE konvenþnČ odebraných vzorkĤ Ihned po odbČru a dopravČ do laboratoĜe byly vzorky zfiltrovány pĜes sklenČný filtr pomocí vysokotlakého filtraþního zaĜízení. Dále byly okyseleny na pH 2 1M HCl. Pro SPE byla použita modifikovaná metoda uvedená v [5, 8]: • PĜíprava kolonky: 6 ml methanolu, 3 ml deionizované vody • Aplikace 250 ml vzorku o pH 2 • Promytí: 3 ml deionizované vody • Sušení proudem vzduchu • Eluce 6 ml methanolu

35

3.4.2. PĜíprava vzorkĤ odebraných vzorkovaþem POCIS Po skonþení expozice byl každý vzorkovaþ promyt deionizovanou vodou, aby byly odstranČny neþistoty z povrchu membrán. Poté byl vzorkovaþ rozebrán a sorbent byl kvantitativnČ pĜeveden do pĜedem pĜipravené SPE kolonky bez náplnČ. Eluce byla provedena 10 ml methanolu. U jednoho disku z pĜítoku nebylo možno kvantitativnČ pĜevést sorbent do kolonky, protože pĜi manipulaci došlo k poškození membrány. Stanovován tak byl pouze jeden vzorek z pĜítoku a tĜi z odtoku ýOV.

3.5. Derivatizace 3.5.1. Derivatizace MSTFA KonvenþnČ odebírané vzorky byly derivatizovány þinidlem MSTFA. Ideální podmínky derivatizace byly použity podle postupu uvedených v literatuĜe [5, 8]. Z každé vialky obsahující eluát bylo odebráno vždy 500 µl do 4ml vialky a odpaĜeno v proudu dusíku. Poté bylo do vialky pĜidáno 200 µl MSTFA + 200 µl pyridinu. Vialky byly potom zahĜívány pĜi teplotČ 70 °C po dobu 90 minut. 3.5.2. Derivatizace BSTFA Vzorky odebrané vzorkovaþem POCIS byly derivatizovány þinidlem BSTFA. Ideální podmínky derivatizace byly opČt použity podle již zmínČných publikací [5, 8]. Z každé vialky s eluátem bylo odebráno vždy 1 ml do 4ml vialky a odpaĜeno v proudu dusíku. Poté bylo do vialky pĜidáno 300 µl BSTFA + 100 µl pyridinu. Vialky byly pak zahĜívány pĜi teplotČ 70 °C po dobu 60 minut. 3.5.3. Retenþní þasy a hmotnostní spektra Pro použitá þinidla (MSTFA, BSTFA) byly charakteristické hmotnosti jednotlivých látek následující: • Kyselina salicylová: m/z = 267±1 • Ibuprofen: m/z = 160±1 • Kofein: m/z = 194±1 • Naproxen: m/z = 185±1 • Ketoprofen: m/z = 282±1 • Diklofenak: m/z = 214±1 PĜi použití MSTFA vycházely následující retenþní þasy pro jednotlivá léþiva: • Kyselina salicylová: RT = 641 s • Ibuprofen: RT = 696 s • Kofein: RT = 803 s • Naproxen: RT = 886 s • Ketoprofen: RT = 929 s • Diklofenak: RT = 962 s Protože se pĜed použitím BSTFA mČnila kolona byly retenþní þasy pro jednotlivá léþiva jiná než v pĜedchozím pĜípadČ: • Kyselina salicylová: RT = 634 s • Ibuprofen: RT = 687 s • Kofein: RT = 914 s • Naproxen: RT = 929 s 36

• •

Ketoprofen: Diklofenak:

RT = 981 s RT = 1026 s

Obr. þ. 17: Fragmentogram zkušebního vzorku za použití MSTFA

Obr. þ. 18: Fragmentogram zkušebního vzorku za použití BSTFA

3.6. Analýza vzorkĤ Analýza reálných vzorkĤ byla provedena pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem s detekcí doby letu (GC/MS-TOF) na pĜístroji Pegasus IV D. Jako primární kolona byla použita HT-5 (30 m x 0,25 mm, 0,1 µm vrstva filmu tvoĜená z 5 % fenylem a z 95 % dimethylpolysiloxanem), která byla pĜed analýzou vzorkĤ z pasivních vzorkovaþĤ POCIS vymČnČna za novou Rxi-17 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm vrstva filmu tvoĜená z 50 % difenylpolysiloxanem a z 50 % dimethylpolysiloxanem) Nosným plynem bylo helium. Podmínky analýzy byly následující: Plynová chromatograf • Množství nastĜíknutého vzorku: 1 µl • Teplota nástĜiku: 270 °C • Metoda nástĜiku: splitless • PrĤtok nosného plynu: 1 ml/min • Teplotní program: zaþátek na 80 °C po dobu 1 min, poté nárĤst teploty 20 °C/min do 300 °C, která byla udržována po 2 min • Teplota Transfer Line: 280 °C

37

Hmotnostní spektrometr • Rozsah sledovaných molekulových hmotností: 50 - 600 • Skenovací rychlost: 5 spekter / s • NapČtí na detektoru: 1850 V • Teplota iontového zdroje: 220 °C

38

4. VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1. Koncentrace léþiv v reálných vzorcích Pro urþení koncentrací jednotlivých léþiv v odpadní i povrchové vodČ byly nejdĜíve sestrojeny kalibraþní kĜivky. Byly namČĜeny zvlášĢ kalibraþní kĜivky pĜi použití MSTFA a zvlášĢ pĜi použití BSTFA. Navíc pro každé þinidlo a léþivo byly vytvoĜeny dvČ kalibraþní Ĝady, jedna pro nízké koncentrace, druhá pro koncentrace vysoké. Z kalibraþních kĜivek a pomocí softwarového programu umožĖujícího ovládání chromatografu byly také stanoveny hodnoty meze detekce (LOD) a meze kvantifikace (LOQ) uvedené v tabulce þ. 4. Hodnoty na ose x jsou uvedeny v ng/ml; tato koncentrace je však uvedena pro koneþný objem (400 µl) ve vialce, tj. po opČtném rozpuštČní reziduí ve 400 µl smČsi pyridinu a derivatizaþního þinidla. PĜi stanovení množství v reálných vzorcích pak byly tyto hodnoty pĜepoþítány. Kalibraþní kĜivka kyseliny salicylové s MSTFA- nižší koncentrace 1600000 1400000

y = 7097,2x + 99569 R2 = 0,998

1200000

A

1000000 800000 600000 400000 200000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 19: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací kyseliny salicylové v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

39

Kalibraþní kĜivka kyseliny salicylové s MSTFA - vyšší koncentrace 30000000 25000000 y = 7933,2x - 466022 R2 = 0,9968

A

20000000 15000000 10000000 5000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 20: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací kyseliny salicylové v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜivka kyseliny salicylové s BSTFA - nižší koncentrace 800000 700000

y = 3340,2x + 15127 R2 = 0,9991

600000

A

500000 400000 300000 200000 100000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 21: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací kyseliny salicylové v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

40

Kalibraþní kĜivka kyseliny salicylové s BSTFA - vyšší koncentrace 14000000 12000000

y = 4166,5x - 382564 R2 = 0,9916

10000000

A

8000000 6000000 4000000 2000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 22: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací kyseliny salicylové v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Kalibraþní kĜivka ibuprofenu s MSTFA - nižší koncentrace 600000 500000

y = 2347x + 7977,9 R2 = 0,9986

A

400000 300000 200000 100000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 23: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací ibuprofen v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

41

Kalibraþní kĜivka ibuprofenu s MSTFA - vyšší koncentrace 8000000 7000000

y = 2470,8x - 72486 R2 = 0,9992

6000000

A

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 24: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací ibuprofen v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜivka ibuprofenu s BSTFA - nižší koncentrace 180000 160000

y = 777,95x + 2616,7 R2 = 0,9958

140000 120000 A

100000 80000 60000 40000 20000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 25: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací ibuprofen v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

42

Kalibraþní kĜivka ibuprofenu s BSTFA - vyšší koncentrace 3000000 2500000 y = 906,88x - 70191 R2 = 0,9936

A

2000000 1500000 1000000 500000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 26: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací ibuprofen v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Kalibraþní kĜivka kofeinu s MSTFA - nižší koncentrace 700000 600000

y = 3197,3x + 4160,6 R2 = 0,9998

500000

A

400000 300000 200000 100000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 27: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací kofeinu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

43

Kalibraþní kĜivka kofeinu s MSTFA - vyšší koncentrace 14000000 12000000 y = 3986,3x - 381065 R2 = 0,995

10000000

A

8000000 6000000 4000000 2000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 28: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací kofeinu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜivka kofeinu s BSTFA - nižší koncentrace 350000 300000 y = 1465,1x - 6973,6 R2 = 0,9873

250000

A

200000 150000 100000 50000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 29: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací kofeinu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

44

Kalibraþní kĜivka kofeinu s BSTFA - vyšší koncentrace 7000000 6000000 y = 1930,1x - 159630 R2 = 0,9907

5000000

A

4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 30: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací kofeinu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Kalibraþní kĜivka naproxenu s MSTFA - nižší koncentrace 350000 300000 y = 1592,9x + 7853,7 R2 = 0,9981

250000

A

200000 150000 100000 50000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 31: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací naproxenu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

45

Kalibraþní kĜivka naproxenu s MSTFA - vyšší koncentrace 6000000 5000000 y = 1866,4x - 75382 R2 = 0,9998

A

4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 32: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací naproxenu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜívka naproxenu s BSTFA - nižší koncentrace 250000

200000

y = 980,3x + 2403,9 R2 = 0,9977

A

150000

100000

50000

0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 33: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací naproxenu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

46

Kalibraþní kĜivka naproxenu s BSTFA - vyšší koncentrace 4000000 3500000 3000000

y = 1163,6x - 93926 R2 = 0,9926

A

2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 34: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací naproxenu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Kalibraþní kĜivka ketoprofenu s MSTFA - nižší koncentrace 250000

200000

y = 1098,2x + 9955,4 R2 = 0,9966

A

150000

100000

50000

0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 35: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací ketoprofenu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

47

Kalibraþní kĜivka ketoprofenu s MSTFA - vyšší koncentrace 4500000 4000000 3500000 y = 1356,6x - 99434 R2 = 0,9996

3000000 A

2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ML VIAL]

Obr. þ. 36: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací ketoprofenu v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜivka ketoprofenu s BSTFA - nižší koncentrace 160000 140000 y = 674,32x + 8126,1 R2 = 0,9977

120000

A

100000 80000 60000 40000 20000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 37: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací ketoprofenu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

48

Kalibraþní kĜivka ketoprofenu s BSTFA - vyšší koncentrace 3000000 2500000 y = 826,31x - 71380 R2 = 0,9935

A

2000000 1500000 1000000 500000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 38: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací ketoprofenu v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Kalibraþní kĜivka diklofenaku s MSTFA - nižší koncentrace 80000 70000 60000 y = 345,12x + 5751,6 R2 = 0,9963

A

50000 40000 30000 20000 10000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 39: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací diklofenaku v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

49

Kalibraþní kĜivka diklofenaku s MSTFA - vyšší koncentrace 2000000 1800000 1600000 y = 596,05x - 58916 R2 = 0,9987

1400000

A

1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 40: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací diklofenaku v reálných vzorcích pĜi použití MSTFA

Kalibraþní kĜivka diklofenaku s BSTFA - nižší koncentrace 200000 180000 160000 y = 852,48x + 8444 R2 = 0,9965

140000

A

120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0

50

100

150

200

250

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 41: Kalibraþní kĜivka pro stanovení nízkých koncentrací diklofenaku v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

50

Kalibraþní kĜivka diklofenaku s BSTFA - vyšší koncentrace 3500000 3000000 y = 1048,2x - 56882 R2 = 0,9989

2500000

A

2000000 1500000 1000000 500000 0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

c [ng/ml VIAL]

Obr. þ. 42: Kalibraþní kĜivka pro stanovení vysokých koncentrací diklofenaku v reálných vzorcích pĜi použití BSTFA

Tabulka þ. 4: Limity detekce a kvantifikace pro jednotlivá léþiva a derivatizaþní þinidla MSTFA BSTFA léþivo LOD [ng/l] LOQ [ng/l] LOD [ng/l] LOQ [ng/l] k. salicylová 14,17 47,22 14,35 47,84 ibuprofen 75,24 250,81 122,02 406,74 kofein 34,85 116,16 59,47 198,23 naproxen 32,00 106,65 62,21 207,35 ketoprofen 90,15 300,50 67,55 225,16 diklofenak 114,59 381,96 49,43 164,78 4.1.1. Koncentrace léþiv ve vzorcích odebíraných konvenþním zpĤsobem Vzorky odpadní vody byly odebírány na pĜítoku a odtoku z ýOV od 17. 11. 2010 do 1. 12. 2010. Každý vzorek byl derivatizován þinidlem MSTFA a tĜikrát promČĜen na GC-MS. V tabulkách þ. 5-10 jsou uvedeny výsledné koncentrace jednotlivých léþiv, smČrodatná odchylka a úþinnost procesu þištČní ýOV. Z tabulek je patrné, že k nejlepšímu vyþištČní docházelo u kyseliny salicylové (témČĜ 100%) a naopak nejhorší vyþištČní bylo v pĜípadČ diklofenaku (prĤmČrnČ 45%). Na obrázcích þ. 43-48 je znázornČna zmČna koncentrace jednotlivých léþiv na pĜítoku ýOV v prĤbČhu 15 dní, kdy probíhalo vzorkování. Na obrázku þ. 49 je porovnání úþinností odstraĖování jednotlivých léþiv pĜi procesu þištČní. Dále pak jsou na obrázcích þ. 50 a 51 uvedeny pĜíklady fragmentogramĤ z analýz vzorkĤ odebraných z pĜítoku a odtoku z ýOV.

51

Tabulka þ. 5: Koncentrace kyseliny salicylové na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. kyselina salicylová pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 48,38 1,88 0,1748 0,0281 99,64 18. 11. 34,24 0,76 < LOQ ~ 100 19. 11. 40,69 1,05 < LOQ ~ 100 20. 11. 20,04 2,84 < LOQ ~ 100 21. 11. 37,10 1,20 < LOQ ~ 100 22. 11. 38,43 0,34 < LOQ ~ 100 23. 11. 13,07 0,65 < LOQ ~ 100 24. 11. 14,77 0,65 < LOQ ~ 100 25. 11. 37,11 0,92 < LOQ ~ 100 26. 11. 23,14 2,36 0,0542 0,0305 99,77 27. 11. 34,63 0,71 < LOQ ~ 100 28. 11. 26,32 0,79 < LOQ ~ 100 29. 11. 30,95 2,17 < LOQ ~ 100 30. 11. 23,72 0,32 < LOQ ~ 100 1. 12. 30,06 1,15 < LOQ ~ 100 Tabulka þ. 6: Koncentrace ibuprofenu na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. ibuprofen pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 32,81 0,34 0,4005 0,0360 98,78 18. 11. 27,61 0,76 0,3766 0,0457 98,64 19. 11. 20,28 1,60 0,0927 0,0309 99,54 20. 11. 23,95 0,09 0,1331 0,0100 99,44 21. 11. 21,67 1,09 0,2350 0,0229 98,92 22. 11. 39,44 0,96 0,1260 0,0231 99,68 23. 11. 10,42 0,46 0,1423 0,0060 98,63 24. 11. 32,55 0,15 0,5438 0,0394 98,33 25. 11. 32,04 1,13 0,1325 0,0074 99,59 26. 11. 20,70 1,41 0,4065 0,0559 98,04 27. 11. 29,53 0,57 0,9319 0,0493 96,84 28. 11. 28,79 1,41 0,7079 0,0181 97,54 29. 11. 27,83 1,69 0,2112 0,0624 99,24 30. 11. 21,74 0,98 0,4580 0,0545 97,89 1. 12. 25,18 1,65 0,4123 0,0153 98,36

52

Tabulka þ. 7: Koncentrace kofeinu na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. kofein pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 28,87 0,62 0,1218 0,0227 99,58 18. 11. 19,85 0,27 0,1660 0,0582 99,16 19. 11. 14,88 1,24 0,2070 0,0108 98,61 20. 11. 20,17 1,64 0,1911 0,0029 99,05 21. 11. 17,17 0,67 0,2084 0,0147 98,79 22. 11. 14,60 2,32 0,0613 0,0148 99,58 23. 11. 14,20 0,62 0,1176 0,0068 99,17 24. 11. 17,57 0,44 0,0778 0,0097 99,56 25. 11. 15,27 1,43 0,1875 0,0185 98,77 26. 11. 14,10 0,34 0,1174 0,0099 99,17 27. 11. 13,75 0,78 0,1008 0,0056 99,27 28. 11. 29,24 3,86 0,1610 0,0132 99,45 29. 11. 18,82 1,56 0,0354 0,0069 99,81 30. 11. 21,93 0,52 0,0594 0,0028 99,73 1. 12. 14,95 0,64 0,0779 0,0135 99,48 Tabulka þ. 8: Koncentrace naproxenu na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. naproxen pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 6,09 0,24 0,4502 0,0161 92,61 18. 11. 3,31 0,65 0,4356 0,0336 86,82 19. 11. 2,57 0,26 0,4185 0,0042 83,73 20. 11. 3,39 0,19 0,3506 0,0290 89,64 21. 11. 5,70 0,91 0,5271 0,0188 90,76 22. 11. 5,16 0,26 0,1378 0,0377 97,33 23. 11. 1,33 0,13 0,2072 0,0435 84,40 24. 11. 3,04 0,13 0,4058 0,0082 86,63 25. 11. 3,70 0,64 0,3498 0,0050 90,56 26. 11. 3,02 0,51 0,4689 0,0616 84,47 27. 11. 4,37 0,37 0,3925 0,0579 91,02 28. 11. 3,61 0,03 0,5354 0,0523 85,18 29. 11. 3,75 0,61 0,2188 0,0219 94,16 30. 11. 2,57 0,06 0,2191 0,0031 91,46 1. 12. 3,47 0,25 0,3613 0,0360 89,60

53

Tabulka þ. 9: Koncentrace ketoprofenu na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. ketoprofen pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 4,64 0,17 0,9343 0,0783 79,88 18. 11. 3,41 0,24 0,7716 0,0434 77,34 19. 11. 2,93 0,05 0,6551 0,0171 77,63 20. 11. 3,50 0,30 0,7474 0,0475 78,63 21. 11. 4,28 0,02 0,6776 0,0105 84,18 22. 11. 4,03 0,05 0,3292 0,0474 91,83 23. 11. 1,17 0,01 0,3486 0,0554 70,10 24. 11. 3,51 0,09 0,4759 0,0194 86,45 25. 11. 3,31 0,23 0,5312 0,0116 83,95 26. 11. 3,39 0,17 0,5269 0,0357 84,47 27. 11. 3,46 0,42 0,6034 0,0551 82,57 28. 11. 2,81 0,20 0,7845 0,0405 72,06 29. 11. 3,01 0,36 0,2754 0,0590 90,85 30. 11. 2,32 0,02 0,3241 0,0492 86,00 1. 12. 2,82 0,03 0,4251 0,0327 84,93 Tabulka þ. 10: Koncentrace diklofenaku na pĜítoku a odtoku z ýOV a úþinnost procesu þištČní. diklofenak pĜítok odtok úþinnost þištČní [%] c [ȝg/l] sm. odchylka c [ȝg/l] sm. odchylka 17. 11. 11,82 0,84 6,66 0,29 43,71 18. 11. 7,99 0,85 7,37 0,63 7,78 19. 11. 11,10 0,21 7,28 0,71 34,40 20. 11. 11,62 0,04 6,19 0,42 46,74 21. 11. 18,39 2,54 7,48 0,69 59,36 22. 11. 14,12 0,90 4,67 0,04 66,91 23. 11. 5,21 0,34 4,87 0,17 6,55 24. 11. 11,80 1,27 5,37 0,08 54,46 25. 11. 12,67 0,64 5,84 0,36 53,86 26. 11. 11,35 0,55 5,61 0,49 50,53 27. 11. 10,98 0,61 4,73 0,18 56,94 28. 11. 11,35 0,83 5,93 0,58 47,80 29. 11. 10,57 0,80 4,30 0,25 59,37 30. 11. 7,73 0,59 4,24 0,26 45,18 1. 12. 6,93 0,60 4,02 0,06 41,96

54

kyselina salicylová 60,00 50,00

c [ȝg/l]

40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

14

15

dny

Obr. þ. 43: ZmČna koncentrace k. salicylové v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

ibuprofen 45,00 40,00 35,00

c [ȝg/l]

30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

dny

Obr. þ. 44: ZmČna koncentrace ibuprofenu v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

55

kofein 35,00 30,00

c [ȝg/l]

25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

14

15

dny

Obr. þ. 45: ZmČna koncentrace kofeinu v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

naproxen 7,00 6,00

c [ȝg/l]

5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

dny

Obr. þ. 46: ZmČna koncentrace naproxenu v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

56

ketoprofen 5,00 4,50 4,00

c [ȝg/l]

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

14

15

dny

Obr. þ. 47: ZmČna koncentrace ketoprofenu v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

diklofenak 20,00 18,00 16,00

c [ȝg/l]

14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

dny

Obr. þ. 48: ZmČna koncentrace diklofenaku v pĜítoku na ýOV v prĤbČhu 15 dnĤ

57

Úþinnost pĜi þištČní jednotlivých léþiv 100,0000

80,0000 k. salicylová ibuprofen

60,0000 [%]

kofein naproxen 40,0000

ketoprofen diklofenak

20,0000

0,0000 1

2

1 - úþinnost þištČní; 2 - smČrodatná odchylka

Obr. þ. 49: Úþinnost procesu þištČní na ýOV pĜi odstraĖování jednotlivých léþiv

Obr. þ. 50: Ukázka fragmentogramu z pĜítoku na ýOV ze dne 18. 11. 2010

Obr. þ. 51: Ukázka fragmentogramu z odtoku z ýOV ze dne 18. 11. 2010

58

4.1.2. Množství léþiv zachycených pasivními vzorkovaþi POCIS Od 19. 11. 2010 do 17. 12. 2010 byly na ýOV v BrnČ ModĜicích „nasazeny“ na pĜítok a odtok pasivní vzorkovaþe typu POCIS. ZjišĢováno bylo množství nasorbovaných léþiv. Byla provedena analýza u jednoho vzorkovaþe na pĜítoku a u tĜí vzorkovaþĤ na odtoku. V tabulce þ. 11 jsou uvedena množství nasorbovaných léþiv na POCIS v ȝg. KvalitativnČ byl prokázán výskyt všech sledovaných léþiv jako u konvenþního vzorkování. Ve vzorku na pĜítoku byl nejvíce obsažen ibuprofen a nejménČ kyselina salicylová. DĤvodem nízkého nasorbovaného množství oproti konvenþnímu vzorkování je zĜejmČ úprava pH na hodnotu 2 pĜed SPE u vzorkĤ získaných konvenþnČ. U vzorkĤ na odtoku byl nejvíce obsažen diklofenak a nejménČ opČt kyselina salicylová. Velké množství dilkofenaku ve vzorcích z POCISĤ na odtoku potvrzuje jeho špatné odstraĖování pĜi procesu þištČní. Na obrázcích þ. 52 a 53 jsou uvedeny pĜíklady fragmentogramĤ z analýzy vzorku z pĜítoku a odtoku z ýOV. Tabulka þ. 11: Množství léþiv nasorbovaných na POCIS na pĜítoku a odtoku z ýOV m [ȝg] léþivo pĜítok odtok 1 odtok 2 odtok 3 k. salicylová 0,13 0,08 0,06 0,07 ibuprofen 29,42 3,98 3,65 4,88 kofein 13,97 1,35 1,39 1,86 naproxen 1,64 4,55 3,57 4,13 ketoprofen 1,57 6,02 4,36 5,03 diklofenak 2,93 14,65 9,58 10,58

Obr. þ. 52: Ukázka fragmentogramu ze vzorkovaþe POCIS umístČného na pĜítoku ýOV

59

Obr. þ. 53: Ukázka fragmentogramu ze vzorkovaþe POCIS umístČného na odtoku z ýOV

4.1.3. Porovnání výsledkĤ získaných konvenþním a pasivním vzorkováním ObČma zpĤsoby vzorkování bylo prokázáno zastoupení všech sledovaných léþiv ve vodČ, a to jak na pĜítoku, tak i na odtoku z ýOV v BrnČ ModĜicích. Na základČ analýz vzorkĤ odebraných konvenþním zpĤsobem bylo možné stanovit pĜesné koncentrace jednotlivých léþiv, a to jak na pĜítoku, tak i na odtoku z ýOV. Pasivní vzorkování mČlo spíše kvalitativní charakter. Pro použití pasivních vzorkovaþĤ ke kvantitativním úþelĤm by bylo zapotĜebí vČtšího množství vzorkovaþĤ a vypracování rozsáhlejšího systému kalibraþních dat.

60

5. ZÁVċR PĜedložená diplomová práce byla zamČĜena na stanovení léþiv metodou plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií s pĜedchozí derivatizací. V diplomové práci byla Ĝešena následující problematika a byly získány tyto výsledky: Léþiva vybraná ke stanovení byla: kyselina salicylová, ibuprofen, kofein, naproxen, ketoprofen a diklofenak. Bylo použito dvou zpĤsobĤ vzorkování odpadní vody. Prvním bylo konvenþní bodové vzorkování na pĜítoku a odtoku z ýOV v BrnČ ModĜicích a druhým bylo provedení odbČru pomocí pasivních vzorkovaþĤ POCIS umístČných na pĜítok a na odtok z ýOV v BrnČ ModĜicích. Konvenþní vzorkování probíhalo v þasovém horizontu od 17. 11. 2010 do 1. 12. 2010. Vzorky odpadní vody byly vyextrahovány metodou SPE a derivatizovány þinidlem MSTFA. Pasivní vzorkovaþe POCIS byly „nasazeny“ v období od 19. 11. 2010 do 17. 12. 2010. Stanovení množství nasorbovaných léþiv probČhlo u jednoho disku na pĜítoku a u tĜí diskĤ na odtoku. Extrakce probíhala kvantitativním pĜevedením sorbentu vzorkovaþe do SPE kolonky bez náplnČ. Eluce probíhala 10 ml methanolu. Následná derivatizace byla provedena þinidlem BSTFA. Všechny vzorky byly analyzovány na plynovém chromatografu s hmotnostním spektrometrem s detekcí doby letu. Konvenþním i pasivním vzorkováním byl prokázán výskyt všech sledovaných léþiv jak na pĜítoku, tak i na odtoku z ýOV ModĜice. Koncentrace léþiv se na pĜítoku pohybovaly od prĤmČrnČ 3,2 ȝg/l u ketoprofenu až po prĤmČrných 30,2 ȝg/l u kyseliny salicylové. Na odtoku byly nejnižší koncentrace u kyseliny salicylové, kdy se vČtšinou pohybovaly pod limitem kvantifikace. Nejvyšší koncentrace na odtoku mČl diklofenak a to prĤmČrných 5,6 ȝg/l. Nejlépe se z odpadní vody procesem þištČní odstraĖovala kyselina salicylová (témČĜ 100%), nejhĤĜe potom diklofenak (prĤmČrnČ 45%).

61

6. POUŽITÁ LITERATURA [1]

HAMPL, František; RÁDL, Stanislav; PALEýEK, Jaroslav. Farmakochemie. 2. rozšíĜené vydání. Praha : VŠCHT Praha, 2007. 450 s. ISBN 978-80-7080-639-5.

[2]

ýeská republika. Zákon o léþivech. In Sbírka zákonĤ. 2007, 90, 378, s. 96. ISSN 12111244.

[3]

KUCHAě, M.: Výzkum a vývoj léþiv. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2008. 166 s. ISBN 97880-7080-677-7.

[4]

KATZUNG, B. G. et al. Základní a klinická farmakologie. Praha : H&H, 1994. ISBN 80-85787-35-0.

[5]

LACINA, P.: Využití plynové chromatografie pro stanovení reziduí léþiv ve vodách. Brno: Vysoké uþení technické, Fakulta chemická, 2009. 96 s. Vedoucí diplomové práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[6]

HAKL, Marek; HěIB, Radovan. Akutní bolest. Remedia [online]. 2005, 4-5, [cit. 201105-02]. Dostupný z WWW: <www.remedia.cz>.

[7]

Nesteroidní antirevmatika. PACE News [online]. 2002, 2, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.pace.cz>.

[8]

SÝKORA, R. Využití plynové chromatografie pro stanovení reziduí léþiv. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, Fakulta chemická, 2009. 39 s. Vedoucí bakaláĜské práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

[9]

ýeský lékopis 2002. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2002. ISBN 80-247-0464-1.

[10] Zentiva [online]. 2006 [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.zentiva.cz> [11] Katzung, B. G.: Základní a klinická farmakologie. 2. þeské vyd. Jinoþany: H & H, 2006. ISBN 80-7319-056-7. [12] Ketonal. [s.l.] : [s.n.], 1999. s. 1-4. [13] BOROVANSKÝ, A., BENEŠ, L. Farmaceutická chemie 2: Léþiva s úþinkem na centrální a periferní nervový systém. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, 1999. 234 s. ISBN 80-85114-78-X. [14] Profenid. [s.l.] : [s.n.], 2007. 3 s. [15] Švihovec J.: Pharmindex – kompendium. MediMedia Informations, Praha 1995. [16] RAINES, Brian R.: Ketoprofen Synthesi. Organic chemistry II. Rogers state university. 2005, 7, s. 1-14. [17] MedicineNett [online]. 1996 [cit. 2011-05-02]. .

Dostupný

z

WWW:

[18] College of Science, Engineering and Food Science Chemistry [online]. 2007 [cit. 201105-02]. Naproxen. Dostupné z WWW: . [19] Farmakoterapie [online]. 2005 [cit. 2011-05-02]. .

62

Dostupný

z

WWW:

[20] Léky na internetu [online]. 2009 [cit. 2011-05-02]. .

Dostupný

z

WWW:

[21] Online lékárna [online]. 2009 [cit. 2011-05-02]. Dostupný WWW:.

z

[22] Biotox.cz [online]. 2001-2007 [cit. 2011-05-02]. Kofein. Dostupné z WWW: . [23] Doktor-zdravi.cz [online]. 2006 [cit. 2011-05-02]. Kofein – stimulant, jenž rozjasní smysly. Dostupné z WWW: <www.doktor-zdravi.cz/lekarna/index.php>. [24] Anamneza [online]. 2001 [cit. 2011-05-02]. IBUFEIN. Dostupné z WWW: <www.anamneza.cz>. [25] Paralen [online]. 2010 [cit. 2011-05-02]. PĜíbalová informace. Dostupné z WWW: <www.paralen.cz>. [26] Drmax-lekarna [online]. 2003 [cit. 2011-05-02]. Panadol Extra. Dostupné z WWW: <www.drmax-lekarna.cz>. [27] Boiron [online]. 2005 [cit. 2011-05-02]. NEO-CEPHYL. Dostupné z WWW: <www.boiron.cz>. [28] Bodybuilding.cz [online]. 2000 [cit. 2011-05-02]. Kofein a jeho úþinky v lidském tČle. Dostupné z WWW: <www.bodybuilding.cz>. [29] ZAJAC, Matthew A., et al. A Novel Method of Caffeine Synthesis from Uracil. SYNTHETIC COMMUNICATIONS [online]. 2003, 33, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.umich.edu>. [30] KOTYZA, Jan, et al. LÉýIVA – „NOVÝ“ ENVIROMENTÁLNÍ POLUTANT. Chemické listy [online]. 2009, 103, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.chemicke-listy.cz>. [31] COOPER, Emili R. ; SIEWICKI, Thomas C.; PHILLIPS, Karl. Preliminary risk assessment database and risk ranking of pharmaceuticals in the environment. SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT [online]. 2008, 398, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [32] HERNANDO, M. D., et al. Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments. Talanta [online]. 2006, 69, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [33] BUSER, H. R.; MILLER, M. D.; THEOBALD, N.:Occurrence of the pharmaceutical drug clofibric acid and the herbicide mecoprop in various Weiss lakes and in the Nord Sea. Environ. Sci. Technol. 1998, 32. [34] GÓMEZ, M. J., PETROVIû, M., BARCELÓ, D. Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography– tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters. Journal of Chromatography A [online]. 2006 [cit. 2011-05-02].

63

[35] VÍTEýKOVÁ, H. Stanovení reziduí léþiv v odpadních vodách metodou HPLC [s.l.], 2006. 56 s. Vysoké uþení technické v BrnČ, fakulta chemická. Vedoucí diplomové práce prof. RNDr. M. Vávrová, CSc. [36] KÜMMERER, Klaus. The presence of pharmaceuticals in the environment due to human use – present knowledge and future challenges. Journal of Environmental Management [online]. 2009, 90, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [37] CUNNINGHAM, Virginia L.; BINKS, Stephen P.; OLSON, Michael J. Human health risk assessment from the presence of human pharmaceuticals in the aquatic environment. Regulatory Toxicology and Pharmacology [online]. 2009, 53, [cit. 201105-02]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [38] AHRER, W., SCHERWENK, E., BUCHBERGER, W. Determination of drug residues in water by the combination of liquid chromatography or capillary electrophoresis with electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A [online]. 2000 [cit. 2011-05-02]. [39] ABU-QARE, A. W., ABOU-DONIA, M. B. A validated HPLC method for the determination of pyridostigmine bromide, acetaminophen, acetylsalicylic acid and caffeine in rat plasma and urine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [online]. 2001 [cit. 2011-05-02]. [40] LACEY, C., et al. An LC–MS method for the determination of pharmaceutical compounds in wastewater treatment plant influent and effluent samples. Talanta [online]. 2008 [cit. 2011-05-02]. [41] KOSTRANOJ, A. V., et al. High-Performance Liquid Chromatography in the Analysis of Multicomponent Pharmaceutical Preparations. Journal of Analytical Chemistry [online]. 2008 [cit. 2011-05-02]. [42] XU, J., et al. Simultaneous determination of pharmaceuticals, endocrine dispturing compounds and hormone in soils by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A [online]. 2008 [cit. 2011-05-02]. [43] SEBÖK, Á., et al. Identification and quantification of ibuprofen, naproxen, ketoprofen and diclofenac present in waste-waters, as their trimethylsilyl derivatives, by gas chromatography mass spectrometry. Talanta [online]. 2008 [cit. 2011-05-02]. [44] Oficiální výukové stránky FCH VUT v BrnČ [cit. 2011-05-02]. Dostupné z WWW: <www.vutbr.cz/elearning/mod/resource/view.php?id=115926>. [45] LOBPREIS, Tomáš; VRANA, Branislav; DERCOVÁ, Katarína. Inovatívne prístupy k monitorovaniu organických kontaminantov vo vodnom prostredí použitím pasivného vzorkovania. Chemické listy [online]. 2009, 103, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.chemicke-listy.cz>. [46] CHÝLKOVÁ, Jaromíra. Analýza zneþištČnin a technika jejich odbČrĤ II. Pardubice : Vysoká škola chemicko-technologická v Pardubicích, 1988. 58 s.

64

[47] BERNÁTH, Pavel; POVÝŠILOVÁ, Michaela. OdbČry rĤzných typĤ vzorkĤ : Vzorkování odpadních vod. In OdbČry vzorkĤ : Sborník pĜednášek z kurzu. 2. upravené. ýeský TČšín : 2 THETA, 2006. s. 262-267. ISBN 80-86380-33-5. [48] KOT-WASIK, Agata , et al. Advances in passive sampling in environmental studies. Analytica chimica acta [online]. 2007, 602, [cit. 2011-05-02]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [49] ZHANG, Zulin; HIBBERD, Andrew; ZHOU, John L. Analysis of emerging contaminants in sewage effluent and river water: Comparison between spot and passive sampling. Analytica chimica acta [online]. 2008, 607, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [50] POPL, Milan; FÄHNRICH, Jan. Analytická chemie životního prostĜedí. 4. pĜepracované. Praha : VŠCHT Praha, 1999. 218 s. ISBN 80-7080-336-3. [51] GROS, Meritxell; PETROVIû, Mira; BARCELÓ, Damiá. Development of a multiresidue analytical methodology based on liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) for screening and trace level determination of pharmaceuticals in surface and wastewaters. Talanta [online]. 2006, 70, [cit. 2011-0503]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [52] VERENITCH, Sergei S.; LOWE, Christopher J.; MAZUMDER, Asit. Determination of acidic drugs and caffeine in municipal wastewaters and receiving waters by gas chromatography–ion trap tandem mass spectrometry. Journal of chromatography A [online]. 2006, 1116, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [53] KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2. upravené a doplnČné. Ostrava : Pavel Klouda, 2003. 132 s. ISBN 80-86369-07-2. [54] COMEAU, F., et al. The occurrence of acidic drugs and caffeine in sewage effluents and receiving waters from three coastal watersheds in Atlantic Canada. SCIENCE OF TOTAL ENVIRONMENT [online]. 2008, 396, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [55] XUE, Y.-J.; PURSLEY, Janice; ARNOLD, Mark E. A simple 96-well liquid–liquid extraction with a mixture of acetonitrile and methyl t-butyl ether for the determination of a drug in human plasma by high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis [online]. 2004, 34, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [56] Sigmaaldrich.com [online]. 2007 [cit. 2011-05-03]. Extrakce na tuhoufázi. Dostupné z WWW: <www.sigmaaldrich.com>. [57] TOGOLA, A., BUDZINSKI, H. Multi-residue analysis of pharmaceutical compounds in aqueous samples. Journal of Chromatography A, [online]. 2007 [cit. 2011-05-03]. [58] KOSJEK, T., HEATH, E., KRBAVýIý, A. Determination of non-steroidal antiinflammatory drug (NSAIDs) residues in water samples. Environment International [online]. 2007 [cit. 2011-05-03]. [59] Regis Technologies, Inc. [online]. 2007 [cit. 2011-05-03]. GC Derivatization Reagents. Dostupné z WWW: <www.registech.com>.

65

[60] Library 4 Science [online]. 2008 [cit. 2011-05-03]. Derivatization. Dostupné z WWW: <www.chromatography-online.org>. [61] LIN, Wan-Ching; CHEN, Hsin-Chang; DING, Wang-Hsien. Determination of pharmaceutical residues in waters by solid-phase extraction and large-volume on-line derivatization with gas chromatography–mass spectrometry. Journal of chromatography A [online]. 2005, 1065, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [62] GÓMEZ, M.J., et al. Simultaneous analysis of neutral and acidic pharmaceuticals as well as related compounds by gas chromatography–tandem mass spectrometry in wastewater. Talanta [online]. 2007, 73, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [63] FARRÉ, M., et al. First interlaboratory exercise on non-steroidal anti-inflammatory drugs analysis in environmental samples. Talanta [online]. 2008, 76, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [64] MIGOWSKA, Natalia, et al. Trimethylsilyldiazomethane (TMSD) as a new derivatization reagent for trace analysis of selected non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by gas chromatography methods. Anal Bioanal Chem [online]. 2010, 397, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [65] Verenitch S.S., Lowe C.J., Mazumder A. Determination of acidic drugs and caffeine in municipal wastewaters and receiving waters by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A [online]. 2006, 1116, [cit. 2011-0503]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>. [66] Thermo scientific [online]. 2011 [cit. 2011-05-03]. MSTFA and MSTFA 1% TMCS. Dostupné z WWW: <www.thermoscientific.com>. [67] Thermo scientific [online]. 2011 [cit. 2011-05-03]. BSTFA. Dostupné z WWW: <www.thermoscientific.com>. [68] SIGMA-ALDRICH. Derivatization Reagents : For Selective Response and Detection in Complex Matrices. [s.l.] : [s.n.], 2007. 83 s. [69] VOLKA, Karel, et al. Analytická chemie II. Praha : VŠCHT Praha, 1995. 236 s. ISBN 80-7080-227-8. [70] Oficiální výukové stránky MU v BrnČ [cit. 2011-05-02]. Dostupné <www.chemi.muni.cz/~literak/uvod.pdf>.

z WWW:

[71] Oficiální výukové stránky JýU v ýeských BudČjovicích [cit. 2011-05-02]. Dostupné z WWW: < users.prf.jcu.cz/sima/analyticka_chemie/separb.htm >. [72] Oficiální výukové stránky FCH VUT v BrnČ [cit. 2011-05-02]. Dostupné z WWW: <www.vutbr.cz/elearning/mod/resource/view.php?id=111643>. [73] Oficiální výukové stránky FVZ UO v BrnČ [cit. 2011-05-02]. Dostupné z WWW: <www.pmfhk.cz/Prednasky/Zaklady_MS.pdf >. [74] Oficiální výukové stránky FCH VUT v BrnČ [cit. 2011-05-02]. Dostupné z WWW: <www.vutbr.cz/elearning/mod/resource/view.php?id=112739>.

66

[75] NIH / NCRR Mass Spectrometry Resource Washington University in St. Louis [online]. 2010 [cit. 2011-05-03]. Time-of-Flight Fundamentals . Dostupné z WWW: <msr.dom.wustl.edu>. [76] ÚOCHB AV ýR [online]. 2007 [cit. 2011-05-03]. GC-MS systems. Dostupné z WWW: <www.uochb.cz>. [77] WEIGEL, Stefan; KALLENBORN, Roland; HÜHNERFUSS, Heinrich. Simultaneous solid-phase extraction of acidic, neutral and basic pharmaceuticals from aqueous samples at ambient (neutral) pH and their determination by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of chromatography A [online]. 2004, 1023, [cit. 2011-05-03]. Dostupný z WWW: <www.sciencedirect.com>.

67

7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLģ AFID API APPI B BSTFA CI CNS COX ýOV ECD EI ESA ESI FID FPD GC GC-AED GC-MS GC/TOF-MS GLC GPC GSC HeD HPLC HPLC-DAD HPLC-MS HPLC-UV ICP LC LC-MS LLC LOD LOQ LSC MALDI MS MSTFA NSAID PC POCIS SFC SPE t-BDMS 68

plamenový ionizaþní detektor s alkalickým kovem léþivá látka chemická ionizace za atmosférického tlaku magnetický analyzátor derivatizaþní þinidlo N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid chemická ionizace centrální nervová soustava cyklooxygenázu þistírna odpadních vod detektor elektronového záchytu elektronová ionizace elektrostatický analyzátor elektrosprej plamenový ionizaþní detektor plamenový fotometrický detektor plynová chromatografie plynová chromatografie s atomovým emisním spektrometrem plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií s detekcí doby letu plynová rozdČlovací chromatografie gelová permeaþní chromatografie plynová adsorpþní chromatografie heliový ionizaþní detektor vysokoúþinná kapalinová chromatografie vysokoúþinná kapalinová chromatografie s detektorem diodového pole vysokoúþinná kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií vysokoúþinná kapalinová chromatografie d UV detektorem indukþnČ vázané plazma kapalinová chromatografie kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií kapalinová rozdČlovací chromatografie limit detekce limit kvantifikace iontovČ výmČnná chromatografie desorpce/ionizace laserem za úþasti matrice hmotnostní spektrometrie derivatizaþní þinidlo Nmethyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid nesteroidní protizánČtlivé látky papírová chromatografie polární organický chemický vzorkovaþ chromatografie s mobilní fází v nadkritickém stavu extrakce tuhou fází t-butyldimethylsilyl

TCD TLC TMS TOF

tepelnČ vodivostní detektor tenkovrstvá chromatografie trimethylsilyl analyzátor doby letu

69