VYHODNOCOVÁNÍ CHROMATOGRAFICKÝCH DAT umístění práce: laboratoř č. S31
vedoucí práce: Ing. J. Krupka 1. Cíl práce: Seznámení s možnostmi, které poskytuje GC chromatografie pro kvantitativní a kvalitativní analýzu. Osvojení samostatné práce s plynovým chromatografem na inženýrské úrovni. 2. Zadání a úkoly: Máte přiděleny 3 vzorky reakční směsi určitého reálného reakčního systému (např. vzorky reakčních směsí odebrané během laboratorního experimentu sledujícího kinetiku reakce). Od vedoucího práce dostanete charakteristiku zadaného reakčního systému a další informace, které jsou nezbytné pro správné rozhodování při řešení zadaných úkolů. Vašimi úkoly jsou: Úkol 1 - Nalézt vhodný způsob stanovení složek daného reakčního systému v reakčních směsích tj.: Úkol 1a - Zhodnotit použití dvou různých kapilárních kolon pro daný reakční systém Úkol 1b - Vybrat optimální teplotní program kolony a vhodnou teplotu injektoru Úkol 1c - Zvolit správnou metodiku pro výpočet složení vzorků, popř. vypočíst příslušné korekční (kalibrační) faktory Úkol 1d - Určit složení reálných směsí v hmotnostních procentech pomocí zvolené metodiky Úkol 2 - Zjistit povahu neznámých složek v reálné směsi na základě porovnání jejich chování na polární a nepolární kapiláře. K dispozici jsou analytické standardy některých látek, které se vyskytují ve vašem reakčním systému, a dále několik dalších čistých látek pro případné použití jako rozpouštědla či standardů. 3. Přístrojové vybavení: K dispozici jsou plynové chromatografy SHIMADZU-GC 9A a Hewlett-Packard 5890 s kapilárami DB-5 (J&W. Scientific) a Stabilwax-DB (Restec Corp.). Kapilára DB-5 obsahuje jako zakotvenou fázi téměř nepolární polysiloxan (95% methylpolysiloxan, 5% fenylpolysiloxan), složky dělí převážně podle jejich molekulových hmotností. Stabilwax-DB je polární kapilára, jako zakotvenou fázi obsahuje polyethylenglykol modifikovaný pro analýzu aminů, na dělení má největší vliv polarita složek. Oba chromatografy pracují v režimu SPLIT ON, což znamená, že jen menší část nastříknutého vzorku vstupuje po vypaření v injektoru do kolony. U obou chromatografů je k detekci jednotlivých rozdělených složek vystupujících z kolony v proudu nosného plynu použito plameno-ionizačního detektoru označovaného zkratkou FID. Ke zpracování signálu z detektoru jsou chromatografy vybaveny integrátory Shimadzu C-R3A a C-R5A. Výstupem z integrátoru je chromatogram s vypočteným procentuálním zastoupením ploch jednotlivých píků. Na integrátoru lze nastavit integraci bez rozpouštědla. 4. Výběr metody kvantitativní analýzy: (kvantitativní vyhodnocení chromatogramů) Je třeba si uvědomit, že stejná váhová množství strukturně různých chemických sloučenin poskytují za stejných pracovních podmínek na stejném detektoru obecně různou celkovou odezvu. Obecným vztahem pro zjištění celkového množství látky prošlé detektorem (mi) je : mi = Ki x Ai kde Ai je plocha píku složky i, Ki je konstanta úměrnosti za daného pracovního režimu. 1
Pro řešení daného analytického problému a s ohledem na požadovaný rozsah analýzy je možno použít některý z následujících postupů: a) Metoda vnitřní normalizace1,3 Nutným základním předpokladem pro použití této metody je jistota, že všechny složky jsou eluovány a posléze detekovány. Výhodou této metody je, že není potřeba znát přesné objemy dávkovaných vzorků. b) Metoda vnitřního standardu1,3 Metoda není závislá na znalosti přesného objemu dávkovaného vzorku a další výhodou je možnost stanovení chromatograficky nedetekovaných podílů ve směsi. c) Metoda absolutní kalibrace1,3 Metoda zakládající se na experimentálním zjištění relace mezi množstvím vzorku a jeho odezvou. Jedná se o univerzální metodu, jejíž nevýhodou je však nutnost znát objemy dávkovaných vzorků. d) Metoda standardního přídavku1,2,3 Metoda umožňuje eliminovat ztráty nebo změny složení během úpravy a čištění vzorku. Základním rysem všech variant této techniky je nutnost provedení dvou nástřiků (zpravidla nástřik původního vzorku a vzorku s přidaným známým množstvím čisté stanovované složky). Nevýhodou metody je nutnost znát množství vzorku dávkovaného do chromatografu. 5. Pracovní postup Přezkoušení elementárních znalostí o chromatografii3. Seznámení s manipulací s GC chromatografy. Nastavení vhodné teploty injektoru pro analýzu daného reakčního systému. Zjišťování, zda se stanovované složky dělí na obou kapilárách a při jaké nejvyšší teplotě kolony ještě dochází k jejich dokonalé separaci. Vyzkoušejte teploty kolony 200°C, 150°C, 100°C a 40°C. Postupujte od nejvyšší teploty k nižším. Analýzami čistých standardů látek řešeného reakčního systému na obou kolonách zjistěte, které z chromatografických píků na chromatogramech analyzovaného vzorku odpovídají těmto látkám. Zhodnoťte použití obou kapilárních kolon pro daný reakční systém a pro následnou kvantitativní analýzu vyberte jednu z nich. Pokud obě kapiláry budou vyhovující z hlediska kvalitní separace složek reakčního systému, dejte přednost nepolární kapiláře. Na základě informací o reakčním systému zvolte jednu z metod pro kvantitativní analýzu a vysvětlete proč. U vybrané metody určete korekční faktory k referenční látce (tj. k jedné ze složek přítomné ve směsích či ke standardu). V případě, že budete uvažovat o metodě vnitřního standardu, jsou jako potenciální standardy k dispozici látky cyklohexan, toluen, 1-butanol, 1,2-ethylendiamin, aceton a 1pentanol. Pomocí zvolené metody určete složení vzorků reálných směsí (v hmotnostních procentech). Reálné směsi mohou obsahovat několik neznámých složek, určete kolik a srovnáním jejich elučních časů na obou kapilárách s ostatními látkami odhadněte jejich přibližnou molekulovou hmotnost (resp. bod varu) a polaritu. Laboratorní protokol zpracujte na počítači a osobně odevzdejte vytištěnou kopii nejpozději do zahájení následující práce. Pro úspěšné absolvování této typové práce musí protokol obsahovat následující body: zdůvodnění všech rozhodnutí jednak při hledání optimálních podmínek analýz a jednak při výběru vyhodnocovací metody; hodnoty korekčních faktorů; složení vzorků v hmotnostních procentech (pokud vzorky obsahují Vám neznámé látky, uveďte i jejich koncentraci) ; příklady výpočtů; tabulku s přehledem elučních časů všech složek nalezených ve Vašich vzorcích; počet a charakteristika neznámých složek.
2
6. Zadaný reakční systém Kysele katalyzovanou reakcí v plynné fázi na jistém modifikovaném katalyzátoru s prostorovou selektivitou vzniká z monoethanolaminu převážně piperazin a morfolin. 2 NH2-C2H4-OH
2 NH2-C2H4-OH
2 NH2-C2H4-OH
- H2O
- H2O
- NH3
NH2-C2H4-NH-C2H4-OH
NH2-C2H4-O-C2H4-NH2
HO-C2H4-NH-C2H4-OH
- H2O
- NH3
- H2O
HN
NH
HN
O
HN
O
Do reaktoru s pevným ložem katalyzátoru je za teploty 300°C nastřikován monoethanolamin (MEA), popř. jeho vodný roztok. Nosným plynem je amoniak, popř. dusík. Konverze MEA je 50-98 %. Piperazin a morfolin vznikají deaminačními a dehydratačními reakcemi. Upřednostňována je tvorba cyklu. Mimo těchto dvou hlavních produktů vzniká za daných reakčních podmínek několik dalších látek komplikovaným sledem následných a bočných reakcí. Přehled možných reakčních cest ilustruje obr.1 v příloze. Mohou vznikat i látky se značně vysokým bodem varu, které při GLC analýzách na Vámi používaných kapilárách nebudou za daných chromatografických podmínek eluovat. Tabulka I.: Body varu surovin a některých možných produktů syntézy piperazinu a morfolinu Látka
bod varu [°C] (literární údaje)
1,4-diazabicyklo[2,2,2]oktan (DABCO) N-(2-hydroxyethyl)piperazin (HEPIP) N,N‘-bis(2-hydroxyethyl)piperazin (BHEPIP) N-(2-aminoethyl)piperazin (AEPIP) monoethanolamin (MEA) diethanolamin (DEA) triethanolamin (TEA) 1,2-diaminoethan (EDA) diethylentriamin (DETA) piperazin (PIP) N-methylpiperazin N,N‘-dimethylpiperazin N-ethylpiperazin N,N‘-diethylpiperazin N-methyl-N‘-ethylpiperazin 2,3-dimethylpiperazin 2,5-dimethylpiperazin 2,6-dimethylpiperazin pyrazin 2,3-dimethylpyrazin 2,6-dimethylpyrazin N-(2-aminoethyl)morfolin (AEMOR) morfolin (MOR) 4-(2-hydroxyethyl)morfolin
174 246 278 218-222 170 271 206-207 118 199-209 145-146 137-138 131 157 169-171 149-151 167-168 162-165 162 115-116 156 154 200-204 128 227 3
7. Specifikace chromatografů Tabulka IIa.: Specifikace plynového chromatografu SHIMADZU-GC 9A (lab. 67) integrátor detektor kolona délka kolony vnitřní průměr kolony tloušťka filmu teplota kolony teplota injektoru split tlak dusíku tlak vodíku tlak vzduchu přetlak dusíku nástřik [μl] maximální pracovní teplota kolony
SHIMADZU C-R3A FID kapilární, DB-5 30 m 0,53 mm 5 μm nalézt nalézt 60 ml/min 5 kPa 70 kPa 40 kPa 80 kPa 0,2 μl 250°C
Tabulka IIb.: Specifikace plynového chromatografu Hewlett Packard 5890 (lab. S 31) integrátor detektor kolona délka kolony vnitřní průměr kolony tloušťka filmu teplota kolony teplota injektoru splitovací poměr tlak vodíku tlak vzduchu přetlak dusíku nástřik [μl] maximální pracovní teplota kolony
SHIMADZU C-R5A Chromatopac FID kapilární Stabilwax-DB 30 m 0,53 mm 1μm nalézt nalézt 15 110 kPa 270 kPa 300 kPa 0,4 μl 210°C
4
8. Metody kvantitativní analýzy (kvantitativní vyhodnocení chromatogramů) Je třeba si uvědomit, že stejná váhová množství strukturně různých chemických sloučenin poskytují za stejných pracovních podmínek na stejném detektoru obecně různou celkovou odezvu. Obecným vztahem pro zjištění celkového množství látky prošlé detektorem (mi) je : mi = Ki x Ai kde Ai je plocha píku složky i, Ki je konstanta úměrnosti za daného pracovního režimu. V chromatografické praxi je nejběžnější korigovat experimentální velikosti ploch píků na rozdílné odezvy sloučenin vynásobením ploch korekčními faktory tak, aby plochy byly navzájem v relaci s hmotnostmi sloučenin. Pro složky i a k o hmotnostech mi a mk a plochách píků Ai a Ak musí být tyto korekční faktory zvoleny tak, aby platilo
mi / mk = (ki Ai) / (kk Ak) Pro řešení daného analytického problému a s ohledem na požadovaný rozsah analýzy je možno použít některý z následujících postupů: Metoda vnitřní normalizace Jedná se o zjištění všech individuálních píků a jejich vztažení na celkovou plochu všech píků. Hmotnostní procenta složky jsou pak vypočtena podle vztahu
ki Ai wi = --------------kj Aj Korekční (kalibrační) faktory je nutno experimentálně stanovit. Pokud zvolíme jednu ze sloučenin za referenční s korekčním faktorem kk = 1, pak je možné vypočítat ostatní korekční faktory vzhledem k této látce podle
ki = (Ak mi) / (Ai mk)
Nutným základním předpokladem pro použití této metody je jistota, že všechny složky jsou eluovány a posléze detekovány. Výhodou této metody je, že není potřeba znát přesné objemy dávkovaných vzorků. Metoda vnitřního standardu Tato metoda se od předchozí liší tím, že referenční látkou není jedna ze složek analyzované směsi, ale látka - vnitřní standard, která ve směsi není přítomna a má eluční čas různý od složek v analyzované směsi. Základem této metody je vztah mezi hmotnostmi a plochami píků jedné složky a vnitřního standardu vyjádřený takto:
mi / mst = (ki Ai) / (kst. Ast),
kst = 1
ki Ai mi = mst -----------kst Ast
(kst = 1)
Postupujeme tak, že ke známému množství analyzovaného vzorku přidáme přesně známé množství standardu mst a po určení plochy jeho píku Ast a píku stanovované složky Ai počítáme hmotnost hledané složky podle vztahu :
Kalibrační faktory vzhledem k vnitřnímu standardu je nutno experimentálně stanovit předem. To znamená přesně navážit kalibrační směsi (standard + jednotlivé složky), ty pak chromatografovat, zjistit plochy píků a vypočítat kalibrační faktory podle již uvedeného vzorce. Metoda není závislá na znalosti přesného objemu dávkovaného vzorku a další výhodou je možnost stanovení chromatograficky nedetekovaných podílů ve směsi. 5
Metoda absolutní kalibrace Metoda zakládající se na experimentálním zjištění relace mezi množstvím vzorku a jeho odezvou. Nejčastější variantou této metody je použití kalibračních grafů (metoda kalibrační křivky). Ten sestrojíme tak, že připravíme řadu roztoků o stoupající koncentraci v uvažovaném oboru analýz, nastřikujeme do chromatografu známé stejné objemy a vyhodnotíme plochy píků. Získáme tak graf závislosti mi na Ai ,tj. mi = ki Ai , (ki může být konstanta i funkce). Jedná se o univerzální metodu, jejíž nevýhodou je však nutnost znát objemy dávkovaných vzorků. Metoda standardního přídavku Metoda je příbuzná metodě vnitřního standardu. Pokud jde o postup při přípravě vzorků k nástřiku, je jediný rozdíl v tom, že jako standard se nepřidává nová složka, ale samotná stanovovaná látka. Skutečnost, že přidaný standard se při chromatografii neseparuje od stanovované složky, však vede k podstatně odlišné a složitější interpretaci chromatogramu. Základním rysem všech variant této techniky je nutnost provedení dvou nástřiků (zpravidla nástřik původního vzorku a vzorku s přidaným známým množstvím čisté stanovované složky). Jednotlivé varianty jsou popsány ve skriptech1, výpočtové vztahy a jejich odvození se nachází v článku2 J. Nováka. Výpočtové vztahy jsou poměrně komplikované, ale za určitých předpokladů je lze zjednodušit na jednoduchý vztah. Do kolony se dávkuje definovaný objem analyzovaného vzorku o neznámé koncentraci stanovované složky ci a z chromatogramu se stanoví plocha Ai. K definovanému objemu analyzovaného vzorku se přidá definované množství složky „i“ jako standardu. Do chromatografu se nadávkuje stejný objem vzniklé směsi a opět se změří zvětšená plocha Ai,s. Za předpokladu, že přidaný objem roztoku standardu nezpůsobí významnou změnu objemu vzorku, můžeme neznámou koncentraci složky ci vypočítat z jednoduchého vztahu ci = (cs . Ai)/(Ai,s – Ai). kde cs je koncentrace přidaného standardu ve vzorku. Metoda umožňuje eliminovat ztráty během úpravy a čištění vzorku. Na začátku analýzy rozdělíme vzorek na dvě části a k jedné z nich přidáme známé množství složky, která má být stanovena a tím je dána koncentrace cs. Na konci analýzy dostaneme z těchto dvou částí dva signály, které se liší intenzitou: větší Ai,s a menší Ai. Nevýhodou metody je nutnost znát množství vzorku dávkovaného do chromatografu. 9. Doporučená literatura: 1. Kolektiv autorů: Laboratoř oboru - organická technologie, SNTL, Praha 1985 2. J. Novák, Kvantitativní analýza plynovou chromatografií V., Chem. listy, 62, 1281 (1968) 3. K. Volka: Analytická chemie II, VŠCHT Praha , 1995.
6
