VÚRV, v.v.i Praha, VŠCHT Praha. ití GMO pro ské. i nepotravinářsk

VÚRV, v.v.i Praha, VŠCHT Praha

pod patronací MŽP ČR

Možnosti využití GMO pro potravinářské i nepotravinářské účely Praha , 13.březen 2008

Tento materiál byl vydán s podporou projektů MŽP ČR /750/1/35/GMO/07 a MZe ČR 0002700602

Editors: Jaroslava Ovesná, Vladimíra Pouchová Issued by : Crop Research Institute, Prague, Czech Republic ISBN: 978-80-87011-43-0

-2-

Možnosti využití GMO pro potravinářské i nepotravinářské účely

Obsah: Úvodní slovo Kateřina Demnerová (VŠCHT Praha), Jaroslava Ovesná (VÚRV, v.v.i.)

4

Geneticky modifikované organismy používané v ČR a Zuzana Doubkova (MŽP ČR)

5

Nové přístupy k identifikaci GMO Jaroslava Ovesná, Jan Hodek (VÚRV, v.v.i.) Kateřina Demnerová (VŠCHT Praha),

11

Geneticky modifikované mikroorganismy jako biosensory kvality životního prostředí Gabriela Kuncová (ÚCHP, v.v.i. AV ČR)

14

Genetické modifikace buněčné stěny kvasničného biosorbentu Pavel Kotrba, Tomáš Ruml (VŠCHT Praha)

19

Expresní systém Pichia pastoris Leona Paulová, Karel Melzoch (VŠCHT Praha)

24

Využití GMO dřevin ve fytoremediacích a pro tvorbu biomasy Jana Malá (VÚLHM, v.v.i.)

28

Transgenní rostliny, příprava a jejich využití pro ochranu životního prostředí 36 Martina Nováková (VŠCHT Praha)

-3-

Vážení kolegové, představujeme vám CD s přednáškami zaměřenými na současnou legislativu GMO v naší republice a na vybrané potencionální aplikace GMO v potravinářské a průmyslové sféře. Tyto přednášky byly uvedeny na semináři konaném dne 13.3.2008 na VŠCHT v Praze. O GMO toho bylo napsáno a řečeno již velmi mnoho, a podíváme-li se na události posledních 10 let, lze s potěšením konstatovat, že i přes stále živený odpor vůči těmto organismům se situace v této oblasti změnila k lepšímu. Je patrna vzestupná tendence konstrukce a využívání GMO na různém stupni úrovně s různým uplatněním. I my se snažíme přispět k porozumění a osvětlení GMO právě organizováním různých odborných seminářů a věříme, že také příspěvky z dnešního semináře tomu napomohou.

Kateřina Demnerová a Jaroslava Ovesná

-4-

GENETICKY MODIFIKOVANÉ ORGANISMY POUŽÍVANÉ V ČR A EU Doubková Zuzana Ministerstvo životního prostředí, Vršovická 65, 100 10 Praha 10, odbor environmentálních rizik, e-mail: [email protected]

Legislativa a základní definice V České republice je nakládání s geneticky modifikovanými organismy (GMO) upraveno zákonem č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, který byl v souvislosti s naším vstupem do EU novelizován zákonem č. 346/2005 Sb. Prováděcím předpisem je vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty. Tímto zákonem a vyhláškou byly do české legislativy převedeny evropské směrnice 2001/18/EC o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismů do životního prostředí a směrnice 98/81/EC o uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy. Kromě našich zákonů platí v České republice po vstupu do EU i některé přímo aplikovatelné předpisy Evropských společenství. V oblasti GMO se jedná o tři nařízení Evropského parlamentu a Rady: •

nařízení č. 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech, které řeší uvádění na trh potravin a krmiv obsahujících GMO nebo z nich vyrobených,

•

nařízení č. 1830/2003 o sledovatelnosti a označování geneticky modifikovaných organismů a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z geneticky modifikovaných organismů a o změně směrnice 2001/18/ES, stanovující povinnosti dovozců, zpracovatelů a prodejců GMO schválených pro uvádění na trh a sledovatelnost (dohledatelnost původu) GM potravin a krmiv,

•

nařízení č. 1946/2003 o pohybech geneticky modifikovaných organismů přes hranice, které přejímá Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti (viz dále).

Tyto předpisy ukládají dovozcům, zpracovatelům, obchodníkům i zemědělcům mnohé povinnosti. Mezinárodní smlouvou stanovující pravidla přeshraničního pohybu živých modifikovaných organismů (dovoz, vývoz, neúmyslný přenos přes hranice např. v důsledku havárií) je

-5-

Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti k Úmluvě o biologické rozmanitosti. Protokol vstoupil v platnost v září 2003 a představuje významný nástroj zejména pro ty státy, které nemají vnitrostátní právní předpisy upravující nakládání s GMO. Zvláštní předpisy se vztahují na registraci léčiv, včetně těch, která obsahují GMO: v ČR platí zákon č. 378/2007 Sb., o léčivech, a současně nařízení ES 726/2004, kterým se stanoví postupy Společenství pro registraci humánních a veterinárních léčivých přípravků a dozor nad nimi a kterým se zřizuje Evropská agentura pro léčivé přípravky (EMEA). Zákon č. 78/2004 Sb. v souladu s předpisy ES definuje genetickou modifikaci jako cílenou změnu dědičného materiálu spočívající ve vnesení cizorodého dědičného materiálu do dědičného materiálu organismu nebo vynětí části dědičného materiálu organismu způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací. Geneticky modifikovaný organismus je podle zákona takový organismus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací provedenou některým ze stanovených technických postupů. Z uvedené definice je patrné, že hranice mezi metodami, jejichž výsledkem je GMO, a metodami, které nespadají do působnosti zákona, byla stanovena administrativně. Rychlý rozvoj molekulární genetiky přináší stále nové techniky, u kterých je třeba z hlediska stávající legislativy posoudit, zda vedou ke vzniku GMO. Právní předpisy rozlišují tři způsoby používání GMO: -

uzavřené nakládání s GMO, což je použití GMO v laboratořích, uzavřených sklenících, chovech zvířat a průmyslových provozech. Pod pojmem nakládání se rozumí nejen vlastní genetická modifikace, ale i uchovávání, pěstování a další manipulace s GMO,

-

uvádění GMO do životního prostředí, neboli jejich záměrné vnesení do životního prostředí mimo uzavřený prostor, a to za jiným účelem, než je uvedení do oběhu. Jde o polní pokusy s geneticky modifikovanými rostlinami na přesně definovaném pozemku, které podléhají přísným pravidlům: sklizené rostliny a semena se po skončení pokusu musí stanoveným způsobem zlikvidovat, pozemek je i po následujících několik let kontrolován. Do této kategorie by patřilo i použití GM mikroorganismů mimo uzavřený prostor, ovšem v ČR zatím nebyl takový výzkum prováděn,

-

uváděním GMO a produktů do oběhu se rozumí jejich předání jiné osobě za účelem distribuce nebo používání, pokud se nejedná o předání výlučně k uzavřenému nakládání

-6-

nebo uvádění do životního prostředí. Jde o dovoz, prodej v obchodní síti, skladování, pěstování za účelem prodeje a zpracování, výrobu konečných produktů a podobně. Používané GMO Spektrum používaných GMO je opravdu široké – od mikroorganismů a buněčných kultur přes laboratorní zvířata po zemědělské plodiny. V ČR, stejně jako v ostatních evropských zemích, převažuje využití GMO k výzkumným a laboratorním účelům, jak je patrné z počtu více než 70 vydaných oprávnění k uzavřenému nakládání. S GM mikroorganismy, buněčnými kulturami, rostlinami a laboratorními zvířaty pracují vědci snad na všech vysokých školách zaměřených na přírodní vědy, ve výzkumných ústavech, kontrolních zemědělských a potravinářských laboratořích a dalších institucích. Pomocí GM baktérií a kvasinek jsou vyráběny enzymy, diagnostika nebo očkovací látky. GM laboratorní myši se používají ve výzkumu genetických poruch a nových léčiv. Modelové GM rostliny slouží ke zkoumání fyziologických pochodů a výběru žádoucích užitkových vlastností. Novou oblast představují léčiva obsahující živé modifikované mikroorganismy - viry, na trhu jsou zatím veterinární vakcíny. Ve stádiu klinických hodnocení se nachází první humánní přípravky, především na onkologická onemocnění. Od konce 90. let probíhají v České republice polní pokusy s různými GM plodinami, zejména kukuřicí, bramborami a do roku 2002 i s řepkou. V současné době je na několika lokalitách testována kukuřice tolerantní k herbicidu s účinnou látkou glyfosát (modifikace GA21 vyvinutá firmou Syngenta a NK603 firmy Monsanto) a hybridní kukuřice NK603 x MON 810 s kombinací dvou vložených vlastností – odolností vůči hmyzím škůdcům (zejména zavíječi kukuřičnému) a tolerancí ke glyfosátu. Celková rozloha všech pokusů s kukuřicí v roce 2007 dosáhla 2,6 ha (včetně ochranného obsevu nemodifikovanou odrůdou). Také v případě brambor zahrnují pokusy různé typy modifikací: český výzkum je zastoupen transgenními bramborami se změněným obsahem cukrů vyšlechtěnými Ústavem experimentální botaniky Akademie věd. Německá firma BASF testuje brambory určené k výrobě technického škrobu, které v hlízách obsahují převážně jen jednu ze složek tvořících škrob – amylopektin nebo amylózu, zatímco produkce druhé složky je potlačena. Cílem je zjednodušení výroby škrobu, protože by odpadla nutnost oddělování obou složek, získané produkty by měly široké použití v papírenském průmyslu, výrobě lepidel, plastických hmot a ve stavebnictví. Tato modifikace je pěstována na poměrně velké ploše 10 hektarů, neboť se předpokládá její schválení pro -7-

uvádění do oběhu na úrovni EU (kromě ČR jsou tyto brambory testovány v Německu a hlavně ve Švédsku, kde byly vyvinuty). Novým typem GM plodiny firmy BASF jsou brambory odolné vůči plísni bramborové, jejich testování je však teprve v začátcích. Výměra pokusů s bramborami (kromě typu Amflora) byla v roce 2007 1,1 ha. Pokusy provádějí instituce, které mají dlouholeté zkušenosti s výzkumem a zkoušením odrůd, jako např. Výzkumný ústav rostlinné výroby, Výzkumný ústav pícninářský atd. Do výčtu polních pokusů patří ještě dva výzkumné projekty: pokusy s geneticky modifikovaným lnem společnosti Agritec Šumperk a výzkum odolnosti ovocných stromů proti virovým chorobám (slivoň Stanley s odolností vůči šarce) Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Ruzyni. V obou posledně jmenovaných případech se jedná o maloplošné pokusy na rozloze max. 300 m2. Uvádění GMO do oběhu je schvalováno na úrovni celé EU a vydaná povolení platí pro všechny členské státy. V důsledku převládajícího negativního postoje veřejnosti i politiků se můžeme na evropském trhu setkat pouze s několika málo GM plodinami nebo výrobky z nich. Nejrozšířenější GM plodinou ve světě je sója tolerantní k herbicidu Roundup, od roku 1998 schválená v EU pro dovoz a zpracování - její pěstování není v Evropě povoleno. Vzhledem k závislosti Evropy na dovozech krmiv se GM sója vyskytuje převážně právě v krmivech, kromě toho lze v obchodech koupit olej vyrobený z Roundup Ready sóji. Jedinou plodinou, kterou je povoleno v EU komerčně pěstovat, je kukuřice linie MON 810, odolná vůči hmyzím škůdcům, zejména zavíječi kukuřičnému, v důsledku vytváření tzv. Bt toxinu. Tato modifikace byla schválena pro uvedení do oběhu, včetně pěstování, v roce 1998 a některé její hybridy byly v uplynulých letech zaregistrovány ve společném katalogu odrůd EU. V regionech, kde je velký výskyt zavíječe kukuřičného, se Bt kukuřice ve srovnání s chemickými postřiky nebo s biologickou ochranou jeví jako nejúčinnější, poskytující vyšší výnosy a lepší kvalitu zrna. Produkce je využívána jako krmivo, nejčastěji přímo pěstitelem. V roce 2007 dosáhla plocha osetá kukuřicí MON 810 v ČR 5 000 ha. Další vydaná povolení k uvádění do oběhu v EU se vztahují pouze na dovoz a zpracování dalších modifikací kukuřice tolerantní k herbicidu (NK 603), odolné vůči škůdcům (MON 863, MON 863 x MON 810) a řepky tolerantní k herbicidu (GT 73 a Ms8 x Rf3). Tyto plodiny ani produkty z nich do ČR nejsou dováženy, i když nelze vyloučit jejich přítomnost v krmných surovinách. Pro zajímavost je možno doplnit, že EU schválila také dovoz řezaných GM karafiátů se změněnou barvou květu (s odstínem do modra, obch. název Moonlite), tyto květiny se však do ČR nedováží. -8-

Všechny GMO a produkty z nich vyrobené musí být označovány podle požadavků evropského nařízení č. 1830/2003. Tato povinnost se týká i výrobků jako je olej, kde není přítomná DNA, a tudíž nelze genetickou modifikaci prokázat. Proto současně s označováním platí i pravidla sledovatelnosti, tj. dohledatelnosti původu zboží. Některé nevládní organizace se snaží jít ještě dále a prosadit označování masa, vajec a mléka zvířat krmených GMO. Označovat není potřeba výrobky, které byly vyrobeny s pomocí GMO, ale žádný geneticky modifikovaný materiál neobsahují, což jsou například sýry, k jejichž výrobě se používají enzymy produkované GM mikroorganismy, nebo krmiva obohacená vitamíny získanými také pomocí GMM. Povinnost označování se dále nevztahuje na výrobky s náhodnými příměsemi povolených GMO do hranice 0,9 %. Zde je nutno zdůraznit, že tato výjimka se týká pouze GMO povolených pro uvádění na trh v EU, pro nepovolené GMO platí nulová tolerance. V ekologickém zemědělství je zakázáno používat GMO, tedy ani např. náhodné příměsi v používaných krmivech nejsou tolerovány. Odborná komise a poskytování informací veřejnosti Z výčtu používaných GMO je patrné, že Česká republika se řadí mezi země ve značné míře využívající potenciálu moderních biotechnologií. Jako každá nová technologie mohou i GMO přinášet určitá rizika, proto je při jejich aplikacích nutná spolupráce zákonodárných i kontrolních státních orgánů s odborníky z různých oborů. Za tímto účelem zřídilo Ministerstvo životního prostředí jako svůj poradní orgán Českou komisi pro nakládání s GMO (ČK GMO), která sdružuje špičkové vědce, zástupce správních úřadů i nevládních organizací. Komise zprostředkovává ministerstvu aktuální vědecké informace jako podklady pro rozhodování, vydává stanoviska a poskytuje podle potřeby odborné konzultace. Díky práci ČK GMO se podařilo vytvořit zázemí pro výkon státní správy v oblasti nakládání s GMO na skutečně vysoké odborné úrovni. MŽP klade značný důraz na poskytování informací veřejnosti a její zapojení do rozhodovacích procesů. Aktuální dokumenty z oblasti GMO, včetně právních předpisů, vydaných povolení, seznamů oprávněných uživatelů, probíhajících řízení a mnoho dalších údajů zveřejňuje MŽP na internetu na adrese http://www.env.cz/AIS/web.nsf/pages/gmo (nebo z hlavní stránky MŽP www.env.cz odkaz na „životní prostředí“, dále na „environmentální rizika“ a „GMO“). V průběhu správního řízení o povolení nakládání s GMO jsou informace zpřístupňovány občanům i prostřednictvím příslušných krajů a obcí. Další -9-

informační zdroje představují publikace MŽP, semináře a každoroční veřejná schůze České komise pro nakládání s GMO.

- 10 -

NOVÉ PŘÍSTUPY K IDENTIFIKACI GMO Ovesná Jaroslava1, Demnerová Kateřina2 , Hodek Jan1 1

VÚRV,v.v.i. Praha, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně, tel. 233 022 424 2 VŠCHT Praha, Technická , 160 00 Praha 6, tel. 220 443 025 e-mail: [email protected]

Abstrakt: Příspěvek podává přehled o základních postupech a normativech stanovení GMO a odvozených produktů v komoditách a

platných pro

výrobcích. Objasňuje kontrolní

systémy v ČR a návaznost na evropská pravidla.

Klíčová slova: GMO, stanovení, DNA, mezinárodní normy

Geneticky modifikované organismy jsou všechny organismy mimo člověka, jejichž genetický materiál byl pozměněn přidáním nebo vynětím genu jiným způsobem než je běžnou rekombinancí. V současné době se běžně využívají geneticky modifikované mikroorganismy (výroba léčiv, produkce potravních doplňků, fytoremediace). Běžnou součástí potravního řetězce jsou i geneticky modifikované kulturní rostliny a potraviny z nich vyrobené. Geneticky modifikovaná zvířata jsou zatím stranou pozornosti spotřebitelů, ale současné technologie již umožňují jejich vývoj. Nakládání s GMO je na všech stupních regulováno příslušnou legislativou. Při uvolňování GM do životního prostředí se zvažují možné interakce s místními ekosystémy, t.j. zkoumá se možný přenos gen prostřednictvím pylu na příbuzné plevelné druhy, možný vliv na cílový i necílový hmyz a další živočichy. Při uvolňování do oběhu se pak zvažuje možná alergenicita a toxicita včetně možné dlouhodobé expozice. Proto je třeba disponovat postupy k pro identifikaci každého GMO. Tyto postupy jsou založeny jednak na sledování nových proteinů, které GMO exprimuje nebo úseků DNA, které do něho byly vloženy. Vzhledem k tomu, že řada výrobků, které obsahují GMO nebo z něj byly připraveny je zpracováno způsobem, který ničí přirozenou strukturu proteinů, nejčastěji se využívá stanovení nukleových kyselin, zjm. DNA. Výsledek stanovení GMO musí obrážet skutečné zastoupení v dané komoditě nebo výrobku a to jak ve velkých zásilkách typu - 11 -

zaoceánských lodních nákladů, na polích nebo na pultech obchodních řetězců. Nedílnou součástí je tedy vzorkování, příprava laboratorního a analytického vzorku a samotná analýza a interpretace vzorku (Tab. 1).

Tab. 1 Základní normy pro stanovení GMO __________________________________________________________________________ Vzorkování se provádí v zásadě podle EN/TS 15568 Pak se přítomnost GMO nebo jejich částí stanovuje na základě přítomnosti DNA nebo proteinů Stanovení proteinů seprovádní podle

EN ISO 21572

(extrtakce, immunoassay,

interpretace) Stanovení transgenní DNA se provádí podle Extrakce nukleových kyselin

►

EN ISO

21571

Skríning

►

EN ISO

21571

Identifikace

► EN ISO 21569

Kvantifikace

►

EN ISO

21570

Interpretace výsledků __________________________________________________________________________

V ČR zajišťují kontrolu nakládání s GMO smluvní laboratoře Ministerstva životního prostředí (laboratoře VÚRV,v.v.i Praha,VŠCHT Praha a SZÚ Brno) a kontrola potravin a krmiv spadá do působnosti orgánů Ministerstva zemědělství ČR. (SZPI Brno, ÚKZÚZ Brno, SVS Jihlava a VÚRV,v.v.i. Praha). Pravidla ko-existence odlišných způsobů rostlinné výroby v praxi napomáhá kontrolovat laboratoř VÚRV,v.v.i. Praha.

Laboratoře se sdružují do

Národní sítě GMO laboratoří. Všechny jsou akreditovány podle ISO 17025:2005, to znamená že pracují v systému jakosti. Společně laboratoře zabezpečují závazky ČR ve smyslu evropské legislativy (Směrnice 2001/18/EC a nařízení Evropského parlamentu a rady 1829/2003, 1946/2003, 1830/2003, 65/2003). Laboratoře jsou i členy sítě Evropských laboratoří pro identifikaci GMO (European Network of GMO Laboratories – ENGL), která je nápomocna činnosti referenční laboratoři Evropské Unie (CRL – Community Reference Laboratory), jmenované podle nařízení - 12 -

Evropského parlamentu a rady 882/2004. CRL jsou předávány k validacím metody, které jsou součástí žádostí o uvolnění nových GMO do oběhu spolu s kontrolním materiálem. Po základním ověření metody jsou vybrány laboratoře, které se účastní validační studie. Po vyhodnocení zpět zaslaných výsledků vydává CRL stanovisko, zda výkonnostní metody odpovídají kritériím přijatými v rámci ENGL. Úkolem ENGL je dále -

napomáhat CRL

-

harmonizovat postupy stanovení GMO

-

v rámci pracovních skupin řešit aktuální problémy spojené se vzorkováním a stanovením GMO

-

hodnotit vědecké poznatky ve vztahu ke stanovení GMO

V rámci ČR je činnost laboratoří podporována ze státního rozpočtu (kontrolní laboratoře). Některé laboratoře se mají možnost zaměřit i na výzkum v dané oblasti. Zadání je dáno projekty MZe ČR, NAZV nebo MŽP ČR). Výzkum se zaměřuje na metody stanovení, odhad možných interakcí nově uvolňovaných GMO s životním prostředím, podklady pro tvorbu normativů pro existenci různých způsobů rostlinné výroby. Z nových postupů je třeba zmínit DNA čipy. Kontrola nakládání s GMO v ČR probíhá v souladu s legislativou ČR i EU. Poděkování: Tento příspěvek byl zpracován s podporou projektů NAZV 1B44068 a CZ 00027006.

Abstract: Contribution provides an overview on basic procedures and standards valid for detection and quantification of GMO and derived products in comodities and products. Control system in the Czech Republic and its link to European rules are discussed.

- 13 -

VYUŽITÍ GMM PŘI KONSTRUKCI BIOSENZORŮ XENOBIOTIK Kuncová Gabriela Ústav chemických procesů AV ČR v.v.i., Rozvojová 135 165 02 Praha 6 e-mail: [email protected]

Biosenzor je analytické zařízení, které kombinuje biologickou citlivou část s přenašečem tak, že produkovaný signál je úměrný koncentraci analytu. Signál může být výsledkem změny koncentrace protonů, vývoje nebo spotřeby plynů, emise nebo absorpce světla v důsledku metabolismu cílové sloučeniny biologickou částí biosenzoru. Přenašeč přeměňuje tento biologický signál na měřitelnou odezvu jako je elektrický proud, potenciál nebo absorpce světla. Tato odezva je dále zesilována a upravována. Jako citlivé části biosenzorů byly použity enzymy, protilátky, organely, živé rostlinné i živočišné buňky a mikroorganismy. Výhody použití mikroorganismů spočívají ve schopnosti detekovat celou řadu chemických látek, v širokém rozsahu teplot i pH a v relativní snadnosti jejich genetické modifikace. Od roku 1990, kdy byla publikována první práce [1] popisující geneticky upravenou bakterii, která sloužila jako bioreportér, bylo připraveno mnoho bakterii kvasinek i eukaryotických buněk, které mohou detekovat celou řadu xenobiotik (cizorodých látek v organismu). V tabulce 1 jsou uvedeny chemické a fyzikální vlivy, které mohou být detekovány bioreportéry s lux geny [2]. Přímá úměrnost v závislosti intenzity bioluminiscence na koncentraci analytu byla prokázána například v případě detekce salycilátu pomocí Pseudomonas fluorescens

HK44.

Termín bakteriální bioreportér označuje živý

mikroorganismus, který odpovídá na změny ve svém okolí specifickým a snadno měřitelným signálem.

Bioreportér muže být ale nemusí být nutně geneticky modifikovaný

mikroorganismus. Každý bioreportér nese dva klíčové geny, které jsou odpovědné za produkci měřitelného signálu a specifické rozpoznání analytu s následnou aktivaci reportérových genů.

Obecné schéma funkce bakteriálního bioreportéru – celobuněčného

optického senzoru - je na obrázku 1.

- 14 -

Ztráta analytu Difuze /transport

Difuze /vyloučení Vlastní senzor: regulační protein

Reportér (β-galaktosidása, bioluminiscence, fluorescence.)

Degradace / modifikace Promoter

+

Reportérové geny

Obr 1.: Obecné schéma bakteriálního bioreportéru. Vlastní senzor je často regulační protein, který zapíná

specifický gen nebo operon

v přítomnosti induktoru (analytu, xenobiotika). Promoter pro tento gen je spojen s reportérovým genem což vede k produkci detekovatelné aktivity, nejčastěji

lacZ, β-

galactosidasové aktivity; luxCDABE, luminiscence; nebo gfp, fluorescence [2]. V závislosti na tom jakým způsobem dochází k identifikaci analytu, jak je tento převáděn na měřitelný signál a který parametr je měřen, můžeme bioreportéry rozdělit do tří základních tříd : I.

Přítomnost analytu zvyšuje výstupní signálu

II.

Výstupní signál je zvýšen v důsledku stresu

III.

Bioreportéry, které reagují nespecificky v širokém rozsahu sloučenin a stresů snížením signálu.

Klíčové kroky, které mohou ovlivnit citlivost bioreportéru zahrnují difuzi nebo transport analytu do buňky, ztráty analytu způsobené degradací, modifikací nebo zpětným vyloučení z buňky, dále afinitu vlastního senzoru ke sledované sloučenině. Zvýšení citlivosti může být dosaženo například použitím většího objemu vzorku, ze kterého buňky samy vychytávají analyt nebo v případě ve vodě špatně rozpustných sloučenin přidáním povrchově aktivní látky.

- 15 -

Tabulka 1. Analyty detekovatelné bioreportéry s lux geny BTEX (benzen, toluen,

trinitrotoluene

zinek

2,4,6-Trichlorofenol

naftalen

nickel

2,4-dichlorofenol

kyselina p-chlorobenzová

železo

3-xylen

salicylát

olovo

4-chlorobenzoat

organické peroxidy

rtuť

4-nitrofenol

aflatoxin B1

chromany

2,3-dichlorofenol

hemolysin

nitráty

fenol

p-cymen

peroxid

ethylbenzen, xylen)

vodíku pentachlorofenol

alginát

amoniak

trichloroethylén

laktony N-acyl homoserinu

tepelný šok

PCBs

tetracyklin

γ-záření

chlorodibromomethan

kobalt

ultrazvuk

chloroform

kadmium

UV světlo

isopropyl benzen

měď

poškození DNA

Citlivost bakteriálních bioreportérů, která obvykle nepřesahuje obvykle 0,1 µM, je nízká pokud ji srovnáváme s chromatografickými metodami

(GC-MS, LC-MC), které mohou

dosahovat selektivní detekce na úrovni ng/l [3]. Výhody celobuněčných senzorů jsou, že není zapotřebí extrakce a zakoncentrování vzorku, a že koncentrace analytu

detekovaná živým biosensorem

lépe odpovídá jeho biologické

dostupnosti. Dále, použití bioreportérů může být zvláště výhodné při detekci na znečištěných lokalitách, kde se obvykle nachází směs různých sloučenin, protože bioreportéry zpravidla - 16 -

detekují skupiny příbuzných látek spíše než jednotlivé chemikálie [4]. V neposlední řadě detekce xenobiotic pomocí bioreportérů je podstatně levnější než chemická analýza. V dané lokalitě je potom realné analyzovat více vzorků a tak přesněji určit polohu znečištěných míst. Pokud jsou buňky bioreportéru pevně spojeny s přenašečem signálu, má tento biosensor výhodu i v tom, že může být použit pro kontinuální on-line detekci ve vodě nebo ve vzdálených a těžko přístupných lokalitách. V současnosti jsou dostupné integrované obvody a další elektro-optické součástky, které umožňují konstrukci čipu s imobilizovaným bioluminiscenčním bioreportérem jehož signál je bezdrátově přenášen nebo lokalizován na kilometrovou vzdálenost.

Vzdálené monitorování fluorescence, změny barvy nebo

elektrochemického signálu vyžaduje navíc zdroj energie nebo světla v místě detekce. Použití jediné buňky jako miniaturního senzoru se zatím ukázalo jako nevhodné, protože klonované bakteriální populace jsou vždy fenotypově a genotypově heterogenní [6]. Použití bioreportérů je a bude omezeno tím, že živé mikroorganismy potřebují zajistit podmínky pro přežití; teplotu, vlhkost, pH, přísun kyslíku a nutrietů. Čas potřebný pro transport analytu v buňce a expresy proteinů odpovědných za produkci biologického signálu prodlužuje rychlost odezvy (produkci detekovatelného signálu) na desítky minut. Při konstrukci bakteriálních senzorů je proto nutné, kromě genetického inženýrství, věnovat pozornost i jejich trvanlivosti a skladovatelnosti. Pro stabilizaci bakteriálních biosenzorů bylo použito lyofylizace, vakuové sušení, kontinuální kultivace a enkapsulace do organických i anorganických polymerů [5]. Každá z uvedených metod má své výhody a nevýhody. Lyofylizace je drahý ale technologicky dobře zvládnutý proces. Vakuové sušení je sice levnější ale méně šetrné vůči mikroorganismům. Kontinuální kultivace zajišťuje nejlépe stálou a vysokou koncentraci čerstvých aktivních buněk ale je náročná na obsluhu a je ohrožována kontaminací a genetickým posunem. Enkapsulace do organických polymeru je šetrný proces ale dobré podmínky pro růst bakterii často vedou k jejich úniku z enkapsulátu. Enkapsulace do anorganického polymerů fixuje bakterie v chemicky stálé a opticky transparentí matrici ale v průběhu imobilizace může dojít k poškození buněk vlivem změn pH, působením alkoholů uvolňujících se při gelaci a smrštěním gelu. Bylo pozorováno dlouhodobé přežívání buněk (měsíce) ale zatím není známo, zda se buňky rozmnožují pouze na povrchu nebo i uvnitř anorganického gelu.

- 17 -

V současnosti je považováno za poměrně snadné připravit specifický bioreportér na bázi bakteriálního signálního řetězce, nicméně je prakticky nemožné úplně odpojit signální řetězec a reportérovou genovou expresy od celkového buněčného kontrolního mechanismu. Bioreportéry se dobře kultivují ale je většinou těžké je udžet ve stavu vhodném pro analytickou aplikaci kvůli nízké reprodukovatelnosti odezvy a skladovatelnosti. Nicméně bioluminiscenční bioreportéry byly již použity k polním pokusům a k detekci arsenu ve vodě [7, 8].

Literatura: 1. King, J.M.H., DiGrazia, P.M., Applegate, B., Burlage, R., Sanseverino, J., Dunbar, P., Larymer F., Sayler G.S. (1990) Rapid, sensitive bioluminescent reporter technology for naphthalene exposure and biodegradation. Science 249: 778–781. 2. Nivens D.E., McKnight T.E., Moser S.A., Osbourn S.J., Simpson M.L, Sayler G.S. (2004) Bioluminescent bioreporter integrated circuits: potentially small, rugged and inexpensive whole-cell biosensors for remote environmental monitoring. Journal of Applied Microbiology, 96: 33–46. 3. van der Meer J.R., Tropel D., Jaspers M.: (2004) Illuminating the detection chain of bacterial bioreporters. Environmental Microbiology: 6 (10), 1005–1020. 4. Trögl J., Kuncová G., Kubicová L., Pařík P., Hálová J., Demnerová K., Ripp S., Sayler G.S. (2007) Effect of Naphthalene and Salicylate Analogues on the Bioluminescence of Bioreporter Pseudomonas Fluorescens HK44. Folia Microbiol.: 52 (1), 3-14. 5. Bjerketorp J., Hakansson S., Belkin S., Jansson J.K. (2006) Advances in preservativ methods: keeping biosensor microorganisms alive and active. Current Opinion in Biotechnology: 17, 43-49. 6. Tecon R., van de Meer J.R. (2006) Information from single–cell bacterial biosensors: chat is it good for? Current Opinion in Biotechnology: 17, 43-49. 7. Ripp S., Nivens D.E., Ahn Y., Werner C., Jarrell J., Easter J.O., Cox C.D., Burlage R.S., Sayler G.S. (2000) Controlled field Release of a Bioluminescent Genetically Engineered Microorganism for Bioremediation Process Monitoring and Control. Environ. Sci. Technol:. 34, 846-853. 8. Trang P.T., Berg M., Viet P.H., Van Mui N., van de Meer J.R. (2005) Bacterial bioassay for rapid and accurate analysis of arsenic in highly variable groundwater samples. Environ. Sci. Technol.: 39, 7625-7630.

- 18 -

GENETICKÉ MODIFIKACE BUNĚČNÉ STĚNY KVASNIČNÉHO BIOSORBENTU Kotrba Pavel, Ruml Tomáš Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, 16 28 Praha 6 – Dejvice, ČR. e.mail: [email protected]

Biosorpce těžkých kovů na polysacharidech a dalších asociovaných biopolymerech a funkčních skupinách buněčných stěn bakterií, kvasinek, plísní, řas a chaluh prostřednictvím iontové výměny, chelatace, fyzikální adsorpce, mikroprecipitace a zachycení volného iontu v kapilárách matrice buněčné stěny, je považováno za slibný biotechnologický přístup pro odstraňování těžkých kovů z odpadních vod.1, 2 Buněčná stěna S. cerevisiae je tvořena především vnitřní rigidní sítí β-1,3-glukanu a vnější plastickou vrstvou mannoproteinů, které vzájemně integrují β-1,6-glukan a chitin a jako minoritní složky dále obsahuje lipidy a pigmenty. Proteinové komponenty buněčné stěny, většinou kovalentně vázány glykosidovou vazbou

na

β-1,6-glukan

prostřednictvím

glykosylfosfatidylinosotolové (GPI) kotvy3,

oligomannosylového

zbytku

jsou bohatě O- a N-mannosylovány a cukerné

komponenty jsou fosforylovány. Funkční skupiny, především karboxylové, acetimidové, fosfátové, hydroxylové, sulfhydrylové a aminoskupiny obsažené v biopolymerech buněčné stěny S. cerevisiae pak představují přirozené ligandy o různé afinitě k iontům kovů. 4 Řada modelových studií zaměřených na modifikace bakteriálních povrchů ukázala, že spektrum ligandů a biosorpční vlastnosti buněčné stěny lze ovlivnit zavedením (poly)peptidů schopných vázat těžké kovy. 5,6 Ukázali jsme například, že povrchová expozice CP peptidu (Gly-Cys-Gly-Cys-Pro-Cys-Gly-Cys-Gly) a HP peptidu (Gly-His-His-Pro-His-Gly) vede k několikanásobnému zvýšení přirozené schopnosti E. coli akumulovat Cd2+ (lit.7). CP peptid byl vybrán ze sady syntetických peptidů navržených pro vazbu Cd2+ (lit.8) a sekvence HP peptidu představuje motiv, který se vyskytuje v 1-3 násobných tandemních repeticích v sekvenci Histidine Rich Glycoproteinu krevní plasmy a vytváří stabilní koordinační sféry tranzitních kovů s afinitou klesající v řadě Cu2+>Zn2+>Ni2+>Cd2+>Co2+ (lit.9). Jako proteinová doména, pro kovalentní zakotvení nových vazebných míst pro kovy na kvasničném povrchu byla vybrána velmi dobře charakterizovaná 320 aminokyselinová C-koncová doména α-aglutininu 10, zde označovaná AGα1Cp. Byl konstruován fúzní gen MFα1-V5-AGα1C (Obr. 1A), kódující signální sekvenci α kopulačního faktoru (MFα1) pro

- 19 -

směrování proteinů do endoplazmatického retikula a následně na povrch kvasinky, 14-ti aminokyselinový V5 epitop paramyxoviru SV5 pro imunochemickou detekci a konečně AGα1Cp nesoucí signál pro připojení GPI kotvy.11 Účinná konstitutivní exprese V5-AGα1Cp v buňkách S. cerevisiae W303 (MATa kmen neprodukující α-aglutinin), jeho expozice a kovalentní zakotvení na buněčné stěně byly potvrzeny imunochemicky (Obr. 1B,C). Důležitým výsledkem této analýzy bylo zjištění, že rekombinantní AGα1Cp je O- a především N-glykosylován (Obr. 1C) podobně jako u nativního α-aglutininu.12 Na základě prvkové analýzy buněčných stěn11 byl počet molekul V5-AGα1Cp na povrchu 1 buňky vypočten jako 4,5×106, což je hodnota souměřitelná s přirozenými 1,6×106 kopiemi u stěnového proteinu CWP2 (lit. 13). S ohledem na předchozí zkušenosti s expozicí peptidů na modelovém povrchu E. coli byly pro modifikace buněčné stěny S. cerevisiae zvoleny sekvence CP (dvě tandemní repetice – CP2; [GCGCPCGC]2G) a HP (tři tandemní repetice – HP3; [GHHPH]3G) peptidů. Další vybraný sekvenční motiv, NP peptid (MDCPTEEALIR), odpovídá konvenční sekvenci některých bakteriálních P1-ATPas, které exportují ionty kovů

(především Pb2+)

z cytoplasmy, kde je motiv CxxEE považován za místo prvotní interakce iontu kovu s transportérem.14 Byly konstruovány odpovídající N-terminální genetické fúze vybraných

Obr. 1: Expresní vektory a imunochemická lokalizace V5-AGα1Cp (A) Schematické znázornění konstrukce expresních vektorů na bázi plasmidu p416GPD (lit.20) (centromerový vektor [CEN6/ARSH4] s promotorem GPD glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasy). (B) V5-AGα1Cp v buněčných stěnách S. cerevisiae W303 detekovaný

pomocí

anti-V5

protílátky.

(C)

Imunochemická

detekce

V5-AGα1Cp

v extraktech

z modifikovaných buněčných stěn. SDSe: nekovalentně vázaný podíl extrahovatelný SDS; LAMe: kovalentně vázaný protein extrahovatelný glukanasou laminarinasou; Endo-H: snížení molekulové hmotnosti V5-AGα1Cp z frakce LAMe po ošetření endoglykosidasou H indikující odštěpení větvených mannanů.

- 20 -

peptidů s V5-AGα1Cp a byla potvrzena povrchová expozice a kovalentní zakotvení CP2-, HP3 a NP-V5-AGα1Cp na buněčné stěně v S. cerevisiae W303. Modifikace krátkými peptidy neměly vliv ani na počet kopií fúzí v buněčné stěně. Posouzení vlivu jednotlivých modifikací na schopnost rekombinantních kmenů akumulovat kovy bylo prováděno ve vsádkovém uspořádání biosorpčního experimentu. Za nastavených podmínek nedocházelo k výraznější intracelulární akumulaci kovů a hlavním mechanismem akumulace byla biosorpce. Nejvýrazněji se projevila modifikace samotnou kotvou V5-AGα1Cp, která vedle postranních řetězců aminokyselin přináší jako vazebná místa také hydroxyly a fosfátové skupiny mannanů. Při 100μM počáteční koncentraci kovů v roztoku znásobila expozice AGα1Cp množství sorbovaného Cd2+ 2,4krát, Cu2+ 4krát a Zn2+ 1,5krát (Obr. 2A), neměla však vliv na akumulaci Pb2+ (data neuvedena). Tyto výsledky dobře korelují se zjištěnou závislostí biosorpční kapacity na tloušťce mannoproteinové vrstvy.15, 16 Dostálek a kol. 17 také ukázali, že biosorpční kapacita S. cerevisiae klesá o 25 %, pokud je kultivace vedena za podmínek limitace zdrojem fosforu. Peptidy CP2, HP3 a NP exponované ve formě fúzí s V5-AGα1Cp přispívaly specificky k biosorpci pouze jednoho určitého kovu (Obr. 2B). Nebylo však dosaženo výrazného efektu a i projev CP a HP motivů se lišil od situace pozorované při jejich expozici na buněčné stěně E. coli. Přibližně 30% zvýšení sorpční kapacity v důsledku expozice CP2 pro Cd2+, 15-20% zvýšení sorpční kapacity pro Zn2+ u buněčných stěn obsahujících HP3 (Obr. 2B) a 22% nárůst kapacity buněčné stěny pro Pb2+ v důsledku expozice NP peptidu (Obr. 2C) nesplňovalo očekávání. V případě modifikovaných buněčných stěn E. coli převyšoval přírůstek v množství akumulovaného Cd2+ počet exponovaných vazebných míst o více než 2 řády.7, 18, 19 Tento jev byl vysvětlován kooperací mezi vazebným místem peptidu a přirozenými vazebnými místy na povrchu E. coli. Ionty Cd2+ primárně vázané peptidem jsou pak následně deponovány na jiných strukturách buněčné stěny. V případě modifikované S. cerevisiae pak patrně k podobné interakci mezi peptidem a přirozenými ligandy buněčné stěny za nedochází. Takovou představu potvrzuje i zjištění, že při nízkých počátečních koncentracích Zn2+, kdy se projevuje především kovalentní vazba kovů 4,

odpovídal

přírůstek vazbě 3,7 iontů Zn2+ na HP3 peptid, což je v dobré shodě se stechiometrií

- 21 -

Obr. 2: Biosorpce kovů buňkami S. cerevisiae W303 exponujícími varianty AGα1Cp. (A) Biosorpce z roztoků o počáteční koncentraci kovu (Me2+) 100 μM. (B) Selektivní příspěvek CP2 a HP3 k biosorpci Cd2+ a Zn2+. (C) Selektivní příspěvek NP k biosorpci Pb2+ (NP nepřispíval k sorpci Cd2+ a Zn2+).

Zn:HP3 stanovenou in vitro jako 3:1 (lit.11). Lze spekulovat, že důvodem nízkého příspěvku CP2, HP3 a NP peptidů k vazbě kovů modifikovanými buňkami S. cerevisiae může paradoxně být vysoká afinita těchto peptidů k Cd2+, Zn2+ a Pb2+, v uvedeném pořadí. Zde jsme ukázali, že jednou z cest jak zvýšit biosorpční kapacitu buněčné stěny je nadprodukce

v podstatě

přirozeného

stěnového

mannoproteinu

a

takto

geneticky

modifikovaný mikroorganismus by mohl být snadněji akceptovatelný pro zavedení do biotechnologické praxe. Ukázali jsme, že v matrici buněčné stěny S. cerevisiae lze zavedením krátkých peptidových motivů, jejichž postranní řetězce vytváří stabilní koordinační sféry pro ionty kovů, lze dále specificky zvýšit sorpční kapacitu pro určitý ion kovu, nicméně toto zvýšení není zásadní. Lze se tedy domnívat, že celkovou charakteristiku modifikovaného povrchu určuje nejen afinita exponovaného peptidu, ale i „reaktivita“ buněčné stěny. Tento projekt je podporován z prostředků MŠMT ČR granty

č. 1M6837805002 a

MSM 6046137305.

Literatura: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Gupta R., Ahuja P., Khan S., Saxena R.K., Mohapatra H. (2000) Curr. Sci. 78, 967-973. Wang, J., Chen, C. (2006) Biotechnol. Adv. 24, 427-451. Klis, F.M., Mol, P., Hellingwerf, K., Brul, S. (2002) FEMS Microbiol. Rev. 26, 239-256. Avery, S.V., Tobin, J.M. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 2851-2856. Mejáre, M., Bülow, L. (2001) Trends Biotechnol. 19, 67-73. Wernerus, H., Stahl, S. (2004) Biotechnol. Appl. Biochem. 40, 209-228. - 22 -

7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Kotrba, P., Dolečková, L., de Lorenzo, V., Ruml, T. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65, 1092-1098. Kotrba, P., Dolečková, L., Pavlík, M., Ruml, T. (1996) Biotechnol. Tech. 10, 773-778. Morgan, W.T. (1984) Biochemistry 24, 1496-1501. Kondo A., Ueda, M. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 28-40. Vinopal, S., Ruml, T., Kotrba, P. (2007) Int. Biodeter. Biodegr. 60, 96-102. Chen, M.-H., Shen, Z.-M., Bobin, S., Kahn, P.C., Lipke, P.N. (1995) J. Biol. Chem. 270, 2616826177. Ghaemmaghami, S., Huh, W.-K., Bower, K., Howson, R.W., Belle, A., Dephoure, N., O’Shea, E.K., Weissmen, J.S. (2003) Nature 425, 737-741. Mergeay, M., Monchy, S., Vallaeys, T., Auquier, V., Benotmare, A., Bertin, P. a kol. (2003) FEMS Microbiol. Rev. 27, 385-410. Brady, D., Stoll, A., Starke, L., Runcán, J.R. (1994) Biotechnol. Bioeng. 44, 297-302. Park, J.K., Lee, J.W., Jung, J.Y. (2003) Enz. Microb. Technol. 33, 371-378. Dostalek, P., Patzak, M., Matejka, P. (2004) Int. Biodeter. Biodegr. 54, 203-207. Sousa, C., Kotrba, P., Ruml, T., Cebolla, A., De Lorenzo, V. (1998) J. Bacteriol. 180, 2280-2284. Kotrba, P., Pospisil, P., de Lorenzo, V., Ruml, T. (1999) J. Recept. Signal Transduct. Res. 19, 703-715. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. (1995). Gene 156, 119-122.

- 23 -

EXPRESNÍ SYSTÉM Pichia pastoris Paulová Leona, Melzoch Karel Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav kvasné chemie a bioinženýrství Technická 3, 16 28 Praha 6 – Dejvice, ČR. e.mail: [email protected]

V posledních desetiletích došlo k velkému pokroku v oblasti molekulární genetiky a tento rozvoj s sebou přinesl možnost vnášet geny do různých organismů, jež jsou významně odlišné od organismů, které původní gen poskytly. Hlavním posláním těchto nově vytvořených rekombinantních organismů je produkce proteinů a mnoho výzkumných prací se soustředí na nalezení způsobu, jak tyto proteiny produkovat efektivně, ve funkční podobě a aktivní formě. Od roku 1980, kdy byl na trh uveden první produkt vyrobený pomocí rekombinantních technologií, byl zaznamenán v biofarmaceutické oblasti neobyčejný nárůst spektra produktů, které nahradily proteiny, které byly doposud získávány z živočišných zdrojů. Motivací tohoto výzkumu je zejména omezení rizik spojených s přenosem různých onemocnění, jako je například BSE nebo Creutzfeld-Jacobsova nemoc u produktů, které byly izolovány z částí tkání jatečních zvířat. Ačkoli jsou v současné době v souvislosti s expresí mikrobiálních terapeutických proteinů nejčastěji zmiňovány expresní systémy E.coli nebo S.cerevisiae, expresní systém Pichia pastoris představuje jejich účinnou alternativu. Kvasinka Pichia pastoris patří spolu s kvasinkami rodu Hansenula, Candida a Torulopsis mezi methylotrofní organismy, které jsou schopny využívat jako jediný zdroj uhlíku a energie metanol (Faber a kol., 1995). Všechny methylotrofní kvasinky sdílejí specifické metabolické cesty, kterými utilizují methanol, k čemuž využívají množství unikátních enzymů, jako jsou například alkoholoxidáza nebo dihydroxyacetonsyntáza (Cereghino a Cregg, 2000). Vývoj

expresního

systému

Pichia

pastoris

je

zajímavý,

neboť

původní

biotechnologické využití této kvasinky bylo od její dnešní úlohy zcela odlišné. V 70. letech byla kvasinka Pichia pastoris díky své schopnosti využívat methanol jako jediný zdroj uhlíku a energie využita jako systém pro produkci krmných bílkovin, tzv. single cell proteins. Společnost Philips Petroleum Company jako první vyvinula média a protokoly, které umožňovaly kultivaci kvasinky P. pastoris na metanolu do vysoké buněčné hustoty (více než 130 g/l sušiny). V důsledku ropné krize, která způsobila dramatický vzrůst ceny methanu

- 24 -

(zdroj methanolu) a současného poklesu cen sojových bobů, však přestal být tento proces ekonomicky atraktivní (Cereghino, Cregg, 1999). V následujícím desetiletí se proto společnost

Philips

Petroleum

Company

ve

spolupráci

se

Salk

Institute

Biotechnology/Industrial Associates, Inc. (SIBIA, La Jolla, CA, USA) soustředila na vývoj metod, které umožnily využít kvasinku P. pastoris jako hostitelský organismus pro expresi cizích proteinů a v průběhu několika let byly vyvinuty protokoly pro molekulární manipulace této kvasinky. To, co původně začalo jako program využití methanolu pro produkci krmných bílkovin se v průběhu dvaceti let vyvinulo v expresní systém, který získává stále širší pozornost, a to zejména díky své schopnosti produkovat širokou škálu proteinů s vysokými výtěžky (Rosenfield a kol., 1999). Využití kvasinky Pichia pastoris pro expresi proteinů s sebou přináší ve srovnání s prokaryotními nebo savčími expresními systémy mnohé výhody. V případě využití AOX promotoru je transkripce vloženého genu účinně regulována a řízena mechanismem represe/dereprese a indukce, což umoňuje získání husté kultury produkčního kmene dříve než je indukována exprese vloženého genu, což se děje přidáním methanolu do kultivačního média. Kvasinka Pichia pastoris je schopna produkovat rekombinantní proteiny jak intracelulárně, tak extracelulárně, a to ve vysokých koncentracích, které se často pohybují v řádech g/l. Výhodou je i to, že je na rozdíl od bakteriálních expresních systémů je tato kvasinka schopna posttranslačních modifikací produkovaných proteinů, jako je například tvorba disulfidových můstků nebo O- a N-glykosylace. Kvasinka Pichia pastoris je schopna růst v relativně širokém rozmezí pH (3-7), což umožňuje zvolit při kultivaci takové pH, které je optimální pro stabilitu produkovaného proteinu. Na rozdíl od živočišných buněk expresní systém Pichia nevyžaduje pro svůj růst komplexní média nebo speciální kultivační podmínky, naopak roste na relativně levných definovaných médiích, která se skládají ze zdroje uhlíku (glycerolu, metanolu), biotinu, roztoku solí a stopových prvků. Jelikož toto médium neobsahuje nedefinované přísady, které mohou být zdrojem pyroxenů nebo toxinů, je proto vhodné i pro produkci farmaceutických proteinů. Fakt, že se při kultivaci pracuje obvykle při relativně nízkém pH a v médiu je přítomen metanol, omezuje možnost kontaminace nežádoucími mikroorganismy. Využití tohoto expresního systému usnadňuje i skutečnost, že tento systém je k dispozici jako komerční kit (Cereghino a Cregg, 1999). Při expresi cizích proteinů kvasinkou Pichia pastoris se nejčastěji využívá AOX promotor a produkce je založena na předpokladu, že enzymy potřebné pro metabolismus metanolu jsou syntetizovány pouze tehdy, je-li metanol přítomen v kultivačním médiu - 25 -

(Veenhuis a kol., 1983). Enzym alkoholoxidáza katalyzuje první krok metabolismu metanolu, jeho oxidaci na formaldehyd a peroxid vodíku, proto se vyskytuje ve velkých množstvích v buňkách rostoucích na metanolu, ale v přítomnosti ostatních zdrojů uhlíku (glukosa, glycerol, ethanol) není v buňce přítomen. Pichia pastoris má dva geny, které kódují enzym alkoholoxidázu, a to geny AOX1 a AOX2, přičemž první z nich je zodpovědný za produkci více než 90% enzymu přítomného v buňce (Cos a kol., 2004). Z hlediska utilizace methanolu lze rozlišit tři fenotypy expresních kmenů. První se označuje jako Mut+ (metanol utilizující typ plus), který má funkční oba geny AOX1 i AOX2 a roste na methanolu stejně jako neupravený kmen specifickou růstovou rychlostí pohybující se kolem hodnoty 0,1 h-1. Druhým fenotypem je MutS (typ pomalu utilizující metanol), který má odstraněn AOX1 gen a metabolismus metanolu závisí pouze na transkripčně slabším AOX2 genu. V důsledku toho je růst na methanolu pomalejší – zhruba 0,04 h-1. Třetí fenotyp je označován jako Mut-. U tohoto fenotypu jsou odstraněny oba AOX geny, a proto nemůže metanol metabolizovat, jeho specifická růstová rychlost na metanolu je rovna nule. Přesto je metanol potřebný pro indukci exprese vloženého genu. Pro efektivní expresi každého jednotlivého rekombinantního proteinu je potřeba optimalizovat kultivační podmínky, v této souvislosti je v odborné literatuře publikováno množství kultivačních protokolů, ale většina z nich vychází ze společného základu. Typický kultivační protokol kvasinky Pichia pastoris se skládá ze tří fází. Prvním krokem je vsádková kultivace na glycerolu, během níž dochází k nárůstu biomasy, ale exprese vloženého genu je potlačena v důsledku represivního efektu glycerolu. Po jejím ukončení následuje fáze, kdy je do bioreaktoru přítokováno glycerolové médium, cílem je získání husté kultury produkčního kmene, která dosahuje často více než 100 g/l. Poslední fází procesu je fáze produkční, kdy je do bioreaktoru přiváděno médium obsahující jako jediný zdroj uhlíku a energie methanol. Tím dochází k indukci exprese vloženého genu a produkci rekombinantního proteinu za současného dalšího nárůstu biomasy (Crowley a kol., 2003). Rostoucí zájem o kvasinkové expresní systémy souvisí se zvyšující se poptávkou po ekonomicky efektivní výrobě terapeutických proteinů. V dnešní době vlastní více než 160 biotechnologických a farmaceutických společností licenční právo na expresní systém Pichia pastoris a více než 500 rekombinantních proteinů je tímto expresním systémem již produkováno. Žádný z těchto produktů ale není zatím vyráběn průmyslově, ačkoli několik z nich v současnosti prochází klinickými testy (Cregg, 1999).

- 26 -

Literatura: Cereghino J.L., Cregg J.M. (2000). Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Mikrob. Rev. 24, 45-66 Cos O., Serrano A., Montesinos J.L., Ferrer P., Cregg J., Valero F. (2004). Combined effect of the methanol utilization (Mut) phenotype and gene dosage on recombinant protein production in Pichia pastoris fed-batch cultures. J. Biotechnik. 116, 321-335 Cregg J.M. (1999). Academic Press

Gene expression systems: using nature for the art of expression.

Crowley J., Arnold S.A., Wood N., Harvey L.M., McNeil B. (2003). Monitoring a high cell density recombinant Pichia pastoris fed-batch bioprocess using transmission and reflectance near infrared spectroscopy. Enz. Microb. Tech. 36, 621-628 Faber K.N., Harder W., Ab G., Veenuis M. (1995). Review:methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins. Yeast 11, 1331-1344 Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B. a Harvey L.M. (2005). Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression systém. Yeast, 22, 249-270 Rosenfield S.A., Nadeau D., Tirado J. (1999). Production and purification of recombinant hirudin expressed in te methylotrophic yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol. 306, 154-169 Veenhuis M., van Dijken J.P, Nardet W. a Fischer A. (1980). The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeast. Adv. Mikrob. Physiol. 24, 1-82

- 27 -

ZHODNOCENÍ MOŽNOSTÍ GENETICKÝCH TRANSFORMACÍ U LESNÍCH DŘEVIN Máchová Pavlína, Malá Jana Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti ,v.v.i., Strnady 136, 252 02 Jíloviště

Lesní dřeviny mají specifické vlastnosti, mimo jiné je pro ně charakteristická dlouhověkost a pozdní nástup plodnosti, což jsou hlavní důvody proč klasické metody šlechtění jsou pomalé. Pro rychlejší dosažení požadovaných vlastností je jedinou možností využití metod genetického inženýrství. Užití geneticky modifikovaných dřevin by v blízké budoucnosti mohlo výrazně přispět ke snížení zátěže životního prostředí. Geneticky ustavená rezistence vůči mikrobiálním patogenům, hmyzím a dalším škůdcům by podstatně omezila aplikaci pesticidů a insekticidů, které se zařazují do potravních řetězů a tak negativně ovlivňují rovnováhu biocenózy. Navíc odborníci předpokládají, že v příštích desetiletích silně vzroste poptávka po lesních dřevinách, a to z celé řady důvodů: výroba papíru a celulózy, výroba nábytku, atd., ale i pro ekologické potřeby znovuzalesňování a přelesňování monokultur. Nadějné jsou i směry zaměřené na změnu morfologie stromů a jejich částí, změny dormance (McAffee et al. 1993, Tuominen et al. 1995, Fladung et al. 1997) a kvalitu dřeva (přehled Whetten et al. 1998, Dwivedi et al. 1994, Feuillet et al. 1995, MacKay et al. 1997). V každém případě je zde požadavek na velký počet vyšlechtěných, rychle rostoucích stromů se zkrácenou vegetační dobou, se schopností akceptovat nová klimata i extrémní změny prostředí (včetně jeho znečistění), případně se schopností přímé fixace vzdušného dusíku a zlepšení schopností fytoremediace (Stomp 1994). Hlavní překážkou genových manipulací u dřevin je jejich nízká regenerační schopnost. Výčet dřevin úspěšně modifikovaných metodami genového inženýrství je proto stále ještě omezen na snadno regenerovatelné druhy listnatých stromů jako jsou topol, osika, bříza, a třešeň. Pro další druhy dřevin nejsou dosažitelné spolehlivé multiplikační techniky a jejich vypracování a standardizace jsou časově náročné. Navíc je lze pak často aplikovat jen na úzký okruh responzívních genotypů. Ze šlechtitelského hlediska je třeba, aby rostlinný materiál určený pro transformace také splňoval řadu kriterií, která ne vždy korespondují s

- 28 -

optimální regenerační schopností in vitro. Jistou výjimkou jsou transformace, kdy není třeba regenerovat kompletní jedince (produkce sekundárních metabolitů kulturami buněk a vlásčitých kořenů, indukce tvorby kořenů na stonkových řízcích). Dalším limitujícím faktorem je, že neexistuje univerzální metoda transformace, která by byla použitelná pro širší druhové

spektrum

dřevin.

Nejčastěji

užívané

postupy

nepřímého

přenosu

genů

prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium jsou aplikovatelné tehdy, patří-li daný rostlinný objekt do jejich hostitelského spektra. Některé objekty, jako jehličnany, však vstupují do efektivního kontaktu s těmito vektorovými bakteriemi jen v omezené míře. Navíc mohou obsahovat látky, jako např. terpeny, které působí baktericidně případně účinně potlačují růst bakterií (Aronen a Haggman 1995). Jistou nevýhodou je také poměrně úzký okruh selektovatelných znaků dosud užívaných při in vitro selekci ke

zvýhodnění transgenních buněk a jedinců oproti

netransformovaným. U dřevin je až na malé výjimky využíváno rezistence k antibiotiku kanamycinu podmíněné genem NPTII, jež je v těsné vazbě s přenášeným genem. Jak se ukázalo i u řady dalších materiálů, ne vždy je využití tohoto znaku dostatečně efektivní či možné. V případě signálních genů je v mnoha studiích s výhodou využíváno genu uidA pro bakteriální β - galakturonidázu (GUS), jehož exprese je i u dřevin spolehlivě prokazatelná jak histochemicky, tak biochemicky (Brasileiro et al. 1991, Hollick a Gordon 1993, Clarke 1994, Kajita et al. 1994, Tzfira et al. 1997). Značné naděje jsou vkládány do možnosti využití genu pro zeleně fluoreskující protein (GFP). Výhodou by byla neinvazívnost metody, založené na detekci zeleného světla emitovaného po ozáření objektu světlem o specifické vlnové délce 470 - 480 nm. Obdobně jako u jiných objektů byla i u dřevin ověřována celá škála transformačních postupů zahrnujících jak přímé tak nepřímé metody (viz přehled Jouanin et al. 1993). Nejjednodušší aplikace jsou zaměřeny na prostou indukci kořenotvorby na stonkových řízcích pomocí A. rhizogenes (McAfee et al. 1993). Ojediněle, jako např. u akátu bylo možné z vlásčitých kořenů „hairy roots“ regenerovat celé transgenní jedince, kteří měly typický fenotyp s nadměrným kořenovým systémem a zkroucenými listy (Han et al. 1993). Původní metoda vpichů bakteriální suspenze do stonků intaktních rostlin sice prokázala její použitelnost jak pro krytosemenné tak i nahosemenné dřeviny, její účinnost je však ovlivněna nejen druhem hostitelské rostliny, ale i použitým bakteriálním kmenem (Aronen a Haggman 1995). Značný vliv na účinnost transformace má zřejmě i stáří a fyziologický stav výchozího materiálu (Charest et al. 1992). Proto mnohé novější postupy využívají k danému účelu - 29 -

asepticky vypěstované rostliny a jejich části (Selmer a McCown 1989, Hajela et al. 1993). Nespornou výhodou tohoto přístupu je dobrá definovatelnost kultivačních podmínek a v důsledku toho i lepší reprodukovatelnost výsledků. Vzhledem k některým nežádoucím efektům genů lokalizovaných v původní neupravené T- DNA (Fladung et al. 1997) jsou v posledních letech používány tzv. odzbrojené vektory zbavené původních bakteriálních genů (Kajita et al. 1994). V současné době jsou poměrně nejlépe rozpracovány nepřímé metody transformace listnatých dřevin (Fenning a Gartland 1995). Naproti tomu přímé metody transformace dřevin jsou stále ještě v stadiu úvodních experimentů. Byla například ověřována technika nastřelování mikroprojektilů s izolovanou DNA do jader buněk suspenzních a kalusových kultur borovice (Aronen et al. 1994). Autoři na základě získaných výsledků předpokládají, že tímto způsobem bude možné nejen získat celé transgenní jedince, ale i využívat biolistickou techniku ke studiu regulace exprese vnášených genů. Že tyto úvahy jsou oprávněné, je patrné z obdobných experimentů u papáji, kde Mahon et al. (1996) prokázali Southernovou hybridizací přítomnost modelových genů pro NPTII a GUS v DNA jedinců regenerovaných ze zygotických i somatických embryí, do kterých byla cizí DNA vpravena pomocí mikroprojektilů. Zkušenosti s transgenními organizmy ukázaly, že jedním ze základních problémů je zabezpečit adekvátní, přesně časově ohraničenou a prostorově lokalizovanou expresi vnesených genů. Z tohoto důvodu je i u dřevin věnována této problematice mimořádná pozornost. Systematický výzkum je směrován hned do několika oblastí: na hledání vhodných promotorů a to jak z cizích objektů tak i vlastního organizmu, studium lokalizace, dynamiky a stability jejich exprese, studium dalších faktorů podílejících se na regulaci exprese vnášených genů, ale i nezbytných úprav těchto genů k zabezpečení dostatečné stability genového produktu, jeho optimálního účinku a směrování na vhodné místo v buňce i organizmu. Ukazuje se, že jde o značně komplexní procesy, kde predikce efektu promotoru i genového produktu je velmi obtížná. Značnou nevýhodou oproti jiným rostlinám jsou i velmi omezené znalosti o vazebných skupinách, lokalizaci genů dřevin a jejich sekvenčních charakteristikách, jakož i regulačních mechanizmech genové exprese, což vedle celé řady technických problémů vyplývajících ze specifiky materiálu, zpomaluje rozvoj genových manipulací u dřevin. Na druhé straně zkušenosti a podrobné znalosti organizace a funkčních charakteristik genomu jiných rostlin spolu s využíváním molekulárně biologických technik výrazně přispívají k pokroku v dané oblasti. V posledních letech se stále větší množství prací zabývá problematikou izolace a charakterizace takových genů dřevin, u kterých lze očekávat možný přínos pro šlechtění a genové manipulace. Jedná se například o geny základního metabolizmu - 30 -

- nitrát- a nitritreduktázy, glutathionreduktázy (Foyer 1995), sekundárního metabolizmu: syntézy ligninu - alkoholoxidoreduktázy, např. dehydrogenáza skořicového alkoholu (CAD), O - metyltransferáza (Feuillet et al. 1995, MacKay et al. 1997, Roth et al. 1997), podílející se na

obranných

reakcích

rostlin

vůči

patogenům:

chitinázy,

inhibitory

proteáz,

monoterpensyntázy apod. (Clarke 1994, Hollick a Gordon 1993, Allona et al. 1996, Bohlmann et al. 1997, Wu et al. 1997). Mezi konkrétní úspěchy genového inženýrství u dřevin je zavedení genu pro β endotoxin z Bacillus thuringiensis (Tian 1993, Robinson et al. 1994) do topolu. Transgenní rostliny byly v menší míře poškozeny bekyní velkohlavou (Lymantria dispar (L.)) a bourovcem (Malacosoma distria Hübner), zvýšená byla rovněž mortalita larev bourovce vystavených účinku β - endotoxinu z takto pozměněných rostlin (Robinson et al. 1994). Rozpracovávány jsou i další strategie boje s hmyzími škůdci, ale také houbovými patogeny jako přenos genů pro chitinázy, lektiny, sekvence bakulovirů apod. (Strauss et al. 1995, 1997). Za schůdnou cestu je rovněž považován přenos genů kódujících inhibitory proteáz (Klopfenstein et al. 1993). Předpokládá se však, že určité části hmyzích populací by mohly v poměrně krátké době překonat takto navozenou rezistenci. Jistou perspektivu skýtají i práce zaměřené na zvýšení odolnosti dřevin vůči virovým onemocněním. Jednou z nejběžnějších strategií, která byla s úspěchem realizována u řady zemědělských plodin a okrasných rostlin, je omezení reprodukce virů na základě konstitutivní tvorby bílkovin virového obalu v buňkách transgenních jedinců. Neúplné kopie nukleové kyseliny viru jsou pak předčasně začleňovány do bílkovin kapsidy, čímž dochází k snižování koncentrace efektivních virových částic v buňce a oddálení nástupu infekce rostlin. Tyto postupy byly zatím ověřovány u některých ovocných dřevin (např. papája, meruňka). Vedle transgenních rostlin vykazujících různý stupeň rezistence, byli nalezeni i jedinci zcela odolní k danému typu viru (Fitch et al. 1992). V mnoha laboratořích jsou již delší dobu rozpracovány systémy zaměřené na získání rostlin tolerujících pesticidy. Takové práce byly úspěšné např. při přenosu bakteriálního genu bar kódujícího rezistenci k herbicidu Basta do osiky (Devillard 1992). U dřevin již byly také rozpracovány progresivní techniky genetických transformací, např. potlačení funkce genu a jeho produktu na základě kosuprese a protismyslové DNA (Dwivedi et al. 1994, Baucher et al. 1996). Jde zejména o práce zaměřené na snížení obsahu ligninu

v

dřevní

surovině

určené

pro

výrobu

celulózy

a

papíru.

Manipulace

s transponovatelnými genetickými elementy by mohly mít značný význam pro mapování genomů nebo cílenou mutagenezi (Fladung a Ahuja 1997). Velmi slibné je využití - 31 -

genetických transformací u některých rychle rostoucích lesních dřevin pro zvýšení jejich schopnosti detoxikovat imisemi zatížené půdy (fytoremediace) (Baker a Brooks 1989, Chung a Chu 1990, Ernst et al. 1992).

Literatura: Allona, I., Collada, C., Casado, R., PazAres, J., Aragoncillo, C. (1996): Bacterial expression of an active class Ib chitinase from Castanea sativa cotyledons.- Plant Mol. Biol. 32(6): 1171-1176. Aronen, T., Häggman, H. (1995): Differences in Agrobacterium infections in silver birch and Scots pine. Europ. J. For. Pathol. 25: 197213. Aronen, T., Häggman, H., Hohtola, A. (1994): Transient β-glucuronidase expression in Scots pine tissues derived from mature trees. Canadian Journal of Forest Research. 24: 2006-2011. Baker, A. J. M., Brooks, R. R. (1989): Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements – A review of their distribution, ecology and phytochemisty. Biorecovery 1: 81-126. Baucher, M., Chabbert, B., Pilate, G., VanDoorsselaere, J., Tollier, M.T., PetitConil, M., Cornu, D., Monties, B., VanMontagu, M., Inze, D., Jouanin, L., Boerjan, W. (1996): Red xylem and higher lignin extractability by down-regulating a cinnamyl alcohol dehydrogenase in poplar.- Plant Physiol. 112(4): 1479-1490. Bohlmann, J., Steele, C.L., Croteau, R. (1997): Monoterpene synthases from grand fir (Abies grandis). cDNA isolation, characterization, and functional expression of myrcene synthase, (-)-(4S)-limonene synthase, and (-)-(1S,5S)-pinene synthase.- J. Biol. Chem. 272(35): 21784-21792. Brasileiro, A.C., Leple, J.C., Muzzin, J., Ounnoughi, D., Michelm M.F., Jouanin, L. (1991): An alternative approach for gene transfer in trees using wild-type Agrobacterium strains.Plant Mol. Biol. 17(3): 441-452. Clarke, H.R. (1994): Wound-induced and developmental activation of a poplar tree chitinase gene promoter in transgenic tobacco.- Plant Mol. Biol. 25(5): 799-815. Devillard, Ch. (1992): Transformation in vitro du tremble (Populus tremula x Populus alba) par Agrobacterium rhizogenes et régénération de plantes tolérantes au basta.- C.R. Acad. Sci. Paris, Sér. III. 314: 291-298. Dwivedi, U.N., Campbell ,W.H., Yu, J., Datla, R.S., Bugos, R.C., Chiang, V.L., Podila, G.K. (1994): Modification of lignin biosynthesis in transgenic Nicotiana through expression of an antisense O-methyltransferase gene from Populus.- Plant Mol. Biol. 26(1): 61-71.

- 32 -

Ernst, W. H. O., Verkleij, J. C. A., Schat, H. (1992): Metal tolerance in plants. Acta Bot. Neerl. 41: 229-248. Fenning, T.M., Gartland, K.M. (1995): Transformation protocols for broadleaved trees.- Methods Mol. Biol. 44: 149-165. Feuillet, C., Lauvergeat, V., Deswarte, C., Pilate, G., Boudet, A., Grima-Pettenati, J. (1995): Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants.- Plant Mol. Biol. 27(4): 651-667. Fitch, M. M. M., Manshardt, R. M., Gonsalves, D., Slightom, J. L., Sanford, J. C. (1992): Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Bio/Technology 10: 1466-1472. Fladung, M., Ahuja, M.R. (1997): Excision of the maize transposable element Ac in periclinal chimeric leaves of 35S-Ac- rolC transgenic aspen-Populus. - Plant Mol. Biol. 33(6): 1097-1103. Fladung, M., Grossmann, K., Ahuja, M.R. (1997): Alterations in hormonal and developmental characteristics in transgenic Populus conditioned by the rolC gene from Agrobacterium rhizogenes. - J. Plant Physiol. 150(4): 420-427. Foyer, C.H. (1995): Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. Plant Physiol. 109(3): 1047-1057. Hajela, R.K., Hajela, N., Bolyard, M.G., Barnes, W.M., Sticklen, M.B. (1993): A simple transformation system using adventitious shoot multiplication of juneberry.- HortScience 28(4): 330-332. Han, K.-H., Keathley, D. E., Gordon, M. P. (1993): Cambial tissue culture and subsequent shoot regeneration from mature black locust (Robinia peudoacacia L.). Plant Cell Rep. 12 (4): 185-189. Hollick, J.B., Gordon, M.P. (1993): A poplar tree proteinase inhibitor-like gene promoter is responsive to wounding in transgenic tobacco. Plant Mol. Biol. 22(4): 561-572. Charest, P. J., Stewart, D., Budicky, P. L. (1992): Root induction in hybrid poplar by Agrobacterium genetic transformation. Can. J. For. Res. 22: 18321837. Chung, K. H., Chu, Y. W. (1990): Variation in aluminum tolerance among 5 species of in vitro cultured Populus. Journal of the Korean Forestry Society. 79: 26-32. Jouanin, L., Brasiliero, A. C. M., Leple, J. C., Pilate, G., Cornu, D. (1993): Genetic transformation: a short review of methods and their applications, result and perspectives for forest trees. Ann Sci For 50: 325-336. Kajita, S., Osakabe K., Katayama, Y., Kawai, S., Matsumoto, Y., Hata, K., Morohoshi, N. (1994):

- 33 -

Agrobacterium - mediated transformation of poplar using a disarmed binary vector and the overexpresion of a specific member of a family of a poplar peroxidase genes in transgenic poplar cell. Plant Sci. 103: 231-239. Klopfenstein, N. B., McNabb, H. S., Jr., Hart, E. R., Hall, R. B., Hanna, R. D., Heuchelin, S. A., Allen, K., Shi, N. Q., Thornburg, R. W. (1993): Transformation of Populus hybrid to study and improve pest resistence. Silvae Genetica 42: 86-90. McAfee, B. J., White, E. E., Pelcher, L. E., Lapp (1993): Root induction in pine (Pinus) and larch (Larix) spp. using Agrobacterium rhizogenes. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 34: 53-62. MacKay, J.J., O'Malley, D.M., Presnell, T., Booker, F.L., Campbell, M.M., Whetten, R.W., Sederoff, R.R. (1997): Inheritance, gene expression, and lignin characterization in a mutant pine deficient in cinnamyl alcohol dehydrogenase. - Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94(15): 8255-8260. Mahon, R.E., Bateson, M.F., Chamberlain, D.A., Higgins, C.M., Drew, R.A., Dale, J.L. (1996): Transformation of an Australian Variety of Carica papaya using microprojectile bombardment. - Aust. J. Plant Physiol. 23(6): 679-685. Robinson, D. J., McCown, B. H., Raffa, K. F. (1994): Responses of gypsy moth and forest tent caterpillar to transgenic poplar containing a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin gen. Environ. Entomol. 23: 1030-1041. Roth, R., Boudet, A.M., Pont-Lezica, R. (1997): Lignification and cinnamyl alcohol dehydrogenase activity in developing stems of tomato and poplar: a spatial and kinetic study through tissue printing.- J. Exp. Bot. 48(307): 247-254. Selmer, J.C., McCown, B.H. (1989): Transformation in Populus spp.- In: Bajaj, Y.P.S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry 9, Plant protoplasts and Genetic Engineering II. Pp. 155-172. Springer - Verlag, Berlin, Heidelberg. Stomp, A.M. (1994 ): Genetic strategies for enhancing phytoremediation. - Ann. N Y Acad. Sci. 721: 481-491. Strauss, S. H., Rottmann, W. H., Brunner, A. M., Sheppard, L. A. (1995): Genetic engineering of reproductice sterility in forest trees. Mol.Breed. 1: 5-26 Strauss, S.H., Knowe, S.A., Jenkins, J. (1997): Benefits and risks of transgenic. - J. Forestry 95(5): 12-19. Tian, Y. (1993): Insect tolerance of transgenic Populus nigra plants transformed with Bacillus thuringiensis toxin gene. - Chin. J. Biotechnol. 9(4): 219-227. Tuominen, H., Sitbon, F., Jacobsson, C., Sandgerg G., Olsson, O., Sundberg, B. (1995): Altered growth and wood characteristics in transgenic hybrid aspen expressing Agrobacterium tumefaciens T-DNA indolacetic acid – biosynthetic genes. Plant Physiol 109: 1179-1189. Tzfira, T., Jensen, C.S., Vainstein, A., Altman, A. (1997): Transformation and regeneration of transgenic aspen plants via shoot formation from stem explants. Physiol. Plant. 99(4): 554-561. Whetten, R. W., MacKay, J. J., Sederoff, R. R. (1998):

- 34 -

Recent advances in understanding lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 585-609. Wu, H., Echt, C.S., Popp, M.P., Davis, J.M. (1997): Molecular cloning, structure and expression of an elicitor-inducible chitinase gene from pine trees. - Plant Mol. Biol. 33(6): 979-987.

- 35 -

TRANSGENNÍ ROSTLINY, PŘÍPRAVA A JEJICH VYUŽITÍ PRO OCHRANU ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ Novaková M.1,2, Macková M.1,2, Demnerová K.1, Sylvestre M.3, Macek T.2,1 1

Vysoká škola chemicko-technologická, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 16628, Praha, CZ, 2 Ústav organické chemie a biochemie AVČR, Oddělení přírodních látek, Flemingovo nam. 2, 16610, Praha, CZ 3 Institute national de la recherche scientifique-Quebec, Pointe-Claire, H9R 1G6, Quebec, Canada e.mail: [email protected]

ÚVOD S rostoucím počtem obyvatel stoupají i nároky na množství potravin a pěstování kulturních plodin (Macek a kol., 2008). Velmi úzce však s tímto problémem souvisí množství polí, zemin, které jsou v důsledku lidských aktivit kontaminovány organickými i anorganickými polutanty. Snaha o jejich odstranění, popř. zabránění další kontaminace vedla k přípravě mnoha geneticky modifikovaných rostlin. Jednou z možností využití transgenních rostlin pro ochranu životního prostředí je tedy zabránění kontaminace. V případech pěstování plodin pro výživu obyvatel je často nutno použít velké množství pesticidů a herbicidů, což může být eliminováno použitím geneticky modifikovaných plodin (Bt-kukuřice, Roundup Ready soya). Problematiku využití transgenních rostlin pro ochranu životního prostředí velmi dobře popisuje článek Macek a kol. (2008), ve kterém se autoři mimo jiné zmiňují o připravených transgenních rostlinách tabáku s transgenem pro acyl-CoA-delta11-(Z)-desaturasu (Nesnerova a kol., 2004). Tento enzym zajišťuje produkci feromonů v samičkách hmyzu. Jeho přítomnost a emise z transgenních rostlin klame samečky a rozmnožování nežádoucího škůdce je sníženo. Přenos výše uvedeného genu do vybraných rostlin by tak mohl snížit množství pesticidů používaných k ochraně zemědělských kultur a zabránit tak další kontaminaci životního prostředí. Dalším ze způsobů ochrany životního prostředí s použitím transgenních rostlin je jejich aplikace v oblasti fytoremediace. V současnosti je uplatňována snaha genetickými manipulacemi získat rostliny upravené na míru požadavkům fytoremediace (Rugh a kol., 1998; French a kol., 1999; Macek a kol., 2002; Frančová a kol., 2003; Surá a kol., 2005; Krämer, 2005). Do rostlin se za účelem zlepšení jejich fytoremediačních vlastností vnášejí bakteriální, kvasinkové a savčí geny nebo se zvyšuje exprese již přítomných rostlinných genů. Exprese těchto genů by měla zajistit zvýšení účinnosti přirozených metabolických drah a schopností

rostlin.

Většina

připravených

transgenních

rostlin

pro

fytoremediace

anorganických polutantů je založena na znalostech mechanismů akumulace těžkých kovů, - 36 -

tozn. přenos těžkých kovů přes membránu nebo z kořenů do nadzemních částí rostliny, jejich chelatace v cytosolu s fytochelatiny, metallothioneiny, glutathionem a následné uskladnění ve vakuole. Byly připraveny transgenní rostliny exprimující řadu proteinů: metallothioneiny; enzymy katalyzující tvorbu fytochelatinů; enzymy redukující rtuťnaté sloučeniny na méně toxickou elementární rtuť; membránové přenašeče. V případě transgenních rostlin pro fytoremediace organických polutantů jsou strategie klonování založeny na dobře prostudovaných bakteriálních degradačních drahách jednotlivých polutantů. Do rostlin tak byly vneseny geny pro monooxygenasy, dioxygenasy, reduktasy aj. Připravené transgenní rostliny tak získají schopnost organický polutant částečně degradovat, v nejlepším případě až mineralizovat. Použití geneticky modifikovaných rostlin pro fytoremediace prozatím nebylo realizováno v praxi v širším měřítku, přesto je však známo několik úspěšných příkladů, které prokázaly vyšší účinnost akumulace anorganických látek, degradace organických látek nebo i vyšší rezistenci nových transgenních rostlinných druhů k různým polutantům a některé z nich jsou již uváděny do životního prostředí. PŘÍPRAVA TRANSGENNÍCH ROSTLIN S GENY TODC1C2 V naší laboratoři se zabýváme přípravou geneticky modifikovaných rostlin s vyšší účinností a schopností degradovat organické polutanty (aromáty, toluen). Pro účel přípravy transgenních rostlin se schopností degradovat organické polutanty byly vybrány geny todC1C2.

Geny

todC1C2

kódují

podjednotky

terminální

dioxygenasy

ISPTOL

multikomponentního enzymu toluendioxygenasy, který katalysuje oxygenaci toluenu a jiných organických sloučenin. Celý multienzymový komplex obsahuje podjednotky ISPTOL, feredoxinTOL a ferredoxinreduktasuTOL. Jak je na obrázku 1 znázorněno, gen todA kóduje flavoprotein, ferredoxinreduktasu, který přijímá elektrony z NADH, přenáší je malému Fe-S proteinu, ferredoxinu (kódovaný genem todB), a ten poté redukuje terminální oxygenasu ISPTOL (velký Fe-S protein), která katalysuje oxidaci toluenu na (1S,2R)-3-methylcyklohexa3,5-dien-1,2-diol (Zylstra a kol., 1988).

- 37 -

Obr. 1: Oxidace toluenu multienzymovým komplexem toluendioxygenasou todA – gen kódující ferredoxinreduktasu, todB – gen kódující ferredoxin, todC1C2 – geny kódující podjednotky oxygenasy ISPTOL Toluendioxygenasa je enzym se širokou substrátovou specifitou, popsáno bylo již přes 60 substrátů, mezi něž patří také bifenyl, trichloroethylen, 2,3-dichloro-1-propen aj. Protože již dříve byla prokázána přítomnost ferredoxinreduktas i ferredoxinů v rostlinném organismu, pro klonování byly vybrány pouze geny todC1C2. Rostliny, které byly vybrány pro transformaci geny todC1C2 jsou tabák (Nicotina tabacum) a len (Linum usitatissimum). Tabák je všeobecně využívaný model pro genetické manipulace, v podmínkách podnebí České republiky je jeho růst však omezen. Proto byla jako druhá rostlina vybrán také len, technická plodina, která se v podmínkách České republiky snadno pěstuje, a u něhož se předpokládá širší využití jak z hlediska bioremediací, tak následného použití. Nutno také dodat, že transgenní rostliny obsahující geny todC1C2 lze využít kromě fytoremediací k účelům přípravy produktů pro syntézy, popř. pro biotransformace. VÝSLEDKY Jako příprava pro klonování bylo nutno nejdříve zjistit aktivitu bakteriální dioxygenasy ISPTOL v rostlinném extraktu, která byla prokázána se substrátem bifenylem. Poté byly připraveny dva rostlinné vektory s využitím plasmidu pGreen0029 (Hellens a kol., 2000), z nichž jeden obsahoval gen todC1 s histidinovou kotvou a druhý gen todC2, oba geny pod kontrolou CaMV 35S promotoru. Tyto plasmidy byly vneseny do bakterie Agrobacterium C58C1. Následovalo studium exprese oxygenasy ISPTOL v rostlinném organismu pomocí agrobakteriální infiltrace rostlin metodou transientní exprese (Kapila a kol., 1997). Pomocí metody transientní exprese lze získat informace o možnosti exprese daného proteinu již za tři

- 38 -

dny. Jako modelová rostlina zde byla použita Nicotiana benthamiana (Mohammadi a kol., 2007). Exprimovaná oxygenasa ISPTOL byla poté detekována na elektroforese SDS-PAGE a také imunochemicky metodou Western blot za použití komerční protilátky proti histidinové kotvě. Aktivita oxygenasy ISP byla studována za použití bifenylu jako subtrátu, avšak její aktivita potvrzena nebyla. Pro účely trvalé transformace rostlin byl připraven jeden rostlinný vektor pGreen, který obsahoval oba geny todC1/His i todC2, oba v samostatných kazetách (pGreen/HistodC1/todC2). Tyto geny byly nejprve sekvenovány, přičemž uvnitř genu todC1 byla nalezena mutace kodonu ATG (Met101 na Thr). Tato mutace mohla být důvodem neúspěšného pokusu ověřování aktivity enzymu po transientní expresi v rostlinách. Důvod ztráty aktivity mutovaného enzymu jsme zkoumali po cílené mutagenezi genu todC1 v bakteriích, dioxygenasa ISPTOL (Thr101) byla exprimována v bakteriálních buňkách. Protože tato mutace byla detekována v Rieske centru enzymu, bylo porovnáváno množství železa v nemutované a mutované formě, soudržnost podjednotek i poměr absorbance Rieske centra ke koncentraci stanoveného proteinu. Výsledky poukázaly na důležitost přítomného Met101, který je zřejmě zahrnut v elektronovém transportu během katalysované reakce. Proto byla provedena v připraveném rostlinném vektoru pGreen/HistodC1/todC2 zpětná cílená mutageneze genu todC1. Možnost exprese a aktivita enzymu ISPTOL byla ověřována transientní expresí v Nicotiana tabacum. Poděkování: Tento projekt je podporován grantem MSMT Centrum 1M06030 a MSMT OC117-Cost859. Literatura: Frančová K., Surá M., Macek T., Szekeres M., Bancos S., Demnerová K.: Generation of plants carrying bacterial enzyme for degradation of polychlorinated biphenyls. Fresenius Environ Bull 12, 309–313 (2003). French C. E., Rosser S. J., Davies G. J., Nicklin S., Bruce N. C.: Biodegradation of explosives by transgenic plants expressing pentaerythriol tetranitranitrate reductase. Plant Physiol 17, 491-494 (1999). Hellens R. P., Edwards E. A., Leyland N. R., Bean S., Mullineaux P. M.: pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant 42, 819-832 (2000). Kapila J., De Rycke R., Van Montagu M., Angenon G.: An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci 122, 101-108 (1997). Krämer U.: Phytoremediation: novel approaches to cleaning up polluted soils. Curr Opin Biotechnol 16, 133-141 (2005).

- 39 -

Macek T., Macková M., Kučerová P., Chromá L., Burkhard J., Demnerová K.: Phytoremediation. V knize: Biotechnology for the Environment: Soil Remediation (Agathos S.N., Reineke W., Eds.), Brussels, Belgium, Kluwer Academic Publishers, 115–137 (2002). Macek T., Kotrba P., Svatos A., Novakova M., Demnerova K., Mackova M.: Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol 26 (3), 146-152 (2008). Mohammadi M., Chalavi V., Novakova - Sura M., Laliberte J. F., Sylvestre M.: Expression of bacterial biphenyl-chlorobiphenyl dioxygenase genes in tobacco plants. Biotechnol Bioeng 97 (3), 496-505 (2007). Nesnerova P., Sebek P., Macek T., Svatos A.: First semi-synthetic preparation of sex pheromones. Green Chem 6, 305-307 (2004). Rugh C. L., Senecoff J. F., Meagher R. B., Merkle S. A.: Development of transgenic yellow poplar for mercury phytoremediation. Nat Biotechnol 16, 925–928 (1998). Surá M., Macková M., Szekeres M., Sylvestre M., Chrastilová Z., Macek T.: Transgenní rostliny pro zvýšenou účinnost fytoremediace PCB a toluenu. Chem Listy 99, 387388 (2005). Zylstra G. J., McCombie W. R., Gibson D. T., Finette B. A.: Toluene degradation by Pseudomonas putida F1: genetic organization of the tod operon, Appl Environment Microbiol, 1498-1503 (1988).

- 40 -