CONCURRERENDE ADSORPTIE VAN PLASMA EIWITTEN AAN VAST/VU)EISTOF GRENSVLAKKEN
prof. dr. C.A. Smolders prof. dr. J. Feijen prof. dr. ir. P. Bergveld : Assistent-piornotor: dr. D, Bargeman
Promotoren,:
,
CONCURRERENDE ADSORPTIE VAN PLASMA EIWITTEN AAN VASTlVLOEtSTOF GRENSVLAKKÉN
PROEFSCHRIFT ter verkrijging van de graad van doctor in de technische wetenschappen aan de Technische Hogeschool Twente, op gezag van de rector magnificus, Prof. ir. W. Draijer, volgens besluit van het College van Dekanen in het openbaar t e verdedigen op 22 maart 1985t e 16.00 uur
door Henricus Gerardus Wilhelmus Lensen IJ
geboren op 4 3 mei 1952 t e 's-Hertogenbosch
aan Jan, Tom, Mariëtte en Jettie
WOORD VOORAF d i t proefschrift w i l i k eenieder
B i j d e v o l t o o i i n gv a n
d a n k e n d i e e e nb i j d r a g eh e e f tg e l e v e r da a n
de totstandko,ming
ervan.
w i l i k i nh e tb i j z o n d e rv e r n o e m e n :
E e na a n t a lp e r s o n e n
h e t o n d e r z o e kh e b
Vanwege h e t m u l t i d i s c i p l i n a i r e k a r a k t e r v a n i k g e b r u i k mogenmakenvan
d e k e n n i se nh e ti n z i c h tv a nm a a r
l i e f s t d r i e p r o m o t o r e ne ne e na s s i s t e n t p r o m o t o r . S m o l d e r s ,J a nF e i j e n ,
P i e t B e r g v e l de n
Cees
D i c k B a r g e m a n ;b e d a n k t
v o o rj u l l i eb i j d r a g e n . i k g e n o t e no p , h e tz i e k . e n -
E e no n g e k e n d eg a s t v r i j h e i dh e b h u i s " D eS t a d s m a t e n "
t e E n s c h e d e b i j F r e d O l t h u i s( k l i n i s c h
c h e m i c u s ) ,P a u lK r ü g e r sD a g n e a u x( a p o t h e k e r ) ,J a nK l e i n Elhorst,
Ook b i j Akzo C o r p o r a t eR e s e a r c h teveel.
Walle.
TonnyKnuifenMarianneZomer-v.d.
t e Arnhemwas
niets
Rob Zsom s c h o n k d e p o l y s t y r e e n l a t i c e s e n o p h e t A K Z O z i j nm i j ng e l a b e l d ee i w i t t e n
a n a l y t i s c hl a b o r a t o r i u mv a n
( A b B u y t e n h u i se n, G e r a r dH o e n s e l a a r ) .
g r a t i sg e k a r a k t e r i s e e r d
H o o f d s t u k V v a n d i t p r o e f s c h r i f th a dn o o i tg e s c h r e v e n d e m e d e w e r k i n g ' v a n W i m Breemhaar,
k u n n e nw o r d e nz o n d e r
die
h i e r a a ne e na a n z i e n l i j k eb i j d r a g eh e e f tg e l e v e r d .
werk
a l s s t u d e n th e tn o d i g ee x p e r i m e n t e l e
J o h a nR o n n e rh e b b e n voor m i j v e r r i c h t . A n t o nS c h u p pe n
Corné Jägers en
Huub K l e i n B r e t e l e r ,
T o n yN e p l e n b r o e c k ,
De o m s l a ge n
d e f i g u r e nz i j ng e t e k e n d . d o o r
h e t t y p e w e r k i s s n e le ng o e dv e r z o r g dd o o r
t y p e b u r e a u SAS ( A l i e t Vos e n A s t r i d O u a a a j .
D e w e r k s f e e r i nE n s c h e d e Zowelop
h e b i k h e e l p l e z i e r i gg e v o n d e n .
d e a f d e l i n g e nC h e m i s c h eT e c h n o l o g i ee nE l e c t r o t e c h -
n i e k a l s h e tz i e k e n h u i s r e d e n e nw a a r d o o r
" D e' S t a d s m a t e n " .D a t
i k moeiteloos
(Nijmegen-Enschede
V.V.)
is é é nv a n
d e noodzakelijke 200.000
h e bk u n n e no v e r b r u g g e n .
de km
Ook h e t v a a k
p r e t t i g e r e i s g e z e l s c h a p h e e f t d a , a r t o eb i j g e d r a g e n . De l u n c h p a u z e s i n
d i s c u s s i e so v e r
d e mensa wer'den v e r a a n g e n a a m dd o o r
d e meest u i t e e n l o p e n d ez a k e n
H a n sW i j m a n s ,F r a n kA l t e n a ,J o h a nR o n n e r ,
met J a nH e e z e n ,
R i c k Bockhorst.en
P i e t e r d e Bock. J a nH e e z e n
w i l i k n o ge e n se x t r ab e d a n k e nv o o r
g a s t v r i j h e i d b i j hem t h u i s .
de genoten
INHOUD HOOFDSTUK I INLEIDING Algemeen
9
en'eiwitten 1.2 Grensvlakken
10
1.3 eiwitadsorptie Meetmethoden voor
14 18 20 22
1.1
1.4
De conformatie van eiwitmoleculen aan grensvlakken
1.5reversibiliteit De eiwitadsorptie van 1.6
Kinetiek mechanisme en van eiwitadsorptie
1.725 eiwitadsorptie Concurrerende 1.8
Doelstellingen proefschrift ditvan 27
Referenties
29
HOOFDSTUK I1 AFWIJKEND ADSORPTIEGEDRAG VAN EIWITTEN TEN GEVOLGE VAN HET GEBRUIK VAN LABELINGSTECHNIEKEN EN/OF VAN ONGEZUIVERD EIWIT
11.1 Inleiding
35
11.2 Experimenteel
36
11.3 Methoden en voorschriften
37
11.4 Resultaten
41
11.5 Discussie
50
Referenties
53
APPENDIX I1 A/B KARAKTERISERING
VAN
RUNDER
SERUM
ALBUMINE55
EN GELABELD RÙNDER SERUM ALBUMINE
HOOFDSTUK 111 D E REVERSIBILITEIT
6
VAN
EIWITADSORPTIE
AAN
POLYSTYREEN
111.1 Inleiding
61
111.2 Materialen en methoden
63
111.3 Resultaten
66
111.4 Discussie
7.4
Referenties
81
Sie
HOOFDSTUK IV HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFIE (HPLC) ALS METHODE
TER BESTUDERING VAN CONCURRERENDE ADSORPTIE VAN EIWITTEN IV. 1
Inleiding
83
IV.3
Resultaten
85 88
IV.4
Discussie
98
IV.5
Conclusie
100
methoden IV.2 en Materialen
10 1
Rederenties HOOFDSTUK V
EEN VERGELIJKENDE STUDIE VAN DE ADSORPTIE VAN MENSELIJK ALBUMINE AAN POLYSTYREEN EN POLYVINYL CHLORIDE
V. 1
103 104
Inleiding
V.2 .
Experimenteel
V.3
Adsorptiemethoden
d
104
V. 4 Resultaten
106
V. 5 Discussie
110
Referenties
114
HOOFDSTUK
VI
ADSORPTIE VAN PLASMA EIWITTEN AAN POLYSTYREEN LATEX VANUIT PLASMA VI. 1
Inleiding
methoden VI.2 enMaterialen VI.3
Resultaten
L
114 115
117
VI. 4
122
Referenties
126
HOOFDSTUK
VI1
TOEPASSING VAN CAPACITEITSMETINGEN TER BESTUDERING VAN DE ADSORPTIE VAN EIWITTEN E N PEPTIDEN A A N SILICIUM/SILICUMOXIDE ELECTRODEN
7
V11.I
Inleiding
127
VII.2
Methoden
128
VII.3
Experimenteel
131
VII.4
Resultaten
132
VII.5
Discussie
Referenties
136
138
SUMMARY
139
SAMENVATTING
141
CURRICULUM
143
VITAE
D
8
HOOFDSTUK I
INLEIDING 1.1.
Algemeen
In dit proefschrift wordt de adsorptie van eiwitten aan vast/vloeistof grensvlakken be'schreven. Over dit onderwerp zijn al veel publicaties v,erschenen. De kennis van eiwitadsorptie wordt onder andere toegepast in de levensmiddelenindustrie, cosmetische industrie en pharmaceutische industrie. Er bestaat vanuit verscheidene disciplines de behoefte aan meer inzicht in eiwitadsorptie. Zo
is de laatste jaren een toenemende interessevoor dit
onderwerp waarneembaar in de biomedische techniek. Dit komt vooral door de veelvuldige toepassing van lichaamsvreemde materialen in de geneeskunde. Te denken valt aa.n het gebruik van medische hulpmiddelen (catheter's, bloedzakken) en ,kunstorganen (kunstnieren en kunststof implantaten). Het materiaal waaruit deze hulpmiddelen en kunstorganen vervaardigd z'ijn dient bloedcompatibel te zijn. Wanneer lichaamsvreemd materiaal in contact komt met bloed, kan trombusvorming optreden ten gevolge van bloedplaatjesadhesie en activering van de intrinsieke stolling. Hierbij speelt de eiwitadsorptie een belangrijke rol. Zo blijkt dat bij oppervlakken waaraan albumine gepreadsorbeerd is, in contact met bloed de bloedplaatjesadhesie geringer is dan bij oppervlakken waaraan fibrinogeen gepreads'orbeerd is ( Z U C K E R en VROMAN, 1969).
Ondanks het grote aantal publicaties over adsorptie van plasma eiwitten aan polymere oppervlakken is hetbeeld tot n u toe nog niet consistent. Dit komt doordat eiwitadsorptie
een ingewikkeld proces is waarbij vele wisselwerkingen tussen adsorbens oppervlak en eiwitmoleculen een rol spelen en doordat hypothesen slechts moeilijk getoetst kunnen worden door de beperkingen van de onderzoekstechnieken.
9
i s s a m e n g e v a ti ne e n
D e l i t e r a t u u ro v e re i w i t a d s o r p t i e
a a n t a lo v e r z i c h t s a r t i k e l e n
(BRASH,
LYMAN,
1971: M A C R I T C H I E ,
1 9 2 8 ; VAN DER SCHEER, 1 9 7 9 ) . D i t H o o f d s t u kg e e f te e no v e r d e o n t w i k k e l i n g e n met b e t r e k k i n g t o t
z i c h tv a n
v a nm e n s e l i j ks e r u ma l b u m i n e (HPb)
e nm e n s e l i j k
(HSA),
m e n s e l i j kf k b r i n o g e e n
gamma g l o b u l i n e( H I g G )a a nv a s t / v l o e i s t o f
l a a t s t e 6 jaar.
g r e n s v l a k k e no v e rd e
d e r e a a n d a c h tb e s t e e da a n vlakken,
de adsorptie
H i e r b i jw o r d to n d e ra n -
d e k a r a k t e r i s e r i n gv a n
d e r u i m t e l i j k es t r u c t u u rv a nh e t
de grens-
e i w i t e nh e ta d -
s o r p t i e / d e s o r p t ï ep r o c e s . B i j h e t a d s o r p t i e / d e s o r p t i ep r o c e sz a la a n d a c h t
w o r d e na a n
d e a d s o r p t i e / d e s o r p t i ek i n e t i e k ,d er e v e r s i b i l i - .
t e i t v a nd ea d s o r p t i ee n eiwitten.
besteed
d e c o n f o r m a t i ev a ng e a d s o r b e e r d e
_.
D e c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n u i tm e n g s e l se n
p l a s m ak o m te v e n e e n sa a nd eo r d e .T e n s l o t t ew o r d e ni n
d i t
H o o f d s t u k de , d o e l s t e l l i n g e n v a n h e t o n d e r z o e k u i t e e n g e z e t .
1 . 2 .G r e n s v l a k k e ne ne i w i t t e n E e ng o e d ek a r a . k - t e r i s e r i n gv a nh e t .v a s t e, o p p e r v l a ke nh e t
e i w i t i s o n o n t b e e r l i j kv o o r
d e b e s t u d e r i n gv a nh e ta d s o r p -
t i e p r o c e sa a nv a s t / v l o e i s t o fg r e n s v l a k k e n .
Het m a t e r i a a l oppervlak is
E e ng o e do v e r z i c h to v e ro p p e r v l a k t ek a r a k t e r i s e r i n g g e g e v e nd o o r
- EX.4
B.D.
RATNER
( 1 9 8 2 ) .E n k e l em e t h o d e nz i j n :
( E l e c t r o n S p e c t r o s c o p y f o r C h e m i c a l Analysis)
,
waar-
b . i j m e t r ö n t g e n s t r a l e ne l e c t r o n e nw o r d e nv r i j g e m a a k tw a a r - ’
d o o ro v e re e na f s t a n dv a n a n a l y s ev a n
~.
vinden.
-
ATR-IR
1-1.0 nm v a n a fh e to p p e r v l a ke e n
d e b i n d i n g s t o e s t a n d e nv a na t o m e nk a np l a a t s -
(Attenuated ~ o t a R l e f l e c t a n c e I n f r a r e d Spectra.
scopy); h i e r b i jw o r d e ni n f r a r o o d s t r a l e nd o o rh e t
t e onder-
z o e k e no p p e r v l a kg e a b s o r b e e r de ng e r e f l e c t e e r d . s p e c t r u mg e e f tc h e m i s c h ei n f o r m a t i eo v e rh e t pervlak.
D e d o o r d r i n g d i e p t e i s d’e l a a t s t ’ e j a r e nt e r u g g e -
b r a c h t v a n 1-5
Km
m o d e r n e r ea p p a r a t u u r .
10
Het IR
m a t e r i a a l op-
( b i j e e r d e r e I R s t u d i e s )t o t
5 0 nm i n
.
-
Randhoek meting is een van de oudste technieken om opper-
vlakken te kar,akteriseren en kan gebruikt worden om te bepalen hoe hydrofoob of hydrofiel het substraat is (VAN DER SCHEER, 1979).
-
Verder kan de lading.van materiaaloppervlakken bepaald worden door middel van potentiometrische titraties en Electrokinetische metingen.
-
Electronen microscoPie wordt ook wel gebruikt voor k.arak-
.
terisering van het materiaaloppervlak. Dit is echtere.en globale methode die alleen 'elementaire infor.matie over de morfologie van het oppervlak verschaft. Er wordt meestal van uitgegaan dat bij adsorptievan eiwitten aan vast/vloeistof grensvlakken de structuur en de eigenschappen van het materiaal oppervlak behouden blijven. Plasma eiwitten
.
.
s
q
.
In dit proefschrift is'de adsorptie van de plasma eiwitten menselijk serum albumine (HSA), menselijk fibrinogeen (HFb) en menseli'jk gamma globuline (HIgG) aan vast-vloeiatof grensvlakken beschreven.. Deze eiwitten hebben verschillende fys'iologische functies in het bloed. Z o reguleert HSA de osmotische druk, depH en het transport
van metaalionen, fosfolipiden en andere verbindingen (Th. Peters, 1975). HFb speelt een belangrijke rol in het bloedstollingsproces. Onder invloed van trombine worden peptides van het HFb molecule afgesplitst, waardoor de
onts'tane fibrine
,
monomeren spontaan polymeriseren tot het fibrine polymeer, dat na crosslinking onderdeel kan uitmaken van een trombus (R.F. DOOLITTLE, 1975). HIgG is het meest voo'rkomende antilichaam uit een serie
,
van vijf, bestaande uit HIgG, HIgD, HIgE, HIgM en HIgA. HIgG is samengesteld uit een aantal electroforetisch te scheiden subklassen. Globulines,spelen een belangrijke rol in het
,
complexe afweersysteem van de mens.
11
Hoewel een gedetailleerde ruimtelijke structuur van de plasma eiwitten KSA, HPb en HIgG niet bekend is hebben WALTON
en K O L T I S K O (1982) o p basis van röntgen diffractie-
en circulair dichroisme ( C D ) studfes een redelijk beeld kunnen geven van d e vorm van deze eiwitten. Figuur 1 toont de ruimtelijke voorstelling van HSA, HFb en HIgG. Tabel 1.1
Tabel I. 1
+ HSA
Plasma
concentratie (g1-l)
40
HFb
HIgG
2-4.5
12
Moleculegewicht
66248
340000
Diffusie coëfficient ( cm2 sec-1
6.1 10-7
2.10-7
Extinctie. (280 m)
cozff. ( glAl
Dimensies ( m )
.O .
S3
1.55
1,85
*Side-on
0,27
*)
9
160000 v.d.SCHEER(1979)
f 1.40
14,0x4#0 4 5 , 0 ~ 9 , 0 v.d.SCHEER(1979): 2 3 , 5 ~ 4 , 4 BMZKIN(1980) 1 1 . ' 5 ~ 4 , 0 47,5X6,5
Adsorptiewaarden voor *&d-on monolaag( ~ . g c z n - ~ )0,90 I '
literatuurplaats
(
O ,25
Deze waarden z i j n berekend op basis
1,70 O, 18
BASZKIN(1980) BSZKIN(1980 )
van de hierboven opgegeven dislensie voor HSA, H F b en HI*, van een dichtste bolstapeling.
door
BASZKIN (1?80)
uitgaande
Bij de in de literatuur vermelde adsorptiestudies is vaak onvoldoende aandacht besteed aan de zuiverheid van eiwitten. de Dit heeft een grote invloed op het adsorptiegedrag, zoals in Hoofdsfuk I1 van dit proefschrift zal worden aangetoond. Een nauwkeurige zuivering en karakteriseringvan eiwitten is dan ook noodzakelijk.
12
F I G U U R 1.
M e n s e l i j kf i b r i n o g e e n
-30a-
Menselijk gamma globuline .
.
Menselijk seruma’lbumine Deze r u i m t e l i j k e v o o r s t e l l i n g e n v a n m e n s e l i j k a l b u m i n e (HSA),
gamma-
m e n s e l i j kf i b r i n o g e e n( H F b )e nm e n s e l i ’ j k
globuline
( H I g G ) - z i j no v e r g e n o m e nu i t
Biomaterials:
- 3 n t e r f a c i a l phenomena and a p p l i c a t i o n s ,a d v a n c e si n c h e m i s t r ys e r i e s
199
S.L.
COOPER e n N.A.
PEPPAS ( p a g .
250
e n 251). HSA e n HFb z i j n r e c o n s t r u c t i e s g e b a s e e r d
v e r k r e g e nu i tc i r c u l a i rd i c h r o i s m e röntgendiffractie.
op g e g e v e n s
spectroscopie e n
HSA b e s t a a t v o o r
4 8 % e n HFb voor 33% uit
a-helices. HIgG h e e f t . e e n @ s t r u c t u u r .
d e l i s g e r e c o n s t r u e e r d ’u i t
Het h i e rw e e r g e g e v e n
HIgG mo-
e1ectronen.microscoopfoto’s. Voor
H F b e n HIgG z i j ng e e nd i m e n s i e sg e g e v e n
( z i e h i e r v o o rT a b e l
1.1)
13
1 . 3 .M e e t m e t h o d e nv o o re i t w i t a d s o r p t i e V O O K e e ni d e a l ea d s o r p t i e s t u d i em o e ta a ne e na a n t a lv o o r D e e i w i t a d s o r p t i em o e tc o n t i n ui n
w a a r d e nw o r d e nv o l d a a n .
s i t u “ k u n n e nw o r d e ng e r e g i s t r e e r d ,k w a n t i t a t i e v em e t i n g e n m o e t e nm o g e l i j kz i j n .V e r s c h i l l e n d ee i w i t t e nm o e t e nw o r d e n de c o n f o r -
o n d e r s c h e i d e ne nb o v e n d i e nm o e to p h e l d e r i n go v e r
e i w i t a a nh e to p p e r v l a k ‘ k u n n e nw o r d e nv e r k r e -
m a t i e v a nh e t gen.
V e e l m e t h o d e nz i j no n t w i k k e . l d
bestuderen,
om e i w i t a d s o r p t i e t e
maar g e e ne n k e l em e t h o d ek a nv o l l e d i ga a n
b o v e n s t a a n d ev o o r w a a r d e nv o l d o e n .E e nk o r to v e r z i c h tv a n d e z em e t h o d e nw o r d tn ug e g e v e n .
A d s o r p t i em e f I i n g
via d e p l e t i e op u i t p u t t i n g
D e ” o u d s t ea d s o r p t i e m e t i n g e nz i j ng e b a s e e r d ’ .
( d e p l e t i e )v a n
d e e i w i t o p l o s s i n g ’d o o r
m i d d e l v a na d s o r p t i e
d e e l t j e s w a a r d o o re e n
a a ne e nf i j nv e r d e e l d ed i s p e r s i ev a n
i s . Momenteew l orden
g r o o to p p e r v l a kb e s c h i k b a a r
b i jv o o r -
k e u r l a t i c e s g e b r u i k to m d a td e z eb e s t a a nu i tg o e dg e k a r a k - ‘ t e r k s e e r d ed e e l t j e s .D e z et e c h n i e kg e e f tk w a n t i t a t i e v e r e s u l t a t e ne nw o r d tv a a kt o e g e p a s t SCHEER,
1979; P A I R ,
(NORDE,
1980; M I T Z U T A N I ,
D e a d s o r p t i ew o r d tb e p a a l du i t
eiwit i n , o p l o s s i n g e n u i t
1 9 7 6 ; Van d e r
1 9 8 0e n
1981).
SUZAWA,
d e c o n c e n t r a t i e a f n a m ev a n
d e b e p a l i n gv a nh e ta a n g e b o d e n
oppervlak. D e t o e p a s b a a r h e i dv a nd e z em e t h o d ev o o ro p p e r v l a k k e n c
b e l a n gz i j nv o o br i o m e d i s c hg e b r u i k gaat h e t h i e r b i j
i s e c h t e br e p e r k t .
om k l e i n eo p p e r v l a k k e nw a a r d o o re e n
g e r i n g ec o n c e n t r a t i e a f n a m e
d i e van
Vaak
te
b e r e i k t wordt.
D e c o n c e n t r a t i e a f n a m ek a n op e e na a n t a lm a n i e r e nw o r d e n ge. . v o l g d :c o l o r i m e t r i s c h ( H L A D Y r 1 9 7 8 ) i, m m u n o l o g i s c h (KLEIN, .~
7
met b e h u l pv a nr a d i o a c t i v i t e i t s -
1 9 8 0 1 ,s p e c t r o s c o p i s c ho f m e t i n g e n ( K L E I N ELHORST!,‘
1978).
R a d i o l a b e l i n g van e i w i t t e n H e t g e b r u i kv a nr a d i o t r a c e r si na d s o r p t i e s t u d i e s
14
komt v e e l
'eiwit-
Met d e z et e c h n i e kk a nd ea d s o r p t i ev a n
v u l d i gv o o r .
t e nk w a n t i t a t i e fw o r d e nb e s t u d e e r da a nk l e i n eo p p e r v l a k k e n . H e t v o o r d e e lv a nd e z em e t h o d e
i s d a t , d o o rh e ta a n b r e n g e n
v a nv e r s c h i l l e n d el a b e l si nd ev e r s c h i l l e n d ee i w i t t e n ,h e t i np r i n c i p em o g e l i j k
e l k a a r t e onde'rscheiden
i s e i w i t t e nv a n
a a nh e to p p e r v l a k . De meest g e b r u i k t e l, a b e l sz i j n
I
125
e n I131. D i v e r s e
l a b e l i n g s p r o c e d u r e sz i j nm o g e l i j k :
-
chlooramine T l a b e l i n g (HUNTER,
e n PENNERS,
-
1 9 6 2 ; KLEIN E L H O R S T ,
1978
1981)
l a c t o p e r o x i d a s el a b e l i n g
( V A N OSS,'
e n d e m o n o c h l o r i d el a b e l i n g
1 9 8 1e n
BORNZIN,
(BRASH e n SCHMITT,
1982),
1983).
Ook w o r d t e r g e b r u i kg e m a a k tv a nc o m m e r c i e e lg e l a b e l d e 1 9 8 0e n
e i w i t t e n (LE",
19831, d i e meestal
VAN DULM,
met d e c h l o o r . a m i n e T m e t h o d e .
g e l a b e l dz i j n
VAN DER. SCHEER h e e f t d r i e l a b e l i n g s m e t h o d e n ( e l e c t r o l y s e
l a c t o p e r o x i d a s ee nc h l o o r a m i n e
T.)
t i e a a np o l y s t y r e e n .
g e t o e t s to ph u nb r u i k -
d e h a n dv a na l b u m i n e a d s o r p -
b a a r h e i di na d s o r p t i e s t u d i e sa a n
H i j komt t o t d e c o n c l u s i e d a t e r s p r a k e
i s v a np r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a ng e l a b e l d SCHEER,
j
e i w i t (VAN DER
1979).
i s om e i w i t - .,
H o e w e lr a d i o l a b e l i n ge e ne e n v o u d i g et e c h n i e k
a d s o r p t i e t e b e s t u d e r e n b l i j k t d a t e r t e ng e v o l g ev a n i n gv e r a n d e r i n g e ni n
label-
d e e i w i t c o n f o r m a t i ek u n n e no p t r e d e n
w a a r d o o rh e ta d s o r p t i e g e d r a gv e r a n d e r t
(WALTON,
1979). Ook
,~
VAN W A G E N E N e n A N D R A D E s t e l l . e n d a t d,e a a n w e z i g h e i dv a ne e n
d e f y s i s c h ee i g e n s c h . a p p e ne n ,
e x t r i n s i e kl a b e l
s o r p t i e g e d r a gv a ne i w i t t e nk a nb e ï n v l o e d e n 1980)
.
A n d e r z i j d sz i j n g e k o m e nd a t d r a gv a n
o o k h e ta d (VAW N AGENEN,
t a l r i j k e o n d e r z o e k e r st o td ec o n c l u s i e
e r g e e nv e r s c h i lb e s t a a tt u s s e nh e ta d s o r p t i e g e -
g e l a b e l d e e nn i e tg e l a b e l d ee i w i t t e n
VAN O S S , . 1 9 8 1 ;
BORNZIN,
1 9 8 2e n
VAN D U L M ,
(BRASH,
1983;
1 9 8 3 ) .E e nb e l a n g -
r i j k e voor.waarde b l i j f t d a t d e l a b e l o n d e r m i l d e omstandig-
h e d e . nm o e tw o r d e na a n g e b r a c h t
~'
.
Ook d e c o n c u r r e n d ea d s o r p t i ev a ne i w i t t e n . i sb e s t u d e e r d d o o rg e b r u i k m a k i n gv a ng e l a b e l d ee i w i t t e n .
HORBETT g e b r u i k t e
15
hiervoor een techniek waarbij uit plasma geadsorbeerde l25 Daarna desorbeerde hij eiwitten werden gelabeld met I
.
de eiwitten met natrium dodecylsulfaat en met behulp van polyacrylamidegel electroforese werden vervolgens de eiwitten in het verkregen mengsel gescheiden. (HORBETT, 1981)
.
IHLENFELD (1979) en YOUNG (1982) gebruikten gelabelde eiwitten voor in vivo adsorptiestudies. Hoewel de labelingsmethode voor wat betreft betrouwbaarheid beperkt is, is dit de enige adsorptiemethode, die in.vivo mogelijkis. F l u o r e s c e n t i e metingen
Met deze methode wordt het eiwit niet met een radioactief label gelabeld maar met een fluorescerend label(fluorescein-: isothiocyanaat, FITC). Deze labeling veroorzaakt ook artefacten in de adsorptieresultaten ten gevolge van optredende structuurveranderingen (CRANDALL en ANDRADE, 1981). Tegenwoordig wordt gebruik gemaakt van Totale Interne Reflectie Fluorescentie, TIRF (VAN WAGENEN en ANDRADE
,
1982). Met de-
ze techniek is geen extrinsiek label meer nodig maar wordt gebruik gemaakt van de intrinsieke fluorescentie van eiwitten als HSA en HFb, gebaseerdo p de excitatie van tryptophaan in het eiwit. Toch blijft het probleem bestaan dat geen directe kwantitatieve informatie verkregen kan worden uit de fluorescentiesignalen, omdat door adsorptiehet fluorescentie signaal van het eiwit verandert. Een onafhankelijke calibratie methode blijft dus noodzakelijk. Vaak wordt dan toch weer gebruik gemaakt van radioactief gelabelde eiwitten. Adsorptiestudies met extrinsiek fluorescerende labels zijn uitgevoerd door BEISSINGER (19821, WALTON (1979), DE BRUIN en VAN OSS (1980). Ellipsometrie
.
.
Een adsorptiemethode waarbij, in principe, in situ en continu informatie verkregen kan worden over de dikte en de
16
b r e k i n g s i n d e xv a n
de g e a d s o r b e e r d e e i w i t h a g i s . e l l i p s o m e -
t r i e (CUYPERS, 1 9 7 8 ; JÖNSSON,
1 9 8 2 e n STENBERG,
1 9 7 9 ) . Door
de v a a kg e r i n g ev e r s c h i l l e ni nb r e k i n g s i n d e xv a ns u b s t r a a t , g e a d s o r b e e r d e e i w i t e ng e b r u i k t eb u f f e rg e e f td e z em e t h o d e w e i n i gi n f o r m a t i eo v e rs t r u c t u u re na a r dv a nd ey e a d s o r b e e r d ee i w i t l a a g .
I n f r a r o o d spectroscopie i s op v e l e r l e i w i j z e t o e g e p a s t b i j
I n f r a r o o ds p e c t r o s c o p i e
de b e s t u d e r i n gv a ne i w i t a d s o r p t i e .I n f r a r o o di n t e r n e
re-
f l e c t i es p e c t r o s c o p i ew e r di n1 9 7 4a lt o e g e p a s td o o r
LEE e n
KIM.
O p h e t z e l f d ep r i n c i p eb e r u s td ei n f r a r o o dv e r s c h i l
s p e c t r o s c o p i ev a n spectroscopie
MORRISEY
( 1 9 7 4 ) ;d ev e e l v o u d i g ei n f r a r o o d
1 9 7 8 e) n
(BRYNDA,
ATR-IR
r e f l e c t a n c ei n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ) .
( A t t e n u a t e dt o t a l
.
D e IR s p e b t r ag e v e nv e e l
c h e m i s c h e2 n f o r m a t i eo v e rd ea a r dv a nd eg e a d s o r b e e r d e
I
e i w i t l a a g v i av e r s c h u i v i n g e ni nd ea m i d e b a n d e n -1 (1300 c m 1 . Deze i n f o r m a t i ew o r d te c h t e rv a a kv e r s t o o r d d o o ro n d e ra n d e r eh e ts p e c t r u mv a n
water.
Deze v e r s t o r i n g e n
k u n n e nm o m e n t e e lv r i j w e lg e h e e lo n d e r d r u k tw o r d e nd o o rg e b r u i k t e m a k e nv a nF T I R ,F o u r i e rT r a n s f o r mI n f r a r o o d spectroscopie
(GENDREAU 1 9 8 2 ) .
Hoewed l e z em e t h o d ev e e l -
b e l o v e n d is, b l i j f t d e i n t e r p r e t a t i e v a n d e
I R spectra
moeilijk.
Overigemethoden N a a s t d eb o v e nb e , s c h r e v e nm e t h o d e ns t a a n
a n d e r em e t h o d e n
e r n o ge e na a n t a l
t e r b e s c h i k k i n gv o o rd eb e s t u d e r i n gv a n
ei-
witadsorptie.
-
C i r c u l a i rd i c h r o i s m e , w o r d e no v e r
de s t r u c t u u r v a n g e a d s o r b e e r d e e i w i t t e n
(WALTON e n MAENPA,
-
-
-
waarmee i n f o r m a t i ev e r k r e g e nk a n
(1919).
H e t m e t e nv a ng r e n s v l a k s p a n n i n g e n
(BAGNALL,
VAN D E R SCHEER,
1981)
1 9 7 9 ; 'E,N VAN
OSS,
E l e c t r o n e n m i c r o s c o p i e (EBERHART,-1977, Calorimetrie
( N O R D E e n LYKLEMA,
ESCA (HANSON
e n RATNER,
Enzym i i m u n oa s s a ym e t h o d e Impedantiemetingen
1978,
.
1982)
1978)
1980) CBREEMHAAR,
(STENBERG, 1 9 7 9 )
1982).
1980;
Deze l a a t s t e t w e e m e t h o d e n w o r d e n i n d i t p r o e f s c h r i f t n o gu i t v o e r i gb e s c h r e v e n( H o o f d s t u k
V e n VII).
C o n c l u s i e sb e t r e f f e n d ea d s o r p t i e m e t i n g e n
van e i w i t t e n
G e e nv a nd e z et e c h n i e k e na f z o n d e r l i j kg e e f tv o l d o e n d ei n f o r matie.
Om e e ng o e db e e l d
t e k u n n e nv o r m e no v e rd ea d s o r p t i e
v a ne i w i t t e nz u l l e nr e s u l t a t e n ,v e r k r e g e nv i av e r s c h i l l e n d e technieken,
'
t e worden.
m e t e l k a a rv e r g e l e k e nd i e n e n
i s , d a td eb e s p r o k e nt e c h n i e k e ni n
E e np r o b l e e mh i e r b i j
h e ta l g e m e e nd o o rv e r s c h i l l e r d eg r o e p e no n d e r z o e k e r sw o r d e n gebruiktwaardoorvergelijkingvanderesultatenvaak
onmo-
g e l i j kw o r d t ;v e r s c h i l l e n d em a t e r i a l e ne ne i w i t t e nw o r d e n onder niet geli j ke .condities gebruikt.
1.4.
D e c o n f o r m a t i ev a ne i w i t m o l e c u l e na a ng r e n s v l a k k e n
A l g e m e e nw o r d ta a n g e n o m e nd a te i w i t t e ng e a d s o r b e e r da a n vloeisto€/vloeistof en. vloeistof/lucht grensvlakken t i a i r es t r u c t u u rv e r l i e z e n .
A l v e l ej a r e nw o r d t
hun t e r -
er gespecu-
l e e r dO v e rd es t r u c t u u rv a ne i w i t t e na a nv a s t / V l o e i S t O f g r e n s v l a k k e ne n
d e v r a a gd o e tz i c hv o o r
of
c o n f o r m a t i ev e r a n d e r tw a n n e e rh e ta a nd i t g r e n s v l a ka d s o r b e e r t .
h e t e i w i t van laatste type
E r z i j n ' a a n w i j z i n g e nd a ta a n ' v a s t /
v l o e i s t o fg r e n s v l a k k e nd ee i w i t t e nm i n d e rd r a s t i s c h ec o n f o r m a t i e v e r a n d e r i n g e no n d e r g a a nd a nb i jv l o e i s t o f / v l o e i s t o f grensvlakken
(McRITCHIE,
.L9781 .
Verscheidenetechniekenzijn.toegepastvoordebepaling v a nd ec o n f o r m a t i ev a ng e a d s o r b e e r d ee i w i t t e n .
met
Veelal,
*
name b i jo u d e r èa d s o r p t i e t e c h n i e k e nz o a l sd e p l e t i e m e t i n g e n i - . ; , w e r de e ns c h a t t i n gg e m a a k tv a n .d em o l e c u l a i r ed i m e n s i e sv a n het e i w i t ingeadsorbeerdetoestand
op b a s i s v a n
de g e v o n d e n
o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ee nd ea a n n a m ed a tm o n o l a a ga d s o r p t i e optrad.
Zo c o n c l u d e e r d e n O R E S K E S . ë n SINGER i n 1 9 6 1 r e e d s d a t
o p b a s i sv a nd e p l e t i ev a n
styreenlatex bij de
Gamma g l o b u l i n e( . I g G )
e i w i t m o l e c u l e np l a t
waar-
op h e t o p p e r v l a k l i q g e n ' t e r w i j l
bijhogereeiwitconcentratiesindeoplossing t i ë l e p l a a t s e na a nh e to p p e r v l a k .o p g e v u l dw e r d e n
18.
aan p o l y -
e r s p r a k e w a s v a ne e ns i d e - o nm o n o l a a g ,
de i n t e r s t i -
'
m e t end-on
g e a d s o r b e e r dI g G ,w a a r b i j
d e . m o l e c u l e nr e c h t o ps t a a n . , H i e r -
b i j w e r d: a a n g e n o m e nd a td ed , i m e n s i , e sv a n
I.gG t i j d e n s a d s o r p -
I
t i e r n i e t .v e r a n d e r d e n . N O R D E b e s t u d e e r d ei n1 9 7 3s y s t e m a t i s c h
d e a d s o r p t i ev a n
H S A a a np o l y s t y r e e nl a t e xo n d e rv e r s c h i l l e n d ec o n d i t i e s( p H ,
t e m p e r a t u u r ,e ni o n s t e r k t e ). e nv o n dv o o r t i e m a x i m a a l was
(0,2
p g cm
-2
bij
)
(pH 4 , 9 ) .D e z eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e
H S A d a t de adsorp-
h e ti s o - e l e c t r i s c hp u n t k o m to n g e v e e ro v e r e e n
met e e ns i d e - o nm o n o l a a g .B o v e ne nb e n e d e nh e ti s o - e l e c t r i s c h pun't' was d e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e l a g e r ( b i j
d e r e i o n s k e r k t e s ) .H i e r u i tc o n c l u d e e r d eh i jd a t
meeri n die
HSA
meer o n t v o u w d e ' c o n f o r m a t i e aanna.m.. Ook B R A S H e n
g e v a l l e ne e n
LYMAN c o n c l u d e e r d e n i n
1969. o p b a s i s v a n, , m o l e c u l a i r ed i m e n - .
s i e s d a tt i j d e n sh e ta d s o r p t i e p r o c e s
d e g r o o t t ev a nh e t
l e c u l e n i e t merkbaar v e r a n d e r d e . E r z i j nw e i n i gt e ' c h n i e k e . n
.
mo-
1
. d i e ' d i r e c t i n f o r m a t i ev e r s c h a f -
f e no v e rd es t r u c t u u rv a ng e a d s o r b e e r d d e i n t e r p x - e t a t i ev a nd e
I
eiwit:Bovendien
gegev1en.S m o e i l i j k .
is
Zo , ' g e b r u i k t e n
M O R R I S E Y e n . S T R O M B E R G i n1 9 7 4i n f r a r o o dv e r s c h i . 1s p e c t r o . s c o - .
p i e w a a r b i j Òp b a s i s v a n d e e i w i t a m i d e - I - b a n dv e r s c h u i v i n g
we.rd i n h e t p e r c e . n t a ' g e :
i nh e t; s p e c t r u m. i n Z i c h Cv e r k r e g e n c a r b o n y l g r - o e p e nv a nh e tg e a d s o r b e e r d e . c o n t a c tm . a a k t e
met h e to p p e r v l a k
m e t i n g e nz i j nu i t g e v o e r d
ei.wit d a t r e c h t s t r e e k s
( . : " b i n d i n g s f . r a c t : i e " ) . Deze
b i j d e a d s o r p t i e 'v a na l b u m i n e ,p r o B i j a l b u m i n ee np r o t r o ' r n b i n e
t r o m b i n ee nf i b r i n o g e e ni ns i t u .
d i e const.,a'nt b l e e f
v o n d e nz ee e nb i n d i n g s f a a c t ' i . ev a n0 , l ; l '
b i j a l l e waargenomen o p p e r v l a k t e c o n c e h t r a b i e s . d e e r d e nh i e r u i t
,
z.ij
concxu-
. d a t ' . d e i n t e r n e "b i n ' d i n g e r ie nd i s u l f i d e b r u g g e n '
i nd e z ee i w i t t e nv a nd i e n
a a r d z i j nd a tc o n f o r m a t i e v e c a n d e -
:'
r i n . g e nt e ng e v o l g ev a na d s o r p t i en i e to p t r e d e n ,F i b r i n o g e e n ip de l ' b i n d i n g s f r a c t i e "
d a a r e n t e g e nv e r t o o n te e n, t o e n s m e . h o g e r eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e . .
bij
, D i t w o r d tv e r k l a a r dd o o r .e e n
.
mogelijka eggregativ ean fibrinogeen.
. .
B i j gamma ~ l o b u l i n e
, , ,
b l e e k d a t h e ta a n t a , lg e a d s o r b e e r q ec a r , b o n y l g r o e p e na f n a mb i j
t o e n e m eonpdpee r v l a k t e c o n c e n t r a t i e MORRISEY,
197.6)
MORRISEY
(FENSTERMAKER en
z a gg e e ns i g n i f i c a n t e, v e r a n d e r i n g
..
b
'
v a nd ec o n f o r m , a t i ev a nd ee ï w i t t e n$ a nh e to p p e r v l a k g a l s f u n k t i ev a n
de t i j d .
19
MC M I L L I N e n WALTON (CD)
e nc o n c l u d e e r d e n
( 1 9 7 4 )g e b r u i k t e nc i r c u l a i rd i c h r o i s m e d a t f i b r i n o g e e nt i j d e n s
de adsorptie .
a a n s i l i c a g e e nv e r a n d e r i n gi nc o n f o r m a t i eo n d e r g a a t
terwijl
f a c t o r X I 1 w e l e e n s t e r k e v e r a n d e r i n go n d e r g a a t .P r o b l e e m b i j d e z et e c h n i e k
i s d a t h e tg e b r u i k t es u b s t r a a te e n
s t o r e n d ef a c t o rk a nz i j nw a n n e e rh e tu l t r a v i o l e tl i c h t a b s o r b e e r t .D e z es t u d i eh e e f to v e r i g e n sg e e nv e r v o l gg e h a d .
i s g e e nc o n f o r m a t i e v e r a n -
.Met f l u o r e s c e n t i e s p e c t r o s c o p i e d e r i n gv a n
B S A a a n g e t o o n dn aa d s o r p t i ea a np o l y - a - a m i n o z u r e n
s u b s t r a t e n (WALTON e n MAENPA,
1 9 7 9 ) . W e l hebben SODERQUIST
e n WALTON i n 1 9 8 0 met b e h u l pv a n v e r s c h e i d e n ep l a s m ae i w i t t e n
CD s p e c t r aa a n g e t o o n dd a t
HFb e nH I g G )e e nv e r l i e s
(HSA,
t e z i e ng a v e nn aa d s o r p t i e
a a ns e c u n d a i r eo fh e l i xs t r u c t u u r a a ns y n t h e t i s c h ep o l y p e p t i d e
films.
I np l a a t sv a ne e nc o n -
t e v o e r e n ,b e p a a l d e n
f o r m a t i ea n a l y s ea a nh e to p p e r v l a ku i t
z i j d e v e r a n d e r i n gi ns t r u c t u u rd o o rv e r g e l i j k i n gv a n
de el-
e i w i t met g e d e s o r b e e r d e i w i t ,
l i p t i c i t e i tv a nh e tn a t i e v e
d e m a t r i xb e d e k t
e l u t i eo v e re e nk o l o mw a a r v a n
na
was met
p o l y - a - a m i n o z u r e n .A l l e e ni r r e v e r s i b e l ev e r a n d e r i n g e nk u n n e n
op d e z ew i j z ea a n g e t o o n dw o r d e n . V o o r t b o r d u r e n do p
d e e x p e r i m e n t e nv a n
SODERQUIST vinden
B R A S H e n C H A N ( 1 9 8 1 )e e nv e r l f e sv a n5 0 %i na - h e l i xs t r u c -
t u u rv a nf i b r i n o g e e nn aa d s o r p t i ea a np y r e x g l a s . m a a k t e ng e b r u i kv a n
Ook z i j
CD.
Conclusie: U i t h e tv o o r a f g a a n d ew o r d td u i d e l i j k ,
d a t e e nc o n f o r m a t i e -
v e r a n d e r i n gv a np l a s m ae i w i t t e n . t e ng e v o l g ev a na d s o r p t i e a a nv a s t / v l o e i s t o fg r e n s v l a k k e nn i e tz o n d e r
meer u i t g e s l o t e n
mag. w o r d e n .
1.5.
D e r e v e r s i b i l i t e i tv a ne i w i t a d s o r p t i e
A d s o r p t i ev a ne i w i t t e na a nv e r s c h i l l e n d eo p p e r v l a k k e n w o r d vt a a kb e s c h r e v e n MILLER,
1973;
a l s " L a n g m u i ar d s o r p t i e " .
LEE e n K I M ,
b e t e k e n te c h t e rg e e n s z i n s
1 9 7 4 ; BRASH e n S A M A K ,
(DILLMAH en
'
1978). D i t
d a t e i w i t a d s o r p t i ev o l d o e ta a n
de
b a s i s v o o r w a a r d e nv o o re e n' L a n g m u i ra d s o r p t i e "g e d r a g .D e z e v o o r w a a r d e nz i j n e: e nh o m o g e e no p p e r v l a km , o n o l a a ga d s o r p -
20
.
tie;
r e v e r s i b e 1 . ea d s o r p t i ee ng e e nl a t e r a l ei n t e r a c t i e si n
g e a d s o r b e e r d et o e s t a n d .
. .
eiwit-
T o c hn e m e nb o v e n s t a a n d ea u t e u r si m p l i c i e ta a n . d a t a d s o r p t i er e v e r s i b e l
is'. E r z i j ne S h t e rd u i d e l i j k ea a n w i j -
z i n g e n ,v o o r a lb i ja d s o r p t i ea a nh y d r o f o b eo p p e r v l a k k e n ,d a t d i t n i e tz o n d e r
meer h e tg e v a l
VAN D E R S C H E E R
is.
( 1 9 7 9 )s t e l d e
d a t e r s p r a k e i s v a ne e n
" s e m i - r e v e r s i b e l "a d s o r p t i e p r o c e s .H o e w e l
e r g e e no f ,e r g
w e i n i g e i w i t d e s o r b e e r tv a nh y d r o f o b eo p p e r v l a k k e n( p o l y s t y r e e n )w a n n e e r
d e e i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n gv e r -
wel meer w a n n e e r d e e i w i t c o n -
m i n d e r dw o r d t ,a d s o r b e e r t ' e r
d e o p l o s s i n gt o e n e e m t .
centratiein
. D i t g e l d tn i e ta l l e e n
v o o re i w i t t e nm a a ro o kv o o rs y n t h e t h i s c h ep o l y m e r e n .V o o r
op
s y n t h e t i s c h ep o l y m e r e n ' i sd i tv e r s c h i j n s e lv e r k l a a r d g r o n dv a nh u nh e t e r o d i s p e r s i t e i t
t e r e m o l e c u l e na d s o r b e r e n
( C O H E N STUART;1980). Gro-
'
met e e n g r o t e r e a f f i n i t e i t d a n . d e te
k l e i n e r e ,e nz i j ni ns t a a td ek l e i n e r ev a nh e to p p e r v l a k verdringen.
meer
B i j e e nh o g e rp o l y m e e r . a a n b o dz u l l e no o k
g r o t em o l e c u l e na a nh e to p p e . r v l a k a' a n w e z i gz i j n d , e z eg r o t e
:
m o l e c u l e nd e s o r b e r e nm o e i l i j k e rd a nk l e i n e r em o l e c u l e n . D a a r d o o rh e e f t
d e i s o t h e r mt o c hg e e nh i g ha f f i n i t yk a r a k t e r
t e r w i j l h e tp o l y m e e rn i e to f ' , z e e rm o e i - l i j kd e s o r b e e r t .V o o r daar e i w i t t e n -
e i w i t t e ng a a td e z ev e r k l a r i n ge c h t e rn i e to p , i nh e ta l g e m e e nm o n o d i s p e r sz i j n . BRASH e n SAMAK
er geen twijfel over
(19781 , 9 8 1 )l a t e n
' .
b e s t a a nd a te i w i t a d s o r p t i e( a a np o l y e t h y l e e n ) , e e nd y n a m i s c h p r o c e s i s , w a a r b i j u i t w i s s e l i n gv a ne i w i t t e na a nh e tg r e n s v l a ko p t r e e d to n d e r" s t e a d ys t a t e "c o n d i t i e s .
Z i j v i n d e ni n
e e r s t e i n s t a n tei eu ni t w i s s e l i nt ug s s e n
HSA e n
1131 H S A e nv e r v o l g e n s ,n ao n g e v e e r
w i s s e l i n g meer m e r k b a a r ,
60 uur,
i s , , g e e nu i t -
eiwit.
D i t
per-
d e g e k o z e na d s o r p t i e c o n d i t i e s .
De
a u t e u r sc o n c l u d e r e nh i e r u i td a t t e i t i nb i n d i n g s e n e r g i et u s s e n o ph e to p p e r v l a k .
I.
t.erwij1 50, t o t 7 0 % v a nh e to p p e r -
v l a kn o gb e z e tw o r d td o o rh e to o r s p r o n k e l i j k c e n t a g e i s a f h a n k e l i j kv a n
,
e r s p r a k e i s v a nh e t e r o g e n i e i w i t e n d e d i v e r s ep l a a t s e n
Z i j v i n d e no v e . r i g e n so o kg e e nd e s o r p t i e
t e ng e v o l g ev a nv e r d u n n ' i n gi no p l o s s i n g .
HFb g e p r e a d s o r b e e r d .
a a ng l a sd e s o r b e e r te v e n m i n
b i j verdunning.
I
D e uitwisseling
21
i s b i j HFb s n e l l e rd a n
b i j HSA.
I nt e g e n s t e l l i n gt o t
v i n d t C H U A N G ( 1 9 7 8 )e n i g ed e s o r p t i ev a n o p p e r v l a k k e n( C u p r o p h a a n )i n
BRASH
HFb b i j h y d r o f i e l e
d e p u r eb u f f e r .
Ook v i n d t
,
e i w i t b e s t u d e e r de n
I
..-
e i w i t doo:r
( 1 9 8 0 )h e e f td ev e r d r i n g i n gv a n . é & ns o o r t
e e na n d e r
.
.
CHUANG u i t w i s s e l i n g .
VROMAN
I.
komk t o t d e c o n c l u s i e d a t
,
h o o g m o l e c u l a i r ee i w i k t e nl a a g m o l e c u l a i r ee i w i t t e nv e r d r i n g e n het
.oppervlak.
van
I
.
*.
DE B R U - I N e n VAN O S S : ( 1 9 8 0 )s t e l l e n
v a n h e t a d s o r p t i e p r o c e sg e r e l a t e e r dk a nw o r d e na a n f o b i c i t e i tv a na d s o r b e n se na d . s o r b a a t . HORBETT
( 1 9 8 1 )e n
uitgevoerd,
.
L
dat de r e v e r s i b i l i t e i t
SCHMITT
de. hydro-
(1983),
( 1 9 8 0 ) .h e b b e na d s o r p t i e s t u d i e s
BASZKIN
w a a r b i j d e h y d r o f o b i c i t e i tv a nh e to p p e r v l a k ' a l s
parameter is gebruikt.
U i t d e z es t u d i e s
b l i j k t dat
" h y d r o f i e l e "o p p e r v l a k k e n* a a n l e i d i n gg e v e nt o tr e v e r s i b e l e e i w i t a d s o r p t i e t e r w i j l a a n" h y d r o f o b e "o p p e r v l a k k e ne i w i t t . e n i r r e v e r s i b e la d s o r b e r e n . Veel a u t e u r s MILLER,
(SODERQUIST,
1980; BRYNDA,
1 9 8 2 1 , m a k e nm e l d i n gv a n
1978; B O R N Z I N e n
t w e e g e l i j k t i j d i g ep r o c e s -
s e n :e e nr e v e r s i . b e 1a d s , o r p t i e . p r o c e sn a i s te e ni r r e v e r s i b e l adsorptieproces.
k a nz o w e lv e r o o r z a a k tw o r d e nd o o r
D i t
h e t e r o g e n i t e i tv a nh e to p p e r v l a k
de
a l s door de aanwezigheid
v a ne e nr e v e r s i b e l ee i w i t c o n f o r m a t i ee ne e ni r r e v e r s i b e l e e i w i t c o n f o r m a t i e .I nH o o f d s t u k . 1 1 1v a n
.
.
d i t proefschrift
w o r d te e no v e r g a n gg e s u g g e r e e r dv a nr e v e r s i b e lg e a d s o r b e e r d
e i w i t n a a r" i r r e v e r s i b e l " .g e a d s o r b e e c d C o n c l u d e r e n dk a n
eiwit.
g e s t e l d w o r d e n . d a tp l a s m ae i w i t t e nn i e t
w a a . r n e e m b a a rd e s o r b e r e nv a nh y d r o f o b eo p p e r v l a k k e n ,z o d a t v e r l a g i n gv a n .
de eiwitconcentratie in. de oplossing niet
l e i d t t o te e na a n z i e n l i j k ev e r m i n d e r i n gi n
de geadsorbeerde
h o e v e e l h e i d .U i t w i s s e l i n g 't u s s e n
e i w i t a a nh e to p p e r v l a ke n
e i w i t i n d e o p l o s s i n gk a ne c h t e r
wel o p t r e d e n .
1 . 6K. i n e t i eekm n e c h a n i s mveaeni w i t a d s o r p t i e D e b e s c h r i j v i n gv a n
I
d e a d s o r p t i e ' v a nk l e i n em o l e c u l e na a n
g r e n s v l a k k e n i s e e n k l a s s i e k p r o b l e e md a t ~
w o r d tb e g r e p e n .
I
.
o p p e r v l a k k e n i s n i e tz od u i d . e l i j k . 22
r e d e l i j k goed
.
De a d s o r p t i ev a nm a c r o m o l e c u l e na a nv a s t e Er
z i j n echter w e l een
.
a a n t a 1 , m o d e l l e nb e k e n d
w a a r m e e h e ta d s o r p t i e p r o c e sb e -
(SILBERBERG, 1 9 7 0 ; C.OHEN STUART, 1 9 8 0 ) . D e
s c h r e v e nk a nw o r d e n
a d s o r p t i ev a ne i w i t t e nv a n u i to p l o s s i n ga a nv a s t eo p p e r v l a k k e n i s d o o r, d ev e l e ' w i s s e l w e r k i n g e nn o gi n g e w i k k e l d e r .
Bi,j
t e worden
h e to p z e t t e nv a ne e na d s o r p t i e m o d e ld i e n tr e k e n i n g
g e h o u d e n met c o n f o r m a t i e v e r a n d e r i n g e nd i eo pk u n n e nt r e d e n
i
ir-
t e ng e v o l g ev a na d s o r p t i e( z i ' eI . 4 ) ,h e tr e v e r s i b e l eo f r e v e r s i b e l ek a r a k t e rv a nd ea d s o r p t i e( z i e
1.51,
eventuele
maar o o k m e t d ee x -
d e n a t u r a t i ev a ng e a d s o r b e e r d ee i w i t t e n , '
p e r i m e n t e l eo m s t a n d i g h e d e ne nd eg e b r u i k t ea d s o r p t i e t e c h n i e k (zie 1.3).
'
Xinetiek B i j de b e s t u d e r i n g v a n d e k i n e t i e k v a n e i w i t a d s o r p t i e z i j n I n d e e e r s t e p l a a t sd ea a n v o e rv a n
t w e e e f f e c t e nv a nb e l a n g .
h e t e i w i t n a a rd eg r e n s l a a ge ni , n
d e ,t w e e d ep l a a t sd e .a d s o r -
p t i ea a nh e tg r e n s v l a k . LEE e n KIM
( 1 9 7 4 )b e s t u d e e r d e na d s o r p t i e s n e l h e d e nv a n
p l a s m ae i w i t t e na a nv e r s c h e i d e n eh y d r o f o b eb i o m a t e r i a l e ng e b r u i k m a k e n dv a ni n t e r n er e f l e c t i ei , n f r a r o o ds p e c t r o s c o p i e . GORMAN
( 1 9 7 1 )h e e f tf i b r i n o g e e na d s o r p t i ea a n
a@ g e a d s o r b e e r d em o l e c u l e n
als, f u n c t i e v a n d e t i j d d o o r
" t e l l e n "m e tb e h u l pv a ne l e c t r o n e n m i c r o s c o p i e .
KOCHWA
te
CUYPERS
t e r w i j l R O O H K ( 1 9 7 7 ) , ,BRASH
( 1 9 7 8 )g e b r u i k t ee l l i p s o m e t r i e ( 1 9 7 4 )e n
mica g e v o l g d
( 1 9 7 7 )r a d i o l a b e l i n gt o e p a s t e n .o r n . s n e l h e i d -
curves t e bepalenwaarbi j
deoppervlakteconcentratieuit.ge-
z e t i s als f u n c t i e v a n d e t i j d b i j e e n c o n s t a n t e . e i w i , t c o n c e n t r a t i ie n do eplossing.
..
VAN, DULM e n NORDE ( 1 9 8 3 ) s t e l l e n m e t g e l a b e l d ee i w i t t e n
m e t b e h u l pv a nm e t i n g e n
v a s t d a td ea d s o r p t i ev a n
g l a se np o l y s t y r e e nd i f f u s i e - b e p a a l d
HSA
aan
. i s . W a n n e e re c h t e r
ei-
w i t enoppervlaknegatiefgeladen.zijn.wordtde'kinetiekbep a a l d d o o re e na d s o r p t i eb a r r i è r ev e r o o r z a a k t
door e l e c t r o -
s t a t i s c h er e p u l s i e s . BORNZIN c o n c l u d e e r t a a n d e . h a n d . v a n
'40, s n e l h e i d s c u r v e s
v a n de a d s o r p t i e ' v a n r u n d e r a l b u m i n e e n r u n d e r f i b r i n o g e e n a a ns i l i c o n r u b b e re nc u p r o p h a a n ' d a te e nd e e lv a nh e t r e v e r s i b e le ne e nd e e l" i r r e v e r s i b e l "a d s o r b e e r t .
ei'wit Het " i r r e -
23
m e t b e h u l pv a ne e n
v e r s í b e l e "d e e lw o r d tb e s c h r e v e n
m e t behulp
diffusievergelijkingenhetreversibelegedeelte v a ne e nt w e e d eo r d eL a n g m u i rk i n e t i e k .
BEISSLNGER..(l980) h e e f t e e n k i n e t i s c h m o d e l o p g e s t e l d , u i t g a a n d ev a nr e v e r s i b e l ea d s o r p t i e ,w a a r b i js p r a k e
i s van
t w e e s o o r t e ni n t e r a c t i e st u s s e n
H i j
e i w i t e no p p e r v l a k .
m a a k t hierbij g e b r u i kv a nd eL a n g m u i r - H i n s h e l w o o db e n a d e ring.
, H e t m o d e lw o r d t .g e c o n t r o l e e r da a nd eh a n d, v a nd ea d -
sorptievan
HIgG a a n k w a r t s . 3
later v e r d e r u i t g e b r e i d
c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e . p t i ev a n
D i t modelheefthijeenjaar
w a s voor
waardoor h e t t o e p a s b a a r
D e e x p e r i m e n t e l er e s u l t a t e n( a d s o r -
HSA e n HIgG)weken
s t e r k af v a n d e m o d e l f i t t i n g
(BEISSINGER 198-1).
Een a d s o r p t i e m o d e lw o r d to o kg e g e v e nd o o r H i j gaatuitvan
SODERQUIST (1980).
3 stadiainhetadsorptieproces:'eenini-
t i B , l e k o r t ep e r i o d ew a a r b i jd ea d s o r p t i er e v e r s i b e ' x
is, een
tweede f a s ew a a r b i jd eg e a d s o r b e e r d ee i w i t t e ne e nl a n g z ' a m e
c o n f q r m a t i e v e r a n d e r i n ga a nh e to p p e r v l a ko n d e r g a a n ,w a a r d o o r d e s o r p t i eo n m o g e l i j k - w o r d te ne e ne i n d s t a d i u mw a a r b i j g e a d s o r b e e r d ee i w i t t e ng e d e n a t u r e e r dz i j ne nw e d e r o mk u n n e n desosberen. PAIR
( 1 9 8 0 )n e e m f
op g r o n dv a ne x p e r i m e n t e n
m e t r u n d e ra l b u -
m i n ee nr u n d e r g l o b u l i n e ,g e a d s o r b e e r da a np o l y s t y r e e n ,a a n d a t e r 3 g e b i e d e n - i nd ea d s o r p t i ei s o t h e r m zijn.
B i j . l a g eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e s
-te o n d e r s c h e i d e n i s e r e e nw i l l e k e u -
r i g ev e r d e l i n gv a ne i w i t t e na a nh e to p p e r v l a k zwakke l a t e r a l e f n t e r a c t i e s .
m e t onderling
E e nt w e e d eg e b i e dw o r d tg e k e n -
merktdoor'een"glasachtige'eiwitstructuuraanhet o p p e r v l a k . , B i j h o g e oppervlakteconcentraties'is er s p r a k e vaneenkristalstructuurmet.sterkelateraleinteracties. Overeffectenindetijdwordtnietgesproken. Vrijwelin
alle v e r s c h e n e np u b l i c a t i e so v e ra d s o r p t i ev a n
e i w i t t e nw o r d ta a n g e n o m e nd a te i w f t t e na d s o r b e r e n nolaag, en dat het oppervlak verzadigd raakt" I nH o o f d s t u k t u u rv e r m e l d e zet.
24
i n e e n mom e t eiwitten.
III v a n d i t p r o e f s c h r i f t z i j n d e i n d e l i t e r a verzadigingswaarden.voor HFb e n HSA b i , j e e n g e -
,
Conclusie
D e adsorptie van eiwitten aan vast/vloeistof grensvlakkenis een ingewikkeld proces, waarvan het mechanisme nog niet goed bekend is. Dit komt vooral door de onduidelijkheid die er bestaat omtrent de re*versibiliteit van het proces.
1.7.
Concurrerende eiwitadsorptie
Bij de meeste adsorptiestudies met eiwitmengsels is gebruik gemaakt van HSA, HIgG enHFb. Bij concurrerende eiwitadsorptie blijkt dat. de geadsorbeerde eiwitlaag is samengesteld uit de drie in oplossing aanwezige eiwitten. De aard van, de geadsorbeerde eiwitlaag wordt bepaald door de concentrat'ie van de eiwitten in de oplossing en hets,ubstraat. Zo stelt HORBETT (1975) dat de HFb oppervlakteconcentratie gehalveerd wordt wanneer een tienvoudige overmaat HSA en HIgG wordt toegevoegd. Meestal blijkt HFb echter preferentieel teadsorbe'ren ten opzichte van,HSA en HIgG (KOCHWA, 1977; ROOHK (1977); BRASH,
.
1979, 1981; LEE, 1974). ROOHK (19771, UNIYAL (1982) en KIM (1979) stellen dat er een nauwe relatie bestaat tussen HFb adsorptie enerzijds en de daarmee gepaard gaande trombogeniciteit en plaatjesadhesie anderzijds. ,YOUNG en COOPER concluderen bovendien dat de,adsorptie van HIgG, fibronectine en de Van
.
Willebrand factor eveneens tromboseversterkend werkt (1982) In al deze studies is,,gebruik'gemaakt van radiolabeling. BEISSINGER en LEONARD.(1982) maken gebruik van fluorescentie labeling. Op grond van hun adsorptieexperimenten met. HSA en HIgG aan kwarts komen zij tot de conclusie ddat e samenstelling van de geadsorbeerde eiwitlaag afhankelijk is . . van het aangeboden eiwitmengsel in oplossing. . LEMM en UNGER (1980) hebben de concurrerende adsorptie van HIgG, HSA en HFb aan polyurethaan en. siliconrubber oppervlakken als functie van de tijd gevolgd vind,en en dat HFb en HIgG in eerste instantie oververtegenwoord,igd zijn,en dat vervolgens uitwisseling plaatsvindt van geadsorbeerd eiwit
25
met a l b u m i n ei n
de oplossing.
.
D i t i s o o kg e v o n d e nd o o r
LEE
e n K I M (1974.1
E e na n d e r ew a a r n e m i n gk o m tu i th e t
w e r k v a n GENDREAU ( 1 9 8 2 ) .
H i j h z e f tg e b r u i k m a k e n dv a nF o u r i e rT r a n s f o r m a t i eI n f r a r o o d
s p e c t r o s c o p i e d e c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e , v a n
H S A e n HFb a a n
H i j komt t o t d e c o n c l u s i e
g e r m a n i u mb e s t u d e e r d .
d a t HSA h e t
dat geadsorbeerd HSA vervolgens u i t -
s n e l s ta d s o r b e e r te n
met H F b i n d e o p l o s s i n g , z o d a t u i t e i n d e l i j k
g e w i s s e l dw o r d t
.
HFb p r e f e r e n t i e e l a d s o r b e e r t .
Omdat d e d i f f u s i e c o ë f f i c i e n tv a n
.
HSA g r o t e r
i s d a nd i ev a n
is inderdaad t e verwachten dat i n eerste i n s t a n t i e HSA
HFb
p r e f e r e n t i e e la d s o r b e e r t ' .V e r d r i n g i n ga a nh ' e to p p e r v l a kv a n HSA d o o r HFb i s v e r v o l g e n s n i e t u i t
h e tg e a d s o r b e e r d e
s l u i t e n ( H F b i s e e ng r o t e rm o l e c u l ed a n
te
HSA).
Wanneer meerdere c o m p o n e n t e ni nh e t .s y s t e e ma ' a n w e z i gz i j n
w o r d t de i n t e r p r e t a t i e van de gevonden r e s u l t a t e n n o g pliceerder.
D a t
i s h e tg e v a lw a n n e e r
p t i ev a ne i w i t t e nu i t
gecom-
d e c o n c u r r e r e n d ea d s o r -
p ' l a s m aw o r d tb e s t u d e e r d .
(1981)
BRASH
c o s s t a t e e r t d a t d e H S A e n HFb a d s o r p t i ev a n u i tp l a s m ab e d u i d e n dl a g e r
i s d a ni nm o d e l s y s t e m e n .
Hij m a a k t h i e r b i j 'ge-
b r u i kv a nr a d i o l a b e l i n ge na d s o r p t i ea a ng l a s . t h a n e na d s o r b e e r tv a n u i fp l a s m a . i n HSA.
Aan p o l y u r e -
h e t g e h e e lg e e n
HFb o f
A l l e e n H I g G w o r d tw a a r g e n o m e n 'a a nh e to p p e r v l a k .
VROMAN ( 1 9 8 2 ) v i n d tg e d u r e n d e
a d s o r p t 2 eu i t
d e ' e e r s t e m i n u t e nv a n
de
_.
plasma e e nh o g ef i b r i n o g e e n c o n c e n t r a t i ea a n
oppervlak^ e n v e r v o l g e n s e e n g e r e d u c e e r d e f i b r i n o g e e n a d -
het
Sorptie.
D i t w o r d to o kg e v o n d e nd o o r
VROMAN s p f e e k tv a nv e r d r i n g i n g
BREEMHAAR ( 1 9 8 2 ) .
door k i n i n o g e e n ,
BREEMHAAR
v a nv e r d r i n g i n gd o o rh o g ed i c h t h e i dl i p o p r o t e i n e n . HORgETT e n W E A T H E R s B Y h e b b e n d e a d s o r p t i e v a n HIgG,
h e m o g l o b i n ee np r o t r o m b i n e' b e s t u d e e r da a n
poly-EMA.
Z i j
k o n d e ng e e n
RSAr BFb,
poly-HEMA
HSA a d s o r p t i e ' d e t e c t e r e n .
en
UNIYAL
( 1 9 8 2 ) s t e l t d a t d o o r d e - a a n w e z i g h e i dv a nr o d eb l o e d c e l l e n i np 1 a s m a " d ea d s o r p t i ev a n
HFb e n H S A v e ' r m i n d e r t .
H e t i s be-
k e n d ' d a th e m o g l o b i n ep r e f G r e n t i e e 1a d s o r b e e r tt e no p z i c h t e v a n HFb ( B R A S H 1 9 8 1 . )
.
1.HLENFELD ' e n COOPER
b e s t u d e e r da a n 26
PVC,
( 1 9 7 9 )h e b b e ni nv i ' v o ,e i w i t a d s o r p t i e
s i l a s t i c e np o l y u r e t h a a n ,g e b r u i k m a k e n d
van radiolabeling. Zij vimden in eerste instantie een piek in de fibrinogeen adsorptie en vervolgenseen uitwisse,ling van geadsorbeerd fibrinogeen.met albumine en g,amma globuli-
'
ne. 'Er wordt geen adsorptie van andere eiwittenvermeld. Conclusie
Het moge duidelijk zijn dat uit deze.concurrerende adsorptie experimenten geen eenduidi,g,econclusies getrokken kunnen worden. Wat wel duideli,jk wordt uit deze' resultaten is dat '
.
gedurende de eerste minuten van de adsorptie verdringing van geadsorbeerd eiwit optreedt met andere woordend e eiwitsamenstelling aan het oppervlak kan variëren als functie van de tijd. Zo
is op grond van de hoge HSA concJntratiein plasma en de
hoge diffusie coëfficiënt van HSA een preferenti,ële a,d-
.'
'
sorptie van HSA te verwachten. Dit is echter niet hetgeval. Wel is .het mogelijk dat aanvankelijk geadsorbeerd HSA ,*
.
.
ver-
I
drongen word,t door HFb of door andere eiwitten in de oplossing. 1.8.
Doelstellingen van dit proefschrift
Uit het literatuuroverzicht wordt duidelijk dat hef .
hoofdstuk van de eiwitadsorptie nog zeker niet afgerond is.
Zo blijkt de gebruikte adsorptiemethode invloed te hebben op de adsorptieresultaten. De mogelijkheid van afwijkingen in
'
"
de adsorptieresultaten ten gevolge van radiolabelingwor-dt aan de orde gesteld in Hoofdstuk 11. Dit gebeurt aan de h a n d van een ver'gelijkend onderzoeli van de adsorptie van gelabeld en ongelabeld eiwit. Vervolgens wordt gelabeld eiwit gekarakteriseerd met behulp van High Performance Liquid Chromatography. (Appendix 11) Ook de vraag of eiwitadsorptie een reversibel proces is, is nog niet bevredigend beantwoord. In Hoofdstuk I 1 1 wordt, rekening houdend met de beperking van de radiolabelingsmethode, nader ingegaan op de reversibiliteit van eiwitadsorptie. In dit Hoofdstuk wordt ook een adsorptie model,
'
,
beschreven.
27
In de Hoofdstukken IV, V, VI en VI1 worden achtereenvolgens adsorptiestudies beschreven waarbij gebruik is gemaakt van alternatieve methoden.
In Hoofdstuk IV worden depletie-
metingen in combinatie met- HPLC beschreven, waarmee de concurrerende adsorptie van HSA, HFb en HIgG aan polystyreen
-
latices is bestudeerd. In Hoofdstuk V wordt de enzym immuno assay methode toegepast in combinatie met radiolabeling van eiwitten. De adsorptie van HSA aan PVC P en S is hier bestudeerd. Hoofdstuk VI behandelt de concurrerende eiwitadsorptie van HFb, HSA en HIgG uit plasma aanPS latices. In dit Hoofdstuk wordt gebruik gemaakt van depletiemetingen in combinatie met HPLC en radiaal immuno diffusie (MANCINI,1965). Tot slot wordt in Hoofdstuk VI1 de mogelijke toepassing van capaciteitsspanningsmetingen beschreven ter bestudering van
de adsorptie van peptiden en eiwitten aan Si0 2.
Het verkrijgen van een beter inzicht in de (concurrerende) adsorptie van HFb, HIgG en HSA aan polystyreen Staat in bijna alle Hoofdstukken van dit proefschrift centraal.
28
REFERENTIES.
B A G N A L LR,. D . ,
J.
B A G N A L LR, . D A . , N N I SJ ,. A . D . , B i o m e d . Mater. R e s . ,
and S H E R L I K E R , 14, 1 (1980).
e n LYMAN, D.,
B A S Z K I NA, . ,
12, 707 (1978).
B i o m e d .M . a t e rR . es.,
J.
Mater.
Biomed.
S.J.,
J.
Res.,
14, 393
(1980). a n d L E O N A R DE,. F A .,SAIO
B E I S S I N G E RR, . L . ,
B E I S S I N G E RR, . L . , a n d L E O N A R DE,. F . , Sci., 85, 521 (1982).
en MILLER,
B O R N Z I NG, . A . ,
J.
C o l l o i d Interface P
J.
I.F.,
160 (1980).
3,
J.,
.
C o l l o i d Inter'face S c i . ,
86, 5'39 (1982). BRASH,
e n L Y M A ND,. J . ,
J.L.,
Biomed.
J.
Mater.
3, 175
Res.,
(1969). B R A S HJ,. L . , e n LYMAN, D.J., i n " C h e n i i s t r y of B i o s l i r f a c e s " p . 177, D e k k e r N , e wY o r k (1971). (M.L. H a i rE d . ) , BRASH,
J.L.,
en DAVI'DSON, V . J . ,
Thrombosis R e s . ,
e n SAMAR, Q.M.,
C o l l o i d Interface
9, 249
(1976). B R A S HJ ,. L . ,
J.
64,
SCi.,
495 (1978).
en UNIYAL, 66, 377 (1979).
B R A S HJ ,. L . ,
Symp. BRASH,
(19811
J.L.,
UNIYAL,
.
S.,
S.,
J.
of Polymer S c i . :
e n C H A NB,. M . C . ,
Eur.
BRYNDA, E . , HOUSKA, M . , POKORNA, Bioeng., 2, 411 (1978).
217
en SCHMITT,
A.,
J.
W., E L L E N SD, . J B .,EUGELING,.TB . , A N T J E SA, . , Soc. A r t ì f .O r g a n s 295 (1982).
BREEMHAAR,
C H A NB,. M . C . ,
5, 475
A r tO . rg.,
BRASH, J . L . , U N I Y A L , S., P U S I N E R IC, . , C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . , 95, 28 (1983).
Proc.
polymer
.
e n BRASH,
J.L.,
e n BRASH,
J.L.
Z.,
e n C E P A L O V AN, . A . ,
J.
J. C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . ,
82,
J., C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . ,
84,
(1981)
C H A NB, . M . C . ,
,
263 (1981).
29
C H U A N GH, . J K .,ING, Med,, 483 (1978). COHEN STUART,
Polymer Sci.:
en M A S O NR,. G , ,
W.F.,
J.
Lab.
Clin.
J.
M.A., S C H E U T J E SJ,. M . H . M . e n F L E E RG, . J . , P o l y m e r P h y s . E d . 58, 559 (1980).
,
C R A N D A L LR, . E . r J.ANATOVA, J , , Biochem., 11, 111 (1981).
en A N D R A D E ,J. . D .
C U Y P E R S . , P . A .H, E R M E N SW , .T., A c a d . S c i . 283, 77 (1977).
e n H E M K E RH, . C .A, n nN. e wY o r k
DB E R U I NH, . G .V, A N I n t e r f a c e Sci,.,
OSS,
Prep.
e n A B S O L O MD, . R , ,
(=.J,,
J.
C o l l o i d
76, 254 (1980).
DILLMAN, W . J . , en MILLER, 4 4 , 221 (1973). D O O L I T T L ER, . F . .", T h Pe l a s m a New Y o r (kF . WP. u t m a n ,
I,F,,, J . C o l l o i d I n t e r f a c e S c i ,
ed.
)
P r o t e i n s 11" A c a d e m i c P r e s s , (1975).
E B E R H A R TR, . C .P, R O K O PL, . D .W , ISSENGER,. T r a n s , A m e r . Soc. A r t i f . M.A.,
Intern.
J . I en W I L K O V , O r g a n s ,V o lX X I I I ,
1 3 1 (1977). E B E R H A R TR, . C L . rY N C HM, . EB , , I L G E- F , . HW ., ISS'INGER, J.F., MUNRO,M,S.ELLSWORTH, S . R., e n Q U A T T R O N EA, . J. A d .C h e m . S e r i e s 199, " B i o m a t e r i a l s : I n t e r f a c i a l P h e n o m e n a and A p p l i c a t i o n "( S . L .C o o p e r e n ' N.A. P e p p a s , E d s , ) p . 293
,
(1982).
, en J A M I E S O NA, . M . , 77, 525 (1980). F A I RB, . D .
F E N S T E R M A K E RC, , , Intern. O r g a n s ,
J.
C o l l o i d Interface Sci.,
e n M O R R I S E YB, . W . ,T r a n sA. m . X X I I , 278 (1976).
Soc.
A r t i f .
Vol,
G E N D R E R U ,R : . M .L, E I N I N G E R , R . 1 , r WIN.TERS, S . , e n JAKOBSEN, R.B., i n A d vC. h e m . Series 199, p . 371 (1982): GORMAN, R.R.
,'
S T O N E RG , .E.
, en
C A T L I NA , .,
J , Phys.
Chem.
,
75, 2103 (1971). H A N S O NS, . R H . , A R K E RL, , A .Rr A T N E RB, . D . , L a b , Clin. M e d , , 95, 289 (1980).
e n HOFFMAN,
A.S.,
J.
HLADY,
V.,
FURDI,
M.,
J.
C o l l o i d Interface Sch.,
6 9 , 460
(19791.
e n HOFMANN, A.S.,. Advances in Chemistry . Series 145 " A p p l i e d C h e m i s t r y a t p r o t e i n I n t e r f a c e s " ( R O E . B a i e rE d . ) p.230 (1975). H O R B E T T ,T. . A . , .
30
H O R B E T TT,. A . ,
of
J.
Mater. R e s . ,
Biomed.
e n W E A T H E R S B YP,. K . , 1 5 , 403 (1981).
H O R B E T TA, . ,
HUNTER,
Nature,
e n C O O P E RS,. L . ,
I H L E N F E L DI ,. V . ,
Res.,
194,. 495 (1962).
Mater.
Biomed.
J.
(l.981).
Mater.
Biomed.
J.
e n G R E E N W O O DF ,. C .
W.M.
15, 673
Res.,
13, 577 (1979).
S.W., e n L E EE, . S . , . 66, 429 (1979).
KIM,
K L E I NC, . P . A . T D . ,G EROOT, G., J . B i o m e d . . ' Mater.. R e s . K L E IE NL H O R S T , S M O L D E R SC, . A . ,
K.,
e n KAMP,
V E R M E I D E NJ,. P . W . ,
14, 705 (1980).
O L T H U I SF ,. M . F . GB. ,A R G E M A ND,. , J. of
J.,
Po1,ymer S y m p .
o f P o l y m e r Sci..:
J.
J.
e n B E R G H E ML,. ,
J O N S S O NU,I. V , A R S S O NB,L. ,U N D S T R O M , I., C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . , 90, 148 (1982).
A r t i f .. O r g a n s ,
en FEIJEN., J&, I n t .
1,
288 (1978). KOCHWA, S . , E . FA. ,n nN.. YA.c a d .
,
L E ER, . G .
L I T W A KR, . S R . , O S E N F I E L DR, . E . , S c i . , 283, 37 (1977).
e n KIM,
J.
S .W.,
Biomed.
e n LEONARD, .
Mater. r e s . ,
8, ,251
(1974). LEMM, (G.D.
e n UNGER, V . , Winter, J . L L . erey
i n " E v a l u a t i o n of B i o m a t e r i a l s " , e n K. de G r o o t ) p . 505 (1980).
W.,
MAC M I L L I N C , . R.', e n WALTON, rA.G., S c i . , 48, 345 (1974). MAC R I T C H I E ,
F.,
Adv.
Prottein Chem.,
8.
M I Z U T A N IT, . ,
J.
t
C o l l o i d Interface
32, 283 (1978).
e n H E R E M A N SJ .,F . . ,
M A N C I WG IC ,. ,A R B O N A R A A,. D . ,
2, 235 (1965')~.
J.
.
Immunochem
.
..
1
C o l l o i d Interface Sci.,
82, 162 (1980).
M O R R I S E Y , B.W.:, S M I T H. L, . EF. ,E N S T E R M A K E RC,. AS. ,T R O M B E R G , R.R., e n G R A N TW, . H . , N a t i o n a lB u r e a u of Standards S p e c i a l
P u b l i c a t i o n s 415
" P r o t e i n s a t I n t e r f a c e s " , commun. Wageningen 76-6 (1976).
NORDE, W . , AgricU . niv.
Proefschr.ift
W., (1978).
e n LYKLEMA,
NORDE,
ORESKES,
.
(1974)
J.,
J.
C o l l o i d :1 n . t e r f a . c e
Sci.
66, 285.
. I.,
en S I N G E R ,
J.M.,
J.
Immun.,
'
86, 338 (1961).
. .
,
.
31
G. , P R I E L , Z . , en S I L B E R B E R GA, . , I n t e r f a c e Sci, 8 0 , 437 ( 1 9 8 1 ) .
J.
PENNERS,
P E T E R S T, . , "The P l a s m a P r o t e i n s (F.W. Putinan E d . () 1 9 7 5 ) .
r NAKAMURA, M., ROOHK, B.V. B A R T L E T T , R.H., Trans. XXIII, 1 5 2 ( 1 9 7 7 ) .
S C H M I T TA, V . , A R O Q U IR, U .,NIYAL, C o l l o L d Interface . S c i .
H I L LR, . L .H, U N G , E .K., en A r t i f . Intern. O r g a n s ;
92,
S., P U S I N E R IC, . , 25 ( 1 9 8 3 ) .
S O D E R Q U I S TM , .E., e n WALTON, Sci., 75, 386 ( 1 9 7 9 ) . STENBERG,
M.
, A R W I NH, , ,
Interface Sci., SUZAWA,
T.,
72,
SHIRAMA,
Interface Sci., U N I Y A L , ,S.,
86,
BRASH,
Series 199, p.277 VAN DULM, P., 248 ( 1 9 8 3 )
.
255
(1982).
Am. S o c .
J. P o l y m e r S c i .
S I L B E R B E R GA, . ,
I", A c a d e m i c Press N e w York
Series 1 9 9 p.9
R A T N E RB, , D .A, d vC. h e m .
Colloid
393 ( 1 9 7 0 )
C30,
en NILSSON, (1979).
J.
.
C o l l o i d Interface
J.
A.G.,
vol.
A.,
H,, en FUJIMOTO, 144 ( 1 9 8 2 ) .
J.
T.
,
Colloid
J.
Colloid
J.L., e n D E G T E R E VI ,. A A . , d vC. h e m . . (1982).
e n NORDE,
W.,
J.
Interface Sci.,
Colloid
,
V A ND E RS C H E E RA, . Proefschrift " A d s o r p t i o n of P r o t e i n s " K r i p sR e p r o B.V. Meppel ( 1 9 7 8 ) . VAN D ES RC H E E RA, S. ,M O L D E R SC, . A . , 63, 7 ( 1 9 7 8 ) .
Plasma
C o l l o i d Interf.
J.
91,
Sci.,
J.,
VAN DES RC H E E R , A., F E I J E N J., K L E I N ELHORST KRUGERS D A G N E A U XP,. G . L . C . e n S M O L D E R SC,. A . , C o l l o i d Interface Sci., 66, 136 ( 1 9 7 8 ) .
J.
en ZING,
VAN O S S , C.J., ABSOLOM, D.R., NEUMANN, A.W., B i o c h i mB . i o p h y sA . cta, 6 7 0 , 6 4 (1981).
VAN WAGENEN, R . A . , ZSADIUK, C o a t i n g s and P l a s t i c C h e m . ,
B.J., 42,
VAN WAGENEN, R.A., ROCKHOLD, S., C h e m . Series 1 9 9 , 3 5 1 ( 1 9 8 2 ) .
32
I
W.#
en ANDRADE, J . D . O , rganic 749
(1980)
.
e n A N D R A D EJ,. D .A, d v .
.
WALTON,
72,
265
e n M A E N P AF, . C . , (1979).
A.G.,
W A L T O NA,. G . , (1982).
J.
e n K O L T I S K OB, .A, d vC. h e m .
YOUNG, B . RL. ,A M B R E C H T , L.K., A d vC. h e m . S e r i e s , 1.99, p.317 ZUCKER, M.B., VROMAN, (1969).
C o l l o i d Interface SCi.
L.,
COOPER, (1982).
Proc.
Soc.
,
S e r i e s 199, p.245
S.L.,
e n MOSHER,
E x p e r .B i o l .
Med.,
.
B.F.,
131,
20
33
HOOFDSTUK I1 AFWIJKEND ADSORPTIEGEDRAG VAN EIWITTEN TEN GEVOLGE VAN KET GEBRUIK VAN LABELINGSTECHNIEKEN EN/OF VAN ONGEZUIVERD EIWIT. I
11.1.
.
Inleiding
Het radiolabelen van eiwitten wordt al vele jaren toegepast voor eiwi,t adsorptiestudies. Ter verkrijging van zinvolie, betrouwbare resultaten moet voldaan worden aan een aantal'voorwaarden, verbonden aan het gebruik van radioactief gelabelde eiwitten.
dient de eiwitoplossing homogeen
Zo
en monodispers te zijn. Na het labelingsproces mag geen' ongebonden radioisotoop in de eiwitoplossing achterblijven. De labeling behoort eenduidig en gelijkmatig te zijnen het ..
adsorptiegedrag van het gelabelde eiwit moet identiek zijn aan het adsorptiegedrag van het niet gelabeldeeiwit. Wanneer aan deze voorwaarden is voldaan, dan is het radiolabelen van eiwitten een elegante methode om kwantitatief de adsorptie van eiwitten te bestuderen aan kleine oppervlakken. Ook kan, gebruikmakend van verschillende specifieke labels,'c-oncurrerende eiwitadsorptie gelijktijdig en kwantitatiefwordenbestudeerd.
.
In de meeste eiwit adsorptiestudies wordt impliciet aangenomen dat aan bovenstaande voorwaarden is voldaan. Zo r e - , fereren R.G.
GREIG!,en D.E.
BROOKS (1981) een aantal adsorp-
tiestudies waarbij zonder meer aangenomen is 'dat de gebruikte eiwitoplossingen homogeen en monodispers zijn. Echter eiwitpreparaten bevatten vaak dimeren.en olig~meren. Bovendien blijkt de ' h e t e r o g e n i t e i t & d i k w i, j. l s nog toe te nemen tijdens de bewerkingen noodzakelijk voor eiwitadsorptiestudies (JANATOVA en ANDRADE,
1980l,.,
Dat het adsorptiegedrag van gelabeld,en niet gelabeld eiwit niet altijd identiek hoeft te zijn is aangetoond door GRANT (19771, V.D.
SCHEER (1978), en KLEIN,E L H O R S T (1978). Dit in .
I
tegenstelling tot CHUANG (19781, P.ENNERS (198.11, V. O S S (19811, BORNZIN (19821, SCHMITT (19831,en V. DULM (19831,
d a t e r g e e nv e r s c h i li na d s o r p t i e g e -
d i e h e tb e w e z e na c h t e n
d r a gb e s t a a tt u s s e ng e l a b e l d ee nn i e t C R A N D A L L e n ANDRADE
gelabelde eiwitten.
( 1 9 8 1 ) h e b b e na a n g e t o o n d
i n gd r a s t i s c h ev e r a n d e r i n g e no p t r e d e ni n
d a t door label-
h e t chromatogra-
BSA e nw a a r s c h u w e nv o o r
f i s c he ne l e c t r o f o r e t i s c hg e d r a gv a n
h e t g e b r u i kv a nr a d i o l a b e l i n gi na d s o r p t i e s t u d i e s .
I n d i t H o o f d s t u kw o r d th e tb e l a n gv a n
de karakterisering
d e plasma e i w i t t e nm e n s e l i j ka l b u m i n e ,
e nz u i v e r i n gv a n
s e l i j k f i b r i n o g e e ne nm e n s e l i j k
men-
immuno gamma g l o b u l i n ea a n -
g e g e v e n met b e t r e k k i n g t o t d e a d s o r p t i e a a n v a s t e o p p e r v l a k -
met g e b r u i k m a k i n gv a ng e z u i v e r d e
k e n .V e r v o l g e n sw o r d t
e i w i t t e n d e i n v l o e dv a nr a d i o l a b e l i n gv a nd e z ee i w i t t e n h e ta d s o r p t i e g e d r a gb e s t u d e e r d .
D i t g e b e u r ta a n
van g e l a b e l de nn i e t
g e l i j k t i j d i g eb e p a l i n gv a nd ea d s o r p t i e g e l a b e l d e i w i t a a np o l y s t y r e e n - l a t e x . r e s u l t a t e nz a ln a d e ri n g e g a a nw o r d e n
op
d e h a n dv a n
Aan d e h a n dv a nd e z e
o p b o v e n s t a a n d ec o n -
troverse.
11.2.
Experimenteel
Materialen
Menselijk s e r u m a l b u m i n e kristallijn,
n r .A 9 5 1 1 ) .
MW=6,6x10
4
)
(Human S e r u mA l b u m i n ,
HSA;
w a s a f k o m s t i g v a n Sigma,
USA ( L o t
H e t o p g e g e v e n e i w i t g e h a l t e bedroeg 98% (ge-
wichtsprocenten,
gew. % ) .
Menselijk f i b r i n o g e e n ( H u m a n F i b r i n o g e n , H F b ; k r i s t a l 5 l i j n , MW=3,4x10 ) w a s a f k o m s t i g van K a b i , Z w e d e n en had de v o l g e n d e s a m e n s t e l l i n g 38;s g e w . % HFb, acetaat en l 5 , 4
gew.%
Natrium-chloride
46 gew.8
.
Menselijk immuno gamma g l o b u l i n e (HumanImmuno
-
lin,
HIgG,
k r i s t a l l i j n MW=1,6x103)
Cen,traal L a b o r a t o r i u m v a n
natrium-
gamnna Globu-
was a f k o m s t i g van het
de B l o e d t r a n s f u s i e d i e n s t .
Het to-
t a l e eiwitgehalte b e d r o e g 7 4 % b e p a a l d i n d i t l a b o r a t o r i u m m e t b e h u l p van HPLC. komstig van KABI,
Ook i s gebruik gemaakt van H I g G af-
AB S t o c k h o l m ,
Zweden.
H l g G i s i n b e i d e ge-
v a l l e n b e r e i d u i t de C o h n f r a c t i e s I1 e n III door precipitatie u i t alcohol,
36
H e t totale eiwitgehalte van HIgG
( K a b i )b e d r o e g
9 5 g e w . %w a a r v a n
9 8 gew.%HIgG,
D e e i w i t t e nz i j ng e k a r a k t e r i s e e r d ,g e z u i v s r de nw e d e r o m
g e k a r a k t e r i s - e e r dv o o rg e b r u i k( z i ev e r d e r o po n d e rr e s u l t a ten). A l l e e x p e r i m e n t e nz i j nu i t g e v o e r di nf o s f a a tg e b u f f e r d e
z o u t o p l o s s i n g e n( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n s , die b e r e i d z i j n d o o r
een o p l o s s i n g v a n
0,Ol M N a H PO .
N a C l t o e t e v o ' e g e na a ne e no p l o s s i n gv a n
e n ' O , 15 M N a C l t o t e e n
PBS),
0 , O l N N a O H e n O , 15 M
pH v a n 7,35 is b e r e i k t .
2 4 De gebruikte
c h e m i c a l i ë nw a r e na n a l y t i s c hz u i v e r .
De polystyreen latex ( P S - l a t e x ) was a f k o m s t i gv a n (Dow u n i f o r m l a t e x p a r t i c l e s n o t j e s d i a m e t e r was 3 9 9 nm
t
41932).
SERVA
D e opgegeven deel-
10 nm. D i t i s g e v e r i f i e e r d m e t b e -
h u l pv a ne e ns c a n n i n ge l e c t r o n e nm i c r o s c o o p .
De electro-
de l a t e x d e e l t j e sw e r dg e m e t e nb i j
f o r e t i s c h em o b i l i t e i tv a n 2 O o C e n . e e n pH v a n 7,35
i ne e n
P B S b u f f e r m e t e e n Rank
B r o t h e r s Mark I1 m i c r o - e l e c t r o f o r e s ea p p a r a t u u r
(de bereken-
d ez ê t ap o t e n t i a a l
i s -'2OmV). H e t s p e c i f i e k e o p p e r v l a k ' v a n 2 -1 d e P S - l a t e x is 1,43 m m l g e b a s e e r d op e e nv a s t es t o f -3 p e r c e n t a g ev a n 1 0 % e ne e nd i c h t h e i dv a n 1,05 gcm v o o r PS.
11.3.
M e t h o d e ne nv o o r s c h r i f t e n
Concentr2tiebepaling D e e l w i t c o n c e n t k a t i e sz i j nr o u t i n e m a t i gb e p a a l dd o o rh e t
m e t e nv a n
de e x t i n c t i e b i j
2 8 0 'nm.
H i e r b i j i s g e b r u i kg e -
m a a k tv a ne x t i n c t i e c o ë f f i c i ë n t e n( d ee x t i n c t i ev a n e i w i t o p l o s s i n g e ni ne e n
l c m k w a r t s c u v e tb i j
b e p a a l dz i j nd o o rv e r d u n n i n g s r e e k s e n c o n c e n t r a t i e s .F i g u u r HIgG,
l g1 2 8 0 nm),
Op b a s i sv a nd e z eg r a f i e kz i j n
die
m e t bekende eiwit-
1 g e e f td ei j k l i j n e nv o o r
t e nr e s p e c t i e v e l i j k eb e p a a l d
-1
HSA,
HFb e n
de e x t i n c t i e c 0 ë f f i c i ë n ' -
op 0,53 voor HSA;
1,40 v o o r
H I g G e n 1,55 voor HFb.
L a b e l ì n g van e i w i t t e n D e e i w i t t e nz i j ng e l a b e l d
m e t I 125 a f k o m s t i vg a n
.37
eiwitconcentratie (g[-')
.
HPb ( A 1 v o o r de b e p a l i n g v a n e x t i n c t i e c o ë f f i c i ë n t e n .
Amersham,Engeland
. . ( I M S 3 0 ) g e b r u i k m a k e n dv a nd ec h l o o r -
. e z em e t h o d e amine T methodeD
i s o n t w i k k e l dd o o r
( 1 9 6 2 ) e n ' l a t e re n i g s z i n sg e w i j z i g dd o o r (1978).
H e t p r i n c i p e i s a l s v o l g t :c h l o o r a m i n e
o x y d a t i e m i d d e ld a t
het
HUNTER
K L E I N ELHORST
T is een
j o d i d e ,b e s c h i k b a a ra l sn a t r i u m z o u t ,
o x y d e e r tt o tj o d i u m .H i e r b i jw o r d ta a n g e n o m e nd a tv e r v o l g e n s d e o r t h o p l a a t sv a n
s u b s t i t u t i ep l a a t s v i n d td . m . v . , 1 2o p p h e n o l r i n gi nh e , ta m i n o z u u r. t y r o s i n e , d ee i w i t m o l e c u l e n .V o o r t sw o r d t
I
.
de
d a t d e e l u i t m a a k tv a n
aa.ngenomen d a t s l e c h t s @ e n
j o d i u m a t o o r n . p e re i w i t m o l ~ e c . u l e w o r d t i n g e v o e r d . i s 11s v o 1 g . t a: a n 5 m l eiwitoplossing (bij-1 voorbeeld 1 g1 HSA) wordt 50 pl. NaI, w a a r i n 5 à 10 1-11 D e procedure
r a d i o a c t i e f Na1 v a n Amers'ham a a n w e z i g i s met e e n a c t i v i t e i t van 1 0 0 0 v C i ,
toegevoegd.
D e i n d e o p l o s s i n ga a n w e z i g e
h o e v e e l h e d e n e i w i t e nj o d i d ez i j ne q u i m o l a i r .
D e sub-
s t i t u t i e r e a c t i ew o r d tv e r v o l g e n sg e s t a r td o o r -1 c h l o o r a m i n e T ( 2 g tl o e t e v o e g e ana n
50
n a 5 m i n u t e nw o r d t
38
p1
de eiwitoplossing;
d e o x y d a t i e r e a c t i e g e s t o p td o o r
toevoeging van een overmaat reducerend agens (50 bisulfiet met een concentratie van 2gl-1).
p 1 natrium
Alle com-
ponenten zijn opgelost'in PBS bufferpH 7,35 bij 2 0 '
C. Na
de labeling wordt het labelingspercentage bepaald met behulp van dunne laag'chromatografie (STERN1965). Hierbij wordt een druppeltje van het reactiemengsel aangebracht op aluminiumfolie bedekt met een dunne laag cellulose-acetaat t
(MERCK no. 5574/0025).
Als eluens wordt een methanol-water
oplossing '(85%-15%) gebruikt. Op deze wijze wordt vrij jodide gescheiden van aan eiwit gebondenjodium. Door de aluminiumfolie in stukken te knippen en vervolgens de radioactiviteit te bepalen in een COBAS gamma-teller kan het percentage gebonden jodium worden berekend. Dit percentage kan bij de chlooramine T methode variëren van 75% tot 85%. Wanneer aangenomen wordt dat slechts 1 jodium atoom per eiwitmolecule is ingebouwd en dat de labelingsreaktie voor radioactief jodium ( I125 1 niet verschilt met de 127 labelingsreactie van niet radioactief jodium ( I ) , dan kan '
gesteld worden, dat van de gezuiverde eiwitoplossing na labeling 75-85% v.an het eiwit gelabeld is met jodium endat daarvan slechts 0,028 gelabeld is met radioactief jodium. Het .reactiemengsel kan op twee manieren gezuiverd worden va.n chlooramine T, natriumbisulfiet en vrij jod,ide. Dit kan door gedurende 16 uur bij 2 0 ° C de eiwitoplossing t e dialyseren
I
tegen PBS buffer of door te elueren over een GPC kolom (G25, PD-10 Pharmacia Fine Chemicals). Deze laatste methode heeft. als voordeel dat d e eiwitoplossingen binnen enkele minuten gezuiverd kunnen worden van de verontreinigingen. Dit komt de stabiliteit van de eiwitoplossing tengoede. Na de zuiveringsstap is wederom met behulp van dunne laag, chromatografie het percentage vrij jodide bepaald. Dit varieerde van 0.2
,
tot 1%.
Na 1 week zijn de gelabelde eiwitoplossingen opnieuw gecontroleerd op aanwezigheid van vrijjodide. met be,hulp van dunne laag chromatografie., Er kon geen toename van vrij jodide worden aangetoond,. Alle experimenten zijn uitgevoerd binne.n 5 dagen na
39
l a b e l i n g met g e z u i v e r d ee i w i t o p l o s s i n g e nw a a r i n
1-10%
g e l a b e l d e i w i t ( u i t 7 5 - 8 5 %v e r k r e g e nd o o rv e r d u n n i n g ) .
A d s o r p t i ev a ne i w i t t e n D e a d s o r p t i ev a n
d e g e z u i v e r d ee i w i t t e n
HSA,
HIgG e n HPb
i s b e s t u d e e r d met d ed e p l e t i e t e c h n i e k .D e z em e t h o d e
bestaat
u i t h e t m e t e n v a nd ee i w i t c o n c e n t r a t i ev o o re nn at o e v o e g e n PS-latex
v a ne e nb e k e n d eh o e v e e l h e i d
a a ne e ne i w i t o p l o s s i n g .
T e r v e r k r i j g i n gv a nb e t r o u w b a r er e s u l t a t e nz i j n
c o n c e n t r a t i e sl a t e xe n o n g e v e e r 2 . 5 % v a nh e t
de
e i w i t meestal z o d a n i gg e k o z e n ,
i n o p l o s s i n ga a n w e z i g e
dat
eiwit a d s o r -
b e e r t a a nd el a t e x .P S - l a t e xe ne i w i t t e nz i j nv o o r a fg e s u s p e n d e e r di n
PBS b u f f e r pH 7 , 3 5b i j
Na t o e v o e g i n gv a n
e . e nt e m p e r a t u u rv a n
20°
p 1 P S - l a t e xo p l o s s i n ga a n
10-200
2-3ml
e i w i t o p l o s s i n g ,w o r d th e tg e h e e la fe nt o eg e s c h u dt o t v e r e i s t ea d s o r p t i e t i j d
is bereikt.
de
Dan w o r d th e tm e n g s e lg e RC-2B c e n t r i f u g e g e -
c e n t r i f u g e e r di ne e nS o r v a l lS u p e r s p e e d d u r e n d e1 5m i n u t e n( v e r s n e l l i n g
C.
20.000
g).
~e i n i t i z l e e i w i t c o n c e n t r a t i e s v a n d e o p l o s s i n g e n v a n d e t w e e m a n i e r e n be-
h e l d e r e b o v e n s t a a n d eo p l o s s i n gw o r d e no p
paald.
H i e r b i j w o r d tr e k e n i n gg e h o u d e n
o p l o s s i n g e nt e ng e v o l g ev a n
m e t v e r d u n n i n gv a n
de t o e v o e g i n gv a nP S - l a t e x .
de De
eiwitconcentratiewordtbepaalddoor .-
m e t i n gv a n
de r a d i o a c t i v i t e i t i n
Cobas gamma-teller
-
de o p l o s s i n g m e t e e n
of door
UV s p e c t r o s c o p i e b i j 2 8 0 nm,
U i t de v e r a n d e r i n g i n e i w i t c o n c e n t r a t i e v e r o o r z . a a k t d o o r
adsorptieaan
de P S - l a t e x
e nh e t. b e k e n d e
l a t e x o p p e r v l a k kan
d e geadsorbeerde h o e v e e l h e i d e i w i t p e r o p p e r v l a k t e e e n h e i d
w o r d e nb e r e k e n d . I ng e v a l l e n werd,
w a a r b i j g e e nh e l d e r es u p e r n a t a n tv e r k r e g e n
i s de b o v e n s t a a n d e o p l o s s i n g
g e f i l t r e e r d d o o re e n
Millipore cellulose-acetaat filter (Poriediameter B i j
f i l t r a t i e v a n d e h e l d e r e s u p e r n a t a n t e nk o ng e e n
teerbare v e r m i n d e r i n g i n
O , 2 .pm).
detec-
d e eiwitconcentratie.worden waarge-
nomen. Door op t w e e m a n i e r e n d e e i w i t c o n c e n t r a t i e te'bepalen k a n
40
gelijktijdig de adsorptie van gelabeld en niet gelabeld eiwit
aan
PS-latex
worden
gevolgd i’n dezelfde oplossing on-
der exact dezelfde omstandigheden. 11.4.
Resultaten
K a r a k t e r i s e r i n g en z u i v e r i n g v a n d e e i w i t t e n
Voor gebru,ik zijn de eiwitten gekarakteriseerd en gezuiverd. Ter karakterisering van HSA, HIgG en HFb is gebruik gemaakt
van H P L C (High
Performance
Liquid
.Chromatography) ,
Polyacrylamide gel electroforese en immuno-electroforese. HIgG is bovendien nog gekarakteriseerdm e t iso-electrische focusering. Uit de karakterisering van HSA,HFb en bleek
dat
deze
eiwitten
voor
gebruik
gezuiverd
HIgG moesten wor-
den. Dit is gebeurd met Sepharose 6 B chromatografie.
K a r a k t e r i s e r i n g m e t HPLC Gebruik is gemaakt van een Waters Associates
chromatograaf gekoppeld aan eenU V spectrofotometer ( U V Cord, LKB) voorzien van een micro doorstroomcel., De HPLC kolom waarvan gebruik is gemaakt is een TSK-GEL SW 3 0 0 0 kolom afkomstig van VARIAN. Deze kolom bevat een poreuzegel met hydrofiele deeltjes (diameter 10
pm) gestapeld in
gedistilleerd water; de kolom is speciaal vervaardigd voor eiwitscheidingen. Het HPLC chromatogram van ongezuiverdH S A laat 3 pieken zien (Figuur 2A), die kunnen worden toegeschreven aan HSA
.
:.
monomeer (l), HSA dimeer (l’) en HSA trimeer (l”). Een hoe,veelheid van ongeveer 14% dimeer is aanwezig en minder dan 1% trimeer is gedetecteerd (berekend0.p basis van de piekoppervlakken). Na zuivering is nog slechts een kleine.hoeveelheid dimeer aanwezig (Figuur 2B). Ook HIgG (Kabi) en BIgG (CLB) bevatten hoogmoleculaire componenten. Na sepharose 6 B chromatografie bevat HIgG (Kabi) nog steeds meer hoogmoleculair materiaal dan HIgG ( C L B ) HFb kan met HPLC niet gescheiden worden in meerdere componenten, dit wil echter nog niet zeggen dat de H F b oplossing
geen andere Componenten bevat dan HPb
41
monomeer. Echter met de T S K gel SW kolommen is het, niet mogelijk HPb te scheiden van hoogmoleculaire aggregaten.
1"
L O
2
elutietijd (min.)
Figuur 2
4
6
O
2
4
6
elutietijd (min.) BPLC chromatogram v a n n i e t gezuiverd. HSA (Figuur A ) , monomeer (L') r d i m e e r (1'' 1 , t r i m e e r ( 1 ' " ) r en E S A n a S e p h a r o s e 6 B z u i v e r i n g (Figuur B).
K a r a k t e r i s e r i n g m e t polyacrylamide g e l e l e c t r o f o r e s e
HSA is gekarakteriseerd met behulp van disc-electroforese o p een polyacryl amide gel. Naast vorm en grootte van het
molecuul, zoals bij HPLCr speelt hier ook de lading van het eiwit een belangrijke rol bij de scheiding tussen monomeer en eventueel aanwezige dimeren. Met deze karakteriseringsmethode konden na eiwitkleuring 3 eiwitbandjes gedetecteerd HSA worden die o p grond van hun plaats'correspdnderen met
42
monomeer, HSA dimeer en HSA trimeer. Polyacryl amide gel electroforese van. HFb leverde o o k hie.r slechts één band o p .
'
Het HIgG preparaat bevatte een groot aantal componenten zichtbaar in een groot aantal bandjes, .dit in tegenstelling tot het HPLC chromatogram (Figuur 3 ) dat slechts 2 extra componenten aangaf. A
v)
Iz
Q v)
P L
O
Figuur 3
HPLC .chromatogrammen van gezuiverd HIgG Kabi. (Figuur A ) en gezuiverd HIgG, CLB (Figuur B )
Karakterisering met is0 e.lectrische focusering
HIgG is bovendien gekarakteriseerd met behulp van iso-electrische focusering (RIGNETTI en DRYSDALE) waarbij over het electroforesemedium een pH-gradiënt is aangelegd, waardoor een scherpe concentrering (foc'usering) van el'k eiwit o p zijn iso-electrisch punt plaatsvindt. HIgG .(CLB)
43
bevat eiwitcomponenten met iso-electrische punten in het lage pH traject (5,2
pH
<
terwijl HIgG (Kabi) geen
7,0),
componenten bevat met een 1 . E . P
<
pH 7.0
(Figuur 3 * ) .
i4
3.50 4.55
"1 i 5.8 5
PH
6.55 6.85 735 -
-s. %ìW. I& d . .. .. . . . -. . . . . . . . . .
* .
i
,
C Figuur '3
A
B
Iso-electrische focusering resultaten A. H I g G (Kabi) B. H I g G (CLB) C. Calibratie k i t p H 3-10 van Hoechst.
Immuno e l e c t r o f o r e s e
Door karakterisering met immuno electroforese (GRBBAR, 19531, waarbij gebruik gemaakt werd van konijnen anti-mense-
lijk serum kon bij zowelH S A , HEb als HIgG geen ander eiwit worden aangetoond.
44
3 ' 5
10
15
20 I
10
15
20
l0
15
20
elutietijd (uren),
5
elutietijd (uren)
C
rn
c O
Q
rn
"
5
elutietijd (uren) Figuur 4 Elutiepatronen van MSA ( A ) , HFb ( a ) en HIgG ( C ) na Sepharose 6 B kolomchromatografie.
45
Z u i v e r i n g van e i w i t t e n e n H P b z i j ng e z u i v e r d ,g e b r u i k m a k e n dv a ng e l -
HSAH I IgG
f i l t r a t i e . D e z em e t h o d e
was o o r s p r o n k e l i j ka l l e e nb e d o e l d
v o o rz u i v e r i n gv a n
w a a r d o o r met b e h u l pv a nS e p h a r o s e
HFb,
6B
c h r o m a t o g r a f i e d e i n H F b a a n w e z i g eh o o g m o l e c u l a i r e com.6 ( M W = l O ) k o nw o r d e nv e r w i j d e c d (VISSER, 1979). Deze
ponent
m e t h o d e b l e e k l a t e r o o kg e s c h i k t
d i m e e r e n m o n o m e e r( F i g u u r
2B).
d e e x t r ac o m p o n e n t e ni nd e
om o pd e z ew i j z e
v o l l e d i g t e v e r w i j d e r e n( F i g u u r e l u t i e p a t r o n e nv a n
HSA,
d e HPb o p l o s s i n g b l i j k t
3B).
H F b ' e n HIgG.
b r u i k t als e l u t i e b u f f e rb i j
HIgG o p l o s s i n g
Figuur 4 t o o n t de PBS
(pH 7 , 3 5 1
w e r dg e -
2OOC. U i t h e t e l u t i e p a t r o o n v a n
d a t ook h i e r i n h o o g m o l e c u l a i r e N a z u i v e r i n gv a n
c o m p o n e n t e na a n w e z i gz i j n .
H P b b l e e kd e
e i w i t a a n z i e n l i j k t e z i j nt o e g e n o m e n .
s t a b i l i t e i tv a nh e t monomeer
om H S A t e z u i v e r e nv a n H e t was e c h t e rn i e tm o g e l i j k
De
e n dimeer f r a c t i e s v a n H S A z i j nv e r z a m e l de n
a f z o n d e r l i j kg e k a r a k t e r i s e e r d , o p n i e u wg e k a r a k t e r i s e e r d .
fracties
Na 3 d a g e nz i j nd e z e
H e t H P L C c h r o m a t o g r a mv a n
HSB
dimeer b l e e k n a 3 d a g e nn i e tv e r a n d e r d ,w a a r d o o r
monomeeren
e r g e e ns n e el v e n w i c h bt e s t a a t
g e c o n c l u d e e r dk a nw o r d e nd a t t u s s e n monomerend , imeren Ook n a h e t l a b e l e nv a n
.
o f e v e n t u e l eo l i g o m e r e n . de g e z u i v e r d ee i w i t t e nk o n
HPLC, immuno e l e c t r o f o r e s e . e n p o l y a c r p l a , m i d e
met
gel e l e c t r o f o r e -
s e g e e nv e r a n d e r i n gt e ng e v o l g ev a nl a b e l i n gi n
de e i w i t o p -
l o s s i n g e nw o r d e nw a a r g e n o m e n .
Biwitadsorptie D e a d s o r p t i ev a ng e z u i v e r d e
w i t t e n HSA, v a n de t i j d . reikt,
gelabelde e n n i e t
HIgG e n H F b aan P S - l a t e x
d i e na
B i n n e n 1 5 m i n u t e n w e r d e e np l a t e a u w a a r d e
d.m.v.
gelabelde eiwitten
UV S p e C t r O S C O p i S
g e v e ni nF i g u u r t h e r m e nv e r k r e g e n
46
ook de a d s o r p t i e i s o t h e r m e n (HSA,
zowelRadioactivfteitsmetingen
b e h u l pv a n
be-
20 u u r n i e t v e r a n d e r d w a s .
Behalve de s n e l h e i d s c u r v e s z i j n
v a ng e z u i v e r d e
gelabelde e i -
i s gemeten als f u n c t i e
5-7.
(uv), D e
HPb e n KIgG)
bepaald
(RAD) als metingen m e t
i s o t h e r m e nz i j n
In a l l e g e v a l l e n v e r s c h i l d e n
weerge-
de i s o -
d o o r radioactiviteitsmetinqen a a n z f e n l i j k
0,4-
O
2
4
6
8
10
HSA concentratie (91-')
Figuur 5
-
A d s o r p t i ei s o t h e r m e nv a n HSA' " ( 3 % g ' e l a b e l d ,d er e s t ..,vanhe't e i w i t i s o n g e l a b e l d ) aan e e n PS-latex n a l : ' uur a d s o r p t i eg e b r u i k m a k e n a. v a n UV s p e d t r o s c o p i e ( O ) e nv a nr a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n g e ' n [O).
47
L
1
1
I
I
I
4
2
6
HFb concentratie(91-’)
Figuur 7
A d s o r p t i ei s o t h e r m e nv a np a r t i e e lg e l a b e l d HFb a a n 4 u u ra d s o r p t i eg e b r u i k m a k e n dv a n e e n . P S - l a t e xn a UV s p e c t r o s c o p i e ( ,&) e n v a n r a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n g e n . H e t HFb b e v a t t e v o o r a d s o r p t i e r e s p e c ), t i e v e l i j k 8% ( 1,6% (O) en 0,8% ( A ) gelabeld e i w i t .
m e t b e h u l pv a nU V . s p e c t r o s c o p i e .
v a n de i s o t h e r m e n v e r k r e g e n
T e r w i j l de RAD i s o t h e r m e n g e e n p l a t e a u w a a r d e n b e r e i k t e n b i j
e i w i t c o n c e n t r a e i e si no p l o s s i n gv a r i ë r e n dv a n werden w e l p l a t e a u w a a r d e nb e r e i k t Figuur 8 l a a t z i e n d a t ,
0-8
q1
-1
a l s UV s p e c t r o s c o p i e w o r d t g e b r u i k t
voor de e i w i t c o n c e n t r a t i e b e p a l i n g ,d e z e l f d ea d s o r p t i e
t h e r m e nv e r k r e g e nw o r d e nv o o r ’
7 8 % g e l a b e l d HFb
t o t a l e HFb o p l o s s i n g v o o r a f d e r g a a n )e nn i e tg e l a b e l d g e l a b e l d ee i w i t o p l o s s i n g e n
iso-
( w a a r b i jd e
de l a b e l i n g s p r o c e d u r e h e e f t o n -
HFb.
N o r m a a lg e s p r o k e ng e l d tv o o r
d a t slechts 3-108 v a nh e to p g e -
l o s t e e i w i t de l a b e l i n g s p r o c e d u r e h e e f t o n d e r g a a n F i g u u r 9 t o o n ta d s o r p t i ei s o t h e r m e n PS-latex,
waarbijdetotale
.
( R A D e n UV) v a n HFb a a n
HFb o p l o s s i n g v o o r a f d e
la-
b e l i n g s p r o c e d u r e heeft , o n d e r g a a n ( 7 8 % g e l a b e l d e i w i t ) . g e v a l, k a ng e c o n s t a t e e r dw o r d e n
,
In d i t
dat g e e n s i g n i f i c a n t v e r s c h i l
w a a r n e e m b a a r is t u s s e n de RAD i s o t h e r m e n
48
I
voor UV i s o t h e r m e n .
de UV i s o t h e r m ,
D i t
l
HFb concentratie (91-')
Figuur 8
A d s o r p t i ei s o t h e r m e nb e p a a l d met b e h u l pv a n alléén U V s p e c t r o s c o p i ev a n 7 8 % g e l a b e l d HFb ( A ) , w a a r HFb d e l a b e l b i j a l h e t i n d eo p l o s s i n ga a n w e z i g e e n n i e tg e l a b e l d i n g s p r o c e d u r eh e e f to n d e r g a a n HFb ( V 1. A d s o r p t i e t i j d l u u r .
A
A
A A
A A
A
925
1
I
0,50
0.75
I
1.00
HFb concentratie (91-') Figuur 9
A d s o r p t i ei s o t h e r m e nv a n HFb d a t voor 7 8 % g e l a b e l d is ( a l h e t i n d e o p l o s s i n g a a n w e z i g e HFb h e e f t d e l a b e l i n g s p r o c e d u r , eo n d e r g a a n ) na 1. u u r a d s o r p t i e UV s p e c t r o s c o p i e a a nP S - l a t e xg e b r u i k m a k e n dv a n ( A ) e nv a nr a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n g e n (A).
49
g e l d t ook v o o r H S A e n H I g G i s o t h e r m e n . D a t nietalleenradiolabeling
l e i d t tot v e r s c h i l l e n in
a d s o r p t i e i s o t h e r m e n w o r d t d u i d e l i j k in Figuur 10, ~e H I g G (CLB) b e r e i k t een p l a t e a u w a a r d e -2 l a g e e i w i t c o n c e n t r a t i ei n d e o p l o s s i n g ( 0 , 4 Ugcm b i j
a d s o r p t i e i s o t h e r mv o o r
gl-l),
t e r w i j l d e i s o t h e r mv a n
HIgG ( K a b i ) n o gh e l e m a a l b i j d e z ee i w i t c o n c e n t r a t i e .
g e e np l a t e a u w a a r d eh e e f tb e r e i k t
d e v o o r b e h a n d e l i n gv a nd e z e
K e n n e l i j kz i j nv e r s c h i l l e ni n
e i w i t t e nv e r a n t w o o r d e l i j kv o o rh e tv e r s c h i li na d s o r p t i e .
F i g u u r 10 A d s o r p t i ei s o t h e r m e n van H I g G( K a b i ) ( 0 ) en H I g G ( C L B ) (n) a a np o l y s t y r e e n %Latex b e p a a l d met UV spectroscopie.
1 1 . 5 .D i s c u s s i e U i t d e k a r a k t e r i s e r i n ge nz u i v e r i n gv a n blijkt
d a t g e e nv a nd e z ee i w i t t e na l l e e nu i t
staat.
H F b 8 HSA e n HIgG b e v a ' t ' t e ne e nn i e t
h o e v e e l h e i d dimeer e no l i g o m e r e n .
HFb,
HSA e n HIgG
monomeren b e t e verwaarlozen
Veel a d s o r p t i e s t u d i e sz i j n
g e p u b l i c e e r d ,w a a r b i jp l a s m ae i w i t t e ng e a d s o r b e e r dz i j n ' a a n v a s t eo p p e r v . l a k k e nz o n d e ' rd e z e - e i w i t t e nv o o r a f seren.
50
.
,
.
te karakteri-
Ook b i jd e z ee i w i t s t u d i e sk u n n e nn a a s th e ta a n w e z i g e
mono-
m e e r , . p o l y m e r em a t e r i a l e na a n w e z i gz i j n , ' d i ed ea d s o r p t i ev a n h e t monomeer s t e r k . k u n n e nb e i n v l o . e d e n( d o o rc o n c u r r e r e n d e d e a n a l y s ev a n
a d s o r p t i e )e n l i j k
k u n n e nv e r s t o r e n .
r
i s a a n g e t o o n di n . o n sl a b o r a t o r i u m
D i t
2 gamma g l o b u l i n ep r e p a r a t e n( a f k o m s t i gv a n
a a nd eh a n dv a n KABI,
d e a d s o r p t i e r e s u l t a t e na a n z i e n -
S t o c k h o l me n
CLB,
A m s t e r d a m ) , d i e ' o n d e rd e z e l f d e
a d s o r p t i ec o n d i t i e se e nz e e rv e r s c h i l l e n da d s o r p t i eg e d r a g v e r t o o n d e n( F i g ' u u r1 0 ) . ( K a b i ) e n HIgG ( C L B ) ,
U i t d.e k a r a k t e r i s e r i n gv a n
z i eF i g u u r
b l e , e k d a t d e z ep r e p a r a t e n
3,
Ook b l i j k t u i t d e k a r a k -
n i e ti d e n t i e kw a r e n( R O N N E & , ' 1 9 8 4 ) . t e r i s e r i n gv a n
i s om e e n
HIgG d a té é nm e t h o d en i e tv o l d o e n d e
t e k r j j g e ni n
g o e di n z i c h t
HIgG
de' i nd eo p l o s s i n ga a n w e z i g e
eiwitcomponenten.
D e z u i v e r i n gv a ne i w i t t e nv o o ra d s o r p t i e
v e r e e n v o u d i g th e t
t e b e s t u d e r e ns y s t e e mi n' i e d e rg e v a l
a a n z i e n l i j ke n
maakt d e v e r k r e g e nr e s u l t a t e ng e m a k k e l i j k e r
interpreteerbaar. T o c hb l i j k t
, .
d a t i n ons' systeem,
b i jg e b r u i kv a nr a d , , ï o - * '
g e l a b e l d ee i w i t t e n ,o o kn az ú i v e r i n g ; .g e e ne e n d u i d i g ei n t e r d e a d s o r p t i e r e s u l t a t e nm o g e l i j k
p r e t a t i ev a n
t h e r m e n 'v a ng e l a b e l d '
HSA,
is. D e iso-
HIgG e n HFb v e r t o n e n s i g n i f i c a n t e
v e r s c h i l l e na f h a n k e l i j kv a n
d e g e b r u i k t e d e t e c t i e methode
( F i g u u r 5-71. E r k a ng e c o n c l u d e e r dw o r d e n
g e b r u i kv a ng e l a b e l d ee i w i t t e n
d a t i n d i t s o o r ts y s t e m e n
het
l e i d t t o t onbetrouwbare
r e s u l t a t e n , VAN D E R , S C H E E R ( 1 9 7 8 )e n
K L E I N E L H O R S T '(1.978)
c o n s t a t e e r d e n reeds e e r d e r p r e f e r e n t i ë l e a d s o r p t i t ev a n j o d i u m gelabe,lde e i w i t t e n aan P S - L a t e x ,
met
Z i j kwamen e c h t e r
I
.
t o t de c o n c l u s i e . d a t w a n n e e r - e e n . p l a t e a u w a a r d e b e r e i k t was,' d e d o o r .1 a b . e l F n g
bepaalde
a d s o r p t i e w a a r d e ' o m g e z e tk o nw o r d e n
i n de r e ë , l e a d s o r p t i e w a a r d e d o o r g e b r u i k . t e m a k e n' v a ne e n
5
c o n s t a n t e preferentiële adsorptief.ac*tor. D e f i g u r e n 5-7 latenzien
d a k d i t . n i e tm o g e 1 k . j k
is: h e tv e r s c h i lt u s s e n
de
a d s o r p t i e w a a r d e ' v a n de UV i s o t h e r m e n 'de RAD . i s o t h e r m i s n i e tc o n s t a n t s p r a k ev a n GRANT
maar c o n c e n t r a t i e a f h a n k e l i j k .
E r i s d u sg e e n .
een c o n s t a n t e ' p r e f e r e n t i ë ' l e a d s o r p t i e f a c t o r .
( - 1 9 7 7 )v o n d
verschillende.adsorptiewaarden v o o r HSA
a a np l a t i n a w , aarbij
HSA g e l a b e l dw e r d
met I
l25
,
I
1 3 1 of
t r i t i u m .D e z e l f d ea u t e u r sv o n d e no o kd a td ea d s o r p t i ev a n ESA-I 125 v e r s c h i l d e v a n
HSA-I131
aan drie polymere
o p p e r v l a k k e n ,p o l y e t h y l e e n ,s i l i c o n e nr u b b e re np o l y e t h y l e e nt e r e p h t a l a a to n d e re x a c td e z e l f d ec o n d i t i e s . H i e r u i tz o ug e c o n c l u d e e r dk u n n e nw o r d e nd a tz e l f sd ea a r d v a n de l a b e l i n v l o e d h e e f t
op h e t a d s o r p t i e g e d r a g ,
was
GRANT v o n d e c h t e r o o k d a t d e a d s o r p t i e o n a f h a n k e l i j k
vandespecifiekeactiviteitindeoplossing. D i t i s e v e n e e n sg e v o n d e nd o o r
CHUANG
( 1 9 7 8 ) r VAN O S S
( 1 9 8 1 1 , PENNERS ( 1 9 8 1 ) , B O R N Z I N (1982), SCHMITT ( 1 9 8 3 )e n VAN DULM
( 1 9 8 3 ) ,d i em o g e l i j k ep r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a n
g e l a b e l d ee i w i t t e nb e p a a l d e nd o o r ,u i t g a a n d ev a ne e nc o n -
eiwit
stantebulkeiwitconcentratie,hetpercentagegelabeld in oplossing te variëren,
Op b a s i sv a nd e z ee x p e r i m e n t e nc o n c l u d e e r d e nz i jd a td e a a n w e z i g h e i dv a ne e nl a b e li ne i w i t t e ng e e ne f f e c th e e f t
op
hetadsorptiegedragvandezeeiwittenaandeverschillende oppervlakken.
B i j a l d e z ee x p e r i m e n t e nw o r d tu i t g e g a a nv a n
r a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n g e nv a ng e a d s o r b e e r d em o l e c u l e na a n k l e i n eo p p e r v l a k k e n .
VAN DER SCHEER ( 1 9 7 8 )h e e f ta a n g e t o o n d
datradioactiviteitsmetingenaankleineoppervlakkenniet g e v o e l i gg e n o e gz i j n
om e e n e v e n t u e l e p r e f e r e n t i ë l e
adsorptie te detecteren. D e m e t UV b e p a a l d e a d s o r p t i e 5 s o t h e r m e n a a n P S - l a t e x v a n
o n g e l a b e l d HFb e n HFb d a t í n z i j n g e h e e l d e l a b e l i n g s (78% g e l a b e l d )z i j ni d e n t i e k
p r o c e d u r eh e e f to n d e r g a a n
( F i g u u r8 ) .H i e r u i tk a ng e c o n c l u d e e r dw o r d e n
d a t d ev e r -
schillenineiwitstructuur,ontstaantengevolgevanlabeling,nietvandienaardzijndathierdoorhetspecifiek o p p e r v l a kv a nh e t
e i w i t . i nd eg e a d s o r b e e r d et o e s t a n da a n -
z i e n l i j kv e r a n d e r dw o r d t ,
Ook d e RAD i s o t h e r m v a n
g e l a b e l d HFb i s i d e n t i e k a a n d e
788
UV i s o t h e r m ( F i g u u r 9 ) .
D i t
houdt in dat de verhouding tussen de radioactiviteit .in oplossingenoppervlakgelijk
is a a n d e v e r h o u d i n g t u s s e n d e
hoeveelheid e i w i t i no p l o s s i n ge no p p e r v l a k .
52
D i t i s e e nv a n
d ev o o r w a a r d e nv o o rh e t ,g e b r u i kv a nr a d i o g e ’ l a b e l d ee i w i t t e n i na d s o r p t i e s t u d i e s .
Met a n d e r ew o o r d e n ,d o o rg e b r u i kt e
m a k e nv a nv o l l e d i gg e l a b e l de i w i t ,z o u d e nt o c he n i g s z i n s b e t r o u w b a r er e s u l t a t e nv e r k r e g e nk u n n e nw o r d e n .B o v e n d i e n k a nu i tF i g u u r
9 g e c o n c l u d e e r dw o r d e nd a th e ta d s o r p t i e -
eiwit n i e tv e r s c h i l tv a nd a t
g e d r a gv a nr a d i o a c t i e fg e l a b e l d v a ng e l a b e l de i w i t .
eiwit-
Toch b l i j f t a l s s l o t c o n c l u s i e g e l d e n d a t , w a n n e e r
m e t b e h u l pv a nr a d i o -
a d s o r p t i e s t u d i e su i t g e v o e r dw o r d e n
l a b e l i n g s t e c h n i e k e na a no n g e z u i v e r d ee i w i t t e n ,d eb e t r o u w -
i s . Ook
b a a r h e i dv a nd ek w a n t i t a t i e v er e s u l t a t e ng e r i n g
r e l a t i e fn i e u w em e t h o d e sz o a l sF o u r i e rT r ’ a n s f o r mI n f r a r e d S p e c t r o s c o p y (GENDREAU, Fluorescence
1 9 8 2 )e nT o t a lI n t e r n a lR e f l e c t i o n
(VAN WAGENEN,
t e w o r d e nn a a r
g e l a b e l d ee i w i t t e n .G e z o c h td i e n t a d s o r p t i e m e t h o d e ,w a a r b i jh e td i r e c t g e l a b e l d ee i w i t t e nn i e t
met
1 9 8 2 )w o r d e ng e c a l i b r e e r d
of
een
i n d i r e c tg e b r u i kv a n
m e e r nodig is t e rk w a n t i f i c e r i n g .
REFERENTIES
BORNZIN,
en MILLER,
G.A.,
I.F.,
J.
C o l l o i dI n t e r f a c eS c i . ,
8 65, 3 9( 1 9 8 2 ) . CHUANG,
H.J.,
KING,
e n MASON, R . G . ,
W.F.,
Med., 483
(1978).
CRANDALL,
R.E.,
Biochem..,
11, 111 ( 1 9 8 1 ) .
JANATOVA,
J.,
e n ANDRADE,
G E N D R E A U , R.M. LEININGER, R.I., WINTERS, R.B., i n Adv. Chem. S e r i e w s1 9 9 p , 3 . 7 1( 1 9 8 2 ) .
GRABAR P.
e n WILLIAMS C . A . ,
J.
LabC . lin.
J.D.,
S.,
Prep.
e n JACOBSEN,
B i o c h e mB . i o p h y sA . cta,
10, 1 9 3
(1953).
GREIG,
ROG.,
e n BROOKS,
D.E.,
J,
C o l l o i dI n t e r f a c eS c i . ,8 3 ,
661 ( 1 9 8 1 ) . HUNTER W.M.,.
e n GREENWOOD,
P.C.
N a t u r e ,4 8 2 7 ,4 9 5( 1 9 6 2 ) .
53
JANATOVA,. J., CRANDALL, Biochem., (1980). KLEIN ELHORST, S M O L D E R SC, , A . ,
J.,
e n ANDRADE,
R.E.,
Prep.
J,D.,
O L T H U I SF ,. M . F . GB. ,A R G E M A ND,. ,
en F E I J E N J.,
Int.
J.
of
A r t i f .O r g a n s ,
1,
288 (1978).
en S I L B E R B E R G , A., f a c e S c i , 80, 437 (1981).
P E N N E R SG, e P . ,R I E LZ, . ;
J.
C o l l o i d Inter-
F O N N E R , J e , L E N S EH N.,G . WO.L, T H U IFS. ,M . F . GS .M , OLDERS, C.A., en F E I J E N , J . , B i o m a t e r i a l s 5 , 241 (1984). I
I
,
_
S T E R N , . K . S ,M , CAFFEE, J.G., en Z O L L E , I., m a c e u t i c a l s , U . S . A t o m i cE n e r g yC o m m i s s i o n ,
VAN DULM,
248
P.
,
e n NORDE,
W.,
J.
R a d i o a c t i v e Phar-
359 (1966).
C o l l o i d Interface Sci.,
.
91,
(1983)
VAN O S S , C.J., ABSOLOM, D.R., NEUMANN, A.W.8 B i o c h i m . -B i o p h y s .A c t a , 670, 6 4 (1981). VAN WAGENEN, R.A., ROCKHOLD, C h e m . Series 199, 351 V I S S E RA, . ,
54
.
S.,
e n Z I N G p W.,'
e n A N D R A D EJ,. D , ,
(1982).
p e r s o o n l i j k gesprek N I Z O ,
Ede (1979).
Adv.
APPENDIX IIA' KARAKTERISERING VAN RUNDER SERUM ALBUMINE EN GELABELD RUNDER SERUM ALBUMINE Om inzicht te krijgen in de oorzaken van het afwijkend adsorptiegedrag van gelabeld HSA, HFb en HIgG aan PS-latexis runder serum albumine (BSA) en gejodeerd BSA gekarakteriseerd met behulp van HPLC (High-Performance Liquid Chromatography); B S A is gekozen vanwege de bestaande expertise met dit eiwit op HPLC gebied. Bij het onderzoek naar verschill'en in adsorptiegedrag tussen gelabeld en ongelabeld eiwit met behulp van HPLCis gebruik gemaakt van gel permeatie chromatografie, reversed phase chromatografie en ionenwisseling. Bij gel permeatie (SW 3 0 0 0 kolom), met PBS als elutiebuffer, kon geen verschil in
chromatografisch gedrag worden aangetoond tussenBSA en. gelabeld BSA. Door de labeling en/of de labelingsprocedure worden de grootte en vorm van B S A kennelijk niet aanzienlijk
'
gewijzigd. Met reversed phase chromatografie, waarbijin de eltltiebuffer de methanol/water ratio is gevarieerd kon eveneens geen verschil in chromatografisch gedrag worden aangetoond tussen BSA en B S A I .
Ee hydrofobe interacties, tussen kolom., * * . matrix en eiwit worden door.labeling of labelingsprocedure eveneens niet merkbaar gewijzigd.
,.
I.
Wanneer echter een 545 TSK anionenwisselaar als kolommatrix gebruikt wordt ter karakterisering blijkt dat ten gevolge van de labeling van BSA een extra component is ontstaan die een hogere affiniteitvoor de kolommatrix bezit (Figuur l.).
Met de vorming van dez-e domponent gaat een'
afname van ongemodificeerd BSA. inde oplòksing gepaard. De . .
vorming van deze component wordtsto'pge'zet'wanneer,'door toevoeging van natr'iumbisulfiet, de oxiderende werking Van ch1ooramin.e T wordt opgeheven. Bij d e gevol-gde labelings-' procedure (Hoofdstuk I1 van dit prbefschrift) wordt op deze wijze een gedeèlte'van het in de'oplossing' aanwezigeB S A
55
elutietijd
HPLC chromatogrammen
van B S A (conc. 1 g1 -l ) r:oor
en
na
jodiumlabeling. Kolommatrix, 5 4 5 TSK anionenwisselaar; elutiebuffer, H O/ O,ll NH OAc p H 585.injectievolume 4
2
5 0 p.1,
flowsnelheid 0 , s m l / m i n .
omgezet
in
een
eiwit
met
UV d e c t e c t i e b i j 280 nm,
een
grotere
affiniteit
voor
de
kolommatrix van de ionenwisselaar. Op basis van deze resultaten kan slechts geconcludeerd BSA worden dat de veranderde ionogene interactie van gelabeld
ten
gevolge
van
de
aanwezigheid
van
deze
nieuwe
component
veroorzaakt wordt door jodiuminbouwof door de gebruikte labelingsprocedure. Om dit.na
56
tegaan werden onder andere
oplossingen van B S A in aanwezigheid van chlooramine T zonder jodium en oplossingen vanB S A in
aanwezigheid
van
jodium
zonder chlooramine T geanalyseerd met behulp van een545 TSK anionenwisselaar. Uit de gegevens inTABEL A I blijkt dat chlooramine T de oorzaak is van de vorming van een nieuwe component en niet de inbouw van jodium, T A B E LA l :
De HPLC analyse van B S A in aanwezigheid van de verschillende labelingscomponenten
BSA
vorming
jodium amine T
+ + + .+ +
+ + +
aanwezig
in
bisulfiet
+ +
+ +
-
NEEN
-
+
NEEN
-
oplossing
niet
van
een
nieuwe component JA JA
aanwezig
in
oplossing
Chlooramine T is echter noodzakelijk in de labelingsprocedure om I- te oxyderen tot jodium. Om veiligheidsredenen wordt radioactief jodium geleverd in de vorm
van
,
jodide zouten. Jodium is namelijk vluchtig. Concluderend blijkt dat door de gebruikte labelingsprocedure extra componenten ontstaan met andere adsorptieve eigenschappen dan BSA. Het is niet onmogelijk dat door labeling van H S A , HFb en HIgG eveneens extra componenten ontstaan, waardoor de homogeniteit van de componenten in deze oplossing verloren gaat.
57
natrium
..
APPENDIX I I B
,"
\
T e r v e r k l a r i n gv a nh e t. a f w i j k e n da d s o x p t i e g e d r a gv a n
g e l a b e l d e i w i t a a n PS-latices
i nH o o f d s t u k
d e b e p a l i n gv a n
a f l e i d i n gv o o r
I1 v o l g t h i e r
een
d e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i eo p
b a s i sv a nr a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n g e nw a a r b i jr e k e n i n gg e h o u d e n w o r d t met d e c h r o m a t o g r a f i s c h eg e g e v e n sv a ng e l a b e l d
BSA.
D e a d s o r p t i e w a a y d e n . - v - a nd ei s o t h e r m e ni nH o o f d s t u k
b e r e k e n dd o o rg e b r u i k m a k i n gv a n
I1 z i j n
de formule . I _
Cs*
c*
C s =
.
c
waarin Cs*
= d e g e m e t e nr a d i o a c t i v i t e i t
p e r o p p e r v l a k t ee e n h e i d , ,e e n
m a a t ~ v o o rd ec o n c e n t r a t i e . g e l a b e 1 d vlak
C*
( R a d cm-2)
= d e g e m e t e nr a d i o a c t i v i t e i tp e rv o l u m ee e n h e i d ,e e nm a a t VOOE
d e c o n c e n t r a t i eg e l a b e l d -3
= de concentratie eiwit
i n d& o p l o s s i n g ( Mg c m
( g e l a b e l dé no n g e l a b e l d )
C s
= d e b e r e k e n d ce o n c e n t r a t i e
vgcm
-2
D e z ef o r m u l e
1
.
e i w i t a a n het o p p e r v l a k
mag a l l e e nw o r d e nt o e g e p a s tw a n n e e rg e l a b e l d
e i w i t e e ni d e n t i e ka d s o r p t i e g e d r a g
v a np r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a ng e l a b e l d
e r s p r a k e was
e i w i t t e no p z i c h t e
eiwit. K i j g i n g e r e c h t e rv a nu i t
a a n w e z i g eg e l a b e l d e
.
.
VAN DER S C H E E R h e e f t a a n g e t o o n d d a t
v a no n g e l a b e l d
-3
1
e i w i t e no n g e l a b e l d vertonen.
eiwit i n de oplossing
1
(rad c m '
C
e i w i t a a nh e to p p e r -
dat a l het
e i w i t i no p l o s s i n gp r e f e r e n t i e e la d s o r -
b e e r d e e nu i t g a a n d ev a nd e z ev e r o n d e r s t e l l i n gh e e f t
h i j een
'
formule afgeleid gebruikmakend van een eenvoudig kinetisch.. model. Op deze wijze kon de juiste oppervlakteconcentratie r verkegen worden door toepassing van Cs*
C
s
=
C*
#
C
(2)
De evenredigheidsfactor,of preferenti-ële adsorptiefactor is een constante wanneer er sprakeis van een volledig bedekte monolaag. Dit geldt voor zowel.reversibele als irrever-' sibele eiwitadsorptie. ( V A N > D E RS C H E E R ,
1978)
afwijkend adsorptie gedrag vertoont. Formule 1 en formule 2 zijn in dit geval niet van toepassing. In formule 1 dient Cs* en C * vervangen te worden door As*+Bs* en A*+B*.
-
En C door A+A*+B*.
A is ongelabeld eiwit.
'
'
A * is gelabeld eiwit dat geen afwijkend adsorptiegedrag
vertoont ten opzichte van A..
-
B * is gelabeld eiwit dat wel een afwijkènd adsorptiegedrag
vertoont ten opzichte van
A.
'
Formule 1 kan nu geschreven worden als
CS*
Cs =
A* +B
*
is
T
meestal
=
As*
C
A*
veel
+
BS*
I
+ (A+A*+B*) B*
kleiner
.
(3)
dan A ( l a a g labelingspercentage)
Formule 3 is dan te vereenvoudigen tot
Cs
=
AS* A*
f
+
BS* B*
A
-
59
.
wat v o o re i w i t m o l e c u l e n
Om i n z i c h t t e k r i j g e n u i t
d e gead-,
s o r b e e r d e e i w i t l a a g b e s t a a t w o r d t d e v o l g e n d er e d e n e r i n g opgezet.
e i w i t i n d e o p l o s s i n g A*i-B*
Het p e r c e n t a g e g e l a b e l d
m e e s t a lz e e r
is
laag ( 3 % ) .
Van d i t p e r c e n t a g e v e r t o o n t s l e c h k s e e n e e na f w i j k e n da d s o r p t i eg e d r a g .
g e d e e l t e B*/A*+B*
dat,
A l s a a n g e n o m e nw o r d t
g é é ne x t r e m ep r e f e r e n t - i Z l ea d s o r p t i eo p t r e e d t ,z o d a t d a n v o . l g th i e r u i td a t
en = A +A *+B * e. A s s s S
O m t e komen t o t e e n j u i s t e b e r e k e n i n g v a n
m o e t e nw o r d e ng e m a a k tv a n
A s z a ld u sg e b r u i k
de formule
I n d e p r a k t i j k i s e c h t e ra l l e e n
As*+Bs*
e n A*+B*
bekend.
En i n d e v e r o n d e r s t e l l i n g d a t g e l a b e l d e i w i t g e e na f w i j k e n d a d s o r p t i e g e d r a gv e r t o o n tw o r d td a no o k
a l t i j d g e b r u i k gemaakt
(1) o f e i g e n l i j kv a nv e r g e l i j k i n g
v a nv e r g e l i j k i n g
(4).
D i t b e t e k e n t d a t d o o rt o e p a s s i n gv a nd e z ev e r g e l i j k i n g e ne e n
a f w i j k i n gi n
d e b e r e k e n d ea d s O r p t . i e w a a r . d eo n t s t a a t
d i e gege-
v e nw o r d td o o r
4'
6' i s Bs*/As*
60
1 1
i-
+
(6)
Bs*/As* B*/A*
k w a n t i t a t i e fm o e i l i j k o n b e k e n dz i j n .
t e b e p a l e no m d a t
B*/A*
en
'
HOOFDSTUK
I11
D E REVERSIBILITEIT VAN EIWITADSORPTIE AAN POLYSTYREEN
111.1.
Inleiding
Er bestaat nog steeds verschil van mening over de vraag of eiwitadsorptie beschouwd kan worden als een reversibel proces. Gepreadsorbeerde eiwitten aan hydrofobe oppervlakken desorberen niet of zeer langzaam wanneer deze oppervlakken in contact komen ,met bufferoplossingen waarin geen eiwit aanwezig is (BRASH, 1969 en BRYNDA, 1978). Eiwitadsorptie aan hydrofobe oppervlakken wordt in dit opzicht beschouwd als "irreversibel", terwijl voor hydrofiele oppervlakken zowel reversibele (BRASH, UNIYAL, 1979) als "irreversibele" adsorptie (MC RITCHIE, 1972) is gevonden (zie noot). I n een uitstekend review zet MC RITCHIE alle factoren met betrekking tot reversgbele en irreversibele eiwitadsorptie op een lrij (MC RITCHIE, 1978). In veel eiwitadsorptiestudies aan ,hydrofobe oppervlakken is aangetoond dat de adsorptietak van de isotherm afhankelijk is van de eiwitconcentratie in de oplossing. Deze concentratie afhankelijkheid wordt vaak beschreven met een Langmuir isotherm (ORESKES en SINGER, 1961; BRASH en
,
LYMAN, 1969; DILLMAN en MILLER 1973: LEE en KIM 1974). Dit vooronderstelt reversibele eiwitadsorptie.
Noot: In de literatuur'wordt eiwitadsorptie beschouwd als irreversibel wannee'r geadsorbeerd eiwit in contact met een buffer niet desorbeert. Desorptie van geadsorbeerd eiwit door verdringing blijft dan nog altijd mogelijk. In dit proefschrift wordt het begrip irreversibel alleen dan gehanteerd wanneerook geen verdringing of uitwisseling van geadsorbeerde eiwitten meer mogelijk is. Het begrip irreversibel uit de likeratuur, waarbij nog wel verdringing mogelijk is, wordt in dit hoofdstuk tussen aanhalingstekens geplaatst ("irreversibel").
61
is
A l s d ee i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n gh o o gg e n o e g
n a d e r t d e i s o t h e r me e np l a t e a u w a a r d e ,w a a r b i ja a n g e n o m e n w o r d t d a t b i j d i ec o n c e n t r a t i e se e nv o l l e d i gb e z e t t e
m,onoDe eiw-
i s o p h e to p p e r v l a k .
m o l e c u l a i r ee i w i t l a a ga a n w e z i g
i t m o l e c u l e ni nd e z eg e a d s o r b e e r d ee i w i t l a a gk u n n e ni np r i n c i p ee n d - o n( s t a a n d )g e s i t u e e r dz i j n . o ph e to p p e r v l a k (BRASH,
1 9 6 9 )o fs i d e - o n( l i g g e n d )z o a l sN o r d ea a n n e e m t
(NORDE,
1976)
.
Dat e i w i t a d s o r p t i en i e te e ne c h ti r r . e v e r s i b e lp r o c e s
is
b l i j k te v e n e e n su i td ea l b u m i n ed e s o r p t i ev a ng l a se nz e l f s
,
met a l b u m i n e
v a np o , l y s t y r e , e no p p e r v l a k k e n ,w a n n e e rd e z e
met
g e p r e a d s o r b e e r d eo p p e r v l a k k e ni nc o n t a c tg e b r a c h tw o r d e n bloedplasma CKAN
(CO'LEMAN e t 1 9 7 6 ) .
( 1 9 8 1 ) t o n e na a n
.
Ook BRASH ( 1 9 7 8 1 , 9 8 3 )e n
d a t e i w i t a d s o r p t i ee e nd y n a m i s c h
'
p r o c e s i s , w a a r b i j u i t w i s s e l i n gv a ne i w i t t e na a nh e tg r e n s v l a ko p t r e e d to n d e r" s t e a d ys t a k e "c o n d i t i e s .D e z ea d s o r p t i e s t u d i e sz i j nu i t g e v o e r da a np o l y e t h y l e e n / a l b u m i n es y s t e : men * ( B R A S H , 19781, g l a s / f i b r i n o g e e ns y s t e m e n . .
1 9 8 1 ) .e n
(CHAN,
a a nf . i b r i n 0 g e e . ni na a n w e z i g h e i dv a np o s i t i e v en e g a t i . e v ee n (BRASH,, 1 9 8 3 ) . B i j a l d e n e u t r a l ep o l y e l e c t r o l i e tc o m p l e x e n 125 zeex p e r i m e n t ew n ordt I g e l a b e l d eiwit u i t g e w i s s e l d , m e t I13'gelabeld
eiwit.
B R A S H v i n d te e nu i t w i s s h l i n g' v a n
g e a d s o r b e e r d ee i w i t t e na a nh e to p p e r v l a k o p l o s s i n g Voor a l d e z es y s t e m e n .
f r a c t i e vah n egt e a d s o r b e e r d e
.:.
met e i w i t t e n i n
Ook b l i j k t t e l k e n s e e n
e i w i t n , . i eut i t w i s s e l b q a r
te
.
zijn. d e a d s o r p t i e , b e s c h r e v e nS a n
I nd i tH o o f d s t u kw o r d t
l i j k a l b u m i n e ( H S A ) e nm e n s e l i j kf i b r i n o g e e n
menSe,-
aan
(HFb)
P S - l a t e x( e e ng r o t eo p p e r v l a k t e / v o I u m ev e r h o u d i n ge ne e n n e g a t i e fg e l a d e no p p e r v l a k ) v l a k t e / v o l u m ev e r , h o u d i n g ) . s e l i n g s e x p e r i m e n t e nv a n w o r d t nad:er
O p b a s i s v a nd e s o r p t i e
H S A e n H F b a a nd e z e
e,n u i t w i s -
P'S o p p e r v l a k k e n
i n g e g a a n o p d e r e v e r s i b i l i t e i t v,an h e t e i w i t -
adsorptieproces. e e nf o s f a ? a t b u f f e r
A l d e z ee x p e r i m e n t e nz i j nu i t g e v o e k di n
pH ' 7 , 3 5 b i j 0 , 9 % N a C l .
r e s u l t a t e nw o r d te e nv o o r m o d e lo p g e s t e l d .
62
e n P S - f i l m s .l e e n . k l e i n eo p p e r -
Aan d e h a n dv a n
d i t s y s t e e mt o e p a s b a a ra d s o r p t i e -
de
e n M a t e r i a1l e1 n1 . 2 .
I
M e n s e l i j ks e r u m 'a l b u m i n e
,
e nm e n s e l i j kf i b r i n o g e e n
(HSA)
( H F b )z i j ng e z u i v e r de n ' g e k a r a k t e r i s e e r dz o a l sb e s c h r e v e ni n h o o f d s t u k 11. H S A w a sa f k o m s t i gv a nS ' i g m a( A 9 5 1 1 ) , KABI,
HFb v a n
Stockholm. MW 670.000
Polystyreen (PS),
Mw/Mn=1,15,
w a sa f k o m s t i g
v a nP r e s s u r eC h e m i c a lC o m p a n y ,P i t t s b u r g h ,M e l l o nI n s t i t u t e f i l m s z i j nv e r v a a r d i g dd o o r' o p l o s -
( L o tn o1 3 A ) .P o l y s t y r e e n s e nv a n
PS
i nt o l u e e n( 7 % )e nd e z eo p l o s s i n gv e r v o l g e n su i t
t e s t r i j k e no v e re e ng l a s p l a a t ,w a a r n a "h e ' to p l o s m i d d e l' v e r d a m p to n d e ru i ' t s l u i t i n gv a nv o c h t .
Op d e z ew i j z e' w o r d te e n
met e e n d i k t e v a n 20 pm.
t r a n s p a r a n t e P S f i l mv e r k r e g e n
i s g e b r u i kg e m a a k tv a nP S - f i l m p j e s
T i j d e n sd ee x p e r i m e n t e n
2 cm
met e e nt o t a a lo p p e r v l a kv a n Polystyreen-latex p o r a t eR e s e a r c h ,
( PS-latex)
2
. t
was a f k o m s ' t i gv a n
Arnhem ( n r . VSUS).
"
.
AKZO C o r -
D e d i ' a m e t e rv a nd e
l a t e x d e e l t j e s i s b e p a a l d met b e h u l pv a ne e ne l e c t r o n e n m i c r o - ' s c o o pe nb e d ' r o e g3 2 6
nm
'f_
1 4 nm.
Het v a s t e s t o f g e h a 1 t e ' " w a s
1 , 5 1 gew.%, d e pH was 7 , 3 5 .
i
.
T i j d e n s d e e x p e r i m e n t e n i s g e b r u i k ' g e m a a k tv a np h o s ' p h a t e ( P B S b u f f e r ) , pH 7 , 3 5 D . e'eiwitten b u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n 125 z i j ng e l a b e l d met I v o l g e n s d e c h l o o r a m i n e T met'hode, z o a l sb e s c h r e v e ni nH o o f d s t u k
,
11.
te
D e a d s o r p t i e e x p e r i m e n t e nz i j nu i t g e v o e r dd o og e b r u i k
m a k e nv a n' 2 , ' a d s o r p t i em e t h o d e n .
(kleine'opptrvlakte/volume"ver-
a . A d s o r p t i ea a nP S - f i l m p j e s houding)
'
D e a d s o r p t i ev a n
e i w i t a a nP S - f i l m p j e sk a nb e p a a l dw o r d e n , .
d o o r g e b r u i k ' t e makenvan
' L
r
radiolabelingstechnieken.
De r a d i o a c ' t i v i t ' e i t o p h e t PS o p p e r v l a k n a
.
: 'S
adsorptie van'
e i w i t v a n u i t de O p l o s s i n g i s e e n maat v o o r de h o e v e e l h e i d r a d i o a c t i e f g e l a b e l d e i w i t a a n w e z i g op h e to p p e r v l a k .
. . '
H i e r u i t k a n 'de t o t a l e h o e v e e l h e i d e i w i t a a n h e t o p p e r v l a k beregend' wordeh,
.
-
d o b r d a t de r a d i o a c t i v i t e i t v a n
s i n g e n m e t b e k e n d ee i w i t c o n c e n t r a t i e sb e k e n d
de o p l o s -
i s (volgens
63
e e ni j k c u r v e )e n
er e e n l i n e a i r v e r b a n d b e s t a a t t u s s e n d e de h o e v e e l h e i d e i w i t .
radioactiviteiten
W a n n e e re e n
g e l i j ka d s o r p t i e g e d r a gv o o r o n d e r s t e l d . w o r d tv a ng e l a b e l d , radioactiefgelabeldenongelabeld
e i w i t n a gg e b r u i kw o r -
d e ng e m a a k tv a nd ev o l g e n d ef o r m u l e :
c,
=
Cs+ C*
I nf o r m u l e
c
1 i s C s d eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e
v a ng e a d s o r b e e r d
(ugcm
-2
1
Cs* d e r a d i o a c t i v i t e i t g e m e t e n -1 -2 cm l , C* d e a a nh e ot p p e r v l a k( c o u n t sm i n -I -1 m l ) en r a d i o a c t i v i t e i ti nd eo p l o s s i n g( c o u n t sm i n eiwit,
.
(
D e adsorptieexperimentenzijnuitgevoerdbij
2OoC o n d e r
s t e a d y state c o n d i t i e si nb u i s j e sg e v u l d oplossing.
pgml
-I
C d et o t a l ee i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n g
)
met 3 m l eiwit-
D e t o t a l ee i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n g
v e r m i n d e r tt i j d e n sa d s o r p t i en i e tw a a r n e e m b a a rd o o r d a t g e b r u i kw o r d tg e m a a k tv a nr e l a t i e fk l e i n eP S - o p p e r k l a k i s c o n t a c tv a nd ep o l y -
k e n ,T i j d e n sd ee x p e r i m e n t e n s t y r e e no p p e r v l a k k e n
m e t hetvloeistof/luchtgrensvlak
v e r m e d e n t e r v o o r k o m i n gv a na r t e f a c t e nt e ng e v o l g ev a nd e e v e n t u e l ea a n w e z i g h e i dv a ne e nL a n g m u i r - B l o d g e t tl a a ga a n hetgrensvlak. i s c o n t a c tv a nh e to p p e r v l a k
Ook t i j d e n sd ew a s p r o c e d u r e
m e t h e tv l o e i s t o f / l u c h tg r e n s v l a kv e r m e d e n . lijk door de eiwitoplossing
D i t w a s moge-
t e v e r d r i n g e n m e t 'PBS b u f f e r .
D e e i w i t o p l o s s i n gw e r dd e r m a t ev e r d u n dd a td ee i w i t c o n -
centratieuiteindelijkgereduceerd
was t o t n u l .
A l l e m e t i n g e nz i j nu i t g e v o e r di nd r i e v o u d ,
D e maximale
s p r e i d i n gi nd eb e r e k e n d eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e sv a n g e a d s o r b e e r d e i w i t b e d r o e g 8%. H e t p e r c e n t a g eg e l a b e l d
e i w i t indeoplossing
w a s meestal
3 8 , v e r k r e g e nd o o rm e n g i n gv a ng e l a b e l de no n g e l a b e l d
Van d i e 3% w a s s l e c h t s e e n k l e i n e f r a c t i e . r a d i o ('L,2 x 10-5 ) . a c t i e fg e l a b e l d eiwit.
64
g e v a lw o r d td eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ev a ng e a d s o r b e e r d de v e r l a g i n g v a n d e e i w i t c o n c e n t r a t i e
e i w i tb e p a a l du i t
i no p l o s s i n gt e ng e v o l g ev a na d s o r p t i ea a nP S - l a t e x .B i j d e z em e t h o d ek a nz o w e lg e b r u i kg e m a a k tw o r d e nv a ng e l a b e l d a l s o n g e l a b e l de i w i t ,o m d a tn a a s td er a d i o a c t i v i t e i t s m e t i n ge e n
UV m e e t m e t h o d eb e s c h i k b a a r
is.
U i t w i s s e l i n g van geadsorbeerd e i w i t met e i w i t i n d e oplossing D e z ee x p e r i m e n t e nz i j nu i t g e v 0 e r . da a nP S - l a t e xe n
films v o o r H S A e n HFb i n P B S b u f f e r pH 7 , 3 5
PS
b i j 2OoC.
T e rb e s t u d e r i n gv a ne i w i t u i t w i s s e l i n ga a nk l e i n e
PS
o p p e r v l a k k e nz i j nd e z eo p p e r v l a k k e nq e p r e a d s o r b e e r d
met
g e l a b e l d e i w i t . b i je e nb e k e n d ec o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s sing.
De oppervlakteconcentratie
i s d a n t e b e r e k e n e na a n
d eh a n dv a nd er a d i o a c t i v i t e i ta a nh e to p p e r v l a k . o p l o s s i n gw o r ' d tn uv e r v a n g e n
De
door o n g e l a b e l d e i w i t m e t
d e z e l f d ec o n c e n t r a t i ea l sd eo o r s p r o n k e l i j k ec o n c e n t r a t i e g e l a b e l de i w i t .
B i j
d e z ep r o c e d u r ew o r d tc o n t a c tt u s s e n
h e to p p e r v l a ke nh e tv l o e i s t o f / l u c h tg r e n s v l a kv e r m e d e n . D e v e r m ' i n d e r i ' n g , v a nr a d i o a c t i v i t e i ta a nh e to p p e r v l a k
w o r d tn ug e r e g i s t r e e r dm e tb e h u l pv a ne e ng a m m a - t e l l e r
a l s f u n c t i ev a nd et i j d . v a ng e l a b e l d
Op d e z ew i j z ew o r d td ed e s o r p t i e
e i w i t b e r e k e n do n d e re v e n w i c h t s c o n d i t i e s . .
A l s a a n g e n o m e nw o r d t
d a t i ne v e n w i c h t
,.
de t o t a l e o p p e r -
v l a k t e c o n c e n t r a t i ec o n s t a n tb l i j f tb i je e nc o n s t a n t e e i w i t c o n c e n t r a t iieonp l o s s i n gk,agne s t e lw d o r d e nd,e h o e v e e l h e i dg e a d s o r b e e r do n g e l a b e l de i w i tb i je v e n w i c h t g e l i j k i s a a nd eh o e v e e l h e i dg e d e s o r b e e r dg e l a b e , l d
eiwit.
D i t e x p e r i m e n tk a nh e r h a a l dw o r d e nd o o rh e to p p e r v l a k
e e r s t t e p r e a d s o r b e r e nm e to n g e l a b e l d
b e p a a l d ec o n c e n t r a t i eo n g e l a b e l d
eiwit b i je e n
e i w i t i n de o p l o s s i n g e n
v e r v o l g e n s de . , , o n g e l a b e l d e e i w i t o p l o s s i n g t e v e r v a n g e n door o p l o s s i n gv a ng e l a b e l d
eiwitconcentratie.
e i w i t , weer m e t d e z e l f d e
eiwit aan het oppervlak bij
Nu k a n d e u i t w i s s e l i n g v a n
gelijkblijvendeeiwitconcentratiesinoplossingworden b e p a a l d a l s . f u n c t i ev a nd et i j dd o o rr e g i s t r a t i ev a nd e het o p p e r v l a k .
toename i n r a d i o a c t i v i t e i t a a n i n d e r d a a ds p r a k e
i s v a né & n
Als
er
op é é n u i t w i s s e l i n g z o n d e r de d e s o r p t i e als f u n c t i e v a n
verschilinaffiniteitzal
de t i j dc o m p l e m e n t a i rz i j na a nd ea d s o r p t i ei nh e tt w e e d e
e x p e r i m e n tb i jd e z e l f d ee i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n g . D e u i t w i s s e l i n gv a ne i w i t t e na a nP S - l a t e x
o pi d e n t i e k ew i j z e verschildat
is uitgevoerd
a l s b o v e nb e s c h r e v e n .E c h t e r
met dit
n ud ed e s o r p t i er e s p e c t i e v e l i j ka d s o r p t i e is bepaald
v a ne i w P ta a nl a t e xo n d e re v e n w i c h t s c o n d i t i e s
de v e r h o g i n g r e s p e c t i e v e l i j k v e r l a g i n g
a a nd eh a n dv a n
w a s Plet
v a nd er a d i o a c t i v i t e i ti nd eo p l o s s i n g .H i e r v o o r
t e centrifugeren
noodzakelijkdelatexsuspensiestelkens. e nv e r v o l g e n s .
t e resuspenderenineiwitoplossingen
met
d e z e l f d ec o n c e n t r a t i e .
111.3.
Resultaten.
A d s o r p t i e Van H F b en , K S A a a n
cm
2
)
PS-plaatjes
(oppervlak 2
i s b e p a a l da l sf u n c t i ev a nd et i j d( F i g u u r
e e n .HSA c o n c e n t r a t i ev a n b e r e i k tb i n n e n
0,'7
I5 m i n u t e ne nn a1 6u u r
verzadigd.
.',
is de o p p e r v l a k t e -
D e a d s o r p t i ev a n
l a n g z a m e r .D e - a d s o r p t i e 'i s o t h e r m e nv a n P S - p l a a t j e sw o r d e ng e g e v e ni nF i g u u r van 16 g 1
B i j
g 1w o r d te e ne v e n w i c h t
c o n c e n t r a t i en i e tv e r a n d e r d .
-1
I).
-1
HFb v e r l o o p t
HSA e n HFb a a n 2.
HSA i nd eo p l o s s i n gb l i j k th e t
B i j e e nc o n c e n t r a t i e
PS o p p e r v l a k
D e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e i s d a n 0,6 u.g c m -2
.
B i j HFb a d s o r p t i ew o r d tg e e n 'v e r z a d i g i n g s w a a r d ew a a r g e n o m e n ,
Wanneer HFb c o n c e n t r a t i e s i n gl-l ontstaat vlokking van 'het
66,
de o p l o s s i n gh o g e rw o r d e nd a n
e i w i t indeoplossing.
4
adsorptie tijd (uren) Fi
Figuur 2
A d s o r p t i e i s o t h e r m e n van HSA ( 8 ) e n HFb PS-films.
(A) aan
De a d s o r p t i e t i j d .is 3 uur. C o n d i t i e s PBS
buffer p H 7 # 3 5 ? temp.
23OC.’’
‘
.67
Sn f i g u u r 3 i s d ea d s o r p t i ev a n f u n c t i ev a nd et e m p e r a t u u r .
HFb e n HSA g e g e v e n als
Een l i c h t e t o e n a m e v a n
de h o e -
0
veelheidgeadsorbeerd
e i w i t a a nh e to p p e r v l a kw o r d tw a a r g e 45OC t r e e d t v l o k k i n g
nomen b i j t o e n e m e n d e t e m p e r a t u u r e n b i j o pv a n
HFb i n de o p l o s s i n g .
D e oppervlakteconcentratie is
A
3
temperatuur (“C)
Figuur 3
A d s o r p t i ev a n
HSA ( O ) e n HFb
d et e m p e r a t u u ra a nP S - f i l m .
(A
)
a l s f u n c t i ev a n
De a d s o r p t i e t i j d is 3
uur , t e l k e n sb e p a a l dd o o rm e t i n gv a nd er a d i o a c t i v i t e i ta a nh e t o p p e r v l a kv a n
PS. D e s o r p t i ev a n
g e e ne n k e lg e v a lw a a r g e n o m e n . d e z ed e s o r p t i e p r o e v e n
eiwit is m e t PBS b u f f e r i n D e PS o p p e r v l a k k e nw a r e n
bij
m e t b u f f e r o p l o s s i n g e nv o o rg e d u r e n d e
1
à 3 uur g e p r e a d s o r b e e r d m e t HSA e n H F b , w a a r b i j de c o n c e n -1 t . r a t i e HSA ( v a n 0 , l t o t 10 g 1 ) e n HFb ( v a n 0 , l t o t 4 g l - l )g e v a r i e e r d
i s . Z e l f s n a 5 0 u u rc o n t a c t
m e t de b u f -
f e r o p l o s s i n g w a s de o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e v a n g e a d s o r b e e r d
eiwit nietverminderd, D e uitwisselingvan
alsfunctievan
68
HSA e n H F b a a n P S - p l a a t j e s
de t i j d i n F i g u u r
4 e nF i g u u r
Ls g e g e v e n
5. H i e r b i j
5
-Q-
I
I
8
4
12
I
16 .
I
20
Q
uitwisselingstijd (uren)
Figuur 4
U i t w i s s e l i n gv a n
HSA
g e a d s o r b e e r da a n
PS-films b i j
evenwicht. H e tp e r c e n t a g ev a n
de o o r s p r o n k e l i j k e o p p e r v l a k t e -
c o n c e n t r a t i e i s u i t g e z e t a l s f u n c t i ev a nd et i j d . D i t i s v e r k r e g e nd o o r :
a.
I n i t i ë l ea d s p r p t i ev a n
H S A 1125e nv e r v o l g e n s
u i t w i s s e l i n g m e t o a g e l a b e l de i w i t
( O 1 of
m e t o n g e l a b e l d IPSA e n v e r 125 S o l g e nusi t w i s s e l i nm g et I g e l a b e l d IPSA
b.Initiëleadsorptie
(0.1. D e e v e n w i c h t s c o n c e n t r a t i e HSA i n o p l o s s i n g . i s
1 g1-l.
D e e v e n w i c h t s c o n c e n t r a t i ea a nh e to p p e r -2
v l a k i s O , 2 1-1.9 cm
.
69
6
- 8
4
16
12
24
20
uitwisselingstijd (uren)
F i g u u r 5 ' U i t w i s s e l i n gv a n evenwi'eht i
HFb g e a d s o r b e e r da a n
PS-film
bij
H e t p e . r c e n t a g ev a nd eo o r s p r o n k e l i j k e
oppervlakteconcentratie v a n de t i j d .
is u i t g e z e t a l s f u n c t i e
D i t is v e r k r e g e nd o o r :
. a. I n i t i ë l e a d s o r p t i e v a n
€iFb11251A) , v e r v o l g e n s
u i t w i s s e l i n g m e t o n g e l a b e l d HFb o f b.Initiëleadsorptie
m e t o n g e l a b e l d HFb
vervolgens uitwisseling ..
,
._
De evenwichtsconcentratie
m e t 1251 g e l a b e l d HFb
HFb i n o p l . o s s i n g is
D e e v e n w i c h t s c o n c e n t r a t i ea a n het -2 o p p e r v l a k is O 8 4 , p g c m D e preads.orptie tija 0 8 6 7 g1-l.
was 3 uur.
70
z i j n de o p p e r v l a k k e ng e p r e a d s o r b e e r dg e d u r e n d e1 5 - 6 0m i n u t e n
m e t . g e l a b e l de no n g e l a b e l de i w i t . . w i s s e l i n gv a n
Voor p r e a d s o r p t i e e n u i t -
HSA i s s t e e d sg e b r u i kg e m a a k tv a ne e n -1 1 g1
o p l o s s i n gm e t . e e ne i w i tc o n c e n t r a t i ev a n a d s o r p t i ee nu i t w i s s e l i n gv a n tiein
,
HSA
. v o o rp r e -
HFb b e d r o e g de HFb c o n c e n t r a -
de o p l o s s i n ' g 0,67 g 1
-1
. Uit
Figuur 4 b l i j k t dat een H S A g e a d s o r b e e r da a nh e t
b e p a a l d ef r a c t i e( c a .6 0 % )g e l a b e l d PS o p p e r v l a k n i e t u i t w i s s e l t
m e t o n g e l a b e l d HSA i n d e o p l o s -
t e r w i j l o n g e l a b e l d H S A g e a d s o r b e e r da a n
sing(stippellijn)
h e t PS o p p e r v l a k ,g e z i e n
d e a d s o r p t i ev a ng e l a b e l d
eiwit,
m e t g e l a b e l de i w i ti nd eo p l o s -
vrijwelvollediguitwisselt sing. v o o rf i b r i n o g e e n
i s e e n z e l f d ev e r s c h i j n s e lw a a r g e n o m e n .
Ook b i j H F b b l i j k t s l e c h t s e e n k l e i n e f r a c t i e g e a d s o r b e e r d g e l a b e l d HFb,
c i r c a 10%, u i t w i s s e l b a a r m e t o n g e l a b e l d HFb i n
d eo p l o s s i n g ,
t e r w i j l o o kn uo n g e l a b e l dg e a d s o r b e e r d
HFb
m e t g e l a b e l d HFb i nd eo p l o s s i n g .
v r i j w e lg e h e e lu i t w i s s e l t
Na 4 u u r l i j k t i n h e t g e h e e l g e e n u i t w i s s e l i n g v a n e i w i t meer OP t e t r e d e n .I nF i g u u r
4 e n 5 i s a a n g e n o m e nd a t
de
t o t a l ee i w i t c o n c e n t r a t i ea a nh e to p p e r v l a kt i j d e n su i t w i s selingconstantblijftalsfunctievan
de t i j d .
A d s o r p t i e van H F b en HSA a a nP S - l a t e x
I n t e g e n s t e l l i n gt o td ea d s o r p t i ev a n
HFb a a nP S - p l a a t j e s
b l i j k t d a t H F b a d s o r p t i ea a nP S - l a t e xb i n n e n
e v e n w i c h t s w a a r d eh e e f tb e r e i k t .
1 5 m i n u t e ne e n
V o o r H S A a d s o r p t i ea a n
P S - l a t e xw o r d te v e n e e n sb i n n e n1 5m i n u t e ne e ne v e n w i c h t s w a a r d eb e r e i k t .
De v o r mv a nd ei s o t h e r mh a n g st t e r ka fv a n
d eb e p a l i n g s m e t h o d ev a nd ee i w i t c o n c e n t r a t i e
i n ' d eo p l o s s i n g
v o o re n 'n aa d s o r p t i e ,v a ne i w i ta a nd el a t i c e s( z i eh o o f d s t u k 11). Wanneer d e . v e r m i n d e r i n g i n d ee i w i t c o n c e n t r a t i et e n
m e t behulp
g e v o l g e .va'n a d s o r p t i ea a nP S - l a t e x - w o r d tb e p a a l d
v a n UV s p e c t r o s c o p i e ' w o r d e n" h i g h - a f f i n i t y "i s o t h e r m e n
i n de
v e r k r e g e n ,w a a r b i jr e e d sb i jl a g ee i w i t c o n c e n t r a t i e o p l o s s i n gh e tv e r z a d i g i n g s n i v e a u w a a r d el i g t
bij
0,l
pgcm
-2
is bereikt.
De H S A p l a t e a u -
b i j a d s o r p t i ea a nP S - l a t e x
71
gebruikmakend van UV detectie. Dit is een factor 6 lager dan de plateauwaarde van HSA-adsorptie aan PS-plaatjes bepaald d o o r meting van de radioactiviteit aan het oppervlak(0,6 pgcm pgcm
-2
-2
1 . D e met UV detectie bepaalde plateauwaarde (0,6 1 van HEb aan PS-latex is niet vergelijkbaar met "de
plateauwaarde" van HFb aan PS-plaatjes omdati n dit geval geen plateau bereikt is.
O
2
4
.
6
8
10
eiwitconcentratie(gl-')
Figuur 6
Adsorptisisothermen voor HSA ( O ) P S - l a t e x .B e p a a l d aktiviteit in
uit d ev e r m i n d e r i n gi nr a d i o -
de o p l o s s i n g t e n g e v o l g e v a n a d s o r p -
t i e van g e l a b e l d e i w i t .
72
e n HFb (A) aan
A d s o r p t i e t i j d 1 uar.
.
De overeenkomst tussen de adsorptieisothermen van HFb en
HSA aan PS-latex (Figuur 6 ) bepaald door vermindering van de
radioactiviteit 'in de
.oplossing
van HSA en HFb (Figuur 2 1 ,
en de. adsorptieisothermen
bepaald door meting van de radio-
activiteit aan het oppervlak van PS-plaatjesis veel groter, dan bij vergelijking van de twee detectiemethodenU V en RAD bij adsorptie aan latices. De op deze wijze verkregen HFb isotherm aan PS-lateX is identiek aan de HFb isotherm aan PS-plaatjes.De HSA isotherm aan PS-latex heeft wel dezelfde vorm als de HSA isotherm aan PS-plaatjes, maar de oppervlakteconcentratie is bij PS-latex gemiddeld 4 0 % lager dan de HSA oppervlakteconcentratie aan PS-plaatjes bij dezelfde eiwitconcentraties in oplossing. is bestuOok uitwisseling van HFb en HSA bij evenwicht
deerd aan een systeem met PS-latex. Uit deze experimenten blijkt dat aan PS-latex geadsorbeerd gelabeld HSA en HFb totaal niet uitwisselt met ongelabeld HSA en HFb in de oplossing. Geadsorbeerd ongelabeld HSA en HFb wisselt slechts gedeeltelijk uit met gelabela HSA en HFb in de oplossing. (Tabel 111.1) De preadsorptietijd bedroeg 1 uur en er is gebruik gemaakt van eiwitoplossingen met een concentratie van1 g1-l. De uitwisselingstijd was maximaal 16 uur. De resultaten
met
betrekking
tot
eiwituitwisseling
aan
PS-latex
zijn
vergeleken met de uitwisseling van HSA en HFb aan PS-plaatjes en worden gegeven in TabelIII.1 Tot slot dient nog vermeld te worde'n dat ook aan PS-latex geadsorbeerd HSA en HFb in het geheel niet desorbeert tegen een PBS buffer binnen 5 0 uur.
73
TABEL
111 o I
Uitwisselingspercentage b i j evenwicht PS-latex
en
PS-plaatjes
van
aan
geadsorbeerd BSA en
HFb na 16 uur bij 2OoC.
*
A/B
wil zeggen preadsorptie metA en vervolgens uitwis-
seling
met
een
evenwichts
concentratie B in
de
oplossing;
een sterretje beduidt radioactief gelabeld materiaal. De -1
evenwichtsconcentratie was steeds 1 gl echter voor
111.4.
Discussie
Plateauwaarden van de adsorptie isothermen Hoewel, zoals uit de resultaten blijkt, ni.et,altijd plateauwaarden worden bereikt bij de adsorptie van plasmaeiwitten aan vaste oppervlakken, wordt toch algemeen aangenomen dat als het oppervlak verzadigd is met geadsorbeerd eiwit er sprake is van een monomoleculaire '
eiwitlaag. Baszkin en Lyman (1980) hebben adsorptiewaarden berekend voor KSA en HPb o p basis van de dimensies van deze eiwitmoleculen voor side-on en end-on adsorptie, waarbij zij uitgaan van een monomoleculaire eiwitlaag. De voorHSA is dan 0 , 2 5 p'g cm- 2 voor
berekende oppervlakteconcentratie side-on adsorptie en 0,90
-2
, p g cm voor end-on adsorptie.
V o o r HPb zijn deze waarden respectievelijk 0,27 en 1,85 Kg cm
-2
. (Hoofdstuk
I n tabel. 111.2
I, Tabel 1.1).
-2
pg cm
'
zijn de plateauwaarden gegeven voor,de
adsorptie van plasma eiwitten (HPb en HSA) aan polystyreen, polyethyleen en glas voor zover bekend in de literatuur. Uit
74
T A B E L1 1 1 . 2
" P L A T E A U W A A R D E NV " OOR DE ADSORPTIE VAN PLASMAEIWITTEN
AAN
POLYSTYREEN ( P S )G, L A E SN POLYETHYLEEN (PE). '
.
AM. E N S E L I J K SERUM A L B U M L N (EH S A )
.~ r e f e r e n t i e
p o l y m epel ra t e a u c o nmce. t h o d e . ( pg cm-2)
pH
(OCP-
I
PS
0.5 o .20 0.11 O . 14 0.62 0.20 0.60 0.10
d,epletle depletie depletie labeling labeling labeling depletie
slas
0.04 0.20 0.14
labeling 1abe.ling labeling
PE
O .'8 O
PE*
0.20 0.16 0.17
PS-latex PS-latex PS-latex PS PS * PS
PS-latex glas* glas*
PE PE* B
I R I
f
j
I R I R
labeling
. MENSELIJKFIBRINOGEEN(HFb
)
r
7.4 4.7 7.O 7.3 7.3 i 7.4 7.4 i 7.4 1
BRASH ( 7 6 ) ' 7.4 7.4 B R A (S8H1 ) . NORDE ( 8 3 ) 7.4 BRASH (69) BRASH (76) BRYNDA ( 7 8 ) BRASH ( 8 1 1,
labeling '
BRASH (69) NORDE (76)' NORDE (761 ' VDSCHEER(78): VDSCHEER( 78 l ì B R A( 8S 1H) ; L E N S E N (84 L E N S E N (84)'
tem
7.4 7.'3 7.4 7.4'
ionste (mol
37.
23 22 22
o -20
23 23 22 37 23 37 23
I
0.15 0.01 0.01 0.01 0.15 0.05 0.15 O . 15
37 20 20 22
0.05 0.05 I
o *,l5 0.20 0.20
0.05
.
1
i
p o l y mp e el ar t e a u c o m n ce.t h or d e fee r e n t i e ( pg cm-'! PS
mol '1
.
PS-latex PS-latex PS PS
PS-latex glas* glas* glas glas qlas
~
l
*
PE PE* PR*
--1.3 1.18 1.06 -L
.
IR labeling labeling
'
.
e i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n g
BRASH BRASH BRASH
(69) (76) (82)
7.4 7.3 7.4
37 23 22"
0.15 0.20 0.05
1 91-1
75
,
deze tabel wordt duidelijk dat de plateauwaarden, voor zover er werkelijk sprake van is, nogal uiteenlopen afhankelijk van de gekozen adsorptiecondities en d e gebruikte adsorptiemethode. In de meeste gevallen blijken de plateauwaarden wel te liggen tussen de door Baszkin berekende extreme waarden voor side-on en end-on monolaag adsorptie. Echter de plateauwaarde van H S A adsorptie aan PS-latex is lager dan verwacht o p basis van de berekende waarde voor side-on adsorptie. NORDE verklaart dit door aanname van een conformatieverandering van HSB ten gevolge van adsorptie. De in Hoofdstuk I1 en 111 bepaalde plateauwaarden voor HSA
door
en HPb adsorptie gemeten aanPS zijn consistent met de NORDE en VAN DER SCHEER bepaalde plateaus onder bijna
dezelfde condities (NORDE, 1976; VAN DER SCHEER, 1978). D e plateauwaarde van H S A aan PS plaatjes, bepaald door meting van de radioactiviteit aan hetPS oppervlak, is 6 maal hoger dan de plateauwaarde van HSA aan PS-latex met behulp van UV detectie (Figuur 5,
Hoofdstuk 11). Vergelijking tussen de
"plateauwaarden" van gelabeld HSA aan plaatjes met de
vlak is negatief geladen, terwijl de PS plaatjes ongeladen zijn, Echter o p basis van de zêta potentiaal ( - 2 0 oppervlaktelading berekend van minder dan
2
mV) is een
p:C cm- 2
voor
het latex oppervlak (NORDE, 1976). Dit correspondeert met de aanwezigheid van 1 of 2 negatieve ladingen per geadsorbeerd eiwitmolecuul in de monolaag. Het effect van de oppervlaktelading o p de adsorptiewaarden lijkt te verwaarlozen, Het verschil in berekende oppervlakteconcentratie dient veeleer gezocht te wordenin de heterogeniteit van gelabeld eiwit, zoals uit de karakterisering van gelabeld eiwit blijkt.
76
(Appendix IIA). Dit in combinatie.met de oppervlakte/volumeverhouding,
die bi j PS
,plaatjes-
anders ,is dan bi j
latex
experimenten. Een deel van het gelabeld eiwit adsorbeert preferentieel aan polystyreen. Deze preferentiële adsorptie komt bij kleine oppervlakken (PS-filmpjes) sterker tot uiting dan bij grote oppervlakken (PS-latex). Hierdoor wordt aan PS-filmpjes een hogere oppervlakte concentratieberekend.. In hoofdstuk IV van dit proefschrift wordt dit nog eens geïllustreerd aan de hand van de concurrerende adsorptie van HSA monomeren en,dimeren. De preferentiële adsorptie van dimeren komt ook hier aan kleinere oppervlakken sterker tot uitdrukking (zie TABEL IV.2). Beschrijvinq van de eiwitadorptie aan hydrofobe oppervlakken. Uit de figuren 2 en 6 blijkt dat de adsorptie van gelabeld HFb' en HSA afhankelijk is.van de concentratie in de oplossing. Echter desorptie van eiwitten geadsorbeerd aan PS oppervlakken in kontakt met buffer wordt niet gevonden. Toch is er sprake.van een dynamisch evenwicht, waarbij eiwitten adsorberen en desorberen (figuren 4 en 5 ) en waarbij verondersteld wordt dat de totale oppervlakteconcentratie konstant blijft tijdens uitwisseling. In aanwezigheid van eiwit in de oplossing kan het adsorptie-desarptie gedrag van eiwitten aan hydrofobe oppervlakken beschouwd worden als een reversibel proces, wanneer de eiwitconcentratie in de oplossing na adsorptie constantblijft. Aan
de
hand
van
een
aantal vergelijskingen 'zaleen
beschrijving worden gegeven voor het adsorptie-desorptie gedrag van eiwitten en de rol die eiwitten in oplossing daarbi j spelen. Voor monolaagadsorptie kan het volgende evenwicht worden opgesteld:
77
'
Hierinstaat
PS v o o r h e t e i w i t m o l e c u l e i n o p l o s s i n g ,
V ( v a c a t u r e )v o o rd eb e s c h i k b a r ep l a a t sa a nh e to p p e r v l a ke n P
A
( r e v )h e tr e v e r s i b e lg e a d s o r b e e r de i w i t m a l e c u l e . M e t dezeVergelijkingzouhetadsorptie/desorptieproces
b e s c h r e v e nk u n n e nw o r d e nb i je e nv o l 1 e . d i gr e v e r s i b e lp r o c e s . D e r e a l i t e i t i s e c h t e rd a tb i jv e r m i n d e r i n gv a nd e
e i w i t c o n c e n t r a t i e in de o p l o s s i n gg e a d s o r b e . e r d
e i w i t zeer
langzaamdesorbeertofinhetgeheelnietdesorbeert,
Nu z i j n e r a a n w i j z i ~ n g e n d a t e i w i t t e n i n g e a d s o r b e e r d e toestandeenandereconformatFebezittendaneiwittenin o p l o s s i n g( H o o f d s t u k
.
I , ) D e v e r a n d e r i n gi nd ee i w i t s t r u k t u u r
tengevolgevanadsorptieaanhetoppervlakheefttotgevolg e i w i t i no p l o s , s i , n gn i e , t
datdesorptieinafwezigheidvan
m o g e l i j k i s o fs l e c h t sz e e rl a n g z a a mv e r l o o p t .W a n n e e r
w e l e i w i t inoplossing
is, b l i j k td e s o r p t i ee c h t e r
er w e l moge.
l i j k ,h o e w e ld et o t a l eo p p e r v l a k t ec o n c e n t r a t i ed a n gelijkblijft(uitwisseling).
Aan h e t o p p e r v l a k
n a a s tr e v e r s i b e lg e a d s o r b e e r d
e i w i t ook e i w i t a a n w e z i g , d a t
m o e i l i j k of n i e t d e s o r b e e r b a a r
.
wel
is evenwel
ris, B i j a f w e z i g h e i dv a n
eiwit
indeoplossingblijktbijnaalhetaanwezigegeadsorbeerde
e i w i t g e f i x e e r di nd e" i r r e v e r s i b e l e "t o e s t a n d ,z o a l sb l i j k t e i w i t o n d e rd e z ec o n d i t i e sn i e td e s o r -
uitketgegevendat beert.
.
.
E e nt w e e d ev e r g e l i j k i n gv o o rd eb e s c h r i j v i n gv a nh e t a d s o r p t i e p r o c e s i s d a a r o mn o o d z a k e l i j k .
In (2) is P
A
( l r i r r l )'
m o e i l i j kd e s o r b e e r b a a rg e a d s o r -
beerd e i w i t . D e overgang van
P
A
( r e v )n a a r
P
A
( I ' i r r " )
k a na f h a n -
kelijkzijnvandecontacttijdtussengeadsorbeerd
e i w i t en
o p p e r v l a ke nv a nd ea a r dv a nd ei n t e r a c t i e 't u s s e ng e a d s o r b e e r de i w i te no p p e r v l a k . ( S O D E R Q U I S T ,
1980)
Dan i s e r n o g e e n d e r d e v e r g e l i j k i n g n o o d z a k e l i j k
78
voor d e
beschrijvingvanhetdesorptieproces:
U i t w i s s e l i n g van HSA en H F b a a n P S B i j
d eu i t w i s s e l i n gv a n
1
.
.
HSA e n HFb a a n P S f i l m p j e s
twee d i n g e n
( F i g u r e n 4 e n 5 ) a l s f u n c t i ev a nd et i j dv a l l e n
eiwit vertoont
o n m i d d e l l i j ko p .G e p r e a d s o r b e e r do n g e l a b e l d
e e na n d e rd e s o r p t i er e s p e c t i e v e l i j ku i t w i s s e l i n g s g e d r a gb i j e v e n w i c h td a ng e p r e a d s o r b e e r dg e l a b e l d
e i w i t .
b l i j k te e nf r a c t i eg e p r e a d s o r b e e r dg e l a b e l d
Bovendien
eiwit n i e t u i t -
w i s s e l b a a r m e t o n g e l a b e l d e i w i t i nd eo p l o s s i n g . t a t e n komen o v e r e e n m e t h e tw e r kv a n
BRASH.
Deze r e s u l -
(1978 en 1983).
eiwit
E r i s s p r a k e s v a n 2 a d s o r p t i e p r o c e s s e nd o o r d a tg e l a b e l d
i no p l o s s i n gh e t e r o g e e nb l i j k t
t e z i j n( A p p e n d i x
IIA).
1. Een r e v e r s i b e la d s o r p t i e p r o c e s ,g e l d e n dv o o ro n g e l a b e l d
e i w i t e ne e nd e e lv a nh e tg e l a b e l d
e i w i t . D i t e i w i t adeiwit i no p l o s -
s o r b e e r tr e v e r s i b e li na a n w e z i g h e i dv a n s i n ge nu i t w i s s e l i n g
i s m o g e l i j k .H i e r o p
i s de v o o r a f -
.
g a a n d ea d s o r p t i e b e s c h r i j v i n gv a nt o e g a s s i n g . 2.
Daarnaast t r e e d te e nt w e e d ea d s o r p t i e p r o c e so p ,w a a r b i j
g e e nu i t w i s s e l i n gm o g e l i j kb l i j k t . e e nd e e lv a nh e t. g e l a b e l d
D i t
g e l d ts l e c h t sv o o r
e i w i t . Voor d i t g e l a b e l d
eiwit
i s d ev o o r g a a n d eb e s c h r i j v i n gv a nh e ta d s o r p t i em o d e l
n i e tv a nt o e p a s s i n g .
Deze b e s c h r i j v i n g i s s l e c h t sv a n
79
t o e p a s s i n g op i d e n t i e k ee i w i t m o l e c u l e n . v a nh e t e r o g e n i t e i tv a ng e l a b e l d
eiwit.
1 9 8 3 ) v i n d t deze h e t e r o g e n i t e i tt e r u g
als
E r is d u ss p r a k e
Brash
(1978 e n 131
voor zowel I
g e l a b e l d HFb e n HSA.
Conclusie E i w i t a d s o r p t i e mag b e s c h o u w dw o r d e n p r o c e s Iw a a r b i j
eiwit i no p l o s s i n g
als eenreversibel
i n e v e n w i c h t is m e t
g e a d s o r b e e r d e i w i t a a nh e to p p e r v l a k .U i t w i s s e l i n gt u s s e n geadsorbeerd e i w i t en e i w i t i n o p l o s s i n g
is mogelijk.
W a n n e e rd ee i w f t o p l o s s i n gv e r v a n g e nw o r d td o o re e n b u f f e r o p l o s s i n gz o n d e r o n m i d d e l l i j kb e v r o r e n
e i w i t wordtdeevenwichtssituatie
of g e f i x e e r d .
Dit g e l d t ' v o o r
g e l a b e l d ee i w i t t e n .V o o rg e l a b e l d ee i w i t t e ng e l d t
deel v a n h e t g e l a b e l d e
g e a d s o r b e e r d e' t o e s t a n dn i e tu i t w i s s e l b a a r
80
dat een
e i w i t eensterketeaffiniteitheeft
met h e t o p p e r v l a kd a no n g e l a b e l d ee i w i t t e n . eiwit.
on-
D i t d e e l is i n
met o n g e l a b e l d
REFERENTIES
e n LYMAN, D.,
B A S Z K I NA, . ,
J.
Mater,. R e s . ,
Biomed.
14, 393
(1980). BRASH,
,
J.L.
e n L Y M A ND, . J . ,
J.
Biomed.
Mater.
Res.,
175
3,
(1969). BRASH,
en DAVIDSON,
J. L . ,
V. J . ,
9, 249
T h r o m o b o s i sR e s . ,
(1976). BRASH,
J.L.
,
e n SAMAK, Q.M.,
,
e n UNIYAL,
J.
C o l l o i d I n t e r f a c e Sci.,
64,
495 (1978). J.L.
BRASH,
S.,
of P o l y m e r S c i . : P o l y m e r
J.
Symp. 66, 377 (1979).
,
BRASH, J . L . , U N I Y A L , S . , P U S I ' N E R IC, . e n S C H M I T TA, . , C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . , 95, 28 (1983).
BRYNDA, E., HOUSKA, M . , Bioeng., 2, 411 (1978). C H A NB, . M , C . #
217
e n BRASH,
.
,
POKORNA, Z.
J.
J.L.,
J.
e n C E P A L O V AN, . A .
C o l l o i d Interface
I
J.
S c i . , . 82,
(1981)
e n A N D R A D EJ .,D . ,
COLEMAN, D.L., ATWOOD, A.I.,
J.
Bioeng.
1,
33 (1976).
JONSSON,
IT., I V A R S S O NB, . ,
J.
C o l l o i d Interface Sci,
90, 148
(1982).
J., O L T H U I SF ,. M . F . GB. ,A R G E M A ND,. , e n F E I J E N J . , I n t . J . o f A r t i f .O r g a n s .
K L E IE NL H O R S T , SMOLDERS', C.A.,
1,
288 (1978). L E ER, . G .
.'
8
en KIM,
S .W.
J.
8, 251
BiomedM . aterR . es.,
(1974)
Interface Sci.,
MAC R I T C H I E ,
F.,
J.Colloid
MAC R I T C ' H I E ,
F.,
Adv. P r o t e i n C h e m . ,
NORDE, Agric,. NORDE,
38, 484 (1972).
32, 283 (1978).
W.,,Proefschrift "Proteins a t Interfaces U n i v . Wageningen 76-6 (1976).
,
W.,
"Adhesion
.
and a d s o r p t i o n o f ' p o l y m e r s ,
Lee, N.York
(1980)
ORESKES,
en S I N G E R , J . M . ,
I.
J.
Immuh.
l',
commun.
B p 80 E d :
.
86, 338 (1961)
M.E., e n WALTON, A.G., 75, 386 (1979)
SODERQUIST,
Sci.,
VAN D E R SCHEER, P r o t e i n s ' ' Krips
82
J.
C o l l o i d Interface
A.., P r o e f s c h r i f t " A d s o r p t i o n R e p r o B.V. Meppel (1978).
o f Plasma
HOOFDSTUK I V
ALS METHODE
H I G H PERFORMANCE , L I Q U I D CHROMATOGRAFIE:(HPLC)
T E R B E S T U D E R I N G VAN CONCURRERENDE ADSORPTIE VAN E I W I T . T E N
.. 1v.1.
Inleiding
,
,
.
I
W a n n e e rl i c h a a m s v r e e m d em a t e r i a l e ni nc o n t a c tk o m e n ' m e t b l o e d 'is e e n v a n d e e e r s t o p t r e d e n d e v e r s c h i j n s e l e n d e a d s o r p t i ev a n ' p l a s m ae i w i t t e na a nh e tm a t e r i a a lo p p e r v l a k .
De
s a m e n s - C e l l i n gv a nd ea a nh e to p p e r v l a kg e a d s o r b e e r d ee i w i t -
"
t e nw o r d tv a a ki nv e r b a n dg e b r a ' c h tm e td e' b l o e d c o m p a t i b i l i Om i n z i c h t t e k r i j g e n i n d e a a n
t e i tv a nd e z em a t e r i a l e n . .
het oppervlak' geadsorbeerd6 eiwitlaag
i"s b e s t u d e r i n g v a n d e , . ' . ,
c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i - ev a np l a s m ae i w i t t e nn o o d z a k e l i j k .
,_
'
S l e c h t se n k e l es t u d i e sz i j nb e k e n dw a a r b i jd ec o n c u r r e r e n d e a d s o r p t i ev a np l a s m a' e i w i t t e n( m e e s t a lm e n s e l i j k a l b u m i n ' e - H S A ,m e n s e l i j kf i b r i n o g e e n - H F be nm e n s e l i j k gamma g l o b u l i n e - H I g G ) s y s t e m a t i s c h MOYER EN G O R I N
(1940)
m a a k t e ng e b r u i kv a nd e p l e t i é m e ' t i n g -
e n o m h e tc o n c u r r e r e n d ea d s o f p b i e g e d r a gv a n kwarts t e bestuderen.
Z i j
immuno
i s onderzocht. ,
v o n d e nd a te i w i t t e nn i e t
l i j k sa d s o r b e e r d e na a nt e v o r e n
,
H S A e n HIgG a a n
of nauwe-
m e t e e nw i l l e k e u r i ga n d e r
e i w i tg e p r e a d s o r b e e r d eo p p e r v l a k k e n .
BRASH'(i96.9)
conc'iu-
d e e r d em e tb e h u l ' pv a n. r a ' d i o l a b e l i n gd a to p p e r v l a k k e nw k a r a a n I
HSA p r e f e r e n t i e e l a d s o r b e e r d e m i n d e r ' t r o m b o g e e n o p p e r v l a k k e hw a a r a a n .
wapendan
HFb p r e f e r e n t i e e l a d s o r b e e r d e .
'
vlakkem.
LEE '
HFb,' HS'A e n HIgG ' a a nh y d r o f o b eo p p e r - "
D e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e 'v a nd ek e s p ' e c t i e v e l i j k e
e i w i t t e nb i jc o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e b i ja f z o n d e r l i j k ea a n b i e d i n g . KOCHWA
.
'
( 1 9 7 4 ) b e s t u d e e r d em e tb e h u l pv a nr a d i o l a b e l i n gd e . c o n c u r - '
r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
'
(19'77)
w a s b e d k i d e n dl a g e rd a n
To't d e z e l f d eb e v i n d i n g e n
v o o rd ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e
kwam
'van HSA, HFb
e n HIgG a a np o l y u r e t h a a n . 'T e v e n sv o n dh i jg e s r u i k m a k e n dv a n r a d i o l a b e l i n g ,d a td e z ee i w i t t e no n d e r l i n gg e d e e l t e l i j k u i t w i s s e l b a a rw a r e n .I nl a t e r es t u d i e sv a n
B R A S H( 1 9 7 9 1 ,
m a a k td e z em e l d i n gv a np r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a n
HFb a a n
p o l y s t y r e e n ,p o l y u r e t h a a ne ns i l i c o nr u b b e ro p p e r v l a k k e n .
83
BEISSINGER
( 1 9 8 2 )h e e f tg e t r a c h tg e b r u i k m a k e n dv a n d e k i n e t i e kv a n
fluorescentielabeling a d s o r p t i ev a n
HSA e n H I g G aan k w a r t s
de concurrerende
t e b e s c h r i j v e n met
b e h u l pv a nL a n g m u i r - H i n s h e l w o o dv e r g e l i j k i n g e n . B e h a l v e h e t r u i mv e e r t i gj a a ro u d eo n d e r z o e kv a n
MOYER e n
a l l e m a a l u i t g e v o e r dd o o r
G O R I N z i j nb o v e n s t a a n d es t u d i e s
U i t h o o f d s t u k I1 e n
g e b r u i k m a k i n gv a nl a b e l i n g s t e c h n i e k e n .
I11 b l i j k t d a t d o o rr a d i o l a b e l i n gh e ta d s o r p t i e g e d r a gv a n
Maar ook b i j g e b r u i k m a k i n gv a n
e i w i t t e n k a nv e r a n d e r e n .
f l u o r e c e n t i e l a b e l i n gk u n n e na r t e f a c t e no p t r e d e n 1981).
(CRANDALL
T e r v e r k r i j g i n gv a nb e t r o u w b a r er e s u l t a t e nd i e n t
g e b r u i k t e w o r d e ng e m a a k tv a no n g e l a b e l d ee i w i t t e n .
t e e l z i j n twee n i e u w em e t h o d e nb e k e n d a d s o r p t i ev a n labelingvooraf
Momen-
waarbij concurrerende
plasma e i w i t t e nb e s t u d e e r dk a nw o r d e nz o n d e r
.Dit
(BREEMHAAR 1 9 8 3 )e n
z i j n d e Enzym Immuno A s s a yM e t h o d e d e F o u r i e rT r a n s f o r m a t i eI n f r a r o o d
R e f l e c t i e methode (GENDREAU 1 9 8 2 ) . D e k w a n t i f i c e e r b a a r h e i d
v a n de met d e z e m e t h o d e n v e r k r e g e n a d s , o r p t i e r e s u l t a t e n v o r m t d e r e s , u l t a t e nv a nd e z e
n o ge e np r o b l e e m .T o tn ut o ew o r d e n m e t h o d e ng e k w a n t i f i c e e r dd o o rg e b r u i k
met g e l a b e l d e e i w i t t e n .
a d s o r p t i e r e s u l t a t e nv e r k r e g e n
In d e z e s t u d i e w o r d t t e r u g g e g r e p e n n a a r
techniek,
maar n ug e c o m b i n e e r d
Chromatografie (HPLC).
a l s f u n c t i ev a n mengsel.
d e o u d ed e p l e t i e
m e t H i g hP e r f o r m a n c eL i q u i d
Met d e z em e t h o d e
c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
t e m a k e nv a n
is h e t mogelijk d e
pIasma e i w i t t e n t e b e s t u d e r e n
eiwit-
de t i j d e n d e s a m e n s t e l l i n gv a nh e t
B i j d e z em e t h o d e
i s e r g e e n s p r a k e v a nm o d i f i c a t i e
v a ne i w i t t e nt e ng e v o l g ev a nl a b e l i n g . c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
HSA,
O p d e z ew i j z e
i s de
H I g G e n HFb a a n p o l y s t y r e e n
l a t e x( P S - l a t e x )b e s t u d e e r d ,d o o rz o w e le e ng e l i j k t i j d i g e a l s o p e e n v o l g e n d ea a n b i e d i n gv a n
plasma e i w i t t e n .
l i j k i n g i s o o kg e b r u i kg e m a a k tv a nl a b e l i n g s t e c h n i e k e n .
84
Ter v e r g e -
IV.2.
M a t e r i a l e ne nm e t h o d e n
was a f k o m s t i gv a n
D e g e b r u i k t ep o l y s t y r e e n( P S - l a t e x )
( D o w u n i f o r ml a t e xp a r t i c l e s
no.
41932) e n i s ge'karak-
t e r i s e e r dz o a l sb e s c h r e v e ni nh o o f d s t u k H e t l a t e xo p p e r v l a kp e r
schrift.
.
.
is gebruik
g e m a a k tv a nd ev o l g e n . d e
plasma e i w i t t e n :
k o m s i gv a n
HIgG ( a f k o m s t i gv a nh e tC e n t r a a l
de f i r m a K A B I ,
.
HSA ( n o . A 9 5 1 1 a f -
L a b o r a t o r i u mv o o rd eB l o e d t r a n ' s f u s i e d i e n s t )e n 6 5 3 1 3 a f k o m s ' t i gv a n
.
I1 v a nd i tp r o e f 2 ml. b e d r o e g 0,143 m
T i j d e ndsceo n c u r r e r e n daed s o r p t ieex p e r i m e n t e n
SIGMA, U S A ) ,
SERVA.
HFb ( n o .
Zweden).
D e karakterise-
is e v e n e e n sb e s c h r e v e ni nH o o f d s t u k
r i n gv a nd e z ee i w i t t e n
11. H S A monomeer e n dimeer i s v e r k r e g e n d o o r p r e p a r a t i e v e
z u i v e r i n gv a n
HSA
( n o . A 95111, d a t 1 0 - 1 4 % d i m e e rb e v a t .
monomeer e n d i m e e r i nh a n d e n
,
O O 1 N N a O H e n O ,15 M N a C l ) .
2 4' a l l e a d s o r p t i ee x p e r i m e n t e nu i t g e v o e r di n
bijeen
pH v a n 7,35
HSA
t e k r i j g e n m e t z u i v e r h e d e nv a n
meer d a n 9 7 % . D e g e b r u i k t ee l u t i e b u f f e r NaH PO
Met
6 B c h r o m a t o g r a f i e was h e m t ogelijk
b e h u l pv a nS e p h a r o s e
was PBS (0,Ol M PBS o p l o s s i n g e n O
e ne e nt e m p e r a t u u rv a n
C o n c u r r e r e n d ee i w i t a d s o r p t i e H P L C / d e p l e t i et e c h n i e kb e p a a l d .
,
O v e r i g e n sz i j n
2 0 C.
i s m e t b e h u l pv a nd e is d a a r b i jg e b r u i k
Er
g e m a a k tv a ne e nH i g hP e r f o r m a n c eL i q u i d .C h r o m a t o g r a a f
(Waters A s s o c i a t e s ) i n c o m b i n a t i e Micropack TSK-Gel
3 0 0 0 SW kolom
m e t e e nT o y 0S o d a (VARIAN).
m e t hydrofieledeeltjes
diameter). D e d e t e c t o rb e s t o n du i te e n '
(UV C o r d ,
LKB)
is
plasma e i w i t t e n e n
s p e c i a a lg e s c h i k tv o o rs c h e i d i n gv a n b e v a te e np o r e u z eg e l
Dezekolom
(10 ,p,m i n
UV s p e c t r o f o t o m e t e r
t o e g e r u s t m e t e e nd o o r s t r o o m c e le na f g e s t e l d
o pe e ng o l f l e n g t ev a n
280 nm.
Concentratiebepaling van het eiwit in d e OplossinÇ N o r m a a lg e s p r o k e nw o r d tb i jd e p l e t i e m e t i n g e nd e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ev a nh e t
e i w i t b e p a a l du i td ea f n a m e
v a ne i w i t c o n c e n t r a t i ei nd eo p l o s s i n gt e ng e v o l g ev a n adsorptie.
D e c o n c e n t r a i e a f n a m ek a no . a .g e v o l g dw o r d e n
b e h u l pv a n
UV s p e c t r o s c o p i e
(280 nm) g e b r u i k m a k e n dv a n
.
met
,
b e k e n ed xe t i n c t i e c o ë f f i c i e n t ze o n a.hli sn oofdstuk beschreven.
.
I1
B i j d e H . P L C / d . e p l e t i e t e c h n i e kw o r d t
de
met b e h u l p
e i w i t c o n c e n t r a . t i ei no p l o s s . i n ge v e n e e n sb e p a a l d
v a n UV s p e c t r o s c o p i e , maar nu i s h e ts p e c i f i e ko p p e r v l a kv a n d e e i w i t p i e k( o o k
wel d e p i e k . h o o g t e )i n. h e t
c h r o m a t o q r a me e nm a a tv q o r
HPLC
.
I
d e b i j d e z ep i e kb e h o r e n d e
de oplossing.
e i w i t c o n c e n t r a t i ei n
Om i n z i c . h t t e k r i j g e n i n - d e j u i s t h e i d e n n a u w k e u r i g h e i d
i s . d e p i e k h o o g t ev a n
v a nd e z em e t h o d e
HSW e n HFb p i e k e n i n h e t
de r e s p e c t i e v e l i j k e
HPLC c h r o m a t o g r a mu i t g e z e t
f u n c t i ev a nh u nc o n c e n t r a t L e. i n
d e o p l o s s i n g( F i g
was n i e t . g r o t e r d a n
s p r e i d i n gi n , d ep i e k h o o g t e
d e z e l f d e ,e i w i t c p n c e n t r a t i e si n
als
,
I). De
3% b i j
d e o p l o s s i n ge nd , e z e l f d e
HPLC
condit.ieS.
Concurrerende a d s o r p t i e : B i j d e c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ee x p e r i m e n t e nk a nn u
met b e h u l pv a n
d e p l e t i eg e v o l g dw o r d e n
H S A monomeer,
v a ne e ne i w i t m e n g s e l( b . v .
m e t H F b e nH I g G )
i nc o m b i n a t i e
HPLC.
de
V o o r a fw o r d t
H S A dimeer o f
HSA
met b e k e n d ee i w i t c o n c e n t r a -
t i e s e e n H P L C c h r o m a t o g r a mg g m a a k t .V e r v o l g e n sw o r d ta a n
dit
m e n g s e le e nb e k e n d eh o e v e e l h e i dP S - l a t e xt o e g e v 0 e g . d( z i e T a b e l IV.l
en^
de PS-latex
' e i w i t s u s p e n s i e sg e c e n t r i f u g e e r dg e d u r e n d e
I.V.2) e nn a
m i n u t e ni ne e n
de vereiste.a'dsorptietijd
SORVALL' RC-28
c e n t r i f u g e (20.000
15
g). D e
b o v e n s t a a n d eh e l d e r e' v l o e i s t o fw o r d tg e ï s o l e e r de n i n d e e i w i t c o n c e n t r a t i ew o r d tb e p a a l dd o o r
word'en'
d e afname
d e a f n a m ei n
de r e s p e c t i e v e l i j k ee i w i t p i e k é ni nh e t
p i e k h o o g t ev a n
Z
HPLC
'
chromatogram. T w e e f a c t o r e ns p e l e ne e nb e l a n g r i j k e
r o l i n d.e nauwkeu-
op d e z ew i j z ev e r k r e g e na d s o r p t i e g e g e v e n s .
r i g h e i dv a nd e
T e n e e r s t e ' h e ts c i e ï d e n dv e r m o g e nv a n
d e g e b r u i k t e H'PLC
r . '
kolom.Eengo-ede
b a s i s l i j n s c h e i d i n gv a n
alle i n de oplosking
a a n w e z i g ec o m p o n e n t e n ' i sn o o d z a k e l i j k .T e n
tweede,
de -
d e p l ' e t i em o e tb e d u i d e n ' dg r o t e rz i j nd a n e i w i t i no p l o s s i n g ,g e z i e n
r
3 % v a n het a a n w e z i g e
d'e s p r e i d i n g i n
de concentratie-'
. .
bepaling. A l s ? a a n b e i d e v o o r w a a r d e nv o l d a a n
86
i s k a n op d e z e w i j z e
de
.
o '0,5 eiwitconcentratie (g!-') Fig.
1 D e h o o g t ev a nd e
H S A monomeer
p i e k e ne nv a nd e
(O)
en.dimeer (O)
HFb ' ( A j p i e k i n h e t
HPLC c h r o m a t o g r a m
a l s f u n c t i ev a nd ee i w i t c o n c e n t r a t i e " i no p l o s s i n g . U i t delineariteit
i s af t e l e i d e n d a t
de p i e k h o o g t e
e e n maat i s v o o r d e - e i w i t c o n c e n t r a t i e i n ' . o p l o s s i n g . v
.
.
.
concurrerende. adso~rptie 'van ongexabelde eiwitten ,. . ,. . k w a n t i t á t i e fw o r d e nb e p a a l d .
.
Ter v e r g e l i j k i n g
I
i s 'de c o n c u r r ' e r e n d e a d s o r p t i e v a n g e l a -
b e l d e e i w i t t e nb e s t u d e e r d .
D e e i w i t t e n, z i j ng e l a b e l dv o l g e n s
de c h l o o r a m i n e T m e t h o d e
( K L E I N ELHORST 1978). Door g e b r u i k
t e maken va'ri I 125 e n Il3l l a b e l s i s h e t m o g e l i j k g e l i j ' k tijdigeadsorptievan
2 e i w i t t e n i n e e ne i ! # i t m e n g s e l
t e vol-
87
gen.
Ook k a n op d e z ew i j z e
de u i t w i s s e l i n g t u s s e n v e r s c h i l -
l e n d ee i w i t t e nw o r d e ng e v o l g d ,z o a l sb e s c h r e v e ni nH o o f d s t u k 111 v a n d i t p r o e f s c h r i f t .
TV. 3 .
Resultaten
I n de f i g u r e n 2 t / m
4 w o r d e n d e HPLC c h r o m a t o g r a m m e ng e -
g e v e nv a nv e r s c h i l l e n d ec o m b i n a t i e s
HIgG e n HFb voor e n
HSA,
2 w o r d te e nc h r o m a t o -
n aa d s o r p t i ea a nP S - l a t e x .I nf i g u u r
-l
g r a mg e t o o n dv a ne e nm e n g s e lb e s t a a n d eu i t -1 e n 1,8 g1 HIgG v o o re nn aa d s o r p t i e .
O , 37 g 1
HFb
H e t v e r s c h i l( g e a r -
c e e r do p p e r v l a k )w o r d tv e r o o r z a a k td o o ra d s o r p t i ev a n Infiguur
eiwit.
3 w o r d te e nc h r o m a t o g r a mg e g e v e nv a ne e nm e n g s e l -I -1 HSA ( 3 g l ) e n HFb (0,3 g1 ) voor-
w a a r i no n g e z u i v e r d
k o m e n ,v o o re nn aa d s o r p t i e .I nb e i d ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e e x p e r i m e n t e nw o r d ta a n g e t o o n d
tieel adsorbeert.
dat HFb s t e r k p r e f e r e n -
A l s i nd e z ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e e x p e -
r i m e n t e n de c o n c e n t r a t i e v a n d e e i w i t t e n w o r d t g e v a r i e e r d
op
steeas HFb i n d e
e e nz o d a n i g ew i j z e
dat naadsorptienog
o p l o s s i n ga a n w e z i g
i s , b l i j k t d a t geen of t e n m i n s t ee e nn i e t
detecteerbarehoeveelheid
HIgG of HSA a d s o r b e e r t a a n
het
P S - l a t e xo p p e r v l a k . Infiguur
4 w o r d td ev e r a n d e r i n gi nh e t
HPLC c h r o m a t o g r a m
g e g e v e nt e ng e v o l g ev a na d s o r p t i ea a nP S - l a t e xv a ne e n
meng-
sel bestaandeuit g l - l 1,
HFb
k e n i n gv a n
3 e i w i t t e n t e w e t e . ng e z u i v e r d HSA (2, O -l -1 (0,45 g1 ) e n HIgG ( O , 7 6 g 1 1. D e bere-
de a d s o r p t l e g e g e v e n s
i s i nd i tg e v a lg e c o m p l i -
c e e r d e rd o o r d a td ep i e kv a n HSA n i e t v o l l e d i g t e s c h e i d e n i s v a n d i e v a n H I g G i n h e tc h r o m a t o g r a m . D e adsorptiec o n c e n t r a t i e sb e h o r e n db i jf i g u u r a a n n a m ev a nv o l l e d i g e
4 z i j nb e r e k e n d
door
HEb a d s o r p t i e e n g e e n HSA a d s o r p t i e .
D e a d s o r p t i e g e g e v e n sv e r k r e g e nd o o rt o e p a s s i n gv a nd e
H P L C / d e p l e t i et e c h n i e k( F i g u r e n
2 .t/m
4)
z i j ns a m e n g e v a t
in
T a b e l IV.1.
H e tb e r e k e n e nv a nk w a n t i t a t i e v ea d s o r p t i e g e g e v e n sv o o r c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
HSA e n HIgG a a nP S - l a t e x
d e h u i d i g e e x p e r i m e n t e l eo p s t e l l i n ge r gl a s t i g .
ss
D i t
de
is met komt,
O
I
I
2
4
t
'
l
I
6
I
8
I
I
10
elutietijd (min.)
Fig.
2 HPLC chromatogram van een m e n g s e l HFb (083.7 g1 -1 ) -1 p i e k 1 en HIgG ( 1 8 8 g1 ) . p i e k 2 e n 2' i n PBS, p H O -1 7 , 3 5 8 2 0 C elutiesnelheid I m l min , elutiebuffer PBS. adsorptie
Het gearceerde oppervlak verdwijnt door
. Adsorptieti jd
is v i e r uur.
89
l
1
I
4
O
1
1
l
-
I
s
8
6
I
10
elutietijd (min.)
Fig.
3 HPLC chrornatogram van
piek 3''-
i
e no n g e z u i v e r d
D e condities
-1 e e nm e n g s e l H F b (0,3 g1 1, -1 ESA ( 3 g1 1 , p i e k 3, 3 ' e n
zijn g e l i j ka a n
d i e v a nf i g u u r
H e t g e a r c e e r d eo p p e r v l a kv e r d w i j n td o o ia d s o r p t i e . 1
90
.
2.
ö
I
I
8
,
I
I
10
12
I
I
.18 14
I
16
elutietijd (min.)
Fig.
4 HPLC chromatogramvaneenmengsel
p i e k 1, H I g G (0,76 gl-'), HSA
(2,O
sl-l),
piek 3.
HFb ( 0 , 4 5
g1
-1
),
p i e k 2 en 2 ' en ,gezuiverd D e c o n d i t i e s voor a d s o r p t i e
z i j n a l s b i j f i g u u r 2. H e t g e a r c . e e r d eo p p e , r v l a kv e r dwijnt door a d s o r p t i e .
.
. ..
n
.
91
z o a l sr e e d s
eerder v e r m e l d ,d o o r d a th e tn i e tm o g e l i j k
i s met
d e g e b r u i k t e HPLC kolom d e H S A e n HIgG c o m p o n e n t e nv o l l e d i g
t e s c h e i d e n .K w a n t i t a t i e v ea d s o r p t i e q a a r d e nk u n n e nd a no o k Wel i s g e c o n s t a t e e r d d a t b i j g e l i j k e
n i e tw o r d e ng e g e v e n .
b e g i n c o n c e n t r a t i e s H S A e n HIgG i n d e o p l o s s i n g e n v o l d o e n d e HSA d e t e c t e e r b a a r
P S - l a t e xa a n b o dn aa d s o r p t i ea l l e e nn o g i n d e o p l o s s i n g .I n
resultatenbeschikbaar v o o r g a a n d er e s u l t a t e n .
,
d i e v e r g e l e k e nk u n n e nw o r d e n
met
Wel i s i n o n s l a b o r a t o r i u m de c.oncur125 131
r e r e n da ed s o r p t b i ee s t u d e e rvda n P S - l a t e xe n
e n H FabaIn
HSAI
PS p l a a t j e so n d e ro v e r e e n k o m s t i g ec o n d i t i e s .
G e z i e n d e r e s u l t a t e ni nH o o f d s t u k
I1 e n 111 i s e c h t e re e n
v e r g e l i j k e n d es t u d i en i e tz o n d e rc o m p l i c a t i e( m o g e l i j k p r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a ng e l a b e l d
I nF i g u u r .
eiwit).
5 i s d e a d s o r p t i e i s o t h e r mv a n
HSA a a n P S
.
p l a a t j e s g e g e v e n b i j a a n w e z i g h e i dv a ne e nv a s t ec o n c e n t r a t i e HFb
92
(0,3
gl-')
is
d e l i t e r a t u u rz i j ng e e nc o n c u r r e r e n d e
i no p l o s s i n g .
D e HSA i s o t h e r m l i j k t e e n
plateauwaarde.te benaderen bij 5 gl-l in de oplossing, waarbij de oppervlakteconcentratie oppervlakteconcentratie i's dan 0,l
0,4
pgcm
pgcm - 2 -2
is. D e HFb
De opper-
vlakteconcentrat'ie HF.b neemt duidelijk af bij toenemende concentratie HSA in oplossing. Wel blijkt dat 'd0o.r aanwezigvoor HSA 3 0 % heid van HFb in de ,oplossing de plateauwaarde
lager is in vergelijking met de plateauwaarde van de adsorptieisotherm van gelabeld HSA (zonder bijmenging van andere -2 ) . eiwitten) aan PS (0,6 pgcm
HSA concentratie (gl-') Fig.
'
5 A d s o r p t i ei s o t h e r mv a ng e l a b e l d HSA b i j v a s t e HFb -1 -2 concentratie van 0 1 3 ga 1a n P S film ( 2 cm ). 125 131 D e a d s o r p t i ev a n HSAI ( O ) e n HFbI (A) i s g e g e v e n als f u n c t i e v a nd ec o n c e n t r a t i e sing.
HSA i n o p l o s -
D e a d s o r p t i e t i j d i s z e su u r .
I n figuur 6 wordt een gelijksoortige isotherm van gelabeld HSA'gegeven als in figuur 5. N u voor de adsorptie HSA1125 .aan PS-latex bij aanwezigheid van een vaste beginconcentratie HFb van 0,8 g1-l. Na
adsorptie is haast alle
HSA concentratie (gl-')
Fig.
6 A d s o r p t i e i s o t h e r m ( a d s o r p t i e t i j d e e nu u r )v a n 125 HSAI CO), b i j e e n vaste b e g i n c o n c e n t r a t i e L31 -2 HFbI ( 0 , 8 4 1 - l ) aan P S - l a t e x ( 1 0 6 8 c m ) i n
een b u f f e r v o l u m ev a n D e adsorptie van HSAI
60O-vl. 125
(o) e n
gegeven a l s f u n c t i e v a n
oplossing.
HFbI
131
(A) i s
de e v e n w i c h t s c o n c e n t r a t i e HSA i n
is n a . a d s o r p t i e
D e e i n d c o n c e n t r a t i e HFbI
m i n d e r dan 3% van .de b e g i n c o n c e n t r a t i e . HFb u i td eo p l o s s i n gv e r d w e n e n .
E r i s h i e rd u ss p r a k ev a n
e e n s t e r k e p r e f e r e n t i g l ea d s o r p t i ev a n v o o r H S A i s nu 0,04 pgcm
-2
.
D e c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
d e e r d ' a l sf u n c t i ev a n b l e e kd a tb i n n e n z o w e lv o o r
HFb.
D e plateauwaarde
HSA en-HFb i s ook b e s t u B i j a d s o r p t i ea a nP S - l a t e x
de t i j d .
1 5 m i n u t e nd ee v e n w i c h t s w a a r d e
was b e r e i k t ,
g e l a b e l d e a l s voor o n g e l a b e l d ee i w i t t e n .
a d s o r p t i ea a nP S - p l a a t j e s
b l e e k HFb b i n n e n 15 m i n u t e ni n
d e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ev a n
e v e n w i c h t ,e c h t e r 1 5 m i n u t e ns l e c h t s
0,25.
e eenv e n w i c h t s w a a r dvea n
B i j
vgcm 0,4
-2
e n . . b e r e i k t ep a sn a -2 -1 pgcm b i j 5 g1
HSA
was n a
5 uur
. -Van-
z e l f s p r e k e n dz i j na l l ei s o t h e r m e no n d e re v e n w i c h t s o m s t a n d i g heden bepaald.
94
-
uitwisselingvan
en i i F b a a n P S - l a t e x .
'HSA
U i t w i s s e l i n g t u s s e n g e a d s o r b e e r d HSA e n HFb i n o p l o s s i n g
met d eH P L C / d e p l e t i et e c h n i e k .
i s b . i jl a t e xn i e ta a n g e t o o n d
e x t r a a d s o r p t i ea a n g e t o o n d .
Wel i s i ns p e c i a l eg e v a l l e n
n e e r a a n PS l a t e xg e d u r e n d e5 , b r u i k m a k e nvda n
l g1
-1
10,
Wan-
30 e n 6 0 m i n u t e n g , e-
HSA o p l o s s i n g , 'HSA g e p r e a d s o r b e e r d -1 1 g1 HFb w o r d t
w o r d et nv e r v o l g e n se e no p l o s s i n gv a n t o e g e v o e g d ,d a nb l i j k td a td e c o n s t a n tb l i j f t , a d s o r b e e r t( 0 , 3 5
HSA o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e
t e r w i j l t o c he e ne x t r ah o e v e e l h e i d -2 ) . HSA a d s o r b e e r tn i e ta a nl a t e x pgcm
HFb
w a a r a a n HFb g e p r e a d s o r b e e r d i s .
met
U i t w i s s e l i n g s s t u d i e sa a nP S - l a t e xz i j n o o ku i t g e v o e r d 131 125 b e h u lvpagne l a b e l de ei w i t t e n (HSAI HFbI en 1. HFb w i s s e l t n i e t meer u i t met
G e p r e a d s o r b e e r dg e l a b e l d g e l a b e l d HSA i no p l o s s i n g .
Wel a d s o r b e e r tg e l a b e l d
l a t e x o p p e r v l a k k e nw a a r a a ng e l a b e l d De HSA a d s o r p t i e
,
HSA a a n
HFb g e p r e a d s o r b e e r d
is.
i s d a n wel a a n z i e n l i j kl a g e ri nv e r . g e l i j -
k i n g met HSA a d s o r p t i ea a nP S - l a t e xo p p e r v l a k k e nw a a r b i j HFb i s g e p r e a d s o r b e e r d .W a n n e e ra a nd el a t e x 2 o p p e r v l a k k e n H S A m e . t e e n waarde v a n O , 14, ygcm g e e ng e l a b e l d
gepreadsoxbeerd.wo'rdtenvervolgens.incontactge
HSA,
HFb i nd e, o p l o s s i n g .
HSA De
HFb w o r d t , n i e t ' b e ï h v l o e d d o o r t e v o r e ng e a d s o r b e e r da a n .h e t .
latexoppervlak.
U i t w i s s e lvianng
H S A e n H F b PaSa-np l a a t j e s
Ie
. .. .
L
Anders i s h e tg e s t e l dw a n n e e rb i ju i t w i s s e l i n g s s t u d i e si n .
p l a a t sv a nP S - l a t e xg é b r u i kw o r d tg e m a a k tv a n , D e u i t w i s s e l i n gv a n
gegeven i n f i g .
H'Fb e n HSA a a n P S p l a a t j e s wordt. weer-
.
7. I nd i tg e v a lw o r d tg e l a b e l d ' H F ba a nh e t " '
o p p e r v l a kg e d e e l t e l i j kv e r d r o n g e nd o o ro n g e l a b e l d lossing.
t
PS p l a a t j e s ' ;
Ook w o r d tg e l a b e l d
HSA i n op-
HSA a a nh e to p p e r v l a k . g e d e e 1 -
t e l i j kv e r d r o n g e nd o o ro n g e l a b e l d
"
'
HFb i n oplossing.
95
h
10
30
20
100
5d
40
uitwisselingstijd(uren)
Fig.
7 U i t w i s s e l i n g van HPb1125 ( 0 , 3 4
b e e r da a nP S - p l a a t j e s
Cv).
U i t w i s s e l i n gv a n
g e a d s o r b e e r da a n oplossing
(a).
V g ~ r n - ~ )g e a d s o r -1 met 3 gl HSA i no p l o s s i n g -2 L25 HSAX ( O , 3 3 gcm 1 ,
-l
PS p l a a t j e s m e t 0,3 g1
HFb i n
H e t p e r c e n t a g e van d e o o r s p r o n k e l i j k e
o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e ís u i t g e z e t a l s f u n c t i e van detijd.
lij k 3 g l
Aan d e PS o p p e r v l a k k e n i s met r e s p e c t i e v e -1 -1 HSA e n O , 3 g 1 HFb g e d u r e n d d erie '.
u u rv o o r a f
HSA e n HFb g e a d s o r b e e r d .
D e concurrerende a d s o r p t i e van ESA m o n o m e r e n en d i m e r e n aan
PS-latex Naast b e s t u d e r i n gv a n HFb e n H I g G i s h e t
de c o n c u r r e r e n d e a d s o r p t i e v a n
o o k m o g e l i j k om met b e h u l pv a n
HSA, de
H P L C / d e p l e t i em e t h o d ed e c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a nd i m e r e n enmonomeren
van e e n z e l f d e e i w i t t e b e s t u d e r e n .
geillustreerdaan
de h a n dv a n
a d s o r p t i ea a nP S - l a t e x .
de H S A d i m e e r enmonomeer
H e t blijktdathetpercentage
d i m e e ri nd et o t a l eh o e v e e l h e i dg e a d s o r b e e r d
96
D i t wordt
HSA
HSA
verandert
TABEL IV. 2
V A N H S AD I M E E R
C O N C U R R E R E N D EA D S O R P T I E G E V E V E N S
EN MONOMEER
AAN PS L A T E X *
oplossing H S A c o n c .d i m e e r
O. 325
12
4.4
0.067
58
0.310
12
8.8
0.137
34
O. 294
11
13.4
O. 104
34
O. 294
l1
13.4
O. 104
34
O. 240
10
29.4
0.114
24
O 247
10
27.5
0.107
24
0.151
10
55.6
0.107
18
O. 1 5 5
10
54.4
O. 1 0 5
17
0.034
13
90 .o
0.086
14
0.032
14
90.6
0.086
14
.
*
oppervlak p e r c . g e a d s geads .hoeeiwit (%) veelheid HSA(ugcm-2:
A d s o r p t i en a 1 u u r . b i j 2OoC i n e e n P B S o p l o s s i n g , pH = 7 , 3 5 . O, 5 m l M e n g s e l s .v a n 1,4 m l o n g e z u i v e r d HSA (14% d i m e e r ) e n PS l a t e x m e t v e r s c h i l l e n d e c o n c e n t r a t i e s z i j n g e b r u i k t . D e HSA b e i n c o n c e n t r a t i e v a n h e t m e n g s e l is steeds O , 34 ( g l - ? )
..
m e td eh o e v e e l h e i dt o e g e v o e g dP S - l a t e xb i je e nk o n s t a n t e beginconcentratie
HSA i n o p l o s s i n g ( T a b e l
IV2).
B i j . e e ng r o t e : v e r h o u d i n gv a nl a t e xo p p e r v l a kt o tv o l u p l e
v a n de e i w i t o p l o s s i n g is d ed i m e e r / m o n o m e e rv e r h o u d i n ga a n h e to p p e r v l a kg e l i j ka a nd ev e r h o u d i n gi nd eo p l o s s i n g .
B i j
e e nk l e i n ev e r h o u d i n gl a t e xo p p e r v l a kt o tv o l u m ev a nd e e i w i t o p l o s s i n gk o m td ep r e f e r e n t i ë l e
dimeer a d s o r p t i eg o e d
'
totuiting.
97
IV.4.
Discussie
H o e w e lv e r s c h i l l e n d em e t h o d e nz i j nt o e g e p a s tv o o rd e b e s t u d e r i n gv a ne i w i t a d s o r p t i ea a nv a s t - v l o e i s t o fg r e n s v l a k k e n ,h e b b e ns l e c h t sh e tg e b r u i kv a nr a d i o l a b e l i n ge n fluorescentielabelingvaneiwittengeleidtotkwantitatieve a d s p r p t i e g e g e v e n sb i jc o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ee x p e r i m e n t e n . H e t g e b r u i kv a ng e l a b e l d ee i w i t t e n ,
zo b l i j k t u i t h o o f d -
s t u k I1 e n 111 l e i d t n i e t a l t i j d t o t b e t r o u w b a r e a d s o r p t i e resultaten.
I n d i t h o o f d s t u k i s a a n g e t o o n dd a tk w a n t i t a t i e v e
g e g e v e n sv o o rc o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ee x p e r i m e n t e nv e r k r e g e n k u n n e nw o r d e nz o n d e rg e b r u i , k eiwitten.
t e m a k e nv a nl a b e l i n gv a n
D e b r u i k b a a r h e i dv a nd eH P L C / d e p l e t i em e t h o d e
is
g e i l l u s t r e e r da a nd eh a n dv a nd ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n HIgG,
HFb,
HSA monomeer e n HSA d i m e e r .G e z i e nd es n e l l eo n t -
wikkeling m e t betrekkingtotde
HPLC e i w i t a n a l y s e , z a l h e t
i n d et o e k o m s tm o g e l i j kw o r d e nd ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e v a nm e e r d e r ee i w i t t e n blijft dat het
t e b e s t u d e r e n .B e p e r k e n d ef a k t o r
m e t d e z em e t h o d en i e tm o g e l i j k
is concurre-
te bestuderen.
r e n d ee i w i t a d s o r p t i ea a nk l e i n eo p p e r v l a k k e n
U i t de r e s u l t a t e n b l i j k t d a t s t e e d s e e n s t e r k e p r e f e r e n -
t i ë l e a d s o r p t i ev a n
v a nz o w e l
HFb w o r d tw a a r g e n o m e nw a n n e e rm e n g s e l s
HSA e n HFb o f HIgG e n HFb i n c o n t a c t g e b r a c h t
w o r d e n m e t P S - l a t e x .B o v e n d i e nt r e e d tg e e na d s o r p t i e HSA e n HIgG w a n n e e r e r n o gs p r a k e
op v a n
i s v a n HFb i n o p l o s s i n g .
D i t stemt o v e r e e n m e t d er e s u l t a t e nv e r k r e g e n
m e t b e h u l pv a n
r a d i o l a b e l i n gw a a r b i jd ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a n H S A I 125
e n HFbI13'
is b e s t u d e e r d a a n P S - l a t e x .
e x p e r i m e n t e nw o r d td u i d e l i j kd a th o e w e l
U i t onze
HSA1125 p r e f e r e n -
tieel adsorbeerttenopzichtevanongelabeld
HSA ( H o o f d s t u k
11) d e z e p r e f e r e n t i e ' n i e t t o t u i t i n g
o n g e l a b e l d HFb.
D a a r b i jm o e t e n
komt t e n o p z i c h t e v a n 125 w e ook b e d e n k e n d a t HSbI
b e s t a . a tu i te e nm e n g s e lv a no n g e l a b e l d
eiwit
( 9 7 % ) e ng e -
l a b e l d e i w i t ( 3 % )w a a r v a ns l e c h t se e nz e e rk l e i n ef r a c t i e r a d i o a c t i e f. g e l a b e l d
is. B i j u i t p u t t i n g s m e t i n g e n i s g e l a b e l d
HSA n i e t i n s t a a t o n g e l a b e l d
te verdringen.
98
HFb v a n h e t P S - l a t e x o p p e r v l a k
Hoewel HFb: s t e r k p r e f e r e n t i e e l a d s o r b e e r t , w a c h t e nd a ti ne e r s t ei n s t a n t i e
HSA e n HIgG w e l a d s o r b e r e n
a a nh e to p p e r v l a ki na a n w e z i g h e i dv a n
HFb.
o m d a t . d ed i f f u s i e c o e f f i c i ë n t e nv a n d a nd i ev a n
HFb.
a a n w e z i g h e i dv a n u i t w i s s e l tm e t
D i t k a ng e b e u r e n
HSA e n HIgG g r o t e r z i j n
H i e r u i tm o e tg e c o n c l u d e e r dw o r d e nd a ti n . HFb i n i t i e e l g e a d s o r b e e r d
HFb.
l a a tg e a d s o r b e e r d
i s h e t te ver-
E c h t e rn a
HSA of
HIgG s n e l
5 m i n u t e np r e a d s o r p t i e t i j d
HSA ( o n g e l a b e l d )z i c hn i e tm e e rv e r d r i n g e n
d o o r HFb ( o n g e l a b e l d ) , D i t b e t e k e n td a td ed o o rh e t o p p e r v l a kg e i n d u c e e r d ev e r a n d e r i n gv a nh e tg e a d s o r b e e r d e b i n n e nv i j fm i n u t e no p t r e e d t .
HSA
Deze v e r a n d e r i n gw o r d ti n
h o o f d s t u k 111 v a n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n
met
vergel'ijking ( 2 ) a l s P ( r e v ) - + P ("irr"). A A GENDREAU v i n d t e c h t e r w e l uitwisselingtussen
HSA e n HFb
'
g e d u r e n d ed ee e r s t em i n u t e nv a na d s o r p t i eg e b r u i k m a k e n dv a n d e FTIR d e t e c t i e t e c h n i e k b i j c o n c u r r e r e n d e a d s o r p t i e v a n
HSA
e n HFb a a ne e ng e r m a n i u m k r i s t a l . , anneer O p v a l l e n d . i s d a tw
HSA e e np l a t e a u w a a r d eh e e f t
b e r e i k ti nd ea d s o r p t i e ,h e tv o o r
i
HFb n o gs t e e d sm o g e l i j k
is
om t e a d s o r b e r e n .K e n n e l i j kz i j ne rd a nn o gs t e e d so p e n p l a a t s e na a nh e to p p e r v l a ka a n w e z i gw a a r o p ren.
Op b a s i sv a nt h e o r e t i s c , h eb e r e k e n i n g e n
volledigbedekt 0,25
HFb k a na d s o r b e -
-2
p.gcm
i s h e to p p e r v l a k
m e t HSA b i j e e n o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e v a n
(een d i c h t s t se t a p e l i n g van side-on geadsor-
b e e r d HSA a a n n e m e n d e ) , D e g e v o n d e np l a t e a u w a a r d ev o o r HSA i s -2 Ot l pgcm Op b a s i sv a nd e z eb e r e k e n i n g e nz i j nb i j deze
.
p l a t e a u w a a r d en o go p e np l a a t s e na a nh e to p p e r v l a ka a n w e z i g . B i j o n d e r l i n g ev e r g e l i j k i n gv a nd ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e -
g e g e v e n sv a n
HFb e n HSA a a nP S - l a t e xe nP S - p l a a t j e ss p r i n g e n
d ea f w i j k e n d ea d s o r p t i e r e s u l t a t e nv a n P S - p l a a t j e so n m i d d e l l i j ki nh e t
HSA e n HFb a a n
oog. K , e n n e l i j ks p e e l td e
o p p e r v l a k t e / v o l u m ev e r h o u d i n ge e nb e l a n g r i j k er o lb i jd e c o n - c u r r e n t i e t u s s e n g e l a b e l d e n o n g e l a b e l d!
HSA e n HFb, D i t
wordtgeïllustreerdbijdepreferentieleadsorptievan d i m e e rt e no p z i c h t ev a n
HSA monomeer.
HSA
H i e r blijktdatde
o p p e r v l a k t e / v o l u m ev e r h o u d i n gi ni e d e rg e v a le e nb e l a n g r i j k e r o l s p e e l t( T a b e l
IV.2).
99
D e d i s c r e p a n t i et u s s e n
t a t e nv a no n g e l a b e l d HSA anderzi jds
de c o n c u r r e r e n d e a d s o r p t i e r e s u l -
HFb e n HSA e n e r z i j d s e n g e l a b e l d
is .niet vreemd als
HFb e n
men b e d e n k t d a t e r a l
artefactenoptredentengevolgevanlabelingindeadsorptie I1 b l e e k .
b i je e né é n c o m p o n e n t s y s t e e mz o a l su i th o o f d s t u k U i t deresultatenverkregen
blijkt dat
m e t d eH P L C / d e p l e t i et e c h n i e k
BSA d i m e e r p r e f e r e n t i e e l a d s o r b e e r t t e n o p z i c h t e
v a n H S A m o n o m e e r ,I nv e e la d s o r p t i e s t u d i e sw o r d tg e b r u i kg e m a a k tv a no n g e z u i v e r d
O n g e z u i v e r d HSA b e v a t v e r s c h i l -
HSA.
l e n d eh o e v e e l h e d e nd i m e e r .
( 1 0 4 5 % ) e nz e l f s
trimeer ( G I T L I N
1 9 7 5 ) - H e t is t e v e r w a c h t e nd a td o o ra a n w e z i g h e i dv a n d i m e e ri no p l o s s i n g r e s u l t a t e nv a n
HSA
er afwijkingenontstaanindeadsorptie
H S A m o n o m e e r ,z o a l sd o o r
BROOKS g e s u g g e r e e r d
( B R O O K S 1 9 8 1 ) . D i t i s e c h t e rn i e th e tg e v a l .
Z e l f s b i jd e
1 0 0 % d i m e e rw o r d td e z e l f d ea d s o r p t i e w a a r d e
a d s o r p t i ev a n
als b i j
g e v o n d e na a nP S - l a t e xo n d e rd e z e l f d ec o n d i t i e s H S A monomeer.
a d s o r p t i ev a n
H i e r u i tm o e tg e c o n l u d e e r dw o r d e n
d a th e ts p e c i f i e ko p p e r v l a kv a nd i m e e rt w e e m a a lz og r o o t als datvan
I V , 5.
is
ESA monomeer.
Conclusie
R e s u m e r e n dk a ng e s t e l dw o r d e nd a tb e t r o u w b a r ec o n c u r r e r e n d e . a d s o r p t i e g e g e v e n sv e r k r e g e nk u n n e nw o r d e n
m e t %iet
g e l a b e l d ee i w i t t e nd o o rg e b r u i k m a k i n gv a nd eH P L C / d e p l e t i e methode.
Als e i w i t m e n g s e l sv a n
g e b r a c h tw o r d e n
e n HIgG i n c o n t a c t
m e t e e nP S - l a t e xo p p e r v l a kw o r d te e ns t e r k e
preferentieleadsorptievan
HFb waargenomen.
U i t de a d s o r p t i e e x p e r i m e n t e n
d i m e e re n
HSA, HFb
m e t HSA o p l o s s i n g e n w a a r i n
monomeer a a n w e z i g z i j n , b l i j k t
HSA d i m e e r p r e f e -
r e n t i e e l t e a d s o r b e r e n , Wederom b l i j k t d a t d o o r v e r g e l i j k i n g v a nc o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i e g e g e v e n sv a ng e l a b e l d Q nv a no n g e l a b e l d g e v o l g ev a nl a b e l i n g .
Dezekomen
PS-plaatjeshetsterksttotuiting.
100
HFb e n HSA
HFb e n HSA e r a f w i f k i n g e n o p t r e d e n t e n b i ja d s o r p t i ea a n
REFERENTIES
B R A S H , J.L. 377 ( 1 9 7 9 ) . B R O O K SD, . E . 661 ( 1 9 8 1 ) .
en UNIYAL,
J.
S.,
e n G R E I GR, . G . ,
Polymer
J.
C o l l o i d Interface S C i . ,
E L L E N SD, . J B . ,E U G E L I N G , BREEMHAAR, W., Proc. 1 A n n . Meeting E S A 0 295 ( 1 9 8 2 ) C R A N D A L LR,. EJ.A , NATOVA, 11, 111 ( 1 9 8 1 ) .
J.
P o l y m e r Symp. 6 6 ,
Sci:
T.,
83,
in
B A N T J E SA,. ,
e n ANDRADE, J.D.,
Prep.
Biochem.
G E N D R E A UR, . M L . , E I N I N G E RR, . I . , W I N T E R S , S . en JAKOBSON, R.B., i n " B i o m a t e r i a l : i n t e r f a c i a l p h e n o m e n a and applications A C S " , 1 9 9 S . L . C o o p e r e n N.A. Peppas, E d s . , ' p . 3 7 1 ( 1 9 8 2 ) .
i n "plasma p r o t e i n s " ,
G I T L I N , D. e n G I T L I ND, . J . , P u t m a n ) ,V o l 1 11, p . 3 2 9 , K L E I NE L H O R S T , J., C.A. en F E I J E N J., KOCHWA, S . , A nN n . YA. c a d .
LEE,
R.G.
M O Y E RL,. S .
N e wY o r k ,
O L T H U I FS ., M . F . GB. ,A R G E M A N , I n t . J . o f A r t i f .O r g a n s ,
L I T W A KR , .
Sci.
e n KIM,
A c a d e m i c Press,
S.,
283,
S.W.,
en GORIN,
' R O S E N F I E L DR , E . .
(F.W.
'
1975.
DS.M , OLDERS,
1, 2 8 8 ( 1 9 7 8 ) . e n L E O N A R DE, .
F.
8
37 ( 1 9 7 7 ) . J.
M.H.,
B i o m e d .M a t e r . R e S . J.
B i o lC . hem.
8 r 251 ( 1 9 7 4 ) I
.
133, 6 0 5 ( 1 9 4 0 ) .
101
HOOFDSTUK V EEN VERGELIJKENDE STUDIE VAN DE ADSORPTIEVAN MENSELIJK ALBUMINE .AAN POLYSTYREEN EN POLYVINYLCHLORIDE V.l
Inleiding Om inzicht te krijgen in de bloedcompatibiliteit van
materialen is een goed begrip van het adsorptiegedrag van plasma eiwitten aan deze materialen noodzakelijk. Vele methodes worden toegepast om de adsorptie van plasma eiwitten aan vaste oppervlakken te bestuderen (Hoofdstuk 1.3). Echter met geen enkele methodewordt' een volledig inzicht verkregen in het adsorptiegedrag van eiwitten uit plasma. Zo
is de depletie van eiwitten uit de oplossing weliswaar
kwantitatief bij gebruik van latices maar de nauwkeurigheid van deze methode bij kleine oppervlakken, noodzakelijkvoor studies aan bijvoorbeeld biomedische materialen, is zeer beperkt. Door radiolabeling van eiwitten kunnen wel kwantitatieve adsorptiewaarden aan'kleine oppervlakken worden verkregen. Maar uit Hoofdstuk I1 en I11 blijkt dat het adsorptiegedrag van eiwitten door radiolabeling kan veranderen. Ellipsometrie en infraroodreflectiespectroscopie worden eveneens gebruikt voor adsorptiestudies, maar deze technie.ken hebben als nadeel dat de resultaten moeilijk interpreteerbaar zijn en dat de toepasbaarheid voor concurrerende adsorptie van eiwitten beperkt is. BREEMHAAR heeft in 1982 gebruik gemaakt van een nieuwe adsorptiemethode gebaseerd op een enzymimmunoassay techniek waarbij op relatief eenvoudige wijze de concurrerende adsorptie van eiwitten vanuit plasma kon worden bestudeerd aan polystyreen en polyvinylchloride. De kwantificeerbaarheid van de verkregen resultaten vormt ook hier nog steeds een probleem. In dit Hoofdstuk wordt de adsorptie beschreven van menselijke albumine (HSA) aan polystyreen en polyvinylchloride waarbij gebruik gemaakt is van drie adsorptietechni-eken:
103
-
de enzymimmunoassay methode radiolabeling van eiwitten en de
- Biorad desorptie methode. Bij deze studie zijn de adsorptiecondities voor de verschillende methoden exact gelijkengehouden. O p deze wijze wordt getracht de betrouwbaarheid en de'bruikbaarheid van de verschillende methoden onderling te toetsen. V.2.
Experimenteel
Polystyreen
( P S ) i s a f k o m s t i g van Hepanostika, O r g a n o n
Teknikat Turnhout, B e l g i k ' . .
p o l y v i n y l c h l o r i d e ( P V C ) Batch no.
1-220-29 is afkomstig van Dynatech, Virginia, USA. Deze polymeren zijn gebruikt in de vorm van microtiterplaten bestaande uit respectievelijk 210 P S titreerputjes met een beschikbaar oppervlak van 1,9 cm2 per stuk en 96 PVC 2 titreerputjes met ieder een oppervlak van 2,O cm Dit
.
zijn de contactoppervlakken na afvullen met7 5 1-11eiwitoplossing. Menselijk albumine (HSA) is verkregen van het Centraal Laboratorium van de Nederlandse Bloedtransfusiedienst en gebruikt zonder verdere zuivering(20% ,oplossing). Deze oplossing is verdund met 0,Ol 0,15 M NaCl bij- een pH van 7 , 3 5
M Fosfaatbuffer waarin
(PBS) tot de gewenste eiwit-
concentraties. PBS en PBS in aanwezigheid van 0,05%
Tween-20
(PBS-Tw) zijn gebruikt als wasbuffers; Tween-20 is een oppervlakte actieve stof. D e pH van deze buffers is 7,35. V.3.
Adsorptiemeth0de.n
Enzym immùnoassay
(BIA)
Het principe is hieronder schematisch weergegeven.
104
H i e r i n i s ( l )d ev a s t ef a s e , h e ta n t i l i c h a a m , l i c h a a me n
( 2 ) h e ta n t i g e e n
(eiwit), ( 3 )
'
'
( 4 ) h e t e n z y mg e k o p p e l d et w e e d ea n t i -
( 5 ) h e ts u b s t r a a t( n o d i gv o o rd ek l e u r i n g s r e a k t , i e
m e t h e te n z y m ) . Eiwit
( 2 ) a d s o r b e e r t op e e nv a s to p p e r v l a k
s o r b e e r d ee i w i t
(1). H e t g e a d -
i s t e b e s c h o u w e n a l s e e na n t i g e e nd a tv e r -
v o l g e n sr e a g e e r t
m e t e e na n t i l i c h a a m
( 3 ) . I n d i t g e v a lw o r d t
a l sa n t i l i c h a a mg e b r u i k tk o n i j n e n s e r u mv e r d u n di n s e r u m i s a f k o m s t i gv a nh e t
Het
met
( 4 ) t o e g e v o e g dd a tc p m p l e x e e r t
a n t i - l i c h a a m( c o n j u g a a t ) h e te e r s t ea n t i l i c h a a m
( 3 ) - D i t c o n j u g a a t , b e s t a a tu i tg e z u i -
v e r ds c h a p e na n t i - k o n i j n e ni m m u n o g l o b u l i n e a f k o m s t i g i s v a nh e t
PBS.
CLB. V e r v o l g e n sw o r d te e nt w e e d e
CLB,
D i t
G d a te v e n e e n s
immunoglobuline G i s vooraf
g e k o p p e l dm e th e te n z y mm i e r i k s w o r t e l p e r o x i d a s e ,
d a t afkoms-
de .
t i g i s v a nB o e h r i n g e r ,M a n n h e i mW e s tD u i t s l a n dv o l g e n s m e t h o d ev a nC a r l s s o n
(CARLSSON 1978). V e r v o l g e n sw o r d th e t
, rganon s u b s t r a a t ( 5 ) u r e u m p e r o x i d a s e( H e p a n o s t i k a O T e c h n i k a ,T u r n h o u t* B e l g i ë )i na a n w e z i g h e i dv a n
3,3',
t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e( F l u k a ,Z w i t s e r l a n d )t o e g e v o e g d . substraatgeeftuiteindelijkeenkleuring mierikswortelperoxidase.
5,5' D i t
m e t d eg e k o p p e l d e
D e e x t i n k t i ev a nh e to m g e z e t t e
(A i s e em n a avto odhreo e v e e l h e i d 450 g e a d s o r b e e r de i w i ta a nh e to p p e r v l a k . D e adsorptieprocedure
substraat
m e td e
EIA m e t h o d e i s a l s v o l g t :
D e t i t r e e r p u t j e sv a nd e
PS
e n PVC m i c r o t i t e r p l a t e n w o r d e n
m e t 7 5 u 1 HSA o p l o s s i n g . ( v a r i ë r e n d v a n i nk o n t a k tg e b r a c h t -6 -1 10 t o t 10 g 1 1 b i j 2OoC g e d u r e n déeé un u r . De m i c r o t i t e r p l a t e nz i j nt i j d e n sa d s o r p t i ea f g e d e k t k o m i n gv a nv e r d a m p i n g ,
ter voor-
N a é é nu u rw o r d e nd ep u t j e sg e l e d i g d
e nv i e r m a a l . g e w a s s e nm e t b e u r td u u r td e r t i gs e c o n d e n .
150 u 1 P B S of PBS-Tw.
I e d e r e was-
D e a d s o r p t i ew o r d tg e m e t e nb i j
4 5 0 nm (A450) m e t b e h u l p , v a ne e nc o l o r i m e t e rv o o r z i e nv a n e e n 8 0 1-1'1d o o r s t r o o m c e l( V i t a t r o n ) .
105
RadiolabeLing met h e t r a d i o a c t i e v e
H S A w o r d tv o o r a fg e l a b e l d
I
125
elders beschreven
v o l g e n s d e c h l o o r a m i n e T m e t h o d ez o a l s
( K L E I N ELHORST 1 9 7 8 ) .V e r v o l g e n sw o r d e nd et i t r e e r p u t j e sv a n
d e P S e n PVC m i c r o t i t e r p l a t e ng e v u l d . m e t7 5
p 1 g e l a b e l d HSA
( 3 % gelabeld eiwit). N a één
v a nv e r s c h i l l e n d ec o n c e n t r a t i e
d e a l b u m i n eo p l o s s i n gw e g g e n o m e ne nw o r d e n
u u rW o r d t
m e t 150
o p p e r v l a k k e nv i e r m a a lg e w a s s e n
de
p 1 P B S o f PBS-Tw.
De
H S A o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ek a nw o r d e nb e p a a l da a nd eh a n d
o p h e to p p e r v l a kv a nd ep u t j e s
v a nd er a d i o a c t i v i t e i t
met e e n C O B A S gamma t e l l e r .
g e m e t e nw o r d t
die
De radioactiviteit
p e r pg e i w i t i s b e k e n du i ti j k p r o e v e n . B i o r a d e i w i t assay
e i w i t a s s a yk i d( B i o r a dL a b o r a t o r i e s ,
Met d eB i o r a d California,
USA),
l a g e e i w i t c o n c e n t r a t i e sg e -1 l t o t 2 5 mg1 ) . Deze
k u n n e ns l e c h t s
d e t e c t e e r dw o r d e ni no p l o s s i n g( v a n
m e t h o d e i s h e t e e r s t b e s c h r e v e nd o o r
BRADFORD
( 1 9 7 6 )e n
is
g e b a s e e r d op e i w i t k l e u r i n g met b e h u l pv a nC o o m a s s i e B r i l l i a n tB l u e
d a t b i j k o p p e l i n g met e i w i t e e n
G-250
a b s o r p t i e m a x i m u mh e e f tb i j h i e rg e v u l d
met 75
5 9 5 nm.
e nn aé é nu u ra d s o r p t i eb i j v i e r m a a lg e w a s s e n
400
p 1 PBS,
worden d e o p p e r v l a k k e n V e r v o l g e n sw o r d t
de
e i w i t g e d e s o r b e e r di ne e no p l o s -
d i e 0,01%
T r i t o n X-100
bevat.
Na z e s -
1 0 0 p1 C o o m a s s i eB r i l l i a n tB l u e
t i e nu u rd e s o r p t i ew o r d t G-250
20°c
met P B S o f PBS-Tween.
g e a d s o r b e e r d eh o e v e e l h e i d s i n gv a n
D e P V C p u t j e sw o r d e no o k
p 1 H S A v a nv e r s c h i l l e n d ec o n c e n t r a t i e s
t o e g e v o e g de n . d ee x t i n c t i e
e e nc o l o r i m e t e r( V i t a t r o n )b e p a a l d .
b i j 5 9 5 nm met b e h u l pv a n Met e e ni j k c u r v ek a n
o o r s p r o n k e l i j k eh o e v e e l h e i dg e a d s o r b e e r d
de
eiwit worden
bepaald.
V.4.
Resultaten De a d s o r p t i ei s o t h. e r .m e nv a n
5 )
e n PS ( F i g u r e n 2 e n 4 )
( F i g u r e n 1 en 21, 4)
106
HSA a a n PVC
z i j nb e p a a l d
d o o rr a d i o l a b e l i n gv a n
e n met b e h u l pv a n
( F i g u r e n l, 3 e n
met d e E I A m e t h o d e HS-A ( F i g u r e n 3
d e B i o r a d e i w i t a s s a y( F i g u r e n
5).
en B i j
O
I
1
I
10
HSA concentratie (gl-l)
107
HSA concentratie (g[-')
F i g u u r 2 A d s o r p t i ei s o t h e r mv a n
HSA a a n PS b e p a a l d m e t d e
E I A methode ,
C o n d i t i e s a l s b i jF i g u u r
g e l i j ka a n zadiging is A 45 O HSA, d o o rr a d i o l a b e l i n gv a n PS w o r d tb i j
van O , 5
5 g1 -2
pg c m
-I
D e i s o t h e r m e nb, e p a a l d
z i j n w e l k w a n t i f i c e e r b a a r , Voor
H S A i n o p l o s s i n ge e n . p l a t e a ub e r e i k t
: PBS
HSA i s o t h e r m a a n
1,5.
1. W a s p r o c e d u r e PBS (O) e n
is gebruikt als wasbuffer.
Ook d e
PVC b e p a a l d m e t b e h u l p v a n B i o r a d
a s s a y ,v e r t o o n te e nv e r z a d i g i n g s w a a r d e
(0,6
pg c m
eiwit-2
).
Er
i s s p r a k ev a ne e n" h i g ha f f i n i t y "i s o t h e r me v e n a l sb i jd e HSA i s o t h e r m e n a d n
PS e n PVC b e p a a l d m e t EIA.
h e to p p e r v l a kb i jz e e r o p l o s s i n gr e e d sv e r z a d i g d
108
Ook h i e r i s
lage e i w i t a o n c e n t r a t i e s i n
met eiwit.
de
B i j d e z ei s o t h e r m
is
Q CI)
r 2
02 -
Q)
Q)
e
O
O
2
I
I
4
I
6
I
8
10
HSA concentratie (gl-l) .. F i g u u r 3 A d s o r p t i ei s o t h e r mv a n
HSA a a n PVC b e p a a l d m e t
radiolabeling. C o n d i t i e s a l s b i j F i g u u r 1. Wasprocedure P B S .
c
(O) e n
.
PBS-Tween . ( 0 )
HSA concentratie (gi-') F i g u u r 4 A d s o r p t i ei s o t h e r m ; v a n
HSA aan PS b e p a a l d met
radiolabeling, C o n d i t i e s als b i jf i g u u r e n PBS-Tween
1. Wasprocedures PBS ( O )
(O).
109
PBS e v e n e e n sg e b r u i k t g e b r u i k tw o r d t
a l s w a s b u f f e r .W a n n e e r
PBS-Tween
als w a s b u f f e r , b l i j k t d a t i i b i j n a a l l e
g e v a l l e nl a g e r ea d s o r p t i e w a a r d e nw o r d e nv e r k r e g e n .S l e c h t s deadsorptie.isothermvan o n d e r v o n dg e e ni n v l o e dv a n
RSA a a n PVC,
bepaald m e t EIA,
de g e b r u j k t e w a s b u f f e r ( F i g u u r
l).
HSA concentratie (91-')
F i g u u r 5 A d s o r p t i ei s o t h . e r mv a n
HSA
a a n P V C b e p a a l d m e t de
b i o r a dE . iwitassay. C o n d i t i e s als. b i j f i g u u r PBS-Tween
'
V.5.
1. W a s p r o c e d u r e P B S ( 0 ) e n
(O).
Discussie
I nd es t a n d a a r d p r o c e d u r ev a ne n z y m meestal PBS-Tween
e i w i t t e n( v a n
WEEMEN,
1971; ENGVALL,
U i t de i s o t h e r m e n( F i g u r e n
adsorptievan
immuno a s s a y s w o r d t
g e b r u i k ta l sw a s b u f f e rn aa d s o r p t i ev a n
2, 3 ,
4 en 51,
HSA c o n c e n t r a t i e
110
w a a r b i j de
HSA a a n PVC e n PS g e g e v e n i s a l s f u n c t i e v a n
i n d eo p l o s s i n gg e b r u i k m a k e n dv a nv e r -
s c h i l l e n d ea d s o r p t i e m e t h o d e n ,b l i j k t PBS-Tween
L971; BREEMHAAR 1982).
d a t h e tg e b r u i kv a n
a l s w a s b u f f e r l e i d t tot l a g e r e a d s o r p t i e w a a r d e n
v o o r HSA i n v e r g e l i j k i n g
m e t PBS a l s w a s b u f f e r .
Aan P V C e n
PS g e a d s o r b e e r d HSA d e s o r b e e r tw a n n e e rh e ti nk o n t a k tk o m t oplossingen.
a d s o r p t i ev a n
BSA ( r u n d e rs e r u ma l b u m i n e )a a n
LETHONEN i n 1 9 8 0 . '
I
D i t i s r e e d se e r d e rg e v o n d e nv o o r
m e t PBS-Tween
I
PS d o o r
Z i jv o n d e nd a tB S A . g e a d s o r b e e r da a n
PS
o p p e r v l a k k e nb i j n av o l l e d i gd e s o r b e e r d en az e s m a a w l assen m e t PBS-Tween.
H i e r d o o rv e r m i n d e r d e
0,57 ugcm
t r a t i ev a n
-2
t o t 0,05
de o p p e r v l a k t e c o n c e n -
pgcm
-2
. Tween
i s een
o p p e r v l a k t e a c t i e v es t o fe nv e r d r i n g te i w i tv a nh e to p p e r v l a k . PBS-Tween
i s dus m i n d e r g e s c h i k t a l s , w a s b u f f e r b i j
e i w i t a d s o r p t i e s t u d i e s .W a n n e e rh i e r n ag e s p r o k e nw o r d tv a n
i s PBS g e b r u i k t a l s w a s b u f f e r
HSA a d s o r p t i ei s o t h e r m e n ,d a n t e n z i ja n d e r sv e r m e l d ,
i s o v e rd ea d s o r p t i ev a n
Hoewel e r v e e l g e p u b l i c e e r d
HSA i s nog
v a n u i tw a t e r i g ea p l o s s i n g e na a np o l y m e r eo p p e r v l a k k e n s t e e d sn i e td u i d e l i j kw e l k em e t h o d eh e t v o o re i w i t a d s o r p t i e s t u d i e s .
meest g e s c h i k t i s , .
U i t d er e s u l t a t e nv a nd e z es t u -
d i e ,w a a r b i je e na a n t a la d s o r p t i e m e t h o d e nz i j nv e r g e l e k e n v o o rd ea d s o r p t i ev a n
HSA a a n PS e n P V C ,
blijktdatonder
d e z e l f d ea d s o r p t i e c o n d i t i e sd ea d s o r p t i ei s o t h e r ma f h a n k e l i j k i s v a nd eg e b r u i k t e 'a d s o r p t i e m e t h o d e . g e d r a gv a n
H e t adsorptie-
!
HSA a a n PVC e n PS v e r t o o n t o n d e r l h g e e n g e l i j -
k e n i s ,t e n m i n s t ew a n n e e rd e z e l f d ea d s o r p t i e m e t h o d ew o r d t toegepast. a a n PVC,
U i t h e tf e i td a td e s o r p t i ev a n
g e r i n g e r i s d a nd ed e s o r p t i ev a n
a a n PS b i jw a s s e nm e t
PBS-Tween,
worden d a t d e a f f i n i t e i t t u s s e n
HSA,
geadsorbeerd
HSA g e a d s o r b e e r d
z o ug e c o n c l u d e e r dk u n n e n HSA e n PVC g r o t e r i s d a nd i e
t u s s e n HSA e nP S .
De a d s o r p t i ei s o t h e r m e nv a n en 4 )
HSA a a n P V C e n PS ( F i g u r e n 3
, b e p a a l dd o o rg e b r u i k m a k i n gv a ng e l a b e l d
HSA,
zijnin
o v e r e e n s t e m m i n g m e t r e e d s e e r d e r b e s c h r e v e n HSA ' i s o t h e r m e n a a n PS , w a a r b i j g e b r u i k - i s g e m a a k t v a n g e l a b e l d s t u k I11 v a n d i t , p r o e f s c h r i f t e n hierblijkt
HSA (Hoofd-
VAN DER SCHEER,
1978).'Ook
d a t h i g h - a f f i n i t yi s o t h e r m e n ,z o a l si nd e
F i g u r e n 1, 2 e n 5 g e v o n d e nw o r d t ,
m e t gelabeld e i w i t n i e t
111
verkregen worden, Een reden hiervoor zou kunnen zijn dat, zoals
in
appendixI1 van
dit
proefschrift
wordt
duidelijk ,
gemaakt aan de hand van adsorptie studies met gelabeld BSA, gelabeld
eiwit
bestaat
uit
twee
soorten mol'eculen die in
affiniteit voor het oppervlak verschillen. Eiwitoplossingen worden z o vergelijkbaar met heterodisperse systemen van (1980) heeft aangetoond dat
STUART macromoleculen. C O H E N
voor adsorptie vanuit dergelijke systemen een low affinity isotherm wordt verkregen terwijl er toch sprake is van een sterke
affiniteit
van
de
macromoleculen
voor
het
oppervlak,
Wanneer de s E L A " adsorptiewaarden (Figuren l en 2 ) gekwantificeerd
worden
aan
de
hand
adsorptiewaarden (Figuren 3 en 41, dat
de
verandering
-2 O , 1 .vgcm tot
0,6
van
de
"radiolabeling"
moet geconcludeerd worden
inH S A oppervlakteconcentratie
van
2 vgcm -over het concentratie gebied
van ca. 0 , l tot 1 0 gl-l, zoals in Figuren 3 en 4 gevoaden *iI
wordt niet merkbaar is in de
rrEIA"
waarden ( A
blijft
450
Een verklaring voor de "constante" adsorptiewaarden in
1,s).
-1
Figuren l en 2 bij concentraties groter dan O, 1 g1 kan gezocht men HSA
worden
ondervinden
de
sterische
wanneer
ze
hindering
gekoppeld
-2
. Bij
. Dit 'is ongeveer
een antilichaam ( 1 0 3 nm
geadsorbeerd
dan
2
HSA
molecule
gelijk aan de dwarsdoorsnede van ).
De interactie tussen geadsor-
beerd H S A en antilichaam is dan maximaal ( A hogere H S A oppervlakteconcentraties interactie niet
meer
antilicha-
een HSA oppervlakteconcentratie van
vgcm is het beschikbaar oppervlak per 2
de
aan
hoger
-2
114 nm
die
zijn
bij een H S A oppervlakteconcentratie
O,l').~gcm 0 , l
in
tussen mogelijk
antilichaam zijn
ten
en
zal
= 1,5). 450 ééno p é&n
Bi
j
geadsorbeerd H S A echter
gevolge
van
de
onderlinge
sterische hindering van de gekoppelde antilichamen. Het bereik HSA
eens
van
de
EIA
methode
is
voor H S A adsorptie
oppervlakteconcentraties van 0',1 vgcm verduidelijkt
wanneer
PBS-Tween door desorptie
ten
. Dit
van
beperkt
tot
wordt nog
hst
wassen
de , H S A oppervlakteconcentratie
-2 P V C wordt verlaagd tot O,l.?Jgcrn
112
gevolge
-2
van
aan
(Figuren 3 en 5 ) en aan
-2 PS t o t O , 0 5 pgcm ( F i g u u r 4). D e v e r l a g i n gt o t -2 0,l gcm a a n P V C i s n i e tm e r k b a a ri nd e "EIA"
isotherm,
o m d a t 0,1 1-(.53cm-2 HSA a a n h e t o p p e r v l a k n o g s t e e d s
'
een
waardg e e e fvt a n 1,5. D e v e r l a g i n gt o t 45 O -2 ,pgcm HSA a a n PS i s w e l m e r k b a a re nr e d u c e e r d t e
maximale A 0,05
A w a a r d ei nF i g u u r 2 t o t c i r c a 5 0 % . Ook d ev e r l a g i n gi n 450 2 O, 6 pgcm t o t d e" b i o r a d "a d s o r p t i e w a a r d e nv a n
pgcm2 ( F i g u u r 5 ) i s i nF i g u u r
O, 1
1 n i e td e t e c t e e r b a a r .
O p g r o n dv a nd e z eb e v i n d i n g e nk a ng e c o n c l u d e e r dw o r d e nd a t
i s t o t opper-2 0 , l pgcm .HSA.'
de E I A m e t h o d em o g e l i j k
k w a n t i f i c e r i n gv a n
v l a k t e c o n c e n t r a t i e sv a nt e nh o o g s t e
B o v e n d i e nb l i j k tu i tv e r g e l i j k i n gv a nd eF i g u r e n m e t d eF i g u r e n
2 en 4 d a td ea f f i n i t e i tv a n
l a g e r i s d a nv o o r '
1 en 3
HSA v o o r PS
PVC e n / o f d a t d e a f f i n i t e i t v a n
v o o r PS h o g e r i s d a nv o o r
Tween-20
PVC.
REFERENTIES
BREEMHAAR,
Proc.
J.
722 , 4 8( 1 9 7 8 ) .
ELLENS, D . J , , BEUGELING, M e e t i n g ESA0 2 9 5( 1 9 8 2 ) .
W.,
I X Ann.
CARLSSON, (1978).
,
A n a lB . iochem.
BRADFORT, M . M . ,
DREVIN,
H'.
e n AXEN,
R.,
T.
e n BANTJES, A . ,
Biochem.
C O H E N STUART, M. A . ,
J.,
1 7 37, 2 3
SCHEUTJES, I . M . H . M . e n FLEER, G . P o l y m e rS c i . P ; o l y m e rP h y s . Ed. 5 8 5 , 5 9( 1 9 8 0 ) . ENGVALL,
E.
e n PELMANN,
P.,
J. J. 8
I m m u n o c h e m i s t r y 8, 8, 7 1( 1 9 7 1 ) .
K L E I N ELHORST, J. OLTHUIS, F.M.F.G., BARGEMAN, D , , SMOLDERS, C.A. e n FEIJEN, I , , I n t . J. A r t i f . Org. 1, 2 8 8( 1 9 7 8 ) . LEHTONEN,
O.D.
e n V I L L A N E NM, . K . ,
. J . , Immun.
M e t h o d s ,3 4 ,6 1
(1980). VAN D E R SCHEER, A . , FEIJEN, J . , K L E I N ELHORST, J . K . , KRUGERS D A G N E A U X , P.G.L.C. e n SMOLDERS, C . A . , J . C o l l o i dI n t e r f a c e
S c i 6. 6 1, 3 6( 1 9 7 8 ) . VAN WEEMEN,
B.K.
e n SCHUURS, A . H . W . M . ,
FEBS L e t t e r s , 1 5 , 232
(1971).
113
HOOFDSTUK V I
VANUIT
A D S O R P T Z E VAN PLASMA EIWITTEN AAW POLYSTYREENLATEX PLASMA
V I . l, I n l e i d i n g
W a n n e e rb l o e di nc o n t a c tk o m t
m e t lichaamsvreemde. materi-
a l e nk a nb i n n e ne n k e l em i n u t e nt r o m b u s v o r m i n go p t r e d e n .
Aan
h e tm a t e r i a a l o p p e r v l a kz u l l e np l a s m ae i w i f t e na d s o r b e r e ne n i s een
d es a m e n s t e l l i n gv a nd e z e. g e a d s o r b e e r d ee i w i t l a a g b e p a l e n d ef a c t o ri n
de d o o r h e t m a t e r i a a l g e ï n d u c e e r d e
stolling, moment i s v a n g e e n e n k e ' l m a t e r i a a l o p p e r v l a k i n
T o to pd i t
c o n t a c t m e t b l o e d ,d et i j d a f h a n k e l i j k h e i de nd es a m e n s t e l l i n gv a nd eg e a d s o r b e e r d ee i w i t l a a ge x a c tb e k e n d .
W e l is
s y s t e m a t i s c ho n d e r z o e kv e r r i c h tn a a rd ec o n c u r r e r e n d e
eiwit-
m e t t w e e of d r i e p l a s m a e i w i t t e n .
a d s o r p t i ei nm o d e l s y s t e m e n
Zo i s de . a d s o r p t i e v a n a l b u m i n e , f i b r i n o g e e n e n
gamma
g l o b u l i n eb e s t u d e e r dv o o rv e r s c h i l l e n d em a t e r i a l e n 1 9 7 6 ; HORBETT,
1 9 7 5 ; LEE,
1 9 7 4 ; LENSEN,
(BRASH,
1984). U i t deze
studiesblijktdatfibrinogeensterkpreferentie&adsorb e e r ta a ne e ng r o o ta a n t a lo p p e r v l a k k e n , m e e r d a n l 0 0 p l a s m ae i w i t t e n
B l o e db e v a te c h t e r
1 9 8 0 ) . Een v e r g e l i j k i n g m e t d e z em o d e l s y s t e m e n nietzonder
m e e r mogelijk.
(SWICK,
i s d a no o k
Daarom i s h e t n o o d z a k e l i j k d e
e i w i t a d s o r p t i e t e b e s t u d e r e nv a n u i tp l a s m a
. BRASK
heeftde
c o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a na l b u m i n e ,f i b r i n o g e e ne n .
g l o b u l i n eb e s t u d e e r dv a n u i tp l a s m ad o o rg e b r u i k radiolabeling.
gamma-
t e makenvan
K e t verrassendresultaatvan'ditonderzoek
datintegenstellingtotdestudievanmodelsystemen,
is
waar-
b i jm e n g s e l sv a ne i w i t t e nw o r d e ng e b r u i k t ,b i jp l a s m ad e f i b r i n o g e e na d s o r p t i es t e r k IHLENFELD ( 1 9 7 9 )e n
VROMAN
i s g e r e d u c e e r d ( B R A S H 19821,
( 1 9 8 2 )v i n d e ne v e n e e n se e ng e r e -
duceerde fibrinogeen adsorptie bi p l a s m a ,m a a rg e d u r e n d ed e
j
gebruikvanbloeden
e e r s t e m i n u t e nv a nd ea d s o r p t i e
er w e l s p r a k ev a ne e nh o g ef i b r i n o g e e n c o n c e n t r a t i ea a nh e t
114
is
o p p e r v l a k . VROMAN s c h r i j f td i tt o ea a nu i t w i s s e l i n gt u s s e n g e a d s o r b e e r d f i b r i n o g e , e ne ni np l a s m a' a a n w e z i gk i n i n o g e e n . Ook BREEMHAAR ( 1 9 8 2 )k o m td o o rm i d d e lv a np l a s m av e r d u n n i n g s e x p e r i m e n t e nt o td ec o n c l u s i ed a tg e a d s o r b e e r d fibrinogeenuitwisselt h e tp l a s m a .
met e e nh o o g m o l * e c u l a i r ec o m p o n e n ti n
H i j h e e f ta a n g e t o o n dd a th o g ed i c h t h e i dl i p o -
p r o t e i n e nf i b r i n o g e e nv e r d r i n g e nv a nh e to p p e r v l a k . WEATHERSBY (197.6) m a a k tm e l d i n gv a nd ep r e f e r e n t i ë l e a d s o r p t i ev a nh e m o g l o b i n ee ne e nv i j f t a lo n b e k e n d ee i w i t t e n
'
m e t kunststoffen.
w a n n e e rb l o e di nk o n t a k tk o m t
I nd i th o o f d s t u kw o r d td ea d s o r p t i ev a nm e n s e l i j k a l b u m i n e( H S A ) m , enselijk
gamma g l o b u l i n e( H I g G )e nm e n s e -
l i j kf i b r i n o g e e n( H F b )u i tp l a s m aa a np o l y s t y r e e n - l a t e x D e adsorptie
b e s c h r e v e na l sf u n c t i ev a nd et i j d .
i s bestu-
d e e r dm e tb e h u l pv a nd eH P L C / d e p l e t i et e c h n i e k ,w a a r b i jd e
,
e i w i t c o n c e n t r a t i ei no p l o s s i n gb e p a a l dw o r d tm e tb e h u l pv a n UV s p e c t r o s c o p i e e n e e n m e t h o d e w a a r b i j d e d e p l e t i e i n
com-
b i n a t i ew o r d tg e b r u i k tm e te e ne i w i t c o n c e n t r a t i eb e p a l i n g d o o rm i d d e lv a nr a d i a l e m e t h o d e nk a no p
p l a s m aw o r d e ng e v o l g d
VI.2.
immuno. d i f f u s i e .
M e tb e h u l pv a nd e z e
t w e e m a n i e r . e nd ed e p l e t i ev a ne i w i tu i t
a l s f u n c t i ev a nd et i j , d .
M a t e r i a l e ne nm e t h o d e n
V e r s i n g e v r o r e ng e c i t r e e r dp l a s m a( f o s f a a te nd e x t r o s e
b e v a t t e n d ) i s v e r k r e g e nv a n
de s t i c h t i n g Rode K r u i sB l o e d -
P o l y s t y r e ' e nl a t e x
b a n kT , w e n t e - A c h t e r h o e k( n o .
31).
(PS-latex)
A K Z O C o r p o r a t eR e s e a r c h ,
w a s a f k o m s t i gv a n
Arnhem
( n r . VS 08). Deze l a t e xb e v a te e nv a s t es t o fg e h a l t ev a n 1,51 gew.% e ne e nd e e l t j e s d i a m e t e rv a n
w a sg e s u s p e n d e e r di n
326
5
1 4 nm.
De latex
PBS b u f f e r pH 7,35 e nb e r e i dz o n d e r
.
emulgator. D e a d s o r p t i ev a n
de s p e c i f i e k e e i w i t t e n
is bestudeerd
d o o rt o e p a s s i n gv a nd ed e p 1 e t i e t e c h n i e k ; z o a l sr e e d se e r d e r beschreven
( L E N S E N 8 4 ) . '1 m l P S - l a t e x w e r d h i e r b i j i n c o n -
11'5
t a c tg e b r a c h t
m e t 100 V 1 p l a s m a .
d e v e r e i s t ea d s o i p t i e -
Na
15 minu-
t i . j dw e r dh e tm e n g s e lv a np l a s m a ' e nl a t e x ,g e d u r e n d e t e n' g e c e n t r i f u g e e r d
(SORVALL
20.000
g).
U i t d ea f n a m ev a nd e
s p e c i f i e k ee i w i t c o n c e n t r a t i e si nh e tp l a s m at e ng e v o l g ev a n a d s o r p t i ea a nd el a t e xk a nd eg e a d s o r b e e r d eh o e v e e l h e i dv a n d er e s p e c t i e v e l i j k ee i w i t t e nw o r d e nb e p a a l d .
i s de a d s o r p t i e v a n
HFb,
Op d e z ew i j z e
HLgG e n HSA b e s t u d e e r d .
t i e - e x p e r i m e n t e nz i j nu i t g e v o e r db i j
D e adsorp-
20OC.
B e p a l i n g van d e c o n c e n t r a t i e e i w i t i n p l a s m a . a. Radiaal immuno d i f f u s i e
(RID)
Om d e a f n a m e v a n d e s p e c i f i e k e e i w i t c o n c e n t r a t i e s
n e nb e p a l e n
i s d ec o n c e n t r a t i e
Voor d e r a d i a a l
D e z em e t h o d e
(RID),
s c h r e v e n door G .
HSA e n HIgG i n p l a s m a
m e t b e h u l pv a nr a d i a a l
v o o re nn aa d s o r p t i eb e p a a l d immuno d i f f u s i e
HFb,
CARBONARW e n J . F .
M A N C I N IA , .0,
immuno d i f f u s i e v a n
HFb,
diffusieplatenafkomstigvanBehringwerke W.
'
i s reeds. i n 1 9 6 5 b e HEREMANS.
HSA e n HIgG i n
p l a s m a i s g e b r u i kg e m a a k tv a nN o r - P a r t i g e e n
'
t e kun-
immuno-
A.G.
I
Marburg
Germany.
als volgt:
D e m e t h o d ev e r l o o p t
brachtineenagarose
5 w 1 p l a s m aw o r d o t pge-
medium d a t e e n a n t i S . e r u r n b e v a t ,
s p e c i f i e k voor h e t t e onderzoeken e i w i t . H e t p l a s m a z a l r a d i a a ld i f f u n d e r e nd o o rh e ta g a r o s e
medium,
waardoor
p r e c i p i t a t i eo n t s t a a tt e ng e v o l g ev a nd ek o p p e l i n gt u s s e n h e tp l a s m a e i w i td a t
a l s a n t i g e e n t e b e s c h o u w e n is e n h e t
a n t i l i c h a a ma a n w e z i gi nd ea g a r o s e .
is logaritmischgerelateerdaan
ontstaneprecipitaatring
d ee i w i t c o n c e n t r a t i ei nh e tp l a s m a . c o n c e n t r a t i e sv a n
HSA,
D e d i a m e t e r va.nde
O p d e z ew i j z ez i j nd e
HFh e n HIgG i n plasma b e p a a l d ,
De
concentratiebepalingenzijnindrievouduitgevoerden te bepalen e i w i t 4 t o t 80
d u u r d e na f h a n k e l i j kv a nh e t uur.
Voor h e t g e b r u i k t e
plasma w a r e nd eb e g i n c o n c e n t r a -
t i e s v.an BFb, HIgG e n HSA r e s p e c t i e v e l i j k
lot1 2
116
0 1 4 g1-l
en 35
,+
I,O
gl-1.
3,7 f: 0 , 2
g1
-l
,
b.
UV
spectroscopie
De afname in de concentratie HFb, HSA e n HIgG in plasma i s eveneens gevolgd met b e h u l p van UV spektroskopie (LC-75 detector bij 280 nm) door toepassingvan een HPLC
kolom, zoals reeds eerder beschreven (LENSEN 19841.. Het piekoppervlak van de specifieke pieken in het HPLC chromatogram is een maat voor de concentratie eiwit in het plasma. De gebruikt,e HPLC kolom was een T O Y 0 SODA 3000 SW kolom, afkomstig van VARIAN. Zoals bek,end bevat menselijk plasma meer eiwitten dan alleen HFb, HIgG en HSA. Deze eiwitten absorberen eveneens in het UV gebied en leveren dus een' bijdrage aan het HPLC chromatogram van plasma. Aangenomen wordt dat de extinctiebijdrage van deze eiwitten in vergelijking met debijdrage van HFb, HIgG en HSAte verwaarlozen is.
VI.3.
Resultaten
Het HPLC chromatogram van gecitreerd plasma is gegeven in Figuur 1. Vier duidelijke pieken zijn zichtbaar: HFb (piek l), HIgG (piek 2 ) en HSA (piek 3). Ook is een merkbare hoeveelheid laagmoleculair materiaal aanwezig (piek 4). Uit Figuur 1 blijkt dat HIgG en HSA niet volledig te scheiden zijn. Dit maakt de berekening van de adsorptiewaarden voor HSA en HIgG gecompliceerd, tenminste wanneer zowel HSAa'ls HIgG adsorberen. In de praktijk blijkt; uitgaande van de
f
HPLC chromatogrammen, dat HSA niet detecteerbaar adsorbeert (Figuur 2 ) .
Waardoor bij voldoende HIgG ,aanbod, de HIgG
adsorptie eenvoudig kwantitatief te bepalen is (zie
"
Hoofdstuk IV). Ook de radiaal immuno diffusie methode kent zijn beperkingen. Zo kunnen HFb concentraties lager dan 0,3 .-..
gl-l in verdund plasma niet meer worden gedetecteerd. Algemeen geldt voor depletiemetingen dat de meest nauwkeurige adsorptiewaarden verkregen worden bijeen depletie van ongeveer 50%. B i j zelfgemaakte eiwitmengsels kan de verhouding tussen de concentratie van verde
117
v)
c O clo
2 L
O
G Q) Q)
t
U
O
I
1
I
1
s
I
1
2
3
4
5
6
I
7
8
elutietijd (min.)
F i g u u r l . HPLC c h r o m a t o g r a mv a np l a s m a( g e c i t r e e r d ) ,W a a r i n HFb
( p i e k 1), HIgG ( p i e k 2 ) , HSA ( p i e k 3 1 e n l a a g
m o l e c u l a i r materiaal ( p i e k 4 ) voorkomen.
De elu-
t i e b u f f e r is PBS p H 7,35.
s c h i l l e n d e e i w i t t e n e n e r z i j d s e n h e t ,l a t e xo p p e r v l a k
d e z e voorwaarde
a n d e r z i j d sz o d a n i gg e k o z e nw o r d e n ,d a ta a n
worden.
v o l d a a nk a n
1 n . p l a s m a i s d ev e r h o u d i n g
t u s s e n de
v e r s c h i l l e n d ee i w i t c o n c e n t r a t i e sv o o r a fv a s t g e l e g d . is het
O n d a n k sb o v e n s t a a n d eb e p e r k i n g e ne nv o o r w a a r d e n t o c hm o g e l i j k
de a d s o r p t i e v a n
t@ bepalenalsfunctievan
Tabelzijn HIgG,
HFb,HIgG
de t i j d
de a d s o r p t i e w a a r d e ng e g e v e nv o o r
o
HFb,
I nd e z e HSA e n
b e r e k e n d op g r o n d v a n d e c o n c e n t r a t i e v e r m i n d e r i n g i n
P l a s m a door a d s o r p t i e a a n P S - l a t e x b e p a a l d s p e c t r o s c o p i ee nr a d i a a l I nF i g u u r PS-lateX
g e g e v e n a l s f u n c t i ev a n
t w e e m a n i e r e nb e p a a l d
m e t b e h u l pv a n
uv
immuno d i f f u s i e .
2 i s de a d s o r p t i e v a n
RSA u i tp l a s m aa a n
.
de t i j d c D e a d s o r p t i e i s op
(UV s p e c t r o s c o p i e e n
b l i j k t d a t HSA n i e t m e r k b a a r a d s o r b e e r t .
118
e n HSA u i t p l a s m a
( T A B E L VI.1)
RID).
Hieruit
Twee a d s o r p t i e -
TABEL V I . 1
D e a d s o r p t i ev a n
2
(2670 c m )
HSA, HFb
u i tp l a s m a
e n HIgG a a n p o l y s t y r e e n l a t e x
als f u n c t i ev a nd et i j d .
R a d i a a l immuno d i f f u s i e b e p a l i n g
*
D e HFb c o n c .i no p l o s s i n g
HPLC/UV
i s n i e tb e p a a l b a a r ' n aa d s o r p t i e .
bepaling
n o o t :H e tt o t a l ev o l u m eb e d r o e g PS-latex.
Bij d e H P L C / U V
1,l m l 100 1.11 p l a s m ae n
1m l
b e p a l i n g e n i s d e 'b e g i n c o n c e n -
t r a t i e b e p a a l d m e t b . e h u l pv a n
RID.
119
w a a r d e ni nd e z ef i g u u rw i j k e ns t e r k
af. D e H S A o p p e r v l a k t e -
c o n c e n t r a t i e sb e p a a l d m e t R I D n a I u u r e n 3 u u ra d s o r p t i e -2 (0,7 pgcm ) komen o v e r e e n m e t e e nz e v e n v o u d i g ep l a t e a u waarde ( O , , l V g c m
-2
)
v e r k r e g e n b i j z u i v e r HSA n aa d s o r p t i e
a a nP S - l a t e x . D e HIgG a d s o r p t i e w a a r d e n ,b e p a a l d
g o e d i no v e r e e n s t e m m i n g
m e t UV e n R I D ,
m e t e l k a a r( F i g u u r
o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ve a r i e e rvt a n -2 m i n u u t 1 t o t O , 28 U g c m (na 1 uur).
3).
llgcm
0,12
zijn
D e HIgG
-2
(na l
D o o r d a td ed e t e c t i e g r e n sv a nd e HFb c o n c e n t r a t i e i n p l a s -1 de HFb c o n c e n t r a t i en aa d s o r p t i e ma 0,3 g 1b e d r a a g te n
c
O
1 -
a,
eOa, 0.2o
D
-
O
(d
a
o 10 20 adsorptie tijd(min.) Figuur 2.
W
I
30
40
D e a d s o r p t i ev a n
' I
50
60
d e HSA p l a t e a u w a a r d e
t-
-
en R I D CO).
-
180
-
grafiek is
( v o o r z u i v e r HSA) eveneens
1.
De a d s o r p t i e w a a r d e n z i j n b e p a a l d (O)
I
170
HSA a a n P S - l a t e x u i t v e r d u n d
p l a s m a als f u n c t i e v a n . d e t i j d . I n d e
aangegeven
2/
m e t b e h u l p .v a n
UV
-1 . l a g e r was d a n O , 3 g 1 8 kon m e t b e h u l pv a n 5
D e HFb a d s o r p t i e ,b e p a a l d
a d s o r p t i en i e tw o r d e nb e p a a l d . UV,
i s g e g e v e ni nF i g u u r
4.
HFb n e e m tl a n g z a a mt o et o t b l i j k tu i td ea f n a m ev a np i e k
R I D d e HFb
met
D e o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ev a n 0, 0 7 , p . 9 cm- 2 *n a 3 u u r . Ook 4 n aa d s o r p t i el a a g m o l e c u l a i r
m a t e r i a a l t e a d s o r b e r e na a nP S - l a t e x .O n b e k e n d
i s h o e v e e le n
w a t v o o rm a t e r i a a l .
adsorptie tijd (min.)
F i g n u r 3.
D e a d s o r p t i ev a n
HIgG a a nP S - l a t e x
als f u n c t i ev a n
d et i j du i tv e r d u n dp l a s m a .D e - H I g Gp l a t e a u w a a r d e i s e v e n e e n sa a n g e g e v e n
(-
-
).
D e a d s o r p t i e w a a r d e n z i j n b e p a a l d m e t b e h u l p van Uv
(I) e n R I D (U).
121
adsorptie tijd (min.)
F i g u u r 4.
D e a d s o r p t i ev a n
w
HFb u i t p l a s m a
(11 x v e r d u n d )b e -
p a a l d m e t U V s p e c t r o s c o p i ea a nP S - l a t e x t i e v a nd et i j d .I nd eg r a f i e k HPb p l a t e a u w a a r d e
.(
-
als func-
i s a a n g e g e v e nd e
- -
)
e nd eo n d e rd eg e g e v e n
o m s t a n d i g h e d e nm a x i m a a lm o g e l i j k eo p p e r vlakteconcentratie
'
VI.4
(..,..).
. Discussie
D e c o n c e n t r a t i e HSA,
m a s t e r kv a r i ë r e n .
HFb e n H I g G k a nv a np l a s m a
D i t b e t e k e n td a no o k
tot p l a s -
d a t d ev e r k r e g e n
adsorptiewaardensterkafhankelijkzijnvanhetgebruikte plasma. H e t i s o p v a l l e n d t e noemen
d a t HSA i n h e t g e h e e l n i e t
a d s o r b e e r ta a nP S - l a t e xv a n u i tp l a s m a ,
t e r w i j l HSA i n z e e r
h o g ec o n c e n t r a t i e sv o o r k o m ti np l a s m a .
D i t b e t e k e n td a td e
geadsorbeerdeeiwitlaaginsamenstellinggeenafspiegeling i s v a nd ev e r h o u d i n g e nt u s s e n
de e i w i t t e n , z o a l s
ze i n
p ' l a s m av o o r k o m e n .K e n n e l i j ks p e l e ns p e c i f i e k ee i w i t - o p p e r v l a k t ei n t e r a c t i e se e nb e p a l e n d e
122
r o l i nh e t ' a d s o r p t i . e p r o c e s .
Toch,zo
b l i j k tu i td es n e l h e i d s c u r v ev a nF i g u u r
wordt
2,
v o o r HSA n a 1 u u ra d s o r p t i ee e nz e e rh o g eo p p e r v l a k t ec o n c e n t r a t i eb e r e k e n d ,w a n n e e rd e w o r d tm e tr a d i a a l
HSA c o n c e n t r a t i e b e p a a l d
immuno d i f f u s i e .
i s gebaseerd
Dezemethode
HSA e n e r w o r d t
o pd ei m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i tv a n. h e t
i m p l i c i e ta a n g e n o m e nd a td e z ei m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i t D i t lijkt
t i j d e n sh e ta d s o r p t i e p r o c e sn i e tw o r d tb e ï n v l o e d . e c h t e rw e lh e tg e v a l .
Op g r o n dv a nd ec o n c e n t r a t i eb e p a l i n g
v a n HSA met UV s p e c t r o s c o p i e n a
1 u u rk a ng e c o n c l u d e e r d
1 u u re r ,g e e ns p r a k e
w o r d e nd a to o kn a t r a t i e a f n a m e ,v a n
i s v a ne e nc o n c e n -
HSA i n p l a s m a e n d a t e r d i e n t e n g e v o l g e g e e n
HS'A a d s o r p t i e o p t r e e d t i n d e m a t e z o a l s g e s u g g e r e e r d u i t d e R I D metingen.
De m e t b e h u l pv a n
R I D b e p a a l d eh o g e
HSA
adsorptiewaardenzijneengevolgvanhetteruglopenin i m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i tv a n d u r i gc o n t a c tt u s s e n
HSA t e n g e v o l g e v a n h e t l a n g -
HSA i np l a s m ae nd eP S - l a t e x .D e z e
t e r u g l o o pi ni m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i tw o r d tn i e tw a a r g e nomen b i jc o n t r s l ee x p e r i m e n t e n ,w a a r b i j i s g e w e e s t met P S - l a t e x .
'
HSA n i e t i n c o n t a c t
Ook KOCHWA v i n d t v o o r
HIgG a d s o r p -
t i ea a nh y d r o f o b em a t e r i a l e ne e na f n a m ei ni m m u n o l o g i s c h e activiteitvan
HIgG (KOCHWA 1967). D i t k a nd u i d e n
t u u r v e r a n d e r i n g e ni nh e t adsorptie/desorptie.
HIgG m o l e c u l et e ng e v o l g ev a n
Voor HFb z i j nd es t r u c t u u r v e r a n d e r i n g e n
t e ng e v o l g ev a na d s o r p t i ea a n g e t o o n d me s p e c t r o s c o p i e datingevalvan
(CHAN,
m e t circulairdichrois-
1980) a a ng l a s .
HSA i n c o n t a c t
g e e na d s o r p t i ew a a r g e n o m e n w e z i g ,d a t
op s t r u c -
Vreemd i s e c h t e r ,
m e tP S - l a t e xi nh e tg e h e e l
i s . .De m o g e l i j k h e i db l i j f ta a n -
HSA k o r t s t o n d i gg e a d s o r b e e r d
i s a a nP S - l a t e xe n
d a t HSA v e r v o l g e n sd o o ra n d e r e' m o l e c u l e nv e r d r o n g e nw o r d t van het .oppervlak.
Hoewelook
b i j HIgG v o o rd ec o n c e n t r a t i ei np l a s m an a
1
,
u u ra d s o r p t i el a g e r ew a a r d e nw o r d e nb e p a a l dm e tr a d i a a l
.immune d i f f u s i e , is o pg r o n dv a nd e z ee i s p e r i m e n t e nn i e tv a s t t e s t e l l e no fd e z ev e r m i n d e r i n gv e r o o r z a a k t . w o r d td o o rh e t
. t e r u g l o p e nv a nd ei m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i tv a n blijktdatook
m e t b e h u l pv a n
HIgG.
Het.
UV s p e c t r o s c o p i e e e n v e r l a g i n g
123
v a n de HIgG c o n c e n t r a t i ew o r d tw a a r g e n o m e nn a t e veranderen.
adsorptielijkt n e e mtto v ean
-2
p g ca'
0,l
l uur.
D e o p p e r v l a k t ec o ' n c e n t r a t i e -2 pgcm D e HIgG
.
t o t 0,3
p l a t e a u w a a r d eb e h o r e n db i jd ea d s o r p t i ev a nz u i v e r draagt 0,d
I
pg cm
Op b a s i s v a n
u i t HFb,
-2
D e HIgG
HIgG b e -
,
de r e s u l t a t e n m e t m o d e l s y s t e m e nb e s t a a n d e
HIgG e n HSA z o u HFb s t e r k p r e f e r e n t i e e l m o e t e n
adsorberen.
i s e c h t e rv o o rp l a s m an i e th e tg e v a l .
D i t
a d s o r p t i eb e d r a " a g ts l e c h t s
O , O 7 pg c m
.
-2
Er
D e HFb
z i j ne e na a n -
t a l r e d e n e nw a a r o md ep r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a n
HFb z i c h
n i e t zo d u i d e l i j k m a n i f e s t e e r t , eerste p l a a t s z i j n d e a d s o r p t i e c o n d i t i e s , v a n d i e n
I nd e
a l l e o o r s p r o n k e l i j ki np l a s m aa a n w e z i g e
a a r dd a tw a n n e e r
z o ua d s o r b e r e n ,d eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i en o gm a a r cm
-2 ,
z o ub e d r a g e n( s t i p p e l l i j ni nF i g u u r
I nd et w e e d ep l a a t sg e l d td a td e p a a l d i s m e t b e h u l pv a n
0,15
HFb a d s o r p t i e a l l e e n b e -
HPLC/UV
e nz o a l sr e e d se e r d e rg e HFb p i e k ( p i e k
l i n
HPLC c h r o m a t o g r a mo o kn o ga n d e r eh o o g -
m o l e c u l a i r ec o m p o n e n t e nb e v a t ,w a a r d o o rh e to n m o g e l i j k eenjuiste
is.
HFb o p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i e t e b e p a l e n .
Ook BRBSH,
VROMAN e n BREEMHAAR' v i n d e n e e n
lagere waarde
v a n d e HFb a d s o r p t i e u i t p l a s m a i n v e r g e l i j k i n g systemen.
l-lg
4).
s t e l d i s h e t 'z e e rg o e dm o g e l i j kd a td e F i g u a r 1) v a n h e t
HFb
Z i j v e r k l a r e nd i td o o rv e r d r i n g i n gv a n
m e t model-
HFb d o o r
H D L e nk i n i n o g e e n , h o o g m o l e c u l a i r ec o m p o n e n t e n ,z o a l s D e z ev e r k l a r i n g i s w e l p l a u s i b e lv o o ra d s o r p t i e aan k l e i n e
i s d i tm i n d e r
o p p e r v l a k k e n ,m a a rv o o rl a t e x o p p e r v l a k k e n Ftaarschi
jnli
jk.
D i t is h e tb e s t
t e i l l u s t r e r e nm e te e nr e k e n v o o r b e e l d .
S t e ld a td eo p p e r v l a k t e c o n c e n t r a t i ev a ne e nh o o g m o l e c u l a i r e -2 l pg c m i s b ivj o l l e d i g e
c o m p o n e nbt ,. vk .i n i n o g e e n ,
,
b e d e k k i n gv a nh e to p p e r v l a ke nd a tk i n i n o g e e ns t e r kp r e f e r e n t i e e la d s o r b e e r t ,
Dan i s u i t g a a n d ev a n
s i n ge e nc o n c e n t r a t i ev a n
0,001
om f i b r i n o g e e n v a n h e t o p p e r v l a k oppervlak 2 cmLis.
124
-
0,005
gl
2 m l eiwitoplos-1 a l voldoende
t e v e r d r i n g e n ,w a n n e e rh e t
U i t g a a n d ev a ne e nl a t e xo p p e r v l a kv a n
'
2000 c m
2
i s u i t g a a n d ev a n
2 m l e i w i t o p l o s s i n ge e nk i n i n o -1 1 t o t 5 g 1n o o d z a k e l i j k . De kinino-
g e e n c o n c e n t r a t i ev a n
g e e n c o n c e n t r a t i e i n plasma b e d r a a g t e c h t e r s l e c h t s -1 0,06 q 1 ( S W I C K 1 9 8 0 ) . D i t b e t e k e n t , d a t k i n i n o g e e ni n '
waar P S - l a t e x w o r d t g e b r u i k t n o o i , t i n
d i ts o o r te x p e r i m e n t e n
s t a a t i s f i b r i n o g e e nv a nh e to p p e r v l a k
te verdringen.
conclusie In dit hoofdstuk
i s de c o n c u r r e r e n d e , a d s o r p t i e v a n
t e nu i tp l a s m aa a nP S - l a t e xb e s c h r e v e n . b l i j k ti na a n w e z i g h e i dv a n
Toch i s h e t meest o p v a l l e n d e r e s u l t a a t h e t
t e r u g l o p e ni n
de i m m u n o l o g i s c h ea c t i v i t e i t
h e tg e b r u i kv a n
D i t
HSA
d e . a n d e r ee i w i t t e nv e r w a a r l o o s -
baar te zijn.
c o n t a c t m e t PS-latex.
'eiwit-
D e a d s o r p t i ev a n
van H S A n a 1 u u r
g e g e v e nk a ng e v o l g e nh e b b e nv o o r
immuno a s s a y s ,
e e ns t a n d a a r dm e t h o d ed i e
v e e l v u l d i gw o r d tt o e g e p a s ti nk l i n i s c hc h e m i s c h el a b o ' r a t o r i a om e i w i t t e n i n
plasma t e d e t e c t e r e n .
v a nd e z em e t h o d ea a n
Men n e e m t b i j g e b r u i k
d a t de i m m u n o l o g i s c h e a c t i v i t e i t v a n
e i w i t t e nd o o ra d s o r p t i en i e tw o r d tb e i n v l o e d .V o o r
.
w a t be-
t r e f td ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a ne i w i t t e nu i tp l a s m aa a n P S - l a t e xk a ng e s t e l dw o r d e nd a tz o w e lH I g G ' a l s b e r e nu i tp l a s m a ,
HFb a d s o r -
maar d a t HSA, d a t i n d e h o o g s t e c o n c e n t r a -
t i e i np l a s m av o o r k o m t ,n i e t
of s l e c h t s i n z e e r g e r i n g e
mate
adsorbeert.
125
REFERENTIES
B R A S H Ju. L .D, A V P D S O NV, . J .
BREEMHAAR,
W.,
Proc.
Soc.
Eur.
T.
E L L E ND S ,. J .B. ,E U G E L I N G , A r t i f
. Organs
.
9, 2498,
ThrombR . es.
r
(1976)
BANTJES,
A.
295 (1982).
Ser.
H O R B E T TT,. AH . , O F F M A NA, . SC . ,LAS d vC.h e m .
145, 230
(1975).
IHLENFELD,
(1979 )
KOCHWA, L.R.,
J.V.,
COOPER,
S.L.
J.
13, 577
B i o m e dM . a tR . es.
. J,
S.,
BROWNELL,
Immunol.
L E ER, . G A ., DAMSON,
C.,
LENSEN,
H.G.W.,. BARGEMAN,
FEIJEN,
J.,
J,
S.,
e n WASSERMAN,
R O S E N F I E L DR, . E .
S .W.
KIM,
D.,
,
Thromb.
Res o 4, 485
Pm
SMOLDERS C,. A .
BERGVELD,
C o l l o i d Interface S c i .
H.,
S C H W I C KH,. GH. ,A U P T ,
UNIYAL,
M.,
99, 981 (1967).
J.L.,
BRASH,
A n g e wC. h e m .
6
.
9’3, 1 (1984)
92, 8 3 (1980).
47,
T h r o m bH , eamostas.
285 (1982).
P.C.,
VROMAN, L., ADAMS, A.L., FISCHER, G.C., MUNOZ,
Blood
55, 156 (1980).
WEATHERSBY,
P.K.,
Soc.
Intern.
124
Artif.
HORBETT, Organs,
%!.A,,
HOFFMAN,
A.S.,
22, 242 (1976).
Tran.S.
Am.
HOOFDSTUK V I 1
TOEPASSING
VAN CAPACITEITSSPANNINGSMETINGEN TER BESTUDERING
VAN DE ADSORPTIE VAN E I W I T T E N EN P E P T I D E N AAN SILICIUM/
SILICIUMOXIDE ELECTRODEN
V I I . 1.
Inleiding
I nd i tH o o f d s t u kw o r d te e nm e e t t e c h n i e kb e s c h r e v e nv o o r d eb e s t u d e r i n gv a nd ee l e c t r i s c h ee i g e n s c h a p p e nv a ng e a d s o f b e e r d ep o l y p e p t i d e ne ne i w i t t e n .
is het
Met d e z et e c h n i e k
m o g e l i j kd ea d s o r p t i ev a ne i w i t t e ne np o l y p e p t i d e nc o n t i n u , .
t e meten a l s f u n c t i ev a nd et i j d , IVARSSON e n A R W I N h e b b e nd e z et e c h n i e kr e e d se e r d e rt o e g e p a s tv o o rd ea d s o r p t i ev a ne i w i t t e na a nm e t a l e n 1980,
(ARWIN
IVARSSON 1981). Zo h e e f t IVARSSON d ea d s o r p t i ev a n
a l s f u n c t i ev a n
f i b r i n o g e e ne na l b u m i n eg e m e t e na a nt i t a n i u m de t i j d d o o r g e b r u i k methoden
t e makenvan
twee e l e c t r o c h e r n i s c h e
(Galvanipotentiaalmetingen e n ' e l e c t r o d e c a p a c i t e i t s -
m e t i n g e n )i nc o m b i n a t i e
m e t e l l i p s o m e t r i e . A R W I N h e e f td e m e t b e h u l pv a n
a d s o r p t i ev a na l b u m 2 n ea a np l a t i n ag e m e t e n
m e t e l l i p s o m e t r i e .I n
c a p a c i t e i t s m e t i n g e n ,o o ki nc o m b i n a t i e b e i d eg e v a l l e n
i s e c h t e rs p r a k ev a np r e l i m i n a i r ee x p e r i m e n -
ten. STENBERG h e e f te v e n e e n sd ea d s o r p t i ev a na l b u m i n eb e s t u d e e r d m e t b e h u l pv a nc a p a c i t e i t s m e t i n g e n . h e tm e t a l e ns u b s t r a a tv e r v a n g e nd o o r G e b r u i k m a k e n dv a ne e n
Si0
2
Hij' heeft'echter
silicium/silicium,oxide.
l a a g m e t e e nd i k t ev a n
1 , 6 nm.
w o r d tt e ng e v o l g ev a na l b u m i n ea d s o r p t i ee e nc a p a c i t e i t s v e r l a g i n gw a a r g e n o m e nv a n
(STENBERG 1 9 7 9 ) .
1,5%.
E v e n a l s STENBERG h e b b e no o k
-wi'j inplaatsvaneenmetalen
o p p e r v l a kg e b r u i kg e m a a k tv a ne e ns i l i c i u m / s i l i c i u m o x i d e e , l e c t r o d e . D i t h e e f te e na a n t a lv o o r d e l e n . m a k e nv a nh e ti s o l e r e n d eS i 0
2
s t r o o m d o o r g a n gv e r m e d e nw o r d e n . m e t a l e ne l e c t r o d e n
is d i t n i e t
a l s z o d a n i gb e t e rv e r g e l i j k b a a r
Door g e b r u i k t e
a l s e l e c t r o d e m a t e r i a a lk a n B i j
g e b r u i k m a k i n gv a n
zo. S i 0 2 is e e n i s o l a t o r e n
m e t p o l y m e r e n( z o a l s
o.a.
g e d e f i n i e e r do p p e r v l a kb e k e n du i t ISFET
( I o nS e n s i t i v e
d e c h r o m a t o g r a f i ee n
Naast de b e s c h r i j v i n g v a n
d e m e e t t e c h n i e kw o r d e ni n
h o o f d s t u k d e g e s u l t a t e ng e g e v e nv a n
HIgG e n H S A a a n S i 0
d e t i j de nc o n c e n t r a t i ed o o rg e -
b r u i k m a k i n gv a nd er a d i o l a b e l i n g s m e t h , o d e .
VII.2.
2. HSA a a nS i 0 2
i s e v e n e e n sd ea d s o r p t i ev a n
b e p a a l d a l s f u n c t i ev a n
dit
d e a d s o r p t i ev a nh e t
t r i p e p t i d e S2238 e n d e e i w i t t e n H F b , T e r vergelijking
de
F i e l d ' E f f e c t T r a n s i s t o r )t e c h n o l o g i e .
.
Methode
klS_ern_e_e_nl oor i n e e n w i s s e l s t r o o m s c h a k e l i n g f e c t i e v ec a p a c i t e i tv a n
t e m e t e nh o e
d e ef-
d e d o o re e nm e t a a l e l e c t r o d e ,
s i l i c i u m o x i d e l a a ge ns i l i c i u mg e v o r m d ec o n d e n s a t o ra f h a n g t v a nd ea a n g e l e g d eg e l i j k s p a n n i n g ,k u n n e ng e g e v e n sw o r d e n v e r k r e g e no v e r
de a a r dv a n
het Si/Si02
grensvlak,
de
d o t e r i n gv a nh e ts i l i c i u m ,e v e n t u e l el a d i n gi nh e to x i d e ,
etc. E r z i j nv e e lm e t i n g e nv e r r i c h ta a nd e r g e l i j k e
O x i d eS e m i c o n d u c t o r )s t r u c t u r e n , r i c h ta a n
EOS
MOS
'maar ook z i j nm e t i n g e nv e r -
( E l e c t r o l i e tO x i d eS e m i c o n d u c t o r )
1 9 7 8 , B O U S S E 1 9 8 2 ) ,w a a r b i jh e t
( D E ROOY
metaal v e r v a n g e n i s d o o re e n
v l o e i s t o fp l u sr e f e r e n t i e e l e c t r o d e( F i g u u r s y s t e e m ,w a a r v a nd e
(Metal
1). B i j e e n E O S
I S F E T e e np r a c t i s c h er e p r e s e n t a n t
k a n men n ut e v e n sd ee i g e n s c h a p p e nv a nh e t
is,
Si0 /electro2
l i e t g r e n s v l a kb e s t u d e r e n . D e c a p a c i t e i t C d i e men b i j e e nb e p a a l d ef r e q u e n t i e
k a nb e s c h o u w dw o r d e n 'S i 0
a l s d e r e s u l t a n t ev a ne e nc a p a c i t e i t
o v e rd eo x i d e l a a gi n
C S i r 2 d i ev e r b a n dh o u d t
meet,
s e r i e met e e n c a p a c i t e i t
met de r u i m t e l a d i n g s w o l ki nh e t
silicium.
Als
128
Csio, >>
Csi
is, wordt C = Csi. Is Csï
>>
Csio2
dan is C = Csio2.
In deze vergelijkingen isC sio
een constante, maar
hangt af van de dikte’van de sepletielaag, die een Si functie is van de aangelegde gelijkspanning envan de
C
doteringsconcentratie van het silicium.
Figuur 1
Meetopstelling referentieelectrode/electroliet/ sio2/Si ( E O S ) . De aan de klemmen gemeten capaciteit is die v a n de serieschakeling van C is en C s i - Degroottevan Si 2 afhankelijk van de aangelegde geli
‘si0
jkspanning.
Het verband tussen capaciteit C en de aangelegde gelijkspanning V voor een MOS of EOS configuratie bij lage frequentie (‘minder dan 1 0 0 Hz) is gegeven in Figuur 2 . Een curve als in Figuur2 wordt capaciteitsspannings ( C V ) c u r v e genoemd. Men onderscheidt de gebieden accumulatie, depletie en inversie, welke respectievelijk te maken hebben met op-
129
h o p i n gv a n
meerderheidsladingsdragers, v e r a r m i n gd a a r v a ne n
o p h o p i n gv a n Si/SiO
minderheidsladingsdragers a a n h e t g r e n s v l a k
2-
T e ng e v o l g ev a na d s o r p t i ea a nh e tS i 0/ v l o e i s t o fg r e n s 2
v l a kk a nd ec a p a c i t e i t
w o r d e nv e r l a a g d ,d o o r d a te e ne x t r a
C
serie m e t C
capaciteitwordtgeïntroduceerdin Csi.
en
SF0
2 D i t effectzalhetsterkstoptredeninhetaccumula-
t i e of i n v e r s i eg e b i e d .
f i g u u r 2 a a n g e d u i da l s
Deze c a p a c i t e i t s v e r l a g i n g w o r d t i n AC
ads
gelijkspanning V (volt)
Figuur 2
.
.
B e t v e r l o o pv a n ' d ec a p a c i t e i t
v a ne e n
(C)
EOS con-
densator m e t deaangelegde.gelijkspanning. condensato h re eef etc na p a c i t e i t
C
sio2'
D e EOS
wan-
n e e r Plet s i l i c i u m vlak o n d e r h e t o x i d e g o e d
ge1e.i-
dend i s . D i t is h e t g e v a l i n a c c u m u l a t i e e n i n i n versie.
De s t i p p e l i j n g e e f t e e n m o g e l i j k e adsorptie.
i n de t e k s t ,
130
ACads
en
C V c u r v e weer n a
A V w o r d e nn a d e ru i t g e l e g d
S T E N B E R G h e e f te e nd u i d e l i j k ec a p a c i t e i t s v e r . l a g i n gi nh e t
a c c u m u l a t i e g e b i e dg e m e t e nt e n g e v o l g ev a np e p t i d e a d s o c p t i e , aan S i 0
2.
D o o ra d s o r p t i ea a nh e t
S i 0 / v l o e i s t o fg r e n s v l a kk a n ,o o k
2
d eo p p e r v l a k t ep o t e n t i a , a l
('Y,)
g r e n s v l a kv e r a n d e r e n .
i s m e r k b a a ri nd e
D i t
a a nh e te l e c t r o l i e t / i s o l a t o r CV c u r v e .
h o r i z o n t a l ev e r s c h u . i v i n gi nd e
v o r mv a ne e n
Deze v e r s c h u i v i n g
2 a a n g e d u i d met A V . B O U S S E h e e f td e r e l a t i e t u s s e no p p e r v l a k t e p o t e n t i a a le n
i s i nF i g u u r
AV b e p a a l d als f u n k t i e , v a n de p H v a n de e l e k t r o l i e t o p l o s s i n g (BOUSSE 1980 )
.
J A N A T A h e e f tt e ng e v o l g ev a na l b u m i n ea d s o r p t i ed r a i n -
b i j een ISFET,
s t r o o m v e r a n d e r i n g e ng e m e t e n w i j z e n op v e r a n d e r i n g e n i n g e v o l g ev a n
die eveneens
de o p p e r v l a k t e p o t e n t i a a l t e n
de a d s o r p t i e .
V i a CV m e t i n g e nk u n n e ni np r i n c i p ed u s
twee effecten
w o r d e ng e m e t e n : A.
E e nv e r a n d e r i n gi n
B.
E e nv e r a n d e r i n gi no p p e r v l a k t e p o t e n t i a a lr e s u l t e r e n di n
capaciteit resulterendineen
AC
ads
e e n AV. V I I . 3E . xperimenteel
materialen;: V o o rd ea d s o r p t i e e x p e r i m e n t e n z u i v e r d H S A ( l o t n r ,A 9 5 1 1v a n
i s g e b r u i kg e m a a k tv a ng e SIGMA),
HFb ( K A B I ) e n HIgG De
( C e n t r a a l a b o r a t o r i u mv a nd eB l o e d t r a n s f u s i e d i e n s t ) . z u i v e r i n ge nk a r a k t e r i s e r i n gv a nd e z ee i w i t t e n i nH o o f d s t u k
i s beschreven
11.
H e t p e p t i d eS 2 2 3 8
was a f k o m s t - i gv a n
KABI,
Stbckholm.
S2238 s t a a t v o o r H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine-p n i t r o a n i l i d ed i h y d r o c h l o r i d e
('M=625,6).. Het p r e p a r a a tw o r d t
g e w o o n l i j kg e b r u i k tv o o rd eb e p a l i n gv a np r o t r o m b i n ee n a n t i t r o m b i n ei na ' c t i v i t e i ti np l a s m a .I nd i tg e v a l
is S2238
g e b r u i k t voor c o ' n t r o l e m e t i ' n g e n ,w a a r b i jS 2 2 3 8g e a d s o r b e e r d i 2-
w e r da a nS i 0
13 1
Radiolabeling D e labelingstechniek
is toegepast
en S i 0 oppervlakken t e bestuderen. 125 I g e b r u i k m a k e nvdadnceh l o o r a m i n e
o m de a d s o r p t i e v a n
KSA
HSA i s g e l a b e l d m e t T m e t h o d ez,o a l s
b e s c h r e v e n i n H o o f d s t u k 11.
V I I . 4.
Resultaten
T e r c o n t r 8 l ev a nd em e e t o p s t e l l i n ge nm e e t m e t h o d e
a d s o r p t i ea a n h e tp e p t i d e
Si0
2
S2238.
a l s f u n c t i ev a nd e
I n F i g u u r 3 i s d ec a p a c i t e i t s v e r l a g i n g
v a nh e ts y s t e e mw e e r g e g e v e nt e ng e v o l g ev a n e v e n a l sd ev e r h o g i n g
is de
t i j d b e s t u d e e r dv a n
S2238 a d s o r p t i e
i n capaciteittengevolgevandesorptie
a a n Si0 H e t s i l i c i u m . bevond z i c hh i e r b i ji na c c u m u l a t i e 2door V = -4V t e kiezen. D e c a p a c i t e i t s v e r l a g i n g i s c o n t i n u
1 32
t e v o l g e n a l s f u n k t i ev a nd e a a nh e te l e c t r o l i e t
t i j d n at o e v o e g i n gv a n
S2238
(PBS). N a 2 0 m i n u t e n s t a b i l i s e e r t
c a p a c i t e i tz i c ho pe e ne i n d w a a r d e . w a a r s c h i j n l i j kv e r z a d i g d
de
H e t o p p e r v l a k . - i sd a n
m e t S2238. met PBS
W a n n e e rv e r v o l g e n sh e to p p e r v l a kg e s p o e l dw o r d t
0,360
'
0,355
0,350
0.345 h
?J
E
u-
5 0,34C
d
.+ .a -w .o cct
Q
o .0,33E
I
O
20
40
60
I
80
100
I
I
I
120
130
140
tijd (min.) Figuur 3
De c a p a c i t e i t s v e r a n d e r i n gv a ne e n Si/SiO
2
( 8 n m ) / P B S( 0 , 1 5N a C l ) / r , e f e r e n t i e
e l e c t r o d eo p s t e l l i n gt e ng e v o l g ev a n a d s o r p t i e / d e s o r p t i ev a n f u n c t i ev a nd e
tijd.
S2238 a a n S i 0
2
als
V = -4V..
13 3
weer o p d eo o r s p r o n k e l i j k e
b u f f e r ,k e e r td ec a p a c i t e i t
Er i s h i e rs p r a k ev a nv e r so p g e l o s tS 2 2 3 8
w a a r d et e r u g .
. Volgens
( F i g u u r3 )
d e c bijsluiter v a n K A B 1 t r e e d t ,
d e a a n w e z i g h e i dv a nm i c r o o r g a n i s m e ni n
g e v o l g ev a n sing.
D i t
i s ook m e r k b a a ri n
E r w o r d e ng e e n
de oplos-
de capaciteitsmeting.
Een n i e t
s t e r k a f w i j k e n d er e s u l t a -
v e r s eo p l o s s i n gS 2 2 3 8v e r o o r z a a k t ten.
b i j niet
o p v a nh e tp e p t i d et e n
v e r s eo p l o s s i n g e n5 2 2 3 8 ,h y d r o l y s e
deteckeerbare capaciteitsveranderingen
meer g e m e t e nt e ng e v o l g ev a nt o e v o e g i n gv a nS 2 2 3 8a a n
d e PBS
o p l o s s i n g ,w a n n e e rd es 2 2 3 8o p l o s s i n g e no u d e rz i j nd a n
1
week.
Voomr de b e p a l i n gv a n
d e l a b e l i n g s m e t h o d eg e b r u i k t ,
w a a r b i j d e a d s o r p t i ev a n
a a n S i 0 2 b e p a a l d i s a l s f u n c t i ev a nd e v a n d e c o n c e n t r a t i e( F i g u r e n c o n c e n t r a t i en e e m tn a w a a r d ev o o rd e
Si02 is
d e a l b u m i n ea d s o r p t i ea a n
HSA
t i j d en als functie
4 e n 5 ) . De H S A o p p e r v l a k t e -
1 5 m i n u t e nn i e t
meer t o e .
H S D A a d s o r p t i e (0,6 pgcm
-2
)
D e plateau-
k o mot v e r e e n
m e t d e H S A p l a t e a u w a a r d ev o o ra d s o r p t i ea a np o l y s t y r e ' e n ,d i e b e p a a l d werd met r a d i o l a b e l i n g . Met b e h u l pv a nc a p a c i t e i t s m e t i n g e n
t i e v a n HSA, HPb
is g e t r a c h t de adsorp-
e n HIgG t e v o l g e n a l s f u n c t i e v a n
w a a r b i j d e e i w i t c o n c e n t r a t i ev a r i e e r d ev a n
1 0 g1-l.
D i t i s i n t e r e s s a n tt . a . v .
s e l e ng e d u r e n d e m e t h o d em o e i l i j k
0,Ol
de t i j d , -1 g1 . t o t
de a d s o r p t i e v e r s c h i j n -
d e eerste 1 5 minuten,
d i e v i a de l a b e l i n g s -
y e r e g i s t r e e r d k u n n e nw o r d e n W . anneer
de
e l e c t r o l i e t o p l o s s i n g b e s t a a t u i t P B S b u f f e r( i o n s ' t e r k t e
0,15
M ) b l i j k t d e c a p a c i t e i tv a nh e tr e f e r e n t i ee l e c t r o d e / / S i s y s t e e md o o r d e a d s o r p t i ev a ne i w i t t e n 2 n i e t d e t e c t e e r b a a r t e v e r a n d e r e n . Wel z i j nt e ng e v o l g ev a n
electroliet/SiO
HSA,
H F b e n HIgG a d s o r p t i e h o r i z o n t a l e v e r s c h u i v i n g e n i n
CV c u r v ew a a r g e n o m e n ,
d i e d u i d e n o p e e nv e r a n d e r d e
o p p e r v l a k t e p o t e n k i a a la a nh e t pH w e r dt i j d e n s
134
de
S i 0 / v l o e i s t o fg r e n s v l a k . 2
d e m e t i n gn i e tv e r a n d e r d
(pH = 7,351.
De
' o
-
0 O
adsorptie tijd (uren) Figuur 4
D e s n e l h e i d s c u r v e v a n H S A adsorptie aan SiOat bepaald met behulp van radiolabeling., De -1 concentratie is l g l
HSA
.
HSA concentratie (gl-l) Figuur 5
De adsorptieisotherm van
H S A aan Si0 bepaald 2r
met behulp van radiolabeling.
13 5
Discussie
VII.5.
H e t m e e s t o p v a l l e n d er e s u l t a a ti n
d i t hoofdstuk
is d a t d e
€€SA, HFb e n HIgG g e e n c a p a c i t e i t s v e r l a g i n g t e n
a d s o r p t i ev a n
g e v o l g ev a nh e tr e f e r e n t i e
electrode/electroliet/SiO
2
/Sí
systeemheeft. Een v e r k l a r i n g v o o r d i t r e s u l t a a t k a n g e z o c h t w o r d e n i n d es t r u c t u u rv a nd ee i w i t t e n .E i w i t t e nz i j nm a c r o m o l e c u l e n tertiaire structuurbezit-
d i ee e np r i m a i r e ,s e c u n d a i r ee n ten.
M e t name de t e r t i a i r es t r u k t u u r ,w a n n e e rd e z eb e h o u d e n
blijfttijdens
i s e r d eo o r z a a k
d ea d s o r p t i ev a nh e te i w i t ,
e i w i t kun-
v a nd a tk l e i n ei o n e nv r i jd o o rh e tg e a d s o r b e e r d e
i s daardoor te
D e g e a d s o r b e e r d ee i w i t l a a g
n e nd i f f u n d e r e n .
b e s c h o u w e na l se e ne l e c t r i s c hp o r e u z el a a g . r e e d sg e w e z e n
E L R I C H h e e f to o k
op d ea a n w e z i g h e i dv a ne e nv r i j ed o o r g a n gv o o r
w a t e r m o l e c u l e ne ni o n e ni ne e nl a a ge i w i t m o l e c u l e n 1 9 7 71
(EIRICH
.
P e p t i d e nz i j nv e e lk l e i n e rd a ne i w i t t e ne nb e z i t t e ng e e n t e r t i a i r e e ns e c u n d a i r es t r u k t u u r .
Een g e a d s o r b e e r d e
p e p t i d e l a a g i s d a no o ke l e c t r i s c hg e z i e nv e e lm i n d e rp o r e u s e ng e d r a a g tz i c hd a a r d o o r
m e e r als eenisolator. 3 ) waaruit een
D i t blijktookuitderesultaten(Figuur
d u i d e l i j k ec a p a c i t e i t s v e r l a g i n gw a a r n e e m b a a r
i s t e ng e v o l g e
D e r e s u l t a t e n m e t be2trekkingtotdeeiwitadsorptieenpeptideadsorptieaan
v a nd ep e p t i d e a d s o r p t i ea a n
S i 0 2 ,g e m e t e n
m e t b e h u l pv a nc a p a c i t e i t s m e t i n g e n ,s t e m m e n
g r o t e n d e e l so v e r e e n vindtechter
SjO
m e t d er e s u l t a t e nv a n
STENBERG, M i j
w e l eenzeergeringecapaciteitsverlagingten
g e v o l g ev a n
HSA
a d s o r p t i e (1,5%), w a a r s c h i j n l i j k t e n g e v o l g e
v a ne e ng r o t e r eg e v o e l i g h e i dv a nd em e e t o p s t e l l i n g( e e n dunnere S i 0
2
laag).
G e z i e nh e t" i r r e v e r s i b e l e n 'k a r a k t e rv a ne i w i t a d s o r p t i e ( H o o f d s t u k 111) e n d e r e v e r s i b e l e a d s o r p t i e v a n
S2238 a a n
d a t de i n t e r a c t i e e n h e t mag v e r o n d e r s t e l dw o r d e n , 2 c o n t a c t t u s s e n e i w i t e no p p e r v l a kg r o t e r i s d a nt u s s e n
Si0
p e p t i d ee no p p e r v l a k .
136
D e v e r k l a r i n gd i e
STENBERG g e e f f , d a t
t e ng e v o l g ev a ne e nz e e rg e r i n gc o n t a c tt u s s e ng e a d s o r b e e r d e i w i te ns u b s t r a a tg e e ns t e r k ec a p a c i t e i t s v e r l a g i n go p t r e e d t is d a no o km i n d e r
invergelijkingmetpeptideadsorptie aannemelijk.
Integenstellingtotcapaciteitsmetingenblijkt,datten g e v o l g ev a n
HSA,
HFb e n HIgG a d s o r p t i e w e l d eS i O zo p p e r -
vlaktepotentiaa1,verandert. D e o p t r e d e n d ev e r a n d e r i n g e nb l e k e ne c h t e rn i e tr e p r o d u c e e r b a a re nd e r m a t eg r i l l i g ,d a to p d i t moment
g r o n dh i e r v a no p
g e e nv e r d e r eu i t s p r a k e n
mogen
w o r d e ng e d a a n . J A N A T A z i e t o pb a s i sv a nd ed o o r, h e ma a ne e n
ISFET geme-
t e nv e r a n d e r e n d eo p p e r v l a k t e p o t e n t i a a lt e ng e v o l g ev a n a l b u m i n ea d s o r p t i e ,m o g e l i j k h e d e nv o o rd eo n t w i k k e l i n gv a n e e ni m m u n o e l e c t r o d e .
H i j v e r m e l d te c h t e rn i e t so v e rr e p r o -
d u c e e r b a a r h e i de nn a u w k e u r i g h e i dv a nz i j nm e t i n g e n .
Conclusie T . a . v .d ec a p a c i t e i t s m e t i n g e nk a ng e s t e l dw o r d e n ,d a t d e z ev o o rd eb e s t u d e r i n gv a ne i w i t a d s o r p t i en i e td i r e c t g e s c h i k tz i j n . H e t
i s e c h t e rw e lm o g e l i ' j k
m e t b e h u l pv a nc a p a c ì t e i t s -
m e t i n g e nd ek i n e t i e kv a na d s o r p t i ee nd e s o r p t i ev a nl a a g in situke
m o l e c u l a i rm a t e r i a a l ,z o a l sp e p t i d e n ,c o n t i n u v o l g e n a l s f u n c t i ev a nd et i j d .
Ook i s h e t m o g e l i j k
om o p
eiwit-
d e z ew i j z ed ec o n c u r r e r e n d ea d s o r p t i ev a np e p t i d e ne n t e nt eb e s t u d e r e n .
T . a . v .d em e t i n g - v a ne e nv e r a n d e r i n gi no p p e r v l a k t e p o t e n t i a a lt e ng e v o l g ev a ne i w i t a d s o r p t i ek a ng e s t e l dw o r d e n ,d a te e n
I S F E T m e t i n gd i r e c t e r
i s d a ne e n
i nd et o e k o m s tp e r s p e c t i e v e nk a nb i e d e n
CV m e t i n ge n
m e t betrekkingtot
d eo n t w i k k e l i n gv a ne e ne i w i t g e v o e l i g eS i / S i Oe l e c t r o d e . 2 D e r e p r o d u c e e r b a a r h e i de ne e n d u i d i g h e i dv a nd e m e t deze e l e c t r o d ev e r k r e g e nr e s p o n sd i e n e ne c h t e r
w e l beter te zijn,
d a nd ei nd i th o o f d s t u k 'v e r m e l d er e s u l t a t e n .
1 37
REFERENTIES
ARWIN,
BOUSSE,
H.
,
Thesis
L.,
(1980).
P r o e f s c h r i f t "The chemkcal s e n s i t i v i t y of
e l e c t r o l y t e / i n s u l a t o rs i l i c o n
Proefschrift
D E ROOIJ, N . F . ,
structures" ( 1 9 8 2 ) . ISFET i n E l e c t r o c h e m i s t r y "
"The
(1978).
EIRICH,
J.,
IVARSSON,
J.
Colloid Interface Sci.
JÖNSSON,
B.,
U.,
LUNDSTRÖM,
C o l l e c t i o n o f p a p e r s from t h e l a b .
L i n k ö p i n g I n s t i t u t e of
JANATA,
138
B.,
J.
Am.
58,
423 ( 1 9 7 7 ) .
I.,
and MC Q U E E N ,
of A p p l i e d P h y s i c s ,
T e c h n o l o g y L A P P H 81-1
Chem. SOC 9 7 ,
2914 ( 1 9 7 8 ) .
(1981).
D.,
r e s u l t s o f a d s o r p t i o ns t u d i e sw i t hs o m e
I nt h i st h e s i st h e
(HSA), f i b r i n o g e n( H F b )
p l a s m ap r o t e i n s( h u m a ns e r u ma l b u m i n a n d human immuno
gamma g l o b u l i n( H I g G ) )o n t os o l i d / l i q u i d described.
i n t e r f a c e sa r e
is
T h ea i mo ft h e s ei n v e s t i g a t i o n s
at the
t oo b t a i nm o r ei n s i g h ti nt h ep r o c e s s e so c c u r i n g s u r f a c e o f p o l y m e r i cm a t e r i a l si nc o n t a c tw i t hb l o o d .
A r e v i e wo ft h el i t e r a t u r ea b o u tp r o t e i na d s o r p t i o na t
i n t e r f a c e s i s p r e s e n t e di nC h a p t e r
I.
I t i s shown t h a t s t i l l
many c o n t r a d i c t i o n s a b o u t p r o t e i n , a d s o r p t i o n
l i k e the
do e x i s t .
q u e s t i o no ft h er e v e r s i b i l i t yo fa d s o r p t i o n 11. i t i s s h o w n ,t h a tp r o t e i n
d i m e r s a n do l i g o -
mers a r e p r e s e n t e di nn o np u r i f i e ds o l u t i o n s .
T h ep r e s e n c eo f
I nC h a p t e r
t h e s ep r o d u c t is np r o t e i ns o l u t i o n u s s e df o ar d s o r p t i o n
,
s t u d i e s may l e a d t o a m i s i n t e r p r e t a t i o no ft h ea d s o r p t i o n d a t aT. h i C s h a p t e ar l s o d e s c r i b e tsh atth a edsorption b e h a v i o u ro fr a d i o l a b e l e dp r o t e i n so n t o
a p o l y s t y r e n el a t e x
o f t h en o n - l a b e l e do n e s .I s o t h e r m s
d i f f e r sf r o mt h a t a d s o r p t i o no f
,
HSA,
for t h e
HIgG a n d HFb o n t o a p o l y s t y r e n e l a t e x a r e
d e t e r m i n e db ym e a s u r i n gt h ed e p l e t i o n
of p r o t e i n i n t h e
s o l u t i o n .T h i s .h a s' e i t h e rb e e nf o l l o w e db yr a d i o a c t i v i t y m e a s u r e m e n t s o r b y UV s p e c t r o s c o p y .D i f f e r e n ta d s o r p t i o n i s o t h e r m sf o rt h es a m ep r o t e i n r a d i o a c t i v i t y o r UV
were o b t a i n e d when e i t h e r
spec,troscopy w au s sed as
a detection
technique.
seems t o
T h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so n t o ,p o l y s t y r e n el a t e x b ei r r e v e r s i b l e
( n o s p o n t e a n o u sd e s o r p t i o nh a sb e e no b s e r v e d i t a l s oa p p e a r s
o n c e t h e p r o t e i nh a sb e e na d s o r b e d ) .H o w e v e r , t h a te x c h a n g eo fp r o t e i n sa tt h es u r f a c ew i t ht h e s ei n s o l u t i o n i s p o s s i b l e .B a s e do nt h i si n f o r m a t i o no n e i n c l i n e dt oi n f e rt h a tp r o t e i na d s o r p t i o n l o n ga se x c h a n g e
o f p r o t e i nm o l e c u l e s
is
i s r e v e r s i b l e as is considered.
A d e s c r i p t i o no ft h ea d s o r p t i o n / d e s o r p t i o np r o c e s so f
p r o t e i n sa tt h ep o l y s t y r e n es u r f a c eh a sb e e ng i v e ni nC h a p t e r III.
139
T h i sd e s c r i p t i o ni n c l u d e dt h ea s s u m p t i o no f
a structural
change of p r o t e i n as a r e s u l t o f t h e a d s o r p t i o n a t t h e s o l i d / l i q u i di n t e r f a c e . I no r d e rt oo b t a i nr e l i a b l er e s u l t sf r o mc o m p e t i t i v e
a m e t h o db a s e d
p r o t e i na d s o r p t i o ne x p e r i m e n t s ,
o n t h eu s e
was d e v e l o p e d a s a
H i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y
is
a l t e r n a t i v eo ft h er a d i o l a b e r i n gm e t h o d .T h i sm e t h o d d e s c r i b e d 'i nC h a p t e r HSA,
IV.
C o m p e t i t i v ea d s o r p t i o ns t u d i e sw i t h
HFb a n d H I g G o n t oP S - l a t e xs h o wt , h a t
p r e f e r e n t i a la d s o r p t i o n
a strong
o f HPb t a k e s p l a c e .
When a d s o r p t i o n
s t u d i e s were c a r r i e d o u t w i t h s o l u t i o n s c o n t a i n i n g m o n o m e ra n dd i m e r ,
of
a p r e f e r e n t i a la d s o r p t i o n
HSA
o f HSA d i m e r was
observed. T h ea d s o r p t i o n
o f H S A o n t op o l y s t y r e n ea n dp o l y ( v i n y 1
c h l o r i d e )m e a s u r e db yr a d i o l a b e l i n ga n da n
Enzyme Immuno
A s s a y ( E I A ) h a sb e e nd e s c r i b e di nC h a p t e r
V.
T h ea d s o r - p t i o n
It is
EIA m e t h o d .
s t u d yw a sd o n ei no r d e rt oq u a n t i f yt h e shown t h a t H S A s u r f a c ec o n c e n t r a t i o n s c a nn o tb eq u a n t i f i e db y
T h i sc o m p a r a t i v e
o f m o r et h a n
pgcm
0,l
-2
EIA.
o f p r o t e i n s a t s o l i d / p l a s m ai n t e r f a c e sh a sb e e n
d e s c r i b e d i nC h a p t e r
VI. No 'HSA a d s o r p t i o nf r o mp l a s m ao n t o
. P S - l a t e x was f o u n d .H o w e v e rt h el a r g e r
HFb a n d HIgG m o l e c u l e sd o
a d s o r bo n t oP S - l a t e x . I nC h a p t e r
V I 1 Capacity-Voltage
a d s o r p k i o ns t u d i e s .T h ea d s o r p t i o no f
i s n o tm e a s u r a b l e
as y e t b e c a u s e
p r o t e i n s a s c o m p a r e dw i t ht h e
(CV)
m e a s u r e m e n t s a r e u s e df o r
HSA, HIgG a n d HFb o n t o S i 0
of t h eh i g hc a p a c i t y
Si0
2
c a p a c i t y( p r o t e i n s
are of
e l e c t r i caT adlhsl ey o r pdat eino sdon r p k t iionne t i c s p e p t i d e sh o w e v e rc o u l d r e s u l t st h a t process.
140
b e f o l l o w e di nt h i s
t h e a d s o r p t i o no f
2
of t h e
way.
peptides onto S i 0
I t i s s h o w nf r o m
2
is a r e v e r s i b l e
SAMENVATTING In dit proefschrift worden de resultaten van een studie naar de adsorptie van enkele plasma eiwitten (menselijk albumine (HSA), fibrinogeen (HPb) en gamma globuline (HIgG),) aan vast/vloeistof grensvlakken beschreven. Het doel van het onderzoek is om meer inzicht te verkrijgen in de processen die zich afspelen aan het grensvlak van polymere materialen en bloed. Uit een literatuur overzicht in HoofdstukI wordt.duidelijk 'dat er met betrekking tot de adsorptie van eiwitten aan grensvlakken nog veel tegenstrijdige opvattingen bestaan. Vooral het al of niet reversibele karakter van eiwitadsorptie is een onderwerp waarover nog geen eensluidende mening i s , gevormd
.
In Hoofdstuk I1 wordt met behulp van verschillende ka'rakteriseringsmethoden aangetoond, dat oplossingen van eiwitten die niet gezuiverd zijn, dimeren en oligomeren bevatten. De aanwezigheid van deze dimeren en oligomeren in de eiwitoplos-. sing kan de adsorptieresultaten aanzienlijk beïnvloeden.Ook wordt in dit Hoofdstuk melding gemaakt van het afwijkend adsorptiegedrag van gelabelde eiwitten in vergelijking metongelabelde eiwitten. De isothermen HSA, HIgG en HFb aan polystyreen-latex werden bepaald door meting van de afname van de eiwitconcentratie in de oplossing. Deze afname werd z.owel met behulp van radioactiviteitsmetingen als met UV spectroscopie gemeten. Er werden verschillende isothermen verk.regen voor de adsorptie van hetzelfde eiwit aan polystyreen-latices indien gebruik gemaakt werd van radioactiviteitsmetingen of van UV spectroscopie als detectie-techniek. De adsorptie van de eiwitten aan polystyreen oppervlakken lijkt irreversibel (eenmaal geadsorbeerde eiwitmo.1eculen desorberen niet meer spontaan).
Uitwisseling blijkt wè1 moge-
lijk. Op .grond van dit gegeven wordt geconcludeerd dat de adsorptie toch reversibel is,wan,neer men naar uitwisseling van eiwitmoleculen kijkt.
141
I nH o o f d s t u k
met d e b e p e r k i n g e n
I11 w o r d t ,r e k e n i n gh o u d e n d
v a nd er a d i o l a b e l i n g s m e t h o d e ,e e nb e s c h r i j v i n gg e g e v e nv a n h e ta d s o r p t i e / d e s o r p t i ep r o c e sv a ne i w i t t e na a np o l y s t y r e e n .
eiwit t e n
E r w o r d th i e r b i j .e e ns t r u c t u u r v e r a n d e r i n gv a nh e t
g e v o l g ev a na d s o r p t i ea a n g e n o m e n . T e r v e r k r i j g i n gv a nb e t r o u w b a r er e s u l t a t e nu i tc o n c u r r e -
r e n d ee i w i t a d s o r p t i ee x p e r i m e n t e n
i s e e nm e t h o d eo n t w i k k e l d
w a a r b i jg e b r u i k tg e m a a k tw o r d tv a nH i g hP e r f o r m a n c eL i q u i d Chromatografie.
D i t a l s a l t e r n a t i e fv o o r
de labelingsmethode.
D e H P L C m e t h o d ew o r d tb e s c h r e v e ni nH o o f d s t u k
IV.
h o o f d s t u kw o r d e nt e v e n sd er e s u l t a t e ng e g e v e nv a n r e r e n d ea d s o r p t i ev a n
HSA,
In dit de concur-
HIgG e n HFb a a nP S - l a t e x .
een sterke p r e f e r e n t i ë l ea d s o r p t i ev a n
E r wordt.
HFb waargenomen.
met o p l o s s i n g e n
W a n n e e ra d s o r p t i e s t u d i e sw o r d e nv e r r i c h t
dimeer a a n w e z i gz i j n ,a d s o r b e e r t
w a a r i n H S A m o n o m e e re n
HSA
dimeer p r e f e r e n t i e e l . I nH o o f d s t u k
V w o r d t d e a d s o r p t i ev a n
e np o l y ( v i n y l c h 1 o r i d e )b e s c h r e v e n .
D e m e t . i n g e nw e r d e nu i t g e -
v o e r d m e t b e h u l p - v a nr a d i o l a b e l i n ge n
met b e h u l pv a ne e n
H e t b l e e k e c h t e rd a t
meer d a n 0 , l
v l a k t ec o n c e n t r a t i e sv a n
Enzym
wijze i n p r i n -
D e . E I A m e t h o d ez o uo p ' d e z e
Immuno A s s a y ( E I A ) .
c i p e t e k w a n t i f i c e r e nz i j n .
t i f i c e r e nz i j n
H S A a a np o l y s t y r e e n
met b e h u l pv a n
ETA.
HSA opper-2 p.gcm n i e t t e kwan-
.
D e a d s o r p t i ev a ne i w i t t e na a nP S - l a t e xv a n u i tp l a s m aw o r d t
b e s c h r e v e ni nK o o f d s t u k
VI.
E r werd g e e n H S A a d s o r p t i e a a n
P S - l a t e xv a n u i tp l a s m aw a a r g e n o m e n . m o l e c u l e na d s o r b e r e ne c h t e r I nH o o f d s t u k
D e g r o t e r e HFb e n HIgG
wel a a nP S - l a t e x .
V I 1 z i j n de Capaciteits-Spannings
HIgG e n KPb a a n S i 0
2
is v o o r a l s n o gn i e t
h o g ec a p a c i t e i tv a nd ee i w i t t e ni nv e r g e l i j k i n g
a l s f u n c t i ev a n
de t i j d .
a d s o r p t i ev a np e p t i d e na a n
142
HSAI
meetbaar v a n w e g e d e
h e t S i 0 2 ( e i w i t t e nz i j ne l e c t r i s c h" p o r e u s " ) . a d s o r p t i ee nd e s o r p t i ev a np e p t i d e n
metin-
(CV)
D e a d s o r p t i ev a n
g e nv o o ra d s o r p t i e s t u d i e sb e s c h r e v e n .
m e t d i ev a n Wel i s d e
o p deze w i j z e g e v o l g d
U i t d e , r e s u l t a t e n b l i j k t dat de
S i 0 2 e e nr e v e r s i b e lp r o c e s
is,
CURRICULUM VITAE Henny Lensen werd in 1952 geboren te 's-Hertogenbosch.
Hij
bezocht daar het St. Janslyceum (Eindexamen HBS-B 1971). In 1971 begon hij zijn scheikundestudie aan Kath'olieke de Universiteit Nijmegen, alwaar hij in 1975 het kandidaatsexamen (met als bijvakken wiskunde, natuurkunde en biologie) en in 1979 het doctoraalexamenaflegde. Het doctoraal gedeelte bestond uit een hoofdvak Biofysische chemie onder leiding van Prof. Dr. G.A.J.
van O s en een
tweede hoofdvak Vaste stof chemie onder leiding van.Prof. Dr.
J. Bloem. In het kader van Vaste stof chemie werd een
student assistentschap bekleed, gefinancierd door de Commissie van Europese Gemeenschappen. Voorts heeft hij enige jaren schei- e n natuurkundelessen verzorgd aan twee opleidingen. voor verpleegkundigen. In 1979 werd hij wetenschappelijk assistent aan de Technische Hogeschool Twente. Vanaf 1979 werd het in dit proefschrift beschreven promotieonderzoek uitgevoerd aan de afdelingen Chemische Technologie en Elektrotechniek van de THT en het ziekenhuis "De Stadmaten" te Enschede.
143
