Vliv teploty a sucha na obsah kyseliny abscisové v rostlinách obilnin Temperature and drought influence on abscisic acid content in cereal plants

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra rostlinné výroby

Doktorský studijní program: 4102V Fytotechnika Studijní obor: Speciální produkce rostlinná

Ing. Eva Vlasáková

Vliv teploty a sucha na obsah kyseliny abscisové v rostlinách obilnin Temperature and drought influence on abscisic acid content in cereal plants

DISERTAČNÍ PRÁCE K ZÍSKÁNÍ AKADEMICKÉHO TITULU Ph.D.

Školitel: prof. Ing. Josef Pulkrábek, CSc. Česká zemědělská univerzita v Praze

Školitel specialista: RNDr. Ilja Prášil, CSc. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.

Praha, květen 2011

PODĚKOVÁNÍ Děkuji svým školitelům, spolupracovníkům a rodině za podporu. Konjugát pro kvantifikaci ABA poskytli F. Janowiak z institutu rostlinné fyziologie Polské akademie věd a F. Asch z Univerzity v Hohenheimu, katedry rostlinné produkce a agroekologie tropů a subtropů. Práce byla realizována s finanční podporou GAČR 521/03/0137, GAČR 521/05/H013, MZe 0002700602, MZe QH 91192, MZe 0002700604.

2

Obsah Abstrakt ................................................................................................................................ 6 Abstract ................................................................................................................................ 6 Seznam zkratek .................................................................................................................... 8 1 Úvod .................................................................................................................................. 9 1.1 Cíle disertační práce ................................................................................................. 10 2 Literární rešerše .............................................................................................................. 12 2.1 Obilniny a prostředí ................................................................................................. 12 2.2 Působení stresorů ..................................................................................................... 14 2.3 Nízká teplota ............................................................................................................ 16 2.3.1 Mráz a rostlinná pletiva .................................................................................... 19 2.3.2 Mrazuvzdornost ................................................................................................ 20 2.3.3 Testování mrazuvzdornosti ............................................................................... 22 2.4 Sucho........................................................................................................................ 23 2.4.1 Průduchy ........................................................................................................... 25 2.5 Kyselina abscisová ................................................................................................... 26 2.5.1 Biosyntéza ......................................................................................................... 27 2.5.2 Katabolizmus .................................................................................................... 29 2.5.3 Regulace metabolizmu ABA ............................................................................ 29 2.5.3.1 Proteiny v roli receptoru kyseliny abscisové ............................................. 30 2.5.3.2 Signální dráhy kyseliny abscisové ............................................................. 32 2.5.3.3 ABA v nadzemní části rostliny .................................................................. 34 2.5.3.4 ABA v kořeni ............................................................................................. 35 2.5.4 ABA a stresové situace způsobené suchem ...................................................... 35 2.5.5 ABA a nízká teplota .......................................................................................... 39 2.5.6 Stanovení ABA ................................................................................................. 41 2.5.7 ABA a fytohormony ......................................................................................... 42 2.5.8 ABA aktuálně.................................................................................................... 42 2.6 Metody pro navození stresu sucha ........................................................................... 43 2.7 Metody pro navození stresu nízké teploty ............................................................... 43 3 Materiál a metody ........................................................................................................... 44 3.1 Příprava rostlinných materiálů a organizace pokusů ............................................... 44

3

3.1.1 Pokusy navozující stres sucha snížením hydratace pletiv (vysušení odstřižených listů – DLT detached leaf test) .................................................... 45 3.1.1.1 Sledování vlivu poškození listů sáním mšic s infikací virem BYDV ........ 46 3.1.1.2 Pokusy navozující stav dlouhodobého sucha sezóna 2008/2009 – venkovní nádobové pokusy pod přístřeškem ............................................................. 46 3.1.1.3 Pokusy navozující stav dlouhodobého sucha sezóna 2009/2010 – venkovní nádobové pokusy pod přístřeškem ............................................................. 47 3.1.2 Pokusy zaměřené na působení vlivu nízkých teplot a dehydratace pletiv (aklimatizační proces a DLT) ........................................................................... 48 3.1.2.1 Působení nízkých teplot během aklimatizace ............................................ 48 3.1.3 Nízké teploty ..................................................................................................... 49 3.1.3.1 Působení jarovizačních teplot a pozdní nízké teploty v době metání ........ 49 3.2 Měřené charakteristiky............................................................................................. 50 3.2.1 Definice charakteristik ...................................................................................... 50 3.2.2 Stanovení charakteristik .................................................................................... 50 3.3 Použitý rostlinný materiál ........................................................................................ 53 4 Výsledky ......................................................................................................................... 57 4.1 Stanovení vodních charakteristik a obsahu ABA v experimentech navozujících stres sucha ........................................................................................................................ 57 4.1.1 Ztráta vody z listů ............................................................................................. 57 4.1.2 Vodní sytostní deficit ........................................................................................ 57 4.1.3 Sání mšicemi a napadení virem BYDV ............................................................ 58 4.1.4 Sledování obsahu ABA v rostlinách ječmene po ukončení zálivky za podmínek krátkodobého sucha .......................................................................................... 59 4.1.5 Stanovení obsahu ABA a množství proteinů v rostlinách ječmene po ukončení zálivky za podmínek déletrvajícího sucha ........................................................ 62 4.1.6 Sledování obsahu ABA v rostlinách pšenic a ječmenů za podmínek dlouhodobého sucha ve venkovních nádobových pokusech ............................ 64 4.1.6.1 Nádobové pokusy realizované v letech 2008-2009 ................................... 64 4.1.6.2 Nádobové pokusy realizované v letech 2009-2010 ................................... 65 4.2 Vliv působení nízkých teplot a vysušení listů na obsah ABA ................................. 67 4.2.1 Aklimatizační proces a DLT ............................................................................. 67 4.3 Obsah ABA v listech pšenice po vystavení rostlin nízké teplotě v době metání ..... 71

4

4.3.1 Doba jarovizace a vystavení rostlin stresu nízké teploty na počátku fáze metání ........................................................................................................................... 71 5 Diskuse ............................................................................................................................ 74 5.1 Typy experimentů a geografický původ rostlin ....................................................... 74 5.2 Dehydratace pletiv ................................................................................................... 75 5.2.1 Působení dlouhodobého sucha na rostliny pšenic a ječmenů-nádobové pokusy realizované v letech 2008-2010 ........................................................................ 79 5.3 Vliv nízkých teplot a dehydratace pletiv na obsah ABA ......................................... 81 5.4 Vliv nízké teploty v době metání ............................................................................. 85 6 Závěr ............................................................................................................................... 86 6.1 Souhrn výsledků....................................................................................................... 86 6.1 Doporučení pro praxi a další vědeckou práci .......................................................... 88 Literatura ............................................................................................................................ 89 Přílohy .............................................................................................................................. 101 Příloha 1: Meteorologické hodnoty z polního pokusu v roce 2009, MZLU v Brně ................................................................................................................. 101 Příloha 2: Meteorologické hodnoty z polního pokusu v roce 2010, MZLU v Brně ................................................................................................................. 104 Příloha 3: Parametry lineární spojnice trendu hodnotami ABA zjištěnými v průběhu chladové aklimatizace s využitím DLT .................................. 107

5

Abstrakt Práce hodnotí využití obsahu kyseliny abscisové v listech obilnin jako selekčního kritéria odolnosti odrůd vůči suchu a nízké teplotě. Během experimentů byly navozeny podmínky nízké teploty a krátkodobého, déletrvajícího i dlouhodobého sucha u souboru osmnácti odrůd pšenice a deseti odrůd ječmene. Byly sledovány změny v obsahu ABA v průběhu chladové aklimatizace a při napadení rostlin virem BYDV (po přenosu mšicemi). Kromě kvantifikace obsahu ABA v listových čepelích byly v podmínkách sucha stanoveny základní vodní charakteristiky (vodní sytostní deficit, osmotický potenciál, obsah vody v pletivech, diskriminace uhlíku

13

C, obsah vody v půdě). Byl hodnocen vztah mezi obsahem ABA a

akumulací dehydrinu DHN5. Endogenní hladina ABA se u sledovaného souboru obilnin významně zvýšila jak při nízkých teplotách (+3/-3°C), tak při působení sucha. Míra navýšení rostla u sucha s dobou jeho působení. Nejvyšší množství ABA bylo zjištěno ve venkovních podmínkách s dlouhodobě sníženou zálivkou (30 % plného nasycení půdy vodou). V tomto pokusu se u pšenice vyskytovaly hodnoty ABA do 1100 ng/g čerstvé hmotnosti a u ječmene hodnoty ABA až 7127 ng/g čerstvé hmotnosti. V oblasti působení nízkých teplot hladina ABA stoupala se snižující se teplotou. Během chladové aklimatizace došlo po rychlém vysušení listů k mírnému nárůstu ABA z průměrné hodnoty 104 na 120 ng/g čerstvé hmotnosti. U rostlin pšenice v pokročilém stádiu vývoje (metání) byla po vystavení chladové teplotě +3°C po dobu 24 hodin průměrná hladina ABA 46 ng/g čerstvé hmotnosti. Ve všech uvedených pokusech nebyla zjištěna významná korelace mezi obsahem ABA v listech a odolností odrůd. Nebyl zjištěn ani statisticky významný rozdíl mezi obsahem ABA kontrolní a virem napadené varianty ječmene. Nebyla nalezena významná závislost mezi obsahem ABA a akumulací DHN5. Významné bylo zjištění o mechanismu pozvolnějšího čerpání vody z půdy u syrské odrůdy ječmene Tadmor oproti středoevropským odrůdám ječmene za sucha. Obsah ABA ne vždy koreloval s charakteristikami vodního režimu rostlin, což ukazuje na její významnou roli jako spouštěče obranných mechanismů než na jednoznačného ukazatele odolnosti genotypů. Klíčová slova: kyselina abscisová, nízká teplota, sucho, vodní charakteristiky

Abstract The main aim of the thesis lies in analysis of the content of abscisic acid (ABA) as a selection criterion for the evaluation of cereal cultivar tolerance to drought and cold. In 6

experiments eighteen wheat and ten barley cultivars have been exposed to various stress conditions. The changes in ABA content have been determined in leaf blades during short- as well as long-term drought treatments, cold acclimation and infection by Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) (after infection by aphids). Besides the ABA quantification, water statusrelated characteristics (water saturation deficit, osmotic potential, relative water content, soil water content) as well as changes in

13

C discrimination and dehydrin protein relative

accumulation have been determined. The endogenous ABA level has significantly risen in selected cereals during both cold (+3/-3°C) and drought treatments. During drought treatments, the content of ABA in leaf blades has significantly risen with the length of the treatment. The highest ABA levels have been found in samples grown in external environments with a long-term decreased water supply (30 % of full soil water saturation). In this experiment, the endogenous ABA levels reached 1100 ng/g fresh weight in wheat and 7127 ng/g fresh weight in barley. In cold experiments, the endogenous ABA levels have risen with a decreasing temperature. During cold acclimation process and next quick drying process, an initial ABA in plant leaf blades increased from 104 ng/g fresh weight to 120 ng/g fresh weight. However, in wheat plants during heading, an average endogenous ABA level was around 46 ng/g FW after a 24 h exposure to +3°C. There has not been observed any statistically significant correlation between the endogenous ABA content in leaf blades and the cultivar tolerance to cold, drought and BYDV infection in all wheat and barley cultivars, that have been studied. No statistically significant difference in endogenous ABA level has been found between control (non-infected) and BYDV-infected barley plants. The ABA content also has not displayed any strong correlation with water status-related characteristics. As well as the correlation between ABA and the protein relative content was not founded very strong. However, an important difference in water status related characteristics has been observed between a Syrian wild barley (Hordeum spontaneum) line Tadmor and barley (Hordeum vulgare) cultivars grown in the Central European region indicating different mechanisms of water uptake between barley genotypes of different geographical origin. Thus, a role of ABA can be proposed as an initial stress-inducible signaling compound during the early stress-responsive phase rather than a compound directly involved in the plant stress acclimation and the acquisition of plant stress tolerance. Key words: abscisic acid, cold, drought, water characteristics

7

Seznam zkratek ABA

– kyselina abscisová (abscisic acid)

ABA-GE

– glukózaester kyseliny abscisové (konjugát ABA, transportní a zásobní forma)

BYDV

– virus žluté zakrslosti ječmene (barely yellow dwarf virus)

čhm

– čerstvá hmotnost

DHN5

– dehydrin 5 (protein)

DLT

– test odstřižených listů zahrnující vysušení na 90 % původní hmotnosti a následnou inkubaci vzorku ve tmě (detached leaf test)

LT50

– letální teplota pro 50 % vzorků (letal temperature)

NCED

– 9-cis-epoxykarotenoid dioxygenáza (enzym)

PNP

– plné nasycení půdy vodou

RWC

– relativní obsah vody (relative water content)

vsd

– vodní sytostní deficit

8

1 Úvod Pěstování obilnin patří k základním zemědělským činnostem. Účelem je získání potravin a přidružených látek, produkce osiva. Cílem každého pěstitele obilnin je finanční zisk. Přirozenou a neoddiskutovatelnou součástí procesu vedoucího k zisku by měla být kvalita výsledného produktu i každého dílčího úkonu. Od výběru lokality, vhodného provedení agrotechnických opatření, poučeného výběru a nakládání s osivem až po sklizeň a následnou manipulaci s produktem. Při řešení otázky výnosu se dostaneme k problematice efektivity využití energie rostlinami. Nízké teploty a sucho patří mezi významné stresové faktory, se kterými se rostliny potýkají. Schéma obecné stresové reakce je uvedeno na obr. 2. Například energie je při nedostatku vody spotřebována na tvorbu nových, do hloubky rostoucích kořenů, je vynakládána na překonání nízkých teplot, na boj s patogeny. Podrobnější popis vlivu konkrétních stresorů na rostliny je součástí této práce. Všechny kulturní plodiny se vyvíjely zásahem člověka, tajemství jejich adaptability je až doposud spojeno s jejich původním rozšířením. Hlavním faktorem vývoje rostlin byl v minulosti selekční tlak prostředí. V průběhu historie došlo díky náhodě a cílenému výběru k pěstování určitých druhů rostlin. Cílený výběr a pěstování jsou považovány za základ domestikace, kterou následovalo účelné křížení. V současnosti probíhá rozvoj genových manipulací se změnami v konkrétních částech genů. Poznat samotnou strukturu genů nestačí, nutnou součástí je znalost transkriptů, metabolomů, mezi které patří i fytohormony. Předložená práce představuje sledování jednoho fragmentu z celkové mozaiky problematiky pěstování rostlinného materiálu odolného vůči podmínkám vnějšího prostředí. Současným trendem je hledání markeru, jak se ukazuje spíše souboru jednotek, které umožní rychlejší výběr rostlin s požadovanými vlastnostmi.

9

1.1 Cíle disertační práce Hlavním cílem předložené práce bylo studovat roli kyseliny abscisové (ABA) při odezvě na působení stresorů u pšenic a ječmenů. Základem všech pokusů byl předpoklad, že se hladina ABA v důsledku působení vnějších faktorů zvýší a že odolné rostlinné materiály jsou schopny syntetizovat více ABA než neodolné. Cílem bylo odlišit odolné a neodolné odrůdy vůči nízkým teplotám, suchu, vůči jejich kombinaci na základě změn endogenní hladiny ABA. Byly testovány hypotézy:
Hladina ABA je odlišná u rostlin vystavených nízké teplotě (druhá fáze aklimatizace s teplotním režimem +3/-3°C) oproti rostlinám pěstovaným při 16°C.
Hladina ABA je vyšší u rostlin vystavených suchu oproti hladině u rostlin, které byly pěstovány za optimální vlhkosti půdy.
Hladina ABA je vyšší u rostlin vystavených kombinaci faktorů nízká teplota a sucho oproti hladině u rostlin, které byly vystaveny buď suchu nebo jen nízké teplotě. Konkrétně řešené otázky jsou rozděleny do tří tematických okruhů. První část je zaměřena na dehydrataci pletiv v důsledku stresoru sucha a to krátkodobého, déletrvajícího i dlouhodobého. Dalším tematickým celkem je působení nízké teploty a to především v rámci aklimatizačního procesu a třetím je kombinace působení nízké teploty a sucha. Dalším cílem bylo zjistit konkrétní rozdíly mezi rostlinným materiálem pocházejícím z Evropy, kde se nepravidelně vyskytují suchá období a ze subtropických oblastí, kde dochází k pravidelnému výskytu sucha na konci vegetačního období. Byla řešena i otázka vlivu konkrétních biotických faktorů na hladinu ABA. Kyselina abscisová je řazena mezi fytohormony, což jsou látky s pleiotropním účinkem, proto bylo třeba zabývat se problematikou stresu a fytohormonu v širších souvislostech. V současné době dochází spolu s rozvojem technologií k velkému množství nových objevů a je snaha aplikovat tyto poznatky během krátké doby do praxe. Z toho důvodu je v práci zahrnut pohled na stresy na několika úrovních od molekulární až po praktickou. Součástí práce je i hodnocení vhodnosti typů pokusů pro sledování endogenního obsahu ABA. Účelem provedených pokusů bylo zhodnotit, jaký vliv má na hladinu ABA v listech obilnin působení dvou abiotických faktorů: sucha, nízké teploty a jejich kombinace. V případě působení biotického faktoru byl hodnocen vliv napadení virem BYDV a jeho přenašečem mšicí na hladinu ABA.

10

Byly realizovány následující pokusy: A. Vliv sucha na ječmen a pšenici 1. Krátkodobé sucho o rychlé vysoušení odstřiženého listu o ukončená zálivka v podmínkách klimatizované komory 2. Déletrvající sucho o ukončená zálivka v podmínkách skleníku 3. Dlouhodobé sucho o regulovaná zálivka ve venkovních podmínkách B. Vliv nízké teploty na pšenici 1. Nízká teplota o podmínky klimatizované komory - jařiny - ozimy C. Vliv nízké teploty a sucha na pšenici 1. podmínky klimatizované komory 2. podmínky skleníku D. Vliv působení mšic a viru BYDV na ječmen

11

2 Literární rešerše 2.1 Obilniny a prostředí Nejstaršími známými obilninami jsou, podle archeologických výzkumů, pšenice a ječmen. Plané formy pšenice dvouzrnky (T. dicoccoides Schweinf.) a ječmene byly nalezeny v lidských sídlech z doby 19. tis. let př.n.l. I dnes je pšenice spolu s rýží a kukuřicí jedním ze základních kamenů lidské výživy. Její předností je relativně snadná a levná agrotechnika, stabilní výnosy, vysoká nutriční hodnota. Hlavním důvodem rozšíření plodiny je adaptabilita a růst její spotřeby. Po mnoha proměnách je pšenice pěstována napříč širokým spektrem podmínek prostředí. Její adaptační schopnost je považována za nejširší mezi všemi druhy obilnin (Briggle a Curtis, 1987). Příčina je ukryta ve schopnosti pšenice tolerovat nízké teploty. Za chladovou toleranci rostlin označujeme jejich schopnost snést teploty nižší než +1 až +4ºC. Ty představují minimální teplotu pro růst. V obecném smyslu se chladová tolerance rostlin vztahuje k výkonu při teplotách nižších než je optimum pro růst rostlin (kolem 20ºC). Z tohoto pohledu je ječmen považován za chladuvzdornou obilninu, která je méně odolná než žito a pšenice a více odolná než oves (Fowler a Carles, 1979). Pro podrobnější sledování se teploty dělí na chladové a mrazové. Další související otázkou je problematika přezimování rostlin. Významné rozdíly ve schopnosti přezimovat jsou v rámci druhu patrné mezi odrůdami. Pochopitelná je snaha šlechtit na tuto vlastnost, avšak jedná se o vlastnost polygenně založenou, proto pouhou selekcí na ni se výrazně zhoršují jiné parametry, jako je například odolnost vůči patogenům či některé ukazatele vztahující se k zrnu (Horčička, 2008). Pšenice i ječmen se kdysi rozšířily z oblasti Blízkého východu, z prostoru tzv. úrodného půlměsíce, který se rozprostírá od přímořských oblastí Izraele přes velkou část Sýrie, jihovýchodní Turecko, přes horní toky Eufratu a Tigridu a vrací se přes Irán a Irák na jih. Podrobněji o tématice evolučních změn pšenice pojednávají Müller et al. (2005). V klimatických podmínkách ČR se obilniny setkávají s nejrůznějšími výkyvy počasí a tlakem patogenů, širokým rozpětím mikroklimatických specifik. Obecně nepříznivé vlivy vnějšího prostředí, které závažně ohrožují rostlinu, označujeme jako stresové faktory (stresory). Pojem stres zavedl do odborné terminologie rakouský endokrynolog Hans Selye na konferenci v Paříži v roce 1946. Jedná se o soubor obranných a nápravných (reparačních) mechanizmů, které jsou realizovány v důsledku působení stresoru. V obecnějším smyslu se dnes používá pojem stres jako příčina i důsledek, tedy jako označení působení stresoru. (např. působení stresu sucha). Faktory ohrožující optimální funkci živého organizmu jsou nedílnou součástí života rostlin. Na rostliny působí vnější vlivy biotické a abiotické. Biotické faktory

12

představují veškeré živé organizmy, tedy živočichové, rostliny, ale také mikroorganizmy, abiotické faktory zahrnují chemické a fyzikální vlivy neživé části přírody. Další členění uvádí např. Gloser a Prášil (1998). Otázkou, která je v posledních letech často uváděna v nejrůznějších diskusích, je změna klimatu na planetě Zemi. Podle odhadů zaměřených na budoucí klimatické podmínky mírného pásma lze očekávat zvýšení aridity klimatu ČR. Očekávány jsou výraznější výkyvy teplot a povětrnostních podmínek. Jednou z možností jak zajistit stabilní výnos je zpřesnění předpovědí teplotních a vláhových poměrů pro konkrétní lokalitu, konkrétní ročník. S rozvojem techniky a sběru dat jsou častěji kladeny otázky vztahující se k aktuálnímu vývoji počasí pro konkrétní lokality a dále pak ke klimatu. Jak uvádí Prášilová a Prášil (2003), a tento názor je poměrně rozšířen, jedním z projevů globálních změn klimatu je zvýšení teploty zemského povrchu. Příčinou klimatických změn spojovaných s oteplováním je zvýšený obsah energie ve spodní vrstvě atmosféry a urychlení atmosférické cirkulace. Výsledkem jsou zejména větší výkyvy a menší stabilita počasí. Daleko častěji se pak vyskytují extrémní povětrnostní situace, kterými jsou silné vichřice, bouře, záplavy, období sucha a veder, ale i mrazivých dnů. V průběhu 20. století můžeme, podle tohoto zdroje, jako studené zimy s výskytem podnormálních teplot označit nejméně 15 zim, tj., přibližně každou šestou až sedmou zimu. Poslední studená zima, která byla spojená se silným poškozením některých odrůd ozimů a neodolného šlechtitelského materiálu v odrůdových a maloparcelkových pokusech, se vyskytla v roce 1995/96. Jak ukázala zima 2002/03, nelze ani do budoucna nebezpečí vyzimování ozimů v našich polních podmínkách podceňovat. Otázkami změny klimatu se zabýval i Cílek (2010), který uvádí, že globální teplota je závislá nejen na koncentraci skleníkových plynů, ale minimálně stejnou měrou závisí na proudění oceánu, ve kterém bylo postupně rozeznáno pět zásadních oblastí či způsobů cirkulace. Podotýká, že hlavním hybatelem klimatu je Slunce, které mění polohu vůči Zemi, ale zároveň podléhá vlastním cyklům. Autor konstatuje, že teplotní výkyvy se jistě vyskytovat budou. A s tímto faktem je třeba pracovat. Budoucnost ukáže, která ze stran diskutujících o klimatu má pravdu, nicméně pokud budeme schopni reagovat na změny prostředí, které existenci Země provází v čase, budeme schopni se přizpůsobit. I když zatím v našich klimatických podmínkách nejsou extrémy tak značné, má smysl se takovými situacemi zabývat a do budoucna vytvořit systém testování rostlin, který umožní kvalitní výběr odrůd vhodných pro pěstování v České republice, přesněji pro konkrétní podmínky prostředí. Tato práce je zaměřena na problematiku sucha a nízkých teplot. 13

Pro redukci počtu rostlin, ale také pro vlastní produkční schopnost přezimujících rostlin, je kritickým obdobím zima a počátek jara, kdy se objevuje nebezpečí vyležení porostu, výskytu ledové vrstvy, vymokání, vytahování rostlin, působení zimního sucha aj. Také jarní odrůdy obilnin jsou vystaveny působení stresorů, pouze jejich působení nebývá pro rostliny v takové míře letální, jako je tomu u ozimů. Pro porosty ozimých obilnin je kritické období od zasetí do jarní regenerace. V této době jsou porosty oslabeny a může dojít k výraznému úhynu rostlin. Pro přezimování je nevhodný porost slabých rostlin, stejně tak jako porost z přerůstajících rostlin (neměla by být překročena III. etapa organogeneze vzrostlého vrcholu – viz obr. 1).

Obr. 1 Třetí etapa organogeneze vzrostlého vrcholu, SR- jednoduchý hrbolek, autorkou fotografie je Z. Nátrová

V prvním případě je třeba podpořit rostliny přihnojením a v druhém zpomalit růst pomocí regulátorů růstu. Rostliny by měly před nástupem zimy dobře zakořenit, částečně odnožit a vytvořit nízký trsovitý habitus. Během zimy již vnějším zásahem aktuální mrazuvzdornost rostlin nelze ovlivnit. Proto i když se podaří dobře připravit porost do nástupu zimy, není v moci pěstitele ovlivnit klimatické podmínky lokality tak, aby umožnily rostlinám projít nezbytným procesem otužení, bez kterého je úroveň mrazuvzdornosti velice nízká. Přesto má smysl péče, kterou pěstitel porostu věnuje, neboť posiluje schopnost regenerace obilnin, díky které dokážou rostliny překonat mnohé nepříznivé podmínky.

2.2 Působení stresorů Během předchozích evolučních etap se u rostlin objevily a upevnily různé ochranné mechanizmy. Příkladem jsou voskové povrchy, zdrsnění chloupky, ale ochranou funkci mají také pluchy, plušky a osiny aj. Další možnost využívají rostliny tím, že se vyhnou poškození načasováním procesu. U generativních orgánů je například realizováno pozdním kvetením.

14

Na základě četných pozorování bylo vytvořeno přibližné schéma stresové reakce (viz obr. 2). Jedná se o dynamickou reakci, která probíhá v několika fázích. V každém jednotlivém případě hraje důležitou roli intenzita a doba působení nepříznivého faktoru. Krátkodobé vystavení stresu, které nepřekračuje meze tolerance, způsobí v rostlině dočasné změny fyziologických procesů. U poškozených rostlin proběhne regenerace a nárůst sušiny se vrátí na předchozí úroveň. Avšak při chronickém stresu je růstová křivka dlouhodobě snížena a produkční ztráty jsou proto větší. Z pozice rostliny je využívána možnost vyhnout se situaci (separace), přizpůsobit se situaci (adaptace), případně obnovit poškozené struktury (reparace). Pokud uvedené mechanizmy nefungují, může dojít k nevratným poškozením až smrti organizmu. Zajímavé je zjištění, že u rostlin je jedním z adaptačních mechanizmů, který se vyskytuje v souvislosti se stresem, aklimatizace. fáze poplachu

fáze rezistenční

fáze vyčerpání maximum přizpůsobení

odolnost

restituce

stresová reakce e

reakce

zdravý stres

stres

rezistence

minimum rezistence chronické poškození

akutní poškození doba působení stresoru

Obr. 2 Schéma průběhu stresové reakce, upraveno podle (Larcher, 2003)

Aklimatizace je definována jako přechodné zvýšení odolnosti získané pod vlivem stresoru. Příkladem je chladová aklimatizace (otužování) - vystavení rostlin nízké teplotě, která ještě nevede k poškození pletiv. Naproti tomu fáze poplachu - prudká změna podmínek potřebných pro normální průběh životních funkcí je následována destabilizací na úrovni proteinů, membrán, buněk a funkčně biochemických procesů, energetického metabolismu. V případě příliš silné nebo příliš rychlé změny dojde, dříve než mohla být využita ochranná opatření, k akutnímu zhroucení buněčné integrity. Tato fáze začíná v okamžiku stresové reakce, kdy katabolismus převažuje nad anabolismem. Pokud zůstává intenzita podnětu nezměněna, rychle nastává další fáze nazvaná restituce. Zahrnuje opravné procesy ve smyslu syntézy proteinů nebo v této fázi jsou de novo syntetizovány ochranné látky. Tento proces 15

následuje fáze, která je označena jako odolnost (rezistenční), kdy při pokračujícím stresu narůstá odolnost. Díky výslednému zlepšení stability se může organizmus, navzdory trvajícímu působení stresu, vrátit do normálního stavu (jedná se o přizpůsobení organizmu). Tímto způsobem může být získána vyšší odolnost, která může trvat ještě nějakou dobu. Působí-li stres příliš dlouho a narůstá-li intenzita stresu, může během konečné fáze nastat stav vyčerpání organizmu. Pokud byla změna pouze dočasná, budou funkce organizmu uvedeny na původní hladinu. Pokud byl organizmus poškozen, mohou být v regenerační fázi poškozené části opraveny. Geneticky mají různé rostlinné druhy reakční normu nastavenou odlišně (Larcher, 2003).

2.3 Nízká teplota Nízké teploty patří mezi jedny z nejzávažnějších problémů zemědělské produkce. V oblasti nízkých teplot se vyskytují dva typy stresů. Jedním je chladový stres (chilling stress) a druhým je mrazový stres (freezing stress). Chladový stres představuje působení teplot nižších než 10-15°C, zatímco mrazový stres je označován při teplotách nižších než 0°C, kdy se tvoří led. Rostliny odolné chladu mohou být dále děleny do dvou skupin podle toho, zda jsou schopny vytvořit mrazovou toleranci během vystavení chladovým teplotám nebo ne (chladuvzdorné x citlivé na chlad). V polních podmínkách se vyskytují dva typy mrazu. Jedním je radiační mrznutí (listy aktivně rostoucích rostlin ztrácejí v noci teplo radiací, takové listy mohou být ochlazeny na teplotu podstatně nižší než je teplota okolního vzduchu). Druhým typem je advektivní mráz. Ten je způsoben přitékáním studeného vzduchu a teplota listu pak poklesne na obdobnou okolnímu vzduchu. Mrazové teploty se nejčastěji vyskytují v rozmezí -1 až -3°C, méně často jsou nižší než -5°C (Chen, 1994). Jevy vztahující se k reakci rostlin na nízké teploty jsou od pradávna člověkem poměrně bedlivě sledovány. Obecně existují určité rozdíly v rychlosti růstu rostlin při nízkých teplotách a v důsledku toho v jejich adaptaci k chladu. Rozdíly v odolnosti k mrazovým teplotám jsou i mezi jednotlivými částmi rostlin. Kupříkladu neotužené listy mohou tolerovat -4 až -8ºC (Gusta a Chen, 1987), ale reprodukční pletiva vyvíjejícího se ouška jsou podstatně méně odolná k mrazu a mohou být poškozena při teplotě -1,8ºC (Single a Marcellos, 1974). Na druhou stranu si rostlina důležitá pletiva chrání. Dále viz kapitola 2.3.1 Mráz a rostlinná pletiva. Odolnost vůči nízkým teplotám je znak kódovaný mnoha geny. Na toleranci k mrazu se také odkazuje širší pojem zimovzdornost jako vlastnost ozimů, která je zodpovědná za rozdíly ve vyzimování nebo přezimování (obecná vlastnost rostlin schopných přežít zimní období,

16

hodnotící stav porostu). Vyzimování definuje Blum (1988) jako konkrétní konečnou celistvou odezvu na velké množství stresů způsobujících poškození během a po stresu mrazem, zahrnuje oboje vnější – fyzikální a biotické stresy. Souhrnem se pod pojem zimovzdornost vztahuje schopnost rostlin vyrovnat se s jevy jako je zaplavení, vytahování rostlin, vznik ledové vrstvy, či působení sněhové pokrývky. Teploty pod bodem mrazu se na území ČR vyskytují od listopadu do dubna (ČHMÚ, 2007). Méně často se mrazové teploty vyskytují během pozdních mrazíků na jaře, kdy způsobují poškození listů nebo vrcholů. V každém případě, i když nejsou rostliny usmrceny mrazem, mohou být ovlivněny mrazovými teplotami, dojde k poškození listů, tedy k redukci listové plochy, důsledkem je zpožděný růst a oslabení rostlin.

sněhová pokrývka

holomráz -9,5°C

teplota vzduchu 2 m nad zemí teplota na povrchu sněhové pokrývky vysoké 16,5 cm

-13,6°C

-18,9°C

přízemní minimální teplota -9,9°C

teplota na povrchu půdy

-9,2°C -5,2°C

-2,5°C

teplota v hloubce 3cm

0,1°C

-3,4°C

teplota v hloubce 5cm

-0,4°C

teplota v hloubce 10 cm

0,6°C 0,8°C

1,3°C

teplota v hloubce 20 cm

1,5°C

4,3°C

teplota v hloubce 50 cm

3,3°C

Obr. 3 Situace popisující rozvrstvení teplot za mrazu, podle P. Prášilové

Poškození ledovou vrstvou se vysvětluje toxickým hromaděním CO2 s etanolem jako produktů anaerobního dýchání. Izolační schopnost ledu je velice nízká. Tepelná vodivost ledu je čtyřikrát větší než vody a stokrát větší než vzduchu. Vzhledem k těmto fyzikálním vlastnostem ledu je kromě vlastního zhoubného působení ledové vrstvy v přirozených podmínkách spojen její vliv s přímým poškozením rostlin mrazem (Prášil a Zámečník, 1987).

17

Bezprostřední příčinou odumírání buněk může být jednak silná dehydratace buněčného obsahu, jednak mechanické poškození buněk rostlinných pletiv. V podzimním období může docházet k dalším poškozením porostů. Při zaplavení rostlin vodou v důsledku déletrvajících dešťů a nedostatečném vsakování vody do ornice se hovoří o vymokání. Nebezpečí přímého poškození rostlin pak závisí na době trvání, spolupůsobící teplotě a osvětlení. Vzcházející nebo slabě vyvinuté rostliny jsou citlivější na vymokání než rostliny vzrostlé. Mezi nejcitlivější obilniny patří podle druhových rozdílů žito. Často je při výskytu podzimního přemokření půdy nejdříve omezen růst, pak odumírají spodní listy a pak celé rostliny. Při teplotách blízko bodu mrazu, kdy se růstové procesy vlivem přemokření omezují, se tyto projevy oproti vyšším teplotám zpomalují. Současně se zaplavené rostliny hůře otužují a v zimě trpí mrazem. U více odolných odrůd dochází k menší depresi odolnosti vůči mrazu než u méně odolných odrůd. Také během zimy mohou být rostliny zaplaveny vodou z tajícího sněhu i ledu po oblevě, zvláště při zamrzlé horní vrstvě ornice. Častější je zaplavení rostlin na jaře z tajícího sněhu, kdy voda zůstane stát na poli. Jarní zaplavení porostů ještě mimo přímého účinku může znásobit dřívější poškození rostlin mrazem. Po zaplavení žloutnou listy (tzv. fyziologické žloutnutí), ztrácí se turgor a během několika dnů rostliny odumírají. Po zaplavení také dochází k odumření části kořenového systému a dodatečnému napadení patogeny. Stupeň poškození rostlin závisí na době působení přebytku vláhy (Prášil a Zámečník, 1987). Fowler a Greer vypracovali také ve spolupráci s VÚRV, v.v.i. v Praze model, který umožňuje pěstitelům po zadání konkrétních dat odhadnout stav porostu po zimě. Model je zatím funkční pouze pro podmínky oblasti Saskatoon a je dostupný na adrese: http://www.usask.ca/agriculture/plantsci/winter_cereals/index.php. Pokud mají pěstitelé zájem, mohou získat informace ze zkoušení odrůd ve VÚRV, v.v.i. nebo v ÚKZÚZ, případně se s dotazy obrátit na majitele odrůd. Literatura týkající se jednotlivých faktorů je v současnosti také dostupná. Podle mojí zkušenosti lze v česky psané literatuře nalézt k tématu obdobné informace, srovnatelné kvality, jako v pracích zahraničních autorů. Pěstitelé tak mají možnost rozhodnout se pro odrůdu, která nejlépe vyhovuje konkrétním přírodním podmínkám. Je otázkou, zda se vyplatí vybrat výnosnější, ale méně zimovzdornou odrůdu. Je vhodné brát v potaz např. původ odrůdy a podle možnosti pracovat se širší odrůdovou skladbou. V současné době se začínají objevovat nové možnosti díky nejmodernějším technologiím, které naznačují snahu o načasované zapnutí konkrétních genů pro konkrétní podmínky prostředí. 18

2.3.1 Mráz a rostlinná pletiva Led se formuje nejdříve v těch částech rostlin, které se nejrychleji ochlazují a nejsnáze mrznou. Jsou to části obsahující vodu v mezibuněčných prostorách. V procesech formování krystalů ledu v rostlinných pletivech mohou hrát roli bakterie rodů Erwinia a Pseudomonas. A to díky uspořádání molekul vody, které se drží povrchových proteinů bakterie. Fungují jako krystalizační jádra pro led. K mrznutí dochází lehce pod bodem mrazu. Formování ledu se šíří rychle přes cévní svazky a homogenní pletiva, ale postup je blokován např. prostorami vyplněnými vzduchem a pletivy s hustě lignifikovanými nebo kutinem zpevněným buněčnými stěnami. Často se při působení mrazových teplot formuje led nejprve v mezibuněčných prostorách a pak mezi buněčnou stěnou a protoplastem. Snižuje se vodní potenciál, což vede ke ztrátám vody z buněk vlivem osmózy. Tato dehydratace je hlavním prvkem stresu způsobeného mrazem (Browse a Xin, 2001). Bezprostřední příčinou odumírání rostlinných buněk pak může být jednak silná dehydratace buněčného obsahu, jednak mechanické poškození buněk rostlinných pletiv narůstajícími krystalky ledu. Pohyb vody a proces mrznutí pokračují, dokud není dosaženo termodynamické rovnováhy mezi ledovou vrstvou a buněčnou šťávou. Termodynamická rovnováha závisí na teplotě: při teplotě -5ºC je zhruba -6 MPa, při teplotě 12ºC je zhruba -12 MPa. Proto mají na protoplazmu mrazové teploty stejný efekt jako desikace. Při chladovém stresu a dehydrataci protoplazmy dochází ve zbývajících nezmrzlých částech k abnormálnímu nárůstu koncentrací iontů a organických kyselin. Projevuje se jejich toxicita a dochází k inaktivaci enzymů. Za takových podmínek jsou membrány přetíženy osmoticky a sílou smrštění, jejich lipidy jsou poškozeny, proteiny disociují a klesá aktivita ATPasy. Na konci je vytaženo z buňky tolik vody, že při určité hladině dehydratace (ta je dána podílem přechodu tekuté do pevné fáze) je jemná struktura protoplazmy nevratně zničena. Bod tuhnutí je snižován v závislosti na koncentraci roztoků, a proto mrzne buněčná šťáva při teplotě mezi -1 až -5ºC. Takovéto snížení bodu tuhnutí je jen mírnou, avšak spolehlivou ochranou pro rostliny. Navíc mohou být buněčné roztoky podchlazeny (angl. supercooled), což znamená, že mohou být okamžitě ochlazeny na teplotu nižší než je bod tuhnutí aniž by zmrzly (Larcher, 2003). Poškození rostlin mrazem je obvykle spojeno s tvorbou ledu a s mrazovou dehydratací buněk (viz. výše). Led vytvořený uvnitř buněk způsobuje téměř vždy neobnovitelné poškození mnoha struktur a rychlé odumírání. Tento typ mrznutí se však vyskytuje jen výjimečně u neodolných rostlin či při velmi rychlém poklesu teploty. Voda přítomná

19

v rostlinách začíná mrznout v závislosti na obsahu osmotik. Avšak ani při teplotách nižších, než je očekávaný bod tuhnutí, nemusí ještě nutně dojít k tvorbě ledu. Pokud nejsou přítomna vhodná krystalizační jádra, voda zůstává v tekutém, podchlazeném (metastabilním) stavu, a to v krajním případě až do teploty -38°C, kdy už dochází ke spontánní (homogenní) krystalizaci. K iniciaci krystalizace podchlazené vody v apoplastu mohou přispívat i některé bakterie žijící na povrchu rostlinných orgánů. Při delší době trvání mrazu se krystalky ledu postupně rozrůstají.

2.3.2 Mrazuvzdornost V přírodních podmínkách dochází k poklesu teplot pod bodem mrazu rychlostí maximálně 1-2ºC za hodinu (Gloser a Prášil, 1998). Důležitou podmínkou k získání odolnosti rostlin vůči mrazu je dostatek asimilátů spolu s utlumením všech buněčných funkcí a dehydratací pletiv. Dehydratace musí probíhat pomalu. Mrazuvzdornosti nelze dosáhnout náhlým poklesem teploty ani ji nelze trvale udržovat jako konstituční znak. Odolnost vůči mrazu má z těchto důvodů velmi sezónní charakter. Mrazuvzdornost rostlin v daném okamžiku, tzv. aktuální mrazuvzdornost, je ovlivněna průběhem teplotních a povětrnostních podmínek, dosaženými růstovými a vývojovými fázemi, půdními a dalšími vlivy. Úroveň mrazuvzdornosti se liší i u jednotlivých částí rostlin. U obilnin jsou méně mrazuvzdorné kořeny oproti listům a odnožovacím uzlům. Proces, který umožňuje mnohým rostlinám přizpůsobit se nízkým či mrazovým teplotám, se nazývá chladová aklimatizace. Biologicky se jedná o komplex metabolických a morfologických změn. Aklimatizační změny zahrnují zvýšenou expresi mnoha genů, dojde ke zpomalení až zastavení růstu, tvorbě stresových proteinů, přechodnému zvýšení koncentrace kyseliny abscisové, změnám ve složení lipidové vrstvy membrán, hromadění osmoticky aktivních látek jako jsou prolin, betain a rozpustné cukry a zvýší se hladina antioxidantů (Browse a Xin, 2001). Aklimatizací pak rozumíme proces, který je vyvolán především teplotami nižšími než 10ºC, avšak stále nad bodem mrazu. Aklimatizační proces nastupuje vlivem nízkých teplot doplněných krátkou fotoperiodou. Bylo vysledováno, že v určitých případech tento proces indukují oba faktory nezávisle na sobě (Welling et al., 2002). Při kombinaci obou uvedených faktorů může dojít, vzhledem k indukované mrazuvzdornosti, k aditivnímu efektu (Li et al., 2005). Plné rozvinutí aklimatizačního procesu trvá dny až týdny. Aklimatizace postupuje v závislosti na rostlinném druhu v 1, 2 nebo 3 fázích. Během první fáze rostliny dosáhnou tolerance ke krátce trvajícím mrazům od -5ºC do -9ºC. Tento typ aklimatizace vykazují jednoleté rostliny jako petúnie, řepka, oves. Druhá fáze závisí na

20

teplotách blížících se k 0ºC. Během této fáze jsou produkovány kryoprotektivní látky, jako jsou proteiny a cukry. Sem patří ozimy. Některé velmi odolné druhy pak dokážou v extrémních případech přežít i mrazem indukovanou desikaci. Třetí fáze se může vyskytovat u některých rostlin při teplotách pod 0ºC, má za následek další nárůst mrazuvzdornosti. Navzdory velkému množství prací publikovaných na téma aklimatizace, není stále zcela jasné, jak rostliny vnímají signál z vnějšího prostředí, který vede k rozvinutí mrazuvzdornosti. Také není známo, zda každá z fází aklimatizace vyžaduje vlastní iniciační podněty nebo zda následující fáze je iniciována tou předchozí. Pravděpodobně bude v budoucnu nalezena vedle několika hlavních přepínacích genů také skupina dalších určujících genů pro regulaci nárůstu mrazuvzdornosti. Některé důkazy uvádějí, že podněty nízkých teplot může zastoupit kyselina abscisová (ABA) (Chen a Gusta, 1983), podle jiných zdrojů má ABA minimální nebo nemá žádný vliv na vývoj mrazuvzdornosti (Yu a Griffith, 2001). Také není známo, zda může být ABA zapojena do všech tří fází aklimatizace nebo zda se uplatňuje hlavně v první fázi. Klasická a molekulární genetika může odhalit ve spolupráci se sledováním genové exprese funkci ABA v uvedeném systému. Velká část výzkumů vlivu nízkých teplot byla provedena na modelové rostlině Arabidopsis thaliana, která má omezený potenciál odolnosti k chladu. Proto se zřejmě tato rostlina nehodí pro sledování druhé a třetí fáze aklimatizace. Proces je dále komplikován, protože mnohé faktory jako je poranění, poškození světlem a chladem může vyvolat toleranci k teplotám 3-5ºC, která nemusí zapojit stejné geny jako při chladové aklimatizaci, jež je realizována při teplotách blízkých bodu mrazu.

Obr. 4 Čtvrtá etapa organogeneze vzrostlého vrcholu, vyfotografovala Z. Nátrová

21

Aktuální mrazuvzdornost má vzhledem k ohrožení generativní fáze význam především v případě, že dojde k přerůstání porostů ozimů v důsledku časného setí v podmínkách teplého a vlhkého podzimu. U intenzivně rostoucích porostů je pro zvýšení jistoty přezimování vhodné aplikovat regulátory růstu. Ohledně přerůstání působí nevhodně i na podzim aplikovaná nadbytečná dávka dusíku. V nebezpečí se ocitají rostliny, jejichž hlavní stébla popř. první odnož dosáhly IV. etapy organogeneze vzrostlého vrcholu (viz. obr. 4). Ta představuje přechod do generativní fáze, kdy u rostlin dochází k poklesu aktuální mrazuvzdornosti. Přitom odumře jen příslušné stéblo, kdežto ostatní stébla přezimují. Nadzemní biomasa žloutne a většinou odumírá, toto je provázeno výskytem patogenů. Žloutnutí se může vyskytnout mimo jiné v důsledku rychlé změny teplot ve dne a v noci, jako následek nedostatku vzduchu v půdě – zamokření, ale také v důsledku nižšího příjmu vápníku v podzimních měsících a zejména v předjaří. V takové situaci dojde k silnému oslabení porostů a působením dalších nepříznivých faktorů i k úhynu rostlin (Petr et al., 1987). Chladová aklimatizace může být navozena i v laboratorních podmínkách a to vystavením rostlin nízkým teplotám v rozmezí 2-6°C při mírném osvětlení. Biologicky se jedná o komplex metabolických a morfologických změn. Změny, které se při nízkých teplotách dějí v rostlinných pletivech lze zaznamenat pomocí metod DTA (differential thermal analysis), IRVT (infrared video thermography), NMR (nuclear magnetic resonance), LTSEM (lowtemperature scanning electron microscopy) (Pearce, 2001).

2.3.3 Testování mrazuvzdornosti Mrazuvzdornost je testována metodami, které se mohou rozdělit na přímé a nepřímé (Prášil et al., 1989). Nepřímé využívají korelaci mezi znaky jako je obsah aminokyseliny prolinu, obsah fytohormonů, vodivost pletiv, obsah sušiny v částech rostliny, rychlost růstu aj. a úrovní mrazuvzdornosti. Rostliny pěstované pro nepřímou analýzu nejsou vystaveny mrazu, bývají pouze otuženy, tedy vystaveny teplotám blízkým nule. Další možností je analýza využívající molekulárních markerů, kdy jsou analyzovány rostliny v kterékoliv vývojové fázi a tedy nemusí projít otužením. U přímých metod se hodnotí míra poškození rostlin vzniklého jako následek působení mrazu. Podle prostředí, ve kterém testování na mrazuvzdornost probíhá, je lze dělit na testy polní, polně laboratorní a laboratorní. Polní testy vykazují největší variabilitu a proto je třeba víceleté opakování. Příkladem takové metody je provokační bedýnková metoda, která je prováděna ve VÚRV v Praze Ruzyni již od 50.let, kdy s ní začínal Segeťa (1957). Tato metoda má mnoho modifikací, např.

22

lze navodit vyšší zálivkou přemokření anebo se umístěním stříšek omezí přísun vláhy. Nevýhodou polních testů je, že vypovídací hodnota polních zkoušek závisí silně na konkrétním ročníku (Prášil et al., 1989). Prášilová a Prášil (2001) aplikovali bedýnkovou metodu s devítibodovou stupnicí při stanovení potenciálu přezimování u 820 ozimých pšenic s různým geografickým původem. Význam ročníku nesnižuje ani fakt, že jsou záměrně vybírány lokality s dlouhodobým výskytem stresoru a proto i nadále přetrvává snaha testovat vlastnosti rostlin v laboratorních podmínkách. Při polně-laboratorních testech jsou v zimním období odebírány rostliny z pole a následně testovány. Zjišťuje se tak i životaschopnost a regenerační schopnost ozimů. Pokud jsou rostliny odebírány v průběhu zimy, mohou být následně v mrazicích boxech vystaveny nízkým teplotám v rozmezí od -5 do -25°C. Pomocí těchto testů lze stanovit aktuální mrazuvzdornost, navíc je takové hodnocení poměrně spolehlivé (Prášil et al., 1989). Třetí skupinou jsou laboratorní testy, které mohou být realizovány bez ohledu na roční období, protože celé probíhají v regulovaných podmínkách. Opakovatelnost testů je nejlepší z výše uvedených. Jejich nevýhodou jsou vysoké náklady a prostor pro menší počet vzorků (Prášil et al., 2004). Jednotlivé druhy obilnin se výrazně liší ve schopnosti přežití v mrazových podmínkách. Nejodolnější odrůdy žita uhynou při teplotách kolem -34°C, odrůdy pšenice zhruba při teplotě -23°C a pro ječmen je letální teplota cca -18°C (Sãulescu a Braun, 2001).

2.4 Sucho Sucho

patří

k abiotickým

faktorům,

které

zřejmě

nejvíce

ovlivňovaly

život

suchozemských rostlin. Přechod rostlin na souš a přizpůsobení se suchému životnímu prostředí byly obrovským evolučním krokem. Vývoj rostlin pokračuje i dnes. Slovo sucho zná každý člověk, ale definovat jej s obecnou platností se dosud nepodařilo. Vždy záleží na konkrétní situaci, vzhledem ke které pojem sucho používáme. V případě této práce je vztaženo ke světu rostlin. Zde může být proto použito ve smyslu záporné vodní bilance rostlin (Zieglerová et al., 2002). Nároky rostliny na množství vody jsou značné. Při produkci 1 g sušiny vytranspiruje rostlina 250 až 1000 g vody. Vzdušná a půdní vlhkost reguluje všechny fyziologické funkce vegetační pokrývky: intenzitu výparu vody z povrchu porostů, fotosyntézu, růst, dýchání, příjem živin atd. (Pospíšilová et al., 1989). Hospodaření živých organizmů s vodou je základním článkem pro udržení homeostaze, tedy k jejich přežití. Voda tvoří 80 až 90 % čerstvé hmotnosti rostlinného pletiva, je základní složkou živé buňky. Tvoří prostředí pro

23

metabolické procesy, transportuje asimiláty, přímo se účastní fotosyntézy, zároveň je i součástí buněčné struktury, a proto podmiňuje životaschopnost buňky. Voda má význam pro pevnost rostlinného pletiva, např. pro udržení tvaru a postavení listů. Rostlina přijímá formou vodných roztoků minerální soli, plyny. V rostlině není voda ve stacionárním stavu, tzn. že každá buňka více méně přijímá i vydává vodu. Všemi rostlinnými buňkami tedy protéká proud vody. Voda je přijímána kořenovým systémem, transportována rostlinou a vydávána z nadzemních částí ve formě páry do vzduchu. Před vysycháním je povrch rostliny chráněn málo propustnou kutikulou a rychlost transpirace, která závisí na epidermální vodivosti, je regulována otevřeností průduchů. Podle poměru mezi rychlostí absorpce vody a transpirace dochází k dosycování pletiv vodou nebo naopak ke vzniku vodního deficitu. Tzv. přechodný vodní deficit vznikající během dne umožňuje vytvoření gradientu vodního potenciálu mezi půdou a vypařujícím povrchem rostliny, který je nutný pro překonání existujících transportních odporů, a tak je zajištěn transport vody odpovídající rychlosti transpirace. Nedostatek vody souhrnně velmi výrazně ovlivňuje produktivitu porostu. Především zpomaluje růst rostlin, protože dělení buněk je možné jen při jejich dostatečném nasycení vodou. Na zásobení vodou ještě více závisí fáze prodlužovací, neboť dlouživý růst se děje na účet vody přibrané do buňky. Zásoba zimní půdní vláhy a rychlost přijímání této vláhy semenem má pro vzcházení jarních obilnin rozhodující význam. Její dostupnost pro obilky a další zabezpečení vláhy pro růst klíčku určuje spolu s teplotou a vzdušným režimem půdy délku období setí – vzcházení. Čím je toto období delší, tím horší je vzcházivost a vyrovnanost vzcházení. Za podmínek normální teploty a vláhy, kdy by vzduch měl být obsažen optimálně asi v 10 % půdních pórů, trvá vzcházení obilnin 7-9 dní (ozimů vzejde přibližně 75-85 % klíčivých obilek, jařin 80-90 % klíčivých obilek) (Petr et al., 1987). Stejně tak jako nadbytek, působí negativně i nedostatek vláhy. Často je pojem sucho spojován s jarním či letním obdobím, ale problémem je i zimní sucho. Zimní sucho má vliv hlavně ke konci zimy, kdy bývá půda zmrzlá bez sněhové pokrývky a denní teploty vystupují nad nulu. To působí na rostliny tak, že dojde k porušení vodní bilance rostlin až dehydrataci pletiv, hlavně nadzemních částí rostlin, v důsledku toho k zaschnutí a odumření pletiv. Disproporce v příjmu a výdeji vzniká tím, že při poklesu teplot pod 0°C kořeny přijímají pouze minimální množství vody a se zamrznutím půdy se tento proces téměř přeruší. Přitom z nadzemních částí se voda ztrácí i za nejsilnějších mrazů (mrazová desikace). Transpirace z nadzemních orgánů je zesílena nízkou relativní vlhkostí, přímým slunečním zářením a větrem. Poškození rostlin následkem dehydratace nastává až při poměrně vysokých hodnotách vodního sytostního deficitu (60-90 %). Škodlivý účinek sucha je zesilován větrnou 24

erozí, kdy je vrchní vrstva jemnozemě odváta a jsou obnaženy odnožovací uzle a kořeny (Prášil a Zámečník, 1987). Citlivost rostlin vůči vodnímu stresu závisí na síle stresu a délce trvání, stejně tak jako na vývojové fázi rostliny. Protože se sucho vyskytuje v našich podmínkách nepravidelně, bývají pro testování vlivu sucha na rostliny pěstební podmínky upraveny například instalací mobilní stěny proti dešti, různým složením půdy. Upravené pěstební podmínky použili například Bahrun et al. (2002), Asch et al. (2009).

2.4.1 Průduchy Při nedostatku vody dochází ke snížení rychlosti fotosyntézy, které je způsobeno jednak poklesem aktivity chloroplastů, jednak zpomalením příjmu CO2 uzavíráním průduchů. Sucho je velmi běžný stresor, kdy je omezení vody nejčastěji kombinováno s vysokými teplotami a vysokými intenzitami světla. Fotosyntéza a fotosyntetická kapacita jsou při suchu výrazně sníženy, primárně z důvodu uzavření průduchů v důsledku sucha, čímž je snížena dostupnost CO2 v chloroplastech. Rostliny využívají menší množství světelné energie pro fotosyntézu ve srovnání s rostlinami pěstovanými v podmínkách dobrého zalití. Takový stav může zvýšit vnímavost suchých rostlin k fotoinhibici. Hustota průduchů je druhově specifická, ale v menším měřítku může kolísat i u jednoho rostlinného druhu podle podmínek prostředí, ve kterém rostlina roste. Průduchy mají rostlině umožňovat chod fotosyntézy a udržet příznivou vodní bilanci. Průduchy se otevírají po rozednění, kdy je dostatek světla pro fotosyntézu, po západu slunce se zavírají. Otevírání trvá déle (30-90 min.), zavírání je obvykle kratší. Světlo působí přímo na svěrací buňky. Účinné je jen modré záření, receptor pro ně je obsažen přímo ve svěracích buňkách průduchů. Regulují obsah CO2 v listu. Další funkcí je ochrana proti nadměrné ztrátě vody, kdy díky peristomatální transpiraci a čidlům, která obsahují, reagují přímo na vlhkost vzduchu. Dalším mechanizmem jak zabránit ztrátám vody je zpětnovazebné zavírání průduchů, které je důsledkem nadměrné ztráty vody a snížení vodního potenciálu mezofylu. Společné pro posledně dva jmenované vlivy, možná i pro ostatní impulzy z vnějšího prostředí, je zprostředkování efektu na svěrací buňky fytohormonem kyselinou abscisovou (ABA). K její syntéze a hromadění dochází patrně v cytoplazmě a k hromadění v chloroplastech. Při působení stresových impulzů z vnějšího prostředí se ABA uvolní do apoplastu a transpiračním proudem se dostane do blízkosti svěracích buněk. Pokusy, při kterých byl rozdělen kořenový systém rostliny do dvou nádob, z nichž jedna obsahovala koncentrovanější osmotikum a druhá normální živný roztok, ukázaly, že i při neměnném vodním potenciálu

25

listu a při konstantních podmínkách vnějšího prostředí docházelo k zavírání průduchů. Míra uzavření závisela na koncentraci osmotika. Z tohoto vznikla dnes již ověřená hypotéza, že k syntéze ABA dochází i v kořenech rostliny. Při krátkodobém období půdního sucha je tak rostlina včas a účinně ochráněna před nadměrnou ztrátou vody: ABA je rychle transportována do listů a ke svěracím buňkám a způsobí zavření průduchů ještě před snížením vodního potenciálu listů. Průduchy reagují na vnější podnět individuálně i ve skupinách. Skupiny bývají ostře odděleny – mozaikovitá struktura otevřenosti průduchů (Šantrůček, 1998). Jedním z prvních efektů sucha (vadnutí) je nárůst obsahu růstových inhibitorů (ABA a etylenu), zároveň se sníží obsah cytokininů, giberelinů a auxinů. Efekt vadnutí na koncentraci ABA je prudký a výrazný. Koncentrace ABA vzrůstá díky syntéze a ne jen uvolněním z uložených prekurzorů. Obě formy (volná i vázaná) rostou zároveň. Vláhové podmínky půdy ovlivňují uzavírání průduchů odděleně od ABA uvolněné z buněk listového mezofylu. Toto naznačuje, že ABA produkovaná v kořenech může být transportována do listů jako posel pro stomata (Iqbal a Bano, 2010). Rostlina ztrácí vodu přes průduchy, proto sledoval Zhang et al. (2009) vztah mezi citlivostí rostlin Arabidopsis thaliana na ABA a vliv na chování průduchů, jejich uzavírání. V tomto případě je výrazný časový rozměr pokusů. Vlivem vodního deficitu klesá rychlost i dalších syntetických pochodů a většinou stoupá rychlost rozkladných pochodů. To vše může vést k poškození rostliny, případně až k jejímu uhynutí (Pospíšilová et al., 1989).

2.5 Kyselina abscisová

Kyselina abscisová, též (+)- abscisinII nebo (+)- dormin. Poprvé byla tato látka izolována Ohkumou, Lyonem, Addiccottem a Smithem v roce 1963 jako látka urychlující opad plodů bavlníku. V téže době byla izolována z pupenů opadaných stromů (javorů) jako látka navozující dormanci Wareingem a Cornforthem (Procházka a Šebánek, 1997). Relativně vysoká množství ABA jsou přítomna v plodech, semenech, odpočívajících pupenech, hlízách a cibulích, ve stárnoucích a žloutnoucích listech (Kutina, 1988). Jedná se o sloučeninu řazenou mezi fytohormony, neboli endogenní růstové regulátory, které jsou účinné ve velmi nízkých koncentracích. Každý z fytohormonů ovlivňuje několik často odlišných procesů a

26

naopak, týž proces bývá ovlivněn větším počtem různých látek. Fytohormony jsou účinné pouze ve vazbě s receptorem, látkou bílkovinné povahy (Macháčková, 1998). Důležitý je i vztah mezi ABA a dalšími látkami v rostlině, proto jsou připravovány experimenty, které mají například zjistit, zda kyselina salycilová modifikuje reakci rostliny na stres zasolení ve smyslu změny vodního deficitu v rostlině, kdy je stav popisován mimo jiné i obsahem ABA (Szepesi et al., 2009). Kyselina abscisová (ABA) má své pevné místo v procesech, které umožňují rostlinám přizpůsobit se podmínkám prostředí. ABA je jedním z mnoha seskviterpenoidů přítomných v rostlinách, které jsou jako skupina odvozeny z kyseliny mevalonové. K přeměně přes izoprenoidy dochází většinou v cytosolu listů (Gupta, 2005). Význam ABA se mění během životních fází rostlin a liší se u jednotlivých rostlinných druhů. Hlavní fyziologické účinky ABA jsou inhibice prodlužovacího růstu, stimulace opadu, urychlení stárnutí, regulace dormance a regulace vodního režimu rostlin. Při nedostatku vody vyvolá uzavření průduchů a mimo to zvýší hydraulickou vodivost kořenů (Gloser a Prášil, 1998). Procesy odehrávající se v rostlinném těle byly prvním impulzem pro hledání a nalezení ABA. Kyselina abscisová byla nalezena u celé řady vyšších rostlin, dále také u mechů, kromě játrovek, dále řas, bakterií a hub (mimo Cercospora rosicola). Dnes existují i biotechnologie, které využívají k produkci kyseliny abscisové Botrytis cinerea

(Zhao et al., 2009).

Objevuje se také v živočišné říši, zde byla izolována z exhudátu mšic, později ji Le PageDegivry et al. (1986) izolovali v různém množství z tkání pocházejících z potkana a prasete. Tito vědci nalezli největší množství ABA v mozkové tkáni obou živočišných druhů, přičemž uvádějí, že kyselina abscisová a některé z jejích konjugátů, takto zjištěné, pravděpodobně nepocházejí z potravy. Propojení živočišné říše s rostlinnou představuje zkoumání ABA v humánní medicíně. ABA navodí trvalou Ca2+ odezvu u lidských granulocytů (Bruzzone et al., 2007). Později byl zjišťován vliv ABA na sekreci inzulinu v lidském pankreatu (Bruzzone et al., 2008). Jejím zlepšujícím vlivem na aterosklerózu se ve své práci zabývali Guri et al. (2010).

2.5.1 Biosyntéza Nejvíce ABA se tvoří v dormantních orgánech, ale i v mladých, rychle rostoucích pletivech. Obsah ABA v semeni se liší v závislosti na podmínkách prostředí růstu mateřské rostliny (Andrade et al., 2009). ABA se tvoří v buňkách obsahujících chloroplasty či amyloplasty tj. v zelených částech rostlin, ale i v kořenových špičkách. ABA dokážou syntetizovat také např. houby Fungi (Zeevart, 2005).

27

Biosyntéza a složení molekuly kyseliny abscisové byly objasněny díky novým technologiím. Nyní víme, že ABA je sesquiterpenoid (C15), složený ze tří isoprenoidních jednotek (3xC5). Vzhledem k jejímu složení se objevily snahy o označení ABA prostřednictvím kyseliny mevalonové jakožto prekurzoru. Avšak ty byly neúspěšné. Vystavení stresovaných listů atmosféře s obsahem

18

O2 vedlo k produkci ABA s jedním

18

O

atomem v karboxylové skupině, ale kyslík nebyl označen v cyklické části molekuly. Tak bylo zjištěno, že ABA vzniká štěpením větší molekuly, patrně karotenoidu, v jehož molekule jsou atomy kyslíku přítomny již v cyklu. Nyní je definováno, že ABA je v zelených rostlinách produktem štěpení 9-cis epoxykarotenoid xantofylů, 9-cis violaxantinu a 9-cis neoxantinu. Při vodním stresu se, díky štěpení molekul při biosyntéze ABA, silně zvyšuje exprese genů (jedná se o případ zvýšené exprese genů v přirozených podmínkách). V transgenních rostlinách vedla uměle zvýšená exprese genů NCED (9-cis-epoxykarotenoid dioxygenaza) ke zvýšení hladiny ABA, nárůstu dormance semen, snížení rychlosti transpirace a nárůstu tolerance k suchu. Takové závěry podpořily myšlenku, že štěpící reakce je hlavním krokem kontrolujícím biosyntézu ABA v zelených pletivech (Wang a Zhang, 2008). Oba typy pletiv obsažené v kořeni, stélé a kortex, umožňují syntézu ABA stejnou měrou. Nejvyšší nahromadění je často pozorováno v kořenových čepičkách, což je velmi pravděpodobně výsledek nízké vakuolizace buněk kořenových čepiček s vysokým podílem cytosolu. Druhým zdrojem xylémové ABA jsou listy. Tato ABA může být vedena floémem do kořenů, tam může být jedna část uložena v pletivu a další část recirkulována do xylémových cév. Množství takto redistribuované ABA záleží na podmínkách prostředí. Konjugáty ABA slouží jako rezervní a transportní formy (Hartung et al., 2002). Volná ABA i ABA glukózaester (ABA-GE) byly nalezeny v půdním roztoku u mnohých plodin v koncentracích až 10 či 30 nM. Vnější volná ABA může být přijímána kořeny. Tento děj se podílí na udržení rovnováhy mezi kořeny a vnějším prostředím. Příjem vnější konjugované ABA je přísně závislý na existenci a vlastnostech apoplastických bariér. Sauter a jeho kolegové (2002) ukázali, že ABA-GE může fungovat jako stresový signál po uvolnění ABA z extrémně hydrofilního a fyziologicky neaktivního konjugátu. Při stresu konjugované formy přispívají k navýšení volné ABA a to díky glukosidáze, která uvolní molekulu ABA. Koncentrace volné ABA v okolí průvodních buněk také závisí na aktivitě β-glukosidázy, která uvolní ABA z fyziologicky neaktivního konjugátu (Pospíšilová, 2003). Wang a Zhang (2008) zveřejnili výsledky experimentu, kdy uvedli, že působení sucha rychle zvýšilo polymerizaci AtBG1 proteinu, což mělo za následek více než čtyřnásobný nárůst jeho enzymatické aktivity. Z toho vyvozují, že při výskytu sucha může AtBG1 sloužit jako 28

molekulární přepínač k uvolnění bioaktivní ABA z ABA-GE transportované ze zásobních vakuol a to zatím neznámým mechanizmem. Na realizaci zvýšení obsahu ABA v buňce se podílejí transportní proteiny (ABC ATP-binding cassette), kterými se u Arabidopsis thaliana zabývali Kang et al. (2009).

2.5.2 Katabolizmus Dvěma hlavními cestami katabolizmu ABA jsou konjugace a oxidace. Konjugací ABA s glukózou vzniká glukózaester (ABA-GE), reakce je katalyzována ABA glukosyl transferázou. Oxidace může být realizována na 7´, 8´ a 9´atomu uhlíku molekuly ABA. Ale ve většině případů probíhá reakce na pozici 8´ a je katalyzována ABA-8´-hydroxylázou. Touto oxidací vznikne nestabilní přechodná forma 8´-hydroxy ABA, která se přemění na kyselinu fazeovou (PA phaseic acid) a ta následně na kyselinu dihydrofazeovou. Tento konečný produkt, stejně jako glykosid dihydrofazeové kyseliny, může být akumulován ve velmi velkém množství v některých orgánech, například v semeni. Degradace přes kyselinu fazeovou a dihydrofazeovou probíhá v cytoplazmě (Zeevaart a Yang, 2005).

2.5.3 Regulace metabolizmu ABA Bylo zjištěno, že aplikace ABA indukuje také expresi genu CYP707As, což znamená, že se jedná zároveň o způsob, kterým je zvýšena degradace ABA. Je možné, že zvýšený katabolizmus je realizován díky regulaci zpětnou vazbou (feedback). Bylo zjištěno, že finální krok při biosyntéze ABA u turgidních rostlin je lokalizován v cévních svazcích, konkrétně v průvodních buňkách sítkovic a v parenchymatických buňkách xylému. Nicméně první spojující krok při biosyntéze ABA, štěpení karotenoidů, se děje v chloroplastech, obvykle v mezofylu. Biosyntézou ABA je vyvolán pohyb meziproduktů (Zeevart a Yang, 2005). ABA je v literatuře často spojována s regulací otevřenosti listových průduchů. Je důležité si uvědomit, že otvírání průduchů může být způsobeno hydraulickými nebo chemickými signály. Hydraulická povaha se projeví při obnovení poměrů vody v nadzemních částech rostliny (shoot) za použití techniky kořenové tlakové nádoby, což bylo dokázáno při experimentech provedených s celou řadou druhů rostlin, kdy došlo k opětovnému otevření stomat u rostlin rostoucích v suché půdě. Význam obou druhů signálů se liší mezi rostlinnými druhy. Signály lze rozlišit na základě změn pH různých částí kořene a nadzemní části rostliny (Hartung et al., 1988). Syntéza ABA je stimulována dehydratací rostlinných buněk (Wright, 1977), zahrnujících buňky v kořenech, ale ABA syntetizují také buňky obsažené v listech. Například Cutler a Krochko (1999) jsou jedni z experimentátorů, kteří podali důkaz o této syntéze. Jedná se o 29

situace, kdy dehydratace listu při silném omezení vody z půdy velmi výrazně zvýšila množství ABA v listu. Tento fakt pak často dobře koreluje s uzavřením průduchů. Pokud obhajujeme myšlenku, že ABA funguje jako chemický signál pro dlouhé vzdálenosti, který může poskytnou informaci o dostupnosti vody v půdě, je důležité rozlišit mezi nárůstem listové ABA vzniklým v důsledku vodního deficitu v nadzemní části rostliny a tím, který vychází z importu ABA z kořene (popsali Davies a Zhang, 1991). Popis situace zvýšení obsahu ABA v listu může vypadat takto. Xylémové cévy předávají svůj obsah (včetně ABA) do listového apoplastu. Tím vzroste koncentrace hormonu v tomto kompartmentu. ABA je následně nesena transpiračním proudem uvnitř listu kolem buněk případně přes buňky mezofylu. Tak jsou v důsledku o ABA obohaceny cílové buňky (průvodní buňky průduchů) v epidermis, které v jejich plazmatických membránách obsahují ABA receptory na vnější a možná i vnitřní straně membrány. Navázaný hormon pak indukuje vnitřní převod signální kaskádové dráhy. Součástí dráhy je i nárůst vnějšího a vnitřního zdroje cytoplazmatického vápníku, který prostřednictvím přesunu iontů K+ a Cl- může redukovat osmotický potenciál průvodních buněk a tak vyvolá uzavření průduchů. V případě, kdy byla ABA dodávána přes xylem do nestresovaných rostlin bobu obecného V. faba, se ABA akumulovala v apoplastu průvodních buněk průduchů. Nedošlo k doprovodnému nárůstu v symplastu průvodních buněk průduchů, což korelovalo s uzavřením (nebo otevřeností) průduchů ve vztahu k absenci jakéhokoli dalšího stresového signálu. Pro pokles apoplastické ABA je epidermální symplast ještě lepším než mezofyl. Epidermální symplast má pětkrát vyšší katabolickou rychlost. Tudíž i když ABA jednou dosáhla epidermis, existuje stále možnost, že ABA může být převedena z jejího místa akce (apoplastu průvodních buněk). Důležitost přínosu oddělení ABA a katabolismu v symplastu objasnili ve své práci Kefu et al. (1991). Spočítali, že množství ABA přenášené každý den v transpiračním proudu rostlin bavlníku je 9krát vyšší než množství ABA aktuálně zjištěného v listech na konci dne. 2.5.3.1 Proteiny v roli receptoru kyseliny abscisové Proteiny se v souvislosti s fungováním ABA uplatňují v několika momentech. Jedním je funkce proteinu jakožto receptoru pro ABA, tedy receptoru, který je na počátku signalizace. Nalezení tohoto receptoru je klíčovým momentem pro pochopení funkce ABA. Jako první oznámili jeho identifikaci Razem et al. (2006). Autoři práce došli k závěru, že hledaným receptorem je RNA vazebný protein FCA, ovlivňující kvetení. Vazba ABA na receptor FCA

30

(Flowering Control Locus A), který je lokalizován v jádře, umožňuje akumulaci mRNA pro FLC (represor kvetení), který zabrání přechodu rostlin z vegetativní do reprodukční fáze. Inhibice tohoto přechodu může pozitivně ovlivnit toleranci rostlin ke stresu (neboť odrůdy ozimé pšenice ztrácí odolnost k mrazu po započetí generativní fáze, tedy indukce kvetení) (Vaňková, 2010). Závěry Razem et al. (2006) později zpochybnili Risk et al.(2008) a tak hledání pokračovalo. Následujícím publikovaným receptorem byl homolog ABA vazebného proteinu bobu CHLH (magnesium-chelatase subunit H). V tomto případě nebyla vyvrácena domněnka, že by CHLH rostlin Arabidopsis fungovala jako ABA receptor. Jako další možný receptor byl označen GCR2, receptor spojený s G proteiny, u něhož se předpokládá struktura se sedmi transmembránovými doménami (Liu et al., 2007). Obdobnou problematikou se zabývali i Pandey et al. (2006), které předešlé důkazy vedly k myšlence, že signální dráhy v semeni i průvodních buňkách průduchů zahrnují heterotrimerické G proteiny. Pro posouzení role podjednotky Gλ, Gß a kandidátního spřaženého G proteinového receptoru v signální dráze ABA použili vědci mutanty postrádající jeden či více uvedených komponent. Zjistili buněčnou a pletivovou specifitu reakce s různými členy G proteinového komplexu v závislosti na signálu, kterým může ABA udat signální dráhu. Naproti tomu Gao et al. (2007) došli k závěru, že GCR2 není ABA receptorem, který by hrál roli při klíčení a vývoji rostlin (u Arabidopsis thaliana). V roce 2009 pak přibyly do klubu ABA receptorů další dvě skupiny proteinů s předpokládanými transmembránovými doménami. První skupina zahrnuje dva membránové proteiny (GTG1 a GTG2) s devíti předpokládanými transmembránovými doménami. Oba uvedené proteiny vážou ABA a mutanty gtg1 a gtg2 vykazovaly sníženou, avšak ne zcela eliminovanou ABA odezvu. Stechiometrie vazby byla v tomto experimentu velmi nízká, pouze 1 % všech GTG získaných z E. coli bylo schopných vázat ABA. Takový výsledek mohl mít několik příčin. Jak uvádějí autoři příspěvku (Pandey et al., 2009) důvodem mohla být slabá čistota proteinu, rozpustnost, případně jeho renaturace. Tvrzení že GTG1 a GTG2 jsou ABA receptory, je tedy třeba podepřít ještě dalšími experimenty a to lépe s proteiny z membrán eukaryotických buněk. Druhou skupinou potenciálních ABA receptorů představují proteiny, které svojí vazbou na ABA mohou zabránit aktivitě proteinové fosfatázy (PP2Cs) v signální dráze ABA. PP2Cs je proteinová fosfatáza 2Cs, která funguje jako negativní regulátor signální dráhy ABA a která je kódována geny HABI1, ABI1 a ABI2 (Rodriguez et al., 1998; Ma et al. 2009; Umezawa et al., 2009). Jedná se o regulátory receptoru kyseliny abscisové neboli PYR/PYL/RCAR (pyrabactin resistence/pyrabactin resistence-like/ Regulatory component of Abscisic acid receptor. Blíže 31

viz Melcher et al. (2009) a Yin et al. (2009). Aktuální ucelený pohled na ABA receptory publikovali Kline et al. (2010) a Muscietti a McCormick (2010). Po identifikaci PYR1/PYL/RCAR rodiny (PYL) proteinů jako ABA receptorů mohl být vytvořen syntetický agonista kyseliny abscisové – pyrabactin, který selektivně inhibuje klíčení semen (Hao et al., 2010). Rozvoj mikro a nanotechnologií umožnil pozorování ABA a PYR1. V současné době je pro její zkoumání využívána například krystalografie využívající rentgenové paprsky. Jedná se o metodu, která rozliší trojrozměrně rozmístění jednotlivých atomů ve struktuře proteinu. Pro použití této technologie je nutné nejprve upravit molekulu do krystalové struktury, což je v některých případech nesmírně náročné. Principem detekce je následně odchýlení paprsků při nárazech na atomy krystalu (difrakce) Na základě takto vzniklé předlohy může být vytvořen model původní molekuly. Bylo ukázáno, že dvě molekuly PYR1 se společně dostanou do rostlinných buněk, kde jsou následně zacíleny kyselinou abscisovou. Každá z kopií molekul PYR1 má vnitřní dutinu a pokud se přiblíží molekula hormonu, zabuduje se do jednoho ze dvou prostorů, ve kterém je následně uzavřena. V prázdné podjednotce se vytvoří kanál zachovávající přístup do dutiny. Další změny struktury molekuly PYR1 spouští vzájemné ovlivňování s dalšími proteiny, tudíž spouští procesy v rostlině pro odolnost (Santiago et al., 2009). 2.5.3.2 Signální dráhy kyseliny abscisové Málo je známo o způsobu, jakým vodní stres spouští biosyntézu ABA, kromě ztráty turgoru, který působí jako signál. S největší pravděpodobností je k tomuto počátečnímu signálu citlivá plazmatická membrána, způsobující nárůst transkripce NCED v jádře, dojde k dopravení NCED proteinu do chloroplastů a štěpení karotenoidů. Většina těchto signálních drah zůstává nejasná. Podle Wilkinsona a Daviese (2002) mohou hrát důležitou roli v regulaci ABA následující situace: 1. uložení ABA v kořeni (sekvestrace), 2. syntéza ABA versus její katabolizmus v kořeni, 3. efektivita přemístění ABA napříč kořenem a do xylemu, 4. výměna ABA mezi lumenem xylemu a parenchymem xylému ve stonku, 5. množství ABA v listovém rezervoáru symplastu a efektivita uložení a uvolnění z tohoto prostoru, jenž je regulováno faktory jako jsou změny pH v kořenech a listech, 6. uvolnění ABA z ABA konjugátu v listovém apoplastu,

32

7. transfer ABA z listu do floemu, 8. citlivost průvodních buněk průduchů k ABA, která k nim je v konečné fázi dodána, 9. možné vzájemné působení mezi nitrátovým stresem a ABA signálem. Zásadní vliv při působení ABA mají v rostlinném těle enzymy. Kalcium dependentní proteinkinázy (CDPKs calcium dependent protein kinesis) působí v signální dráze ABA pod vlivem dvou pozitivních regulátorů CPK4 a CPK11 (Zhu et al., 2007). Vliv ABA, respektive funkce její signální dráhy v období dormance, klíčení a růstu rostlin Arabidopsis thaliana probíhá pomocí dvou proteinových kináz SnRK2.2 (SNF-1related protein kinase 2.2) a SnRK2.3 (Fujii et al., 2007; Fujita et al., 2009; Cutler et al., 2010). V listech kukuřice (Zea mays) studoval Xu (2010) kalcium dependentní a kalmodulinem stimulovanou proteinovou kinázu v antioxidačním obranném mechanizmu kyseliny abscisové. Podle Li a Assman (1996) mohou být proteinové kinázy aktivované kyselinou abscisovou součástí ABA signálních drah svěracích buněk průduchů nezávislých na vápenatých iontech. ABA indukované proteinové kinázy (PKABA1) v aleuronové vrstvě ječmenů jsou pravděpodobně důležitým členem signální dráhy vedoucí k potlačení giberelinové genové exprese (Gómez-Cadenas et al., 1999). Byly realizovány i pokusy ovlivnit toleranci k suchu přes enzymatický aparát (9-cisepoxykarotenoid dioxygenázu), který se podílí na biosyntéze kyseliny abscisové pomocí genové manipulace u Arabidopsis thaliana (Iuchi et al., 2001). S pomocí současných metod je možné postupně po sekvenování DNA přiřadit vlastnosti k určitým genům – díky vyhledání podobných genů či získat profil exprese genu (s pomocí mikročipu se sekvencemi DNA – sondy), s pomocí mutantů lze vypínat geny a zkoumat změny v organizmu. Co se týče obtížné křížitelnosti kulturních forem hexaploidní pšenice s planými diploidními druhy, lze tento problém vyřešit díky kolchicinu (navození zdvojení počtu chromozomů) a vytvořením tzv. syntetické pšenice. Lze využít i nejrůznější markery a s pomocí fingerprintingu urychlit selekci rostlinného materiálu (Goff a Salmeron, 2005). Takto vypadá zjednodušený náčrt možností. Už víme, že nestačí vědět, kde je gen lokalizován, ale pro jeho využití u všech výše jmenovaných metod a další jistě přibydou, je třeba co nejlépe poznat co představuje exprese každého z genů. Jako negativní a pozitivní regulátory ABA signální dráhy jsou vedeny isoprenylcystein metyltransferázy (ICMT) a isoprenylcystein metylesterázy (ICME), které souvisejí s farnesylací. Farnesylace je posttranslační úprava proteinu začínající přidáním 15uhlíkové farnesylové skupiny k označenému CaaX motivu (C cystein, a alifatická aminokyselina, X jedna z aminokyselin) na C konci cílového proteinu. U rostlin je farnesylace proteinů 33

realizována pomocí farnesyltransferázy, který je heterodimerem složeným ze dvou podjednotek (λ a ß). Beta je kódován geny rodiny ERA1 a je součástí negativní regulace průvodních buněk. Delece ERA1 nebo specifická inhibice farnesyltransferázy měla za následek zvýšenou ABA indukovanou aktivitu S-typu aniontových kanálků a rychlý nárůst Ca2+ v cytosolu, tedy snížení stomatální vodivosti s širokým rozpětím fyziologicky přítomné koncentrace ABA. V rostlinách Arabidopsis jsou upraveny farnesylované proteiny specifickou CaaX proteázou, aby byla odstraněna aaX část motivu a současně ICMT, které metylují karboxylovou skupinu isoprenylcysteinu na C konci. Homeostáze farnesylovaného proteinu je regulována synergicky metylací a demetylací díky činnosti ICMT a ICME. Aplikace exogenní ABA je tedy doprovázena expresí mnoha specifických proteinů (Huizinga et al., 2008). 2.5.3.3 ABA v nadzemní části rostliny Jednou ze základních reakcí rostlin, na níž se ABA podílí, je ovládání velikosti průduchové štěrbiny. Při tomto mechanismu se uplatní kyselina abscisová, která se nachází v okolí průvodních buněk. Quarrie et al. (1997) studovali vztah mezi velikostí listu a akumulací ABA ve vysušených listech rýže a provedli srovnání mezi obilninami prostřednictvím analýzy QTL. Množství ABA může vzrůst díky její redistribuci, ABA může být importována xylémem jako signál ze stresovaných kořenů, anebo je nárůst ABA v apoplastu průvodních buněk zapříčiněn výparem vody ze stěn průvodních buněk. Koncentrace volné ABA v okolí průvodních buněk také závisí na aktivitě β-glukosidasy, která uvolní ABA z fyziologicky neaktivního konjugátu (Pospíšilová, 2003). Při reakci na sucho se hladina ABA v listech může zvýšit 10-50krát během 4-8 hodin a po opětovném dodání vláhy se hladina upraví na původní hodnotu. Pokles hladiny ABA nastane snížením biosyntézy, zrychlením degradace či transportem z listu. Transportuje se z kořenů do nadzemní části v xylému a v rámci nadzemní části ve floému (Macháčková, 1998). V kořenech a listech může být transportována v symplastu i apoplastu (Pospíšilová, 2003). ABA je transportována ve volné aktivní formě nebo ve formách neaktivních konjugovaných, hlavně jako glukózaester kyseliny abscisové (Sauter et al., 2002). Hlavním transportním mechanizmem uvnitř buněk je difuse a rozdílná propustnost membrán, kdy propustnost tonoplastu je obvykle menší než plasmalem (Hose et al., 2002). Bylo zjištěno, že xylemová šťáva rostlin dobře zásobených vodou má pH kolem 6 a šťáva ze sušených rostlin má pH více alkalické kolem 7 (Wilkinson a Davies, 1997). Uměle pufrovaná xylemová šťáva na pH 7 dodaná celé ustřižené rostlině c.communis nebo listům rajčete

34

xylemovým tokem redukovala otevřenost průduchů ve srovnání s kontrolami, kterým byla aplikována šťáva s pH6. Bylo zjištěno, že v důsledku zvýšení pH došlo k uzavření průduchů a to poskytnutím více ABA, která směřuje do listu, aby se dostala do průvodních buněk průduchů. Zároveň dojde důsledkem změny pH ke snížení množství ABA v symplastickém rezervoáru, tak, jak byl proces popsán výše. 2.5.3.4 ABA v kořeni ABA se v kořeni objevuje několika způsoby. Vlastní syntézou v kořenech nebo je uvolněna z konjugovaných forem, případně je nasáta z půdní vody v okolí kořene a nebo je floemem dopravena do kořene z nadzemních částí rostliny. Uvnitř kořene může být ABA uchopena symplastem a skladována nebo degradována a nebo může být převedena z buňky do buňky směrem ke xylémovým cévám nebo je nesena apoplasticky s transpiračním proudem směrem ke xylému. Anebo může být ABA ztracena z kořene difuzí do půdní vody (rhizosféra). Pokud neplatí ani jedna z předchozích možností, tedy není kořenová ABA degradována, uložena v symplastu nebo ztracena do půdní vody, tak je transferována do xylemových cév pro transport do listu. ABA která se dostala do xylému se sem může dostat přímo z apoplastu, nebo nepřímo díky specializovaným buňkám parenchymu, které se nacházejí podél kořenového xylému. Jedná se o dynamický proces v živém organizmu.

2.5.4 ABA a stresové situace způsobené suchem Listy jsou pokládány za nejproduktivnější místo syntézy ABA během vodního stresu. Koncentrace ABA u nestresovaných listů pšenice je nižší než 10 ng/g čhm (při stresu až 620 ng/g čhm), u prosa nižší než 20 ng/g čhm (stresované varianty 240 ng/g čhm), u rýže nižší než 15 ng/g čhm (při stresu 1200 ng/g čhm) (Henson a Quarrie, 1981). ABA je přítomná ve všech kvetoucích rostlinách a je obecně známa jako stresový hormon, který se účastní mnohých odpovědí na sucho. Když rostliny vadnou, její hladina typicky stoupá jako výsledek nárůstu v rychlosti syntézy (Taylor, 1991). Vzrůst koncentrace ABA vede k mnoha změnám ve vývoji, fyziologii a růstu. A co je nejdůležitější, je považována za signál k iniciaci zapojení adaptačních procesů k suchu a jiným stresům prostředí (Hartung a Davies, 1991; Bray, 1993). Jak zhodnotil Setter (1996), spočívají její hlavní vývojové a morfologické účinky ve snížení úbytku vody transpirací a současně přijme rostlina kořeny více vody, také mění relativní rychlost růstu různých částí rostliny. Při nárůstu obsahu ABA v kořeni se v prýtu zvýší obsah sušiny, je utlumen proces vývinu listové plochy, je podpořen růst kořene – rostliny hlouběji zakořeňují (Sharp et al., 1994).

35

Nejdůležitější pro zachování obsahu vody v rostlině je uzavření průduchů, též vyvolané fytohormonem ABA (Ward et al, 1995). ABA zlepšuje transport vody mezi částmi rostliny, jedná se především o pohyb vody z kořenů do listů (Zhang et al., 1995), také je zahrnuta v působení buněčných změn, které prokazují schopnost udržovat buněčný turgor a odolat škodlivým vlivům spojených se sníženým vodním potenciálem a vysušením. Vliv stresu sucha a kyseliny abscisové na fotosyntézu v rostlinách ječmene sledovali Popova et al. (1996). Stres sucha byl navozen situací, kdy listy snížily čerstvou hmotnost o 12 %. Byl použit cykloheximid jako inhibitor akumulace ABA (úplná blokace) v důsledku stresu. Cílem bylo odlišit změny ve fotosyntetických reakcích, které jsou důsledkem stresu sucha odpovědí na zvýšení hladiny ABA, od těch, které jsou způsobeny přímo změnami vodního stavu. Čtyři hodiny po navození vodního stresu nebo dvě hodiny po aplikaci ABA stoupl její obsah v listu 14-16krát. Změny v rychlosti asimilace CO2 jako funkce vypočtené substomatalní CO2 byly použity ke zjištění role pevnosti průduchů v závislosti na ošetření ABA a stresu sucha. Zjistili téměř desetinásobné snížení rychlosti asimilace v případě ošetření ABA nebo snížení čhm o 12 %. Cykloheximid nechává otevřené průduchy za světla a zamezuje jejich uzavření během vysychání listu. Podle této práce došlo k podstatnému zvýšení endogenní ABA po aplikaci exogenní ABA nebo navozením sucha. Také hodnoty listové ABA byly velmi podobné pro obě varianty, lišily se ve stupni fotosyntetické inhibice. Protože byly buňky mezofylu dobře zásobeny CO2, v obou případech, nebyla redukce fotosyntézy otázkou průduchů. Podobný pokus s ječmeny uveřejnila Popova v roce 1998. Použila fluridon, který je stejně jako norflurazon selektivním inhibitorem působící v buňkách při syntéze karotenoidů. Dalším činitelem v jejich pokusu byla intenzita světla, opět ztráta čerstvé hmotnosti listů o 12 %. Sledovali růstové charakteristiky a anatomii listu, zajímali se o míru poškození tylakoidních membrán. Hladina ABA výrazně reagovala na vysušení (nárůst více než patnáctinásobný). Pěstování rostlin při nízké intenzitě osvětlení (40 µmol·m-2·s-1) snížilo hladinu ABA ve vysušených listech. Rostliny pěstované ve tmě měly hladinu ABA detekovatelnou, ale dvakrát nižší než ty pěstované za světla. Rostliny, které byly vysušeny a inkubovány po dobu 4 hodin, naakumulovaly 40krát více ABA než nasycené listy. Naproti tomu růst rostlin ve tmě za přítomnosti 10 µM fluridonu snížil hladinu ABA v nestresovaných i dehydrovaných listech. Účinek fluridonu se neomezil pouze na růst, ale byla ovlivněna anatomie listu. Změny se týkaly struktury různých buněčných typů, také průvodních buněk průduchů. Listy rostlin pěstovaných za světla, ošetřené fluridonem neobsahovaly chloroplasty, ale jen malé rudimenty bez chlorofylu, jejichž vnitřní struktura téměř vymizela. 36

Hladiny ABA kontrol pěstovaných při světle stouply víc než 15krát po vysušení listů a čtyřech hodinách inkubace. Rostliny pěstované s fluridonem akumulaci ABA plně blokovaly. Rostliny pěstované při nízké intenzitě osvětlení vykazovaly sníženou hladinu ABA po vysušení. Vysušení listů ječmenů pěstovaných za tmy způsobilo čtyřiceti násobný nárůst ABA během čtyř hodin, zatím co rostliny s fluridonem akumulovaly po vysušení minimum ABA. Je možné, že rostliny rostoucí při méně světla měly dostatek karotenoidů pro podporu její akumulace po vysušení listu, zatímco v rostlinách s aplikací fluridonu bylo redukováno množství karotenoidů nebo mohly akumulaci ABA limitovat poruchy plastidů. Pokusy byly realizovány s desetidenními rostlinkami. Asch (2005) sledoval rozdíly v obsahu ABA u kukuřice a rýže v souvislosti s rychlostí reakce na sucho. Pokusy proběhly v polních podmínkách (dva různé půdní typy) spolu s experimenty v regulovaných podmínkách s různou velikostí nádob. Z výsledků vyplývá, že komunikace mezi kořeny a nadzemními částmi rostlin se mění v důsledku intenzity působícího stresu. Z obou pokusů bylo zřejmé, že pokud voda pomalu odtékala, využila rostlina čas a situaci se přizpůsobila a reakce se dále významně od kontrol nelišily. Reakce v hladině ABA na různé vysušení půdy byla u rýže mnohem výraznější než u kukuřice. U rýže se projevily i jasné rozdíly mezi odrůdami. Henson a Quarrie (1981) stanovovali obsah ABA v odstřižených listech u tří druhů obilnin: prosa (Pennisetum americanum L.), rýže (Oryza sativa L.) a pšenice (Triticum aestivum L.). Listy částečně vysoušeli a následně ponechali ve tmě. Zaznamenali nejrychlejší a největší nárůst ABA u rýže, dále prosa a u pšenice byly změny obsahu ABA nejmenší a uskutečnily se v delším časovém intervalu. Sledovali také různé genotypy (20) jarní pšenice a u dvou nalezli odlišnou schopnost listů akumulovat ABA. Podle těchto autorů se u všech tří druhů vysoušených listů schopnost akumulovat ABA snižovala se zvyšujícím se stářím listu. U rýže a prosa byla snížená schopnost akumulovat ABA do doby, než se objevil jazýček, oproti pšenici, kde byl pokles zaznamenán teprve tři dny po objevení se jazýčku. Quarrie et al. (1997) studovali vztah mezi velikostí listu a akumulací ABA ve vysušených listech rýže a provedli srovnání mezi obilninami prostřednictvím analýzy QTL. Použili test DLT (detached-leaf drought test). Asch et al. (2009) sledovali v xylému a listech kukuřice obsah ABA spolu s pH a koncentrací NO3- s cílem popsat potenciální signální dráhu mezi kořeny a nadzemní částí rostlin. Z počáteční hladiny ABA v xylému (mezi 50-200 pmol·ml-1) byl nárůst ABA proti plně zalévané variantě mírný a lokální maximum s vysokým gradientem se na křivce hladiny ABA projevil až ve 12. dni (cca 450 pmol·ml-1). Při opakování pokusu byla počáteční hladina ABA 150 pmol·ml-1 a její obsah stoupl během tří dnů na cca 600 pmol·ml-1, po týdnu hladina 37

opět klesla na hodnoty kolem 200 pmol·ml-1 a na této hladině se v obou letech držela do 35. dne, kdy byl experiment ukončen. V listech hladina ABA kolísala a k samotnému nárůstu došlo po 29.dni v prvním roce a po 30.dni v druhém roce. Rozdíly v hladině ABA mohly být způsobeny podmínkami pokusu, neboť byl realizován na poli. V prvním roce pokusu vysychaly sledované pokusné parcely pomalu, rostliny se postupně přizpůsobily nedostatku vody, kontinuálně narostla koncentrace ABA v xylému a listech a pravděpodobně tak vzrostla i hydraulická vodivost kořenů. Při opakování pokusu vysychala půda velice rychle již v prvních týdnech. Snaha ovlivnit toleranci rostlinných organizmů k suchu pomocí genových manipulací není v přírodních vědách novinkou. Například Iuchi et al. (2001) použili genovou manipulaci v případě 9-cis-epoxykarotenoid dioxygenázy, klíčového enzymu pro biosyntézu kyseliny abscisové. Pracovali s rostlinami Arabidopsis. Prokázali funkci genu NCED za pomoci zvýšené exprese genu. U transgenních rostlin získali nárůst endogenní hladiny ABA a došlo k transkripci suchem a ABA indukovaných genů. Rostliny se zvýšenou expresí genu ukázaly redukci v rychlosti transpirace z listů a zlepšení tolerance k suchu. Naproti tomu poškození genu vedlo k vytvoření rostlin citlivých na sucho. Fakt, že vodní stres není vždy hodnocen na základě standardních parametrů, komplikuje klasifikaci tohoto děje. Nejčastějšími parametry k ohodnocení síly stresu sucha jsou vodní potenciál listu (Ψ – zahrnuje hybné síly transportu se složkou osmotickou, tlakovou a gravitační, vyjadřuje schopnost odevzdávat vodu) a relativní obsah vody (RWC, kritická hodnota RWC je 50 %, při nižších hodnotách pletivo odumírá). Vyskytl se názor, že pro porovnání efektu sucha mezi různými druhy rostlin a odlišnými podmínkami prostředí je vhodnější stanovení světlem saturované stomatální vodivosti (g). Lösch et al. (1994) uvádějí, že stomatální vodivost listů se snižuje pouze vlivem dlouhodobého sucha (sníženým vodním půdním potenciálem) a není ovlivňována krátkodobým snížením listového vodního potenciálu (např. v poledních hodinách). Snížení listové vodivosti je vázáno na určité prahové snížení využitelné vodní kapacity (o 60 – 80 %). Závislost metabolických procesů na Ψ a RWC je extrémně proměnlivá mezi druhy a podmínkami experimentu, protože sucho mění metabolické procesy, jejichž signální cesty jsou obdobné jako pro snížení dostupnosti vody v buňkách. Mezi tyto procesy patří syntéza ABA nebo snížená hydraulická vodivost. Tím, že stomatální vodivost začleňuje všechny tyto komponenty, je závislost různých fotosyntetických parametrů na stomatální vodivosti do značné míry konstantní.

38

2.5.5 ABA a nízká teplota Rostliny Arabidopsis thaliana (L.), kterým byla exogenně aplikována ABA (15 mg/l při teplotě 20°C), získaly rychleji odolnost k mrazu, oproti rostlinám vystaveným aklimatizační teplotě (4°C) (Lång et al., 1989). V dalších letech bylo potvrzeno, že se během aklimatizačního procesu uplatňují mechanizmy závislé na ABA a na ABA nezávisející (Bravo et al., 1998; Wang a Nick, 2001; Yu a Griffith, 2001; Gusta et al., 2005). Souhrnem lze říci, že ABA reguluje mnohé z genů spojených s nárůstem mrazuvzdornosti. Význam ABA při chladuvzdornosti kukuřice sledovali Janowiak et al. (2002). Zjistili, kromě dalších ukazatelů, vyšší obsah ABA v rostlinách odolných nízkým teplotám proti genotypům citlivým. Dále se ukázalo, že klíčenci s aplikovaným norflurazonem byly méně odolné vůči chladu a akumulovaly méně ABA oproti kontrole. Po dodání ABA byl rozdíl v odolnosti vyrovnán. Podle výsledků, které uvádí Faltusová-Kadlecová et al. (2002), tolerance testovaných odrůd vůči mrazu nebyla zřejmě v souvislosti s absolutním množstvím listové ABA. U některých odrůd se během experimentu vyskytly přechodné nárůsty ABA. Bravo et al. (1998) sledovali šest odrůd jarních a čtyři odrůdy ozimých ječmenů a jednu přesívkovou formu, použili exogenně aplikovanou ABA na neaklimatizované rostliny a následně měřili mrazuvzdornost rostlin (7denní), LT50, stanovovali obsah cukrů, prolinu. LT50 neaklimatizovaných rostlin byla v rozmezí -4,8 až -10,8ºC. Mrazuvzdornost neměla vztah k typu ječmene. Významná korelace se projevila mezi LT50 a obsahem ABA i sacharozy. Veselova et al. (2003) sledovali při ochlazení kořínků rostlin (10 dnů starých) jarní pšenice (Triticum durum L.) obsah ABA a jejích antagonistů, IAA a cytokininů ve stoncích, kořenech a kořenových exudátech. Rostliny pěstovali ve vodném roztoku. Fytohormony stanovovali imunologickými metodami. Pokles teploty v oblasti kořene nezvýšil významně obsah ABA ve stonku ani v kořenech, obsah cytokininů byl dvakrát nižší ve stonku, v kořenech se od kontroly nelišil, zvýšilo se množství IAA ve stonku a pokleslo v kořenech. Stanovení obsahu ABA v xylémové šťávě neodhalilo při ochlazení kořenů žádný významný rozdíl. Hodnotili také rychlost transpirace, relativní obsah vody (RWC), aktivitu cytokinin oxidázy, stomatární vodivost. Ochlazením kořínků se zvýšil vodní deficit stonků, k čemuž došlo v souvislosti s poklesem hydraulické vodivosti kořenů. RWC rostla s časem, což může být vysvětleno sníženou transpirací díky uzavření průduchů na základě sníženého příjmu vody kořeny. Murelli et al. (1995) sledovali změny v metabolismu dvou odrůd (jařina a ozim) ječmene vyvolané chladovou aklimatizací. Stanovovali obsah volného prolinu ve vodě, rozpustné

39

cukry a volné mastné kyseliny. V důsledku aklimatizace vzrostl obsah prolinu u obou odrůd, hladina ABA byla po prvním dni otužení nižší než u neotužených kontrol bez rozdílu mezi odrůdami. Druhý den aklimatizace vzrostla na dobu 24 hodin u mrazu odolné odrůdy, pak klesla a mezi odrůdami nebyl dále žádný rozdíl. Obsah cukrů byl nejvyšší po třech dnech otužení, ačkoli po 14 a 21 dnech otužení byl obsah cukrů obdobný jako u neotužených rostlin. Mrazuodolná odrůda měla mnohem vyšší obsah mastných kyselin (především nenasycené m.k.) Kadlecová et al. (2000) uvádí, že otužování rostlin nízkou teplotou (3ºC po dobu tří týdnů) vedlo k nárůstu mrazuvzdornosti v době plně vyvinutého druhého listu z LT50 -4,9ºC na -14,5ºC. Vzrostl i podíl sušiny z 12 % na 23 %. Hladina ABA mírně kolísala ve srovnání s kontrolními rostlinami. Rostliny vystavené nízké teplotě nevykazovaly příznaky vyskytující se při deficitu vody. Vzorky rostlin, u kterých bylo provedeno rychlé vysušení z 97,3 % na 67,9 % RWC během 24 hodin (krátkodobé sucho), vykazovaly jednoznačně nárůst koncentrace ABA. Nicméně nárůst nebyl doprovázen vzrůstem mrazuvzdornosti. Mírný nárůst mrazuvzdornosti nastal po 14 denním ošetření polyetylenglykolem (PEG) ve smyslu dlouhodobého sucha, kdy RWC klesla jen o 6-10 %. Sušina se postupně akumulovala v listech. Obsah ABA v listech narostl částečně druhý den, avšak po 14denním ošetření PEG nebyla výrazně vyšší hladina ve srovnání s kontrolou. Po přidání ABA do růstového roztoku hladina ABA v rostlinách lehce stoupla, LT50 lehce klesla, obsah sušiny se nezvýšil. Exogenní aplikaci ABA použili ve vztahu k indukci mrazuvzdornosti pšenice Dallaire et al. (1994). Autoři uvádí, že exogenně aplikovaná ABA nemůže při indukci mrazuvzdornosti nahradit potřebu nízké teploty. Dále jejich výsledky naznačují, že mrazuvzdornost kalusů pšenice získaná díky ABA funguje na základě jiného regulačního mechanizmu než ta, která byla získána při nízké teplotě. Roli ABA v procesu tolerance ječmene k mrazu a chladové aklimatizace sledovali Bravo et al. (1998). Ječmen (Hordeum vulgare L.) je považován za chladuodolnou obilninu. Je méně odolný než žito a pšenice a odolnější než oves. Autoři uvádějí, že důsledkem aplikace vyšší koncentrace exogenní ABA byly chlorozy na rostlinách. Odolnost mrazu byla stanovena zjištěním letální teploty pro 50% listových vzorků (LT50). Objevila se významná negativní korelace mezi LT50 a ABA i sacharózou u neaklimatizovaných rostlin. Exogenní aplikace ABA u některých vzorků zvýšila, u jiných snížila bod mrznutí listu. Tři neaklimatizované odrůdy s různou úrovní endogenní ABA byly ošetřeny exogenní ABA. Ačkoliv se body tuhnutí lišily mezi neaklimatizovanými odrůdami, po ošetření exogenní ABA nebyly rozdíly významné. 40

Bravo et al. (1997) sledovali efekt napadení mšicemi (Schizaphis graminum, Rhopalosiphum padi L.) na obsah ABA a vliv napadení na mrazuvzdornost ječmene (odrůd Aramir, Atlas). Třináctidenní rostliny se po předchozím šest dnů trvajícím sání mšic v obsahu ABA nelišily. Kontrolní varianta odrůdy Atlas obsahovala čtvrtinové množství ABA oproti odrůdě Arami. Stanovena byla mrazuvzdornost listů, přesněji listových segmentů v kryostatu a vyhodnocení proběhlo pomocí konduktometrie. Při porovnání hodnot LT50 u šestidenních klíčenců nebyla mrazuvzdornost výrazně modifikována napadením.

2.5.6 Stanovení ABA Pro stanovení ABA je možné použít celou řadu kvantifikačních metod. Stanovena může být přímo ABA, její prekurzory, případně metabolity. Metody vhodné pro stanovení jsou vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (kapalinová chromatografie-electrospray/tandem mass spectrometry (Gómez-Cadenas, 2001), plynová chromatografie (Okamoto, 2009), RIA(radioimmunoassay) (Quarrie et al., 1988). Rozmezí stanoveného množství metodou RIA bylo od 0,04 pmol do 48 pmol (Le Page-Degivry, 1984). Kvantifikace ABA je prováděna také metodou ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Modifikaci ELISA kvantifikace uvádí Label et al.(1994). Postup stanovení ABA metodou ELISA bez použití tenkovrstvé chromatografie vypracoval a uveřejnil Asch (2000). Byly použity i metody využívající odporový imunosenzor o-fenylendiamin s modifikovanou zlatou elektrodou (Li et al., 2010). Spektrometrické metody pro kvantifikaci ABA popsali Duffield a Netting (2001). ABA se vyskytuje v rostlinách ve velmi nízkých koncentracích a její molekula není nijak velká. To vše je třeba zohlednit při detekci a kvantifikaci ABA. Podle literárních zdrojů je extrakce ABA do vody stejně účinná jako použití etanolu či acetonu (Quarrie et al., 1988). Molární hmotnost je 264,32 g/mol. Z popsaných vědeckých výzkumů vyplývá, že pro interpretaci výsledků měření je třeba vymezit poměrně přesně podmínky, kterým jsou sledované rostliny vystaveny. Je nutné definovat i podmínky pro odběr analyzovaných vzorků. Například Zeevaart (1980) použil při sledování hladiny ABA odstřižené listové čepele. Eliminoval tak změny v hladině ABA o složku, která je způsobená transportem ABA v rostlině a zjišťoval schopnost syntézy a degradace ABA v listech. V tomto systému je snížení obsahu ABA uskutečněno formováním jednoho nebo více ABA metabolitů. Navození stresu sucha se simuluje vysoušením listů proudícím vzduchem. Tento postup uvádí Quarrie a Henson (1981). Postup, který vede

41

k nárůstu ABA, je spojen s inkubací listů, autoři ho označují zkratkou DLT (detached leaf test). Významným faktorem je čas, ve kterém je veličina sledována. Proto je přesnější termín změna hladiny ABA, jak se vyskytuje v některých literárních zdrojích. Účinek ABA na rostlinu, případně obsah ABA bývá sledován v různých částech rostlin. Například růst postranních kořínků a prodlužovaní ve vztahu k ABA studovali na odstřižených koříncích rajčat v podmínkách in vitro Hooker a Thorpe (1998). Jiným typem sledování je kvantifikace ABA v odstřižených listech (spolu se sledováním fyziologických změn jako je turgor), měřenými veličinami může být vodní potenciál nebo turgorový tlak (p) (Pierce a Raschke, 1980). Vyjádření množství ABA je pak vztaženo na jednotku čerstvé hmoty, na jednotku sušiny nebo je uvedeno v molech, případně gramech.

2.5.7 ABA a fytohormony Účinnost fytohormonů závisí na jejich obsahu, aktivitě a vzájemných interakcích. Vodní stres spouští změny hladin jednotlivých hormonů, zahrnující nárůst obsahu ABA v listech, možné snížení obsahu cytokininů, auxinů a giberelinů. Odpovědi rostlin na změnu hladin fytohormonů mohou být posuzovány podle jejich odezvy na exogenně aplikované přírodní nebo syntetické fytohormony. Avšak sledujeme-li rekci rostlin po aplikaci fytohormonu, je vždy nutné mít na paměti, že aplikované látky mohou změnit obsah endogenních fytohormonů jejich přijetím, podpořením biosyntézy endogenního fytohormonu nebo stimulací jejich degradace. Další komplikace může způsobit fakt, že aplikace jednoho fytohormonu může stimulovat nebo inhibovat syntézu jiných. Dobře jsou známy interakce mezi auxiny a cytokininy a také odezva rostliny na aplikaci exogenního hormonu nemusí nutně znamenat, že endogenní hormon je zapojen v přirozené regulaci systému. Nejpravděpodobněji působí na zmírnění účinků ABA cytokininy a auxiny a pro stimulaci ABA jsou to kyselina jasmonová a methyl ester kyseliny jasmonové. Kromě toho hrají rostlinné hormony svou roli v přeměně signálů během stresové reakce (Pospíšilová, 2003). Goh et al. (2009) sledovali u rostliny huseníku vztah mezi ABA a kyselinou giberelovou v procesu otvírání stomat jako reakci na světlo. Jejich výsledky s využitím sledování exprese genů jasně ukazují, že kyselina giberelová GA3 reguluje ABA-indukovanou inhibici otvírání průduchů jako odezvu na světlo.

2.5.8 ABA aktuálně Využití ABA v praxi bránila její citlivost na světlo, která se rychle mění v inaktivní formu a vysoké výrobní náklady. To platilo do roku 2009, kdy se na trhu objevil první prostředek, 42

jehož součástí je S-ABA. Další možností je vytvoření syntetické látky s obdobnými vlastnostmi signální molekuly jako ABA. Aktuálně se jeví slibně látka pyrabactin na jejímž zdokonalení pracuje spolu s kolegy Sean Cutler (2010). V roce 2009 zveřejnili Kang et al. (2009) informace o identifikaci transportéru ABA přes plazmatickou membránu. Následovaly další publikace. V současné době je snaha o aktivní úpravu ABA signální dráhy. Tedy ABA je základní zdroj informací, který je třeba zmapovat, poznat a porozumět mu a podle něj lze vytvořit určité specificky fungující látky, případně upravit rostliny, aby s látkou pracovaly.

2.6 Metody pro navození stresu sucha Navodit stres sucha lze několika způsoby. V zásadě můžeme snížit dostupnost, příjem vody anebo zvýšit výdej vody rostlinou. Technicky nejjednodušším je omezení zálivky (je vhodné definovat půdní podmínky a k nim úroveň zálivky). V polních podmínkách bývá suchá varianta zastřešena nebo je vybrána lokalita s propustnější půdou (Bahrun et al., 2002; Asch et al., 2009). Lze využít vysoušení rostlin nebo jejich částí. Další možností je ovlivnit hospodaření s vodou samotnou rostlinou. V laboratorních podmínkách může být použita chemická látka PEG (polyetylenglykol). Potíže může působit pěstování rostlin v roztoku po delší dobu, stanovení koncentrace a zajištění přiměřeného provzdušnění roztoku. Někteří experimentátoři využívají regulace otevřenosti průduchů, tedy ovlivnění ztrát vody z rostliny, například aplikací exogenní ABA.

2.7 Metody pro navození stresu nízké teploty Jelikož se v klimatických podmínkách ČR nízké teploty běžně vyskytují a měření teplot je poměrně přesně definováno, můžeme je využít a takový experiment je nejméně energeticky náročný. Ve všech ostatních případech je nutné použít chladící zařízení a to v komůrkách, menších či rozměrnějších boxech a komorách. Pro krátkodobé snížení může stačit chlazení ledem.

43

3 Materiál a metody 3.1 Příprava rostlinných materiálů a organizace pokusů Pokusy navozující stres sucha snížením obsahu vody v půdě Pokusy byly provedeny ve VÚRV, v.v.i. Pro všechny pokusy byla společná metodika klíčení a vysazování klíčenců dále popsaným způsobem. Obilky pšenic a ječmenů byly uloženy na klíčidle (plastové destičky s průhledným plastovým víkem, na kterých byly položeny označené polystyrenové destičky ovinuté filtračním papírem pokropeným a plovoucím na 1 mm vrstvičce destilované vody). Klíčidlo bylo umístěno po dobu 48 hod. do boxu s termostatem při 21-24°C. Po vyklíčení byly vysazeny do půdní směsi. Počet rostlin v květináči byl určen podle velikosti květináče a doby, do které byly rostliny pěstovány. Půdní směs pro pokusy se suchem byla tvořena šesti díly zeminy, dvěma díly prosátého půdního substrátu a jedním dílem písku. V pokusech zaměřených na sucho byla nejprve stanovena hodnota plného nasycení půdy (PNP) a vůči této hodnotě byla určena zálivka. Pro stanovení hodnoty plného nasycení půdy byla zjištěna hmotnost válečku se vzorkem půdy plně nasyceným vodou a hmotnosti suché půdy vysušené do konstantní hmotnosti při teplotě 105°C). Byla vypočtena hodnota zálivky na požadovanou úroveň pro konkrétní hmotnost půdy. Limitní práh nasycení substrátu suché varianty byl určen na základě stanovení bodu vadnutí, který vymezuje dolní mez vody v půdě využitelné rostlinami. Bod vadnutí byl stanoven podle Váši (Valla et al., 2002), za takových podmínek jsou rostliny nedostatečně zásobeny vodou a trvale vadnou. Pro sledování vlivu krátkodobého sucha na hladinu ABA u dvou odrůd ječmene (Amulet a Tadmor) byla v kontrolní variantě stanovena zálivka na 79 % PNP a konečná hodnota suché varianty na rozmezí 21-24 % PNP. Květináče byly naplněny půdou o hmotnosti 3900 g a známé vlhkosti. Aktuální vlhkost byla stanovena vysušením přesné navážky vzorku půdy do konstantní hmotnosti při 105°C. Rozměry květináčů byly 24,5 cm horní průměr, 13,5 cm průměr podstavy, výška květináče 20 cm. Klíčenci byli vysazeni do květináčů. V klimatizované komoře byla intenzita světla 350 µmol·m-2·sec-1, nastavena fotoperioda: 14 hod. světlo/10 hod. tma, teplota 25ºC/20ºC den/noc. Během pokusů byl obsah vody v půdě stanovován vážením květináčů s rostlinami (od zjištěné hmotnosti byla odečtena hmotnost květináče a suché půdy v květináči), rostliny byly pak zality nebo ponechány bez zálivky tak, aby obsah vody v půdě odpovídal naplánovanému pokusu. Listové pletivo pro všechny analýzy bylo odebíráno z druhého plně vyvinutého listu. Bezprostředně po odběru byl stanoven vodní sytostní deficit (vsd) podle Čatského et al. (1965). Vzorky pro stanovení osmotického

44

potenciálu a obsahu ABA byly po zvážení zamraženy v tekutém dusíku a uchovány při teplotě -40°C. Pletivo listů, uzlů a kořenů pro izotopové analýzy bylo po odebrání vysušeno při 80°C do konstantní hmotnosti a uchováváno v uzavřených plastových zkumavkách. Byl stanoven obsah vody v listech, uzlech a kořenech rostlin. V pokusu zaměřeném na déletrvající sucho byla hodnota obsahu vody v půdě kontrolní varianty pro Amulet, Akcent, Malz a Tadmor stanovena na 60 % PNP a pro suchou variantu byla stanovena na 21-24 % PNP. Do každého květináče bylo odváženo 3 400 g zeminy. Hmotnostní vlhkost půdy byla monitorována gravimetrickou metodou a udržována na 48 % PNP až do stádia 2. listu. Následovala diferenciace kontrolní 60% PNP a suché varianty. Rostliny ječmene byly pěstovány v regulovaných podmínkách skleníku za teploty 20ºC/18ºC den/noc, při fotoperiodě 16 hod světlo/8 hod tma. Po odebrání vzorků listových čepelí byl stanoven vodní sytostní deficit (vsd). Pletivo pro následné analýzy dehydrinů a stanovení osmotického potenciálu, též pro kvantifikaci ABA bylo zváženo a zmraženo v tekutém dusíku a vzorky byly uchovávány při -80°C. Pro stanovení izotopu uhlíku byly vzorky vysušeny a uchovány v uzavřených zkumavkách. Listové pletivo pro všechny analýzy bylo odebíráno ze čtvrtého plně vyvinutého listu.

3.1.1 Pokusy navozující stres sucha snížením hydratace pletiv (vysušení odstřižených listů – DLT detached leaf test) Listy byly po odstřižení uloženy do mikrotenového sáčku a následně zváženy pro zjištění čerstvé hmotnosti. Dalším krokem bylo vysoušení listů proudícím vzduchem. Listy visely na konstrukci s gumovými kolíčky tak, aby mohly rovnoměrně vysychat. Po dosažení redukce čerstvé hmotnosti o 10 % a zaznamenání hmotnosti, následovala inkubace listových čepelí vložených do skleněných zkumavek o objemu 16 ml. Do zkumavky bylo zároveň nutné vložit i filtrační papír o velikosti cca 4 x 4 mm, který byl ovlhčený destilovanou vodou (na 0,5 g čhm přidat 5 µl vody), označená zkumavka byla uzavřena parafínovou fólií, aby nedošlo k úniku vodních par. Po dobu inkubace byla zkumavka uložena v temnu při laboratorní teplotě. Při inkubaci byly navozeny takové podmínky, aby nedocházelo k výrazným změnám v hmotnosti listu (max. 5 %). Aby se minimalizovala chyba vzniklá změnou hmotnosti, proběhlo vážení a zavření zkumavek co nejrychleji. Další vzorky byly vysoušeny vzduchem na 90 % čerstvé hmotnosti a inkubovány ve zkumavkách 4 hodiny ve tmě při teplotě 21°C bez dalšího snížení hmotnosti, což bylo zkontrolováno vážením, následně byly fixovány v tekutém dusíku.

45

3.1.1.1 Sledování vlivu poškození listů sáním mšic s infikací virem BYDV Byly použity dihaploidní (DH) linie ječmene odvozené z křížení náchylné odrůdy Igri s odolnou odrůdou Atlas 68, nositelkou genu rezistence Yd2. Pro pokusy byla vybrána náchylná DH linie 075 (bez genu rezistence Yd2) a odolná DH linie 08 (s genem rezistence Yd2). Rostliny byly pěstovány v regulovaných podmínkách (den 12 hod., 19°C / noc 12 hod., 12°C). Ve fázi plně vyvinutého druhého listu byly rostliny infikovány pomocí mšic Rhopalosiphum padi (15-20 mšic na rostlinu), které před inokulací prodělaly po dobu 24 hodin akviziční sání na zdrojích infekce. Rostliny byly individuálně zaizolovány skleněným válcem překrytým silonovou tkaninou. Některé rostliny byly ponechány bez infekce jako kontrola. Inokulační sání bylo po 3 dnech ukončeno postřikem insekticidu Pirimor. Rostlinný materiál byl po ukončení inokulačního sání odebírán v třídenních intervalech. Rostliny byly dostatečně zalévány, listy pro analýzu ABA byly odebírány hodinu před ukončením tmavé periody. Po zvážení (0,5 g čhm) byly listy fixovány v tekutém dusíku. Pokus byl dvakrát zopakován. Byl stanoven obsah viru v listech a kořenech, obsah ABA v listech. Pokus byl proveden ve spolupráci s L. Širlovou, která také analyzovala obsah viru v listech a kořenech. 3.1.1.2 Pokusy navozující stav dlouhodobého sucha sezóna 2008/2009 – venkovní nádobové pokusy pod přístřeškem Pokusy byly prováděny v rámci společného projektu s MZLU v Brně v areálu univerzity. L. Holková a L. Melišová provedly pěstování rostlin a odběry vzorků pro analýzy. Pšenice byly vysety na podzim 2008, každá odrůda do 6 nádob o objemu cca 5 l zeminy (po 9 rostlinách). Rostliny přezimovaly za přírodních podmínek na pozemku MZLU v Brně. 24. 4. 2009 byly přeneseny pod zahradní přístřešek a od tohoto data byl zahájen režim regulované zálivky. Polovina nádob byla udržována za optimální zálivky (75 % plného nasycení půdy) a druhá polovina byla pěstována v režimu omezené zálivky (30 % plného nasycení půdy). Oba režimy byly udržovány dále do konce vegetace. Pro stanovení obsahu ABA byly odebírány nejmladší plně vyvinuté listy. V pokusu byly pěstovány rostliny šesti odrůd pšenice: Alacris, Etela, Hedvika, Meritto, Mulan a Venistar. Ječmeny byly vysety na jaře 2009 (9. 4. 2009). Stejně jako u pšenic byla každá odrůda vyseta do 6 nádob o objemu cca 5 l zeminy (po 9 rostlinách), avšak nádoby s ječmeny byly ihned umístěny pod zahradní přístřešek. Z počátku byla v celé části experimentu udržována zálivka na 75 % plného nasycení půdy. Po čtyřech týdnech byl u poloviny nádob s ječmeny zaveden režim omezené zálivky (30 % plného nasycení půdy) a udržován až do konce

46

vegetace. Ostatní podmínky zůstaly závislé na aktuálním počasí (délka dne, teplota, vlhkost vzduchu). Byly pěstovány rostliny šesti odrůd ječmene: Amulet, Bojos, Er, Jersey, Malz a Tadmor. V pěti termínech (viz. tab. 1 a tab. 2) v závislosti na době trvání omezené zálivky a růstové fázi rostlin byly z každé nádoby odebírány směsné vzorky listů pro analýzy. Pro stanovení obsahu ABA byly odebírány nejmladší plně vyvinuté listy. Tab. 1 Termíny odběrů vzorků pro analýzy – odrůdy pšenice. Pšenice Datum odběru

Doba sucha [dny]

Růstová fáze

30.4.2009

4

sloupkování

7.5.2009

11

zduření listové pochvy

14.5.2009

18

začátek kvetení

21.5.2009

25

začátek metání

4.6.2009

39

začátek zrání

Tab. 2 Termíny odběrů vzorků pro analýzy – odrůdy ječmene. Ječmen Datum odběru

Doba sucha [dny]

Růstová fáze

12.5.2009

3

konec odnožování

15.5.2009

6

sloupkování

22.5.2009

13

metání

4.6.2009

26

začátek kvetení

19.6.2009

41

zrání

3.1.1.3 Pokusy navozující stav dlouhodobého sucha sezóna 2009/2010 – venkovní nádobové pokusy pod přístřeškem Pšenice byly vysety na podzim 2009 (12.10.), každá odrůda do 6 nádob o objemu cca 10 l zeminy (po 9 rostlinách). Přezimovaly za přírodních podmínek na pozemku MZLU v Brně. Od 18. 4. 2010 byl zahájen režim regulované zálivky. Polovina nádob byla udržována za optimální zálivky (75 % plného nasycení půdy) a druhá polovina byla pěstována v režimu omezené zálivky (30 % plného nasycení půdy). Oba režimy byly udržovány až do konce vegetace. Byly pěstovány rostliny šesti odrůd pšenice: Alacris, Etela, Hedvika, Meritto, Mulan a Venistar. Ječmeny byly vysety na jaře 2010 (9. 4.). Každá odrůda byla vyseta do 6 nádob o objemu cca 7 l zeminy (po 9 rostlinách), které byly umístěny pod zahradní přístřešek. Vzhledem k slabému vernalizačnímu požadavku odrůdy Tadmor byla semena před vysetím vystavena teplotě 4 °C. Z počátku byla u všech nádob udržována zálivka na 75 % plného nasycení půdy. Po čtyřech týdnech byl u poloviny nádob zaveden režim omezené zálivky (30 % plného 47

nasycení půdy) a udržován až do konce vegetace. Ostatní podmínky zůstaly závislé na ročním období a aktuálním počasí (délka dne, teplota, vlhkost vzduchu). Byly pěstovány rostliny šesti odrůd ječmene: Amulet, Bojos, Jersey, Malz, Radegast a Tadmor. V pěti termínech (viz. tab. 3 a tab. 4) v závislosti na době trvání omezené zálivky a růstové fázi rostlin byly z každé nádoby odebírány směsné vzorky listů. Tab. 3 Termíny odběrů vzorků pro analýzy – odrůdy pšenice. Pšenice Datum odběru Doba sucha [dny]

Růstová fáze

23.4.2010

2

počátek sloupkování

30.4.2010

12

sloupkování

7.5.2010

19

sloupkování

14.5.2010

26

praporcový list vyvinut

28.5.2010

40

metání

Tab. 4 Termíny odběrů vzorků pro analýzy – odrůdy ječmene. Ječmen Datum odběru

Doba sucha [dny]

Růstová fáze

14.5.2010

7

počátek sloupkování

21.5.2010

14

sloupkování

28.5.2010

21

sloupkování

11.6.2010

35

konec kvetení

V obou letech byly zaznamenány i minimální a maximální teploty, průměrná vlhkost vzduchu, množství srážek. Hodnoty jsou uvedeny v příloze č. 1 a 2.

3.1.2 Pokusy zaměřené na působení vlivu nízkých teplot a dehydratace pletiv (aklimatizační proces a DLT) 3.1.2.1 Působení nízkých teplot během aklimatizace Pokusy byly provedeny v klimatizovaných komorách VÚRV, v.v.i. v Praze Ruzyni. Půdní směs byla tvořena čtyřmi díly zeminy a třemi díly prosátého zahradnického kompostu s vysokým podílem organických látek a přídavkem dolomitického vápence od firmy AGRO CS, a.s. Podmínky pro klíčení jsou popsány výše viz. pokusy zaměřené na sucho. Klíčenci byli vysazeni do květináčů (9,5 x 9,5 cm á 13 semen) a rostliny pěstovány v klimatizované komoře při dostatečné zálivce a teplotě 16°C (12 hodin fotoperioda) po dobu tří týdnů, další dva týdny byla teplota nastavena na den +3°C / noc 0°C, světlo 8 hodin a při třetí fázi den +3°C / noc -3°C.

48

Vysoušení odstřižených listů DLT (detached-leaf drought test) viz. kap. 3.1.1 Pokusy navozující stres sucha snížením hydratace pletiv - vysušením odstřižených listů. K procesu otužování (aklimatizační proces v regulovaných podmínkách při teplotách den/noc: 16°C/16°C, 3°C/0°C, 3°C/-3°C) byla přiřazena kombinace podmínek sucha DLT. Byly použity odstřižené listové čepele druhého plně vyvinutého listu na konci každé z aklimatizačních fází. Listy pro analýzu ABA byly odebírány na konci každé ze tří fází, hodinu před ukončením tmavé periody. Po zvážení (0,5 g čerstvé hmotnosti) byly kontrolní vzorky fixovány v tekutém dusíku. Ostatní vzorky listových čepelí byly zpracovány dále popsaným způsobem. Pro analýzy bylo pěstováno sedm odrůd pšenice: Samanta, Bill, Šárka, Zdar, Sandra, Mironovská 808, Leguan. Tab. 5 Fáze aklimatizace. Fáze aklimatizace Počet týdnů 0 1 2

3 2 2

Teplota (den/noc) [ºC] 16/16 +3/0 +3/-3

3.1.3 Nízké teploty 3.1.3.1 Působení jarovizačních teplot a pozdní nízké teploty v době metání Podmínky pro klíčení jsou popsány výše viz. pokusy zaměřené na sucho. Klíčenci byli vysazeni do květináčů (9,5 x 9,5 cm po jedné rostlině na květináč, půdní směs byla tvořena čtyřmi díly zeminy a třemi díly prosátého zahradnického kompostu s vysokým podílem organických látek a přídavkem dolomitického vápence od firmy AGRO CS, a.s. Pro každou variantu byla provedena tři opakování. Kontrolní varianta bez jarovizace byla od počátku pěstována při teplotě 18°C, ostatní varianty byly vystaveny jarovizační teplotě v klimatizované komoře po určenou různě dlouhou dobu (doba jarovizace byla 2–8 týdnů) a následně byly rostliny pěstovány spolu s kontrolami do počátku metání. Na počátku metání byly vzorky postupně, tak jak fáze nastala, umístěny opět do klimatizované komory a vystaveny teplotám 3-5°C po dobu 24 hod. V té době byla zjištěna doba do metání, počet listů, počet odnoží, hmotnost praporcového listu a druhého nejmladšího listu pod praporcovým, odebrán vzorek pro zjištění osmotického potenciálu z třetího nejmladšího listu a byla provedena kvantifikace ABA (směsný vzorek z praporcového a druhého nejmladšího listu). Bylo pěstováno šest odrůd pšenice: Tercie, Trappe, Brawura, Seance, Septima, Sandra.

49

3.2 Měřené charakteristiky 3.2.1 Definice charakteristik 

Obsah ABA. Kvantitativní stanovení obsahu endogenní ABA.



Vodní sytostní deficit (vsd). Poprvé ho zavedl Stocker (1928). Jedná se o kvantitativní hodnotu, která je vyjádřitelná absolutním množstvím vody, které rostlině nebo její části chybí do plného nasycení. Rozdíl mezi obsahem vody v rostlině v daném okamžiku a obsahem vody při maximálním nasycení (maximální turgescenci) vyjádřený v procentech maximálního obsahu vody.



Osmotický potenciál. Osmotický potenciál buňky je tlak, pod nímž do cytoplazmy přes cytoplazmatickou membránu vniká čistá voda. Je tím vyšší, čím je vyšší koncentrace osmoticky aktivních látek v buňce. Jedná se o zápornou hodnotu osmotického tlaku. Je závislý na teplotě a koncentraci roztoku.



Plné nasycení půdy vodou. Maximální množství vody, kterou dokáže konkrétní půda zadržet.



Obsah dehydrinů. Mezi ochranné proteiny indukované stresem spojeným s dehydratací pletiv se řadí proteiny skupiny LEA (Late Embryogenesis Abundant). Mezi tyto proteiny patří i dehydriny (DHNs). Do dnešní doby bylo v genomu ječmene (Hordeum vulgare) identifikováno 13 dehydrinových genů, přičemž 9 z nich je popisováno jako indukovaných suchem. V práci byla provedena kvantifikace DHN5. Jedná se o protein kódovaný genem Dhn5 zjištěném na chromozomu 6H, jehož exprese je v literatuře popisována jako chladem indukovaná.



Diskriminace uhlíku

13

C. Při fotosyntetické fixaci uhlíku C3 rostliny diskriminují těžší

z obou přirozeně se vyskytujících stabilních izotopů uhlíku, 13C, a ochotněji přijímají CO2 s lehčím uhlíkem

12

C. V těle rostlin je proto izotopový poměr

13

C/12C nižší než v okolní

atmosféře. 

Ztráta vody z listů. Úbytek množství vody za čas.

3.2.2 Stanovení charakteristik Veškerá získaná data byla zpracována v programech EXCEL a STATISTICA CZ verze 9. 

Stanovení obsahu ABA metodou ELISA podle Folkarda Asche Příprava vzorků Vzorky listových čepelí o známé hmotnosti jsou fixovány v tekutém dusíku a takto mohou být při teplotě -70°C uchovány po dobu několika měsíců. Následně jsou vzorky rozetřeny v tekutém dusíku s přídavkem mořského písku a převedeny do zkumavek s destilovanou

50

vodou (5 ml vody/0,5 g vzorku). Dalším krokem je umístění vzorků na dobu 16 hodin na třepačku při teplotě 4°C. Následuje centrifugace (5000 otáček po dobu 25 min.). Supernatant je odebrán pipetou do zkumavek a znovu zamražen při teplotě -20°C. Připravené homogenáty se vloží do mrazícího boxu s teplotou -20ºC. Po prvním týdnu jsou vzorky z mrazícího boxu vyndány a krátce rozmraženy, aby přešly do tekutého stavu a opět zamraženy. Je opakováno po dalším týdnu. Celkem jsou v tomto mrazícím boxu vzorky na dobu 2-3 týdnů, následuje centrifugace pro odstranění karotenoidů a takto upravený vzorek může být uchováván při teplotě -20°C do doby analýzy. Pro vlastní kvantifikaci je použito 100 µl vzorku ve třech opakováních. Vlastní analýza – stručný popis Na mikrotitrační destičku je nanesen roztok obsahující proteinový nosič a antigen (ABA4-BSA konjugát). Ten je ponechán na destičce po dobu 16 hodin při 4ºC. Destička je třikrát promyta promývacím pufrem a na volná místa na stěně destičky je během inkubace po dobu 20 min. při teplotě 37ºC navázán BSA. V dalším kroku jsou do jamek aplikovány standardy ABA a vzorky spolu s roztokem protilátky MAC 252. Antigen obsažený ve vzorku a antigen vázaný na stěnách jamek soutěží o omezené množství primární protilátky. Destička je inkubována po dobu 3 hod. při teplotě 4ºC. Množství protilátky v poměru ke koncentraci antigenu ve vzorku se váže na stěny jamek a je označeno v průběhu dalšího kroku sekundární protilátkou nesoucí enzym. Prakticky je po opakovaném promytí destičky promývacím pufrem nanesen roztok obsahující sekundární protilátku molekuly AntiRat IGg. Destička je inkubována po dobu jedné hodiny při teplotě 37ºC. V posledním kroku je po promytí destičky pufrem přidán substrát pnitrofenylfosfát. Enzym reaguje se substrátem za vzniku barevného produktu. Intenzita zbarvení je měřena extinkčním fotometrem. Reakce je ukončena při dosažení maximální hodnoty 1,0 pro kontrolní vzorek vody. Měření probíhá při vlnové délce 405 nm. Naměřené hodnoty jsou dále zpracovány. Z hodnot pro standardní vzorky je vypočtena rovnice charakterizující kalibrační křivku. Koncentrace je dále upravena podle vstupní hmotnosti vzorku a použitého objemu vody. Podrobný popis metody uvádí Asch (2000). 

Vodní sytostní deficit. Odstřižené vzorky listových čepelí byly ostrým skalpelem seříznuty na mikroskopickém sklíčku na segmenty o délce 1 cm. Segmenty byly po zvážení umístěny do sytících komůrek, vyříznutých v polyuretanové destičce plně nasycené vodou, následně překryté vlhčeným filtračním papírem. Vše bylo uloženo na plastové destičce a přikryto víkem. V určených časových intervalech byly vzorky zváženy. Po ukončení sycení byly vzorky vysušeny do konstantní hmotnosti při 95°C. Ze 51

zjištěných hmotností byla vypočtena hodnota vsd v procentech. Sycení bylo provedeno i s celými listy, které byly vloženy do odměrného válce s vrstvou vody a překryty mikrotenovým sáčkem přetaženým gumičkou. vsd =

2 × váha po 3 hod. nasycení – váha po 6 hod. nasycení – počáteční váha 2 × váha po 3 hod. nasycení – váha po 6 hod. nasycení – váha sušiny

· 100

Vzorec byl získán úpravou Stockerova vzorce (Čatský, 1965). 

Osmotický potenciál. Vzorky listových čepelí byly vloženy do sterilních plastových stříkaček o objemu 2 ml (vhodných do tekutého dusíku), píst lehce stlačen a otvor byl překryt parafínovým čtverečkem. Pro manipulaci bylo vhodné použít plastové rukavice. Vzorek byl označen a fixován v tekutém dusíku. Vlastní analýza byla prováděna na přístroji Vapro firmy Wescor. Po rozmražení vzorku byl odstraněn parafín a tlakem na píst byla do zkumavky vytlačena tekutina pro vlastní analýzu. Po vytemperování přístroje a vzorku byly změřeny hodnoty osmolality, která byla přepočtena podle van't Hoffovy rovnice po vynásobením koeficientem (-0,00227) na hodnotu osmotického potenciálu.



Plné nasycení půdy vodou. Byla zvážena prázdná nádoba. Nádoba s otvorem na dně byla naplněna konkrétní směsí půdního substrátu, postavena do nižší nádoby naplněné vodou a zalita seshora. Takto byla směs sycena vodou až nepohlcovala další vodu, pak byla nádoba se směsí odstavena a nechána okapat a ve chvíli, kdy byla po opakovaném postavení na filtračním papíře skvrna odpovídající velikosti otvoru na dně nádoby, byla nádoba se směsí zvážena. V dalším kroku byla směs vysušena do konstantní hmotnosti a zjištěna váha sušiny. Hodnota PNP byla vypočtena: Hmotnost vody = hmotnost po nasycení – hmotnost sušiny – hmotnost květináče Takto vypočtená hmotnost představuje 100 % PNP.



Obsah dehydrinů. Byly provedeny analýzy akumulace dehydrinů na SDS-PAGE a Western blotu s pomocí primární protilátky, která se specificky váže na K-segment dehydrinů. Analýzy provedl Z. Škodáček.



Diskriminace uhlíku 13C. ∆13C se definuje jako “přesah” izotopového efektu Ra/Rp přes jedničku, nebo jako rozdíl izotopového poměru uhlíku ve vzduchu a v rostlině (Ra – Rp) vztažený relativně k poměru ve vzduchu Ra. Výsledkem je malé kladné bezrozměrné číslo, které z praktických důvodů násobíme tisícem a vyjadřujeme jako počet jednotek z tisíce, tedy promile (‰, aby výsledek byl v celých číslech): 

R  ∆13C =  a − 1 ⋅ 1000 R   p 

52

Měření se provádí izotopovým poměrovým hmotovým spektrometrem (isotope ratio mass spectrometer – IRMS) po převedení na plynný CO2 (spálením). Analýza byla realizována formou služby ve VÚRV, v.v.i.



Ztráta vody z listů. Listy pocházely z rostliny pěstované při teplotě 16˚C. Listy byly odebrány ve fázi plně vyvinutého třetího listu. Po odstřižení byly listy označeny a zváženy, vysychaly za laboratorní teploty, volně položené na mřížce. Byl zaznamenán čas a hmotnost během vysychání.

3.3 Použitý rostlinný materiál Tab. 6 Vybraný rostlinný materiál analyzovaný v pokusech a jeho charakteristika. Druh/ Forma

Název odrůdy

pšenice / ozimá

Alacris

pšenice / ozimá

Bill

pšenice / jarní

Brawura

pšenice / ozimá

Etela

pšenice / ozimá

Hedvika

pšenice / jarní

Leguan

Původ odrůdy

Stručná charakteristika

Zdroj

Raná, odolnost k vyzimování střední až vyšší, střední až vyšší odolnost Slovenská www.legusem. vůči poléhání, vysoká odolnost republika sk k suchu, rodičovské odrůdy Hana a Zerda. Polopozdní až pozdní s chlebovou B jakostí, nízký až středně vysoký výnos, náchylná k vyzimování, Německo Rostliny nízké, velmi dobře SDO 2006 odnožující, zrno středně velké, odolná proti napadení rzí pšenice, menší odolnost proti porůstání zrna. Středně raná odrůda kvalitní A jakosti se středně vysokým výnosem zrna. Rostliny vysoké, středně Polsko SDO 2010 odnožující, zrno velké. Menší odolnost proti napadení listovými skvrnitostmi, odolná proti porůstání. Polopozdní-pozdní nevhodná pro Česká pekařské využití. Rostliny středně SDO 2009 republika vysoké, středně a méně odnožující, zrno je velké. Pozdní odrůda chlebové B jakosti se středně vysokým až vysokým Nizozemí výnosem. Rostliny středně vysoké, SDO 2009 středně odnožující, zrno středně velké. Výnosná poloraná odrůda s doplňkovou pekařskou jakostí B, velmi dobrá odolnost proti porůstání Česká zrna v klasech, dobrá úroveň www.selgen.cz republika odolnosti proti souboru chorob, střední odolnost k poléhání, registrovaná i v zemích EU.

Stupeň zimovzdornosti

-

2-3

-

4

6

1

53

Druh/ Forma

pšenice / ozimá

Název odrůdy

Meritto

pšenice Mironovská / 808 ozimá

Původ odrůdy

Stručná charakteristika

Zdroj

Stupeň zimovzdornosti

Česká republika

Rostliny vysoké, středně odnožující, zrno je středně velké. Mrazuvzdornost, menší odolnost proti poléhání, napadení padlím travním na listu, listovými skvrnitostmi a rzí pšeničnou, náchylnost k napadení plísní sněžnou, nízký obsah dusíkatých látek, nízká úroveň čísla poklesu.

SDO 2009

7

Ukrajina

Mrazuvzdorná, s dlouhou jarovizací.

pšenice / ozimá

Mulan

Německo

pšenice / ozimá

Samanta

Česká republika

pšenice / jarní

Sandra

Česká republika

pšenice / jarní

Seance

Česká republika

pšenice / jarní

Septima

Česká republika

pšenice / ozimá

Šárka

Česká republika

Polopozdní kvalitní jakosti s vysokým až velmi vysokým výnosem zrna, rostliny středně vysoké, velmi dobře odnožující, zrno středně velké. Odolná proti napadení braničnatkou plevovou v klasu, středně odolná proti napadení plísní sněžnou a vymrzání. Nízká hodnota čísla poklesu. Poloraná, odolná proti vymrzání, odrůda použita jako standard pro určení doby metání, zralosti. Rostliny středně vysoké, středně odnožující, zrno středně velké Poloraná odrůda středního až nižšího vzrůstu. Předností odrůdy je vysoká stabilita výnosu. Pěstitelská rizika představují náchylnost k napadení padlím travním na listu a citlivost na poléhání v intenzivních podmínkách. Poloraná odrůda. Rostliny středně vysoké až nízké, středně odnožující, zrno středně velké, odolnost proti napadení padlím travním na listu a v klasu. Menší odolnost proti poléhání a napadení rzí pšeničnou. Středně raná odrůda kvalitní A jakosti s vysokým výnosem zrna v neošetřené variantě pěstování. Rostliny nízké, méně odnožující, zrno malé. Poloraná odrůda vysoké krmné hodnoty, vysoké výnosy zrna, kratší stéblo s dobrou odolností proti poléhání, středně odolná rzi pšeničné, dobře odolná většině chorob, vysoká HTZ, střední odolnost proti porůstání a střední mrazuvzdornost.

8

SDO 2009

4-5

SDO 2009

8

http://www.agr oweb.cz/Odru dova-skladbajarnipsenice__s44x 8815.html

1

SDO 2009

-

SDO 2009

-

www.selgen.cz

6

54

Druh/ Forma

Název odrůdy

Původ odrůdy

Stručná charakteristika

Poloraná odrůda A jakosti s vysokým výnosem zrna, plastická odrůda. Rostliny nízké, středně Česká odnožující, zrno malé. Odolnost proti SDO 2009 republika napadení padlím travním na listu a v klasu. Menší odolnost proti napadení rzí pšeničnou. Pozdní odrůda chlebové B jakosti s vysokým až velmi vysokým Německo výnosem zrna. Rostliny středně SDO 2010 vysoké, dobře odnožující, zrno středně velké. Raná, vyšlechtěná z křížení Blava a Barbara. Rostliny středně vysoké, Slovenská středně vysoká odnožovací www.legusem. republika schopnost, vysoká odolnost sk k poléhání, vysoká suchovzdornost, vysoká úrodová stabilita. Vyšší vzrůst, s větší odnožovací http://www.agr Česká schopností a agresivitou vůči omass.cz/?pa republika plevelům, odolná proti houbám a geId=312 vymrzání. Pro fytomasu. Sladovnický ječmen, polopozdní, nízkého typu s dobrou odolností Česká proti poléhání a lámání stébel. Velmi LPO 1992 republika dobrý zdravotní stav a vysoká sladovnická kvalita. Poloraná odrůda nízkého typu, zrno velké, výtěžnost předního zrna Česká vysoká, odolnost proti poléhání, SDO 1998 republika vysoký výnos a podíl předního zrna v podmínkách trvalých přísušků.

pšenice / jarní

Tercie

pšenice / jarní

Trappe

pšenice / ozimá

Venistar

pšenice / ozimá

Zdar

ječmen / jarní

Akcent

ječmen / jarní

Amulet

ječmen / jarní

Atlas 68

USA

ječmen / jarní

Bojos

Česká republika

ječmen / jarní

Er

Sýrie

ječmen / ozimý

Igri

Německo

Pro pokus byly použity dihaploidní linie z křížení Igri x Atlas.

Nizozemí

(H.vulgare L.spp. vulgare) polopozdní sladovnická odrůda, výnos PZ nízký. Rostliny středně vysoké až vysoké, náchylné k poléhání, zrno malé. Rizikem je náchylnost k napadení rzí ječnou, náchylnost k poléhání a nízký výnos PZ.

ječmen / jarní

Jersey

Zdroj

Stupeň zimovzdornosti

-

-

-

3-4

-

-

Pro pokus byly použity dihaploidní linie z křížení Igri x Atlas. Polopozdní sladovnická odrůda vhodná pro výrobu českého piva. Rostliny středně vysoké až vysoké, méně odolné proti polehání. Linie ze selekce z původních syrských krajových odrůd poddruhu H. vulgare L., spp. spontaneum (citlivá vůči suchu).

SDO 2010

-

-

SDO 2010

-

55

Druh/ Forma

Název odrůdy

Původ odrůdy

ječmen / jarní

Malz

Česká republika

ječmen / jarní

Radegast

Česká republika

ječmen / jarní

Tadmor

Sýrie

Stručná charakteristika Polopozdní, plastická, sladovnická, středního vzrůstu, vhodná do všech oblastí pěstování zdravotní stav dobrý, vykazuje střední odolnost vůči chorobám dobrá odolnost proti polehání, velmi dobrá odolnost proti lámání stébla. Polopozdní sladovnická odrůda, rostliny středně vysoké až vysoké, středně odolné proti poléhání. Zrno středně velké až velké, PPZ středně vysoký. Střední odolnost proti napadení hnědou skvrnitostí. Linie vyselektovaná z původních syrských krajových odrůd poddruhu Hordeum vulgare L., spp. spontaneum (dobře adaptována na terminální sucho).

Zdroj

Stupeň zimovzdornosti

SDO 2006

-

SDO 2010

-

-

Poznámka: • Pro pěstování na našem území jsou odrůdy s hodnotami zimovzdornosti 3-4 rizikové při silnějších zimách. Dostatečně odolné jsou odrůdy s hodnotami 5-8. Hodnocení 9 mají např. kanadské odrůdy Harrier, Clair, Osprey. • SDO = Seznam doporučených odrůd – ÚKZÚZ. • LPO = Listina povolených odrůd – ÚKZÚZ.

56

4 Výsledky 4.1 Stanovení vodních charakteristik a obsahu ABA v experimentech navozujících stres sucha 4.1.1 Ztráta vody z listů Bylo zjišťováno, zda se liší listy odebrané z jedné rostliny v rychlosti ztráty vody. Listy pocházely z rostliny odrůdy Mironovská 808. Maximální redukce čerstvé hmotnosti (čhm) během 400 minut byla 50 %, minimální 30 %. Nejrychleji vysychal první list (nejstarší),

hmotnostní úbytek čhm [%]

nejpomaleji třetí list. 60 50 40 30 20 10 0 0

100 průměr 1. list

200 300 čas [min] průměr 2. list

400

500

průměr 3. list

Obr. 5 Časový průběh vysychání listů obilnin.

4.1.2 Vodní sytostní deficit Byla řešena otázka, zda se liší vsd celých listů od vsd listových segmentů. Bylo provedeno porovnání stanovení vsd pro sycení celých listů a listových segmentů. Vodní sytostní deficit segmentů a celých listů se vzájemně významně neliší. Tab. 7 Časový průběh vysychání celých listů a listových segmentů obilnin. Hmotnost Hmotnost Čerstvá Označení nasyceného vsd hmotnost sušiny vzorku [g] [g] [g] [%] 1 0,2378 0,4907 0,0774 61,19 2 0,1625 0,3069 0,0568 57,74 3 0,2478 0,5062 0,0814 60,83 celý list 4 0,2490 0,5041 0,0780 59,87 5 0,1766 0,3883 0,0603 64,54 6 0,1444 0,3027 0,0561 64,19 1 0,0714 0,1407 0,0221 58,46 2 0,1045 0,2132 0,0280 58,69 3 0,1075 0,2238 0,0318 60,57 listový segment 4 0,0656 0,1451 0,0178 62,45 5 0,0645 0,1175 0,0201 54,41 6 0,0848 0,1973 0,0235 64,73

Průměr

SD

[%]

[%]

61,39

2,60

59,89

3,58

57

4.1.3 Sání mšicemi a napadení virem BYDV Byla řešena otázka, zda se liší hladina ABA u rostlin napadených mšicemi a virem od rostlin bez napadení. Jestli se liší hladina ABA u rezistentní a náchylné rostliny ječmene. 400 350 ABA [ng/g čhm]

300 250 200 150 100 50 0 0

9 18 27 dny od ukončení infikace mšicemi R

36

NKR

Obr. 6 BYDV – Igri/Atlas rezistentní linie – varianta (R) infikovaná a bez infekce (NKR).

Vzájemně se rezistentní a náchylná varianta v hladině ABA od sebe s výjimkou 27. dne po infekci statisticky významně nelišily. Průměrné hodnoty ABA infikovaných rostlin byly ve většině případů vyšší oproti kontrolám bez infekce. U rezistentní varianty tomu tak bylo od třetího do třicátého dne od ukončení infikace mšicemi. U náchylné linie tomu tak bylo po celou dobu sledování, s výjímkou dvacátého čtvrtého a dvacátého sedmého dne, kdy byla hladina kontroly nepatrně vyšší. Obecně hladina ABA dosahovala mírně vyšších hodnot u rezistentní varianty oproti náchylné. 400 350 ABA [ng/g čhm]

300 250 200 150 100 50 0 0

9 18 27 dny od ukončení infikace mšicemi S

36

NKS

Obr. 7 BYDV – Igri/Atlas náchylná linie – varianta (S) infikovaná a bez infekce (NKS).

Relativní obsah viru zjištěný v kořenech (obr. 8) byl maximální dvanáctý den od ukončení inokulace. V listech stoupal relativní obsah viru do dvacátého prvního dne a pak

58

klesal. Nebyl zjištěn významný vztah mezi relativním obsahem viru v listech nebo kořenech a ABA. 2 1,8 1,6 absorbance 405NM

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

3

6

9

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 dny po ukončení inokulace náchylná

rezistentní

Obr. 8 Relativní obsah viru BYDV v kořenech (analýzu provedla L. Šírlová). 2 1,8 1,6 absorbance 405NM

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

3

6

9

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 dny po ukončení inokulace náchylná

rezistentní

Obr. 9 Relativní obsah viru BYDV v listech (analýzu provedla L. Šírlová).

4.1.4 Sledování obsahu ABA v rostlinách ječmene po ukončení zálivky za podmínek krátkodobého sucha Cílem bylo zjistit, zda se dvě suchu odolné odrůdy ječmene (Amulet a Tadmor) liší v hladině ABA. Kontrolní varianta byla po celou dobu pěstování tj. 13 dní zalévána na 79 % PNP (v grafu na obr. 10 jsou uvedeny hodnoty zjištěné vždy před zalitím, které se pohybovaly v rozmezí 70-71,5 % PNP) a 14. den byly odebrány vzorky kontrolní varianty. Suchá varianta byla v období od 1. do 9. dne zalévána stejně jako kontrola, od 10. dne byla ponechána bez

59

zálivky. Vzorky suché varianty byly odebrány 17. den. Suchá i kontrolní varianta byla odebrána ve stejné růstové fázi. Proto je den odběru vzorků u obou variant rozdílný. U suché varianty Tadmoru klesla hodnota obsahu vody v půdě na 23,0 % PNP a u Amuletu klesla na 19,3 % PNP. U suché varianty vysychala půda v květináčích v důsledku

PNP [%]

odběru vody rostlinami Tadmoru pomaleji oproti Amuletu. 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

dny Amulet

Tadmor

Obr. 10 Obsah vody v půdě během pokusu s ukončenou zálivkou navozujícího podmínky krátkodobého sucha.

Vodní sytostní deficit kontrol byl u Tadmoru i Amuletu nižší oproti suché variantě, v podmínkách sucha byl vsd vyšší u Amuletu než u Tadmoru (obr. 11). Osmotický potenciál u kontrolních variant byl vyšší než v suché variantě (obr. 12). 35

Amulet

30

-0,5

25 20 [MPa]

[%]

Tadmor

0

15 10 5

-1 -1,5 -2

0 Amulet kontrola

Tadmor sucho

Obr. 11 Vodní sytostní deficit v listech.

-2,5 kontrola

sucho

Obr. 12 Osmotický potenciál v listech.

60

Diskriminace uhlíku (obr. 13) ukázala pokles hodnot od listu přes odnožovací uzly po kořeny. Za kontrolních podmínek byly u Amuletu i Tadmoru hodnoty vyšší než za sucha. Zjištěný obsah vody v listech, odnožovacích uzlech a kořenech (obr. 14) byl za kontrolních podmínek vyrovnaný a při srovnání s podmínkami sucha byl u kontrol vyšší. Za podmínek sucha byl obsah vody v kořenech Tadmoru vyšší než Amuletu. Amulet

Tadmor

100 95

-24 -26 OV [%]

d 13C [‰]

-28 -30 -32 -34 -36

90 85 80 75 70 65 60 55 50

-38 -40

Amulet

Tadmor

kontrola-list

kontrola-uzel

kontrola-list

kontrola-uzel

kontrola-kořen

sucho-list

kontrola-kořen

sucho-list

sucho-uzel

sucho-kořen

sucho-uzel

sucho-kořen

Obr. 13 Diskriminace uhlíku.

Obr. 14 Obsah vody v rostlině.

Obsah ABA (obr. 15) byl u kontrolních variant nižší proti podmínkám sucha a za sucha bylo více ABA zjištěno u Tadmoru než u Amuletu, zatímco při kontrolních podmínkách obsahoval Amulet více ABA než Tadmor. 80

ABA [ng/g čhm]

70 60 50 40 30 20 10 0 Amulet kontrola

Tadmor sucho

Obr. 15 Obsah ABA v listech rostliny ječmene.

61

4.1.5 Stanovení obsahu ABA a množství proteinů v rostlinách ječmene po ukončení zálivky za podmínek déletrvajícího sucha Cílem pokusů bylo kvantifikací fytohormonu kyseliny abscisové a proteinů dehydrinů DHN5 zjistit, zda existuje korelace mezi těmito dvěma veličinami u odrůd ječmene Amulet, Akcent, Malz a Tadmor. Listové pletivo bylo odebíráno ze čtvrtého plně vyvinutého listu. Bezprostředně po odběru byl stanoven vodní sytostní deficit (vsd). Pro analýzy obsahu dehydrinů, ABA a osmotického potenciálu byly vzorky listového pletiva po zvážení fixovány v tekutém dusíku. Rychlost vysychání půdy byla nejvyšší u Amuletu, následovaly Akcent a Malz, půda u Tadmoru vysychala nejpomaleji (obr. 16). 45 40 35

Amulet

PNP [%]

30

Akcent

25

Malz

20

Tadmor

15 10 5 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

dny bez zálivky

Obr. 16 Změny obsahu vody v půdě během pokusu s ukončenou zálivkou navozujícího podmínky déletrvajícího sucha.

Vodní sytostní deficit (obr. 17) byl u všech rostlin vyšší v podmínkách sucha. Za podmínek sucha byla hodnota vsd nejnižší u Tadmoru. Amulet Akcent Malz Tadmor

40

0

35 30

-0,5 -1

25 [MPa]

[%]

45

20 15 10

-1,5 -2 -2,5

5

-3

0 Amulet Akcent kontrola

Malz

Tadmor

sucho

Obr. 17 Vodní sytostní deficit v listech.

-3,5 kontrola

sucho

Obr. 18 Osmotický potenciál v listech.

62

Hodnoty osmotického potenciálu kontrolní varianty byly mezi odrůdami vyrovnané (obr. 18). Za sucha byly hodnoty nižší, minima dosáhla odrůda Malz. Průměrná diskriminace

13

C (obr. 19) byla u všech kontrolních variant nižší. Za

kontrolních podmínek i za sucha byla hodnota diskriminace 13C nejnižší u Tadmoru. Akumulace DHN5 (obr. 20) byla nižší v kontrolní variantě oproti suchu. V kontrolní i suché variantě byla akumulace DHN5 nejvyšší u Tadmoru. 2,5

Amulet Akcent

1,5 d 13C [‰]

denzita DHN5

2

1 0,5 0 Amulet Akcent kontrola

Malz

Tadmor

Tadmor

-25 -26 -27 -28 -29 -30 -31 -32 -33 -34 -35

sucho

kontrola

Obr. 19 Denzita DHN5 v listech (analýzu provedl Z. Škodáček).

Malz

sucho

Obr. 20. Diskriminace uhlíku v listech.

Obsah ABA (obr. 21) u testovaných odrůd ječmene byl nejvyšší v listech suché varianty Tadmoru. Amulet vykázal významně vyšší hladinu ABA v suché variantě oproti kontrolní. Akcent a Malz měly hladiny v obou variantách vyrovnané a hladina ABA u Tadmoru byla

ABA [ng/g čhm]

vyšší v kontrolní variantě oproti podmínkám sucha. 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Amulet

Akcent kontrola

Malz

Tadmor

sucho

Obr. 21 Obsah ABA v listech ječmene.

63

Změny v obsahu ABA se během experimentu projevily především u odrůdy Amulet, která na dlouhodobě snížené nasycení půdního substrátu reagovala výrazným navýšením obsahu ABA v listech. U odrůd Akcent a Malz se rozdílné vláhové podmínky neprojevily. Odrůda Tadmor reagovala na rozdílné vláhové podmínky zcela opačně než ostatní odrůdy běžně pěstované v našich klimatických podmínkách.

4.1.6 Sledování obsahu ABA v rostlinách pšenic a ječmenů za podmínek dlouhodobého sucha ve venkovních nádobových pokusech Cílem pokusu bylo posoudit v podmínkách nádobových pokusů suchou a kontrolní variantu, posoudit odlišnosti v obsahu endogenní ABA mezi jednotlivými druhy, mezi odrůdami.

4.1.6.1 Nádobové pokusy realizované v letech 2008-2009 8000 7000

ABA [ng/g čhm]

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Amulet

Bojos

Er

Jersey

Malz

Tadmor

12.5. - kontrola

15.5. - kontrola

22.5. - kontrola

4.6. - kontrola

12.5. - sucho

15.5. - sucho

22.5. - sucho

4.6. - sucho

Obr. 22 Obsah ABA v listech – ječmen 2009.

U ječmenů v prvním odběru (12. 5.), tj. sedm dní po navození sucha nedošlo k významnému zvýšení obsahu ABA u pěti ze šesti odrůd ječmene. Mírný nárůst oproti kontrole se projevil pouze u Jersey. V dalších dvou odběrech (15. 5. a 22. 5.), deset a sedmnáct dní ve variantě sucho, narůstal postupně obsah ABA u všech odrůd, mohutný nárůst obsahu ABA byl pak zaznamenán v posledním odběru 4. 6. Nejvyšších hodnot dosáhla odrůda Malz (7127 ng/g čhm) a Amulet (6727 ng/g čhm). U odrůdy Er byl zjištěn, vzhledem k předchozím kontrolním odběrům, výrazně vyšší obsah ABA u kontrolní varianty

64

v předposledním a posledním odběru (22.5. a 4.6.). Mírný nárůst obsahu ABA v kontrolní variantě vykázal Amulet v odběrech 15.5. a 55.5. 1200

ABA [ng/g čhm]

1000

800

600

400

200

0 Alacris 14.5. - kontrola

Etela

Hedvika

21.5. - kontrola

4.6. - kontrola

Meritto 14.5. - sucho

Mulan 21.5. - sucho

Venistar 4.6. - sucho

Obr. 23 Obsah ABA v listech – pšenice 2009.

S dobou odběru postupně narůstal obsah ABA u všech odrůd pšenic u suché varianty oproti kontrole. K největšímu nárůstu ABA došlo v posledním odběru, 4. 6. Největší hodnoty dosahovala odrůda Hedvika, nejmenší Venistar a Meritto.

4.1.6.2 Nádobové pokusy realizované v letech 2009-2010 Tab. 8 Obsah vody v listech obilnin. (L. Holková a L. Melišová, MZLU v Brně) Obsah Obsah Obsah Odrůda vody SD vody SD Odrůda vody SD kontrola sucho kontrola [%] [%] [%] [%] [%] [%] Alacris Amulet 76,8 1,7 75,2 1,0 85,6 8,9 Etela Bojos 78,9 0,8 75,4 3,2 82,8 3,4 Hedvika Radegast 79,7 2,4 77,8 1,5 85,1 4,7 Meritto Jersey 78,6 1,8 74,8 3,2 84,1 3,2 Mulan Malz 78,0 3,1 77,4 1,7 81,9 2,8 Venistar Tadmor 78,6 1,1 77,2 2,3 89,1 3,9

Obsah vody sucho [%] 78,7 78,5 78,6 79,3 78,6 86,0

SD [%] 5,7 6,2 4,8 5,4 6,5 8,6

65

5000 4500 4000

ABA [ng/g čhm]

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Amulet

Bojos

Radegast

Jersey

Malz

Tadmor

14.5. - kontrola

21.5. - kontrola

28.5. - kontrola

11.6. - kontrola

14.5. - sucho

21.5. - sucho

28.5. - sucho

11.6. - sucho

Obr. 24 Obsah ABA v listech – ječmen 2010.

700 600

ABA [ng/g hm]

500 400 300 200 100 0 Alacris

Etela

Hedvika

Merito

Mulan

Venistar

23.4. - kontrola

30.4. - kontrola

7.5. - kontrola

14.5. - kontrola

28.5. - kontrola

23.4. - sucho

30.4. - sucho

7.5. - sucho

14.5. - sucho

28.5. - sucho

Obr. 25 Obsah ABA v listech – pšenice 2010.

66

4.2 Vliv působení nízkých teplot a vysušení listů na obsah ABA 4.2.1 Aklimatizační proces a DLT 200

ABA [ng/g čhm]

175 150 125 100 75 50 25 0 0

10

20

30

40

red čhm [%] kontrola

inkubace

Obr. 26 Obsah ABA v listech odrůdy Samanta po redukci čerstvé hmotnosti (čhm) 0 až 30 % pěstované při 16°C.

Doba vysychání listů proudícím vzduchem byla u vzorků rostlin pěstovaných při 16°C 35-40 min., pro teploty 0 až +3°C 40-60 min. a pro vzorky z teploty -3 až 0°C 110 min. U odrůdy Samanta se hladina ABA pohybovala při odběru rostlin pěstovaných při teplotě 16°C a následném vysušení na 30 % původní čerstvé hmotnosti v rozmezí 20-167 ng/g čhm. U odrůdy Samanta pěstované při 16°C, jejíž listy byly vysoušeny do 30 % redukce čhm byla porovnávána hladina ABA vzorků bez inkubace a s inkubací 4 hodiny. Při 10 % vysušení bylo po inkubaci zjištěno více ABA oproti variantě bez inkubace, při dalším vysoušení na 20 a 30 % původní hmotnosti došlo k poklesu hladiny ABA a inkubace 4 hodiny neměla dále na hladinu ABA vliv. 300 ABA [ng/g čhm]

250 200 150 100 50 0 -3

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

hod. inkubace Leguan

Mironovská 808

Obr. 27 Obsah ABA v listech po redukci 10 % čhm – závislost na době inkubace u rostlin pěstovaných při teplotě 16°C.

67

Odrůdy pšenice Mironovská 808 a Leguan jsou formy ozimá a jarní, byly porovnány z podmínek pěstování tří teplotních režimů: 16°C, +3/0°C, +3/-3°C, odpovídajících aklimatizačním fázím. Po redukci čerstvé hmotnosti 10 % a různě dlouhé době inkubace vzorků za podmínek popsaných výše byly vzorky fixovány v tekutém dusíku pro následnou kvantifikaci ABA. V grafech jsou pro porovnání uvedeny i hodnoty hladiny ABA zjištěné v době odběru vzorků a další po vysušení, tedy varianty bez následné inkubace. Jedná se o hodnoty do doby inkubace 0 na ose x. ABA [ng/g čhm]

300 250 200 150 100 50 0 -3

0

3

6

9

hod. inkubace Leguan

Mironovská 808

Obr. 28 Obsah ABA v listech po redukci 10 % čhm – závislost na době inkubace u rostlin pěstovaných při teplotě +3/0°C.

U odrůdy Leguan (jařina) došlo po vysušení listů k nárůstu ABA u všech teplotních variant. Mironovská 808 (ozim) při vysušení hladinu nezměnila u rostlin z teploty 16°C, snížila u rostlin z teplot +3/0°C nebo zvýšila u teplot +3/-3°C. Během prodlužující se doby inkubace při teplotě 16°C se pohybovala hladina ABA odrůdy Mironovská 808 výš než odrůdy Leguan do 6 hodin inkubace. ABA [ng/g čhm]

300 250 200 150 100 50 0 -3

0

3

6

9

hod. inkubace Leguan

Mironovská 808

Obr. 29 Obsah ABA v listech po redukci 10 % čhm – závislost na době inkubace u rostlin pěstovaných při teplotě +3/-3°C.

V dalších měřeních (9 a 15 hod) byla hladina u Mironovské 808 níž (9 a 15 hod.) nebo na stejné úrovni (měření 12 a 24 hod.) s Leguanem. Při teplotách pěstování rostlin +3/0°C

68

stoupala hladina ABA odrůdy Leguan do 15 hodin inkubace, kdy dosáhla maxima (450 ng/g

čhm), následoval strmý pokles. Při inkubaci po dobu 24 hodinách nastal mírný vzestup hladiny, která tak dosáhla obdobné úrovně u obou testovaných odrůd. Obsah ABA u odrůdy Mironovská 808 byl vyšší než u Leguanu v době 3 a 18 hodin inkubace, její hladina dosáhla maximální hodnoty 200 ng/g čhm. U vzorků listů rostlin pěstovaných při teplotách +3/-3°C byly hladiny ABA u obou odrůd na stejné úrovni do 9 hodin inkubace, v 15. a 24. hodině bylo více ABA u odrůdy Leguan. Maximální zjištěný obsah ABA byl u obou odrůd 200 ng/g čhm. Tab. 9 Stupeň mrazuvzdornosti. (převzato od P. Prášilové) Stupeň mrazuvzdornosti Název Forma (1 až 9) Bill ozim 2 Šárka ozim 6 Zdar ozim 3-4 Mironovská 808 ozim 8 Leguan jařina 1 Sandra jařina 1

Bylo sledováno, zda se liší vybrané odrůdy pšenice pěstované při různých teplotách v hladině ABA a jaká je reakce odrůd na vysušení listu. Pro další pokusy byly vybrány odrůdy pšenice s různou úrovní mrazuvzdornosti (Mironovská 808, Leguan, Sandra, Šárka, Bill, Zdar). Stupeň mrazuvzdornosti sledovaných odrůd byl stanoven na základě mrazového testu (Prášil et al., 1994) a vyjádřen ve stupnici 1 až 9 (1 = nejméně a 9 = nejvíce odolná) v tab.9. 300

ABA [ng/g čhm]

250 200 150 100 50 0 Bill

Šárka 16°C

+3/0°C

Zdar +3/-3°C

Sandra

Mironovská 808

Leguan

Obr. 30 Obsah ABA v listech rostlin pěstovaných při sledovaných teplotách.

69

Šárka

250

250

200

200

ABA [ng/g čhm]

ABA [ng/g čhm]

Bill

150 100 50

150 100 50 0

0 16°C

+3/0°C

16°C

+3/-3°C

kontrola

kontrola

red čhm10% Lineární (red čhm10%)

red čhm10%

Sandra

250

250

200

200

ABA [ng/g čhm]

ABA [ng/g čhm]

+3/-3°C

Lineární (red čhm10%)

Zdar

150 100 50 0

150 100 50 0

16°C

+3/0°C

+3/-3°C

16°C

kontrola red čhm10% Lineární (red čhm10%)

+3/0°C

+3/-3°C

kontrola red čhm10% Lineární (red čhm10%)

Mironovská 808

Leguan

250

250

200

200

ABA [ng/g čhm]

ABA [ng/g čhm]

+3/0°C

150 100 50 0

150 100 50 0

16°C

+3/0°C

+3/-3°C

kontrola red čhm10% Lineární (red čhm10%)

16°C

+3/0°C

+3/-3°C

kontrola red čhm10% Lineární (red čhm10%)

Obr. 31 Obsah ABA pro 0 a 10 % redukce čerstvé hmotnosti (DLT) u rostlin pěstovaných při zvolených teplotách (16 až -3°C). (parametry spojni ce trendu viz. příloha 3)

70

Byly porovnány hladiny ABA všech sledovaných odrůd při zvolených teplotách pěstování. Při teplotách 16 a 3/0°C vykázala nejvyšší obsah ABA odrůda Mironovská 808. Nejvyšší hladina ABA během celého experimentu byla zjištěna u odrůdy Bill. Téměř nezměněnou hladinu ABA měla odrůda Leguan. U odrůd Bill, Šárka, Zdar a Sandra došlo u teplot blízkých 0°C k nárůstu ABA proti hladině zjištěné u vzorků pěstovaných při 16°C. Hladina ABA zjištěná ve variantě po vysušení (redukci čerstvé hmotnosti o 10 % a inkubaci 4 hodiny) se při porovnání hodnot vzorků rostlin pěstovaných při 16°C a při nižších teplotách u všech sledovaných odrůd zvýšila. Nejnižší hladina ABA při teplotách 3/-3°C po vysušení byla u odrůdy Sandra.

4.3 Obsah ABA v listech pšenice po vystavení rostlin nízké teplotě v době metání 4.3.1 Doba jarovizace a vystavení rostlin stresu nízké teploty na počátku fáze metání Bylo sledováno, jak ovlivní délka jarovizačních teplot dobu metání. Zda se liší vybrané odrůdy jarních ječmenů vystavené nízkým teplotám na počátku fáze metání v hladině ABA. 100 90 80 70 [den]

60 50 40 30 20 10 0 Tercie

Trappe

Brawura

dny při vyšší teplotě

Seance

Septima

Sandra

dny při jarovizační teplotě

Obr. 32 Celkový počet dnů do metání rostlin pšenice s odlišením doby působení jarovizačních teplot.

Rostliny se dostaly do fáze metání během 6 až 13 týdnů po výsevu. Průměrný počet listů vypočtený na rostlinu se pohyboval v rozmezí 6,7-8,3. Nejvyšších hodnot dosáhla odrůda Brawura. Odrůdy se mezi sebou v počtu listů na rostlinu statisticky významně nelišily.

71

Stanovený průměrný počet listů u rostlin bez jarovizace byl nižší oproti jarovizovaným rostlinám. Rozdíly mezi odrůdami nebyly statisticky významné. Vypočtený průměrný počet odnoží se pohyboval v rozmezí 0,7-2,3. Rozdílné průměrné hodnoty počtu odnoží na rostlinu vykázaly ve zvýšené míře odrůdy Seance, Septima a Sandra, avšak rozdíly nebyly statisticky průkazné. 12

počet listů

10 8 6 4 2 0 Tercie

Trappe

Brawura Seance Septima Sandra

bez jarovizace

8 týdnů jarovizace

Obr. 33 Průměrný počet listů na rostlinu v době metání.

počet odnoží

4 3 2 1 0 Tercie

Trappe

Brawura Seance Septima Sandra

bez jarovizace

8 týdnů jarovizace

Obr. 34 Průměrný počet odnoží na rostlinu v době metání.

Na počátku fáze metání po vystavení rostlin stresu nízké teploty se průměrné hodnoty osmotického potenciálu odrůd vzájemně významně nelišily. Nejnižší hodnotu vykázala Tercie a nejvyšší Trappe. Nejvyšší průměrná hladina ABA byla stanovena u odrůdy Brawura, nejnižší u odrůdy Trappe. Hladiny všech testovaných odrůd se vzájemně statisticky významně nelišily.

72

Tercie

Trappe Brawura Seance Septima Sandra

0

[MPa]

-0,5

-1

-1,5

-2 bez jarovizace

8 týdnů jarovizace

Obr. 35 Osmotický potenciál po stresu nízkou teplotou v době metání. 100 90 ABA [ng/g čhm]

80 70 60 50 40 30 20 10 0 Tercie

Trappe Brawura Seance Septima Sandra bez jarovizace

8 týdnů jarovizace

Obr. 36 Obsah ABA v listech po stresu nízkou teplotou v době metání.

73

5 Diskuse 5.1 Typy experimentů a geografický původ rostlin Kyselina abscisová patří mezi fytohormony, které mají pleiotropní funkci. Je poměrně obtížné určit příčinu změny hladiny ABA, nejsou-li vnější podmínky co nejpřesněji zhodnoceny, proto byly v pokusech preferovány regulované podmínky. Ve skleníku a klimatizované komoře byla ovlivněna vlhkost a proudění vzduchu, teplota, intenzita světla, složení pěstebního substrátu. Byly eliminovány nepříznivé vlivy prostředí a to biotické i abiotické. Nevýhodou mohl být omezený prostor pro růst kořenů i nadzemní části rostlin, intenzivní péče o rostliny i přístroje. Venkovní podmínky byly upraveny pomocí stříšky, avšak hlavní význam mělo stálé působení aktuálního počasí, podmínky byly klasifikovány jako částečně regulované. Byl sledován obsah fytohormonu v listech intaktní rostliny, ale i změny hladiny ABA v odstřižených listech. V prvním případě byly zaznamenány změny hladiny ABA způsobené její syntézou, distribucí, degradací, která byla realizována jak v listech, tak v dalších pletivech rostlin. V druhém případě se jednalo o sledování procesů, které se děly pouze v listech. Hodnocení pokusů z venkovních podmínek bylo ve vztahu k suchu úspěšné, i když bylo provázeno rozdílným počasím během dvou let pokusů. Omezená zálivka v kombinaci s působením počasí zřejmě zesílil a jindy snížil intenzitu stresu působícího na rostliny a tyto podmínky ovlivnily i hladinu ABA. K obdobným závěrům dospěl Asch et al. (2009). Rostlinný materiál, který byl v práci použit, zahrnuje jak starší odrůdy, které vynikají konkrétními parametry a proto jsou dnes využívány jako určité standardy pro konkrétní znak, např. Mironovská 808, která má velmi vysokou odolnost vůči nízkým teplotám, tak i novější odrůdy, které jsou pěstovány na území České republiky jako je Etela. Zastoupeny byly i materiály, které jsou adaptovány na jiné podmínky sucha a mohou v budoucnu představovat zdroj určitého genu například pro specifický typ suchovzdornosti (Er, Tadmor). Na základě hodnocení výsledků získaných z několika sérií rozdílných pokusů, byly popsány určité společné rysy v rámci obsahu endogenní ABA v listech. Při zohlednění výsledků lze konstatovat, že hladina ABA je součástí reakčních mechanizmů, jež působí v řádu několika hodin od doby, kdy se rostlina setká se stresem. Takový závěr vyplývá z hodnocení pokusů využívajících inkubaci pro akumulaci ABA, ale i z venkovních nádobových pokusů se suchem, podporují ho i literární prameny. ABA je prostředníkem, který připravuje podmínky a přenáší signály pro vlastní funkční jednotky. Její hladina se zvyšuje především v souvislosti s dehydratací pletiv v důsledku sucha, přičemž podstatná je

74

intenzita a doba trvání působení stresoru. Rostliny využívají velmi citlivý systém, ve kterém je ABA syntetizována, využívána, převáděna do neaktivní formy a redistribuována či degradována. To vše probíhá v čase.

5.2 Dehydratace pletiv Typickým příkladem pro dehydrataci pletiv je působení sucha. Vysychání odstřižených listů je jedním ze způsobů navození krátkodobého sucha, které byly v práci použity. Podle provedených měření vysychal nejrychleji nejstarší list, u kterého trvalo vysušení na 50 % hmotnosti zjištěné ihned po odstřižení listu (čerstvé hmotnosti) 400 minut. Rychlost vysychání listu byla závislá na jeho stáří - čím mladší byl list, tím pomaleji vysychal (obr. 5). Rostlina tedy chrání mladá pletiva před poškozením. Odebírat druhý list bylo vhodné především z hlediska organizace odběru a zpracování vzorků. Pro hodnocení vlivu krátkodobého sucha bylo vhodné odebrat druhý, plně vyvinutý list. Takto bylo možné dobře standardizovat vzorky, protože fáze byla na rostlinách dobře rozpoznatelná. Druhý list bývá dobře vyvinutý a nebývá poškozen ani při sledování rostlin do fáze zrání. Odběr druhého listu také snížil dobu pěstování a tedy i náklady na pěstování rostlin oproti třetímu a dalším plně vyvinutým listům. V pokusech, které simulovaly dlouhodobé sucho byl pro stanovení ABA odebírán čtvrtý list aby byly sníženy rozdíly v hladině ABA způsobené stářím listu. Vodní sytostní deficit bylo možné vypočítat jak ze sycení segmentů listů, tak po sycení celých listů. Vážení celých listů na laboratorních vahách bylo v některých případech obtížnější než vážení segmentů (velké rozpětí ve velikosti listů), a tak ačkoliv byla práce se segmenty náročnější na čas, byla pro porovnání většího množství vzorků vhodnější. Aktuální vodní režim rostlin může být charakterizován mnoha způsoby. Mimo stanovení vodního sytostního deficitu (vsd) bylo v práci použito měření osmotického potenciálu pletiv. Pokud by bylo třeba hodnotit stanovení vsd a stanovení osmotického potenciálu, pak stanovení vsd bylo z hlediska aktuálního vodního stavu rostliny přesnější, časově náročnější na provedení a stanovení osmotického potenciálu bylo poměrně rychlé a v rámci pokusů dostačující. V rámci předložené práce byly pro stres suchem provedeny experimenty s ukončenou zálivkou. Jeden simuloval podmínky krátkodobého sucha a druhý podmínky déletrvajícího sucha. V obou případech se konečný obsah vody suché varianty blížil hodnotě 20% plného nasycení půdy vodou (obr. 10, 16). Z podmínek krátkodobého sucha mohou být, na základě naměřených dat, porovnány dva typy suchu odolných rostlin (Amulet – přizpůsoben nepravidelně se vyskytujícímu suchu v průběhu vegetace v podmínkách ČR, Tadmor –

75

přizpůsoben terminálnímu suchu). Aby byla zajištěna stejná růstová fáze, byly vzorky z kontrolní varianty odebrány o čtyři dny dříve než vzorky suché varianty. Podle sledovaných charakteristik vypovídajících o aktuálním vodním stavu rostlin byl v kontrolních podmínkách zálivky zjištěný průměrný obsah vody Amuletu i Tadmoru obdobný v listech a v pletivech odnožovacích uzlů a nejvyšší v kořenech (obr. 14). Tento poměr se změnil v případě, že obsah vody byl stanoven po osmi dnech bez zálivky, kdy půda postupně vysychala. V takovém případě se poměr změnil tak, že listy obsahovaly nejvíce vody, uzly méně a kořeny nejméně vody. Tadmor se od Amuletu lišil v poměru vody v uzlech a kořenech, kdy kořeny Tadmoru obsahovaly více vody než uzly a v kořenech Amuletu bylo méně vody než v kořenech Tadmoru. Obsah vody byl na konci experimentu vyšší také v půdě u Tadmoru. Takový výsledek lze vysvětlit sníženou spotřebou vody Tadmoru, který může souviset s rychlostí růstu a vývoje rostliny, s jejím habitem a nebo s fyziologickými pochody v rostlině. Vodní sytostní deficit listu byl za kontrolních podmínek u Amuletu i Tadmoru stejný a v podmínkách sucha se u obou hodnota vodního sytostního deficitu zvýšila, pouze u Tadmoru bylo navýšení nižší než u Amuletu (obr. 11). Hodnoty osmotického potenciálu zjištěného z listových čepelí byly v kontrolní I suché variantě mírně vyšší u Tadmoru oproti Amuletu (obr. 12). Hodnoty korespondovaly se závěry Mikulkové et al. (2007), kteří uvedli, že po odstřižení a následném vysychání listu byly zřetelné rozdíly v zavadnutí Tadmoru (méně) oproti Amuletu (více) i když dynamika ztráty vody byla u obou podobná. Fakt, že hodnota navýšení vsd byla menší u Tadmoru je zřejmě způsoben tím, že Tadmor obsahoval v této variantě v půdě více vody než Amulet, tudíž síla stresu vzhledem k veličině obsahu vody v půdě byla menší. Hodnoty uvádějící diskriminaci uhlíku byly nižší u kontrolních variant proti suchu, což platilo pro listy, uzly i kořeny. Takové výsledky jsou v souladu se závěry, které publikovali Farquhar et al. (1982), kteří teoreticky odvodili, že míra diskriminace těžkého uhlíku (∆13C) by měla být nízká u rostlin, které získaly více uhlíku na jednotku spotřebované vody, tedy mají vysokou účinnost využití vody WUE (water use efficiency). Naopak méně účinné rostliny by měly mít relativně méně uhlíku 13C, protože by jej měly více diskriminovat, což je žádoucí pro rostliny pěstované v aridních podmínkách. Hodnoty rostly v obou variantách v pořadí list-uzel-kořen (obr. 13). Jedinou výjimkou byla suchá varianta Tadmoru, kde byly vyrovnané hodnoty diskriminace mezi uzlem a kořenem a to pravděpodobně v důsledku mírně vyššího obsahu vody v půdě u Tadmoru, který čerpal vodu z půdy o něco pomaleji než Amulet. Obsah ABA u kontrolních variant byl nižší než u sucha (obr. 15). Navýšení bylo větší u Tadmoru. Podle literárních zdrojů obsah ABA významně koreluje s uzavřením průduchů (Gowing et al., 1993; Davies et al., 1994; Cutler a 76

Krochko, 1999). Dosažené výsledky lze interpretovat tak, že Amulet měl oproti Tadmoru v podmínkách optimální zálivky přivřenější průduchy a za sucha je uzavřel ještě více. V optimálních podmínkách by je měl Tadmor více otevřené než Amulet a v suchých podmínkách by je více zavřel než Amulet. Tak by snížil transpiraci a voda proto zůstávala déle v půdě. Rostliny mohou reagovat zvýšením hladiny ABA v důsledku působení stresoru, jak uvedl např. Taylor (1991). Vzrůst koncentrace ABA vede k mnoha změnám ve vývoji, fyziologii a růstu. A co je nejdůležitější, ABA je považována za signál k iniciaci zapojení adaptačních procesů k suchu a jiným stresům prostředí (Hartung a Davies, 1991; Bray, 1993). Zvýšená hladina ABA tedy nemusí znamenat pouze uzavření průduchů. V každém případě reagovaly na stejné podmínky Amulet a Tadmor odlišně. Jelikož byla stanovení provedena na sedmnáctidenních rostlinách, byl eliminován vliv rozdílnosti růstových fází i habitus rostlin měl menší význam oproti déletrvajícím experimentům. Pravděpodobně se tedy jednalo o rozdílné hospodaření rostlin s vodou. V pokusech simulujících déletrvající sucho byla kromě vodních charakteristik a obsahu ABA sledována také otázka vztahu mezi obsahem stresového fytohormonu ABA a obsahu dehydrinu, stresového proteinu DHN5. V literatuře je DHN5 uveden jako ABA indukovaný protein (Brini et al., 2007). Oba prvky působí v ochranném mechanizmu rostlin. U testované skupiny rostlin nebyla zjištěna významná korelace mezi obsahem ABA a obsahem DHN5. Obsah DHN se významně zvýšil u suché varianty Amuletu a Tadmoru oproti kontrolní variantě (obr. 19). Tyto hodnoty byly v souladu s tvrzením o vyšší odolnosti Amuletu a Tadmoru vůči suchu oproti Akcentu a Malzu. Hodnoty vodního sytostního deficitu byly za podmínek optimální zálivky mírně vyšší u Amuletu a Akcentu oproti Malzu a Tadmoru. Za podmínek dlouhodobého sucha vzrostlo vsd více u odrůd přizpůsobených středoevropskému klimatu než u Tadmoru ze Sýrie (obr. 17). Hodnoty osmotického potenciálu kontrolní varianty byly vyrovnané. Za podmínek sucha byla nejnižší hodnota osmotického potenciálu zjištěna u Malzu, ostatní rostliny měly hodnoty vyrovnané (obr. 18.). Lze vyvodit závěr, že Tadmor se dlouhodobému suchu lépe přizpůsobil a jeho pletiva zůstala více hydratována. Kontrolní varianta evropských odrůd obsahovala obdobnou hladinu ABA, zatímco Tadmor měl hladinu ve srovnání s nimi mírně vyšší. Naproti tomu v podmínkách dlouhodobého sucha byla hladina ABA ve čtvrtém listu Amuletu přibližně desetinásobně vyšší oproti kontrole, u Akcentu byla mírně vyšší, u Malzu mírně nižší než v kontrole a u Tadmoru byla nízká, na úrovni Malzu ( obr. 21). Součástí experimentu byl pokles obsahu vody v půdě od patnáctého dne pěstování na konečnou úroveň suché varianty do třicátého třetího dne experimentu. Během této doby nejrychleji vysychala půda odrůdy Amulet, pomaleji u odrůd Akcent a 77

Malz, nejpomaleji u Tadmoru. Odrůda Amulet pravděpodobně citlivě reaguje na podmínky prostředí prostřednictvím ABA. Pro Tadmor by mohla úroveň kontrolní varianty představovat mírný stres přemokřením. Diskriminace uhlíku u Tadmoru v kontrolní i suché variantě byla nižší než hodnoty evropských odrůd (obr. 20). Což může být interpretováno jako vyšší schopnost využití vody Tadmoru oproti ostatním odrůdám. Kvantifikací ABA byla při kontrolních podmínkách s 30 % vlhkostí půdního substrátu detekována signifikantně vyšší hladina obsahu ABA u odrůdy Tadmor. V experimentu s Amuletem, Akcentem, Malzem a Tadmorem při déletrvajícím suchu, kdy vlhkost půdy klesla na 22 % PNP reagovala téměř desetinásobným navýšením obsahu ABA odrůda Amulet, zatímco Akcent a Malz měly při dlouhodobém suchu hladinu ABA vůči kontrole nezměněnou. Jiná dynamika se projevila u Tadmoru, kde se hladina ABA oproti kontrolní variantě snížila, což můžeme považovat za důsledek přiblížení se optimální dostupnosti vody pro pokusné rostliny ze Sýrie, avšak v tom případě by kontrolní varianta sycení půdy vodou představovala pro Tadmor stresovou situaci způsobenou přemokřením. V experimentu s ukončenou zálivkou, simulující působení krátkodobého sucha na rostliny, byly rostliny Amuletu a Tadmoru vystaveny postupujícímu mírnému stresu po relativně krátkou dobu. U všech rostlin došlo k nárůstu hladiny ABA v podmínkách sucha ve srovnání s kontrolou. V experimentu s ukončenou zálivkou, navozující déletrvající (osmnáctidenní) sucho, nezareagovaly rostliny Akcentu, Malzu a Tadmoru na výrazným nárůstem hladiny ABA. Pravděpodobně se u nich ABA této části stresové reakce neúčastní. Ke ztrátě vody z rostlinných pletiv může docházet v důsledku působení abiotických, ale i biotických faktorů. Konkrétním příkladem bylo poškození pletiv sáním mšic a napadením virem (BYDV). V polních podmínkách, v některých případech i v regulovaných podmínkách, jsou přes veškerou snahu rostliny napadeny patogeny. V případě šíření viru BYDV mšicemi, které sáním poškozují listová pletiva a tím vedle infekce zvyšují výpar vody z rostliny, bylo zajímavé zjistit, zda má napadení a poškození rostlinných pletiv mšicemi a virem BYDV vliv na obsah ABA v listech. Pokud by byl vliv napadení patogeny potvrzen, bylo by třeba takový závěr brát v úvahu při realizaci a hodnocení dalších pokusů. Napadení pokusných rostlin mšicemi a virem BYDV (obr. 6, 7) způsobilo mírný nárůst hladiny ABA. Hladina k viru rezistentní varianty dosáhla mírně vyšších hodnot než náchylná. Rozdíly však ve většině případů nebyly statisticky významné. Vyšší hodnoty mohou být vysvětleny tím, že napadené rostliny zmenšily plochu pro únik vodních par. Rezistentní linie byla schopna produkovat více ABA pro přivření průduchů. Rozdíly mezi liniemi nebyly velké 78

z důvodu, že měření napadené varianty bylo provedeno tři dny po ukončení inokulačního sání a poškození rostlin nebylo příliš rozsáhlé, případně již fungovaly další ochranné a reparační mechanizmy, proto nebyly ztráty vody velké a tudíž ani hladinu ABA nebylo třeba tak výrazně zvyšovat. Zvláště pokud byly rostliny v prostředí s dostatečným množstvím využitelné vody. Tři dny po ukončení inokulačního sání až do třicátého šestého dne nebyla nalezena významná korelace mezi obsahem viru v kořenech a listech (obr. 8, 9) a hladinou ABA.

V porovnání

hladiny

ABA

s množstvím

zjištěným

v pokusech

z podmínek

dlouhodobého sucha, byla hladina nízká, na úrovni nestresovaných rostlin. Závěry jsou v souladu s výsledky, které uveřejnili Bravo et al. (1997), kteří hodnotili obsah ABA po napadení mšicemi (Schizaphis graminum (Rondami) a Rhopalosiphum padi L. Podle těchto autorů se třináctidenní rostliny po předchozím šest dnů trvajícím sání mšic v obsahu ABA nelišily. Další otázkou, která vyvstala v souvislosti s působením patogenů, byl úbytek chlorofylu v poškozených částech rostliny, který byl dobře viditelný s postupující dobou experimentu. Pro analýzu ABA byla odebírána zelená listová pletiva, hladina ABA v průběhu experimentu zůstávala na stejné úrovni. K obdobnému hodnocení, avšak z jinak koncipovaného experimentu, dospěla i Popova (1998), která sledovala efekt fluridonu na anatomii listu, strukturu chloroplastů a akumulaci ABA. Uvádí omezenou schopnost akumulace ABA u listů s poškozenými chloroplasty v podmínkách sucha. V podmínkách dostatečné zálivky rozdíl není významný.

5.2.1 Působení dlouhodobého sucha na rostliny pšenic a ječmenůnádobové pokusy realizované v letech 2008-2010 Dalším krokem k přiblížení polním podmínkám bylo pěstování testovaných rostlin ve venkovních nádobových pokusech. V přírodních podmínkách může být působení stresu sucha v půdě doplněno o stres způsobený prouděním vzduchu a nízkou vlhkostí vzduchu, nízkými teplotami, svůj význam má i působení radiace a další faktory. Ačkoliv se v klimatických podmínkách České republiky jedná o vlivy, které působí relativně krátkodobě, mohou být pro porost kritickými. Využít ABA jako biomarker pro hodnocení citlivosti vůči konkrétním stresorům je velice lákavá myšlenka. Vzhledem k dynamické povaze obsahu ABA v jednotlivých orgánech rostlin je však velmi obtížné určit konkrétní podmínky pro odběr pletiv. Množství ABA závisí na stáří rostliny, světelných podmínkách, dostupnosti vody pro rostlinu, teplotě prostředí, ale také na genetické výbavě sledované rostliny. V pokusech byly zohledněny závěry Daviese a Zhanga (1991), že ABA funguje jako chemický signál pro

79

dlouhé vzdálenosti, který může poskytnout informaci o dostupnosti vody v půdě. Proto byly v pokusech zvoleny definované varianty kontrolní a redukované zálivky, byly zaznamenány maximální

a

minimální

dvacetičtyřhodinové

teploty,

srážky,

vlhkost

vzduchu.

V experimentech se simulací dlouhotrvajícího sucha během celé vegetace byl potvrzen vztah mezi ABA a stresem sucha u rostlin pěstovaných v regulovaných podmínkách. Dlouhodobé sucho bylo hodnoceno během venkovních nádobových pokusů, kdy bylo sledováno několik odrůd patřících ke dvěma rostlinným druhům. Experiment probíhal po dvě vegetační období. Hladina ABA kontrolní varianty zalévané na 75% plného nasycení půdy vodou byla v průměru u pšenic i ječmenů nižší než u varianty s omezenou zálivkou (30% plného nasycení půdy vodou). Maximální hladina ABA (7127 ng/g čerstvé hmotnosti), které bylo dosaženo u pšenic i ječmenů v roce 2009 (obr. 22, 23), byla v důsledku průběhu počasí vyšší než v následujícím roce 2010 (4412 ng/g čerstvé hmotnosti)(obr. 24, 25). Hodnoty obsahu ABA v podmínkách dlouhotrvajícího sucha byly v obou letech u ječmenů o řád vyšší než u pšenic a to především v podmínkách dlouhotrvajícího sucha. U odrůd Amulet, Bojos a Malz existoval vzhledem k jejich původu předpoklad vyšší tolerance vůči suchu než u odrůdy Jersey. V nádobovém pokusu bylo prokázáno, že u variant s nižší zálivkou došlo k nárůstu ABA u všech odrůd ječmene i pšenice. Obsah ABA nebyl vyšší ve všech odběrech suché varianty oproti kontrole. Nejvyšší hodnoty obsahu ABA byly nalezeny u odběru ječmenů z 4.6. 2009. Nebyla zjištěna závislost obsahu endogenní ABA v listech na růstové fázi, avšak navýšení se objevovalo spíše v druhé půli vegetace a pravděpodobně díky nárůstu stresu vlivem počasí. Při porovnání výsledků změn obsahu ABA za dvě vegetační období, kdy probíhaly nádobové pokusy, lze potvrdit určité trendy. Zvýšení ABA se významně objevuje u suché varianty, zatímco odrůdy kontrolní varianty se mezi sebou obvykle neliší. Větší obsah ABA byl potvrzen u ječmenů než u pšenic. K výraznějšímu zvýšení ABA došlo v roce 2009 oproti roku 2010, což lze zdůvodnit teplejším a méně vlhkým průběhem počasí v roce 2009. V roce 2009 byl i zřetelnější postupný nárůst obsahu ABA s pokračujícím vývojem rostlin (pokročilejší růstovou fází) v suché variantě než v chladnějším roce 2010. V chladnějším roce 2010 byla slabší reakce ječmenů na podmínky sucha oproti roku 2009. Z výsledků nelze jednoznačně stanovit rozdíly v akumulaci ABA mezi odrůdami, spíše se ukazuje, že obsah ABA je velmi citlivý ukazatel vodního režimu rostlin, který může odrážet celou řadu aktuálních změn prostředí i vývoje rostlin a projevuje se přechodným kolísáním obsahu ABA v listech rostlin pšenic i ječmenů.

80

U pšenic došlo k menším změnám obsahu vody v listu než u ječmenů. Hodnoty ječmenů byly více rozkolísané. Listy ječmenů obsahovaly více vody než listy pšenic. Hodnoty obsahu vody v listech ječmenů suché varianty odpovídaly kontrolním variantám pšenic. Při porovnání rostlinného materiálu se v průměrném obsahu vody v listu lišil Tadmor od evropských odrůd, kdy v jeho kontrolní i suché variantě byly zjištěny nejvyšší průměrné hodnoty obsahu vody v listu. Lze vyslovit hodnocení, že odrůda Amulet využívá citlivě ABA ve svých mechanizmech, neboť v obou letech reagovala změnou hladiny ABA jak v suché, tak v kontrolní variantě. Z výsledků je dobře patrné, že ABA není jediným rozhodujícím faktorem v systému hospodaření rostlin s vodou. Z hlediska ABA hrají svou roli také počty průduchů a velikost průduchové štěrbiny, ale zřejmě je podstatný i fakt, jak dalece je konkrétní rostlina vůči ABA citlivá, jak dalece rostlina využívá cesty na ABA závislé či nezávisející.

5.3 Vliv nízkých teplot a dehydratace pletiv na obsah ABA Součástí strategie rostlin pro přežití za nízkých teplot je proces aklimatizace, tedy přizpůsobení se nízkým teplotám. V průběhu procesu aklimatizace se během pokusů průměrný obsah ABA s klesající teplotou zvyšoval (obr. 30). V předložené práci byly rostliny vystaveny kombinaci stresů nízké teploty a sucha. Předpokladem byla myšlenka, že mechanizmus reakce na oba typy stresu je obdobný. U obou typů stresu je ABA regulujícím prvkem. Rostlinná pletiva byla postupně v krátkém časovém intervalu vystavena oběma stresům a tak bylo možné sledovat jednotlivé části reakce na zesílený stres. Problematika stresu sucha se objevila při venkovních pokusech, ale podrobněji byla řešena metodou vysoušení odstřižených listů a jejich následnou inkubací podle Quarrieho a Hensona (1981), která umožňuje posoudit změny hladiny ABA v důsledku přeměny z neaktivní formy a samotné syntézy a degradace ABA v rámci jednoho orgánu – listu. Zohledňuje i faktor času, který je pro hladinu ABA podstatný. V experimentech byla zjištěna optimální doba pro inkubaci s udržením hmotnosti vzorku do 9 hod inkubace. Z měření obsahu ABA vyplynula optimální doba pro inkubaci 4 hodiny (obr. 26, 27-29). K obdobnému závěru dospěla Popova (1998). Otužování rostlin je proces, který umožňuje rostlinám přizpůsobit se teplotám blízkým 0°C a nižším. Výsledky potvrzují fakt, že se obsah ABA v konkrétním rostlinném pletivu dynamicky mění v čase. Její syntéza patrně probíhá v určitých vlnách. Takovou představu podporují nejen výsledky uvedené v předložené práci, ale i uveřejněné práce, zabývající se tématem biofeedback – zpětnovazebnou regulací hladiny ABA. V podmínkách redukce

čerstvé hmotnosti o 10 % lze při době inkubace 3-6 hodin sledovat nárůst hladiny ABA.

81

Takové hodnocení je v souladu se závěry Hensona a Quarrieho (1981). To platí pro rostliny odrůd Mironovská 808 a Leguan pěstovaných při 16°C. V případě, že rostliny byly pěstovány po další dva týdny při teplotách +3/0°C, došlo k nárůstu hladiny ABA v době 0-3 hod. inkubace po vysušení listů. Při další fázi otužení se hladina do 3 hodin inkubace držela na obdobné úrovni a následně při 6 hodinách inkubace poklesla. Takový posun s teplotou lze vysvětlit zpomalením metabolizmu při nižší teplotě, kdy nedojde, případně se sníží syntéza prekurzorů ABA. Pokud mají rostlinná pletiva menší obsah vody, může to znamenat pomalejší transport uvnitř pletiv a tudíž pomalejší reakci na měnící se podmínky. Takové opatření by mělo smysl i pro udržení homeostáze, neboť rostlina by reagovala jen na dlouhodobější změny teplot a ne na krátkodobé výkyvy počasí. Podle Zhanga et al. (1995) zlepšuje ABA transport vody mezi částmi rostliny, jedná se především o pohyb vody z kořenů do listů. Pak rostlina sníženou hladinou ABA v listech za nepříznivých podmínek udržuje hydrataci oblasti odnožovacího uzlu a kořenů, což podporují i předchozí výsledky. Pravděpodobně rostliny využívají uvedený mechanizmus podle konkrétní situace. Henson a Quarrie (1981) stanovovali obsah ABA v odstřižených listech pšenice (Triticum aestivum L.). Listy částečně vysoušeli a následně ponechali ve tmě. U pšenic zaznamenali poměrně malé změny v obsahu ABA, které navíc probíhaly v delším časovém intervalu. Sledovali také různé genotypy (20) jarní pšenice a u dvou nalezli odlišnou schopnost listů akumulovat ABA. Podle těchto autorů se u všech tří druhů rostlin, které sledovali, u vysoušených listů schopnost akumulovat ABA snižovala se zvyšujícím se stářím listu, u pšenice byl pokles zaznamenán teprve tři dny po objevení se jazýčku. Dynamika hladiny ABA v listu může být ovlivněna stářím rostliny, stářím listu, pozicí listu na rostlině, ale i vývojovou fází listu. Po zesílení stresu nízké teploty následným vysušením listů a inkubací došlo ve většině případů k nárůstu hladiny ABA, při nižších teplotách byly v několika případech stanovené hodnoty po vysušení a inkubaci snížené. U některých odrůd se hladina ABA zvýšila po vysušení a inkubaci při pěstebních teplotách +3/0°C, u jiných došlo k dalšímu nárůstu při teplotách +3/-3°C (obr. 31). Oba stresory mají společného jmenovatele a tím je omezení obsahu vody v rostlinných pletivech. Proto bylo možné předpokládat, že stresy, které se vyskytly společně, zvýšily u rostliny zatížení stresem a ta využila více ABA pro uzavření průduchů a udržení homeostáze. Snížení hladiny ABA lze vysvětlit jako důsledek její degradace. Dynamika hladiny ABA v čase se lišila u jednotlivých odrůd. Jak bylo uvedeno, hlavní vývojové a morfologické účinky ABA spočívají ve snížení úbytku vody transpirací a zároveň přijme rostlina kořeny více vody (Setter, 1996). Stručně, ABA mění relativní rychlost růstu různých částí rostliny. Při nárůstu obsahu ABA v kořeni se v prýtu 82

zvýší obsah sušiny, je utlumen proces vývinu listové plochy, je podpořen růst kořene – rostliny hlouběji zakořeňují (Sharp et al., 1994). Nejdůležitější pro zachování obsahu vody v rostlině je uzavření průduchů, vyvolané fytohormonem ABA (Ward et al., 1995). Tyto dvě strategie jsou na první pohled v obsahu ABA v listech protichůdné. V důsledku jsou využívány v interakci aktuálního stavu rostliny a prostředí velice efektivně. Odrůda jarní pšenice Leguan rostoucí postupně ve všech teplotních režimech (16°C, +3/0°C, +3/-3°C) reagovala ve všech fázích otužení na vysušení listů navýšením ABA. U odrůdy Mironovská 808, ozimé pšenice se po dehydrataci listů rostlin pěstovaných při 16°C hladinu nezměnila. U rostlin této odrůdy z nižších teplot (+3/0°C) hladina ABA po vysušení a inkubaci poklesla. U vzorků rostlin z teplot pod bodem mrazu (+3/-3°C) při reakci na vysušení a inkubaci po dobu 4 hodin hladina ABA vzrostla. Tyto závěry jsou v souladu s těmi, které uvedli Murelli et al. (1995), podle nichž nebyl po ukončení aklimatizačního procesu v hladině ABA rozdíl mezi odrůdami. Tento závěr je ve shodě s faktem, že rozdíly mezi odrůdami pšenice Mironovská 808 a Leguan byl patrný u rostlin pěstovaných při teplotě 16°C i při +3/0°C, u rostlin pěstovaných při další fázi aklimatizace (+3/-3°C) ale nebyl zjistitelný. Rozdíly mezi odrůdami jsou oproti 16°C zřetelnější při porovnání změny hladiny ABA ve vztahu ke vzorkům, které vysušeny nebyly. Takový závěr potvrzuje hodnocení Quarrieho a Hensona (1981). Při zobecnění je s použitím DLT patrný trend nárůstu ABA u všech analyzovaných ozimých forem pšenice v závislosti na snižující se teplotě. Takový výsledek je v souladu se závěry Mäntylä et al. (1995), kteří se zabývali rostlinami A. thaliana a došli k závěru, že aklimatizační proces vedoucí k mrazuvzdornosti probíhá v souvislosti s ABA spolu s faktory na ABA nezávislými. V dalším experimentu bylo vybráno šest odrůd pšenice tak, aby byly zastoupeny jarní i ozimé formy. Z porovnání šesti odrůd pšenice (Bill, Šárka, Zdar, Mironovská 808, Leguan, Sandra) pěstovaných ve třech fázích aklimatizace vyplývá, že v podmínkách pěstování 16 a +3/0°C měla významně vyšší hladinu ABA odrůda Mironovská 808, u které byl zároveň určen nejvyšší stupeň zimovzdornosti. Pokud předpokládáme, že obsah ABA je při mrazových teplotách nejvyšší u nejodolnější odrůdy, pak je překvapivý závěr, že při teplotách +3/-3°C hladina ABA u odrůdy Mironovská 808 nebyla, vzhledem k hodnotám stupně mrazuvzdornosti, nejvyšší z testovaných odrůd. Nejvyšší hladinu ABA vykázala odrůda Bill, jedná se o nejméně odolný ozim z vybraných odrůd, významně nižší hladina byla u odrůdy Sandra, tedy mrazu neodolné jařiny a dále následovaly poměrně vyrovnané hodnoty ostatních odrůd. Jednoznačně obsah ABA zjištěný v listech rostlin, které prošly aklimatizačním procesem, nezávisel na stupni 83

mrazuvzdornosti testovaných rostlin. Na základě uvedených výsledků nebylo možné samotnou kvantifikací ABA zjistit, zda se jednalo o jarní či ozimou formu pšenice. Obecně se vzorky odrůd v obsahu ABA, na rozdíl od závěrů Lalka a Dörfflinga (1985) lišily. Tento rozpor byl zřejmě způsoben sledováním rozdílného rostlinného materiálu. I přes skutečnost, že působení nízkých teplot vyvolalo u všech sledovaných listů nárůst hladiny ABA, nebyly výsledky v rozporu se závěry, které uvedli Faltusová-Kadlecová et al. (2002). Ti hodnotila rostliny pěstované v hydroponii při první aklimatizační fázi a uvedli, že u odrůdy Leguan byly změny ABA minimální. Ani v případě odrůdy Mironovská 808 nebyly změny v hladině ABA, s přihlédnutím k hodnotě směrodatné odchylky výběru, výrazné. Výrazný nárůst ABA vykázala odrůda Bill při působení teplot +3/-3°C. V tomto případě se pravděpodobně jednalo, vzhledem ke stupni mrazuvzdornosti odrůdy, o reakci na stresovou situaci, nikoli o proces, který byl součástí aklimatizačních změn. Dále byly listy rostlin z jednotlivých fází aklimatizačního procesu vystaveny dehydrataci. Pro zjištění vhodnosti využití kombinace stanovení hladiny ABA a DLT jako ukazatele míry odolnosti stresu pro širší škálu odrůd byly v pokusech pěstovány jarní a ozimé formy pšenice (např. Mironovská 808 a Leguan). Ani takové uspořádání pokusu nepřineslo ve všech fázích otužení jednoznačné rozlišení odrůd v závislosti na jejich zimovzdornosti. Samotné působení nízké teploty v rozmezí 3 až -3°C oproti hladině při 16°C způsobilo u všech odrůd navýšení hladiny ABA. Při proložení hodnot hladin ABA získaných z vysušených listů po akumulaci během celého procesu otužení přímkou, byl větší sklon lineárních přímek u zimovzdornějších odrůd oproti jařinám, což potvrzuje trend zvýšení hladiny při kombinaci snížení teploty a sucha. Výsledky ukazují vyšší schopnost akumulace ABA u odolnějších odrůd. U rostlin odrůdy Mironovská 808 došlo po vysušení listů k poklesu hladiny ABA v druhé fázi aklimatizace u rostlin pěstovaných při teplotách (+3/0°C) a ve třetí fázi aklimatizace u rostlin odrůd Bill a Sandra pěstovaných při teplotách (+3/-3°C). Listy rostlin, které byly pěstovány při teplotě 16°C a následně vystaveny suchu, se mezi sebou v obsahu ABA významně nelišily. Takový závěr odpovídá hodnocení Zeevaarta (1980) pro listy Xanthium strumarium, kdy při vystavení stresu sucha došlo během 4-5 hodin k nárůstu ABA a pak se hladina snížila v důsledku vyrovnání syntézy a degradace (Zeevaart, 1980). Ve všech ostatních případech došlo po vysoušení listů k nárůstu hladiny ABA. Příčinou takových rozdílů by mohly být například rozdílné strategie reakce na vnější podmínky u zvolených odrůd, které se projeví teprve při zesíleném stresu (nízká teplota a vysušení listů). Příčinu bude zřejmě třeba hledat v expresi konkrétních genů.

84

5.4 Vliv nízké teploty v době metání Nízké teploty se nevyskytují pouze v podzimním a zimním období, ale ovlivňují i jařiny. Vyskytnou-li se v době metání, mohou způsobit hluchost kvítků. Nízké teploty v době metání způsobují velké problémy například v Austrálii, na území ČR není jejich vliv tak silný. V dalším pokusu zaměřeném na vliv nízké teploty na rostliny byl sledován obsah ABA v listech jarních ječmenů na počátku fáze metání, po krátkodobém vystavení nízkým teplotám. Jedná se o simulaci vlivu pozdních mrazíků na rostliny. Doba metání se v závislosti na délce jarovizace přímo úměrně prodlužovala, rostliny neměly jarovizační požadavky (obr. 32-34). Rostliny vystavené jarovizačním teplotám po dobu sedmi týdnů dospěly do fáze metání o sedm týdnů později než rostliny bez jarovizace. Experiment dobře rozlišil ranost odrůd v pořadí od nejranější po pozdní: Seance, Sandra, Septima, Tercie, Trappe, Brawura. Počet listů na rostlinu a počet odnoží byl v průměru u jarovizovaných variant vyšší oproti variantě nejarovizované. Tento fakt souvisí s působením nízkých teplot v době diferenciace vzrostlého vrcholu. Na počátku fáze metání, kdy byly všechny rostliny vystaveny stresu nízké teploty, vykázaly odrůdy průměrné hodnoty osmotického potenciálu, které se statisticky významně nelišily (obr. 35). Průměrná hladina ABA, která byla stanovena na počátku fáze metání po působení nízkých teplot byla nejnižší u odrůdy Trappe, která měla zároveň nejvyšší průměrnou hodnotu osmotického potenciálu obr. 36.). Při srovnání hodnot obsahu ABA u pšenic z jednotlivých experimentů je patrné, že hladina ABA při působení nízkých teplot nedosahuje tak vysokých hodnot, jako je tomu u sucha a to bez ohledu na růstové fáze. Listy jsou pokládány za nejproduktivnější místo syntézy ABA během vodního stresu.

85

6 Závěr 6.1 Souhrn výsledků Nízká teplota a sucho jsou významnými faktory ovlivňující produkci obilnin. V předložené práci byl sledován obsah fytohormonu kyseliny abscisové (ABA) jako možného biomarkeru pro selekci rostlin v podmínkách stresu. Práce se zabývá studiem působení abiotických i biotických stresů na vybrané obilniny. Pro sledování vlivu nízké teploty a sucha byla provedena série pokusů, které proběhly v řízených podmínkách VÚRV, v.v.i. a venkovních prostorách MZLU v Brně. Pro analýzy byly použity rostliny několika odrůd pšenice a ječmene. Ve všech experimentech byl stanoven obsah endogenní ABA v listech. V podmínkách sucha byly stanoveny vybrané vodní charakteristiky (vodní sytostní deficit, osmotický potenciál, obsah vody v pletivech, diskriminace uhlíku

13

C). V jednom

experimentu byl spolu s ABA sledován obsah dehydrinu (DHN5) v listech ječmene. Navození stresu sucha u rostlin bylo řešeno třemi způsoby. Prvním způsobem bylo ukončení zálivky, druhým bylo dlouhodobé snížení zálivky a třetím rychlé laboratorní vysoušení odstřižených listů. Bylo porovnáno působení sucha na evropské odrůdy a rostliny pocházející ze subtropických oblastí přizpůsobené terminálnímu suchu. Vliv nízkých teplot byl sledován během procesu aklimatizace. Významné bylo posouzení vlivu kombinace stresorů nízké teploty a sucha na endogenní hladinu ABA u pšenice a ječmene. V pokusech byly analyzovány jarní i ozimé formy pšenice. Obsah ABA byl rovněž stanoven po působení nízké teploty na počátku fáze metání, kdy chlad může způsobit poškození a sterilitu kvítků. Byla sledována hladina ABA u rostlin ječmene po sání mšicemi a infikaci virem BYDV. Zjištěné poznatky jsou stručně shrnuty v následujících bodech:


Byla potvrzena hypotéza, že hladina ABA se statisticky významně liší u rostlin vystavených nízké teplotě (druhá fáze aklimatizace s teplotním režimem +3/-3°C) oproti rostlinám pěstovaným při 16°C.


Byla potvrzena hypotéza, že hladina ABA je vyšší u rostlin vystavených suchu oproti hladině u rostlin, které byly pěstovány při optimální vlhkosti půdy.


Hladina ABA je vyšší u rostlin vystavených kombinaci faktorů nízká teplota a sucho oproti hladině u rostlin, které byly vystaveny buď suchu nebo jen nízké teplotě. •

Za podmínek krátkodobého sucha (osm dní po ukončení zálivky), kdy obsah vody v půdě poklesl na 19 % (Amulet) a 23 % plného nasycení půdy vodou (Tadmor), byla v listech sedmnáctidenních rostlin ječmenů vyšší hladina ABA u české odrůdy Amulet (40 ng/g

čerstvé hmotnosti) i syrského Tadmoru (65 ng/g čerstvé hmotnosti) oproti kontrolní

86

variantě Amuletu (19 ng/g čerstvé hmotnosti) a Tadmoru (9 ng/g čerstvé hmotnosti) pěstovaných při 70 % obsahu vody v půdě. •

Za podmínek déletrvajícího sucha (osmnáct dní po ukončení zálivky) v řízených podmínkách, kdy obsah vody v půdě poklesl na 24 až 20 % plného nasycení půdy vodou, byla vyšší hladina ABA u odrůdy Amulet (1164 ng/g čerstvé hmotnosti) a Akcent (175 ng/g čerstvé hmotnosti), oproti odrůdám Malzu (50 ng/g čerstvé hmotnosti) a Tadmoru (40 ng/g čerstvé hmotnosti).

•

Za podmínek dlouhodobého sucha, při snížení zálivky na 30% plného nasycení půdy vodou v nádobách umístěných venku pod stříškou, byl u pšenic i ječmenů patrný významný nárůst hladiny ABA. U této varianty byla maximální hodnota obsahu ABA u pšenice 1084 ng/g čerstvé hmoty a ječmene 7127 ng/g čerstvé hmotnosti.

•

Testované pšenice u dlouhodobého sucha reagovaly nárůstem hladiny ABA v obou letech pokusu, 2009 i 2010, zatímco ječmeny reagovaly zvýšeným obsahem ABA především v teplejších podmínkách roku 2009. Přitom nebylo možné jednoznačně odlišit jednotlivé odrůdy na základě množství ABA.

•

U pšenic vedl kombinovaný stres nízké teploty a následného rychlého vysoušení odstřižených listů k mírným změnám hladiny ABA. Ani zde nebylo možné jednoznačně odlišit jarní a ozimou formu pšenice.

•

Průměrný obsah ABA při odezvě na působení nízké teploty během procesu aklimatizace byl 104 ng/g čerstvé hmotnosti a při odezvě na působení nízké teploty a vysušení listů 120 ng/g čerstvé hmotnosti.

•

Hladina ABA u pšenic vystavených v době metání vlivu nízké teploty se mezi odrůdami významně nelišila. Průměrné hodnoty se pohybovaly v rozmezí 34 až 68 ng/g čerstvé hmotnosti.

•

Odrůda ječmene Amulet citlivě reagovala na vnější podmínky změnami v hladině ABA ve všech pokusech. Syrský Tadmor zachovával vyšší obsah vody v pletivech déle než evropské odrůdy.

•

Poškození rostlin mšicemi a virem BYDV bylo příčinou mírně vyšší hladiny ABA v listech ječmenů, rozdíl však nebyl statisticky průkazný.

87

6.1 Doporučení pro praxi a další vědeckou práci Rostlinný materiál původem ze Sýrie projevuje určité odlišnosti oproti středoevropským odrůdám a v budoucnu by mohl být využit jako zdroj konkrétních genů, které jsou exprimovány v podmínkách sucha. Ze získaných poznatků vyplývá, že stanovení endogenního obsahu ABA v listech není ukazatelem míry odolnosti odrůd pšenice a ječmenů vůči suchu či nízké teplotě. Bylo prokázáno, že dlouhodobé sucho vede ke zvýšení obsahu ABA, zatímco krátkodobé sucho nebo působení nízké teploty může vyvolat kolísaní obsahu ABA. Stanovení ABA doplněné o další charakteristiky ukáže míru zátěže a mechanizmus odolnosti genotypu v konkrétních podmínkách. Hodnocením několika kritérií je možné vyčlenit mechanizmy, kterými se rostliny s působením stresoru vyrovnávají. Do budoucna navrhuji otestovat pro širší škálu odrůd výběr vodních charakteristik spolu s ABA tak, jak bylo stanoveno v podmínkách krátkodobého a déletrvajícího sucha. Především pro šlechtitele a následně i pěstitele bude při hodnocení odolnosti rostlin vůči suchu, případně vůči kombinaci faktorů, hodnotící systém velkým přínosem; umožní jim výběr vhodných odrůd, odolných do našich podmínek.

88

Literatura Andrade, A., Vigliocco, A., Alemano, S., Alvarez, D., Abdala, G. 2009. Differential accumulation of abscisic acid and its catabolites in drought-sensitive and drought-tolerant sunflower seeds. Seed Science Research. 19. 201-211. Asch, F. 2000. Laboratory Manual on Determination of Abscisic Acid by Indirect Enzyme Linked Immuni Sorbent Assay (ELISA). The Royal Veterinary and Agricultural University department of Agricultural Sciences. Denmark. p. 20. Asch, F. 2005. Pflanzliche Reaktionen auf Abiotischen Stress unter Veränderlichen Umveltbedingungen. Kumulative Habilitationsschrift für das Fachgebiet Pflanzenphysiologie/Agrarökologie. Landwirtschaftliche Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn. s. 28-29. Asch, F., Bahrun, A., Jensen, Ch. R. 2009. Root-shoot communication of field-grown maize drought-stressed at different rates as modified by atmospheric conditions. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 172. 678-687. Bahrun, A., Jensen, C. R., Asch, F., Mogensen, V. O. 2002. Drought-induced changes in xylem pH, ionic composition, and ABA concentration act as early signals in field-grown maize (Zea mays L). Journal of Experimental Botany. 53. 251-263. Blum, A. 1988. Plant breeding for stress environments. CRC Press. Florida. USA. Bravo, L. A., Zúñiga, G. E., Corcuera, L. J., Argandoña, V. H. 1997. Freezing tolerance of barley seedlings infested by aphids. Journal of Plant Physiology. 150. 611-614. Bravo, L. A., Zúniga, G. E., Alberdi, M., Corcurea, L. J. 1998. The Role of ABA in freezing tolerance and cold acclimation in barley. Physiologia Plantarum. 103. 17-23. Bray, E. A. 1993. Molecular responses to water deficit. Plant Physiology. 103. 1035-1040. Briggle, L. W., Curtis, B. C. 1987. Wheat worldwide. In: Heyne, E. G. (ed.). 2nd eddition Wheat and Wheat Improvement. Madison, USA. p. 1-32. Brini, F., Hanin, M., Lumbreras, V., Amara, I., Khoudi, H., Hassairi, A., Pagès, M., Masmoudi, K. 2007. Overexpression of wheat dehydrin dhn-5 enhances tolerance to salt and osmotic stress in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Reports. 26. 2017-2026. Browse, J., Xin, Z. 2001. Temperature sensing and cold acclimation. Plant Biology. 4. 241246.

89

Bruzzone, S., Moreschi, I., Usai, C., Guida, L., Damonte, G., Salis, A., Scarfi, S., Millo, E., De Flora, A., Zocchi, E. 2007. Abscisic acid is an endogenous cytokine in human granulocytes with cyclic ADP-ribose as second messenger. Proceedings of the National Academy of Sciences. USA. 104. 5759-5764. Bruzzone, S., Bodrato, N., Usai, C., Guida, L., Moreschi, I., Nano, R., Antonioli, F., Magnone, M., Scarfi, S., De Flora, A., Zocchi, E. 2008. Abscisic acid is an endogenous stimulator of insulin release from human pancreatic islets with cyclic ADP ribose as second messenger. The Journal of Biological Chemistry. 283 (47). 32188-32197. Cílek, V. 2010. Odložené globální oteplování. Vesmír. 89 (Červen). 372-375. Cutler, A. J., Krochko, J. E. 1999. Formation and breakdown of ABA. Trends in Plant Science. 4. 472-478. Cutler, S. R., Rodriguez, P. L., Finkelstein, R. R., Abrams, S. R. 2010. Abscisic acid: emergence of a core signalling network. Annual Reviews Plant Biology. 61. 651-679.

Čatský, J. 1965. 3.3 Vodní sytostní deficit In: Slavík, B., Brčák, B., Čatský, J., Pokorný, V., Šesták, Z. Metody studia vodního provozu rostlin. 1965. Metodické příručky experimentální botaniky 1. NČAV. s. 119.

Český hydrometeorologický ústav (ČHMÚ), Univerzita Palackého v Olomouci (UP). 2007. Atlas podnebí Česka. Praha, Olomouc. ISBN 978-80-86690-26-1 (ČHMÚ), 978-80-2441626-7 (UP). Dallaire, S., Houde, M., Gagné, Y., Boileau, S., Chevrier, N., Sarhan, F. 1994. ABA and Low Temperature Induce Freezing Tolerance via Distinct Regulatory Pathways in Wheat. Plant and Cell Physiology. 1. 1-9. Davies, W. J., Zhang, J. 1991. Root signals and the regulation og growth and development of plants in drying soil. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42. 55-76. Davies, W. J., Tardieu, F., Trejo, C. L. 1994. How do chemical signals work in plants that grow in drying soil? Plant Physiology. 104. 309-314. Duffield, P. H., Netting, A. G. 2001. Methods for the quantitation of abscisic acid and its precursors from plant tissues. Analytical Biochemistry. 289. 251-259.

90

Faltusová-Kadlecová, Z., Faltus, M., Prášil, I. 2002. Abscisic acid content during cold hardening of barley and wheat cultivars with different freezing tolerance. Rostlinná výroba. 48 (11). 490-493. Farquhar, G. D., O'Leary, H. M., Berry, J. A. 1982. On the relationship between carbon isotope discrimination and intercellular carbon dioxide concentration in leaves. Australian Journal of Plant Physiology. 9. 121-137. Fowler, D. B., Carles, R. J. 1979. Growth, development and Cold Tolerance of Fall Acclimated Cereal Grains. Crop Science. 19. 915-922. Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. 2007. Identification of two protein kinases required for abscisic acid regulation of seed germination, root growth, and gene expression in Arabidopsis. Plant Cell. 19. 485-494. Fujita, Y., Nakashima, K., Yoshida, T., Katagiri, T., Kidokoro, S., Kanamori, N., Umezwa, T., Fujita, M., Maruyama, K., Ishiyama, K., Kobayashi, M., Nakasone, S., Yamada, K., Ito, T., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. 2009. Three SnRK2 protein kinases are the main positive regulators of abscisic acid signalling in response to water stress in Arabidopsis. Plant and Cell Biology. 50. 2123-2132. Gao, Y., Zeng, Q., Guo, J., Cheng, J., Ellis, B., Chen, J. 2007. Genetic characterization reveals no role for the reported ABA receptor, GCR2, in ABA control of seed germination and early seedling development in Arabidopsis. Plant Journal. 52. 1001-1013. Gloser, J., Prášil, I. 1998. Fyziologie stresu. In: Fyziologie rostlin. Academia. Praha. s. 412431. ISBN: 802000862. Goff, S. A., Salmeron, A. J. M. 2005. Budoucnost patří obilovinám, genomové studie hlavních světových obilovin by spolu s křížením za použití molekulových značek mohly vést k nové zelené revoluci. Scientific American. (1). 78-83. Goh, Ch. H., Lee, D. J., Bae, H. J. 2009. Gibberrelic acid of Arabidipsis regulates the abscisic acid-induced inhibitin of stomatal opening in response to light. Plant Science. 176. 136142. Gómez-Cadenas, A., Verhey, S. D., Holappa, L. D., Shen, Q., Ho, T. H. D., WalkerSimmons, M. K. 1999. An abscisid acid-induced protein kinase, PKABA1, mediates abscisic acid-suppressed gene expression in barley aleurone layers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96. 1767-1772.

91

Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. 2001. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. The Plant Cell. 13. 667679. Gowing, D. J. G., Jones, H. G., Davies, W. J. 1993. Xylem-transported abscisic acid: the relative importance of its mass and its concentration in the control of stomatal aperture. Plant Cell Environment. 16. 453-459. Gupta, U. S. 2005. Drought tolerance. 62. In: Physiology of stressed crops. Department of Crop and Soil Sciences, University of Georgia. USA. pp. 253. ISBN: 1578083559. Guri, A. J., Misyak, S. A., Hontecillas, R., Hasty, A., Liu, D., Si, H., Bassaganya-Riera, J. 2010. Abscisic acid ameliorates atherosclerosis by suppressing macrophage and CD4+ T cell recruitment into the aortic wall. The Journal of Nutritional Biochemistry. 21 (12). ISBN: 1178-1185. Gusta, L. V., Chen, T. H. H. 1987. p. 115-150. The physiology of water and temperature stress. In: Heyne, E. G. (ed.). 2nd eddition Wheat and Wheat Improvement. Madison, USA. Gusta, L.V., Trischuk, R., Weiser, C. J. 2005. Plant cold Acclimation: The Role of abscisic Acid. Journal of Plant Growth Regulation. 2005 (24). 308-318. Hao, Q., Yin, P., Yan, Ch., Yuan, Li, W., Zhang, Z., Liu, L., Wang, J., Yan, N. 2010. Functional Mechanism of the Abscisic Acid Agonist Pyrabactin. Journal of Biological. Chemistry. 285. ISBN: 28946-28952. Hartung, W., Radin, J. W., Hendrix, D. L. 1988. Abscisic acid movement into the apoplastic solution of water-stressed citron leaves. Role of apoplastic pH. Plant Physiology. 86. 908913. Hartung, W., Davies, W. J. 1991. p. 63-79. Drought-induced changes in physiology and ABA. In: Abscisic acid physiology and biochemistry. BIOS Scientific. UK. Oxford. Hartung,W., Sauter, A., Hose, E. 2002. Abscisic Acid in the xylem: where does it come from, where does it go? Journal of Experimental Botany. 53 (366). 27-32. Henson, I. E., Quarrie, S. A. 1981. Abscisic Acid Accumulation in Detached Cereal Leaves in Response to Water Stress, I. Effects of Incubation Time and Severity of Stress. Zeitschrift fűr Pflanzenphysiologie. Bd. 101. 431-438.

92

Hooker, T. S., Thorpe, T. A. 1998. Effects of fluridone and abscisic acid on lateral root initiation and root elongation of excised tomato root cultures in vitro. Plant Cell Tissue and organ Culture. 52. 199-203. Horčička, P. 2008. Možnosti šlechtění pšenice. s. 46-49. In: Pšenice - od genomu po rohlík. Kurent, s.r.o., ISBN: 9788087111123. Hose, E., Sauter, A., Hartung, W. 2002. Abscisic acid in roots − biochemistry and physiology. pp. 435-448. In: Waisel, Y., Eshel, A., Kafkafi, U. (eds.). Plant Roots. The Hidden Half. rd

3 ed. Marcel Dekker, New York – Basel. Huizinga, D. H., Omosegbon, O., Omery, B., Crowell, D. N. 2008. Isoprenylcysteine methylation and demethylation regulate abscisic acid signaling in Arabidopsis [W]. Plant Cell. 20 (10). 2714-2728. Chen, T. H. H., Gusta, L. V. 1983. Abscisic acid –induced freezing resistance in cultured plant cells. Plant. Physiology 73. 71-75. Chen, T. H. H. 1994. Plant adaptation to low temperature stress. Canadian Journal of Plant Pathology. 16. 231-236. Iqbal, S., Bano, A. 2010. Effect of drought and abscisic acid application on the osmotic adjustment of four wheat cultivars. Journal of the Chemical Society of Pakistan. 32 (1). 1319. Iuchi, S., Kobayashi, M., Taji, T., Naramoto, M., Seki, M., Kato, T., Tabata, S., Kakubari, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. 2001. Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis. The Plant Journal. 27 (4). 325-333. Janowiak, F., Maas, B., Dörffling, K. 2002. Importace of abscisic acid for chilling tolerance of maize seedlings. Journal of Plant Physiology 159 (6). 635-643. Kadlecová, Z., Faltus, M., Prášil, I. 2000. Relationship between abscisic acid content, dry weight and freezing tolerance in barley cv. Lunet. Plant Physiology. 157. 291-297. Kang, J., Hwang, J. U., Lee, M., Kim, Z. Z., Assmann, S. M., Martinova, E., Lee, Z. 2009. PDR-type ABC transporter mediates cellular uptake of the phytohormone abscisic acid. Dostupné z

93

Kefu, Z., Munns, R., King, R. W. 1991. Abscisic acid levels in NaCl-treated barley, cotton and salt-bush. Australian Journal of Plant Physiology. 18. 17–24. Kline, K. G., Sussman, M., Jones, A. M. 2010. Abscisic acid receptors. Plant Physiology. 154. 479-482. Kutina. J. 1988. Regulátory růstu a jejich využití v zemědělství a zahradnictví. SZN. Praha. s. 416 s.103-114. ISBN: 07028880411. Label, P., Imbaut, N., Villar, M. 1994. ELISA quantitation and GC-MS identification of abscisic acid in stigma, ovary and pedicel of pollinated poplar flowers (Populus nigra L.). Tree Physiology. 14. 521-530. Lalk, I., Dörffling, K. 1985. Hardening, abscisic acid, proline, and freezing resistance in two winter wheat varieties. Physiologia Plantarum. 63. 287-292. Lång, V., Heino, P., Palva, E. T. 1989. Low temperature acclimation and treatment with exogenous abscisic acid induce common polypeptides in Arabidopsis thaliana (L.) Heynth. Theor. Apply Genetics. 77. 729-734. Larcher, W. 2003. Physiological Plant Ecology, Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. 4th ed. Springer. pp. 513. p. 345-427. ISBN: 3540435166. Le Page-Degivry, M. T., Duval, D., Bulard, C., Delaage, M. 1984. A radioimmunoassay for abscisic acid. Journal of Immunol Methods. 67. 119-128. Le Page-Degivry, M. T., Bidard, J. N., Rouvier, E., Bulard, C., Lazdunski, M. 1986. Presence of abscisic acid, a phytohormone, in the mammalian brain. Neurobiology. 83. 1155-1158. Li, C., Yang, Y., Junttila, O., Palva, E. T. 2005. Sexual differences in cold acclimation and freezing tolerance development in sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) ecotypes. Plant Science. 168. 1365-1370. Li, J., Assmann, S. M. 1996. An abscisic acid-activated and calcium-independent protein kinase from guard cells of fava bean. The Plant Cell. 8. 2359-2368. Li, Q., Wang, R. Z., Huang, Z. G., Li, H. S., Xiao, L. T. 2010. A novel impedance immunosensor based on O-phenylendiamine modified gold electrode to analyze abscisic acide. Chinese Chemical Letters. 21. 472-475.

94

Liu, X., Yue, Y., Li, B., Nie, Y., Li, W., Wu, W. H., Ma, L. 2007. A G protein coupled receptor is a plasma membrane receptor for the plant hormone abscisic acid. Science. 315. 1712-1716. Lösch, R., Schulze, E. D. 1994. Internal Coordination of Plant Responses to Drought and Evaporational Demand. p. 185 – 204. In: Schulze, E. D., Caldwell, M. M. (eds.). Ecological studies, Ecophysiology of Photosynthesis. Ma, Y., Szostkiewicz, I., Korte, A., Moes, D., Yang, Y., Christmann, A., Grill, E. 2009. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324. 1064-1068. Macháčková, I. 1998. Růst a vývoj: Růstové regulátory. In: Fyziologie rostlin. Academia. Praha. s. 265-269. ISBN: 802000862. Mäntylä, E., Lång, V., Palva, E. T. 1995. Role of abscisic acid accumulation of LT178 and RAB18 proteins in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology. 107. 141-148. Melcher, K., Ng, L. M., Zhou, X. E., Soon, F. F., Xu, Y., Suino-Powell, K. M., Park, S. Y., Weiner, J. J., Fujii, H., Chinnusamy, V., Kovach, A., Li, J., Wang, Y., Li, J., Peterson, F. C., Jensen, D. R., Yong, E. L., Volkman, B. F., Cutler, S. R., Yhu, J. K., Xu, H. E. 2009. A gate-latch-lock mechanism for hormone signalling by abscisic acid receptors. Nature. 462. 602-608. Mikulková, P., Holková L., Chloupek, O. 2007. Rozdílné reakce DHN genů v rostlinách ječmene vystavených náhlému a dlouhodobému suchu. 1-8. In: Mendelnet07Agro. MZLU v Brně. s. 109. ISBN: 9788073751197. Müller, O., Mikulcová, J., Martinek, P. 2005. Evoluční a šlechtitelské změny u pšenice. Úroda. 3. 3-13. Murelli, C., Rizza F., Albini, F. M., Dulio, A., Terzi, V., Cattivelli, L. 1995. Metabolic Changes associated with cold-acclimation in contrasting cultivars of barley. Physiologia Plantarum. 94. 87-93. Muscietti, J., McCormick, S. 2010. Abscisic acid (ABA) receptors: light at the end of the tunnel. Faculty of 1000 Biology Reports. 2 (15). Okamoto, M., Hanada, A., Kamyija, Y., Yamaguchi, S., Nambara, E. 2009. Measurement of Abscisic Acid and gibberelling by gas chromatography/mass spektrometry. 1-8. In: Methods in Molecular Biology. Plant Hormones. p. 495.

95

Pandey, S., Chen, J. G., Jones, A. M., Assmann, S. M. 2006. G-Protein complex mutants are hypersensitive to abscisic acid regulation of germination and postgermination development. Plant Physiology. 141. 243-256. Pandey, S., Nelson, D. C., Assmann, S. M. 2009. Two novel GPCR-type G proteins are abscisic acid receptors in Arabidopsis. Cell. 136. 136-148. Pearce. R. S. 2001. Plant Freezing and Damage. Annals of Botany. 87. 417-424. Petr, J., Baier, J., Bureš, R., Coufal, V. 1987. Počasí a výnosy. Státní zemědělské nakladatelství. Praha. 1. vydání. s. 152. Pierce, M., Raschke, K. 1980. Correlation between loss of turgor and accumulation of abscisic acid in detached leaves. Planta. 148. 174-182. Popova, L. P., Tsonev, T. D., Lazova, G. N., Stoinova, Z. G. 1996. Drought- and ABAinduced changes in photosynthesis of barley plants. Physiologia Plantarum. 96. 623-629. Popova, L. P. 1998. Fluoridone and light affected chloroplast ultrastructure and ABA accumulation in drought-stressed barley. Plant Physiol. Biochem. 36 (4). 313-319. Pospíšilová, J., Solárová, J., Slavík, B. 1989. Metody studia vodního provozu. s. 378-405. In: Dykyjová, D. Metody studia ekosystémů. Academia. Praha. s. 690. Pospíšilová, J. 2003. Paricipation of phytohormones in the stomatal regulation of gas exchange during water stress. Biologia Plantarum. 46 (4). 491-506. Prášil, I., Zámečník, J. 1987. Vliv počasí na přezimování ozimů. In: Počasí a výnosy. 1. vydání. Státní zemědělské nakladatelství. Praha. Prášil, I., Zámečník, J., Papazisis, K., Hanišová, A. 1989. Testování mrazuvzdornosti pšenice ozimé na vybraných pracovištích ČSSR. Genetika a šlechtění, 25. 79-86. Prášil, I., Prášilová, P., Papazisis, K., Valter, J. 1994. Evaluation of freezing injury and dynamics of freezing resistance in cereals. p. 37-48. In: Dörffling, K., Brettschneider, B., Tantau, H., Pithan, K. (eds.). Crop Adaptation to Cool Climates. ECSPEEC- EAEC. Brussels. Prášil I., Prášilová, P., Martinek, P. 2004. Globální oteplování a vymrznutí polních plodin. Vesmír. 83 (12). 692-694. Prášilová, P., Prášil, I. 2001. Winter-hardiness scale for wheat cultivars of different geographical origin. Agronomical Science. 14. 35-39.

96

Prášilová, P., Prášil, I. 2003. Zima 2002-2003 a příčiny vyzimování ozimých plodin. Úroda. 7. 44-47. Procházka, S., Šebánek, J. 1997. Regulátory rostlinného růstu. Academia. Praha. 395 s. ISBN 80-200-0597-8. Quarrie, S. A., Henson, I. E. 1981. Abscisic acid accumulation in detached cereal leaves in response to water stress, II. Effects of leaf age and leaf position. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. Bd. 101. 439-446. Quarrie, S. A., Whitford, P. N., Appleford, N. E. J., Wang, T. L., Cook, S. K., Henson, I. E., Loveys, B. R. 1988. A monoclonal antibody to (S)-Abscisic acid: its characterisation and use in radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves. Planta. 173. 330-339. Quarrie, S. A., Laurie, D. A., Zhu, I., Lebreton, C. 1997. QTL Analysis to study the association between leaf size and abscisic acid accumulation in droughted rice leaves and comparisons across cereals. Plant Molecular Biology. 35. 155-165. Razem, F. A., El-Kereamy, A., Abrams, S. R., Hill, R. D. 2006. The RNA-binding protein FCA is an abscisic acid receptor. Nature. 439. 290-294. Risk, J. M., Macknight, R. C., Day, C. L. 2008. FCA is not an ABA receptor. Nature. 456. E5-E6. Rodriguez, P. L., Benning, G., Grill, E. 1998. ABI2, a second protein phosphatase 2C involved in abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. FEBS Letters. 4421. 185-190. Santiago, J., Dupeux, F., Round, A., Antoni, R., Park, S. Y., Jamin, M., Cutler, S. R., Rodriguez, P. L., Marquez, J. A. 2009. The abscisic acid receptor PYR1 in complex with abscisic acid. Nature. 462. 665–668. Sauter, A., Dietz, K. J., Hartung, W. 2002. A possible stress physiological role of abscisic acid conjugates in root to shoot signalling. Plant Cell and Environment. 25. 223-228. Sãulescu, N. N., Braun, H. J. 2001. Breeding for adaptation to environmental factors. Cold tolerance. p. 111-123. In: Reynolds, M. P., Ortiz-Monasterio, J. I., McNab, A. (eds.). Application of physiology in wheat breeding. Mexico. D. F. CIMMYT. Segeťa, V. 1957. Jednoduchá metoda určení odolnosti ozimých obilovin proti některým škodlivým činitelům zimy. In: Vědecké práce VÚRV Praha-Ruzyně. 3. 83-96.

97

Setter, T. L. 1996. Role of the phytohormone ABA in drought tolerance: potential utility as a selection tool. p. 142-150. In: Edmeades, G. O., Banziger, M., Mickelson, H. R., PenaValdivia, C. B. (eds.). Developing Drought and Low N-Tolerant Maize. Proceedings of a Symposium. CIMMYT. El Batan. Mexico. D. F. Sharp, R. E., Wu, Y., Voetberg, G. S., Saab, I. N., LeNoble, M. E. 1994. Confirmation that abscisic acid accumulation is required for maize primary root elongation at low water potentials. Journal of Experimental Botany. 45. 1743–1751. Single, W. V., Marcellos, H. 1974. Studies on frost injury to wheat. IV. Freezing of ears after emergence from the leaf sheath. Australian. Journal of Agricultural Research. 25. 679. Stocker, O. 1927. Der Wasserhaushalt ägyptischer Wüsten- und Salzpflanzen. Botanische Abhandlung. Jena. Hefte 13, pp. 200. Szepesi, Á., Csiszár, J., Gémes, K., Horváth, E., Horváth, F., Simon, M. L., Tari, I. 2009. Salicylic acid improves acclimation to salt stress by stimulating abscisic aldehyde oxidase activity and abscisic acid accumulation, and increase Na+ content in leaves without toxicity symptoms in Solanum lycopersicum L. Journal of Plant Physiology. 166 (9). 914-925. Šantrůček, J. 1998. Vodní režim rostlin. In: Procházka, S., Macháčková, I., Krekule, J., Šebánek, J. Fyziologie rostlin. Academia. Prahas. 52-87. ISBN: 8020005862. Taylor, I. 1991. Genetics of ABA synthesis. p. 23-35. In: Davies, W., Jones, H. (eds.). Abscisic acid, physiology and biochemistry. Bios Scientific. Oxford. Umezawa, T., Sugiyama, N., Mizoguchi, M., Hayashi, S., Myouga, F., Yamaguchi-Shinozaki, K., Ishihama, Y., Hirayama, T., Shinozaki, K. 2009. Type 2C protein phosphatases directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106. 17588-17593. Valla, M., Kozák, J., Němeček, J., Matula, S., Borůvka, L., Drábek, O. 2002. Pedologické praktikum. ČZU. Praha. Vaňková, R. 2010. Plant hormone functions in abiotic and biotic stress responses. 191-211. In: Pessarakli, M. (ed.). Handbook of Plant and Crop Stress. 3rd edition. CRC Press. Veselova, S., Farthutdinov, A., Symonyan, M., Hartung, W. 2003. The Effect of Root Cooling on Hormone Content, Leaf Conductance and Root Hydraulic Conductivity of Durum Wheat Seedlings (Triticum durum L.). Bulgarian Journal of Plant Physiology Special Issue. 360-366.

98

Wang, Y. Q., Nick, P. 2001. Cold Acclimation Can Induce Microtubular Cold Stability in a Manner District from Abscisic Acid. Plant Cell Physiology. 42 (9). 999-1005. Wang X. F., Zhang D. P. 2008. Abscisic acid receptors: multiple signal-perception sites. Annual Botany. 101 (3). 311-317. Ward, J. M., Pei, Z. M., Schroeder, J. I. 1995. Roles of Ion Channels in Initiation of Signal Transduction in Higher Plants. Plant Cell. 7. 833–844. Welling, A., Moritz, T., Palva, E. T., Junttila, O. Independent activation of cold acclimation by low temperature and short photoperiod in hybrid aspen. 2002. Plant Physiology. 129 (4). 1633-1641. Wilkinson, S., Davies, W. J. 1997. Xylem sap pH increase: a drought signal received at the apoplastic face of the guard cell that involves the suppression of saturable abscisic acid uptake by the epidermal symplast. Plant Physiology. 113. 559-573. Wilkinson, S., Davies, W. J. 2002. ABA-based chemical signalling: the co-ordination of responses to stress in plants. Plant, Cell and Environment. 25 (2). 195-210. Wright, S. T. C. 1977. The relationship between leaf water potential(ψleaf ) and the levels of abscisic acid and ethylene in excised wheat leaves. Planta. 134. 183-189. Xu, S. 2010. Abscisic acid activates a Ca2+-calmodulin-stimulated protein kinase involved in antioxidant defence in maize leaves. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 42. 646-655. Yin P., Fan, H., Hao, Q., Yuan, X., Wu, D., Pang, Y., Yan, Ch., Li, W., Wang, J., Yan, N. 2009. Structural insights into the mechanism of abscisic acid signalling by PYL proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 16. 1230-1236. Yu, X. M., Griffith, M. 2001. Winter rye antifreeze activity increases in response to cold and drought, but not abscisic acid. Physiologia Plantarum. 112. 78-86. Zeevart, J. A. D. 1980. Changes in the Levels of Abscisic Acid and Its Metabolites in Excised Leaf Blades of Xanthium strumarium during and after Water Stress. Plant Physiology. 66. 672-678. Zeevaart, J. A. D., Yang S. H. 2005. Abscisic acid metabolism. Dostupné z .

99

Zhang, J., Zhang, X., Liang., J. 1995. Exudation rate and hydraulic conductivity of maize roots are enhanced by soil drying and abscisic acid treatment. New Phytologist. 131. 329336. Zhang, H., Qiu, M. Q., Wang G. X., Gan, Y., Zheng, K. F., Yao, X. G. 2009. The effect of sensitivity to abscisic acid on stomatal behaviour in Arabidopsis thaliana. EurAsian Journal of BioSciences. 3. 10-16. Zhao, M., Zhou, J. Y., Tan, Y. J., Song, W. W., Li, Z. D., Tan, H. 2009. Two LTR retrotransposon elements within the abscisic acid gene cluster in Botrytis cinerea B05.10, but not in SAS56. Electronic Journal of Biotechnology. Vol 12. Dostupné z <www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/345>. Zhu, S. Y., Yu, X. Ch., Wang, X. J., Zhao, R., Li, Y. 2007. Two calcium-dependent protein kinases, CPK4 and CPK11, regulate abscisic acid signal transduction in Arabidopsis[W]. The Plant Cell. 19. 3019-3036. Zieglerová, J., Möllerová, J., Štolcová, J. 2002. Rostlina a stresory od pravěku do současnosti. s. 1-12. In: Sborník příspěvků z konference "Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2002“. 13. 11. 2002. ČZU Praha, Česká zemědělská spol., VÚRV Praha. Praha. ISBN: 8021309490.

100

Přílohy Vysvětlivky: Prům. t

– průměrná teplota za 24 hodin (0-24 hodin)

Max. t

– maximální teplota

Min. t

– minimální teplota

Prům. rh

– průměrná vlhkost vzduchu

Srážky –

množství srážek

GR

– intenzita záření - podbarvená políčka označují dny se srážkami

Příloha 1: Meteorologické hodnoty z polního pokusu v roce 2009, MZLU v Brně Datum 1.III 2.III 3.III 4.III 5.III 6.III 7.III 8.III 9.III 10.III 11.III 12.III 13.III 14.III 15.III 16.III 17.III 18.III 19.III 20.III 21.III 22.III 23.III 24.III 25.III 26.III 27.III 28.III 29.III 30.III 31.III 1.IV 2.IV 3.IV

Prům. t [°C] 4,4 3,5 4,6 4,9 7,0 6,1 4,8 5,2 4,3 4,0 3,1 3,7 4,5 4,6 4,2 5,8 3,3 3,5 1,7 0,2 1,1 2,6 6,1 2,4 -0,4 2,1 6,6 10,5 6,4 5,9 5,8 10,0 12,7 11,5

Max. t [°C] 9,0 4,2 6,9 6,9 8,8 7,2 6,4 8,3 7,5 7,8 7,4 8,1 9,2 8,2 6,2 9,3 9,2 7,3 6,4 2,8 5,8 7,1 9,4 7,2 5,0 7,2 13,4 17,3 9,5 9,8 9,8 13,2 18,9 20,2

Min. t Prům. rh [°C] [%] 76,6 2,1 84,4 2,2 91,3 2,6 90,3 3,6 82,5 6,1 95,5 4,8 83,9 3,5 63,3 2,1 76,7 0,2 71,1 -0,6 87,0 0,7 72,7 0,4 80,5 1,2 79,6 2,2 88,6 1,8 70,1 0,0 80,9 -0,8 60,5 1,4 69,1 -1,4 69,5 -2,5 59,8 -2,9 65,7 -4,0 69,6 4,0 75,2 -3,5 59,9 -4,2 89,6 -0,6 78,8 2,0 64,7 6,2 81,4 4,0 79,3 2,9 72,8 0,2 7,4 56,9 6,6 39,5 2,2 61,2

Srážky [mm] 0,0 2,0 0,0 0,0 6,5 13,5 0,3 0,6 1,5 5,0 1,0 2,0 0,4 0,0 3,5 0,0 6,0 0,4 0,1 0,0 0,0 0,0 3,5 2,5 1,5 2,5 0,5 0,0 18,5 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0

GR -2 [J·cm ] 857,7 236,3 329,2 156,7 256,9 169,0 141,3 894,6 590,2 811,6 570,3 1223,5 879,7 1025,4 293,9 997,3 554,1 1561,5 1133,3 665,2 1576,8 710,3 998,7 1631,6 1660,6 711,4 1051,0 1826,2 247,7 536,3 848,0 663,7 2014,1 2023,9

101

Datum 4.IV 5.IV 6.IV 7.IV 8.IV 9.IV 10.IV 11.IV 12.IV 13.IV 14.IV 15.IV 16.IV 17.IV 18.IV 19.IV 20.IV 21.IV 22.IV 23.IV 24.IV 25.IV 26.IV 27.IV 28.IV 29.IV 30.IV 1.V 2.V 3.V 4.V 5.V 6.V 7.V 8.V 9.V 10.V 11.V 12.V 13.V 14.V 15.V 16.V 17.V 18.V 19.V 20.V 21.V 22.V 23.V 24.V

Prům. t [°C] 13,4 14,3 15,0 14,4 14,6 15,5 16,5 17,3 14,7 13,2 13,1 14,6 16,2 12,5 12,0 12,6 14,4 13,5 13,7 8,9 12,0 13,9 14,5 14,1 15,6 14,4 13,7 16,7 13,1 14,2 10,4 10,1 11,6 13,4 15,9 17,9 18,4 17,9 12,5 11,5 9,5 12,3 14,1 15,9 18,4 16,1 17,5 19,6 17,7 14,8 16,6

Max. t [°C] 22,2 22,6 21,9 22,9 22,9 22,6 23,9 24,2 22,0 20,7 19,3 22,1 22,1 15,1 18,5 19,6 21,5 19,3 22,3 12,8 20,1 20,7 20,1 19,6 21,7 20,1 24,2 23,7 19,0 23,4 20,6 15,3 15,4 19,7 23,7 23,7 27,5 26,0 16,8 17,6 13,0 16,0 17,2 24,3 25,3 20,6 26,8 27,1 25,1 20,9 25,3

Min. t Prům. rh [°C] [%] 5,1 61,4 6,6 59,0 8,9 59,1 6,2 53,6 6,0 51,2 8,5 51,7 7,6 49,2 10,4 43,0 7,9 51,2 6,0 58,7 5,6 55,2 5,6 48,3 10,3 40,3 9,5 60,5 6,6 57,3 4,3 56,7 7,5 45,3 7,2 32,4 5,5 45,9 5,4 72,0 3,2 53,8 4,6 42,9 9,0 36,2 9,0 40,5 10,9 33,8 8,8 48,1 6,6 65,6 9,8 41,7 4,6 39,4 5,6 47,8 6,0 73,1 4,4 59,2 7,9 71,3 7,7 62,7 6,4 60,1 12,3 53,3 9,6 57,0 12,0 63,1 7,5 67,7 3,6 47,7 6,0 71,4 8,7 78,7 8,1 78,0 6,1 65,4 11,6 66,9 10,4 76,8 8,5 62,0 10,0 56,8 11,3 71,6 8,6 56,0 7,0 53,2

Srážky [mm] 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,8 0,0 0,0 0,0 0,0 1,8 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,2 0,0 0,0 0,0 7,6 0,0 0,7 0,1 0,0 0,0 0,0 3,2 1,2 0,0 6,0 0,0 1,2 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0 1,4 0,2 0,0

GR -2 [J·cm ] 2062,2 1793,1 1869,6 1995,2 1883,4 1986,6 2146,7 2220,6 2157,3 2116,6 2303,2 2242,8 2190,0 1221,5 1944,3 2441,3 2032,8 2520,3 2454,2 1067,2 2384,9 2513,7 2306,8 2046,2 2501,0 1579,3 2069,4 1946,1 2210,9 2154,0 1604,4 1983,2 866,5 2041,1 2491,6 2287,4 2336,0 2418,7 1323,9 2432,9 660,5 669,5 1009,1 2806,1 2047,5 1518,7 2723,4 2641,9 1658,4 2800,2 2629,7

102

Datum 25.V 26.V 27.V 28.V 29.V 30.V 31.V 1.VI 2.VI 3.VI 4.VI 5.VI 6.VI 7.VI 8.VI 9.VI 10.VI 11.VI 12.VI 13.VI 14.VI 15.VI 16.VI 17.VI 18.VI 19.VI 20.VI 21.VI 22.VI 23.VI 24.VI 25.VI 26.VI 27.VI 28.VI 29.VI 30.VI 1.VII 2.VII 3.VII 4.VII 5.VII 6.VII 7.VII 8.VII 9.VII 10.VII 11.VII 12.VII 13.VII 14.VII

Prům. t [°C] 20,5 20,9 15,4 12,7 10,5 9,9 12,1 12,8 15,8 14,0 11,9 15,8 14,0 17,6 16,5 20,6 15,8 14,8 11,5 13,6 17,3 21,1 18,6 16,9 20,0 16,9 14,0 14,3 12,1 16,2 17,4 19,3 19,8 19,8 18,3 18,3 20,3 21,4 20,9 19,9 21,7 21,4 19,2 19,5 16,7 16,5 14,6 14,5 16,4 20,0 22,6

Max. t [°C] 28,4 28,3 20,4 19,6 14,1 14,4 14,3 17,3 21,3 19,2 16,6 23,1 19,5 24,0 23,0 26,7 20,7 20,6 16,2 22,1 26,3 28,7 23,9 24,1 28,3 20,8 16,5 20,4 15,2 20,4 20,4 25,1 24,2 24,7 20,8 26,5 28,5 28,2 31,1 25,2 29,0 27,7 26,5 27,7 22,8 23,6 22,3 19,7 24,2 28,9 30,9

Min. t Prům. rh [°C] [%] 11,8 49,1 11,3 48,9 8,6 61,3 62,1 7,0 69,8 8,0 83,7 7,1 88,0 9,2 72,1 10,8 67,7 11,5 51,2 6,8 59,9 6,4 48,8 13,5 62,2 11,7 61,4 10,2 10,0 67,9 14,7 58,0 12,3 76,3 10,7 76,9 7,4 75,2 4,2 55,0 5,5 47,3 12,9 58,3 12,8 65,3 8,9 54,3 10,0 52,9 12,6 82,8 10,2 82,0 7,2 64,6 9,8 81,0 11,9 78,8 15,0 83,8 14,5 73,0 14,5 74,5 15,3 74,2 15,7 85,8 14,4 85,0 14,5 78,1 16,6 73,2 15,8 74,3 16,1 78,8 15,1 66,3 16,1 63,9 13,8 74,5 14,4 74,3 13,2 73,8 11,9 61,3 10,1 73,0 9,6 68,0 8,1 64,6 11,3 60,0 13,8 64,6

Srážky [mm] 0,0 0,0 0,6 2,5 7,5 5,0 6,5 0,1 0,0 0,0 0,2 2,5 0,0 7,1 1,5 0,0 4,0 0,3 0,1 0,1 0,0 6,0 0,1 0,0 2,5 27,5 2,2 0,0 6,5 6,5 5,0 0,2 0,4 0,1 11,5 10,5 0,3 0,1 1,0 2,0 0,4 0,6 2,0 12,5 0,0 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,0

GR -2 [J·cm ] 2921,4 2816,0 1749,0 1801,3 1255,7 1192,4 835,4 1909,1 1983,6 3069,0 1533,3 2668,7 1191,3 2207,9 1871,3 2470,0 1330,9 1198,6 1830,8 3170,0 3130,5 2486,0 2342,1 2737,6 2875,6 615,0 968,7 2207,1 499,2 997,9 1543,8 2239,3 1965,3 1670,4 742,3 2080,6 2524,0 2584,9 2278,4 1527,4 2328,7 2402,7 1741,4 2474,3 1914,0 2034,1 1578,5 1529,3 2235,3 2774,8 2651,9

103

Datum 15.VII 16.VII 17.VII 18.VII 19.VII 20.VII 21.VII 22.VII 23.VII 24.VII 25.VII 26.VII 27.VII 28.VII 29.VII 30.VII 31.VII

Prům. t [°C] 22,3 22,2 24,4 17,0 16,9 17,5 19,4 22,8 23,8 21,0 17,2 16,8 18,8 19,0 20,0 21,7 20,4

Max. t [°C] 31,7 29,3 30,8 23,8 22,6 25,4 27,2 31,7 32,1 27,8 22,4 23,3 25,9 24,0 26,4 31,2 25,9

Min. t Prům. rh [°C] [%] 16,6 76,8 16,3 70,3 15,4 58,5 13,2 80,5 12,6 66,3 10,7 62,6 11,0 64,4 14,0 67,6 16,4 71,0 15,9 68,7 12,4 74,8 11,0 61,0 9,6 55,7 13,2 68,7 13,1 59,2 12,5 59,0 15,1 48,6

Srážky [mm] 0,0 0,0 0,1 0,2 0,0 9,3 0,1 13,9 16,9 8,0 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

GR -2 [J·cm ] 2468,9 2782,2 2582,0 287,0 2139,7 1841,0 2159,9 2479,7 2195,6 2044,7 2407,5 2480,3 2775,0 1969,8 2738,5 2586,7 2069,4

Příloha 2: Meteorologické hodnoty z polního pokusu v roce 2010, MZLU v Brně Datum 1.III 2.III 3.III 4.III 5.III 6.III 7.III 8.III 9.III 10.III 11.III 12.III 13.III 14.III 15.III 16.III 17.III 18.III 19.III 20.III 21.III 22.III 23.III 24.III 25.III 26.III 27.III 28.III

Prům. t [°C] 5,2 2,7 0,9 -0,5 -3,4 -5,1 -3,9 -4,1 -4,1 -1,8 -1,6 -0,6 2,2 3,8 0,6 1,3 3,6 5,7 6,7 7,3 10,4 9,8 7,7 10,2 13,7 13,8 9,5 8,3

Max. t [°C] 10,2 8,6 6,7 3,7 -0,2 -0,6 0,6 -0,1 0,5 2,7 0,4 2,7 4,4 5,8 4,9 4,6 7,6 14,3 13,9 13,1 17,7 16,3 16,9 18,5 19,2 19,6 13,6 14,5

Min. t Prům. rh [°C] [%] -0,4 67,9 -2,9 62,5 -3,6 58,3 -4,7 60,6 -7,0 60,1 -9,9 60,5 -7,5 54,4 -7,4 55,5 -8,0 47,3 -6,6 39,7 -3,8 83,2 -3,3 77,5 0,7 72,4 1,9 66,0 -1,8 68,0 -0,5 74,6 -0,8 63,3 -1,2 61,1 -0,8 62,6 0,4 68,5 5,3 75,8 3,0 60,4 -0,4 64,3 1,1 59,4 8,8 59,9 8,8 60,5 3,3 55,2 3,3 60,7

Srážky [mm] 5,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,3 0,1 0,0 0,0 1,5 1,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

GR -2 [J·cm ] 1460,4 1386,7 1266,1 665,2 1232,1 817,1 1257,4 1476,1 1551,6 1084,4 678,7 832,7 660,0 562,7 1252,4 993,2 846,4 1710,8 1296,9 914,9 750,7 1551,6 1712,5 1858,3 1729,9 1811,1 1095,7 1385,4

104

Datum 29.III 30.III 31.III 1.IV 2.IV 3.IV 4.IV 5.IV 6.IV 7.IV 8.IV 9.IV 10.IV 11.IV 12.IV 13.IV 14.IV 15.IV 16.IV 17.IV 18.IV 19.IV 20.IV 21.IV 22.IV 23.IV 24.IV 25.IV 26.IV 27.IV 28.IV 29.IV 30.IV 1.V 2.V 3.V 4.V 5.V 6.V 7.V 8.V 9.V 10.V 11.V 12.V 13.V 14.V 15.V 16.V 17.V 18.V

Prům. t [°C] 10,1 12,4 6,9 6,1 4,9 6,7 11,2 7,5 7,0 7,7 9,9 9,5 5,2 5,1 6,0 8,2 7,2 7,7 9,8 8,0 9,3 11,9 11,8 8,5 6,8 7,1 12,1 15,1 13,5 12,8 12,4 14,0 17,3 16,3 14,4 13,0 11,1 9,5 14,4 12,9 11,6 13,2 14,4 15,9 14,7 13,4 10,1 9,3 8,2 8,8 9,7

Max. t [°C] 16,9 20,0 12,1 15,4 10,6 14,7 17,2 9,1 12,4 15,0 18,0 15,3 9,0 8,4 9,3 10,6 8,9 8,8 16,4 15,8 16,0 20,0 18,9 13,6 13,7 13,7 19,5 22,1 22,9 19,8 20,0 21,3 24,4 22,2 17,9 14,2 12,9 12,2 20,9 19,3 19,0 18,1 19,0 21,8 17,9 16,2 12,2 12,2 10,8 10,6 12,2

Min. t Prům. rh [°C] [%] 2,6 65,0 4,6 56,8 0,6 75,5 -1,6 69,6 0,5 68,8 -2,0 59,4 7,1 48,5 5,4 74,0 2,4 55,0 -0,8 58,5 1,4 60,8 3,2 62,2 1,4 73,0 1,8 72,8 2,8 82,8 6,6 86,4 5,6 85,2 6,6 87,4 4,8 66,0 0,4 54,3 0,4 59,0 3,8 58,3 4,5 60,2 3,8 59,3 -0,1 47,9 -0,6 62,3 3,8 52,2 6,1 37,5 6,8 59,5 5,7 61,1 5,0 53,0 3,9 50,4 8,0 53,5 12,5 73,9 11,6 77,8 11,3 85,0 8,8 85,8 7,6 81,4 8,9 70,9 8,6 66,4 8,1 82,8 9,1 72,8 9,8 72,6 9,1 70,1 12,6 76,8 10,2 79,9 8,6 89,8 6,0 72,2 5,7 70,5 7,7 71,2 6,8 66,7

Srážky [mm] 0,0 0,0 2,7 6,9 0,3 0,0 0,0 5,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,5 0,1 2,2 0,9 10,7 12,1 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8,3 2,0 1,4 6,1 8,3 5,4 0,0 8,7 0,1 1,6 0,0 0,0 8,3 4,5 0,0 1,1 0,1 0,1

GR -2 [J·cm ] 1344,3 1637,9 357,1 1968,0 1526,9 2134,3 2047,4 561,9 2118,6 2246,6 2179,9 1408,2 1178,0 1118,5 725,0 427,2 580,8 380,4 1756,7 2483,1 1928,9 2071,6 2077,6 1986,6 2541,0 1654,8 2397,2 2430,2 1808,3 1797,3 2380,1 2637,0 2490,0 1900,8 1155,2 724,8 712,2 1048,5 2022,8 1941,8 1769,8 2002,3 1680,1 1867,0 837,3 1212,8 639,5 1669,2 462,7 481,7 962,4

105

Datum 19.V 20.V 21.V 22.V 23.V 24.V 25.V 26.V 27.V 28.V 29.V 30.V 31.V 1.VI 2.VI 3.VI 4.VI 5.VI 6.VI 7.VI 8.VI 9.VI 10.VI 11.VI 12.VI 13.VI 14.VI 15.VI 16.VI 17.VI 18.VI 19.VI 20.VI 21.VI 22.VI 23.VI 24.VI 25.VI 26.VI 27.VI 28.VI 29.VI 30.VI 1.VII 2.VII 3.VII 4.VII 5.VII 6.VII 7.VII 8.VII

Prům. t [°C] 8,4 12,2 15,0 15,1 14,6 14,3 15,5 13,3 15,1 15,4 15,9 14,8 11,8 10,9 9,9 13,6 16,4 17,2 18,4 20,1 21,4 24,1 24,5 24,1 24,0 18,3 15,2 15,6 15,8 17,6 16,4 14,4 13,0 13,8 16,0 16,2 16,9 18,2 18,7 19,3 20,5 21,9 22,7 22,2 23,0 22,8 21,3 21,1 17,5 16,3 18,6

Max. t [°C] 9,8 17,0 20,9 21,6 21,1 22,0 22,0 16,8 20,4 22,3 20,4 18,2 15,1 13,0 12,2 17,4 22,3 24,1 25,6 26,2 27,4 28,8 29,9 30,3 31,0 23,4 19,1 20,8 16,9 21,9 22,2 18,6 17,2 16,8 20,6 22,8 23,3 23,6 24,8 26,3 26,9 27,8 30,3 28,9 30,2 29,5 28,4 28,1 23,8 21,7 26,7

Min. t Prům. rh [°C] [%] 7,0 77,8 7,9 73,7 10,9 74,5 11,4 75,3 10,2 79,9 9,4 84,8 10,6 78,7 10,9 79,7 11,5 83,0 10,0 75,7 11,7 72,9 11,5 82,3 10,0 72,6 9,2 78,8 7,9 94,4 7,9 85,6 11,1 61,1 8,7 54,1 8,3 61,7 15,1 63,2 13,6 66,9 19,2 57,5 19,7 54,1 16,5 61,9 16,5 65,5 15,1 75,9 11,4 82,1 8,9 67,2 14,4 65,3 11,7 53,5 12,9 80,1 10,5 73,9 9,4 64,9 10,2 68,3 11,6 53,3 9,2 52,7 9,9 56,0 12,7 57,6 10,7 62,8 12,4 54,5 11,4 55,4 15,6 58,0 13,7 50,3 15,8 58,2 15,8 58,7 16,2 52,5 12,7 48,0 14,2 57,3 12,6 78,4 10,6 58,7 9,5 51,2

Srážky [mm] 6,5 0,0 1,0 0,4 5,7 16,4 7,9 0,4 3,6 5,6 3,0 0,1 0,0 5,9 29,8 0,0 0,4 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 8,7 11,2 23,7 0,0 2,8 0,0 35,9 0,1 0,1 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,6 0,1 0,0

GR -2 [J·cm ] 710,9 1224,3 1583,6 1850,5 1814,9 1730,9 2106,9 1333,6 1490,2 2784,2 2187,1 1167,8 1454,5 731,8 616,9 1683,0 2136,4 3168,3 3066,2 2242,8 2694,2 2833,6 2848,0 2828,6 2811,9 1892,6 1002,5 1996,7 656,9 1637,9 1242,9 1541,4 967,6 1017,3 2476,8 2965,8 2631,4 2053,5 2189,5 2850,2 3045,5 2726,6 2943,7 2405,9 2626,0 2872,3 2944,6 2679,8 1270,3 2206,8 3006,8

106

Datum 9.VII 10.VII 11.VII 12.VII 13.VII 14.VII 15.VII 16.VII 17.VII 18.VII 19.VII 20.VII 21.VII 22.VII 23.VII 24.VII 25.VII 26.VII 27.VII 28.VII 29.VII 30.VII 31.VII

Prům. t [°C] 21,2 23,4 24,4 25,7 24,8 25,8 25,4 27,0 24,9 17,1 18,0 20,9 24,0 25,7 24,2 16,6 14,8 15,1 18,8 19,3 18,6 15,6 17,9

Max. t [°C] 29,5 31,7 32,8 33,3 31,7 33,4 33,0 33,3 33,2 19,3 22,6 27,9 30,8 33,7 29,1 19,6 16,9 18,6 25,2 23,8 24,8 19,4 23,8

Min. t Prům. rh [°C] [%] 11,3 50,9 13,9 47,1 15,5 52,2 17,1 51,5 17,8 57,5 18,1 49,8 18,4 54,8 19,9 52,7 18,5 65,9 15,3 85,2 15,2 65,4 14,8 69,2 16,2 64,8 17,7 57,3 19,4 63,6 14,5 86,7 13,0 70,3 12,5 84,7 13,4 62,1 16,0 59,8 14,3 68,8 14,0 87,5 13,8 73,0

Srážky [mm] 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 1,9 1,8 14,8 3,1 0,1 0,0 34,2 12,2 0,0 2,6 0,0 0,0 13,4 4,4 0,0

GR -2 [J·cm ] 2933,7 2968,1 2909,9 2859,5 2525,0 2634,9 2173,5 2687,3 1968,8 480,1 2101,9 2147,7 2550,3 2600,9 2187,9 696,2 676,4 871,0 2455,0 1804,4 2013,8 867,9 1682,5

Příloha 3: Parametry lineární spojnice trendu hodnotami ABA zjištěnými v průběhu chladové aklimatizace s využitím DLT Název odrůdy Bill Šárka Zdar Sandra Mironovská 808 Leguan

Rovnice lineární spojnice trendu y = 18,392x + 59,001 y = 35,416x + 33,691 y = 29,531x + 40,569 y = 14,213x + 63,526 y = 25,052x + 75,763 y = 9,9691x + 95,949

R² 0,4176 0,8194 0,9834 0,0513 0,5277 0,6805

107