Vědecký výbor veterinární

Vědecký výbor veterinární ________________________________________________________________ Klasifikace:

Draft Oponovaný draft Finální dokument Deklasifikovaný dokument

Pro vnitřní potřebu VVV Pro vnitřní potřebu VVV

X

Pro oficiální použití Pro veřejné použití

MOŽNOSTI DETEKCE POSTVAKCINAČNÍCH PROTILÁTEK PROTI VIRU AVIÁRNÍ INFLUENZY Z MASA JATEČNĚ ZPRACOVANÉ HRABAVÉ A VODNÍ DRŮBEŽE

Garant studie :

Doc. MVDr. Petr Lány, Ph.D.

Spoluautoři studie: Mgr. Kateřina Rosenbergová Prof. MVDr.Zdeněk Pospíšil, DrSc

ŘÍJEN 2007

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno tel.: +420 54156 1111 / fax +4205 4121 9752, URL: http://www.vfu.cz/

Výzkumný ústav veterinárního lékařství v.v.i., Hudcova 70, 621 32, Brno Tel. +4205 3333 1111 / fax +4205 4121 1229, URL: http://www.vri.cz/

Úvod ................................................................................................................................... 3 Materiál a metodika ............................................................................................................ 4 2.1. Použitá zvířata ............................................................................................................ 4 2.1.1. Kuřata ................................................................................................................. 4 2.1.2. Kachny ............................................................................................................... 4 2.1.3. Husy ................................................................................................................... 4 2.2. Odběr vzorků .............................................................................................................. 5 2.2.1. Séra ..................................................................................................................... 5 2.2.2. Masové šťávy ..................................................................................................... 5 2.3. Stanovení protilátek.................................................................................................... 5 2.3.1. ELISA................................................................................................................. 5 2.3.2. Hemaglitinačně inhibiční test ............................................................................. 5 3. Výsledky............................................................................................................................. 6 3.1. Sérologické vyšetření ................................................................................................. 6 3.1.1. Kuřata ................................................................................................................. 6 3.1.2. Kachny ............................................................................................................... 7 3.1.3. Husy ................................................................................................................... 9 3.2. Vyhodnocení senzitivity a specifity použitých testů ................................................ 10 3.2.1. Kuřata ............................................................................................................... 10 3.2.2. Kachny ............................................................................................................. 11 3.2.3. Husy ................................................................................................................. 13 4. Diskuse ............................................................................................................................. 14 5. Závěr ................................................................................................................................. 15 6. Souhrn .............................................................................................................................. 16 1. 2.

1. ÚVOD Od roku 2006, kdy se v Evropě objevil vysokopatogenní virus aviární influenzy H5N1 byla v některých státech Evropské unie povolena vakcinace drůbeže, která se v jihovýchodní Asii provádí v daleko větším měřítku. Ochranná opatření proti zavlečení nákazy a zajištění bezpečnosti potravin nedovolojí dovoz vakcinované drůbeže do Evropské unie, potažmo na území České republiky. Detekce protilátek v séru drůbeže není problém, avšak vzhledem k tomu, že poražená drůbež je vykrvena, nelze sledovat protilátky v séru. Jedna z tělních tekutin, které lze získat z poražené drůbeže je masová šťáva. Průkaz protilátek v drůbeží masové šťávě nebyl zatím nikde publikován, ale jsou známé práce o průkazu protilátek proti salmonelám v masové šťávě z vepřového masa. Některé z těchto prací uvádějí, že hladina specifických protilátek je asi 10x nižší, než v krevním séru. V současné době se k průkazu protilátek proti influenze drůbeže v krevním séru standardně používá imunodifuzní test (IDT), který reaguje s protilátkami proti nukleoproteinu a matrixovému proteinu všech influenzových virů typu A. Pomocí IDT však nelze zjistit s jakým subtypem přišla drůbež do kontaktu, přičemž subtypů je v současné době 16 a za nebezpečné jsou považovány pouze varianty virů influenzy suptypů H5 a H7. Protilátky proti hemaglutininu H5 jsou v sérech infikované nebo vakcinované drůbeže zjistitelné hemaglutinačně inhibičním testem, který je subtypově specifický a nově také metodou ELISA. Naše práce byla zaměřena na možnost detekce postvakcinačních protilátek v masové šťávě z kuřat, kachen a hus a na porovnání senzitivity a specificity metod HIT a ELISA u jednotlivých druhů.

2.

MATERIÁL A METODIKA

2.1. Použitá zvířata Pokusná zvířata byla držena v akreditovaných experimentálních stájích Ústavu infekčních chorob a epizootologie na základě schváleného projektu pokusu. 2.1.1. Kuřata Byla použita 1 denní brojleří kuřata ROSS 308 z líhně ABRO Zdražílek, Hrušovany nad Jevišovkou, která byla krmena do 8. dne krmnou směsí BR I a potom až do porážky krmnou směsí BR II. Počty zvířat ve skupinách, doby vakcinace, revakcinace a porážky jsou v tabulce č. 1. Tabulka č. 1 Počty kuřat ve skupinách, vakcinace, revakcinace a porážka Skupiny Počet Vakcinace Revakcinace Porážka den života den života den života Kontrolní 6 0 0 40 Vakcinované 7 10 0 40 Revakcinované 7 10 24 40 2.1.2. Kachny Byla použita 1 denní bílá brojlerová kachňata kachny pekingské z líhní Rybářství Hodonín, která byla do 10 dne krmena granulovanou směsí pro výkrm kachen I a potom až do porážky krmnou směsí pro výkrm kachen II. Počty zvířat ve skupinách, doby vakcinace, revakcinace a porážky jsou v tabulce č. 2. Tabulka č. 2 Počty kachen ve skupinách, vakcinace, revakcinace a porážka Skupiny Počet Vakcinace Revakcinace Porážka den života den života den života Kontrolní 10 0 0 64 Vakcinované 10 10 0 63 Revakcinované 10 10 24 62 2.1.3. Husy Byla použita 10 denní housata husy landeské z líhní Rybářství Hodonín, která byly krmena od 10 dne až do porážky granulovanou krmnou směsí pro výkrm kachen II. Počty zvířat ve skupinách, doby vakcinace, revakcinace a porážky jsou v tabulce č. 3. Tabulka č. 3 Počty hus ve skupinách, vakcinace, revakcinace a porážka Skupiny Počet Vakcinace Revakcinace den života den života Kontrolní 9 0 0 Vakcinované 9 11 0 Revakcinované 9 11 25

Porážka den života 72 72 72

Vakcinace byla provedena komerční vakcínou Gallimune Flu H5N9 f. Merial, Italy, obsahující virus influenzy H5N9 v dávce 0,3 ml do stehenního svalu. Použití vakcíny proti aviární influenze u experimentální drůbeže bylo na základě povolení ředitele Ústavu státní kontroly veterinárních biopreparátů a léčiv povoleno ústředním ředitelem Státní veterinární správy České republiky. 2.2. Odběr vzorků 2.2.1. Séra Po omráčení drůbeže bylo provedeno vykrvení, krev byla zachycena na získání séra. Získané sérum bylo uloženo až do vyšetření při -20ºC. 2.2.2. Masové šťávy Z každého brojlera byla odebrána část prsní a stehenní svaloviny. Z kachen bylo pro měření množství uvolněné masové šťávy odebíráno 100g (+- 2g) prsní a stehenní (včetně lýtkové svaloviny) a pro odběr orgánové šťávy také celá játra. Z hus byla, pro malou hmotnost housat, odebrána veškerá svalovina stehna a lýtka. Masové šťávy ze svaloviny stehna a lýtka jsou pro zjednodušení dále označovány jako šťávy stehenní. Svalovina byla po dobu 4 - 6 hodin chlazena při 4ºC a poté byla zamražena na -20ºC. Svalovina byla pro uvolnění masové šťávy uložena přes noc při 4ºC. Uvolněná masová šťáva byla zachycena a až do vyšetření uložena při -20ºC. 2.3. Stanovení protilátek 2.3.1. ELISA Pro metodu ELISA byl dle firemního návodu použit kit H5 AIV Ab ELISA, f. Animal Genetics, Inc., Korea (viz http://www.oie.int/eng/avian_influenza/AI_kits.pdf). Test pracuje na principu kompetitivní ELISA. Postup byl dle firemního návodu a každé sérum bylo aplikováno do dvou jamek . 2.3.2. Hemaglitinačně inhibiční test HIT byl proveden v U destičkách dle metodiky O.I.E, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004, Chapter 2.1.14. Avian influenza B, 3b, (http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00037.htm). Použité byli živé viry H5N1 A/Chicken/Scotland/59 (Národní referenční laboratoř pro chřipku, Státní zdravotní ústav, Praha) a A/Cygnus olor/Brno/06 (vlastní izolát z pozitivního vzorku uhynulé labutě, získaného z Národní referenční laboratoře pro newcastleskou chorobu a aviární influenzu, Státní veterinární ústav, Praha) Všechny práce s živými viry byly prováděny v „Laboratořích nebezpečných nákaz“ Ústavu infekčních chorob a epizootologie, VFU Brno (stupeň zabezpečení BSL 3), kde je Státním úřadem pro jadernou bezpečnost povoleno nakládání s vysoce rizikovými agens - viry influenzy drůbeže. Ke stanovení senzitivity, specifity a vypovídajících hodnot pozitivního a negativního výsledku byl použit freewarový program Win Episcope 2 (http://www.clive.ed.ac.uk/cliveCatalogueItem.asp?id=B6BC9009-C10F-4393-A22D48F436516AC4)

3.

VÝSLEDKY

3.1. Sérologické vyšetření 3.1.1. Kuřata Výsledky metodami ELISA i HIT byly negativní u všech kontrolních vzorků sér i masových šťáv z nevakcinovaných kuřat a pozitivní ve všech vzorcích sér vakcinovaných i revakcinovaných kuřat. Negativní byl nález u vzorků masových šťáv z prsní svaloviny kuřat s nízkými hladinami sérových protilátek (skupina pouze 1x vakcinovaná). Vzorky masové šťávy ze stehenní svaloviny vakcinovaných kuřat byly jak pozitivní, tak negativní, přičemž metoda HIT měla větší záchytnost. U kuřat s vysokými hladinami sérových postvakcinačních protilátek (revakcinovaná kuřata) nebyly 100% pozitivní nálezy v masových šťávách z prsní svaloviny, vyšší záchytnost ale měla metoda ELISA, která měla také 100% záchytnost u vzorků ze stehenní svaloviny (tab. č. 4). Tab. č. 4 Kontrola č.1 Kontrola č.2 Kontrola č.3 Kontrola č.4 Kontrola č.5 Kontrola č.6

Výsledky u kuřat získané metodami ELISA a HIT Sérum Šťáva z prsní svaloviny ELISA HIT ELISA HIT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Vakcinavané č.1 Vakcinavané č.2 Vakcinavané č.3 Vakcinavané č.4 Vakcinavané č.5 Vakcinavané č.6 Vakcinavané č.7

+ + + + + + +

1:64 1:32 1:256 1:64 1:32 1:32 1:128

-

0 0 0 0 0 0 0

Revakcinovane č.1 + 1:512 0 Revakcinovane č.2 + 0 + 1:512 Revakcinovane č.3 + 1:1024 + 1:32 Revakcinovane č.4 1:16 + 1:256 Revakcinovane č.5 + 0 + 1:256 Revakcinovane č.6 + 1:128 0 Revakcinovane č.7 + 1:128 0 Zvýrazněná čísla ukazují nesrovnalosti mezi výsledky ELISA a HIT

Šťáva ze stehenní sval. ELISA HIT 0 0 0 0 0 0 + +

0 0 1:32 0 0 1:64 1:32

+ + + + + + +

1:64 0 1:128 1:32 1:32 1:16 0

Porovnáním výsledků metod ELISA a HIT ukazuje, že pozitivní nálezy jednou metodou ne vždy korelují s pozitivitou výsledků druhou metodou (viz tabulka č. 4).

3.1.2. Kachny V průběhu experimentu uhynula čtyři kachňata, dvě ve skupině kontrolní a dvě ve skupině 1x vakcinované. Při porovnání výsledků HIT s použitím aktuálního viru aviární influenzy H5 A/Cygnus olor/Brno/06 a staršího viru A/Chicken/ Scotland/59 dal lepší výsledky starší virus (tab. č.5), a proto byl použit pro další hodnocení. Protilátky sledované metodou HIT byly negativní u všech kontrolních vzorků z nevakcinovaných kachen. Protilátky však nebyly zachyceny jak v žádných vzorcích z masových šťáv u jednou vakcinovaných kachen, tak z žádných vzorků masových šťáv z prsní svaloviny revakcinovaných kachen. Metodou ELISA byly u kontrolní skupiny v masové šťávě ze svaloviny z prsou (1x) a z nohou (2x) nalezeny rozdílné výsledky, kdy v jedné jamce byl výsledek pozitivní a v druhé jamce negativní. Tyto rozdíly byly dány mírným překročením či naopak chybělo velmi málo k označení za pozitivní. Po opakovaném testování vzorků byl vzorek masové šťávy z prsní svaloviny pozitivní a oba vzorky z masové šťávy z nožní svaloviny negativní. U kachňat s vysokými sérovými hladinami postvakcinačních protilátek (revakcinovaná kuřata) byly pozitivní nálezy z obou masových šťáv, přičemž 100% byly ve vzorcích ze stehenní svaloviny (tab. č. 6). Tabulka č. 5 Porovnání výsledků HIT s aktuálním a starším virem aviární influenzy H5 Masová šťáva Sérum Prsní svalovina Stehenní svalovina Vzorek K č.1 K č.2 K č.3 K č.4 K č.5 K č.6 K č.7 K č.8 V č.1 V č.2 V č.3 V č.4 V č.5 V č.6 V č.7 V č.8 R č.1 R č.2 R č.3 R č.4 R č.5 R č.6 R č.7 R č.8 R č.9 R č.10

A/Cygnus olor/Brno/06

A/Chicken/ Scotland/59

A/Cygnus olor/Brno/06

A/Chicken/ Scotland/59

A/Cygnus olor/Brno/06

A/Chicken/ Scotland/59

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:32 1:16 1:4 0 0 1:32 1:16 1:32 1:8 0

0 0 0 0 0 0 0 0 1:16 0 1:4 0 1:16 1:8 1:8 1:4 1:512 1:64 1:16 1:128 1:128 1:256 1:64 1:64 1:64 1:128

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:4 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:4 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:4 0 0 1:8 0 1:32 0 0 0 1:16

Tab. č. 6

Výsledky u kachen získané metodami ELISA a HIT Sérum Šťáva z prsní svaloviny Šťáva ze stehenní sval ELISA HIT Množství ELISA HIT Množství ELISA HIT masové masové šťávy ze šťávy ze 100 g 100 g svaloviny svaloviny (ml) (ml K č.1 4,0 4,9 +- (-) K č.2 4,5 NT K č.3 8,0 2,5 +- (-) K č.4 5,0 5,0 K č.5 7,2 2,2 K č.6 8,3 5,5 K č.7 +- (+) 7,1 2,9 K č.8 6,3 5,9 Průměrné množství masové šťávy ze 100 g 6,3 4,1 svaloviny V č.1 + 1:16 6,8 9,9 V č.2 4,8 7,0 V č.3 + 1:4 7,6 9,1 V č.4 + 9,0 7,0 V č.5 +- (+) + 1:16 4,8 6,9 V č.6 + 1:8 4,6 3,1 V č.7 + 1:8 6,4 2,0 V č.8 + + + 1:4 6,0 3,0 Průměrné množství masové šťávy ze 100 g 6,3 6,0 svaloviny R č.1 + 1:512 3,4 4,8 + 1:4 R č.2 + + 1:64 3,0 7,4 R č.3 + + + 1:16 13,6 3,3 R č.4 + 1:128 8,5 3,7 + 1:8 R č.5 + + + 1:128 3,4 3,3 R č.6 + 1:256 9,5 NT + 1:32 R č.7 + + + 1:64 10,0 7,9 R č.8 + + + 1:64 7,6 NT R č.9 + + + 1:64 2,4 2,5 R č.10 + + + 1:128 6,8 2,8 1:16 Průměrné množství masové šťávy ze 100 g 7,6 4,7 svaloviny Čísla v závorkách jsou výsledky druhého vyšetření Zvýrazněná políčka ukazují nesrovnalosti mezi výsledky ELISA a HIT Tkáňová šťáva z jater měla při použití ELISA testu pozitivní výsledky ve všech třech skupinách, pro HIT byla pro silnou hemolýzu nepoužitelná.

3.1.3. Husy V průběhu experimentu nejdříve uhynulo jedno house, posléze byla z důvodů zaostávání v růstu a slabosti poražena čtyři housata. Po úhynu dalších čtyř růstově zaostávajících housat byla provedena jejich pitva a histologické vyšetření na Ústavu patologické morfologie naší fakulty. Na základě potvrzené aspergilózy byla provedena předčasná porážka zbývajících housat. Prsní svalovina byla minimálně vyvinuta a proto nebyla použita k získání masové šťávy. Při porovnání výsledků HIT s použitím aktuálního viru aviární influenzy H5 A/Cygnus olor/Brno/06 a staršího viru A/Chicken/ Scotland/59 dal, podobně jako u kachen, lepší výsledky starší virus (tab. č.7), a proto byl použit pro další hodnocení. Protilátky sledované metodou HIT byly negativní u vzorků sér i masových šťáv z nevakcinovaných kachen. Protilátky však nebyly zachyceny ani v žádných vzorcích masových šťáv u jednou vakcinovaných hus. Metodou ELISA byly v masové šťávě kontrolní nevakcinované skupiny nalezeny tři falešně pozitivní výsledky. U revakcinovaných housat byly pozitivní nálezy z masových šťáv jak metodou HIT, tak ELISA, přičemž ELISA měla větší záchytnost (tab. č. 8).

Vzorek K č.1 K č.2 K č.3 K č.4 K č.5 K č.6 K č.7 K č.8 V č.1 V č.2 V č.3 V č.4 V č.5 V č.6 V č.7 V č.8 V č. 9 R č.1 R č.2 R č.3 R č.4 R č.5 R č.6

Tabulka č. 7 Porovnání výsledků HIT s aktuálním a starším virem aviární influenzy H5 u hus Masová šťáva Sérum ze stehenní svalovina A/Cygnus olor/Brno/06

A/Chicken/ Scotland/59

A/Cygnus olor/Brno/06

A/Chicken/ Scotland/59

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:64 1:4 0 1:4 0 1:8 1:8 1:4 0 1:8 1:8 1:32 0 1:4

0 0 0 0 0 0 0 0 1:4 1:64 1:16 1:8 1:16 1:8 1:64 1:32 1:16 1:8 1:64 1:32 1:64 0 1:32

Netestováno 0 0 0 0 0 1:4 0 0 1:4 1:4 1:4 0 0 0 0 0 0 1:4 1:4 1:32 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1:4 1:16 1:16 1:128 0 1:64

Tab. č. 8 K č.1 K č.2 K č.3 K č.4 K č.5 K č.6 K č.7 V č.1 V č.2 V č.3 V č.4 V č.5 V č.6 V č.7 V č.8 V č.9

Výsledky u hus získané metodami ELISA a HIT Sérum Šťáva ze stehenní sval. ELISA HIT ELISA HIT + + + + + + + + + + + +

1:4 1:64 1:16 1:8 1:16 1:8 1:64 1:32 1:16

+ + + + + + +

-

R č.1 + 1:8 R č.2 + 1:64 + 1:16 R č.3 + 1:32 + 1:16 R č.4 + 1:64 + 1:128 R č.5 + + R č.6 + 1:32 + 1:64 Zvýrazněná políčka ukazují nesrovnalosti mezi výsledky ELISA a HIT 3.2. Vyhodnocení senzitivity a specifity použitých testů Pro stanovení senzitivity, specificity a další vlastnosti obou testů v programu WinEpiscope jsme při zadávání údajů do sloupce Disease No zadali nevakcinovaná zvířata a všechna vakcinovaná i revakcinovaná zvířata jsme zařadili do sloupce Diseas Yes. 3.2.1. Kuřata V masové šťávě z prsní svaloviny je senzitivita ELISA metody a HIT 21% resp. 14% a specificita obou testů je 100%. Vypovídající hodnota pozitivního výsledku je u obou testů 100% a negativního výsledku je 35% resp. 33% (obrázek č. 1). V masové šťávě ze stehenní svaloviny je senzitivita ELISA metody a HIT 64% resp. 57% a specificita obou testů je 100%. Vypovídající hodnota pozitivního výsledku je u obou testů 100% a negativního výsledku 54%, resp. 50% (obrázek č. 2).

Obrázek č. 1 Stanovení validity testů ELISA (#1)a HIT (#2) při vyšetřování masové šťávy z prsní svaloviny kuřat

Obrázek č. 2 Stanovení validity testů ELISA (#3)a HIT (#4) při vyšetřování masové šťávy ze stehenní svaloviny kuřat

3.2.2. Kachny V masové šťávě z prsní svaloviny je senzitivita ELISA metody a HIT 39% resp. 0% a specificita 87% resp 100%. Vypovídající hodnota pozitivního výsledku je u ELISA metody a HIT 87% resp. 100% a negativního výsledku je 39% u ELISA, u metody HIT ho nebylo možné stanovit (obrázek č. 3).

V masové šťávě ze stehenní svaloviny je senzitivita ELISA metody a HIT 67% resp. 22% a specificita obou testů je 100%. Vypovídající hodnota pozitivního výsledku je u obou testů 100% a negativního výsledku 57%, resp. 36% (obrázek č.4) Obrázek č. 3 Stanovení validity testů ELISA (#5)a HIT (#6) při vyšetřování masové šťávy z prsní svaloviny kachen

Obrázek č. 4 Stanovení validity testů ELISA (#7)a HIT (#8) při vyšetřování masové šťávy ze stehenní svaloviny kachen

3.2.3. Husy V masové šťávě ze stehenní svaloviny je senzitivita ELISA metody a HIT 80% resp. 27% a specificita je 57% resp. 100%. Vypovídající hodnota pozitivního výsledku je 80% resp. 100% a negativního výsledku 57%, resp. 39% (obrázek č5). Obrázek č. 5 Stanovení validity testů ELISA (#9)a HIT (#10) při vyšetřování masové šťávy ze stehenní svaloviny hus

4. DISKUSE Výsledky ukázaly rozdíly v senzitivitě HIT a ELISA testu. Rozdílnost výsledků mezi ELISA testem a metodou HIT při detekci protilátek v masových šťávách může být způsoben mnoha vlivy. Jedny z hlavních vlivů jsou hemaglutininy použité v uvedených testech a v jejich slabé reaktivitě s nízkými hladinami protilátek proti hemaglutininu použitému ve vakcíně nebo v interferenci mezi neuraminidázou a hemaglutininem. Při zjišťování vhodnějšího viru k HIT jsme porovnali dva kmeny viru s hemaglutininem H5. Protože vakcinační virus obsahoval virus s neuraminidázou N9 (H5N9), použili jsme k odstranění interference, způsobené protilátkami proti stejné neuraminidáze a hemaglutininu v HIT viry H5N1. A to jak aktuální terénní kmen z roku 2006, tak referenční kmene WHO euroasijské linie z roku 1959. Použitý ELISA test obsahuje pouze hemaglutinin z blíže nespecifikovaného viru euroasijské linie H5N1 ze současné panzootie. Vliv různých použitých hemaglutininů na HIT jasně ukázalo srovnání aktuálního kmene viru aviární influenzy izolovaného v roce 2006 z uhynulé labutě a staršího sbírkového kmene. Je zajímavé, že byly nalézány vyšší postvakcinační titry se starším sbírkovým kmenem. Nízká reaktivita postvakcinačních protilátek s aktuálním kmenem aviární influenzy však nastoluje otázku - jaký bude protektivní efekt imunizace touto vakcínou? Výsledky ELISA a HIT testů jsou shodné a vysoce senzitivní i specifické při detekci sérových hladin postvakcinačních protilátek u kuřat s různě vysokou hladinou sérových protilátek. Podobné výsledky dosáhl ELISA test u kachen i hus. Jeden negativní výsledek oběma testy u séra vakcinované kachny je možné vysvětlit malou reakcí jejího imunitního systému. HIT se u vodní drůbeže ukázal jen o něco méně senzitivní, když pozitivně neoznačil jedno kachní. Získání masové šťávy ukázalo v našem experimentu na kachnách značnou variabilitu v jejím uvolňování po jednoduchém zamražení a rozmražení. Příčina bude pravděpodobně v rozdílných fyzikálních vlastnostech svaloviny jednotlivých kusů. Při stanovení protilátek v masové šťávě získané z rozmraženého masa nejsou výsledky obou testů tak jednoznačné. Výrazný rozdíl je i v detekci obsahu protilátek v masové šťávě z prsní a stehenní svaloviny získané ze stejných zvířat a jak z kuřat, tak z kachen i hus. Naše hypotéza je taková, že stehenní svalovina je více zatěžována oproti svalovině prsní a je tedy i lépe prokrvena. Proto v ní po vykrvení může zůstat více zbytkové krve, což může následně zvýšit množství protilátek v uvolněné masové šťávě. Nízká senzitivita ELISA testu při detekci protilátek v masové šťávě u jedenkráte vakcinovaných kachen může být způsobena také nízkými hladinami cirkulujících protilátek, protože kachny na vakcinaci neodpovídají tak dobře, jako např. kur domácí. K detekci protilátek pouze v masové šťávě nevakcinované vodní drůbeže nemáme vysvětlení. Můžeme pouze teoretizovat o látkách uvolňovaných do masové šťávy vodní drůbeže, které nejsou u kuřat, a které mohou svými fyzikálními vlastnostmi inhibovat navazování protilátek na vázaný antigen. V případě kompetetivní ELISA, jako je tato, může nedostatečné navázání konjugované protilátky způsobit falešně pozitivní výsledek. Přesto mají ELISA testy oproti HIT výhodu v menších mezilaboratorních rozdílech a pro hromadné testování je metoda ELISA vhodnější, zvláště pokud se mají srovnávat výsledky více laboratoří.

5. ZÁVĚR Postvakcinační protilátky proti viru H5 lze spolehlivě detekovat v sérech vakcinovaných kuřecích, kachních i husích brojlerů použitím jak ELISA testu, tak HIT, který má však o něco menší senzitivitou. Pro monitoring protilátek se podle výsledků jako nejvhodnější u všech testovaných druhů drůbeže ukazuje masová šťáva ze stehenní svaloviny. Naopak vůbec nevyhovuje orgánová šťáva z jater. Výsledky jsou však závislé na koncentraci cirkulujících protilátek a proto může mít drůbež s nižšími titry negativní nálezy v masové šťávě. Senzitivita ELISA testu při použití stehenních masových šťáv z kachních a kuřecích brojlerů dosahuje pouze 66% resp. 64%. Z toho vyplývá, že skoro každý druhý vakcinovaný kus bude označen jako falešně negativní, tedy nevakcinovaný. Pozitivní výsledky ale mají velmi vysokou vypovídající hodnotu (predictive value +) - 100%. Senzitivita ELISA testu při detekci postvakcinačních protilátek ze stehenních masových šťáv z hus je vyšší a dosahuje 80%, ale nízká specificita testu – 57% (skoro každý druhý nevakcinovaný může být označen jako falešně pozitivní, tedy vakcinovaný) znehodnocuje vypovídající hodnotu pozitivního výsledku na pouhých 80%.

6. SOUHRN V experimentu byla prováděn pokus o detekci postvakcinačních protilátek po vakcinaci vakcínou s virem H5N9 v masových šťávách prsní a nožní svaloviny kuřecích, kachních a husích brojlerů metodami ELISA H5 AIV Ab testu a HIT s viry H5N1 A/Chicken/Scotland/59 a A/Cygnus olor/Brno/06. Pro srovnání bylo také prováděno vyšetření sér experimentálních zvířat. K sérologickému testování HIT nebyl vhodný virus H5N1 z roku 2006, lepší výsledky vykazoval referenční virus WHO z roku 1959. Získání masové šťávy ze 100 g kachní svaloviny ukázalo značnou variabilitu v jejím uvolňování po jednoduchém zamražení a rozmražení. Pro monitoring protilátek se podle výsledků jako nejvhodnější u všech testovaných druhů drůbeže ukazuje masová šťáva ze stehenní svaloviny. Senzitivita ELISA testu a HIT při použití stehenních masových šťáv z kachních brojlerů byla 66% resp. 22%, u kuřecích brojlerů 64% resp. 57% a u husích stehenních masových šťáv dosahuje 80% resp. 26%. Specificita byla u kuřecích a kachních masových šťáv 100%, kdežto u husích pouze 57%. 7. SUMMARY The aim of our experiment was attempt to detection of postvaccination antibodies in drippings from breast and leg muscle of chicken, duck and goose broilers after H5N9 avian influenza vaccination. To comparison the blood sera from the same experimental animals were tested too. Antibody response was analyzed using ELISA for H5 AIV antigen and haemagglutination inhibition test (HIT) with H5N1 A/Chicken/Scotland/59 and A/Cygnus olor/Brno/06 avian influenza viruses. In HIT the avian influenza virus H5N1 from year 2006 wasn't available, better results yield referential virus WHO from year 1959. Obtaining the dripping from 100g of duck muscle showed considerable variability in its loosening after simple freezing and refreezing. The dripping from leg muscle is the optimal to the monitoring of antibodies by all tested animals. Sensitivity of ELISA and HIT was 66% and 22% in duck leg muscle drippings, 64% and 57% in chicken leg muscle drippings and 80% and 26% in goose leg muscle drippings. Specifity was 100% in chicken and duck drippings, but only 57% in goose drippings.