VARIABILITY IN H-FABP, C-MYC, GH , LEP, LEPR GENES IN LARGE WHITE, LANDRACE AND DUROC BREEDS OF PIGS VARIABILITA GENŮ H-FABP, C-MYC, GH, LEP, LEPR U PLEMEN PRASAT BÍLÉ UŠLECHTILÉ, LANDRASE A DUROK Mikolášová R., Urban T. Ústav genetiky, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail:
[email protected] ABSTRACT We genotyped 313 pigs, breeds Large White (BU), Landrace(LA) and Duroc(D) in loci for HFABP, MYC, GH , LEP, LEPR genes. All of the breeds were in genetic equilibrium in the tested loci, except the breed BU in LEP loci. Observed heterozygosity was calculated from allele frequency with Popgene programme and range of levels was: BU/0,27 LEP - 0,52 H-FABP, LA/0,11 GHHaeII - 0,53 LEPR, D/0,38 GHMspI -0,53 GHHaeII. Observed heterozygosities were neare expected heterozygosities. Low values of average heterozygosity and PIC in LA than those in BU and D were determined. Keywords: candidate genes, H-FABP, MYC, GH , LEP, LEPR, heterozygosity, pig ABSTRAKT V souboru celkem 313 prasat plemen BU, LA , D jsme pomocí DNA testu stanovili genotypy v lokusech genů kandidátních pro masnou užitkovost prasat, H-FABP, MYC, GH , LEP, LEPR.. Byla zjištěna genetická rovnováha ve všech lokusech u všech tří testovaných plemen s výjimkou plemene BU v lokusu LEP. Heterozygotnost pozorovaná se pohybovala v tomto rozmezí: BU/0,27 LEP - 0,52 H-FABP; LA/0,11 GHHaeII - 0,53 LEPR; D/0,38 GHMspI -0,53 GHHaeII a těmito hodnotami se blížila heterozygotnosti očekávané. Klíčová slova: kandidátní geny, H-FABP, MYC, GH , LEP, LEPR., heterozygotnost, prase ÚVOD Při studiu asociací kandidátních genů s užitkovými parametry v populacích prasat vycházíme také z analyzování variability na genetické úrovni v rámci plemen a mezi jednotlivými plemeny, populacemi. Jako nástroj pro tuto analýzu slouží tzv. F-statistiky, pro jejichž výpočet je nutné určit heterozygotnosti studovaných populací. Cílem této práce bylo určení molekulárně genetické variability u šesti lokusů kandidátních genů a stanovení míry heterozygotnosti a polymorfního informačního obsahu u tří plemen prasat.
1
MATERIÁL A METODIKA Populace Analýza zahrnuje jedince plemen bílé ušlechtilé (n = 221) a landrase (n = 76), durok (n=16), kteří byly testováni ve stanici pro kontrolu výkrmnosti a jatečné hodnoty. Poměr pohlaví vepřík : prasnička byl přibližně 1:1. Izolace DNA Pro určení genotypů byla použita DNA: 1/ obsažená v 7-9µl lyzátu - dle kvality lyzátu a dle konkrétního polymorfismu - získaného izolací z krve testovaných zvířat proteinázovou metodou, modifikovanou v naší laboratoři (Nebola, Dvořák, 1994) 2/ obsažená v 1µl lyzátu získaného izolací pomocí QIAamp® kitu (QIAGEN). Genotypování metodou PCR-RFLP V následujícím přehledu uvádíme stručný přehled podmínek pro PCR amplifikaci jednotlivých genů, teplotní podmínky a počty cyklů naprogramované v termocykleru PTC100TM (MJ Research, Inc.), délky amplifikovaných fragmentů s polymorfními místy a literární zdroje. Název genu
Teplotní podmínky PCR
PCR produkt
Zdroj
H-FABP
95/60s 57/60s 72/120s, 30x
700bp
Gerbens et al.(1997)
MYC
95/40s 58/60s 72/60s, 30x
322bp
Reiner et al.(2000)
GH
95/40s 60/60s 72/90s, 30x
506bp
Schellander et al.(1994)
LEP
95/40s 55/60s 72/60s, 30x
152bp
Stratil et al.(1997)
LEPR
94/60s 55/60 72/120s, 30x
2000bp
Stratil et al. (1998)
Metodou RFLP dle literatury byly určeny tyto genotypy: Gen
Restrikční endonukleáza Genotypy
H-FABP:
HinfI
HH 195, 59; Hh 256, 195, 59; hh 256 bp
MYC:
MspI
AA 322; AB 322, 201, 121; BB 201, 121 bp
GH:
MspI
AA 222,147, 137; AB 282, 222, 147, 137; BB 282, 222 bp
GH:
HaeII
AA 333, 173; AB 506, 333, 173; BB 506 bp
LEP:
HinfI
TT 152; CT 152, 84, 68;- CC 84, 68 bp
LEPR:
HpaII
AA 2000; AB 2000,1450, 550; BB 1450, 550
Statistická analýza Pomocí programu Popgene version 1.31 (1999) bylo provedeno vyhodnocení sledované populace na základě zjištěných genotypů. Rozdíly ve frekvencích genotypů mezi plemeny byly
2
testovány chí kvadrát testem pro kontingenční tabulku k x m. Zjišťované populační parametry: frekvence genotypů a alel, Hardy-Weinbergova rovnováha, heterozygotnost pozorovaná (Pozor. het.), očekávaná (Oček. het.) a hodnoty PIC podle vzorců níže.
(
2N 1− ∑ qi2
H = 1− ∑ qi2
H=
(podle Nei 1973)
(podle Nei 1978)
2N − 1
)
n 2 n−1 n PIC= 1− ∑ pi − ∑ ∑ 2pi2p2j i=1 i=1 j=i+1 (podle Botstein et al., 1980)
VÝSLEDKY A DISKUZE Při hodnocení jednotlivých plemen pomocí genotypových a alelových frekvencí v tabulkách 1, 2, 3 byl zjištěn rovnovážný stav pro danou populaci ve všech lokusech s výjimkou lokusu LEP u plemene bílé ušlechtilé. Frekvence alely A lokusu GHMspI a GHHaeII u plemene LW uvádí Handler (1996) 0,71 resp. 0,53, u plemene LA stejný autor uvádí v lokusech GHMspI a GHHaeII frekvence alely A 0,98 resp. 0,16. Huang a kol. (2001) uvádí v lokusu HFABPHinfI u plemene LA frekvence alely H 0,75. Tab. 1: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene bílé ušlechtilé H-FABP
n
rel. freq. LEP
n
rel. freq. LEPR
n
rel. freq. MYC
n
rel. freq. GH-MspI
n
rel. freq. GH-HaeII rel. freq.
n
HH 36 0,41 TT 155 0,70 AA 2 0,11 AA 102 0,51 AA 96 0,57 AA 81 0,47
Genotypy Hh 45 0,52 CT 60 0,27 AB 8 0,42 AB 84 0,42 AB 60 0,36 AB 72 0,42
H-W (χ2)
Alely hh 6 0,07 CC 6 0,03 BB 9 0,47 BB 14 0,07 BB 13 0,07 BB 18 0,11
3
H
h
0,67±0,04 T
0,33±0,04 C
NS
* 0,84±0,02 A
0,16±0,02 B NS
0,32±0,08 A
0,68±0,08 B
0,72±0,03 A
0,28±0,03 B
0,75±0,03 A
0,25±0,03 B
0,68±0,04
0,32±0,04
NS
NS
NS
Tab. 2.: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene landrase Genotypy Alely HH Hh hh H h H-FABP n 28 8 3 rel. freq. 0,72 0,20 0,08 0,82±0,04 0,18±0,04 TT CT CC T C LEP n 64 10 2 rel. freq. 0,84 0,13 0,03 0,91±0,02 0,09±0,02 AA AB BB A B LEPR n 3 28 21 rel. freq. 0,06 0,54 0,40 0,33±0,05 0,67±0,05 AA AB BB A B MYC n 49 12 1 rel. freq. 0,79 0,19 0,02 0,89±0,03 0,11±0,03 AA AB BB A B GH-MspI n 46 6 1 rel. freq. 0,87 0,11 0,02 0,92±0,03 0,08±0,03 AA AB BB A B GH-HaeII n 7 15 35 rel. freq. 0,12 0,26 0,62 0,25±0,04 0,75±0,04
H-W (χ2) NS
NS
NS NS
NS
NS
Tab. 3.: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene durok LEP n rel. freq. MYC n rel. freq. GH-MspI n rel. freq. GH-HaeII n rel. freq.
TT 8 0,57 AA 8 0,53 AA 7 0,47 AA 6 0,38
Genotypy CT 6 0,43 AB 7 0,47 AB 8 0,53 AB 6 0,38
H-W (χ2)
Alely CC 0 BB 0 BB 0 BB 4 0,25
T
C
0,79±0,08 A
0,21±0,08 B
0,77±0,08 A
0,23±0,08 B
NS
NS
NS 0,73±0,08 A
0,27±0,08 B NS
0,56±0,09
0,44±0,09
Note: NS – neprůkazné; * P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01
Další statistickou charakteristikou zjištěnou pro celý soubor i jednotlivá plemena je heterozygotnost (Tabulky 4, 5, 6). U plemene BU nejnižší heterozygotnost pozorovaná i očekávaná v genu LEP a nejvyšší heterozygotnosti u tohoto plemene byly vypočteny pro HFABP lokus. U plemene LA byla nejnižší a nejvyšší heterozygotnost vypočtena pro lokusy GHMspI a LEPR resp. U plemene Durok byly zjištěny velmi podobné hodnoty heterozygotnosti lokusů testovaných u tohoto plemene, ale v důsledku malého počtu testovaných jedinců lze těžko srovnávat s ostatními plemeny. Průměrná pozorovaná heterozygotnost u plemene BU byla 0,40, u LA 0,24 a u D 0,45.
4
Tab. 4: Hodnoty heterozygotnosti a PIC pro jednotlivé lokusy zjištěné pro BU Pozor, het, H-FABP LEP LEPR MYC GH-MspI GH-HaeII průměr sx
0,5172 0,2715 0,4211 0,4200 0,4211 0,3550 0,4010 0,0819
Oček, het, (Nei 1973) 0,4405 0,2727 0,4321 0,4032 0,4321 0,3794 0,3934 0,0634
Oček, het, (Nei 1978) 0,4431 0,2733 0,4438 0,4042 0,4334 0,3805 0,3964
PIC 0,3440 0,2360 0,3390 0,3220 0,3390 0,3070
Tab. 5: Hodnoty heterozygotnosti a PIC pro jednotlivé lokusy zjištěné pro LA Pozor. het. H-FABP LEP LEPR MYC GH-MspI GH-HaeII průměr sx
0,2051 0,1316 0,5385 0,1935 0,2632 0,1132 0,2408 0,1554
Oček. het. (Nei 1973) 0,2945 0,1672 0,4401 0,2003 0,3793 0,1396 0,2702 0,1216
Oček. het. (Nei 1978) 0,2984 0,1683 0,4443 0,2019 0,3827 0,1409 0,2728
PIC 0,2520 0,1530 0,3430 0,1800 0,3070 0,1300
Tab. 6: Hodnoty heterozygotnosti a PIC pro jednotlivé lokusy zjištěné pro D Oček. het. Oček. het. PIC (Nei 1973) (Nei 1978) LEP 0,3492 0,2800 0,4286 0,3367 MYC 0,3701 0,2940 0,4667 0,3578 GH-MspI 0,5081 0,3710 0,3750 0,4922 GH-HaeII 0,4046 0,3150 0,5333 0,3911 průměr 0,4080 0,4509 0,3945 sx 0,0666 0,0689 Pozn.: Pozor. het.– pozorovaná heterozygotnost; Oček. het.– očekávaná heterozygotnost Pozor. het.
ZÁVĚR Zjistili jsme, že mezi plemeny BU, LA a D jsou průkazné rozdíly ve frekvencích genotypů sledovaných genů, při použití χ2 testu. Tyto výsledky jsou ovlivněny zejména nestejným počtem zjištěných genotypů. S těmito výsledky korespondují také rozdílné frekvence alel mezi plemeny. U všech tří testovaných plemen s výjimkou plemene BU v lokusu LEP byla zjištěna genetická H.-W. rovnováha ve všech lokusech. Zjištěné hodnoty heterozygotnosti a PIC byly opět různé mezi jednotlivými plemeny, kdy plemeno landrase vykazovalo nižší úroveň genetické variability.
5
POUŽITÁ LITERATURA Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. (1980): Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32, 314 – 331. Gerbens F., Rettenberger G., Lenstra J.A., Veerkamp J.H., tePas M.F.W.
(1997):
Characterization, chromosomal localization, and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene. Mammalian Genome, 8 (5): 328-332. Huang L., Lin W., Gao J., Ren J., Deng S. (2001): H-FABP polymorphism frequencies in ten pig breeds. Manuscript Handler J., Schmoll F., Stur I., Brem G., Schellander K. (1996): Distribution of ApaI and CfoI polymorphisms of the porcine growth-hormone (pGH) gene in two ryr 1 genotyped Austrian pig breeds. J. Anim. Breed. Genet., 113, 57-61. Dvorak J., Nebola M. (1994): Analysis of genotype distribution in Hal locus in pigs of landrace breed. Zivocisna Vyroba 39 (9): 781-788. Nei M. (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc Natl Acad Sci. USA 70: 3321-3323. Nei M. (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89:583-590. Reiner G., Willems H., Geldermann H., Dzapo V. (2000): Four PCR-RFLPs and a sequence polymorphism in the porcine c-myc proto-oncogene and confirmation of the chromosomal localisation on SSC4 by linkage mapping. Anim. Genet. 31 (2): 155-156. Schellander K., Peli J., Kneissl F., Schmoll F., Mayr B. (1994): Variation of the growthhormone gene in RYR-1 genotyped austrian pig breeds. J. Anim. Breed. Genet., 111 (2): 162166. Stratil A., Peelman L., VanPoucke M., Cepica S. (1997): A HinfI PCR-RFLP at the porcine leptin (LEP) gene. Anim. Genet. 28 (5): 371-372. Stratil A., Kopecny M., Moser G., Schroffel J., Cepica S. (1998): HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping. Anim. Genet., 29 (5): 405-406. Práce byla zpracována s podporou MŠMT MSM č. 432100001.
6
