.JURNAL SAINVETERINER
JSV 31 (2), Desember 2013
ISSN : 0126 - 0421
Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat Hewan Enrofloksasin Validation of the Spectrophotometry method on the concentration assessment of Enrofloxacine as the animal drug Ambarwati" Novida AriyaDil daD Maria Fatima Palupi' I Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan, Gunungsindur Bogor 16340 Email:
[email protected]
Abstract Validation for analysis of enrofloxacin injection method using spectrophotometry has been conducted. Enrofloksasin in a solution ofNaOH (sodium hydroxide) 0.1 N, measured at the maximum wavelength (A) 271 nm. The parameters of validation that were carried out are precision, accuracy, linearity, limit of detection and limit of quantitation. Precision showed good results with coefficien variation (CV) results smaller than that of CV Horwitz. Accuracy parameters calculated by the method of analysis to determine levels of analyte in a known active ingredient purity and yielded 0.449%. Linearity parameters showed good results with r = 0.9996. Limit of detection value was obtained for 0.757 flg / mL and limit of quantification of 2.522 flg / mL. The results of validation test of enrofloxacin injection analysis using spectrophotometric method can be used as a good method to provide a valid test of quality assurance veterinary drugs. Key words: validation, enrofloxacin, spectrophotometry, precision, accuracy
Abstrak Telah dilakukan validasi terhadap metode uji kadar obat hewan enrofloksasin dalam bentuk sediaan injeksi, digunakan metode spektrofotometri. Enrofloksasin dalam larutan NaOH (natrium hidroksida) 0, 1 N, diukur pada panjang gelombang maksimum (A)271 nm. Parameter validasi yang digunakan antara lain: presisi, akurasi, linearitas, batas deteksi dan batas kuantitasi. Parameter presisi menunjukkan hasil yang baik, dengan nilai koefisien variasi (CV) hasil uji lebih kecil daripada CV Horwitz. Parameter akurasi dihitung dengan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan aktifyang diketahui kemumiannya dan memberikan hasil 0,449 %. Parameter linearitas menunjukkanhasil yang baik dengan nilai r = 0,9996.Nilai batas deteksi diperoleh sebesar 0,757 flg/mL dan nilai batas kuantitasi sebesar 2,522 flg/mL. Hasil validasi uji kadar enrofloksasin bentuk sediaan injeksi dengan metode spektrofotometri memberikan hasi1 yang dapat diterima dan dapat digunakan sebagai metode yang valid untuk menjamin mutu hasil uji obat hewan. Kata kUDCi:validasi, enrofloksasin, spektrofotometri, presisi, akurasi
266
--
-
----
--
-- -
Ambarwati et al.
Pendahuluan
instrumentasi yang telah terkalibrasi serta sumber
Salah satu misi, tugas dan fungsi Balai Besar
daya laboratorium yang mendukung. Tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui
Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan
sejauh mana penyimpangan metode tidak dapat
(BBPMSOH) dalam SK Menteri Pertanian No.
dihindari pada kondisi normal, dengan seluruh
628/Kpts/OT.140/12/2003 adalah melaksanakan
elemen terkait telah terlaksana dengan baik dan
pengembangan tehnik dan metoda pengujian mutu
benar (Hadi, 2007). Validasi metode sangat diperlukan
obat hewan. Balai Besar Pengujian Mutu dan
oleh
Sertifikasi Obat Hewan, selaku laboratorium penguji
laboratorium, karena dapat mengetahui tingkat
harus melakukan validasi terhadap metode baku
kepercayaan yang dihasilkan dari suatu metode
yang dimodifikasi, dengan berpedoman pada ISO SNI/IEC 17025:2008.
pengujian (Hadi, 2007). Hasil validasi metode
Menurut ISO IEC 17025:2008, validasi adalah
analisis dapat digunakan sebagai bahan acuan untuk menentukan
apakah
metode
terse but dapat
konfirmasi melalui pengujian dan penyediaan bukti
digunakan untuk pengujian mutu secara rutin atau
obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
tidak. Validasi ulang perlu dilakukan meskipun
maksud terpenuhi (Hadi, 2007). Salah satu jenis
validasi sebelumnya menghasilkan data yang sesuai
validasi adalah validasi metode analisis/pengujian
dengan kriteria penerimaan, karena metode yang
(Aswad dkk., 2011). Metode pengujian ialah
dinyatakan valid pada kondisi tertentu belum pasti
prosedur tertentu untuk melaksanakan pengujian.
valid pada kondisi lain dikarenakan perbedaan
Validasi metode pengujian adalah suatu tindakan
peralatan dan pereaksi yang digunakan, analis yang
penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan
mengerjakan, waktu dan sebagainya (Oktavia,
percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
2006). Selain itu, validasi metode merupakan salah
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
satu bentuk jaminan mutu hasil kepada pelanggan,
penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter unjuk
dengan metode yang digunakan telah terbukti baik,
kerja pengujian
maka hasil yang dikeluarkan oleh BBPMSOH adalah valid.
antara
lain adalah
presisi
(keseksamaanlrepitabilitas), akurasi (kecermatan)
Enrofloksasin
(Shelke dkk., 2009), spesifisitas (selektifitas), batas
merupakan
fluorokuinolon
deteksi, batas kuantitasi, rentang linearitas, kekuatan
pertama yang diperkenalkan dan digunakan sebagai
(robustness) dan ketangguhan (rudgedness) (Hadi,
obat
2007; Harmita, 2004). Pemilihan parameter yang
Kemoterapeutika ini adalah senyawa quinolon
akan diuji tergantung dari jenis dan metode
pertama yang digunakan dalam veteriner, yang
pengujian yang akan divalidasi.
mempunyai
Penggunaan metode yang valid memegang
hewan
berspektrum
(Zahid
aktivitas
dan Isnindar,
2013).
antibakterisidal
antimikrobial
luas
dan
terhadap
peranan yang penting guna mendapatkan data yang
mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif
valid dari suatu laboratorium, di samping pengujian
(Dimitrova dkk., 2006) serta aktif baik pada fase
dilakukan oleh personel yang kompeten, dengan
diam maupun fase pertumbuhan dari replikasi
267
Validasi Metode Spektrofotometri
pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
bakteri dengan absorbsi yang lebih baik dan dapat
2012). Peningkatan jumlah sampel yang cukup
mencapai jaringan lebih cepat (Zahid dan Isnindar,
signifikan dan pentingnya memberikan jaminan
2013).
mutu hasil pengujian obat hewan dengan hasil uji
Enrofloksasin secara kimia dikenal sebagai 3-
yang valid maka perlu dilakukan validasi terhadap
kuinolin asam karboksilat, l-siklopropil- 7-(4-etil-lpiperazinil)-6- fluoro-1 ,4-dihidro-4-okso, dengan
metode pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis kadar enrofloksasin
rumus empiris C9H22FN303 dan berat molekul dari
sediaan injeksi menggunakan spektrofotometer
359,4 g/mol (Gambar I). Serbuk kristal berbentuk
dengan cara melakukan dan menguraikan tehnik validasi metode analisis.
jarum berwama putih atau agak kuning, tidak berbau dan berasa dan tersedia dalam garam hidroklorida, laktat dan sodium. Enrofloksasin sangat larut dalam as am
at au
bas a media,
larut
Materi dan Metode
dalam
dimetilformamida, sedikit larut dalam kloroform, Bahan yang disiapkan yaitu sampel obat hewan
metanol dan tidak larut dalam air (Zahid dan
injeksi yang mengandung enrofloksasin, natrium
Isnindar,2013).
o ...0
hidroksida/N
0
aOH
(Merck)
dan
standar
enrofloksasin (Sigma-Fluka). Alat yang dipakai
F
dalam pengujian adalah sebagai berikut: neraca digital (Libror), magnetic stirrer, vortex mixer
Nl
~N1
(Iuchi), labu ukur 50 mL, 100 mL, 1000 mL (Scott-
CH]
Gambar 1. Struktur kimia enrofloksasin
Duran), pipet volumetrik (Pyrex-Iwaki-A), kuvet dan spektrofotometer
UV-Vis double beam
(Shimadzu). Enrofloksasin memiliki aktivitas antibakteri berspektrum luas terhadap bakteri Gram negatif dan
Uji Presisi
Sejumlah sampel setara dengan 50-100 mg
Gram positif dan aktif baik pada fase diam maupun pertumbuhan dari replikasi bakteri. Enrofloksasin tidak membentuk ikatan komplek dengan protein plasma, sehingga memungkinkan metabolit secara bebas melewati membran plasma (Mitchell, 2006). Enrofloksasin merupakan antimikrobia yang
enrofloksasin dipipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan dengan pelarut NaOH 0,1 N. Pengenceran bertingkat dibuat menggunakan pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh konsentrasi akhir 10 ~g/mL (Anonim, 2009). Standar enrofloksasin ditimbang dengan tepat
cukup luas dikenal di dunia veteriner. Jumlah obat hewan yang mengandung enrofloksasin dan telah terdaftar di Indonesia terus meningkat dari 62 produk enrofloksasin pada tahun 2009 menjadi 73 produk enrofloksasin pada tahun 2012 (Anonim,
10 mg, kemudian dibuat pengenceran bertingkat digunakan pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh konsentrasi akhir 10 ~g!mL. Absorbansi sampel diukur dengan spektrofotometer UV/Vis pada
268
-
--
--
-
-
-
---
--
----
Ambarwati et at.
panjang gelombang maksimum 271 nm (Anonim,
CV Horwitz
2009).
(%) = t-O.510gC
CV hitung (%) <
Kadar yang didapat dari sampel dihitung dan
;
xCV Horwitz
C = konsentasi analit saat diukur
pengujian sampel di atas diulang sebanyak 7 kali, kemudian dihitung koefisien variasi (CV) (BPOM, 2009; Harmita, 2004). Rumus untuk menghitung
UjiAkurasi Penghitungan
persentase kadar enrofloksasin adalah sebagai
kerja
akurasi
digunakan metode analisis dalam menetapkan kadar
berikut (Rumus 1):
analit Aspl -x Astd
untuk
Cs XXd
dalam
bahan
aktif
yang
diketahui
kemumiannya (BPOM, 2009). Sejumlah 10 mg
x 100%
standar enrofloksasin ditimbang dan dilakukan
Cspl
pengenceran hingga diperoleh konsentrasi akhir 10 Aspl Astd Cstd Cspl
=absorbansi sampel = absorbansi standar = konsentrasi standar = konsentrasi sampel
)lg/mL. Absorbansi menggunakan
deviasi (SD) dan relatif standar deviasi (RSD) rumus
sebagai
terse but diukur
spektrofotometer
UV/Vis pada
panjang gelombang maksimum 271 nm. Penetapan
Nilai CV diperoleh dengan menghitung standar dengan
larutan
berikut
(Rumus
2)
kadar seperti di atas diulang sebanyak 7 kali (Hadi, 2007). Nilai perolehan kembali dihitung dengan rumus (Rumus 4) (Kantasubrata, 2011): 1 nilai benar - n nilai hitung 1
(Kantasubrata, 2011):
Akurasi (%)=
nilai benar
x 100%
Uji Linearitas SD =
Sejumlah
10 mg standar enrofIoksasin
ditimbang dan dibuat pengenceran bertingkat pada 5 RSD =
SD x
CV = RSD x 100 %
konsentrasi (BPOM, 2009) digunakan NaOH 0,1 N sehingga didapatkan konsentrasi 1,25; 2,5; 5,0; 10 dan 20 )lg/mL. Absorbansi tiap konsentrasi tersebut diukur
n =jumlah pengulangan x = kadar enrofloksasin pengujian ke-x x' = rerata kadar enrofloksasin Nilai CV hitung ini, kemudian dibandingkan
menggunakan spektrofotometer UVNis
pada panjang gelombang 271 nm dan nilai koefisien korelasi (r) dihitung. Nilai r didapat dari analisis regresl linier dengan (Rumus 5) (Kantasubrata, 2011): y = bx + a
dengan CV Horwitz (Rumus 3) (Kantasubrata, 2011):
269
a = intersep b = slope x = absprbansi
Validasi Metode Spektrofotometri
pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
lebih kecil daripada CV Horwitz. Menurut Harmita
HasH dan Pembahasan
(2004), suatu rnetode pengujian dikatakan seksarna
Uji Presisi
Keseksarnaan (presisi) rnerupakan ukuran
jika rnetode rnernberikan simpangan baku relatif
yang rnenunjukkan derajat kesesuaian antara hasil
(RSD) atau CV 2 % atau kurang. Sedangkan rnenurut
uji individual,
Kantasubrata
diukur rnelalui sebaran hasil
(2011), persyaratan repitabilitas
individual dari reratajika prosedur diterapkan secara
adalah baikjika nilai CVhitung lebih kecil atau sarna
berulang-ulang pada sarnpel yang diarnbil dari
dengan CV Horwitz, sehingga dapat dikatakan
carnpuran
2004).
bahwa rnetode uji enrofloksasin rnenggunakan
cara
spektrofotornetri ini rnernpunyai presisi yang baik
Pengujian
yang hornogen presisi
(Harrnita,
dilakukan
dengan
keterulangan yang dilaksanakan oleh penguji yang sarna. Hasil pengujian
kadar
(Tabell dan 2).
enrofloksasin
rnenggunakan spektrofotorneter UVNis
adalah
UjiAkurasi
sebagai berikut: Nilai CV pengujian ini adalah 0,934
Nilai akurasi dihitung rnelalui penetapan
%, sedangkan CV Horwitz yang terhitung adalah
kadar standar untuk rnenernukan perolehan kernbali
11,314 %. CV hasil pengujian dengan rnetode ini
terhadap nilai kadar standar sebenamya.
Tabel 1. Hasil Uji Kadar Enrofloksasin dengan Spektrofotorneter
Kadar Enrofloksasin(%)
Pengulanganke: 1 2 3 4 5 6 7 Rerata SD RSD
102,64 102,50 102,24 103,96 104,75 103,96 102,64 103,24 0,965 9,345 x 10-3
Tabel 2. Nilai Perolehan Kembali Standar Enrofloksasin Pengulanganke: 1 2 3 4 5 6 7
Kadar Enrofloksasin (%) 100,77 98,69 98,99 100,68 98,099 100,08 98,79
Rerata SD CV (%)
99,44 1,057 1,063
270
-
--
-
--
-
-----
-
- -
- --
--------
Ambarwati et al.
di
untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung
atas adalah 0,449 %. Semakin kecil nilai akurasi,
sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu
maka semakin mendekati nilai kebenaran suatu zat
rentang kerja yang diberikan (Harmita, 2004). HasH
(semakin akurat) (Kantasubrata, 2011). Sedangkan,
absorbansi pada uji linearitas terdapat dalam Tabel3, Gambar 2.
Akurasi penghitungan
kadar enrofloksasin
menurut Harmita (2004), selisih kadar pada berbagai harus 5 % atau kurang pada setiap
Dari data Tabel 3. Nilai r yang didapatkan
konsentrasi anal it dengan prosedur yang dilakukan.
adalah 0,9996, sedangkan syarat suatu metode uji
Oleh sebab itu, metode ini memiliki akurasi yang
mempunyai linearitas yang baik jika nilai r lebih
baik.
besar 0,98 (BPOM, 2009). Hal ini membuktikan
penentuan
bahwa metode uji enrofloksasin dengan metode spektrofotometrimempunyai linearitas yang baik.
Uji Linearitas Linearitas merupakan kemampuan metode Tabel 3. HasH Absorbansi untuk Uji Linearitas
Std Enrofloksasin(~g/mL) 0,00 1,25 2,50 5,00 10,00 20,00
Absorbansi 0,000 0,118 0,235 0,491 0,989 1,872
Intersep Slope R
0,009 86 0,09408 0,9996
2.0 y = O,094lx + 0.0097 RJ = 0.9991
.-41' 1.5 'i of
~kurvastandar
1.0
5t
it
0.5 -Linear (kurva standar enro)
0.0 0
10
20
30
kons8ntrasl
Gambar 2. Kurva kalibrasi larutan standar enrofloksasin
271
enro
Validasi Metode Spektrofotometri
pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
Daftar Pustaka
Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Definisi batas deteksi menurut Rarmita (2004) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
Anonim. (2009) Farmakope Obat Rewan Indonesia. Jilid II. Edisi IV. Direktorat Jenderal Petemakan dan Kesehatan Rewan. Jakarta.
dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan
dibandingkan
dengan
blanko.
Berdasarkan perhitungan, diperoleh batas deteksi pada konsentrasi 0,757 flg/mL untuk pengujian enrofloksasin dengan metode spektrofotometri. Ini berarti bahwa enrofloksasin pada konsentrasi tersebut masih dapat terbaca absorbansinya, namun tidak dapat digunakan dalam perhitungan, karena dapat membuat bias perhitungan. Batas kuantitasi merupakan parameter pada
Anonim. (2012) Indeks Obat Rewan Indonesia. Edisi VII. Asosiasi Obat Rewan Indonesia. Jakarta. 56-58, 81-85, 89-90, 132-135. Aswad, M., Fatmawaty, A., Nursamsiar, Rahmawanti. (2011) Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak untuk Analisis Formalin dalam Tahu. Majalah Farmasi dan Farmakologi. 15:26-29. BPOM. (2009) Petunjuk Operasional Penerapan Cara Pembuatan Obat yang Baik. Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 583-609.
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Nilai batas kuantitasi pada pengujian
ini sebesar
2,522
flg/mL.
Konsentrasi tersebut merupakan konsentrasi terkecil
Dimitrova, D.J., Lashev, L.D., Yaney, St.G., Pandova, V.T. (2006) Pharmacokinetics of Enrofloxacin and Its Metabolite Ciprofloxacin in Male and Female turkeys following Intravenous and Oral Administration. V. Research Com. 30: 415.
yang tidak menimbulkan bias perhitungan. Metode uji kadar obat hewan enrofloksasin menggunakan spektrofotometer telah divalidasi dengan presisi, akurasi dan linearitas yang baik.
Radi, A. (2007) Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025: Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi. PT. Gramedia Pustaka Utama.259-274.
Nilai batas deteksinya yaitu 0,757 flg/mL dan batas kuantitasinya yaitu 2,522 flg/mL. Berdasarkan hasil validasi ini, maka metode uji kadar enrofloksasin bentuk sediaan injeksi dengan spektrofotometri dapat digunakan sebagai metode uji yang baik, karena mampu memberikan jaminan mutu hasil uji
Rarmita. (2004) Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah IlmuKefarmasian.I: 117-135. Kantasubrata, J.K. (2011) Pelatihan Validasi dan Verifikasi Metode Pengujian. Disampaikan dalam Pelatihan Validasidan Verifikasi.Badan StandardisasiNasional.
yang valid. Mitchell, M. A. (2006) Enrofloxacin: Therapeutic Review..!.Exotic Pet. Med. 15:66-69. Ucapan Terima Kasih Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Emi Rusmiati yang telah membantu selama proses
Oktavia, E. (2006) Tehnik Validasi Metode Analisis Kadar Ketoprofen secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Buletin Tehnik Pertanian. 11: 23 - 28.
pembuatan tulisan ini.
272
---
Ambarwati et al.
Shelke, S., Dongre, S., Rathi, A., Dhamecha, D., Maria, S., Dehghan, M.H.G. (2009) Research Article: Development and Validation of UV Spectrophotometric Method of Cefuroxime Axetil in Bulk and Phrmaceutical Formulation. AsianJ. Research Chern.2: 222-224.
273
Zahid, M. dan Isnindar. (2013) Ulasan Ilmiah: Penggunaan Antibiotik Fluorokuinolon Sebagai Obat Hewan. Buletin Pengujian Mutu ObatHewan 12: 13-22.
