Vajna Balázs. doktori értekezés. Témavezető: Márialigeti Károly (ELTE Mikrobiológiai Tanszék)

Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Kísérletes Növénybiológia doktori program

Vajna Balázs

A baktérium közösségek változásának jellemzése molekuláris módszerekkel a laskagomba-alapanyag gyártása során: A T-RFLP adatfeldolgozás optimalizálása és alkalmazása – doktori értekezés –

Témavezető: Márialigeti Károly (ELTE Mikrobiológiai Tanszék)

A Biológia Doktori Iskola vezetője: Dr. Erdei Anna tanszékvezető egyetemi tanár (ELTE Immunológiai Tanszék)

A Kísérletes Növénybiológia doktori program vezetője: Dr. Szigeti Zoltán tanszékvezető egyetemi tanár (ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék)

Készült az ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszékén 2010-ben.

-2-

„A tudomány világossága azt a veszélyt hordozza magában, hogy az ember elhiszi: a világot és saját magát már teljesen a kezében tartja. A valóságban azonban a fényforrástól elvakítva a saját környezete sötétségbe

és

érthetetlenségbe

borul

számára,

miközben a saját orra ragyogó világosságban tündököl.”

(Peter Hoeg: Fortællinger om natten [Éjszakai történetek])

-3-

-4-

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék....................................................................................................... - 5 1. Rövidítések jegyzéke............................................................................................ - 7 2. Bevezetés ............................................................................................................. - 9 3. Irodalmi áttekintés.............................................................................................. - 11 3.1 A T-RFLP módszer helye a bakteriális közösségek diverzitásának vizsgálatában………...…………………………………...………...…..- 11 3.1.1 A T-RFLP módszer működési elve és célja ............................................ - 12 3.1.2 A T-RFLP kritikus lépései a DNS-izolálástól a gélelektroforézisig......... - 13 3.1.3 A T-RFLP eredmények adatfeldolgozása az adatmátrix elkészítéséig..... - 15 3.1.3.1 A nyers adatok feldolgozása a zajszűrésig ....................................... - 15 3.1.3.2 Zajszűrés......................................................................................... - 18 3.1.3.3 A futások egymáshoz illesztése – az adatmátrix létrehozása ............ - 20 3.1.4 T-RFLP eredmények értelmezése........................................................... - 22 3.1.4.1 T-RFLP ujjlenyomatok közötti különbségek vizuális megjelenítése. - 22 3.1.4.2 A T-RFLP ujjlenyomatok egymástól elváló csoportjainak felismerése ............................................................................... - 26 3.1.4.3 A T-RFLP ujjlenyomatok és más mért paraméterek összevetése...... - 27 3.1.4.4 A populációk azonosítása a közösségekben a T-RFLP módszer segítségével .............................................................................. - 29 3.1.5 A T-RFLP módszer rövid értékelése ...................................................... - 31 3.2 A laskagomba termesztése…...……………………………………………….- 32 3.2.1 Rövid történeti áttekintés ....................................................................... - 32 3.2.2 A termesztés napjainkban....................................................................... - 34 3.2.2.1 Az alapanyaggyártás ....................................................................... - 35 3.2.2.2 A termesztés.................................................................................... - 37 3.3 Mikrobiális folyamatok a laskagomba alapanyag-gyártáshoz hasonló környezetekben……………………………………………………………..- 38 3.3.1 Csiperkekomposzt gyártás mikrobiológiája ............................................ - 38 3.3.2 A komposztálás mikrobiológiája ............................................................ - 40 4. Célkitűzések ....................................................................................................... - 43 5. Anyag és módszer .............................................................................................. - 45 5.1 Laskagomba alapanyaggyártás és termesztés ………………………………- 45 5.2 Mintavétel és fizikai-kémiai analízis………… …………………………….- 45 5.3 Az alkalmazott baktérium-közösség elemző módszerek összefoglalása……..- 47 5.4 Közösségi DNS-kivonás………………………………………………...……- 48 5.4 T-RFLP……………………………………………………………...………..- 49 5.4.1 PCR reakció........................................................................................... - 49 5.4.2 Restrikciós emésztés és kapilláris elektroforézis..................................... - 49 5.4.3 T-RFLP adatfeldolgozás ........................................................................ - 50 5.5 Klónkönyvtárak készítése, elemzése és a T-RFLP mintázatokkal való összekapcsolása………………………………...…………………………..- 52 6. Eredmények és értékelésük................................................................................. - 55 6.1 A T-RFLP adatfeldolgozás optimálása……………...………………………..- 55 6.1.1 Futások nyersadatainak feldolgozása...................................................... - 55 6.1.2 Párhuzamos futások kérdése................................................................... - 57 6.1.3 A futások zajszűrése............................................................................... - 61 6.1.4 A futások egymáshoz illesztése .............................................................. - 63 6.1.5 A futások közötti különbségek láthatóvá tétele....................................... - 65 6.1.6 Az optimalizált T-RFLP adatfeldolgozás leírása..................................... - 69 -5-

6.2 A laskagomba-alapanyag gyártás során kialakuló baktérium-közösségek jellemzése…………………………………………...……………………...- 72 6.2.1 A teljes gyártási sor jellemzése T-RFLP segítségével ............................. - 72 6.2.1.1 A kész laskagomba alapanyag jellemzése T-RFLP segítségével....... - 75 6.2.2 Az egyes fázisok domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével .................................................................................................... - 80 6.2.2.1 Az 1. fázis domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével................................................................................................. - 83 6.2.2.2 A 3. fázis domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével................................................................................................. - 86 6.2.2.3 A kész alapanyag domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével ....................................................................... - 88 6.2.3 Az eredmények összegzése és továbblépési lehetőségek a laskagombaalapanyag gyártás baktérium-közösségeinek elemzése kapcsán....................... - 93 7. Összefoglalás...................................................................................................... - 95 8. Abstract .............................................................................................................. - 97 9. Irodalomjegyzék ................................................................................................. - 99 10. Köszönetnyilvánítás........................................................................................ - 113 -

-6-

1. Rövidítések jegyzéke ANOSIM: ANalysis Of Similarities (hasonlóságok elemzése) bp: bázispár CA: Correspondence Analysis (korreszpondencia elemzés) CCA: Canonical Correspondence Analysis (kanonikus korreszpondencia elemzés) CVA: Canonical Variate Analysis (kanonikus variancia elemzés) DA: Discriminant Analysis (diszkriminancia elemzés) db-RDA: distance based RDA (távolság alapú redundancia elemzés) dCA: detrended Correspondence Analysis („detrendált” korreszpondencia elemzés) DEPC: dietil-pirokarbonát DGGE:

Denaturing

Gradient

Gel

Electrophoresis

(denaturáló

gradiens

gélelektroforézis) FU: Fluorescence Unit (fluoreszcencia egység) MANOVA: Multivariate ANalysis Of VAriance (többváltozós variancia-elemzés) NMDS: Nonmetric Multi-Dimensional Scaling (nem-metrikus többdimenziós skálázás) NPMANOVA: NonParametric Multivariate ANalysis Of VAriance (nem-metrikus többváltozós variancia-elemzés) OTU: operational taxonomic unit (operatív rendszertani egység) PCA: principal component analysis (főkomponens elemzés) PCoA: principal coordinates analysis (főkoordináta elemzés) PCR: polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) PLFA: phospholipid fatty acid (foszfolipid-zsírsav) PVPP: polivinil-polipirrolidon RDA: Redundancy Analysis (redundancia elemzés) RFU: relative fluorescence unit (relatív fluoreszcens egység) RISA: ribosomal RNA intergenic spacer analysis (riboszomális RNS intergénikus szakaszainak elemzése) SIMPER: similarity percentages (hasonlósági százalékok) sp.: faj spp.: fajok SSCP: single strand conformation polymorphism (egyszálú DNS konformációs polimorfizmusa)

-7-

T-RF: Terminal Restriction Fragment (restrikciós enzimmel hasított darabok terminális része) T-RFLP: Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (restrikciós enzimmel hasított darabok terminális hossz-polimorfizmusa) UPGMA: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages (csoportátlag módszer)

-8-

2. Bevezetés A mikroba közösségek szerepének és működésének jobb megértéséhez alapvető feltétel a közösségek összetételének leírása. Hagyományosan ezt a (környezeti) mintákból való tenyészetek készítésével oldják meg, amelynek során tiszta tenyészeteket állítanak elő és jellemeznek. Ezekre a módszerekre ma is szükség van, hiszen így lehetséges az egyes baktériumok pontosabb megismerése, leírása. A mai mikrobiális ökológia egyik fő problémája azonban a „tenyésztésbe nem vonható” baktériumok kérdése. Vagyis az, hogy a korábbi eljárások csak a „mikrobiális jéghegy” csúcsát mutatják ki. A molekuláris technikák ugyanakkor új lehetőségeket adnak a mikrobiális sokféleség, a „csendes többség” diverzitásának a feltárásában (Handelsman és Smalla, 2003). A molekuláris módszerek egyrészt a teljes baktérium sejtet (pl.: fluoreszcens in situ hibridizáció), másrészt a mintákból kivont, a mikroba-közösségekre jellemző vegyületeket, elsősorban nukleinsavakat (DNS és RNS), zsírsavakat, kinonokat használják fel a baktériumok diverzitásának a vizsgálatára. A baktérium genom közösségi elemzés során leggyakrabban vizsgált része a 16S rDNS régió, amelynek részletes elemzését klónkönyvtárak vizsgálata segítségével végzik el. Nagyszámú minta esetében ez meglehetősen költség- és időígényes, így az elmúlt évtizedben számos közösségi ujjlenyomat vizsgáló módszer terjedt el, mint a DGGE (denaturáló gradiens gélelektroforézis), a RISA (Ribosomal RNA Intergenic Spacer Analysis; riboszomális RNS intergénikus szakaszainak elemzése), az SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism; egyszálú DNS konformációs polimorfizmusa) és a T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism; restrikciós enzimmel hasított darabok terminális

hossz-polimorfizmusa).

Ezek

közül

a

T-RFLP

pontosságával,

reprodukálhatóságával és nagy felbontásával tűnik ki (Osborn, 2000). Munkánk során ezért az ELTE Mikrobiológiai Tanszéken már hosszabb ideje használt T-RFLP módszert vizsgáltuk meg részletesen, és használtuk fel a laskagomba alapanyag-gyártás baktérium-közösségének monitorozására. A laskagomba (Pleurotus spp.) a csiperke után a második legnagyobb mennyiségben termelt gomba Magyarországon. Annak ellenére, hogy a laskagombát már régóta termesztik, nem rendelkezünk elégséges tudással az alapanyag mikrobiótájáról, amely az alapanyag minőségének fontos paramétere. Bár a komposztálás során végbemenő mikrobiológiai szukcessziót már régóta tanulmányozzák, az jelentősen eltér a gyorsabb és szabályozottabb, részleges komposztáláson, pasztörizáláson és kondicionáláson alapuló gomba-alapanyag előállítástól. Mivel tanszékünkön már évek óta foglalkozunk -9-

a komposztálás mikrobiológiájával, elsősorban a csiperketermesztés kapcsán, jelen munkánkban a laskagomba-alapanyag gyártási folyamatában jelenlévő és változó összetételű mikrobiota-közösségeket akartuk megismerni.

- 10 -

3. Irodalmi áttekintés 3.1 A T-RFLP módszer helye a bakteriális közösségek diverzitásának vizsgálatában A T-RFLP 1997-ben történt részletes leírása (Liu és mtsai, 1997) óta közkedvelt módszerré vált (3/1. ábra). A módszer kidolgozása mégis pár évvel korábbra nyúlik vissza. Cancilla és munkatársai (1992) genomi ujjlenyomat mintázatot hoztak létre Lactococcus lactis törzsekből. Ehhez kis szigorúságú AP-PCR-ben (arbitrarily primed polymerase

chain

reaction

[véletlenszerűen

indított

polimeráz

láncreakció])

fluoreszcensen megjelölt M13 primert használtak a törzsekből izolált DNS felszaporítására, melynek során a primerek önkényesen, nem a komplementer szekvenciának megfelelően kapcsolódtak a DNS templáthoz. A PCR-termékeket szekvenáló poliakrilamid gélben választották el. Avaniss-Aghajani és munkatársai 1994-ben már a mai T-RFLP-vel szinte azonos módszert dolgoztak ki, de azt a következő munkájukban (1996) még csak Mycobacterium törzsek elválasztására használták. Bruce (1997) gyakorlatilag Liu és munkatársaiéval (1997) megegyező módszert

használt

„fluorescent-PCR-restriction

fragment

length

polymorphism

profiling” néven egy higannyal szennyezett terület baktérium-közösségében a higanyrezisztencia (mer) gén diverzitásának kimutatására. 160

3500

140

3000 2500

100 2000 80 1500 60

Idézések száma

Publikációk száma

120

1000

40

500

20 0

0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Év

Publikációk száma

Idézések száma

3/1. ábra: A T-RFLP módszer megjelenése a publikációkban, és ezen közlemények idézettsége az elmúlt évtizedben. Forrás: Web of Science (ISI Web of Knowledge, Thomson Reuters) keresés 2010. május 10-én „T-RFLP” kulcsszóval (topic) a 2009 decemberéig tartó időszakban.

- 11 -

3.1.1 A T-RFLP módszer működési elve és célja A T-RFLP vizsgálatokat két fő szakaszra lehet bontani. Az első szakasz a T-RFLP ujjlenyomat létrehozása, mely 3 részből áll. (1) Az izolált DNS megfelelő szakaszait 5’ végén fluoreszcensen jelölt PCR-primerekkel felszaporítják. Így az egyik végükön jelölt PCR-termékek jönnek létre. (2) Ezeket restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztik, ami által különböző méretű jelölt – ez a hasított szakaszok terminális része, a T-RF (terminális restrikciós fragment) – és jelöletlen DNS szakaszok (fragmentumok) keletkeznek. A reakcióelegyet ezután tisztítják (például etanolos kicsapással). (3) Végül a jelölt és jelöletlen DNS-fragmentumokat nagy felbontású kapilláris gélelektroforézis segítségével választják el, és közülük a jelölt szakaszokat (T-RF-ek) a fluoreszcencia alapján lézerfény segítségével detektálják. A detektálás során keletkezik a T-RFLP kromatogram (3/2. ábra). A második szakasz a T-RFLP kromatogram adatfeldolgozása, értelmezése (ld. 3.1.3-3.1.4 fejezet; 16. oldal, 3/3. ábra).

Környezeti mintából izolált DNS

Fluroeszcensen jelölt PCR termékek (1) PCR reakció fluoreszcensen jelölt primerekkel

relatív fluoreszcencia

(2) Emésztés restrikciós enzimekkel

e

a

c

b

a (3) DNS fragmentumok elválasztása

d

c poliakrilamid gélelektroforézissel

e

retenciós idő

f

T-RFLP kromatogram Fluroeszcensen jelölt és jelöletlen fragmentumok

3/2. ábra: T-RFLP ujjlenyomat létrehozása.

A T-RFLP vizsgálatok célját négy fő csoportba lehet sorolni (Schütte és mtsai, 2008). (1) Ujjlenyomatok közötti különbségek láthatóvá tétele, elsősorban ordinációk segítségével. (2) Egymástól szignifikánsan elváló csoportok felismerése osztályozással. (3) A T-RFLP módszerrel feltárt mikrobiális változatosság és az egyéb környezeti tényezőkben megfigyelt változatosság közötti összefüggések feltárása. (4) Populációk azonosítása a közösségekben. - 12 -

Az ELTE, Mikrobiológiai Tanszéken több korábbi munka (Mohr, 2006; Sipos, 2009) foglalkozott a módszer optimalizálásával a DNS-izolálástól kezdve a kapilláris elektroforézis futtatási paramétereinek beállításáig. A következőkben ezért elsősorban a T-RFLP eredmények adatfeldolgozásának, értelmezésének irodalmára összpontosítunk (3.1.3-3.1.4 fejezet), és a korábbi lépéseket, a T-RFLP ujjlenyomat létrehozását, csak rövidebben tekintjük át (3.1.2 fejezet). Már itt érdemes megjegyezni, hogy a következő fejezetekből úgy tűnhet, hogy a TRFLP módszernek rengeteg hibája van. Ezért felmerülhet az olvasóban, hogy akkor miért is ezt az eljárást választottuk a vizsgálatok elvégzésére. A T-RFLP-nek valóban vannak hibái, de véleményünk szerint nem több mint más hasonló technikáknak (ARISA, DGGE, SSCP). Azért mutatjuk be az egyes lépéseket, és emeljük ki a hibákat is, mert egy módszert akkor tudunk megfelelően alkalmazni, eredményeit helyesen értékelni, ha előnyei mellett ismerjük hibáit, korlátait is.

3.1.2 A T-RFLP kritikus lépései a DNS-izolálástól a gélelektroforézisig Mint minden közösségi DNS-izoláláson és PCR-en alapuló technika, a T-RFLP is magában hordozza ezen lépések hibáit, torzításait. Ezeket részletesen áttekintik von Wintzingerode és munkatársai (1997), Sipos és munkatársai (2007) valamint Sipos (2009). A torzításokat valamint azok hatását a módszerek optimalizálásával és egységesítésével lehet leginkább csökkenteni. Singh és munkatársai (2006) ezen felül hasonló T-RFLP mintázatot mutattak ki olyan módon is, hogy ugyanazon mintákból két különböző módszerrel vonták ki a DNS-t és direkt mellett nested-PCR-t is alkalmaztak. Szerintük a korábban leírt eltéréseket részben a különbségek kimutatására használt DGGE torzításai (pl.: gélhibák) okozták, nem maguk a DNS-izolálások közti különbségek. A következő lépés a restrikciós emésztés. Ismert, hogy restrikciós enzimek hasítási hatékonysága függhet a célszekvencia környezetétől is, ugyanis a DNS-szál végén található helyeken csak részleges hasítást végeznek (Moreira és Noren, 1995). Egy másik probléma, hogy a PCR során részlegesen egyszálú DNS-szakaszok is keletkeznek, amit a restrikciós enzimek nem ismernek fel, hanem „átugornak”. Az egyszálú szakaszok mennyiségét a PCR ciklusszámának csökkentésével és az egyszálú DNS-t elbontó mungóbab-nukleázos kezeléssel lehet mérsékelni (Egert és Friedrich, 2003). Ezek miatt is lehetséges, hogy két DNS-szakasz, melynek in silico meghatározott terminális fragmentuma ugyanakkora, a kapilláris elektroforézis során eltérő T-RF méretet eredményez. Az itt használt legtöbb restrikciós enzim négy bázispáros felismerő - 13 -

hellyel rendelkezik. Mivel ezen szakaszok aránylag gyakoriak az egyes szekvenciákban, nem rokon szekvenciák is rendelkezhetnek azonos pozícióban található felismerő hellyel. Tehát egy restrikciós enzimmel való emésztés segítségével nem különíthető el az összes szekvencia. Ezért már Liu és munkatársai (1997) is ajánlják, hogy egy munkában párhuzamosan alkalmazva több restrikciós enzimet használjunk. Számuk meghatározásához a gyakorlatban a közösség diverzitása mellett figyelembe kell venni természetesen a rendelkezésre álló időt, a feladat mennyiségét és az anyagi keretet is. Ezért bíztató, hogy már 2 enzim alkalmazásával is szignifikánsan nő a kimutatott OTUk (operational taxonomic unit; operatív rendszertani egység, genotípusok) száma. Az enzimek számának „korlátlan” növelése ellen szól, hogy az 50 tagnál nagyobb diverzitású in silico modellközösségekben, 4 restrikciós enzim párhuzamos használata esetén is maximálisan csak az OTU-k 70%-át lehetett kimutatni (Engebretson és Moyer, 2003). Ha rendelkezünk a vizsgálni kívánt közösségről már előzetes információkkal, akkor számos szoftver (TAP, MiCA, TRF-CUT, REPK; ld. 29. oldal, 3.1.4.4 fejezet) segíthet a konkrét enzimek kiválasztásában (Schütte és mtsai, 2008). Ezek ajánlásai a program adatbázisában található vagy általunk megadott szekvenciák in silico hasításain alapulnak. Az adatbázisok azonban csak részben fedik le az általunk vizsgálni kívánt közösséget, valamint a valós és az in silico módon meghatározott fragmenthosszok eltérhetnek (ld. alább és 3.1.4.4 fejezet), így a programok által ajánlott enzimeket mindenképpen ajánlatos ténylegesen kipróbálni a mintasorozatok részletes vizsgálata előtt. Az utolsó lépés az emésztett fragmentumok elektroforézise, amit gélben vagy kapillárisban lehet elvégezni. Az elválasztott fragmentumok közül a jelölt szakaszokat (T-RF-ek) a fluoreszcens jelölés alapján lézerfény segítségével detektálják. A fragmentumok méretének meghatározásához egy a mintától eltérő fluoreszcens festékkel megjelölt,

ismert

méretű DNS-fragment

keveréket (belső kontroll,

méretmarker) adnak még a mintához. Ez teszi lehetővé, hogy az egyes T-RFLP futásokat össze lehessen hasonlítani egymással. A gyakorlatban a kapilláris elektroforézis az elterjedtebb, pontosabb elválasztásának, nagyobb felbontásának köszönhetően. Ebben az esetben a hagyományos poliakrilamid gélelektroforézissel szemben a DNS elektrokinetikus injektálással kerül a kapillárisba, ami előnyben részesíti a rövidebb fragmentumokat. A hibát csökkenti az alacsony sókoncentráció. Ezért szükséges az emésztett termékek megfelelő tiszítása (pl. etanolos kicsapással) (Irwin és mtsai, 2003). A kapillárisban a denaturálószernek (pl. formamid) és a magas hőmérsékletnek (kb. 60 °C) köszönhetően a DNS denaturált állapotba kerül, - 14 -

és a futás során az elektroforetikus erők képezik az elválasztás alapját. Így a T-RF-ek szeparációja nem közvetlenül a méreten, hanem a vele szorosan összefüggő töltésen alapszik (Slater és mtsai, 2003). Azonban a T-RF-ek mobilitása és töltése, valamint mérete között nem teljesen lineáris az összefüggés, a nagyobb T-RF-ek mobilitása az előre vártnál kisebb (Kitts, 2001), ami szintén szükségessé teszi a méretmarker használatát. A denaturáló körülményeknek köszönhetően a molekulák másodlagos szerkezetének nincs hatása a mobilitásra, a fragmentumok eltérő GC-tartalma viszont csökkenti a pontosságot, mivel a purin-bázisok „nehezebbek” mint a pirimidin-bázisok (Kaplan és Kitts, 2003). Ezért a T-RF-ek bázispárban (bp) megadott mérete nem csak egész (100 bp) hanem törtszám (100,46 bp) is lehet. Így a T-RF-ek mérete nem egy kategorikus, csak diszkrét értékeket felvevő, hanem egy folytonos változó. Mindezeket figyelembe véve a kapilláris elektroforézis tehát egy nagy felbontású, de nem abszolút pontossággal rendelkező módszer: elvileg a megismételt futások között maximum ± 1 bp (bázispár) az eltérés az azonos csúcsok között (Behr és mtsai, 1999), sőt Wenz és munkatársai (1998) 0,25 bp alatti átlagos eltérést mutattak ki ABI PRISM 310 készüléken. A gyakorlatban azonban a kapilláris üzemidejének növekedésével ez a pontosság csökkenhet. Ezért lehet szükség ugyanazon minta többszöri futtatására, hogy a fellépő hibákat csökkenteni lehessen. (Az ilyen futásokat fogjuk a továbbiakban párhuzamos futásoknak nevezni.)

3.1.3 A T-RFLP eredmények adatfeldolgozása az adatmátrix elkészítéséig A T-RFLP vizsgálat második szakasza az eredmények, a feldolgozatlan T-RFLP kromatogram, adatfeldolgozása, értelmezése, aminek irodalmát a jelen és a következő (3.1.4) fejezetben tekintjük át. A folyamat lépéseit a következő oldalon a 3/3. ábra foglalja össze.

3.1.3.1 A nyers adatok feldolgozása a zajszűrésig Applied Biosystems kapilláris elektroforézis rendszerek használata esetén a GeneMapper program automatikusan értékeli az egyes futásokat, és amennyiben nem találja meg a belső kontroll csúcsait, ki sem értékeli a futást. A kiértékelés után érdemes manuálisan is ellenőrízni a görbét, mert lehetnek benne olyan rendellenességek, amit a program nem jelez. (ld. 56. oldal, 6/1. ábra. Mivel a módszer optimalizációja az elvégzett munka része az Irodalmi áttekintésben az Eredmények és értékelésük fejezet megfelelő ábráira hivatkozunk.) - 15 -

3.1.3: A T-RFLP eredmények adatfeldolgozása az adatmátrix elkészítéséig T-RFLP kromatogram 3.1.3.1: A nyers adatok feldolgozása: • Futás minőségének ellenőrzése • Csúcsok detektálása • Minta mennyiségének ellenőrzése • Detektált csúcsok pozíciójának meghatározása Kiértékelt T-RFLP kromatogram 6-019-1 Alu-050 Alu-053 Alu-054 Alu-056 Alu-057 Alu-059 Alu-060 Alu-062 Alu-063 Alu-065 Alu-066 Alu-067 Alu-070 Alu-072 Alu-074 Alu-075

3.1.3.2: Zajszűrés 3.1.3.3: Futások egymáshoz illesztése, adatmátrix létrehozása

6-019-7 6-055-1 6-055-3 1, 21 0,34 0 0 0 0 0 2,87 0,27 0, 78 0 0 0 0 0 0, 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,66 7, 49 0 0 4, 31 0,51 1,5 0 0 0 3, 99 0 1,29 17, 05 20,19 0,68 0 16,03 1,13 1, 38 7,28 5,37

0 0 0 0 0 0 0 0,75 0 0 0 0 22,41 6,25 1,5 0

Adatmátrix

3.1.4: T-RFLP eredmények értelmezése

3.1.4.1: T-RFLP ujjlenyomatok közötti különbségek láthatóvá tétele 3,6

3.1.4.3: T-RFLP ujjlenyomatok és más mért paraméterek összevetése

3.1.4.2: T-RFLP ujjlenyomatok egymástól elváló csoportjainak felismerése

3.1.4.4: Populációk azonosítása a közösségekben

6-55-1 6-019-7

0,3

0,8

0

1,2

0,7

7- 019-7 7- 051-7

0

6-09 3- 7

7-203-7 6-05 5-7

6-099-7

-1,2

7-19 7-7

6-077-7

6-11 0- 7

0,6 52

68 0,4

21

56

-2

-1,5

-1

-0,5 0 PC1 (23,0%)

0,5

1

1,5

6-19-7

74

-1,2 33 36

8 31

37 18

6- 061-7 0,2

-2,5

12

38

0,3

-0,9

52 25

27

konverzió-10-FPU hemi-cellulóz

28

35

17 1114

cellulóz S-H S-2/3 S-2/14 6-19-1

-0,6

64 95

0,5

47

S-2/6

-1,5

32 57

27

-1,8 -3

-0,3

94

7-178-7 7-187-7

7-11 8- 7

6- 104-7 8-06 7- 7

98

CCA2

0,6

-0,6

6-55-3 6-55-7 sza% lignin hamu

0,6 0,9

1,8

Hasonlóság

PC2 (16,3%)

3 2,4

66

-1,8 49 100

0,1

-0,9 -0,6 -0,3 0

4

8

12

16

20

24

28

32

0

0,3 0,6 CCA1

0,9

1,2 1,5

1,8

3/3. ábra: A T-RFLP eredmények adatfeldolgozásának, értelmezésének főbb lépései. A számok az Irodalmi áttekintés megfelelő fejezeteire utalnak.

A második lépés a csúcsok megtalálása a nyers kromatogramban. Ehhez az egyes szoftverek

(pl.:

GeneMapper)

polinom

görbét

illesztenek

a

feldolgozatlan

kromatogramra, és a csúcsot úgy definiálják, mint egy olyan görberészletet, amelynek magassága, szélessége és a szakasz elején és végén mérhető meredeksége meghalad egy előre megadott küszöbértéket. Általában érdemes meghagyni a gyári beállítást. Változtatásra akkor van szükség, ha ezekkel a beállításokkal a szoftver „nem vesz észre” általunk „szabad szemmel” csúcsnak tekintett részleteket, több csúcsot egybeolvaszt, vagy éppen fordítva egy csúcsot feleslegesen több részre választ szét. Ekkor a paraméterek kísérletes finomhangolásával vagy a kérdéses esetek manuális felülbírálásával érhetjük el a kívánt eredményt (ld. 56. oldal, 6/2. ábra). A következőkben el kell dönteni, hogy megfelel-e az adott futás minősége a további munka részére. Ehhez ellenőrizni kell a kapillárisbaa injektált fluoreszcensen jelölt DNS mennyiségét. Ezt ugyanis nem lehet előre, a DNS koncentrációjának megmérésével meghatározni. Hiszen a kapilláris elektroforézisben ugyanúgy résztvevő, de a fluoreszcens detektálásból kimaradó, jelöletlen DNS fragmentumok mennyiségét is meghatároznánk. Másrészt az elektrokinetikus injektálás ugyanazon mintából sem - 16 -

mindig azonos mennyiségű jelölt fragmentumot juttat a kapillárisbaa. Alsó korlátként Rossi és munkatársai (2009) azt javasolják, hogy akkor fogadjunk el egy futást, ha a csúcsok görbe alatti területe (összfluoreszcencia) meghaladja a 100.000 relatív fluoreszcens egységet (RFU: relative fluorescence unit), és a háttérzaj magassága nem haladja meg a 10 fluoreszcencia egységet (FU: fluorescence unit), ahol az RFU és FU mértékegységek az elemzést végző program saját mértékegységei. A felső korlát, hogy ne juttassunk a kapillárisra annál több DNS-t, mint amennyit a műszer érzékelni tud, vagyis kerüljük el az annál nagyobb fluoreszcencia-intenzitású („offscale”) csúcsok megjelenését. Természetesen ezeket az értékeket is munkánként és készülékenként érdemes meghatározni. Hiszen egy nagyon diverz közösség esetén még 100.000-nél jóval magasabb összfluoreszcencia értékek is csak kis csúcsokat eredményeznek, míg egy kis diverzitású közösségnél egy-két nagy domináns csúcs miatt a 100.000-es RFU értéket is csak alig lehet elérni. Negyedik lépés a detektált csúcsok pozíciójának meghatározása, amelyhez a szoftver a méretmarker fragmentumainak ismert méreteit használja fel. Ehhez számos eljárás áll rendelkezésre. Osborn és munkatársai (2000) szerint a legpontosabb eredményt a Southern (1979) által kidolgozott Local Southern algoritmus adja, de megjegyzik, hogy minden munkában érdemes kísérletesen kiválasztani a legmegfelelőbb módszert. A pontos méretmeghatározást több dolog is akadályozza (Kaplan és Kitts, 2003). Először is a minta és a méretmarker DNS-ének eltérő fluoreszcens festékkel való jelölése miatt az azonos hosszúságú szakaszok nem pontosan ugyanolyan gyorsan „futnak” a gélben. Ezt egyszerű számítással javítani lehet, amit a Beckman-Coulter rendszerek tartalmaznak is, az Applied Biosystems műszerei sajnos még nem. Mint fentebb említettük, a fragmentumok eltérő GC-tartalma szintén csökkenti a pontosságot, mivel a purin-bázisok „nehezebbek” mint a pirimidin-bázisok. A bázissorrend elemzéssel és elektroforézissel meghatározott T-RF hossz közötti eltéréseket a T-RF-drift fogalommal definiálja az irodalom (Kaplan és Kitts, 2003). Ezeket az eltéréseket tehát akkor is figyelembe kell venni, amikor adatbázisok vagy klónkönyvtárak segítségével próbáljuk azonosítani a T-RFLP ujjlenyomatban az egyes csúcsokat (ld. 3.1.4.4 fejezet). Végül érdemes kizárni az 50 bp-nál rövidebb és az 500 bp-nál hosszabb fragmentumokat a további elemzésből, figyelembe véve, hogy mekkora a legnagyobb belső kontroll bpban megadott mérete. Ugyanis az 50 bp-nál rövidebb molekulák egy része elvész a restrikciós emésztés utáni tisztításban, másrészt ebbe a mérettartományba esik, a PCR során keletkező „primer dimer”. A molekula méretének növekedésével egyre csökken két hasonló méretű molekula vándorlási ideje közötti különbség, ezért a jelenlegi - 17 -

technikai szinten 500 bp felett már nem eléggé megbízható a bázispárban megadott méretmeghatározás (Engebretson és Moyer, 2003).

3.1.3.2 Zajszűrés A zajszűrés célja, hogy a valós csúcsokat elválassza a háttérzajtól. Utóbbiak eredhetnek például a polimer inhomogenitásából de akár a tápfeszültség pillanatnyi ingadozásából is. Fontos már az elején megjegyezni, hogy nincsen tökéletes módszer a zajszűrésre még elméleti alapon sem. Hiszen a kapilláris elektroforézis érzékenységi küszöbét

éppen csak

elérő

koncentrációban

jelenlévő

OTU-kat

nem

lehet

megkülönböztetni a háttérzajtól. Vagyis mindig ki fogjuk szűrni a zajjal együtt a legkisebb valós csúcsokat is. A cél tehát olyan optimális zajszűrés kialakítása, ahol a háttérzaj minél nagyobb részét kiszűrjük, ugyanakkor minél kevesebbet vesztünk el a valós csúcsok közül (ld. 61. oldal, 6/8. ábra). Mint fentebb láthattuk a csúcsok megtalálása már önmagában is zajszűrés, hiszen a küszöbértékek változtatása befolyásolja az eredményt. Ezen túl számos módszer létezik a zaj kiszűrésére, mint például a fix küszöbérték (Osborn és mtsai, 2000), az arányos küszöbérték (Dunbar és mtsai, 2001; Sait és mtsai, 2003), és a küszöbérték statisztikai meghatározása (Abdo és mtsai, 2006). A fix küszöbérték esetén (Osborn és mtsai, 2000) csak azok a görberészletek kerülhetnek bele a csúcs katagóriába, amik meghaladnak egy előre meghatározott, FU értékben megadott magasságot. Az ilyen előre beállított küszöbérték hátránya, hogy nem veszi figyelembe a kapillárisba juttatott DNS mennyiségét. Így nagy DNSkoncentráció esetén a felerősödött háttérzaj egy részét is csúcsként kezeli, míg kis DNSkoncentráció esetén a reprodukálható csúcsok egy részét is kizárja. Ezért újabban ezt a módszert nem használják önállóan, csak mint a kezdeti csúcsmeghatározás egy lépését (Székely és mtsai, 2009). A következő módszerekben az egyes futásokat először standardizálják. Jelenleg nem található az irodalomban egységes útmutatás, hogy melyik átalakítást használjuk. Rees és munkatársai (2004) illetve Abdo és munkatársai (2006) a csúcsok összterületét, míg mások a csúcsok összmagasságát (Dunbar és mtsai, 2001) veszik alapul, és van, aki mindkettőt alkalmazza (Culman és mtsai, 2008b). Kitts (2001) a csúcsok alatti területet ajánlja, mert a nagyobb fragmentumokat alulértékeli a csúcsok magasságának használata az elektroforézis közben lejátszódó diffúzió következtében. Sipos és munkatársai (2007) páronként, 1:1 arányban keverték össze baktériumtörzsek azonos koncentrációjú, jelölt PCR-termékét. Azt tapasztalták, hogy a csúcsok alatti terület - 18 -

alkalmazása szignifikánsan jobban adja vissza az előre beállított 1:1 arányt, mint a csúcsok magasságának alkalmazása. Előfordul még az adatok bináris átalakítása is (Székely és mtsai, 2009), mely minden csúcsot azonos súllyal kezel, független attól, hogy az adott csúcs milyen magas, vagy mekkora a területe. Ezért az alacsonyabb vagy kisebb területű csúcsok eltávolításának is ugyanakkora jelentősége van, mint a magasabb vagy nagyobb területű csúcsokénak. Így a bináris adatkezelés mutatja meg legérzékenyebben a különböző zajszűrések hatása közti különbséget (Bennett és mtsai, 2008). Amennyiben a csúcsok magassága vagy területe alapján standardizált értékeket használunk kisebb köztük a különbség (Schütte és mtsai, 2008). Az arányos küszöbérték zajszűrési módszert többféleképpen is alkalmazzák. Dunbar és munkatársai (2001) először egy minta megismételt, párhuzamos futásaiból kiválasztották azt, amelyikben a csúcsok összmagassága a legkisebb volt. Majd ezzel az értékkel elosztották a többi párhuzamos futás összmagasságát, és az így kapott korrekciós faktorral szorozták meg minden egyes csúcs magasságát. Amelyik csúcs magassága ezután nem érte el a 25 FU-t, azt zajnak tekintették. Mivel a 25 FU aránylag alacsony érték, nem képes minden zaj kiszűrésére, ezért második lépésben kizárták azokat a csúcsokat is, amelyeket nem találtak meg az összes megismételt, párhuzamos futásban. Végül a harmadik lépésben a különböző mintákból szintén kiválasztották a legkisebb összmagasságút, és ezzel az értékkel ugyanúgy standardizálták a többi minta futását, mint az első lépésben a párhuzamos futásokét. Sait és munkatársai (2003) egy másik megközelítést alkalmaztak. Abból a feltevésből indultak ki, hogy a legkisebb, zajnak tekinthető csúcsok egy-egy futásban csak a csúcsok számát növelik és a minta összfluoreszcenciáját csak egészen kis mértékben. Ezért első lépésben standardizálták a futásokat az egyes futások összfluoreszcenciáját alapul véve. Második lépésként egyre magasabb százalékos küszöbértéket alkalmazva kizárták az 1, 2, 3%-nál kisebb csúcsokat, és meghatározták a maradék csúcsok összfluoreszcenciáját. Harmadik lépésben vizsgálták az eredeti összfluoreszcencia és a megmaradt csúcsok száma közötti korrelációt. Küszöbértéknek azt a százalékos értéket választották, amikor a két változó között megszűnt az összefüggés, vagyis a korreláció nagyjából zéró értéket adott. Abdo és munkatársai (2008) a küszöbérték statisztikai meghatározását alkalmazták. Ennek során fordítva jártak el, mint a korábbi módszerek. Itt ugyanis az adatsorból a valós csúcsokat távolították el, és az adatsorból megmaradt csúcsokat tekintették zajnak. Először is standardizálták a csúcsok területét az összfluoreszcenciával. Majd kiszámolták a csúcsok területének szórását, amihez szükség van a csúcsok átlagterületéhez. Mivel a cél itt a zajnak minősülő csúcsok megtartása volt, feltételezni - 19 -

lehetett, hogy azok átlagterülete tart a nullához. Ezután azon csúcsokat, melyek területe a szórás háromszorosánál nagyobb volt, valós csúcsnak tekintették, és eltávolították az adatsorból. A maradék csúcsra ezután, az előbb ismertetett módon, újra kiszámolták a szórást, és az említett kritériumok alapján újra eltávolították a valódi csúcsokat. A folyamatot a szórás kiszámolásától a valós csúcsok eltávolításáig addig ismételték, míg már nem találtak több valós csúcsot. A maradék csúcsokat tekintették ezután zajnak, míg az eltávolítottakat valódi csúcsoknak.

3.1.3.3 A futások egymáshoz illesztése – az adatmátrix létrehozása A

következő

lépésben

az

egyes

minták

futásainak

egymással

való

összehasonlításához, meg kell találni bennük az azonos méretű (bp) csúcsokat. Ezt nevezi a szakirodalom kategorizálásnak, vagy binelésnek. Két csúcs, két különböző mintában akkor feleltethető meg egymásnak, ha azonos kategóriába, binbe kerülnek az illesztés során. Mint a kapilláris elektroforézis tulajdonságainak tárgyalásakor említettük, a méret nem kategorikus hanem folytonos változó. Tehát mesterségesen kell meghúzni a határokat, hogy két csúcs egy kategóriába, binbe tartozik-e (ld. 64. oldal, 6/11. ábra). Ez – hasonlóan a zajszűréshez – nem tökéletes folyamat, hiszen a kapilláris elektroforézisnek és a csúcsok bázispárban megadott méretmeghatározásának is van hibája. Culman és munkatársai (2008a) erre a hibára, amikor ugyanaz a T-RF fragmentum a különböző mintákban más kategóriába, binbe kerül, szintén a már említett T-RF drift fogalmat használják (ld. 17. oldal, 3.1.3.1 fejezet, 4. bekezdés). A legegyszerűbb illesztési módszer a csúcsok bázispárban megadott méretének a legközelebbi egész számra való kerekítése (Rees és mtsai, 2004; Osborne és mtsai, 2006). Egyszerűsége mellett a módszer hátránya, hogy tévesen is elválaszthat egymáshoz közel eső csúcsokat. Például a 100,4 és a 100,6 bp hosszú fragmentumok valószínűleg összetartoznak, de kerekítve őket külön-külön a 100-as és a 101-es binbe kerülnek. Manuális binelés esetén (Blackwood és mtsai, 2003) a tapasztalt elemző dönti el, hogy mely csúcsok kerülnek egy kategóriába. Ez segíthet megoldani olyan problémákat, ha két mintában előfordul ugyanaz a csúcsmintázat, de a két futás egymáshoz képest több bázispárral elcsúszott, amit egy automatikus binelés nem venne figyelembe. Azonban a sok szubjektív döntés, és a magas ráfordított idő miatt ez a módszer sem ajánlatos. Bennett és munkatársai (2008) a két módszert kombinálták, vagyis először a legközelebbi egész számra kerekítették a csúcsméreteket, majd manuálisan ellenőrizték, és ha kell javították a binelést. - 20 -

Dunbar és munkatársai (2001) azokat a csúcsokat helyezték azonos kategóriába, melyek mérete nem különbözött egymástól 0,5 bp-nál többel. Azért a 0,5 bp-os konfidencia intervallumot választották, mert tapasztalatuk szerint ennyi az elektroforézis maximális hibája az általuk használt ABI 377-es genetikai analizátoron. Egyes esetekben egy minta összes párhuzamos futásában jelen lévő két csúcs távolsága kevesebb volt, mint 0,5 bp. Ekkor a két csúcsot külön kategóriába tették, mert valószínűleg a két DNS-fragmentum eltérő hosszúságú vagy bázis-összetételükben különböznek, csak nem váltak el eléggé egymástól. Tehát egy futásból egy kategóriába (binbe) mindig csak egy csúcs került. A párhuzamos és különböző mintákból származó futások egy kategóriába került csúcsainak méretét ezután átlagolták. Smith és munkatársai (2005) ezt a módszert építették be a T-Align programba, annyi bővítéssel, hogy a felhasználó különböző értékeket állíthat be konfidencia intervallumnak. Számolás

közben

a

program

elvégzi

a

csúcsok

összfluoreszcencia-alapú

standardizálását is. A program hibája, hogy amennyiben egy futásban több csúcs is található a konfidencia intervallumon belül, csak az elsőt veszi figyelembe, a továbbiakat törli. Ezért az eredményt manuálisan ellenőrizni kell például úgy, hogy megnézzük, hogy az immár standardizált csúcsok összterülete egy futáson belül eléri-e a 100%-ot. Culman és munkatársai (2008a) felhasználták a T-Align modult a T-REX (T-RFLP Analysis Expedited) nevű on-line T-RFLP kiértékelő programban. Itt két lehetőség van, ha egy futásban a konfidencia intervallumon belül több csúcs található. Vagy létrehoz a T-REX újabb kategóriát minden csúcsnak, vagy csak a legnagyobb csúcsot veszi figyelembe a kategórián belül, és a többit zajnak tekintve elhagyja (utóbbi esetre ld. 64. oldal, 6/11. ábra). Abdo és munkatársai (2008) nem készítettek párhuzamos futásokat az egyes mintákból. Valamennyi minta csúcsai között megkeresték a két egymáshoz legközelebb eső csúcsot, és méretüket az átlagukkal helyettesítették. Ha a két csúcs egy mintából származott, akkor a területüket is összegezték. Itt tehát egy mintából egy kategóriában nem csak egy csúcs szerepelhet. A csúcsok kategorizálását és akár a kategóriák összevonását addig végezték, míg a köztük lévő legkisebb távolság is meghaladt már egy előre megadott határértéket, például az 1 bp-t (ld. 64. oldal, 6/11. ábra). Az illesztés befejeztével létrejön az adatmátrix. Ebben minden egyes minta valós csúcsai külön oszlopként szerepelnek. Az egyes sorok a különböző minták azonos kategóriába, binbe került T-RF-eit tartalmazzák. A következő fejezetben számos statisztikai eljárást ismertetünk, ezért érdemes megemlíteni, hogy a statisztikában a mintákat objektumoknak, a T-RF sorokat változóknak is nevezik (3/4. ábra). - 21 -

6-019-1

...

A mátrix minden egyes sora egy T-RFnek, más néven változónak felel meg.

A mátrix minden egyes oszlopa egy mintának, más néven objektumnak felel meg.

Alu-050 Alu-053 Alu-054 Alu-056 Alu-057 Alu-059 Alu-060 Alu-062 Alu-063 Alu-065 Alu-066 Alu-067 Alu-070

0 0 0 0 0 0 0 0,75 0 0 0 0 22,41

6-019-7 6-055-1 6-055-3 6-055-7 1,21 0,34 0 0 0 0 0 0,47 0 2,87 0,27 0 0,78 0 0 0 0 0 0 0,21 0,69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,61 0 0 0,66 6,19 7,49 0 0 0 4,31 0,51 1,5 0 0 0 0 0 3,99 0 1,29 2,94

3/4. ábra: Az elkészült adatmátrix a mátrix oszlopainak és sorainak lehetséges elnevezéseivel.

3.1.4 T-RFLP eredmények értelmezése Mivel az elkészült adatmátrix „első ránézésre” nehezen átlátható, további technikák szükségesek a benne tárolt információ kinyerésére. Alábbiakban ezek irodalmát és módszertanát tekintjük át a 3.1.1 fejezetben említett 4 féle T-RFLP vizsgálati célnak megfelelően.

3.1.4.1

T-RFLP

ujjlenyomatok

közötti

különbségek

vizuális

megjelenítése Legegyszerűbb egy táblázatkezelő programban 100%-ig halmozott oszlopdiagramot rajzolni, ahol minden mintának egy oszlop felel meg, és az oszlopon belül minden T-RF más színben, relatív arányának megfelelően jelenik meg. Sajnos, ahogy a minták diverzitása növekszik, az ilyen ábra egyre kevésbé átlátható. Következő lehetőség, hogy diverzitási indexeket számolunk az egyes mintákra. Ekkor a sokváltozós adatsorokat egyetlen számba sűrítjük bele, vagyis az adatok nagy részét elvesztjük. Természetesen az is fontos információ, hogy az egyes minták közösségei egymáshoz képest kis vagy nagy diverzitással rendelkeznek, de ez még nem segít annak a kérdésnek a megválaszolásában, hogy az egyes közösségek mennyire hasonlóak egymáshoz. Ezért ajánlottabbak a következőkben ismertetésre kerülő többváltozós módszerek, többek között az ordinációk használata (Blackwood és mtsai, 2007; Ramette, 2007). A diverzitás számolás inkább kiegészítő lépés, ugyanis a közösség átlagánál jóval kisebb - 22 -

vagy nagyobb diverzitású minták gyakran csak ezen tulajdonságuk, és nem valós hasonlóságuk miatt kerülnek közel egymáshoz. Így ezen mintáknál felmerül a további vizsgálatokból való kizárás lehetősége is (ld. 72. oldal, 6/16. ábra). Az ordinációk elsődleges feladata a sok dimenzió behelyettesítése kevés számú, de az eredeti adatstruktúrát többé-kevésbé jól tükröző dimenzióval. Az ordinációs módszerek közé sorolunk tehát minden olyan eljárást, melyben a dimenzionalitás csökkentése mesterséges változók bevezetésével történik (Podani, 1997). T-RFLP esetében az adatmátrixban minden egyes T-RF, azaz minden egyes sor egy-egy külön dimenziót képvisel. A T-RFLP vizsgálatokban a két legelterjedtebb ordinációs módszer a főkomponens elemzés (PCA: principal component analysis; Dollhopf és mtsai, 2001; Culman és mtsai, 2008b) és a nem-metrikus többdimenziós skálázás (NMDS: nonmetric multi-dimensional scaling; Culman és mtsai, 2008b; Rees és mtsai, 2004). De használják még a korreszpondencia elemzést (CA: correspondence analysis; Culman és mtsai, 2008b) és a főkoordináta elemzést, avagy metrikus többdimenziós skálázást (PCoA: principal coordinates analysis; Singh és mtsai, 2006) is. Ezen módszerek részletes leírása megtalálható többek között Podani (1997) illetve Legendre és Legendre (1998) műveiben. Így az alábbiakban csak röviden mutatjuk be őket a két említett mű alapján – didaktikai okokból a PCA, CA, PCoA, NMDS sorrendben –, és elsősorban a T-RFLP szempontjából fontos vonásaikat emeljük ki. A főkomponens-elemzés (ld. 58. oldal, 6/5. ábra) a sokdimenziós adatfelhőben megkeresi azokat az új tengelyeket (=főkomponenseket), amelyek az összvariancia legjelentősebb hányadát magyarázzák meg. (Az összvarianciát az adatmátrix egyes értékeinek a sor- és oszlopátlagoktól való eltérés-négyzetösszege adja.) Az első főkomponens lesz az összvariancia legnagyobb hányadáért a felelős, a következő – amelynek merőlegesnek kell lennie az elsőre (vagyis nem korrelálhatnak egymással) – már kisebbért, és így tovább. Az egyes objektumok új koordinátáit az eredeti koordináták lineáris kombinációjaként lehet meghatározni, míg a főkomponensek az eredeti változók lineáris kombinációi. A PCA előnye, hogy egy diagramon lehet ábrázolni az objektumokat és az elválásukat okozó eredeti változókat. Ez a biplot funkció (ld. 69. oldal, 6/15. ábra), ami hiányzik a távolságmátrixon alapuló módszereknél (PCoA, NMDS). A módszer érzékeny a „páros hiányokra”, azokra az esetekre, amikor egy változó értéke két különböző objektumban is zéró, vagyis egy TRF két különböző mintából egyszerre hiányzik. Ugyanis a PCA megőrzi a minták közötti euklidészi távolságot, amely a páros hiányt hasonlóságként kezeli. Így, elméleti alapon a PCA T-RFLP esetén is elsősorban olyan minták összehasonlítására alkalmas, - 23 -

amelyekben a minták csúcs-összetétele hasonló, a minták rövidebb gradiensről származnak, és csak a mennyiségi viszonyokban különböznek egymástól (3/5. ábra). Abundancia

1 2 3

4 5

6

7

8 Gradiens

Gradiens

3/5. ábra: A lineáris (bal oldal) és az unimodális (jobb oldal) adatstruktúra összevetése. A gradiens jelenthet időbeli, térbeli különbséget, melynek egyes pontjain zajlik a mintavétel. Lineáris adatstruktúra esetén az egyes OTU-k abundanciája lineárisan változik a gradienssel, míg unimodális esetben az egyes OTU-k abundanciája egy optimumgörbével írható le. Amennyiben a minták egy rövidebb gradiensről származnak (például 0-tól 3-ig terjedő gradiens részről), majdnem minden OTU jelen lesz az egyes mintákban, míg ha hosszabb gradiensről, több OTU is csak bizonyos mintákban lesz megtalálható, és előfordulhat a „páros hiány” esete.

A PCA módszernek két gyakran nem teljesülő feltétele is van. Az egyik, hogy az adatok normál eloszlásúak legyenek, a másik, hogy a változók között lineáris összefüggések legyenek. Azonban kimutatták, hogy a módszer elég robosztus, így az előfeltételektől való kisebb eltérések még elhanyagolhatóak, vagy a nyers adatok transzformációjával lehet az előfeltételeket jobban megközelíteni (például húrtávolság szerinti transzformáció; Legendre és Gallagher, 2001). Talán itt érdemes megjegyezni, hogy minden ordinációs módszer kompromisszumot jelent, hiszen nem lehetséges a sokdimenziós adatmátrixot tökéletesen ábrázolni két-három dimenzióba sűrítve. A diagram torzításának egy lehetséges ellenőrzése, ha az adott ordinációra rávetítik a minimális feszítőfát vagy más osztályozás eredményét (ld. 66. oldal, 6/13.b. és 73. oldal, 6/17.a. ábra). (A minimális feszítőfa a minták távolságmátrixából állítható elő oly módon, hogy a minden lépésben az egymáshoz legközelebb eső két minta között élt húznak mindaddig, amíg nem keletkezik kör a gráfban. A feszítőfa esetén minden szögpont megfelel egy mintának.) Az ordinációs eredményt megerősíti, ha a minimális feszítőfa ágai nem keresztezik egymást (Podani, 1997). A korreszpondencia elemzés előnye, hogy az objektumok és a változók egymásra illesztését egyidejűleg és közvetlen módon alakítja ki reciprok átlagolással. A PCA-tól eltérően itt unimodális adatstruktúra az elvárt (3/5. ábra), ami az ökológiai vizsgálatokban a lineárisnál általában megfelelőbb feltételezés. Valamint euklidészi helyett χ2-távolságot használ. Ez utóbbi tulajdonság miatt, a CA nagyobb súlyt ad a - 24 -

ritkább változóknak, így szükség lehet az adatok transzformációjára (Culman és mtsai, 2008b). A módszer a T-RFLP adatfeldolgozásában nem túlságosan elterjedt. Ennek oka lehet az is, hogy a χ2-távolság elfogadásában nem egységesek az ökológusok (Legendre és Gallagher, 2001). A főkoordináta módszer – mely előfeltételeiben hasonlít a PCA-ra – a mintákra először egy távolságmátrixot készít el. Ez az, ami egyben előnye és hátránya is a PCAval szemben. A távolságot ugyanis többféle módszerrel ki lehet számolni. Singh és munkatársai (2006) például Jaccard hasonlósági indexet használtak, mert ez – bináris adatok esetén – nem veszi figyelembe a páros hiányt. Második lépésben a PCoA úgy próbálja meg elhelyezni az objektumokat a sokdimenziós térben, hogy minél pontosabban megőrizze a köztük lévő távolságot. Közben azonban elveszik az az információ, hogy a minták elválását hogyan befolyásolják az eredeti változók (a T-RFek), így a PCoA-ban nincsen biplot funkció. Az eddigi módszereknek mindig voltak valamilyen kiinduló feltételei, amik csak többé-kevésbé teljesülnek (pl.: lineáris vagy unimodális adatstruktúra). Ezzel szemben a nem-metrikus többdimenziós skálázás (NMDS) egyik legfontosabb tulajdonsága, hogy nem-paraméteres eljárás, vagyis semmilyen előfeltételt nem igényel a használata. A PCoA-hoz hasonlóan először itt is egy távolságmátrix készül. A leggyakrabban használt index itt a Bray-Curtis hasonlóság, melynek értékét nem befolyásolja a páros hiány, illetve újabb minták bevétele, vagy kizárása az elemzésből (Rees és mtsai, 2004). Bináris adatokra ugyanazt az eredményt adja a Sørensen index, mint a Bray-Curtis hasonlóság (Culman és mtsai, 2008b). Az NMDS ezután a távolságmátrix értékeit nagyság szerint sorba rendezi, és ezután már nem az abszolút távolságértékek, hanem csak ez a sorrend számít. Végül előre megadott számú dimenzióban helyezi el az egyes objektumokat úgy, hogy a köztük lévő távolságok sorrendisége minél jobban megfeleljen a távolságmátrixban található értékek sorrendiségének. Bár biplot funkció a PCoA-hoz hasonlóan itt sincsen, Clarke (1993) kidolgozta a SIMPER (similarity percentages; hasonlósági százalékok) módszert. Ez az egyes változóknak, jelen esetben T-RF-eknek, a minták közti Bray-Curtis hasonlóságokhoz való hozzájárulása alapján számolja ki, hogy az egyes változók mennyire fontosak egyes minták vagy mintacsoportok elválásában. Az ordinációs és egyéb módszerek sokasága nem feltétlenül egyszerűsíti a kutatók feladatát. Mint Culman és munkatársai (2008b) megfogalmazták: „áttekintve az elmúlt időszak T-RFLP elemzéssel foglalkozó irodalmát, számos hasonló célú cikket lehet találni, amik a statisztikai módszerek széles skáláját használják, miközben gyakran nem - 25 -

támasztják alá módszertani választásukat.” Ezért érdemes elméleti alapon ajánlásokat megfogalmazni az egyes ordinációs típusok használatára. Culman és munkatársai (2008b) szerint az egyik fő irányelv a minták béta-diverzitásban mért heterogenitása, amit a következőképpen definiáltak: Heterogenitás =

az adatmátrixban található összes T-RF száma -1 az egyes mintákban található T-RF-ek átlagos száma

A nagy béta-diverzitással – tapasztalataik alapján 2-nél nagyobb érték – rendelkező minták vizsgálatára az NMDS-t ajánlják. Míg kisebb béta-diverzitású minták esetén az egyes ordinációs módszerek hasonló eredményt adnak. Az egyes ordinációs módszerek eredményeinek összehasonlításában segíthet a Prokrusztész elemzés (ld. 65. oldal, 6/12. ábra), amely a különböző konfigurációkat úgy forgatja egymásra, hogy az egyes pontpárok közötti távolságnégyzetösszeg minimális legyen (Podani, 1997). Ez nemcsak egy adatmátrix különböző ordinációira lehet alkalmazni. Singh és munkatársai (2006) Prokrusztész elemzéssel hasonlították össze a fiziológiás (Biolog), biokémiai (zsírsav) és a molekuláris ujjlenyomatokra (DGGE és TRFLP) készített ordinációkat. Arra jutottak, hogy a DGGE és T-RFLP mintázata nagyon hasonló egymáshoz, míg a fiziológiás és biokémiai ujjlenyomatok mintázatai jobban eltérnek egymástól és az előbbiektől.

3.1.4.2 A T-RFLP ujjlenyomatok egymástól elváló csoportjainak felismerése Az ordinációk megmutatják, mennyire hasonlóak egymáshoz az egyes minták, de ezek alapján azok direkt csoportosítása esetenként szubjektív. A hierarchikus osztályozások ezzel szemben közvetlenül csoportosítják a mintákat. E módszereknél az első lépés általában a távolságmátrix kiszámolása egy hasonlósági index alapján. A következő lépés a fa elkészítése a távolságmátrixból többek között csoportátlag (UPGMA: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages; Moesender és mtsai, 1999; ld. 68. oldal, 6/14.a. ábra), Ward (Schwartz és mtsai, 2007), illetve legkisebb négyzetek módszerével (Sait és mtsai, 2003). Ezek az eredmények és így a minták csoportosulásai függhetnek a fakészítési algoritmustól, valamint a csoportok elválását nem támasztja alá statisztika (Kropf és mtsai, 2004). Az Abdo és munkatársai (2006) által kidolgozott fakészítés – mely CCC (cubic cluster criteria) algoritmuson és pszeudo F-teszten alapul – viszont már meghatározza az egymástól szignifikánsan elváló csoportokat. - 26 -

Nem csak hierarchikus osztályozás keretében lehetséges a mintacsoportok elválasztása. Amennyiben létezik már a minták egy a priori csoportosítása, az ordinációk között is létezik olyan módszer, ami ezek elválásának szignifikanciáját vizsgálja. Ez a diszkriminancia elemzés (DA: discriminant analysis), vagy más néven kanonikus variancia elemzés (CVA), mely szoros kapcsolatban áll a többváltozós variancia-elemzéssel (MANOVA: multivariate analysis of variance) is (Podani, 1997). Azonban a CVA és a MANOVA csak olyan adatmátrixokra alkalmazható, ahol a változók (T-RF-ek) száma nem haladja meg az objektumokét (mintákét). A probléma orvoslására Park és munkatársai (2006) a mintáikon először egy PCA-t végeztek el. Majd az objektumok első három főkomponensen felvett koordináta értékeit használták fel új változókként a CVA-ban. Így az új változók száma már nem haladta meg az objektumokét, és így meg tudták határozni, hogy szignifikánsan különböznek-e egymástól az egyes csoportok. Clarke (1993) az NMDS-nél már említett Bray-Curtis hasonlósági mátrix rangsorolt értékeire építve alkotta meg az ANOSIM (ANalysis Of Similarities; hasonlóságok elemzése) tesztet. Ez a teszt a csoportokon belüli és csoportok közötti rangkülönbségek összevetéséből számolja ki az „R”-ként definiált értéket, amelyet azután összevet a távolságmátrix permutációi után számolt „R” értékekkel. Ehhez hasonló Kropf és munkatársainak (2004) Monte Carlo féle permutációs teszten alapuló módszere illetve Anderson (2001) NPMANOVA (nonparametric multivariate analysis of variance) elemzése. Ezek alkalmazásával meg lehet állapítani előre meghatározott csoportok között, hogy egymástól szignifikánsan válnak-e el. Tang és munkatársai (2007) egy, a Bayes-féle statisztikán alapuló programot alkottak meg, a T-BAPS-ot. Előnye, hogy figyelembe veszi a T-RFLP sajátságait, többek között, hogy a változók száma jóval meghaladja az objektumok számát, valamint azt is hogy számos változó akár az objektumok többségében is 0 értéket vesz fel. Emellett nem kell előre megadni sem az egyes csoportokat, sem a csoportok számát, hanem a program határozza meg az optimális modellt. Szimulált adatokat használva a T-BAPS jobb eredményt adott, mint a hagyományos csoportosítások, valamint az elválasztásokat statisztikailag is alátámasztotta.

3.1.4.3 A T-RFLP ujjlenyomatok és más mért paraméterek összevetése Az eddigi vizsgálatok a T-RFLP adatokat (alapadatok) önmagukban elemezték. (Ez alól egyedül a Prokrusztész elemzés volt kivétel.) Gyakran az is a kérdés viszont, hogy hogyan viszonyulnak a T-RFLP és más mért környezeti paraméterek (pl.: pH, hőmérséklet) egymáshoz. Ebben az esetben a két adattípust nem érdemes együtt kezelni, - 27 -

hiszen ekkor pont a különböző adattípusok, mint egységek közötti összefüggések feltárásáról mondanánk le. Az első lehetőség, hogy az alapadatokra már elkészített ordinációt vetjük utólag össze a környezeti paraméterekkel (Ramette, 2007). Ekkor korrelációt számolunk a minták egyes ordinációs tengelyeken felvett koordinátái és a környezeti paraméterek értékei között. Ennek előnye – szemben a további módszerekkel –, hogy az ordináció független a mért környezeti paraméterektől, és a korreláció szignifikancia-szintjét egyszerű meghatározni. A következő két módszer a direkt (kanonikus) elemzések közé tartozik (Podani, 2007). Ezekben az esetekben feltételezzük, hogy a két változócsoport kapcsolata nem szimmetrikus. Például a bakteriális közösség reagál a környezeti paraméterek, például a hőmérséklet változására, de ez visszafelé már csak korlátozottan vagy közvetett módon igaz. Ekkor a mintákat a PCA-hoz, illetve a CA-hoz hasonlóan ordináljuk, de úgy, hogy az elemzés során bevezetett új komponensek, illetve tengelyek a környezeti változókat értelmezzék a lehető legjobban, miközben a lehető legnagyobb varianciát magyarázzák meg az alapadatokból is. Előbbi a redundancia analízis (RDA), utóbbi a kanonikus korreszpondencia analízis (CCA). Ezen módszerek előnye, hogy triplot formájában könnyen ábrázolhatóak egy diagramon a minták, az alapadatok és a környezeti változók. A két változócsoport közötti összefüggés szignifikáns volta Monte Carlo féle permutációs teszttel ellenőrizhető. A két módszer között aszerint érdemes választani, hogy az alapadatok lineáris, vagy unimodális reakciót adnak a környezeti háttérgradiensre (ld. 24. oldal, 3/5 ábra). Amennyiben ezen feltételek nem teljesülnek Legendre és Gallagher (2001) az alapadatok PCA-nál már említett transzformációját javasolják. Az ordinációkhoz hasonlóan itt is léteznek előfeltétel-mentes nem-paraméteres eljárások. Clarke és Ainsworth (1993) Bio-Env programja az alapadatokból számolt Bray-Curtis hasonlósági és a környezeti változók különböző alcsoportjaiból kalkulált euklidészi távolságmátrixok között számol rangkorrelációt. Így keresi meg a környezeti változók azon csoportját, amelyeknek a legnagyobb hatása lehet az alapadatokra. Legendre és Anderson (1999) a távolság alapú RDA (db-RDA: distance based RDA) módszert dolgozta ki. Ennek lényege, hogy az RDA-hoz nem közvetlenül az alapadatokat használja fel, hanem az alapadatokra készített PCoA, vagy NMDS ordináció koordinátáit. Legendre és Gallagher (2001) kidolgozott ehhez egy olyan kiegészítést, mely segítségével a kész db-RDA ordinációra utólag lehet rávetíteni az alapadokat, és így hasonló képet kaphatunk, mint az eredeti RDA triplot funkciójával. - 28 -

Az előző három pontban (3.1.4.1-3 fejezetek) számos többváltozós analízist és statisztikai tesztet írtunk le röviden. Amennyiben a kérdésfelvetésünknek legjobban megfelelő módszert választjuk, sok feladat, probléma megoldására képesek. Azonban nem szabad szem elől téveszteni, hogy „bár ezek az elemzések segíthetnek a mintázatok feltárásában, a megfigyelések értelmezése és magyarázata végül is a kutató hipotézisén és a kérdésről korábban szerzett tudásán alapszik. Magának a mikrobiális ökológusnak kell megfogalmaznia és tesztelnie az ökológiailag helytálló hipotéziseket” (Ramette, 2007).

3.1.4.4 A populációk azonosítása a közösségekben a T-RFLP módszer segítségével A mikrobiális diverzitás feltárásának fontos lépése a közösségben található mikrobák azonosítása. Ennek molekuláris módszerekkel történő direkt módja a klónkönyvtárak készítése és a reprezentatív klónok bázissorrend elemzése. Azonban – amíg az új generációs szekvenálási lehetőségek (Metzker, 2010) nem terjednek jobban el – ez meglehetősen időigényes folyamat. Kompromisszumos megoldásként került előtérbe a mikrobaközösségek domináns tagjainak közösségi ujjlenyomatokból való azonosítása. Ez a DGGE, RISA és SSCP módszereknél direkt módon lehetséges – a főbb kivágott gélcsíkokból a DNS izolálásával, újrafelszaporításával és bázissorrend elemzésével –, de a T-RFLP-nél nem. Egyrészt a T-RFLP esetén a gélben a fluoreszcensen jelölt T-RFek mellett jelen vannak jelöletlen DNS darabok is, amelyek hosszúsága egybeeshet a jelölt T-RF-ekkel, és így zavarnák a bázissorrend elemzést. Másrészt a T-RF-ek elválasztása általában kapilláris elektroforézissel történik, ahol nem lehetséges a megfelelő géldarabok „kivágása”, visszanyerése. A T-RFLP nagyobb felbontását, érzékenységét és könnyebb adatfeldolgozását azonban pont e második tulajdonsága adja (Moeseneder és mtsai, 1999). Bár a direkt szekvencia-meghatározás nem lehetséges, számos indirekt eljárást dolgoztak ki az évek során az egyes T-RF-ek azonosítására. Az első lehetőség a szekvencia-adatbázisokban végzett in silico PCR és restrikciós emésztés. Majd a valós T-RFLP kromatogram csúcsainak azonosítása az in silico előállított T-RF-ek segítségével. Ilyen program – többek között – a TAP (T-RFLP analysis program; Marsh és mtsai, 2000), a TRAMP (T-RFLP matching program; Dickie és mtsai, 2002), a PAT (phylogenetic assignment tool; Kent és mtsai, 2003), a MiCA (Microbial Community Analysis; Shyu és mtsai, 2007) és a FragMatch (Fragment Matching; Saari és mtsai, 2007). Az egyes programok abban különböznek - 29 -

egymástól, hogy csak publikus szekvencia-adatbázisokkal dolgoznak, vagy képesek saját adatok fogadására is; a szekvenciákat csak a forward, vagy mindkét primer segítségével választják ki; mennyire szigorúak a primer és a szekvencia pontos illeszkedését illetően; képesek-e több restrikciós enzimmel való emésztés eredményeit együttesen kezelni. Az adatbázisból való azonosításnak azonban számos korlátja van. A T-RF-ek elméleti és gyakorlati hossza eltérhet egymástól (ld. 17. oldal, 3.1.3.1 fejezet, 4. bekezdés; Kaplan és Kitts, 2003), ezért az in silico meghatározott pontos hosszhoz képest egy (szűk) intervallumot érdemes figyelembe venni. Másrészt az adatbázisban megfelelő hasítási hellyel rendelkező szekvenciák nem biztos, hogy valóban előfordulnak a közösségben, illetve a közösségben lehetnek olyan szekvenciák, melyek még nem szerepelnek az adatbázisban. Blackwood és Buyer (2007) a lentebb ismertetendő módszerrel a közösségből valóban meghatározott T-RF szekvenciák nagyobb részét még csak nem is azokba a csoportokba sorolta, amikbe a megfelelő TRF-eket az adatbázisok segítségével előre besorolták. Matsumoto és munkatársai (2005) a humán vastagbél mikrobiotáját vizsgálták T-RFLP alkalmazásával is. A T-RF-ek azonosítását részben saját adatbázissal végezték. Ehhez a korábbi humán vastagbél mikrobiotából azonosított szekvencia adatokat használták fel. Az így leszűkített adatbázisból kapott eredmények már körülbelül 80%-ban átfedtek a közösségből készült klónkönyvtárak segítségével meghatározott szekvenciákkal. Vagyis szűkebb csoportok esetén van létjogosultsága az adatbázisok használatának. A következő – szintén indirekt – megközelítés az általunk „szekvenciával-támogatott T-RFLP” (sequence-aided T-RFLP) nevezett módszer (Székely és mtsai, 2009), amelyhez hasonlót már korábban Grant és Ogilvie (2004) is alkalmazott. Ekkor a közösségi T-RFLP vizsgálatot követően egy kiválasztott mintából klónkönyvtárat is készítettünk. A közösségi T-RF-ek azonosítása céljából elvégeztük a klónok T-RFLP elemzését is. Majd azon klónok bázissorrendjét határoztuk meg, amelyek T-RF pozíciói egybeestek a 0,2%-nál nagyobb közösségi T-RF-ek pozícióival. A módszer előnye a korábbiakkal szemben, hogy a klónok méretét nem in silico, hanem a közösségi TRFLP-vel megegyezően határoztuk meg. Azonban nem biztos, hogy minden közösségi csúcshoz tudunk rendelni egy-egy klónt. Újabban több megközelítést is kidolgoztak a T-RF-ek közvetlen bázissorrend meghatározására. Ezek elvi alapja, hogy a T-RF-eket a restrikciós emésztés után elválasztják a többi DNS darabtól. Innen ered a physical capture (fizikai befogás) TRFLP név. A Nagashima és munkatársai (2003) által leírt, majd Blackwood és Buyer (2007) által is alkalmazott módszer esetén a PCR primer biotinnal jelölt. Így a - 30 -

restrikciós emésztés után a T-RF-ek kiköthetőek sztreptavidinnel borított mágneses gyöngyökre, és a nem jelölt termékek elmoshatóak. Ezután a T-RF-eket agaróz gélben választották el egymástól, a főbb csíkokat kivágták, belőlük klónkönyvtárat készítettek, végül a reprezentatív klónok bázissorrendjét meghatározták. Lee és munkatársai (2008) ugyanígy választották el a T-RF-eket az emésztés után. De még az elektroforézis előtt egy extra PCR-t végeztek, amelyben a reverz primer kötőhelyét egy – a restrikciós hasítási helyhez tervezett, és odakötött – adapter szolgálta. Az így felszaporított T-RFeket ezután poliakrilamid gélelektroforézissel választották el egymástól. A további lépések megegyeznek az előzőekben leírtakkal. A második módszernek nagyobb az érzékenysége (a T-RF-ek PCR-rel való szelektív felszaporítása miatt) és a felbontása (a poliakrilamid gélelektroforézisnek köszönhetően). A physical capture T-RFLP módszerek tehát megoldást kínálnak arra az alapvető gondra, hogy a T-RFLP nem alkalmas közvetlen bázissorrend meghatározásra. Azonban pár dolgot érdemes szem előtt tartani (Blackwood és Buyer, 2007). Egyrészt a 200 bpnál rövidebb szekvenciák nem vonhatók be a filogenetikai rekonstrukcióba. Másrészt az agaróz illetve a normál poliakrilamid gélelektroforézis felbontása kisebb, mint a kapilláris gélelektroforézisé. Tehát érdemes párhuzamosan elvégezni a hagyományos, és a kiválasztott mintákkal a physical capture T-RFLP-t; végül az azonosított klónokkal ismét a hagyományos T-RFLP-t. Ugyanis a T-RFLP egyik alapfeltevése, hogy az egymáshoz hasonló mintákban található azonos csúcsokat azonos, vagy hasonló szekvenciák eredményezik. Ha tehát azonosítunk egy csúcsot az egyik mintában, akkor ebből következtethetünk a többi hasonló minta azonos csúcsára is. Ehhez azonban a klónok pontos T-RF mérete, vagyis kapilláris elektroforézissel való futtatása szükséges.

3.1.5 A T-RFLP módszer rövid értékelése A T-RFLP alapvető előnye, hogy nagy mennyiségű minta feldolgozását és összehasonlítását teszi lehetővé rövid idő alatt. A módszer bevezetése során számos ponton kell a körülményeket mérlegelni, és azoknak megfelelő döntést hozni, mind a mintaelőkészítés, mind az adatfeldolgozás során. Amikor azonban elkészül az optimalizált

protokoll,

a

T-RFLP

stabil,

nagypontosságú

és

reprodukálható

eredményeket ad (Osborn, 2000). A módszer elsősorban közösségek összehasonlítására, a változások nyomonkövetésére és ezek környezeti változókkal való összekapcsolására alkalmas, de segíthet a közösségben előforduló populációk azonosításában is (Schütte, 2008).

- 31 -

3.2 A laskagomba termesztése A laskagomba-fajok (Pleurorus spp.) nagyon közkedvelt, vadon élő és termesztett, fehérkorhasztó, ehető gombák. A legnagyobb mennyiségben termesztett, közismert ehető csiperkegomba (Agaricus bisporus) távoli rokonai, ugyanis mindkét gomba a bazídiumos gombák törzsén belül az Agaromycetes család Agaricales rendjébe tartozik. Latin nevüket a görög „pleuro” szóra lehet visszavezetni, ami annyit jelent, mint „oldalt képződő”, utalva arra, hogy a gomba kalapja a tönkön féloldalasan helyezkedik el (Stamets és Chilton, 1983). Bár intenzív termesztésük csak az 1960-70-es években kezdődött, 1997-re már a harmadik legnépszerűbb termesztett gomba volt a Földön a csiperke (Agaricus bisporus) és a shiitake (Lentinula edodes) után, és 2002-ben Kínában piacvezetővé vált (Chang és Miles, 2004). Magyarország 1997-ben az európai termesztés (100%) középmezőnyéhez tartozva Olaszország (56,6%), Spanyolország (22,4%) és Franciaország (6%) mögött a 4. helyen (4,5%) állt (Lelley, 1999). Gyors elterjedése több okra vezethető vissza. (1) A laskagomba értékes tápanyag magas fehérje- és vitamintartalma valamint alacsony zsírtartalma miatt (Bonatti és mtsai, 2004). (2) Kiemelt a gyógyászati jelentősége, ugyanis gátolja a daganatok és a gyulladások terjedését. Ezen kívül immunrendszer-moduláló, valamint vércukor csökkentő, trombózis gátló és antimikrobiális hatással is rendelkezik. Fogyasztása a vér lipid-koncentrációjának csökkenését idézi elő, és gátolja a magas vérnyomás kialakulását (Gregori és mtsai, 2007). (3) Lignolitikus enzimrendszerének köszönhetően termesztéséhez sokféle, helyben keletkező mezőgazdasági mellékterméket fel lehet használni (többek között szalmát, kukoricacsutkát, kipréselt cukornádat, a kávébab húsos héjhulladékát [Stamets, 2000], fűrészport, gyapot hulladékot, banánlevelet [Chang és Miles, 2004]), ami csökkenti a termesztés költségeit. (4) A Pleurotus nemzetséget számos faj alkotja, amelyek egymáshoz viszonyított rokonsági rendszere még nem teljesen tisztázott (Stajić és mtsai, 2005). Ezek elterjedése a Föld különböző éghajlati övezeteire kiterjed, így gyakorlatilag világszerte termeszthetőek (Chang és Miles, 2004). (5) Alkalmazható mezőgazdasági melléktermékek állati takarmánnyá alakításában, szerves eredetű szennyező anyagok és xenobiotikumok biológiai lebontásában (Cohen és mtsai, 2002).

3.2.1 Rövid történeti áttekintés Elsőként a késői laskagomba (Pleurotus ostreatus) és az ördögszekér laskagomba (P. eryngii) keltette föl a kutatók, erdészek érdeklődését. Az első, 1897-es termesztési próbálkozások a francia Matruchot nevéhez fűződtek. Az erdészek a természetes úton - 32 -

késői laskagombával fertőzött fatörzseket kivágták és az erdészlak közelében árnyékos helyre helyezték, időről időre megöntözték. Az így tartott rönkökön évről évre megjelentek a termőtestek egészen addig, amíg a fa teljesen el nem korhadt. A kutatómunka az 1910-es években Németországban folytatódott, ahol Falck kidolgozta a tömör faanyagon történő termesztést. Ehhez a laskagombából nyert spórákat kicsíráztatta, majd sterilizált szalmát szövetett át vele. Az így kapott oltóanyagot frissen vágott fába fúrt lyukakba helyezte (Koronczy és Uzonyi, 1969). Később 1930 és 1940 között Busse, Liese, Baveudamm és Luthardt végeztek e területen figyelemre méltó kísérleteket, továbbfejlesztve és biztonságosabbá téve a Falck által kidolgozott termesztési eljárást. Oltóanyagként gombafonalakkal átszőtt fűrészport használtak, és a faanyag beoltás utáni átszövését, majd a termesztést is meghatározott környezeti feltételek között végezték (Koronczy és Uzonyi, 1969). Az NDK-ban az 50-es évek elején tulajdonképpen ezt a módszert alkalmazták, amikor tömegével oltották a fatuskókat. Nem minden esetben termőtesteket akartak nyerni. A gomba által „átalakított” fa ugyanis könnyű, lyukacsos állományú, jól faragható, viszonylag hő- és vízálló, jó ipari fa volt, amit utólag más anyagokkal (pl.: paraffin) is kezeltek. Többek között ceruzákat, vonalzókat, üveggyártásban használatos formákat készítettek ebből az ún. mikofából (Schmidt, 2006). Fűrészporon és egyéb lágyszárú növények melléktermékein történő első termesztési kísérletekről Block, Tsao és Han számoltak be (Block és mtsai, 1959). Ők még a laskagomba szubsztrátot komposztálták. E kutatók számos xilofág ehető gombafajt vizsgáltak meg. Munkájukban fűrészport, rizshéjat, kukoricacsutkát használtak. Kísérleteikben a floridai laskagomba is szerepelt, amely kitűnt gyors növekedésével, viszonylag bőséges termésével. Hazánkban Heltay Imre az 1950-es években a Gombatermelési Vállalatnál sterilizált franciaperje és malátacsíra-kivonaton termesztett Pleurotus eryngii-t. A 60-as évek elején kezdett el foglalkozni a farönkön történő termesztéssel Tóth Ernő, akihez később Véssey Ede csatlakozott. A soproni Erdészeti Egyetem kutatócsoportjában ugyanakkor 1963-ban Luthardt ösztönzésére és segítségével kezdődtek meg a kísérletek Gyurkó Pál vezetésével. Magyarországon tehát lényegében a faanyagon történő termesztést Falck és Luthardt módszere alapján Véssey Ede, Tóth Ernő és Gyurkó Pál vezették be (Heltay, 1999). A módszer szélesebb körű elterjedésének határt szabott, hogy nagyüzemileg nem volt gazdaságos a használata. Hátrányai voltak, hogy a termőtestképzés az időjárás függvénye, a tenyészidő hosszú, a termés szezonálisan jelenik meg, a gondozási munkák az időjárás miatt nem mindig végezhetők el, a termés gyakran szennyezett, - 33 -

kártevők, vadak károsíthatják. Ez a módszer a mai napig kisüzemi, háztáji, hobbi módszer maradt (Balázs, 1982). Ezt követte Véssey Ede és Tóth Ernő sterilizált mezőgazdasági hulladékon (pl.: kukoricacsutka) történő termesztési technológiájának kidolgozása, melyre 1966-ban adtak be szabadalmat. A további munkákban már Tóth László és Heltay Imre is részt vett, ezért termelési eljárásukat nevük kezdőbetűiből összeállítva, HTTV névre keresztelték, amit mára már 36 országban szabadalmaztattak. A módszer nagy lendületet adott a 60-as évek végétől meginduló és a 70-es években kibontakozó intenzív termesztéstechnológiának. Ez a kiindulási alapanyagok olyan előkészítését jelentette, hogy azt a gomba micéliuma át tudja szőni, és azon termőtestet hozzon. 1972-ben, az olaszországi Trevisoban indította el Tóth Ernő az első ipari jellegű laskagomba termelő üzemet a HTTV-szabadalmak alapján. A későbbiek során Heltay Imre is több olaszországi üzem létrehozásában vett részt. Az első magyarországi üzemet Borotán adták át 1973-ban, ahol a világon először használtak alapanyagként búzaszalmát (Heltay, 1999). A hazai de mondhatjuk, hogy az európai laskagomba-termesztés mérföldköve is a Gyurkó Pál által a 70-es évek elején előállított hibrid-fajták elterjedése lett. A P. ostreatus és a Kaliforniából származó P. florida keresztezése útján létrehozott fajták gyors fejlődésűek (3 hetes átszövetési idő), bőtermőek voltak, és a nyári meleget is jobban tűrték, mint a P. ostreatus. A sok hibrid fajtajelölt közül kiválasztott H-7 fajta lett az egyik szülője a ma is forgalomban lévő HK-35 fajtának (Hajdú és mtsai, 2005).

3.2.2 A termesztés napjainkban Balázs (1982) két fő csoportra osztja a termesztés módszereit: az extenzív és az intenzív technológiákra. Az alapvető különbség, hogy az extenzív módszereknél az alapanyag hő-, vagy kémiai kezelés nélkül marad, míg az intenzív eljárások esetén az alapanyagot hővel és, vagy vegyszerekkel kezelik, és csak ezt követi a gombacsírával való beoltás. Mivel a laskagomba fehér-korhasztó gomba, így – a csiperkével ellentétben – képes a kezeletlen kiindulási anyagok lebontására, vagyis nincs feltétlen szükség a lentebb vázolt intenzív technológiákra az alapanyag-gyártáshoz (Choi, 2004). Extenzív módszer a történeti áttekintés során említett farönkös módszer, de lehetőség van megfelelően aprított és nedvesített mezőgazdasági hulladékok felhasználására is laskagomba csírával való közvetlen beoltással. A beoltás utáni inkubálás ebben az esetben hasonló az intenzív módszereknél leírtakhoz (ld. 3.2.2.2 fejezet), azonban a termesztés sikere ekkor nem túlságosan kiszámítható. Alapvetően függ attól, hogy az - 34 -

alapanyag milyen mértékben fertőződött. Ezen részben nagyobb mennyiségű gombacsíra bekeverésével lehet segíteni, ekkor viszont a költségráfordítás már nem áll arányban a gomba hozamával. Az intenzív termesztés két részből áll: az alapanyag előkészítése (gyártása) és a szorosabban vett gombatermesztés, amikor is a becsíráztatott alapanyagot átszövi a gomba micéliuma, és létrehozza a termőtestet.

3.2.2.1 Az alapanyaggyártás A folyamat célja, hogy a laskagomba számára optimális termesztőközeget, szubsztrátot hozzon létre. Ehhez el kell távolítani a versengő és a Pleurotus fajokra nézve patogén mikroorganizmusokat, és olyan környezetet kell kialakítani, ahol egy esetleges későbbi újrafertőződés esetén sem tudnak ezen szervezetek elszaporodni. Ez utóbbihoz szükséges a könnyen bontható szerves anyagok (pl.: egyszerű szénhidrátok, aminosavak) eltávolítása. A termesztőközeg előállítása számos alapanyagból indulhat ki, mivel a laskagomba, változatos enzimrendszerének köszönhetően (Cohen és mtsai, 2002), rendkívül sokféle szubsztráton tud növekedni. Magyarországon elsősorban búzaszalmát használnak hozzá. Mivel a szalma nitrogén-tartalma nagyon kicsi, esetenként napraforgót, szójababot, lucernát adnak hozzá. Ezek adagolása azonban egyrészt serkenti a versengő és patogén mikroorganizmusok szaporodását is, másrészt ha túl könnyen bonthatóak, akkor később az átszövetés alatt az alapanyag hőmérséklete oly mértékben megemelkedhet, ami már káros a laskagomba számára (Ororbia és Núñez, 2001). Így kellő körültekintéssel kell ezeket adagolni, lehetőleg az alapanyaggyártás elején, és elsősorban olyan esetekben, amikor az átszövetés előtt komposztálják vagy kondicionálják a szubsztrátot. Ekkor ugyanis a könnyen bontható szerves anyagok elfogynak, a felszabaduló nitrogén meg beépülhet a nehezebben bontható, ám a laskagomba számára hozzáférhető, mikrobiális biomasszába, sejtfalakba. A következőkben az alapanyaggyártás főbb módszereit tekintjük át. a, A sterilizálásos eljárás során az aprított és nedvesített szalmát autoklávban 121 °Con 1-2 óráig túlnyomás alatt gőzzel csíramentesítik. A módszer hátránya, hogy az alapanyag ezután nagyon érzékeny a fertőzésre, így steril körülmények között kell becsíráztatni, és az átszövetést elkezdeni. Ez meglehetősen drága. Emiatt nem a termesztésben, hanem elsősorban kutatási célokra alkalmazzák (Ororbia és Núñez, 2001). További hátránya, hogy a magas hőmérsékleten az alapanyag kémiai szerkezete is változik, ugyanis részben felbomlanak a lignocellulózokban található hidrogénhidak, ami hozzájárul az egyszerű cukrok kioldódásához (Sánchez és Royse, 2001). - 35 -

b, A pasztörizálásos eljárás nem eliminálja az összes mikroorganizmust, a termofil, vagy spórás szervezetek túlélik a kezelést, ami csökkenti a későbbi fertőződés esélyét. A laskagombára káros mikroorganizmusok nagy része viszont elpusztul. A módszernek több változata is elterjedt. (1) Nedves hőkezeléskor az aprított és nedvesített szalmát alagutakba (4 x 3 x 30 m) töltik, ahol gőzzel 60-80 °C-on 6-12 órán keresztül pasztörizálják. Ezt a módszert kezdték el először a kereskedelmi gombatermesztésben is használni. Hátránya, hogy ez sem biztosít védelmet a későbbi fertőzésekkel szemben, így általában a laskagombára nem káros fungicid használata is szükséges. (2) Forró vízzel is lehetséges a hőkezelés, amikor is az aprított szalmát 70-80 °C-os vízbe áztatják. Ezt többször megismétlik, míg a víz tiszta nem marad már. Az áztatás teljes időtartama nem haladja meg a 15 percet. Ezután a szalma becsíráztatható és zsákokba rakható az átszövetéshez. A módszer egyszerre biztosítja az alapanyag nedvesítését, pasztörizálását és a könnyen oldódó anyagok eltávolítását. Nagy vízfogyasztása miatt mégsem túlságosan elterjedt. (3) Száraz hőkezelés (xeroterm eljárás) során, a kalapácsos darálóval aprított száraz szalmát hőkezelő alagutakba töltik, ahol 100 °C-on szárazon melegítik 1 órán keresztül. Ezután fungicides vízzel nedvesítik, ami egyben le is hűti a megfelelő hőmérsékletre az alapanyagot, majd becsíráztatják. (4) Létezik a módszernek egy „kémiai sterilizálásnak” nevezett változata, ami valójában nem teljes sterilizálás. Ezt Indiában dolgozták ki, hogy helyettesítsék a drága és nem mindig elég hatékony pasztörizálást. Ehhez az aprított szalmát különböző fungicideket tartalmazó vízben nedvesítik, és ezután becsíráztatják (Ororbia és Núñez, 2001). c, Pasztörizálás és kondícionálás: Ez a módszer két folyamatot egyesít, egy 60-70 °Cos 2-12 óra hosszú pasztörizálást és egy 50-55 °C-os párnapos termofil hőntartást, más néven kondícionálást. A hőkezelést követően az alapanyagot legalább 30°C-ra lehűtik és elvégzik a becsírázást. A kondícionálás értelme, hogy a termofil baktériumok felhasználják a könnyen lebontható szerves anyagokat, és antibiotikumokat termelnek a különböző penészek ellen (Ororbia és Núñez, 2001). Ezekről a mikróbákról már Gyurkó Pál is említést tett „védő mikroorganizmusok” néven (Balázs, 1982). E módszerek közé tartozik a történeti áttekintés során említett HTTV eljárás. d, Komposztálás, pasztörizálás és kondícionálás: Ezt a technológiát kissé részletesebben mutatjuk be, mert a dolgozatban vizsgált laskagomba-alapanyag is így készült. A komposztálás szigorú értelemben a szilárd fázisú szerves anyagok aerob úton való biológiai lebontását jelenti hőtermelés közben, szabályozott körülmények között. Ez utóbbi tulajdonsága különbözteti meg a természetes körülmények között zajló korhadástól (és rothadástól). Etimológiai szempontból a latin „compositum” (keverék) - 36 -

szóból származik, arra utalva hogy a többféle anyag keverékét egy összetett mikrobiota közösség bontja le (Ryckeboer és mtsai, 2003b). A technológia laskagomba alapanyag-gyártás esetén röviden a következő. Az aprított és nedvesített szalmát halmokba rakják, és meghatározott időszakonként átforgatják. Ez az első rész a tulajdonképpeni komposztálás. Ekkor az aprított, nedvesített szalmahalomban a víz hatására a mikróbák aktivizálódnak, és elkezdik a könnyen bontható vízoldékony szénforrásokat felhasználni. Ezek a mikróbák elsősorban a talajból származnak. A tápanyaglebontás közben hő szabadul fel, ami folyamatosan emeli a komposzthalom hőmérsékletét. Miután elfogynak a könnyebben bontható szénforrások, a mikróbák elkezdik bontani a cellulózt, hemicellulózt és a lignint. Közben a halmot 1-2 naponta átforgatják, hogy a komposzt belseje ne váljon anaerobbá, és hőmérséklete ne emelkedjen 60-70 °C fölé. A kezdeti mezofil mikrobiótát a hőmérsékletnek megfelelően egy termofil mikrobióta váltja fel (Choi, 2004). Nagyjából 1 hét után az alapanyagot hőkezelő alagutakba töltik, ahol a folytatás már megegyezik az előbbi módszernél leírtakkal. Először tehát a pasztörizálás következik, melynek során elpusztulnak az ízeltlábúak (pl. gombalegyek), férgek, a mezofil mikróbák, és puhul a szalma is, így később könnyebben hozzáférhető és bontható lesz (Choi, 2004). Végül a kondícionálás során elsősorban az aktinobaktériumok szaporodnak el tömegesen, amit az alapanyagon található fehér bevonat is jól mutat. Jelenlétük jelzi, hogy az alapanyag kellőképpen átalakult már és pH-ja 7 feletti, ami gátolja a zöld penészek növekedését (Choi, 2004). Ez a módszer még nem annyira elterjedt, és számos változata létezik akár a pasztörizálás és a kondícionálás elhagyásával (Choi, 2004; Sánchez és Royse, 2001). A komposztálás, pasztörizálás és kondícionálás nagy előnye, hogy kevésbé kell tartani az alapanyag

átszövetés

alatti befertőződésétől.

Érdemes

megjegyezni,

hogy a

laskatermesztők nyelvezetében a komposztálás és a kondícionálás helyett a „prefermentálás” és „posztfermentálás” kifejezéseket használják.

3.2.2.2 A termesztés A laskagomba termesztése általában zsákokban történik, de steril módszereknél üvegedényeket is használnak. Ezekbe töltik bele a kész alapanyagot, amihez már hozzáadták a „szemcsírát”. A termesztés Stamets (2000) alapján 4 részre osztható. (1) Az első 2-3 héten a micélium átszövi az alapanyagot. Ehhez nincsen szükség fényre és különösebb szellőztetésre sem, csak 85-95%-os páratartalomra és az adott laskagomba - 37 -

törzsnek megfelelő hőmérsékletre. (2) A primordiumok (termőtest-kezdemények) képződését a környezeti körülmények hirtelen megváltoztatásával lehet elindítani. Ez magába foglalja a hőmérséklet csökkentését (nagyjából 10 °C-kal), a páratartalom emelésével (95% körül) együtt a jobb oxigénellátást (szellőztetőrendszerek beindítása) és 1000-1500 lux megvilágítást 3-5 napig. (3) A termőtestek fejlődése ezután már pár fokkal magasabb hőmérsékleten kisebb alacsonyabb páratartalom (85% körül) és további intenzív szellőztetés mellett történik a következő 4-7 nap folyamán. (4) Végül az érett termőtestek leszedhetőek, és a folyamat újrakezdésével még további 1-2 terméshullámot lehet leszedni az alapanyagról.

3.3 Mikrobiális folyamatok a laskagomba alapanyag-gyártáshoz hasonló környezetekben Mivel a laskagomba üzemi szintű termesztése csak az 1970-es években kezdődött, sok részlet még nem tisztázott kellő mélységig. Ilyen az alapanyaggyártás mikrobiológiája is. A kezdetben alkalmazott steril eljárásnál az autochton mikrobióta teljesen elpusztul. Pasztőrözés esetén sem egy „folyamatról” van szó, hiszen a kezelés után közvetlenül beoltják az alapanyagot a laskacsírával, és itt már a szorosabban vett gombatermesztés kezdődik. Ennek részletes áttekintése így nem része a jelen dolgozatnak. Tehát csak a kondícionálás és a komposztálás esetén vizsgálhatóak igazán az alapanyag-gyártás mikrobiológiai folyamatai. Viszont ez a két módszer még újabb keletű a laskagomba termesztése esetén (Choi, 2004). Így az irodalom is inkább az alapanyag-gyártással, mint mezőgazdasági folyamattal foglalkozik (Sánchez és Royse, 2001). Ezért ebben a fejezetben a valamivel jobban ismert csiperkekomposzt és általában a komposztálás mikrobiológiáját mutatjuk be röviden, felhívva a figyelmet az egyes módszerek közt levő hasonlóságokra és különbségekre is.

3.3.1 Csiperkekomposzt gyártás mikrobiológiája A folyamat hasonló a laskagombánál leírthoz, a főbb lépések itt is a halomkomposztálás, a pasztörizálás és a kondícionálás. A szakirodalom gyakran a folyamat egészét nevezi komposztálásnak. A legfontosabb különbség, hogy a csiperkének nagyobb a nitrogén-igénye, így a szalmához csirke- és lótrágyát is adnak. Különbség még, hogy a szalmát a trágyával való összekeverés előtt gyakran napokig áztatják, és maga a komposztálás időtartama is hosszabb (Gerrits, 1988). A csiperkekomposzt gyártás számos területét vizsgálták már meg alaposabban, mint - 38 -

például a komposztban végbemenő szerkezeti és kémiai változásokat (Iiyama és mtsai, 1994; Straatsma és mtsai, 1995; Lyons és mtsai, 2000; Lyons és mtsai, 2006), a kiindulási anyagok összetételének hatását a termesztésre (Straatsma és mtsai, 2000), azonban a mikroba közösségekről alkotott képünk még elég hiányos. Derikx és munkatársai (1990) a hőmérséklet oxigénfogyasztásra és a mikrobiális aktivitásra gyakorolt hatását vizsgálták a komposztálás során. A hőmérséklet a halomkomposztálás során elérheti a 80 °C-ot is, de az addig izolált mikroorganizmusok között nem volt extrém termofil, vagyis hőmérsékleti optimumuk jóval 80 °C alatt volt. Ennek megfeleltethető az az eredményük, hogy az oxigénfogyasztás a legnagyobb értéket röviddel az alapanyagok összekeverése után érte el, majd 50-60 °C felett radikálisan csökkent, ugyanúgy mint az összes kivonható lipidfoszfát formájában mért biomassza. A mikroba közösség folyamatosan, dinamikusan változik a komposztálás során. A szukcesszió a hőmérséklet és az elérhető tápanyagok változásával, valamint a populációk egymástól való függésével magyarázható. Ugyanis az egyes közösségek részben a korábban már jelen lévő mikróbák által termelt metabolitokat használják fel. Ivors és munkatársai (2000) a kész, becsíráztatás előtti gombakomposzt mikroba közösségeit vizsgálták klasszikus és molekuláris módszerekkel. Bár elkészítettek egy 192-tagú bakteriális 16S rDNS klónkönyvtárat, mindössze 8 klónt azonosítottak bázissorrend elemzéssel. Ezekből 4 a proteobaktériumok különböző csoportjaiba, 2-2 az aktinobaktériumok illetve a kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé tartozott. Azonban az ismert törzsekkel való hasonlóságuk parciális 16S rDNS szekvencia alapján csak 90-96%-os volt. Az izolátumok közül 5 baktérium parciális 16S rDNS szekvenciáját határozták meg. Ezek mindegyike a kisG+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé tartozott. Közülük kettőt sikerült faji szinten is azonosítani, a Bacillus licheniformist és a Caryophanon latumot. Később hasonló kész komposztminták gombaközösségét is megvizsgálták (Ivors és mtsai, 2002), de az összetett bakteriális közösséghez képest jóval egyszerűbb gombaközösséget találtak. Song és munkatársai (2001) koreai gombatermesztők feltehetően becsíráztatás előtti komposztjaiból izoláltak termofil

aktinobaktériumokat

Saccharopolyspora,

Streptomyces

(Pseudonocardia, és

Thermobifida

Saccharomonospora, nemzetségek

tagjait)

és

Thermoactinomyces fajokat. (A szerzők nem adták meg a minták pontos eredetét.) Az eddigi vizsgálatoknál részletesebben, a teljes komposztgyártást vizsgálták Peters és munkatársai (2000) molekuláris eszközökkel (SSCP, klónkönyvtárak) és törzsek izolálásával. A komposztálás 18 napján keresztül mind a teljes baktérium, mind az - 39 -

aktinobaktériumok diverzitása emelkedett. A kezdeti közösségben számos Lactobacillus klónt találtak, míg Bacillus klónokat a teljes komposztálás során detektáltak. Hasonlóan átfogóbban elemeztük a teljes komposztgyártást az ELTE, Mikrobiológiai Tanszéken mikrobiális ujjlenyomatok (DGGE, T-RFLP), klónkönyvtárak készítésével és törzsek izolálásával (Székely és mtsai, 2009). A DGGE és a T-RFLP vizsgálatok alapján készült PCA-ordinációk segítségével három csoportba sorolhatóak a minták: (1) az első hat nap halomkomposztálása, (2) a komposztálás termofil fázisa és az (3) érett gombakomposzt. Az azonosított klónok és törzsek alapján (1) kezdetben Acinetobacter és Pseudomonas fajok dominálták a közösséget, (2) majd a termofil fázisban a Thermus thermophilus és rokonai voltak kimutathatóak, (3) végül az érett komposztra a Pseudoxanthomonas, a Thermobifida és a Thermomonospora nemzetségek képviselői voltak jellemzőek. Látható, hogy a csiperkekomposzt mikrobiológiájával már részletesebben foglalkozik a szakirodalom mint a laskagomba alapanyaggyártáséval, de jellemzőbb egy-egy részlet vizsgálata, mint a teljes folyamat jellemzése.

3.3.2 A komposztálás mikrobiológiája Az alapvető különbség a gombatermesztés során történő komposztálás és az általános komposztálás között, hogy az előbbiben egy olyan szubsztrát létrehozása a cél, ami mentes a versengő és a gombára nézve patogén mikroorganizmusoktól, és amiben egy esetleges későbbi újrafertőződés esetén sem tudnak ezen szervezetek elszaporodni. E cél eléréséhez csak mérsékelt szervesanyag lebontásra van szükség, elsősorban a könnyen bontható szerves anyagok eltávolítására. Míg általában a komposztálás során az a cél, hogy egy a talajéhoz hasonló, viszonylag stabil, lingin-humusz komplexekből felépülő szerves anyagot hozzanak létre (Jann és mtsai, 1959). Így ez utóbbi folyamat jóval hosszabb, a körülményektől függően (kiindulási anyagok összetétele, oxigénellátottság, nedvességtartalom, halom átforgatásának gyakorisága, külső hőmérséklet) több hónapig is eltarthat (ld. 42. oldal, 3/6. ábra), és gyakran kevésbé szabályozott is. Az általános komposztálás mikrobiális dinamikáját számos módszerrel vizsgálták már. Többek között tenyésztéssel (Ryckeboer és mtsai, 2003a; Takaku és mtsai, 2006); T-RFLP-vel (Tiquia és mtsai, 2005), DGGE-vel (Takaku és mtsai, 2006; Adams és Frostick, 2009), klónkönyvtárak készítésével (Partanen és mtsai, 2010), PLFA (phospholipid fatty acid; foszfolipid-zsírsav) elemzéssel (Klamer és Bååth, 1998) és a bakteriális aktivitás változásának nyomonkövetésével (Adams és Frostick, 2009).

- 40 -

A következőkben a folyamat főbb lépéseit és a mikrobiális változásokat Ryckeboer és munkatársai (2003b) összefoglalása alapján mutatjuk be. A komposztálást 4 szakaszra lehet bontani (3/6. ábra): az (1) első mezofil, a (2) termofil, a (3) második mezofil és az (4) érési fázisra. Az első két fázis alapvetően megegyezik a gombatermesztésnél bemutatott komposztálással, csak jelen esetben a termofil fázis jóval hosszabb, míg a második két fázis gyakorlatilag hiányzik a gomba-alapanyag előállításánál. (1) A kezdeti mikrobióta nagyon változatos a kiindulási anyagok összetételének megfelelően. A kezdeti biodegradációért és hőtermelésért elsősorban a baktériumok a felelősek, bár jelen vannak mikrogombák is. (2) A termofil fázis során elpusztulnak a patogének, és elkezdődik a nehezebben lebontható lignocellulózok degradációja. A megemelkedett hőmérsékletnek köszönhetően a biokémiai folyamatok felgyorsulnak, de a teljes bakteriális diverzitás csökken, és 60-70 °C felett már limitáló tényező a hőmérséklet. Az átalakult baktérium-közösség főbb képviselői a spóraképző fajok (pl.: Bacillus spp.), a Thermus nemzetség képviselői és az aktinobaktériumok. Bár a termofil gombák hatékonyabban bontják a baktériumoknál a lignocellulózt, hőmérsékleti optimumuk alacsonyabban, 40-55 °C körül található, 60 °C felett pedig elpusztulnak, vagy spórákat hoznak létre. Így a termofil fázisban sem játszanak túl fontos szerepet. (3) A tápanyag mennyiségének csökkenésével a termofil organizmusok aktivitása csökken, és ezzel együtt a hőmérséklet is. A komposztot újra mezofil szervezetek kezdik el kolonizálni, akár kívülről, akár belülről a termofil fázist valamilyen formában túlélve (spórák formájában vagy védett mikroniche-ekben). Ekkor a baktériumok mennyisége több nagyságrenddel is csökkenhet, de taxonómiai és anyagcsere diverzitásuk nő, és megjelennek a termotoleráns és mezofil gombák is. (4) Utóbbiak fontos szerepet játszanak az érés során a még megmaradt lignin és más rekalcitráns vegyületek bontásában és humusszá való átalakításában. Fontos, hogy az így elkészült komposzt minél stabilabb legyen. Talajba keverve az éretlen komposzt ugyanis nagyon megnövelheti a mikrobiális aktivitást, ami oxigénhiányt és más közvetett fitotoxikus hatást eredményezhet.

- 41 -

Termofil fázis

2. mezofil fázis

Érési fázis

Mikróbák relatív abundanciája

Érési fok

Hőmérséklet (°C)

Érési fok Hőmérséklet

(Rottegrade stabilitási index)

1. mezofil fázis

Baktériumok Gombák Aktinobaktériumok

pH

C/N-arány

pH C/N-arány

A komposztálás napjai 3/6. ábra: A komposztálás jellemző paramétereinek és a mikróbák mennyiségének változása. A balról jobbra sötétedő háttér a komposztálás 4 fázisát jelzi. A görbék pontos lefutása – beleértve az időtengely megnyúlását – nagy mértékben változhat az olyan körülményektől, mint a kiindulási anyagok összetétele, az oxigénellátottság, a nedvességtartalom és külső hőmérséklet alakulása valamint a halom átforgatásának gyakorisága (Ryckeboer és mtsai, 2003b alapján).

- 42 -

4. Célkitűzések Az elmúlt évtizedben a mikrobiális ökológiai módszerek, ezen belül a molekuláris ujjlenyomat technikák nagy fejlődésen mentek keresztül. Egyre gyakrabban használják ezen technikákat, az alkalmazók azonban sokszor nem rendelkeznek megfelelő technikai háttérismerettel hozzájuk. Az Irodalmi áttekintésben bemutattuk az egyik ilyen módszert, a T-RFLP-t, előnyeivel és hátrányaival, és leírtuk, hogy milyen kérdések megválaszolására alkalmas. Említettük, hogy alkalmazása során az egyes lépésekben gyakorta nem megfelelően járnak el, elsősorban az adatfeldolgozás során. Dolgozatunk első részében erre a területre koncentrálva a következő célokat kívánjuk elérni: 1. A T-RFLP adatfeldolgozás optimalizálása, amely a következő lépések megvizsgálását foglalja magában: a. Meghatározzuk azon kritériumokat, amelyek teljesülése esetén egy TRFLP futás alkalmas a további elemzésekre. b. Elemezzük azt, hogy szükség van-e párhuzamos futások adatainak feldolgozására, vagy elegendő minden mintából egy futás adatainak felhasználása. c. Megjelöljük a zajszűréshez megfelelő módszer kiválasztásának elveit; ennek alapján lehet eldönteni, hogy mikor minősül egy csúcs zajnak, vagy valódi csúcsnak. d. Optimáljuk az egyes T-RFLP futások adatainak egymáshoz illesztését és az adatmátrix létrehozását, vagyis azt a folyamatot, hogy hogyan lehet megtalálni az egymásnak megfelelő csúcsokat két különböző futásban. e. Értelmezzük az egyes futások közötti, adatmátrixban „kódolt” különbségeket. Bemutatjuk a különbségeket okozó domináns T-RF-ek megtalálásának eljárását. 2. Az optimalizálás nyomán leírunk egy standardizált T-RFLP adatfeldolgozási protokollt. Ennek tartalmaznia kell minden lépés esetén az ajánlott módszert, illetve jeleznie kell, hogy milyen esetekben kell esetleg más eljárást választani. A protokoll segítségével a jövőben szilárdabb tudományos alapon használható a T-RFLP mikrobiális ökológiai vizsgálatokban. Dolgozatunk második részében a standardizált protokoll segítségével a laskagombaalapanyag gyártás baktérium-közösségeit vizsgáljuk. Mint az Irodalmi áttekintésben - 43 -

leírtuk, a laskagomba nagyüzemi termesztése a XX. század első felében kezdődött, de csak a második felében teljesedett ki. Ma is sokféle termesztési eljárás létezik, amelyek leginkább tapasztalati úton alakultak ki. Így nem ismerjük a termesztés alatt lezajló folyamatokat elég részletesen. Pedig ez a tudás segíthetne a termesztés minőségének emelésében. A termesztés első lépése az alapanyag-gyártás. Dolgozatunk második részében ennek mikrobiológiai vonatkozásait vizsgáltuk meg a következő célokat kitűzve: 3. A standardizált T-RFLP adatfeldolgozási protokoll segítségével a laskagomba alapanyag baktérium-közösségének megvizsgálása, a gyártás során benne végbemenő változások feltárása. 4. A kész alapanyag mikrobiális és fizikai-kémiai tulajdonságai, illetve az adott alapanyagon később termett laskagomba mennyisége közötti összefüggések feltárása. 5. Az egyes alapanyaggyártási fázisokra jellemző domináns baktériumok azonosítása T-RFLP és klónkönyvtárak segítségével.

- 44 -

5. Anyag és módszer 5.1 Laskagomba alapanyaggyártás és termesztés Az általunk vizsgált laskagomba alapanyagot búzaszalma részleges komposztálásával a Pilze-Nagy Kft. állította elő. A nyers búzaszalmához a száraz szalma 5 tömeg%-os mennyiségében lucernát adtak nitrogénforrás-kiegészítésként, majd 1-6 cm-es darabokra aprították és kútvízzel 75 tömeg%-os nedvességtartalomig nedvesítették. A nedves szalmát ezután 5 x 3 m-es átmérőjű halmokban komposztálták 7 napig (5/1. ábra). A halmot naponta átforgatták, miközben a halom belső hőmérséklete elérte a 6570 °C-ot. A 7. napon a komposztált alapanyagot alagutakba töltötték. A betárolás alatt az

alapanyag

lehűlt,

azért

gőzzel fűtötték fel 65 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten 18 óráig pasztörizálták a laskagombára nézve

patogén

mikróbák

elpusztítása céljából. Ezután következett a kondícionálás lépése (48 °C, 2 nap), végül az alagút

kiürítése

előtt

megvárták, míg az alapanyag

5/1. ábra: Az alapanyaggyártás halomkomposztálási

lehűlt 25 °C-ra (ld. 47. oldal,

szakasza.

5/2. ábra). A szorosabb értelemben vett termesztés ezután kezdődött a kész alapanyag becsíráztatásával, mely során az alapanyag minden tonnájához 20 liter csírát adtak, a szubsztrátot 23-24 kg-os mennyiségben perforált zsákokba rakták. A zsákokat termesztőházakba

vitték,

ahol

ellenőrzött

körülmények

(hőmérséklet,

nedvességtartalom, fényviszonyok) között zajlott az alapanyag gombamicéliumok általi átszövetése majd a termőtestképzés egészen a harmadik termőhullámig. A laskagomba terméshozamát 100 kg alapanyagról leszedett gomba friss súlyában határozták meg. A terméshozam egyenletességét annak variációs koefficiensével, a szórás és az átlag hányadosával határoztuk meg.

5.2 Mintavétel és fizikai-kémiai analízis A vizsgálandó mintákat a termesztő cég munkatársai gyűjtötték a 2006-2008-as évek során (5/1. táblázat). Az alapanyag-gyártást 7 ponton mintáztuk, de végül ezekből csak - 45 -

három fázist választottunk ki a mikrobiológiai vizsgálatokra: (1) aprított, nedvesített szalma a gyártás kezdetekor; (3) alapanyag a halomkomposztálás végén, az alagútba töltés előtt; (7) kész alapanyag az alagútból való kitároláskor, a becsíráztatás előtt (5/2. ábra). Az adott fázisú alapanyag-halom belső részéből három különböző helyen vettek mintát, amit aztán alaposan összekevertek, hogy a minta minél reprezentatívabb legyen és végül zárható fóliába helyezték, feliratozták, és -20 °C-ra lehűtve tárolták. A minta 3 számból álló jelölést kapott: az első a gyártási évet jelöli, a második a gyártási sor száma, a harmadik az alapanyaggyártás fázisának a száma (pl. 6-093-7). Az alagútból kitárolt minták (7. fázis) kémhatását, N-, nedvesség- és hamutartalmát egy akkreditált laboratórium (Bács-ÁG Kft.) határozta meg.

5/1. táblázat: A vizsgált minták felsorolása.

Gyártási sor Feldolgozott Az alagúból való száma minták kitárolás (7. fázis) fázisa dátuma 6-019 6-055 6-061 6-077 6-093 6-099 6-104 6-110 7-019 7-051 7-118 7-178 7-187 7-197 7-203 8-067

1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 3, 7 1, 3, 7 1, 3, 7 7 7 7 7 1, 3, 7

2006. febr. 17. 2006. máj. 15. 2006. máj. 31. 2006. júl. 10. 2006. aug. 21. 2006. szept. 1. 2006. szept. 12. 2006. szept. 23. 2007. febr. 1. 2007. márc. 17. 2007. ápr. 24. 2007. nov. 3. 2007. nov. 14. 2007. nov. 24. 2007. dec. 5. 2008. ápr. 18.

- 46 -

80 70 2

3

Hőmérséklet (°C)

60

Pasztörizálás 4

Kondícionálás

50

6

5

40 30

1

20

7

10 Halomkomposztálás szabad téren

Alagútban zajló folyamatok

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Idő (nap)

5/2. ábra. Az alapanyaggyártás hőmérsékleti görbéje. A számok a mintavételi pontokat jelzik. (A kisméretű számok azon pontok, ahonnan nem történt mikrobiológiai vizsgálat). A függőleges vonal középen a szabad téren és az alagútban zajló fázisokat választja el egymástól.

5.3

Az

alkalmazott

baktérium-közösség

elemző

módszerek

összefoglalása Munkánk során a baktérium közösséget 16S rDNS szekvencia alapon molekuláris technikákkal vizsgáltuk (5/3. ábra). Ehhez izoláltuk a közösségi DNS-t, majd PCR segítségével felszaporítottuk a 16S rDNS régió egy részét és T-RFLP ujjlenyomatokat hoztunk

létre.

Optimalizáltuk

a

T-RFLP

adatfeldolgozás

lépéseit,

hogy

összehasonlíthassuk egymással az egyes minták baktérium-közösségét. Megvizsgáltuk van-e szignifikáns összefüggés az egyes közösségek bakteriális ujjlenyomata illetve a hozzájuk tartozó fizikai-kémiai paraméterk illetve az egyes gyártási sorok laskagomba terméshozama

között.

Mivel

a

T-RFLP

technika

nem

alkalmas

közvetlen

fajazonosításra, ezért a közösségi DNS mintákból 16S rDNS klónkönyvtárakat hoztunk létre. A klónok T-RFLP profiljainak felvétele és a közösségi profilokkal való összevetése után elvégeztük a domináns csúcsoknak megfelelő klónok bázissorrend elemzését.

- 47 -

Mintavétel Közösségi DNS izolálása PCR alkalmazása a 16S rDNS szakaszra T-RFLP T-RFLP adatfeldolgozás optimalizálása T-RFLP mintázatelemzés Klónkönyvtárak létrehozása

Domináns T-RFLP csúcsok azonosítása

Fizikai-kémiai változók és laskagombahozamok meghatározása

T-RFLP mintázat, fizikai-kémiai változók és laskagombahozamok összevetése

5/3. ábra: Az alkalmazott módszerek kapcsolata.

5.4 Közösségi DNS-kivonás A DNS kivonásához folyékony nitrogénes fizikai feltárást, majd a tisztításhoz szilikagél alapú módszert használtunk. A fagyasztott mintákat folyékony nitrogén segítségével steril dörzsmozsárban porítottuk, vigyázva, hogy közben a minták ne olvadjanak fel. Minden alkalommal 3 almintát (300 mg) vittünk tovább 1 ml CLS-Y lízis puffert (Bio 101, La Jolla, CA, USA) és 50 mg polivinil-polipirrolidont (PVPP) (Sigma, St. Louis, MO, USA) tartalmazó centrifugacsőbe. A PVPP a PCR-t gátló huminsavakat és fenoloidos vegyületeket köti meg. A CLS-Y oldat a sejtek lízisét, valamint a DNázok és egyéb fehérjék inaktiválódását segíti elő. Centrifugálás után (12.000 g, 5 perc) a felülúszóból 600 μl-t, amely a nyers DNS kivonatot tartalmazta, a G-spin For Bacteria, Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Dél-Korea) segítségével tisztítottuk meg a gyártó leírása szerint. A kapott 3 almintát végül egyesítettük és a további felhasználásig a DNS-t -20 °C-on tároltuk.

- 48 -

5.4 T-RFLP 5.4.1 PCR reakció Munkánk során a bakteriális 16S rDNS régió első szakaszát vizsgáltuk. Ehhez az alábbi összetételű (5/2. táblázat) és paraméterű (5/3. táblázat) PCR reakciót végeztük el. 5/2. táblázat: Az alkalmazott PCR reakciók összetétele Koncentráció ill. mennyiség

Összetevő

50 μl végtérfogat esetén 0,200

mM

dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Fermentas, Vilnius, Litvánia)

2,000

mM

MgCl2 (Fermentas)

2,000

U

Taq polimeráz (Fermentas)

0,400

mg/ml

BSA (bovin [szarvasmarha] szérum albumin, Fermentas)

0,325

μM

primerek (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)

5,000

μl

0,500-4,000 μl 50,000

μl-ig

kiegészítve

10x-es PCR puffer (Fermentas) DNS DEPC (dietilpirokarbonát) kezelt víz (Roth, Karlsruhe, Németország)

5/3. táblázat: A HEX-27F – 534R PCR reakcióban alkalmazott primerek és a reakció hőprofilja Primer neve HEX-27F

534R

Primer bázissorrendje (5'  3') HEX-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ATT ACC GGG GCT GCT

Kezdeti denaturáció 98 °C 94 °C 5 perc 10 mp

Referencia Lane, 1991 Lane, 1991

Ciklusszám: 32 94 °C 52 °C 72 °C 30 mp 30 mp 30 mp

Végső extenzió 72 °C 10 perc

Az amplikonok méretének és mennyiségének ellenőrzése 1 vegyes%-os agaróz gélben történt. Az elektroforézist követően (20 perc, 100 V-on TBE pufferben) az etídiumbromiddal (500 μg/l végkoncentrációban) megfestett DNS-t UV fényben detektáltuk.

5.4.2 Restrikciós emésztés és kapilláris elektroforézis A 16S rDNS PCR termékeket az amplifikáció után AluI (AG/CT) és Hin6I (G/CGC) (Fermentas, Vilnius, Litvánia) enzimekkel emésztettük 3 órán keresztül 37 oC-on. A reakcióelegy mintánként 2 µl restrikciós enzim puffert, 0,3 µl restrikciós enzimet, 10 µl PCR-terméket és 17,7 µl DEPC kezelt vizet tartalmazott. A következő lépésben etanolos tisztítást végeztünk (5/4. táblázat), mely során a DNS alkoholos közegben - 49 -

kationokkal reagálva kicsapódik, így megtisztítható az elektroforézist zavaró anyagoktól.

5/4. táblázat: Az etanolos tisztítás lépései Művelet oldat hozzáadása

Részletek 3 μl 3 M NaAc (pH 4,6), 62,5 μl 95%-os etanol és 14,5 μl DEPCkezelt víz (Roth)

keverés

5 mp, 50 Hz-en asztali kémcsőrázatóval

inkubáció

15 perc, szobahőmérsékleten

centrifugálás

20 perc, 18.000 g

felülúszó elöntése

-

oldat hozzásadása

250 μl 70%-os etanol

keverés

5 mp, 50 Hz-en asztali kémcsőrázatóval

centrifugálás

10 perc, 18.000 g

felülúszó elöntése

-

kiszárítás

kb. 15 perc, vákuum centrifugában

A kapilláris elektroforézis során egyszálú DNS molekulákra van szükség, ezt denaturálószer hozzáadásával (formamid) és magas hőmérséklet (98 oC, 5 perc) biztosításával értük el. Az alkalmazott reakcióelegy összetétele a következő volt: 12 μl formamid (Sigma), 0,6 μl GeneScanTM-500 TAMRATM méretmarker (Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA) és 0,5-8 μl minta (20 μl DEPC-kezelt vízzel oldatba vitt DNS). Az elektroforézist ABI PrismTM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) berendezéssel végeztük POP-4 polimerrel, 60 oC-on, 8 mp injekciós és 30 perces futási idővel, 15 kV-on.

5.4.3 T-RFLP adatfeldolgozás Mivel az adatfeldolgozás optimalizálása a dolgozat egyik célkitűzése, itt csak röviden ismertetjük az egyes lépéseket és a felhasznált programokat. A részletes elemzést az Eredmények és értékelésük fejezetben mutatjuk be. A T-RFLP kromatogramok feldolgozását a GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) programok Microsatellite módszerével végeztük. A csúcsok megtalálásához a következő paramétereket állítottuk be: alapvonal (1 FU), minimum csúcs-félszélesség (2 pont), illesztett polinom foka (5), ablakméret (11 pont). A csúcsok pozíciójának meghatározásához a Local Southern algoritmust használtuk. Csak olyan futást fogadtunk el, ahol a GeneMapper a méretmarker minden csúcsát azonosította. (Ez alól - 50 -

kivétel, ha olyan csúcs hiányzott, ami már egyáltalán nem vett részt a méretmeghatározásban. [vö: 56. oldal, 6/1. ábra]). Feltétel volt még, hogy a futás RFUja meghaladja a 100.000 egységet, és ne tartalmazzon „offscale” csúcsot. Ha egy mintából több megfelelő futás is rendelkezésünkre állt, akkor azt választottuk ki, amelyikben a legnagyobb csúcs megközelítette a 6-7.000-es FU méréshatárt, és az összfluoreszcencia az átlagos 300.000 egységhez közelített. Kizártuk az 50 bp-nál rövidebb csúcsokat, de az 500 bp-nál hosszabbakat meghagytuk. A zajszűrést a T-REX programmal (Culman és mtsai, 2008a) végeztük kivéve az arányos küszöbérték módszernél, ahol az Excel programban határoztuk meg a valódi csúcsokat. Az egyes futások egymáshoz illesztéséhez a T-REX programba beépített legközelebbi egész számra való kerekítést és T-Align (Smith és mtsai, 2005) modult illetve az Abdo és munkatársai (2006) által R programban (R Development Core Team, 2010) írt parancssort használtuk. Az optimális binek meghatározásához, vagyis ahhoz, hogy két egymást követő T-RF csúcs mikor tartozzon azonos kategóriába, a párhuzamos futások azonos csúcsai között megfigyelt eltérések nagyságát (T-RF drift) használtuk fel, amit Excel programban számoltunk ki. Az illesztés során az egyes csúcsok nagyságát a programok standardizálták a görbe alatti terület, vagyis az összfluoreszcencia segítségével. A továbbiakban a két restrikciós enzimmel (AluI és Hin6I) kapott mátrixot a robosztusabb eredmény érdekében együttesen kezeltük. A kapott mátrixok értelmezését (ordinációk és dendrogramok) és statisztikai vizsgálatát Past (Paleontological Statistics Software Package; Hammer és mtsai, 2001) és R (R Development Core Team, 2010) programmal végeztük. Kiszámoltuk az egyes minták diverzitását (Shannon és Simpson-index alapján), és box-plotot készítettünk ezekre az értékekre meghatározva a diverzitás alapján kilógó mintákat. Az egyes mintacsoportok szignifikáns különválását ANOSIM módszerrel teszteltük, míg az elválást leginkább befolyásoló csúcsokat SIMPER módszerrel határoztuk meg. A különböző módszerekkel kapott ordinációkat Prokrusztész-analízissel hasonlítottuk össze a GenStat for Windows (12th Edition, VSN International, Hemel Hempstead, UK) programot használva. A kanonikus elemzések során a minták első főkomponenseken felvett koordinátái és a fizikai-kémiai paraméterek illetve terméshozamok között Past programmal számoltunk lineáris korrelációt, és határoztuk meg, hogy az adott érték szignifikáns mértékű-e. Elemzésünket kiegészítettük, az R program „envfit” parancsának futtatásával is, mely a már elkészült PCA ordinációra vetíti vektorként a környezeti paramétereket, majd ezen

- 51 -

illeszkedés korrelációs koefficiensét és – random permutációk segítségével – szignifikancia szintjét határozza meg (Oksanen és mtsai, 2010).

5.5 Klónkönyvtárak készítése, elemzése és a T-RFLP mintázatokkal való összekapcsolása A klónkönyvtárakhoz (5/5. táblázat) ugyanolyan közösségi PCR terméket készítettünk, mint a T-RFLP-hez (5.4.1) csak a 27F primer jelöletlen változatát használtuk, és a végső extenzió 30 percig tartott, majd a termékeket PCR-MTM Clean Up System (Viogene, Sijhih, Tajvan) segítségével tisztítottuk meg a gyártó leírását követve. A tisztított PCR termékek klónozását a kék-fehér szelekción (Sambrook és Russell, 2001) alapuló, pCR®2.1-TOPO® vektort tartalmazó TOPO TA Cloning® kittel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) végeztük a gyártó utasításait követve. A DNS reamplifikációja első körben M13 primerekkel történt (5/6. táblázat), hogy elkerüljük a szuperkompetens sejtek DNS-ének zavaró hatású felszaporítását. 5/5. táblázat: A klónkönyvtárak készítéséhez kiválasztott minták Minta neve 6-066-1 6-066-3 6-066-7

Klónkönyvtár kódja PBA PBB PBC

Minta neve 6-099-7 7-118-7 7-203-7

Klónkönyvtár kódja PBD PBE PBF

5/6. táblázat: Az M13 PCR reakcióban alkalmazott primerek és a reakció hőprofilja Primer neve Primer bázissorrendje (5'  3') M13F (-20) GTA AAA CGA CGG CCA GT M13R GGA AAC AGC TAT GAC CAT G (-24) Kezdeti denaturáció 95 °C 3 perc

94 °C 30 mp

Ciklusszám: 32 52 °C 72 °C 30 mp 1 perc

Referencia Sambrook és Russel, 2001 Sambrook és Russel, 2001 alapján módosítva Végső extenzió 72 °C 10 perc

Az M13 PCR terméket felhasználva elvégeztük a klónok T-RFLP elemzését az 5.4.12 pontoknak megfelelően, és a hasítási helyeknek megfelelően csoportosítottuk őket. Kiválasztottuk az olyan hasítási hellyel rendelkező klóncsoportokat, amelyek megfeleltethetőek voltak közösségi T-RFLP kromatogramokon az egyes fázisokra, illetve a 7. fázis esetén azon belüli csoportokra jellemző Simper50 csúcsoknak (ld. 68. oldal, 6.1.5 fejezet), vagy az egyes fázisokban illetve csoportokban átlagosan 2% RFU gyakoriság feletti csúcsoknak.

- 52 -

A kiválasztott klóncsoportok egy-egy reprezentáns tagjának bázissorrend elemzését a következőkben leírtak szerint végeztük. A szekvenáló reakciók a BigDye® Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems) felhasználásával, a gyártó utasításait követve, a megadott reakciótérfogat egynegyedében játszódtak le. Ezt etanolos tisztítás követte (ld. 5/4. táblázat). A bázissorrend elemzéshez szükséges kapilláris elektroforézist a Biomi Kft. (Gödöllő)

munkatársai

végezték.

A

kromatogramokat

a

Chromas

program

(Technelysium Pty Ltd, Tewantin, Ausztrália) segítségével manuálisan korrigáltuk, a vektor és a primerek szekvenciáit eltávolítottuk. Az esetleges kiméra szekvenciákat a Mallard (Ashelford és mtsai, 2006) program segítségével találtuk meg, majd eltávolítottuk őket. A szekvenciákat a Blast programmal (Altschul és mtsai, 1997) a Genbank DNSadatbázissal (Benson és mtsai, 2010), ill. a prokarióta típustörzseket tartalmazó EzTaxon adatbázissal (Chun és mtsai, 2007) vetettük össze.

- 53 -

- 54 -

6. Eredmények és értékelésük Munkánk első részében optimalizáltuk a T-RFLP adatfeldolgozás lépéseit, majd ezt az optimalizált protokollt alkalmaztuk a laskagomba alapanyag-gyártás baktériumközösségének vizsgálatára. Ezt követően elemeztük, hogy van-e szignifikáns összefüggés a T-RFLP eredmények és a kémiai háttérváltozók értékei illetve a laskagomba terméshozama között. Végül klónkönyvtárak segítségével jellemeztük az egyes fázisok és kiemelten a kész alapanyag baktérium-közösségének összetételét.

6.1 A T-RFLP adatfeldolgozás optimálása Az optimalizáció során az Irodalmi áttekintésben (ld. 16. oldal, 3/3. ábra) tárgyalt pontoknak megfelelően haladtunk a 6-061, 6-077 és 7-051-es mintasorokat – továbbiakban referencia mintasorok – felhasználva (ld. 46. oldal, 5/1. táblázat), kivéve a 6.1.2 fejezetben, ahol csak a 6-061 és 6-077-es mintasorokkal dolgoztunk.

6.1.1 Futások nyersadatainak feldolgozása Az első lépésben a GeneMapper® program a megadott beállítások szerint dolgozta fel az egyes futásokat. Ehhez ellenőrizte, hogy a méretmarker valamennyi csúcsa megtalálható-e a mintában. Amennyiben a program itt hibát érzékelt, nem értékelte ki az adott futást. Ekkor elvégeztük a méretmarker csúcsainak manuális megkeresését a kromatogramon. Ezzel a lehetőséggel csak akkor éltünk, ha olyan méretmarker csúcs hiányzott, ami nem vett részt az adott futás csúcsainak bázispárban megadott méretmeghatározásában (6/1. ábra). Lehetőség volt futásonként a program által detektált csúcsok manuális ellenőrzésére, az esetlegesen kihagyott csúcsok elemzésbe való bevonására. Ez azonban rendkívül időigényes és szubjektív lépés, és csak a hibaforrások számát növeli. Ezért csak akkor éltünk a lehetőséggel, ha a főbb csúcsoknál találtunk szembeötlő hibát (6/2. ábra). Az irodalmi adatoknak megfelelően nem vettük figyelembe a 35 bp-nál rövidebb fragmentumokat (Engebretson és Moyer, 2003). Az 500 bp-nál hosszabbakat azonban megtartottuk. Ugyanis a létrehozott klónkönyvtárakban is találtunk olyan klónokat – elsősorban a Hin6I enzimmel való emésztés után –, amelyek T-RF mérete meghaladta az 500 bp-t (ld. 6/3-5. táblázat). Ezek a fragmentumok többségükben nem valódi T-RFek, hanem hasítatlan darabok, de az adott enzimmel való hasítóhely hiánya ugyanúgy információ, mint a megléte. Ráadásul a 16S rDNS ezen régiójának hossza az irodalmi adatok szerint 470 és 570 bp között változik (Suzuki és mtsai, 1998), vagyis a hasítatlan termékek ugyanúgy elválhatnak egymástól hosszúság szerint, mint a valódi T-RF-ek. - 55 -

Azt, hogy a méretmeghatározás pontossága 500 bp felett már eléggé csökken, később, a futások illesztésénél vettük figyelembe (ld. 6.1.3 fejezet).

a

b

450 bp-os méretmarker csúcs

6/1. ábra: Egy T-RFLP futás (a) és a hozzá tartozó méretmarker (b) kromatogramjai. A függőleges tengely a fluoreszcens intenzitást (FU) a vízszintes a fragmentek hosszát (bp) mutatja. A GeneMapper® program a méretmarker szemmel látható 450 bp-os csúcsát általunk ismeretlen okból nem detektálta, így a futást csak manuális korrigálás után tudta feldolgozni. Az alkalmazott Local Southern módszer a méretmeghatározáshoz minden csúcsnál csak az adott csúcs előtt és után lévő két méretmarkert vette figyelembe. A 450 bp-os méretmarker csúcs pozícióját a kiszürkített régióban található csúcsok méretmeghatározásához kellett volna figyelembe venni, ahol viszont jelen mintában nem volt csúcs. Így ezt a futást fel lehetett használni a további vizsgálatokban.

a

b

6/2. ábra: Csúcsok detektálása: (a) a beszürkített régióban található csúcsot a program már eredetileg is megtalálta; (b) a GeneMapper® program a beszürkített részen a csúcsnak a jobb oldali részét nem vette figyelembe, ezért ezt manuálisan javítottuk.

- 56 -

Utolsó lépésként, csak olyan futásokat fogadtunk el optimálisnak, amelyekben nem volt „offscale” csúcs, de az összfluoreszcencia elérte a legalább 100.000 RFU értéket (6/3. ábra).

6/3. ábra: Egy elfogadott (fent) és egy „offscale” csúccsal rendelkező futás (lent). Az ábra jobb oldalán a bal oldali teljes kromatogramból az „offscale” csúcsot tartalmazó kiszürkített régió látható kinagyítva.

6.1.2 Párhuzamos futások kérdése A T-RFLP módszer egyik nagy előnye, hogy aránylag gyorsan és költséghatékony módon lehet vele nagy számú mintát feldolgozni. Ezért szerencsés, ha minden mintából elegendő egy optimális futás, és nincs szükség párhuzamosok használatára. Ezt a hipotézist azonban ellenőriznünk kellett. Először végignéztük a 6-061-es és 6-077-es mintasorok 6.1.1 pontban leírtak alapján már elfogadott párhuzamos futásait, mintánként 5 darabot, az AluI és a Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek esetén is. Kizártunk az elemzésből egy futást, ha a benne lévő csúcsok pozíciója jelentősen eltért az adott minta összes többi párhuzamos futásától (6/4. ábra). Majd enzimenként összehasonlítottuk az egyes futásokat. Ehhez a következő paramétereket használtuk: csúcsok területének standardizálása az adott futás összfluoreszcencia értékének segítségével; a 0,2%-nál kisebb csúcsok elhagyása; futások egymáshoz illesztése T-Align programmal 0,5 bin értékkel; grafikus ábrázolás PCA alkalmazásával (6/5. ábra).

- 57 -

a

b

6/4. ábra: Egymásra vetített párhuzamos futások. (a) A 6-061-7 minták Hin6I enzimmel emésztett futásai, ahol az egyes futásokban a 82 bp-os csúcs pontos pozíciója nem azonos, de elég kicsi köztük az eltérés (ld. 6/6 ábra). (b) A 6-061-3 minták Hin6I enzimmel emésztett futásai, ahol az egyik futásnál (piros színnel jelölve) az 525 bp-os csúcs pozíciója annyira eltér a többi párhuzamosétól, hogy kizártuk az adott futást az elemzésből.

6-061-1 6-061-3

1,6

6-061-7 1,2

6-077-1 6-077-3

PC2 (14,2%)

0,8

6-077-7 0,4 0 -0,4 -0,8 -1,2 -1,6 -2 -2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

0,4

0,8

PC1 (34,4%)

6/5. ábra: A 6-061 és 6-077-es mintasorok AluI enzimmel emésztett párhuzamos futásainak kétdimenziós ábrázolása főkomponens elemzés segítségével. Az egyes pontok átmérője arányos az adott futás összfluoreszcencia értékével.

Az 6/5. ábrán látható, hogy a párhuzamos futások néha jelentősen eltérnek egymástól. Ezt részben a többi futáshoz képest nagyon nagy (6-061-7), vagy kicsi (6-061-3) összfluoreszcencia okozta, de többnyire nem ez magyarázta az eltéréseket, hiszen a főkomponens elemzés során nem a csúcsok alatti valódi területekkel, hanem az egyes futások összfluoreszcenciájával standardizált relatív területekkel számoltunk. Megoldási lehetőséget nyújtana, ha minden egyes mintából nagyszámú optimális párhuzamos futtatást készítenénk el – Dunbar és munkatársai (2001) például 9 párhuzamos futtatást - 58 -

ajánlanak –, majd a párhuzamos futásokat egymáshoz illesztenénk, és ezek átlagértékeivel dolgoznánk a továbbiakban. Azonban ez éppen a T-RFLP módszer gyorsaságát és költséghatékonyságát rontaná. Érdemesebb ezért ezt a hibát a kapilláris elektroforézist végző műszer (ABI PrismTM 310 Genetic Analyser) saját hibájának tekinteni, amit nem tudunk kiküszöbölni a futtatás közben, hanem figyelembe kell venni a további adatfeldolgozási lépések során. A hiba csökkentése érdekében a következő két kezelést alkalmaztuk. Először is megpróbáltuk figyelembe venni, hogy a párhuzamos futások mennyire csúsznak el egymáshoz képest, vagyis mekkora a T-RF drift (Kaplan és Kitts, 2003). Ehhez megkerestük a párhuzamos minták egymáshoz tartozó domináns csúcsait, kiszámoltuk a pozícióik közötti eltérést, és ábrázoltuk ezt a fragmentumok hosszának függvényében. Az eltérés függött az alkalmazott restrikciós enzimtől és a fragmentum hosszától, ezért azoknak megfelelően határoztuk meg az illesztés során (6.1.4) az alkalmazandó binek értékeit (6/6. ábra). 3

Átlagos eltérés illetve terjedelem (bp)

2,8

Bin értékek

2,6

AluI: 0,8 bp Hin6I: 0,5 bp

2,4 2,2

0,5 bp 0,6 bp

0,7 bp

0,7 bp 1 bp

2 bp 2 bp

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

100

200

300

400

500

600

Fragmentumok hossza (bp) AluI: Átlagos eltérés

AluI: Terjedelem

Hin6I: Átlagos eltérés

Hin6I: Terjedelem

6/6. ábra: Párhuzamos futások között megfigyelt elcsúszás (T-RF drift). Kiszámoltuk a párhuzamos futások esetén az egymásnak megfelelő fragmentumok átlagos eltérését (2*[Σ(xixátlag)/n)]) és terjedelmét (xmax-xmin), majd az így kapott pontokra illesztett görbét ábrázoltuk. AluI enzim esetén nem találtunk 300 bp-nál hosszabb domináns fragmentumot. A görbék alapján a függőleges vonalakkal (100, 350, 450 és 500 bp) tagolt régiókra osztottuk a fragmentumokat. Az egyes régiókban az egyes enzimek esetén alkalmazott binek értékei az ábra felső részén olvashatók.

- 59 -

Második kezelésként mintánként egybevontuk az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek futásadatait. Az ezzel a két lépéssel kapott eredményt a 6/7. ábrán mutatjuk be.

1,6 1,2

PC2 (16,1%)

0,8

6-061-1 6-061-3 6-061-7 6-077-1 6-077-3 6-077-7

0,4 0 -0,4 -0,8 -1,2 -1,6 -2 -1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

0,4

0,8

1,2

PC1 (28,9%)

6/7. ábra: A 6-061 és 6-077-es mintasorok párhuzamos futásainak két-dimenziós ábrázolása főkomponens elemzés segítségével. Az 6/5. ábrához képest itt már változó bineket (ld. 6/6. ábra) és az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek egybevont futásadatait használtuk.

Látható, hogy a kezelések előtti (6/5. ábra) és utáni (6/7. ábra) kép eltér egymástól, de ennek mértékét szabad szemmel nehéz megállapítani. Ezért az egyes minták párhuzamos futásainak összetartozását, és a minták egymástól való elválását ANOSIM statisztika segítségével ellenőriztük (6/1. táblázat). Látható, hogy az R érték minden esetben szignifikáns a teljes mintára nézve, és két eset kivételével elmondható ez a páronkénti összehasonlításokról is. A legmagasabb R értéket – és így a különböző minták legjobb egymástól való elválást –, akkor kaptuk, amikor mindkét kezelést alkalmaztuk. Kijelenthetjük tehát, hogy a két kezelés növelte az egyes minták párhuzamos futásainak összetartozását, és így hozzájárult annak a hibának a csökkentéséhez, hogy a továbbiakban minden mintából csak egy futást használtunk fel.

- 60 -

6/1. táblázat: Az ANOSIM statisztika eredményei a 6-061-es és 6-077-es minták párhuzamos futásainak különböző összehasonlításai esetén. Használt enzimek és illesztés binje

R

R érték szignifikanciaszintje

AluI; 0,5 bin Hin6I; 0,5 bin AluI és Hin6I; 0,5 bin AluI; változó bin

0,9019 0,9537 0,9689 0,9105

Hin6I; változó bin AluI és Hin6I; változó bin

0,939 p<0,0001 0,9765 p<0,0001

p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

Szignifikáns-e valamennyi páronkénti post-hoc összehasonlítás? Igen (kivéve a 7-es fázisú minták egymás közötti értéke: p=0,1247) Igen Igen Igen Igen (kivéve az 1-es fázisú minták egymás közötti értéke: p=0,0728) Igen

6.1.3 A futások zajszűrése A következő lépésben azt kellett meghatározni, hogy egy csúcsot mikor tekintsünk zajnak. Ehhez az arányos küszöbérték és a küszöbérték statisztikai meghatározása módszereket

(ld.

19.

oldal,

3.1.3.2

fejezet)

hasonlítottuk

össze

különböző

küszöbértékeket alkalmazva. A referencia mintasorokat a T-REX programba töltöttük be, és a zajszűrés szórás paraméterét fokozatosan növeltük. Majd megnéztük, hogy az adott paraméternél mekkora a legkisebb megmaradt csúcs relatív területe (6/8. és 6/9. ábra). 3,2 2,0 1,9 1,8

Csúcsok relatív területe (%)

1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

1 SD

2 SD

3 SD

4 SD

5 SD

6 SD

7 SD

Zajszűrés során alkalmazott szórás nagysága

6/8. ábra: Az arányos küszöbérték és a küszöbérték statisztikai meghatározása módszerek összevetése. A vízszintes tengelyen fokozatosan növekszik a T-REX programban végrehajtott zajszűrés szórás paramétere. Az oszlopok magassága az egyes futásokban megmaradt legkisebb csúcs relatív területeinek átlagértékeit mutatja annak szórásaival együtt.

- 61 -

6 SD 0,77%

7 SD 1,29%

3,80%

7 SD

5 SD

2 SD

0,45%

0,03%

1,70%

6 SD

4 SD

3 SD

0,25%

1,03%

0,12%

4 SD 0,14%

6/9. ábra: Az arányos küszöbérték és a küszöbérték statisztikai meghatározása módszerek összevetése egy kromatogram-részleten. A kijelölt csúcsoknál a felső szám azt jelzi, hogy mekkora az a mértékű zajszűrés, amikor az adott csúcs már zajnak minősül. Míg az alsó szám az adott csúcs relatív nagyságát adja meg. Az utolsó csúcsnál csak egy szám szerepel, mert azt a csúcsot még a legerősebb zajszűrés sem tekintette zajnak.

Abdo és munkatársai (2006) a 3 SD küszöbértéket javasolják. Azonban esetünkben nagyon változó a megmaradt legkisebb csúcs relatív nagysága 3 SD értéknél, amit azok viszonylag nagy szórása jelez. Másrészt a párhuzamos futások vizsgálata során azt figyeltük meg, hogy általában csak a 0,2%-os relatív területnél nagyobb csúcsok találhatóak meg valamennyi futásban, vagyis a kisebb csúcsok mindenképpen zajnak tekinthetőek. Ezért a 4 SD értéket választottuk a zajszűréshez. Meg kell jegyezni, hogy mi az egyes csúcsok relatív területével számoltunk, így a legkisebb csúcsoknak a továbbiakban nincs olyan nagy jelentőségük. Egyesek bináris adatkezelést alkalmaznak, mert a PCR torzításai (Sipos és mtsai, 2007) miatt a T-RFLP amúgy is szemikvantitatív módszer. Ezt nem szem elől tévesztve azonban érdemes megkülönböztetni a csúcsok méretét, és az általuk jelzett OTU-k nagyságát, ezért döntöttünk a relatív területek alkalmazása mellett. Végül összevetettük – az illesztés során a T-REX programban változó bineket használva, majd a mátrixot főkomponens analízis segítségével értelmezve –, hogy a különböző zajszűrési szintek alkalmazása, mennyire befolyásolja a minták egymáshoz való hasonlóságát. A 6/10. ábrán jól látható, hogy csak a binárisan kezelt és az 5%-os küszöbértékkel szűrt minták térnek el kis mértékben a többitől. Vagyis a zajszűrésnek valóban nincs túl nagy jelentősége relatív területek alkalmazása esetén, mint ezt Bennett és munkatársai (2008) is megerősítik. - 62 -

6-061-1 6-061-3

15

5%

5%

6-061-7 6-077-1

10 5%

5%

5

6-077-7

PC2 (16,5%)

5% 0

6-077-3 7-051-1

5%

7-051-3

5%

7-051-7

-5 5%

-10 -15 -20

5%

-25 -30 -30

-24

-18

-12

-6 0 6 PC1 (29,7%)

12

18

24

6/10. ábra: A referencia mintasorok futásainak két-dimenziós ábrázolása főkomponens elemzés segítségével különböző zajszűrési küszöbértékkel (0,2; 0,5; 1; 2,5; 5%, illetve 0,2% után bináris kezelés) szűrve. Mivel az egyes mintapontok nagyon közel helyezkednek el egymáshoz, csak az 5%-os küszöbértéket (kiírva) és a bináris kezelést (fekete pontok) jelöltük külön.

6.1.4 A futások egymáshoz illesztése Az illesztés feladata, hogy megtalálja a különböző mintákban előforduló, egymásnak megfelelő csúcsokat. Nehézséget okoz, hogy két eltérő OTU-nak a futási mérete két különböző mintában annyira hasonló lehet, hogy az illesztés során hibásan kerülnek egy kategóriába (binbe). Másrészt két azonos OTU futási mérete két különböző mintában eltérhet annyira, hogy az illesztés során tévesen kerülnek külön binbe. Az egyes illesztési eljárások abban is különböznek egymástól, hogy mit tesznek akkor, ha egynél több csúcs kerül egy binbe (6/11. ábra).

- 63 -

A csúcs mérete (bp): 217,76 218,69 220 221,12

224,87 225,99 227,12

230,04 231,08

Abdo 0,5 és 0,7 bin; T-REX 0,5 és 0,7 bin; Legközelebbi egész számra való kerekítés Abdo 1 bin Abdo 2 bin T-REX 1 bin T-REX 2 bin

6/11. ábra: Az egyes illesztési eljárások különbözősége egy adott futás adatainak feldolgozása során. A kromatogram-részleten 9 csúcs látható. Egyes módszerek az egy binen belül található több csúcs területét összevonják (Abdo), vagy csak a legnagyobbat tartják meg (T-REX), ahogy azt az ábra alsó részén – a csúcsokat jelképező vonalak segítségével – bemutatjuk. Az „Abdo” az Abdo és munkatársai (2006) által leírt módszert jelenti.

A párhuzamos futások kérdésénél már bemutattuk, hogy miért van szükség változó binre (ld. 59. oldal, 6/6. ábra). A kérdés így már csak az maradt, hogy a T-REX által alkalmazott módosított T-Align módszert, vagy Abdo és munkatársai (2006) módszerét használjuk változó binekkel. Ezek mindössze abban különböznek, hogy mit csinálnak akkor, ha több csúcs kerül egy binbe (6/11. ábra). Ezért elkészítettük változó binekkel a két módszerrel az illesztést, de hozzávettük az állandó bineket alkalmazó párjaikat és a legközelebbi egész számra való kerekítést is. Mivel sem a T-REX, sem az Abdo féle módszer nem alkalmas közvetlenül változó binek használatára, ezen esetekben először külön-külön elvégeztük az illesztést valamennyi binnel, majd mindegyik mátrixból kivágtuk a megfelelő részt. Ezután valamennyi esetben egybevontuk az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek futásadataiból készült mátrixot. Végül ezen mátrixokból készült főkomponens elemzés eredményeket Prokrusztész elemzéssel vetettük össze (6/12. ábra).

- 64 -

6-061-1

a 0,12

6-061-7 6-077-3 6-077-7

0

7-051-7

A

T0,7

N

T

A0,7 -0,04

b -0,08

A

T0,7 T

-0,16

T N

A0,7

0,4 0 -0,4

A A0,7 T0,7 T

T0,7 A

A

T

N

A0,7

-0,8 -1,2

T0,7 A A0,7 -0,16

A0,7

1,2 0,8

A0,7 N

-0,2

A T0,7 T N N T0,7

7-051-3

-0,12

T

7-051-1

PC2 (23,4%)

PC2 (12,1%)

0,04

A

N T0,7 T0,7 A A0,7 T NT A T0,7 N A0,7

6-077-1

0,08

A0,7

T

6-061-3

-1,6

N -0,9 -0,6 -0,3 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 PC1 (54,9%)

-0,12

-0,08

-0,04

0

0,04

0,08

0,12

PC1 (17,5%)

6/12. ábra: A különböző illesztési módszerek hatása: (a) A referencia mintasorok futásainak kétdimenziós ábrázolása főkomponens elemzés segítségével. A különböző illesztési módszerekkel kapott ábrákat Prokrusztész módszer segítségével vetítettük egymásra. (b) Az egyes illesztési módszerek egymáshoz való hasonlósága a Prokrusztész elemzés alapján (N – legközelebbi egész számra való kerekítés; T0,7 – T-REX 0,7-es binnel; T – T-REX változó binnel; A0,7 – Abdo 0,7es binnel; A – Abdo változó binnel).

Nincsen óriási eltérés a két módszer között változó binek alkalmazása esetén (6/12.b. ábra). Mivel a T-REX féle módszer jobban hasonlított a többi módszerhez, és alkalmazása is egyszerűbb, ezt alkalmaztuk a további lépésekben. Hozzájárult ehhez még az az elvi megfontolás is, hogy ha két csúcs – változó bineket használva – egy mintán belül egy binbe kerül, akkor nagyobb a valószínűsége annak, hogy a kisebb csúcs zaj (Culman és mtsai, 2008a), mint annak, hogy mindketten valódi csúcsok.

6.1.5 A futások közötti különbségek láthatóvá tétele Az adatfeldolgozás optimalizálásának utolsó lépése, a különböző minták kiválasztott és illesztett futásaiból készült mátrix vizuális megjelenítése. Eddig csak a főkomponens elemzést használtuk, de létezik más ordináció és a fakészítésről sem érdemes elfeledkezni. Itt érdemes megjegyezni – amit a teljes mintán végzett elemzésnél (ld. 72. oldal, 6/16. ábra) majd látni is fogunk –, hogy előfordulhatnak egy-egy mintasokaságban „nagyon - 65 -

kilógó” minták, amelyek torzíthatják az elkészülő ordinációt, vagy fát. A kilógás hátterében gyakran a nagyon kis diverzitás áll, mikor csak néhány csúcs található egy futásban. Ha ilyen eset áll fent, akkor érdemes a minták Shannon- és Simpsondiverzitását kiszámolni. Az eredmények függvényében szükség lehet a „nagyon kilógó” minták eltávolítására a további elemzésből. Az ordinációk közül a főkomponens elemzést, a korreszpondencia elemzést, a főkoordináta-módszert és a nem metrikus többdimenziós skálázást vetettük össze. Utóbbi kettőnél euklidészi távolságot és Bray-Curtis hasonlóságot is használtunk (6/13. ábra).

PCoBC

6-061-1

a

6-061-3

0,12

6-061-7 6-077-1

PCoBC

6-077-3

0,08

6-077-7

NBC CA

7-051-1 7-051-3

PCA NE

7-051-7

0

PCoE

PCoBC NE PCoE NE NBC PCA CA CA PCoBC NBC NE NBC NMSE CA PCoE PCA PCoBC CA

PCA

-0,04

NBC PCoBC

NE

NBC CA -0,08 PCoBC CANBC PCoE PCA CA NE -0,12 PCoE PCA PCoBC

-0,16

-0,2

b1,6 1,2 0,8 0,4 0 -0,4 -0,8 -1,2 -1,6 -2

PCoE

NE

NE

PC2 (30,4%)

2. koordináta

0,04

CA PCA PCoE NBC PCoBC PCoE PCA CA PCA PCoE NBC NE

PCA PCoE

PCoBC NMSBC -0,9 -0,6 -0,3 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 PC1 (49,8%)

-0,16 -0,12 -0,08 -0,04

0

0,04

0,08

0,12

1. koordináta

6/13. ábra: Különböző ordinációk összehasonlítása: (a) A referencia mintasorok futásainak kétdimenziós ábrázolása különböző ordinációk segítségével. A kapott ábrákat Prokrusztész módszer segítségével vetítettük egymásra. (b) Az egyes ordinációs módszerek egymáshoz való hasonlósága a Prokrusztész-elemzés alapján, a pontokat összekötő vonalak az ordinációra vetített minimális feszítőfa élei (CA – korreszpondencia analízis; NMSBC – nem metrikus skálázás Bray-Curtis hasonlóságot használva; NMSE – nem metrikus skálázás euklidészi távolságot használva;PCA – főkomponens analízis; PCoBC – főkoordináta módszer Bray-Curtis hasonlóságot használva; PCoE – főkoordináta módszer euklidészi távolságot használva).

- 66 -

A 6/13. ábrán látszik, hogy az illesztésekhez hasonlóan itt is nagy különbséget okoz az, hogy melyik módszert használjuk. Mint az Irodalmi áttekintésben említettük Culman és munkatársai (2008b) szerint az ordinációk közötti választásban az egyik fő irányelv a minták

béta-diverzitásban

mért

heterogenitása.

A

nagy

béta-diverzitással

–

tapasztalataik alapján 2-nél nagyobb érték – rendelkező minták vizsgálatára az NMDS-t ajánlják. Míg kisebb béta-diverzitású minták esetén az egyes ordinációs módszerek hasonló eredményt adnak. A referencia mintasorok esetén a heterogenitás értéke 2,16. Lepš és Šmilauer (2003) egy másik lehetőséget ajánl, miszerint készítsünk a mintára egy dCA (detrended correspondence analysis) ordinációt. Az elemzés a béta-diverzitást a gradiens hosszában adja meg az egyes tengelyek esetén. Azt tanácsolják, hogyha a leghosszabb gradiens értéke 4-nél nagyobb, akkor unimodális módszereket (dCA, CA, CCA) használjunk. 3-nál kisebb érték esetén valószínűleg a lineáris módszerek (PCA) alkalmzása a jobb választás. A 3 és 4 közötti tartományban mindkét típusú módszerek használhatóak. Esetünkben a leghosszabb gradiens 3,05. Vagyis mindkét ajánlás alapján a mintánk béta-diverzitása pont azon a határon mozog, ami elválasztja egymástól a kevésbé diverz és a diverzebb mintasorokat. A fentiek végiggondolása után főkomponens elemzésre esett a választásunk, mert a PCA elméleti háttere és így a kapott eredmény is viszonylag könnyen értelmezhető. Ráadásul rendelkezik biplot funkcióval, ami fontos az egyes csoportok elválását okozó T-RF-ek meghatározásában. Viszont a PCA során, mint valamennyi ordináció esetében, a mintáinkat 2, vagy 3 dimenzióban tudjuk csak ábrázolni, ami információvesztéssel járhat. Jelen esetben az ábrázolt első két tengely az összvariancia 46,4%-át fedi le. A főkomponens elemzés eredményeinek alátámasztására és kiegészítésére ezért még két módszert alkalmaztunk. Először elkészítettük a minták Bray-Curtis hasonlósága alapján történő csoportosítását UPGMA módszerrel (6/14.a. ábra). Azért ezt a típusú fát választottuk, mert a BrayCurtis hasonlósági értéket, mint azt az Irodalmi áttekintésben már említettük, nem befolyásolja a páros hiány, szemben a PCA során alkalmazott euklideszi távolsággal. Az így kapott fát rávetítettük a főkomponens elemzéssel készült ordinációra (6/14.b. ábra). Jól látható, hogy a két módszerrel kapott kép alapjaiban megegyezik, bár a dendrogram pontosabban ábrázolja a minták között lévő távolságokat.

- 67 -

6-061-1

7-051-1

6-077-1

7-051-7

6-077-7

6-061-7

6-061-3

7-051-3

6-077-3

a

b 6-061-1 6-061-3

1

1,6

0,9

1,2

PC2 (16,4%)

Hasonlóság

0,7 0,6

6-077-3 6-077-7 7-051-1 7-051-3

0,4

7-051-7

0 -0,4 -0,8

0,5 54 0,4

0,2

6-077-1

0,8

0,8

0,3

6-061-7

62 93

93 37

77

-1,2 -1,6 -2

77

-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

0,4

0,8

1,2

1,6

PC1 (30,0%)

100

6/14. ábra: (a) A referencia mintasorok futásainak összehasonlítása Bray-Curtis hasonlóságok alapján UPGMA módszerrel készült fa segítségével. A fa elágazásainál látható számok az 1000 ismétlés után kapott bootstrap értékeket jelzik. (b) A referencia mintasorok futásainak összehasonlítása főkomponens elemzés segítségével. A mintákat összekötő vonalak az ordinációra rávetített Bray-Curtis hasonlóságon alapuló UPGMA fát jelzik.

Második lépésként szétválasztottuk a mintákat az alapanyaggyártás 3 fázisának megfelelően (1, 3, 7), és elvégeztük a SIMPER elemzést. Majd kiválasztottuk azokat a csúcsokat, amelyek a 3 csoport elválásához együttesen 50%-ban járulnak hozzá. Ezeket Simper50 csúcsoknak neveztük el. A SIMPER analízis előnye, hogy dimenziófüggetlen és Bray-Curtis hasonlóságon alapul a számítása. Ezután megvizsgáltuk, hogy a PCA ordináció első 4 tengelyén, mely az összvariancia 73,3%-áért felelős, melyek a PCA szerinti domináns csúcsok (PCAdom). (PCAdom csúcsoknak azokat tekintettük, amelyekre igaz, hogy xdom>xátlag±2SD, ahol xdom a domináns csúcs adott tengelyen vett koordinátája, xátlag az adott tengelyen vett összes csúcs-koordináta átlaga, SD meg az összes csúcs-koordináta szórása.) Végül összevetettük a kétféle módon kiválasztott domináns csúcsokat, és azt kaptuk, hogy a 35 PCAdom csúcsból mindössze 6 olyan volt, amelyek nem voltak a Simper50 között. De a 6 csúcsból semelyik sem az első tengelyen felvett koordinátája miatt került bele a PCAdom csoportba (6/15. ábra).

- 68 -

Alu-070

6-061-1 6-061-3 4

6-061-7 6-077-1

3

Hin-101 Alu-076

6-077-3 6-077-7

Hin-250 Hin-237 Hin-098_(2) Hin-342 Alu-242_(2) Alu-053 Hin-186 Hin-052_(4) Alu-075

7-051-1 2

7-051-3 7-051-7

PC2 (16,4%)

1

Alu-207

Hin-369 Hin-080

0

Hin-205 -1

Alu-247

Hin-081

Alu-245

Alu-206_(3) Alu-254

Alu-074 Alu-246

Hin-140 Hin-540

Alu-234

-2

Hin-249_(2) Hin-368_(2) Hin-082 Hin-472 Hin-377 -3 Hin-359

Alu-072 -4

Alu-235 -5 -6,4

-4,8

-3,2

-1,6 0 PC1 (30,0%)

1,6

3,2

4,8

6/15. ábra: A referencia mintasorok futásainak összehasonlítása főkomponens elemzéssel. A biplot funkció segítségével látható, hogy mely csúcsok alapján válnak el egymástól az egyes minták. Csak a Simper50 és a PCAdom csúcsokat ábrázoltuk. Azon csúcsok színe fekete, melyek csak a PCAdom csoportba tartoztak a Simper50 csoportba nem. Ez utóbbi csoportnál a zárójelben lévő szám azt mutatja, hogy az egyes csúcsok melyik PCA tengelyen dominánsak.

A két példa azt mutatja, hogy a PCA megfelel a mintáink bakteriális T-RFLP ujjlenyomatainak összehasonlítására, de a részletesebb elemzéshez érdemes a kiegészítő módszereket is használni.

6.1.6 Az optimalizált T-RFLP adatfeldolgozás leírása A kifejlesztett módszert a következő pontokban lehet röviden összefoglalni: 1) Első lépés a megfelelő futások kiválasztása. A GeneMapper® program automatikusan ellenőrizte a T-RFLP futások minőségét, és csak a program által megfelelőnek minősítetteket fogadtuk el. Majd manuálisan ellenőríztük a futásokat, de a program által detektált csúcsokon csak akkor változtattunk, ha a főbb csúcsoknál találtunk szembeötlő hibát. A kiértékelés során csak a 35 bp-nál hosszabb fragmentumokat vettük figyelembe, de megtartottuk az 500 bp-nál hosszabbakat is. Végül egy futást csak akkor fogadtunk el megfelelőnek, ha nem - 69 -

tartalmazott „offscale” csúcsot, de az összfluoreszcencia elérte a legalább 100.000 RFU értéket. Ezeket a futásokat feltöltöttük a T-REX online T-RFLP adatfeldolgozó programba (Culman és mtsai, 2008a). Majd ott végeztük a futások zajszűrését és egymáshoz való illesztését. 2) Mivel minden mintából csak egy futást használtunk fel a vizsgálatokhoz – elsősorban költséghatékonyság és időtakarékosság miatt –, csökkenteni kellett azt a hibát, amit egy minta párhuzamos futásai közötti variancia elhanyagolása okozott. Emiatt mintánként egybevontuk az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek futásadatait. Majd a párhuzamos futások közti varianciák alapján meghatároztuk az egyes T-RF méreteknél, az egyes enzimek esetén alkalmazott binek értékeit. Ezek az értékek közvetlenül is felhasználhatóak más minták esetén, vagy az itt leírt módon kell meghatározni a binek értékeit. 3) A zajszűréshez összehasonlítottuk az arányos küszöbérték és a küszöbérték statisztikai meghatározása módszereket. A konkrét zajszűrési paraméter megállapításához figyelembe vettük, hogy a párhuzamos futásoknál általában csak a 0,2%-os relatív területnél nagyobb csúcsok találhatóak meg valamennyi futásban, vagyis a kisebb csúcsok zajnak tekinthetőek. Végül az Abdo és munkatársai (2006) által kidolgozott, és a T-REX programba kisebb módosítással beépített módszert választottuk, 4 SD küszöbértékkel. 4) A T-RFLP futások egymáshoz illesztését szintén a T-REX programmal végeztük a beépített módosított T-Align modullal, a párhuzamos futások vizsgálata során meghatározott változó binekkel. Mivel a T-REX nem alkalmas közvetlenül változó binek használatára, először külön-külön elvégeztük az illesztést valamennyi binnel, majd egyesítettük a megfelelő részeket az illesztésekből. Végül az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek futásadataiból így összerakott két mátrixot egybevontuk. 5) Az így elkészült mátrixok alapján a minták közötti különbségeket főkomponens elemzéssel (PCA) tettük láthatóvá. A nagyon kis Shannon- és Simpson-diverzitással rendelkező minták torzíthatják az elkészülő ordinációt, vagy fát, így érdemes őket kizárni az ábrázolásból. A megfelelő ordinációs módszer kiválasztásában segítségünkre volt az illesztési mátrix bétadiverzitásának meghatározása dCA és heterogenitás-számolás segítségével. Végül az ordináció értelmezését Bray-Curtis hasonlóság alapján történő UPGMA csoportosítással és SIMPER elemzéssel, valamint a Simper50 csúcsok klónkönyvtárak segítségével történő azonosításával egészítettük ki. - 70 -

A fentebb vázolt protokoll közvetlenül alkalmazható más minták esetében is, vagy a felhasznált döntési mechanizmusok útján kialakítható az adott mintához még megfelelőbb protokoll. A protokoll segítségével a jövőben szilárdabb tudományos alapon használható a T-RFLP mikrobiális ökológiai vizsgálatokban.

- 71 -

6.2 A laskagomba-alapanyag gyártás során kialakuló baktériumközösségek jellemzése A baktérium-közösségeket T-RFLP segítségével vizsgáltuk meg az előző fejezetben leírt optimalizált eljárás szerint. Majd a domináns csúcsok azonosítását és a kész alapanyag közösségének részletes jellemzését bakteriális 16S rDNS klónkönyvtárak segítségével végeztük el.

6.2.1 A teljes gyártási sor jellemzése T-RFLP segítségével A T-RFLP adatok feldolgozásának eredményét főkomponens elemzés segítségével ábrázoltuk (6/16.a. ábra). Jól látható, hogy a 6-099-1 minta jelentősen, a 6-019-3 pedig mérsékelten eltér a többi mintától. Ezért meghatároztuk a minták Shannon- és Simpsonindex alapú diverzitását. Kiderült, hogy mindkét minta kilógó értékűnek tekinthető kis diverzitásuk alapján (6/16.b. ábra). Ez akkor is kitűnik, ha egy pillantást vetünk egy átlagos diverzitású és a kilógó minták futásképére (6/15.c. és d. ábra). Ezért a további vizsgálatokból a két mintát kizártuk.

b

a

4,8

6-099-1

0,93

4,2

1,2

0,9

3,9 Shannon diverzitás

PC2 (11,8%)

1,8

0,6 0 -0,6 -1,2 -1,8

0,96

4,5

6-019-3

3,6 3,3 3 6-019-3

2,7

2,1

-3

-4,8 -4,2 -3,6 -3

-2,4 -1,8 -1,2 -0,6 0 PC1 (18,7%)

0,87

8-067-7 8-067-1

6-019-3

0,84 0,81

6-099-1

0,78 0,75

2,4

-2,4

Simpson diverzitás

2,4

6-099-1

0,72

0,6

c

d

6/16. ábra: (a) A laskagomba alapanyag-gyártás bakteriális T-RFLP futásainak összehasonlítása főkomponens elemzéssel. Jelölések: kék – 1. fázis; piros – 3. fázis; szürke – 7. fázis. (b) Az egyes minták Shannon- és Simpson-diverzitása alapján készített box plot. A kilógó mintákat pontok jelölik. A pontok és a felirat mérete az átlagtól való eltérés mértékét jelöli. (c-d) Egy átlagos diverzitású (c, 6-077-1) és a kilógó 6-099-1 (d) minta AluI enzimmel emésztett futásainak képe.

- 72 -

A maradék mintával elvégeztük újra a főkomponens elemzést, majd teszteltük a PCA alkalmazhatóságát az adatmátrix béta-diverzitásának kiszámolásával. A Culman és munkatársai (2008b) által definiált heterogenitás értéke 3,98 (Culman és mtsai, 2008b), míg dCA ordináció esetén a leghosszabb gradiens értéke 3,58. A referencia mintasorokhoz képest a heterogenitás értéke majdnem kétszeresére emelkedett, a gradiens hossza azonban csak az ötödével nőtt. Ráadásul az első két tengely csak az összvariancia 28,1%-át fedi le. Ezért a PCA ordinációra rávetítettük a Bray-Curtis hasonlóságok alapján készült UPGMA fán egymáshoz 20 illetve 35%-nál nagyobb hasonlóságot mutató minták alkotta csoportokat (6/17.a. ábra).

1,6

a

6-099-3 6-104-3 7-118-3 6-093-3 8-067-3 6-061-3

7-118-1 1,2

0,8

6-055-3 7-051-3

7-019-3

0,4

6-110-3 6-077-3

6-061-7 6-077-7

6-093-1

6-099-7

6-110-7 6-093-7

0

6-055-1 6-019-7

-0,4

7-203-7 7-118-7 7-187-7 6-104-7 6-055-7 7-051-7 7-178-7

6-077-1

-0,8 8-067-1

b

-1,2

7-051-1

-1,6 6-104-1

6-110-1

6-061-1

Bray-Curtis hasonlóság

PC2 (11,1%)

7-197-7

0,5 0,45

7-019-7

0,4 0,35

8-067-7

0,3 0,25 0,2 0,15

1. fázis

6-019-1

-2 -1,5

-1

-0,5

0

3. fázis

0,5

7. fázis

1

1,5

2

2,5

PC1 (17,0%)

6/17. ábra: (a) A laskagomba alapanyag-gyártás bakteriális T-RFLP ujjlenyomatainak összehasonlítása főkomponens analízissel a kilógó minták elhagyása után. A folytonos és a pontvonalak a Bray-Curtis hasonlóságon alapuló UPGMA fán alkotott csoportokat jelölik. A folytonos vonallal körbevett minták egymáshoz való Bray-Curtis hasonlósága meghaladja a 20%-ot, a pontvonallal körbevetteké 35% feletti. Jelölések: kék – 1. fázis; piros – 3. fázis; szürke – 7. fázis. (b) Az egyes fázisokon belüli átlagos Bray-Curtis hasonlóság. A hibasávok az átlag±szórás értéket jelölik.

- 73 -

A 6/17. ábrán jól látható, hogy a különböző fázisokból származó minták – 1-2 kilógó értéktől eltekintve – elkülönülnek egymástól, mind a PCA ordináció, mind a BrayCurtis hasonlóság segítségével készült UPGMA fa alapján. A fázisok globális és páronkénti szignifikáns különbségét az ANOSIM statisztika is megerősíti (p<0,001). Az egyes fázisokon belül a minták csoportosulása már több esetben nem egyezik meg az ordináció és a dendrogram alapján. Így a továbbiakban következtetéseinket elsősorban az egyes fázisok egészére vontuk le. A

laskagomba

alapanyag-gyártás

baktérium-közösségének

változásában

egy

határozott szukcesszió figyelhető meg a kezdeti mezofil közösségtől a komposztálás termofil közösségén át a kész alapanyag baktérium-közösségéig. Hasonló szukcessziót talált Herrmann és Shann (1997) lakossági hulladék komposztálás PLFA-val való, valamint Székely és munkatársai (2009) gombakomposzt T-RFLP-vel és DGGE-vel való vizsgálata során. A laskagomba alapanyag-gyártás során az egyes fázisokon belül kis mértékben nő az átlagos Bray-Curtis hasonlóság (6/17.b. ábra). Ez jól mutatja a standardizált gyártási körülmények hatását. A kiindulási szalma ugyanis több helyről származik, és minősége is változik a tárolás során. Ennek ellenére a kész alapanyag baktérium-közössége kevésbé változatos, mint a kiindulási anyagé. A változások természetesen nem csak a baktérium-közösséget érintették. A munkánkat kiegészítő kutatások során az SZTE Mikrobiológiai Tanszékén a mikroszkopikus gombák szukcesszióját, míg a BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszékén a búzaszalma lignocellulóztartalmának átalakulását vizsgálták (Vajna és mtsai, 2010). Mikroszkopikus gombák elsősorban a halomkomposztálás alatt, a halom külső, hidegebb régióiban fordultak elő. A harmadik napon a mikrogombaközösség nagy részét két mezofil bazídiumos élesztőgomba alkotta, a mérsékelt mennyiségű extracelluláris

enzimet

termelő

Rhodotorula

mucilaginosa

és

Trichosporon

moniliiforme. A halomkomposztálás termofil fázisából a fonalas gombák Thermomyces, Myceliophthora és Rhizomucor nemzetségeit sikerült kimutatni. Azonban nem találtak gombákat az alagútban a pasztörizálás és a kondícionálás egyenletesen magasabb hőmérsékletén. Ez összhangban van Klamer és Båås (1998) eredményével, akik a gombákra jellemző PLFA markerek csökkenését írták le 50 °C-nál melegebb komposztokból. Hasonlóan Dees és Ghiorse (2001) mikrogombák 18S rDNS-ét maximum 50 °C-os komposztból tudták kimutatni. Tehát a mikroszkopikus gombák elsősorban a kezdeti mezofil fázisban játszanak szerepet változatos extracelluláris enzimeiknek köszönhetően, amelyek résztvesznek a búzaszalma lignocellulózának - 74 -

bontásában. Ez utóbbi átalakulás, mint a cellulóz/lignin és hemicellulóz/lignin arányok enyhe csökkenése (9 ill. 19%) mutatkozott meg, miközben jelentősen, 77%-kal nőtt az alapanyag cellulázok általi bonthatósága (Vajna és mtsai, 2010).

6.2.1.1 A kész laskagomba alapanyag jellemzése T-RFLP segítségével Részletesebben megvizsgáltuk a kész alapanyag baktérium-közösségét, hiszen ez a további gombatermesztés kiindulási anyaga. Csiperke esetén Sharma és Kilpatrick (2000) hangsúlyozzák az alapanyag minőségének fontosságát. Munkájuk során nagy számú kész alapanyag pH-ját, szárazanyag-, ammónia-, szén-, hamu-, réz-, vas-, és nátriumtartalmát határozták meg, majd az ezen paraméterekre illesztett modell segítségével 90%-os biztonsággal becsülték meg, az adott alapanyagon megtermő csiperke mennyiségét. Ezért mi is kíváncsiak voltunk, hogy a kész laskagomba alapanyag baktérium-közösségei hogyan csoportosulnak, vannak-e elváló csoportok, és ha vannak, ezek elválására található-e magyarázat.

6-019-7

3 2,4

PC2 (16,3%)

1,8 1,2 0,6

7-178-7

7-019-7 7-051-7

0

6-104-7

8-067-7

7-187-7

7-118-7 6-093-7

-0,6

7-203-7

6-055-7

7-197-7

6-099-7 6-077-7

-1,2

6-061-7

6-110-7

-1,8 -2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

PC1 (23,0%)

6/18. ábra: A kész laskagomba alapanyag bakteriális T-RFLP ujjlenyomatainak összehasonlítása főkomponens elemzéssell. A görbék a Bray-Curtis hasonlóságon alapuló UPGMA fán alkotott csoportokat jelölik. A folytonos vonallal körbevett minták egymáshoz való Bray-Curtis hasonlósága meghaladja a 30%-ot, a pontvonallal körbevetteké 40% feletti.

A főkomponens elemzés segítségével elkészített ordináción jól látszik – amit már a 6/17. ábrán is észrevettünk –, hogy a 6-019-7 minta élesen elkülönül a többi mintától. - 75 -

Ezt az elválást a Bray-Curtis hasonlóság alapján történő UPGMA csoportosítás is megerősítette (6/18. ábra). Bár erre az ordinációra is rávetítettük a szűkebb csoportokat, azok jobban láthatóak a 6-019-7 minta elhagyásával készült ordináción (6/19. ábra). Ezért a továbbiakban a 6-019-7 minta nélkül vizsgáltuk a kész alapanyagot.

a 1,6

6-110-7

6-061-7

1,2 6-099-7

PC2 (19,2%)

0,8

6-077-7 6-104-7

0,4

6-093-7

7-118-7

0

6-055-7

8-067-7 -0,4

7-197-7 7-051-7

-0,8

7-203-7

7-019-7

-1,2

7-187-7 -1,6 7-178-7 -2 -3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

6-061-7

6-055-7

7-178-7

7-203-7

7-187-7

7-197-7

7-118-7

8-067-7

7-051-7

7-019-7

6-099-7

6-110-7

6-104-7

6-077-7

b

6-093-7

PC1 (27,1%)

0,96 0,88

Hasonlóság

0,8 0,72

94

0,64

63

74

85

0,56 0,48 55 0,4 0,32 0

1,6

3,2

4,8

6,4

8

9,6

100 11,2 12,8 14,4

16

6/19. ábra: A kész laskagomba alapanyag bakteriális T-RFLP ujjlenyomatainak összehasonlítása (a) főkomponens elemzéssel a 6-019-7 minta elhagyása után. A görbével körülvett minták 40%-os hasonlósági csoportot alkotnak a Bray-Curtis hasonlóságon alapuló UPGMA fán. (b) A kész laskagomba alapanyag bakteriális T-RFLP ujjlenyomatainak összehasonlítása Bray-Curtis hasonlóságok alapján UPGMA módszerrel készült fa segítségével. A fa elágazásainál látható számok az 1000 ismétlés után kapott bootstrap értékek közül az 50%nál nagyobbakat jelzik.

- 76 -

A korábbiakhoz hasonlóan itt is megvizsgáltuk a PCA alkalmazhatóságát. A Culman és munkatársai (2008b) által bevezetett heterogenitás értéke 1,76 (Culman és mtsai, 2008b), míg dCA ordináció esetén a leghosszabb gradiens értéke 2,54. Mindkét érték elég kicsi, ráadásul az első két PCA tengely lefedi az összvariancia 46,3%-át. Tehát a PCA itt teljesen megfelelő módszer kiegészítve a Bray-Curtis hasonlóságok alapján készült UPGMA fán kapott csoportok rávetítésével. A csoportokat vizsgálva feltűnő a 2007 telén készült alapanyagok (7-178-7, 7-187-7, 7-197-7, 7-203-7) ujjlenyomatának a hasonlósága. Ezért megvizsgáltuk, hogy van-e összefüggés az alapanyaggyártás időpontja és a mikroba közösség összetétele között. Kiderült, hogy a kész alapanyag csoportok megfeleltethetőek a tél végi – tavaszi, a nyári – ősz eleji és a téli mintáknak (6/20.c. ábra). Tehát az egymás után gyártott kész alapanyagoknak a mikróbaösszetétele is közelebb áll egymáshoz. Érdekes kérdés, hogy ez csak egy adott éven belül jellemző, vagy általánosan évszakokhoz köthető jellemző. Utóbbit támasztaná alá a 2 év mintáit is magába foglaló tél végi – tavaszi csoport. De pont ebből az időszakokból származnak a semelyik csoportba sem tartozó minták. Így az évszakok és a mikrobiális közösség összetétele közötti összefüggés létezésének alátámasztásához még további minták vizsgálatba való bevonása lenne szükséges. Ezután megnéztük, hogy a feltárt összefüggés – az időben egymás után gyártott minták mikrobotájának hasonlósága – érvényes-e a korábbi fázisokra is. A diagramok elkészítése után azt kellett megállapítanunk, hogy az első és a harmadik fázis ezt az összefüggést nem támasztja alá (6/20.a. és b. ábra). A jelenség értelmezésére két hipotézist vetettünk fel. Az első szerint a kiindulási búzaszalma kis mennyiségben tartalmaz olyan nyugalomban lévő spórás, illetve termofil szervezeteket, amiket – pont kis abundanciájuk miatt – nem lehet kimutatni az első és harmadik fázisból. Ezen mikróbák mennyisége és összetétele a búzaszalma tárolása közben változik, majd a pasztörizálást túlélve az így keletkezett szabad nichekben szaporodnak el, tehát a kész alapanyagból már kimutathatóak. A másik hipotézis arra épül, hogy az alagútban – bár az egyes gyártási sorok között tisztítják és fertőtlenítik – fennmaradhatnak spórás, illetve termofil szervezetek, amelyek mennyisége és összetétele folyamatosan változik, és amik újra és újra beolthatják az alagútba érkező alapanyagot. Nézetünk szerint a második hipotézis a valószínűbb, bár alátámasztására meg kellene vizsgálni a kitisztított és fertőtlenített alagút feltételezett mikrobiótáját.

- 77 -

Dec.

Dec.

Jan.

2006

b

2006

a

Febr.

Febr.

Nov.

2007

2007

Nov.

Jan.

6-019

2008

2008

Okt.

7-019

Okt.

Márc.

Márc.

7-051

7-051

6-110

Ápr.

2007 2008

6-055

6-093

6-061 Máj.

Aug.

Júl.

6-055 6-061 Máj.

Aug.

6-077

2006

6-077

Ápr.

2006

6-093

Szept.

8-0677-118

6-104 6-099

2007 2008

Szept.

6-110

8-0677-118

6-104

Júl.

Jún.

Dec.

Jún.

Jan.

2006

c

Febr.

7-203

Okt.

2008

7-197 7-187 7-178

2007

Nov.

6-019 7-019 Márc.

7-051

6-110 Szept.

8-0677-118

6-104

Ápr.

2007 2008

6-099 6-093

6-055 6-061 Máj.

6-077

2006

Aug.

Júl.

Jún.

6/20. ábra: Összefüggések az alapanyaggyártás időpontja és a mikroba közösség összetétele között. Az alapanyaggyártás időpontját a kördiagramokon az egyes körgyűrűk (években) és körcikkelyek (hónapokban) adják meg. A pontvonallal körbevett minták egymáshoz való BrayCurtis hasonlósága meghaladja a 30%-ot, míg a folytonos vonallal körbevetteké 40% feletti. A három diagram az (a) 1., (b) 3. és (c) 7. fázis mintáinak felel meg.

Végül megvizsgáltuk, hogy található-e összefüggés a kész alapanyag bakteriális ujjlenyomata és a fizikai-kémiai paraméterek illetve az adott alapanyagon később termett

laskagomba

mennyisége között

(6/2. táblázat).

De a minták első

főkomponenseken felvett koordinátái és az említett paraméterek között sehol sem kaptunk szignifikáns (p<0,05) korrelációt. Ennek hátterében más-más ok húzódik a két paramétercsoport esetében. A fizikai-kémiai paraméterek meghatározásához sajnos nem - 78 -

pontosan ugyanazt a mintát használták fel, mint mi a mikrobiológiai analízishez. Korábbi csiperkekomposzton végzett vizsgálataink során feltártuk, hogy a halom rendszeres átforgatása ellenére is megfigyelhető egy bizonyos inhomogenitás az alagútból kitárolt minta fizikai és kémiai paramétereiben (Földi, 2005). Bár a laskatermesztő cég munkatársai törekedtek a reprezentatív mintavételre, a nem azonos minták felhasználása nem teszi lehetővé, hogy az eredményekből pontosabb következtetést vonjunk le.

6/2. táblázat: A kész alapanyag fizikai és kémiai paraméterei, valamint az alapanyagon később

1

0,76 0,76 0,76 0,64 0,79 0,72 0,97 0,97 0,75 0,67 0,78 0,88 0,96 0,89 0,95 1,11

77,3 75,7 75,1 75,1 74,3 73 77,2 75,8 75,7 74,5 72,9 75,4 72,6 77,5 75,4 75,4

7,6 8,6 7,4 7,4 8,4 6,8 10 8,4 8,8 6,7 10,6 10,7 9,4 11,9 12,8 9,6

Terméshozam (100 kg alapanyagról leszedett friss gomba súlya)

Kitárolt anyag hamutartalma (m/m%)

8,38 7,93 8,4 8,41 8,94 8,6 7,92 8,52 8,41 8,57 8,94 8,42 7,98 8,82 8,27 8,5

Kitárolt anyag nedvességtartalma (m/m%)

Kitárolt anyag pH-ja

6-0191 6-055 6-061 6-077 6-093 6-099 6-104 6-110 7-019 7-051 7-118 7-178 7-187 7-197 7-203 8-067

Kitárolt anyag N-tartalma (szárazanyagra vonatkoztatott m/m%)

Gyártási sor száma

termett laskagomba mennyisége.

26 22 27 28 16 20,7 26,5 31 28,7 23 15,2 17 23 21 24 9

A 6-019-es mintát a kész alapanyagok ordinációs eredményének megfelelően nem vontuk be a kanonikus elemzésbe.

A bakteriális ujjlenyomatok és a laskagomba terméshozama közti összefüggés hiányát több tényező is magyarázhatja. (1) A megfelelő mikróbaközösség szükséges a magas laskagomba terméshozam eléréséhez, de önmagában nem elégséges. A termesztés körülményei szintén meghatározóak ebben a tekintetben. Így egy „jó” baktériumközösség nem biztos, hogy ki tudja fejteni a hatását, ha a termesztési körülmények nem - 79 -

megfelelőek. (2) Esetünkben a terméshozam variációs koefficiense, a szórás és az átlag hányadosa, a nem túl nagy 26,8%-os értéket éri el. Ezt nem olyan könnyű összevetni más eredményekkel, mert általában jóval kisebb léptékű kísérletekről számol be az irodalom. De Labuschagne és munkatársai (2000), akik már viszonylag nagyobb léptékkel, 10 kg-os zsákokkal dolgoztak, a miénknél jóval nagyobb, 38,5%-os variációs koefficienst írnak le. Tehát a mi esetünkben a terméshozamok közti mérsékelt különbségek is eredményezhetik az összefüggések hiányát. (3) Nem szabad megfeledkezni az ún. funkcionális redundanciáról sem (Pérez-Piqueres és mtsai, 2006), amely szerint egy adott közösségi funkciót több különböző baktérium is elláthat. Vagyis a közösség szerkezetében végbement átalakulások nem feltétlenül vezetnek a közösségi funkciók változásához és így esetleg eltérő gombahozamhoz. (4) Nem utolsó sorban meg kell még említeni a minták számát is. Egy 15 elemű halmaz szignifikáns statisztikai összefüggések esetén elég kicsi. Sharma és Kilpatrick (2000) fentebb említett munkájukban többszáz mintát használtak fel modellük elkészítéséhez. Mindezek arra hívják fel a figyelmet, hogy munkánkban a kanonikus elemzés használata inkább csak demonstratív jellegű. Be tudtuk mutatni, hogy egy adott mintasor esetén milyen típusú analízissel lehet kiegészíteni a T-RFLP ujjlenyomatok eredményét. De mintasorunk a fenti okok miatt mennyiségi elemzésekre nem igazán alkalmas. Ezért a továbbiakban klónkönyvtárak feldolgozása során is inkább az egyes közösségek közti minőségi eltéréséket mutatjuk be.

6.2.2 Az egyes fázisok domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével A továbbiakban azt vizsgáltuk meg, hogy mely baktériumok alkotják az egyes fázisok baktérium-közösségének domináns tagjait. Ehhez lehetőség lenne a Simper50 csúcsok (ld. 68. oldal, 6.1.5 fejezet) adatbázisok segítségével való azonosítására. De az Irodalmi áttekintésben (ld. 29. oldal, 3.1.4.4 fejezet) már említettük, hogy az in silico és a TRFLP futtatás során meghatározott fragmentum méretek között jelentős eltérések lehetnek (6/21. ábra). Ezért az egyes fázisok kiválasztott mintáiból bakteriális parciális 16S

rDNS

klónkönyvtárakat

hoztunk

létre,

majd

a

klónokat

T-RFLP-vel

csoportosítottuk. Célunk nem a klónkönyvtárak általános elemzése, hanem a főbb TRFLP csúcsok azonosítása volt. Így csak azokat a klónokat választottuk ki, amelyek megfeleltethetőek voltak az egyes fázisokra, illetve a 7. fázis esetén azon belüli csoportokra jellemző Simper50 csúcsoknak, vagy az egyes fázisokban illetve

- 80 -

csoportokban átlagosan 2% RFU gyakoriság feletti csúcsoknak. Végül elvégeztük ezen klónok bázissorrend meghatározását. 10

Alu I

Hin 6I

8

6

T-RF drift (bp)

4

2

0

-2

-4

-6 0

50

100

150

200

250

300

350

400

T-RF valós hossza (bp)

6/21. ábra: A parciális 16S rDNS klónok bázissorrend elemzéssel (valós T-RF hossz) és elektroforézissel meghatározott T-RF hosszúsága közötti eltérés (T-RF-drift) a valós T-RF hosszúság függvényében a PBA és PBC klónkönyvtárak esetében.

A domináns T-RF csúcsok és az egyes minták közötti kapcsolatot a PCA biplot funkciója segítségével ábrázoltuk. A 6/21. ábrán jól látható, hogy az egyes fázisok domináns T-RF készlete között kisebb-nagyobb átfedés található. Az előző fejezethez hasonlóan (6.2.1 rész) itt is a kész alapanyag baktérium-közösségének megismérésére fektettük a hangsúlyt. Ezért az 1. és 3. fázis közösségét csak 1-1, míg a 7. fázisét 4 klónkönyvtár segítségével jellemezzük.

- 81 -

2,4

1,6

Alu-070 Alu-072 Alu-150 Alu-241 Alu-242 Alu-249 Hin-098 Hin-182 Hin-184 Hin-185 Hin-228

Alu-075 B

B’ B’ Alu-074 AB

B Alu-076 Hin-250 B’C B Hin-186

B B

PC2 (11,1%)

0

-0,8

Alu-207

Hin-237 B B’ Hin-101 Hin-342 B

B

B’CEF

Hin-473 D

B’

B Hin-366 Hin-236 B’ A Alu-233

0,8 Alu-054 Alu-234 Hin-053 Hin-066 Hin-068 Hin-206 Hin-340 Hin-369 Hin-522 Hin-540

Alu-063 Alu-074 Alu-075 Alu-098 Alu-231 Alu-234 Alu-244 Alu-250 Alu-256 Hin-083 Hin-465

Alu-234

Hin-369 Alu-245 CF

Alu-053

Hin-204

CD’F D’ C’E’F’ C’E’F CE E CDE’ CE’

Alu-246 CDE’

A Hin-082C’D’E’F’

Hin-205

A A A

Alu-236 EF Hin-463

Alu-203 C’E’F’

D Alu-202 Hin-249 E’F’

- 82 -

Alu-235

CED

-1,6

AHin-140 A Hin-081 -2,4

Hin-359 CD’F

AAlu-231

Alu-070 A

Hin-080

AC’F’

Hin-377

C’DE’F’

Hin-368

E’F’

-3,2

Alu-072 A

-4

A Alu-247 -4,8 -4,8

-3,6

-2,4

-1,2

0

1,2

2,4

3,6

4,8

6

PC1 (17,0%)

6/22. ábra: Az alapanyag-gyártás ujjlenyomat mintáinak elválásáért felelős Simper50 csúcsok a már látott főkomponens elemzés ábrán (6/17. ábra). Színkódok: kék – 1. fázis; piros – 3. fázis; szürke – 7. fázis. A poligonok és az ábrán belül külön bekeretezett csúcsok az egyes fázisokhoz tartozó Simper50 csúcsokat veszik körbe. Az ábra szélén külön négyszögekben lévő csúcsok, bár nem tartoznak az adott fázis Simper50 csúcsai közé, az adott fázis mintáiban átlagosan 2% RFU feletti gyakoriságúak. A klónkönyvtárak segítségével azonosított csúcsokat, a csúcsok utáni betűk jelölik: A – PBA, B – PBB, C – PBC, D – PBD, E – PBE, F – PBF klónkönyvtár. A vesszős érték azt jelöli, hogy az adott klónkönyvtárban található klón legközelebbi leírt rokon fajjal való hasonlósága nem érte el a 95%-ot.

- 82 -

6.2.2.1

Az

1.

fázis

domináns

T-RFLP

csúcsainak

azonosítása

klónkönyvtárak segítségével RFLP

csúcsainak

megfelelő

bázissorrend elemzéssel azonosított klónokat a 6/3. táblázat tartalmazza. A táblázatban és a 6/23. ábrán jól látszik, hogy az 1. fázis domináns baktériumai jórészt faji szinten azonosíthatóak,

Klónok száma (darab)

A kiindulási alapnyag domináns T-

mivel a legközelebbi rokon leírt

93 94 95 96 97 98 99 100 Hasonlóság (%)

fajokkal való hasonlóság meghaladja a 97%-ot. A leírt fajokkal 95%-osnál alacsonyabb klónokat

hasonlóságot nem

osztályoztuk

elért a

táblázatokban (6/3-5. táblázat) és nem diszkutáljuk, mert ezek valószínűleg

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

6/23. ábra: A PBA klónkönyvtár azonosított tagjainak és a legközelebbi leírt rokon fajok %-os hasonlóságából készült hisztogram. (Színkódok: fehér – közeli rokon leírt fajjal nem rendelkező klónok; világosszürke – nemzetség szintjén azonosítható klónok;

még le nem írt nemzetségbe tartoznak

sötétszürke – faji szinten azonosítható

(Tindall és mtsai, 2010). Ebben a

klónok.)

klónkönyvtárban mindössze a PBA032 és a PBA203 klónok tartoztak ebbe az utóbbi csoportba. Az 1. fázisra jellemző 15 Simper50 csúcsból 9 darabot, míg az ezeken kívüli 10 darab 2% RFU átlagos gyakoriság feletti csúcsból 4 darabot sikerült azonosítani. A táblázatból az is látszik, hogy egymással nem rokon fajok is rendelkezhetnek azonos hasítóhellyel. Ilyen pl. az Alu-074 csúcs, amihez a Lactococcus garvieae, a Sphingomonas aerolata, a Hydrogenophilus sp. és a Stenotrophomonas rhizophila is hozzárendelhető. Vagyis az Alu-074-es csúcs területéhez mind a négy baktérium hozzájárul, de ezek egymáshoz viszonyított arányát nem ismerjük. Meg kell elégednünk azzal, hogy ezek a klónok domináns T-RF-ekhez rendelhetőek hozzá. Az aktinobaktériumok közül a Rothia nemzetség tagjait még nem írták le komposztokból. A Saccharopolyspora flava-t talajból izolálták először (Lu és mtsai, 2001), de már gombakomposztból is leírták (Song és mtsai, 2001). A Streptomyces nemzetség tagjai általános elterjedésűek, talajokban, illetve komposztok mezofil és termofil fázisában is gyakran megtalálhatóak és jelentős biodegradatív potenciállal rendelkeznek (Ryckeboer és mtsai, 2003b; Song és mtsai, 2001). Utóbbi két aktinobaktérium gyakran izolálható a gombatermesztéshez felhasznált gabonákról is

- 83 -

(Lacey, 1997). Szintén talajból írták le a Bacteriodetes csoportba tartozó Pedobacter sandarakinus-t (Yoon és mtsai, 2006). A Firmicutes taxonba két klón tartozik. A Planomicrobium fajokat eddig elsősorban tengeri élőhelyeken találták meg (Dai és mtsai, 2005). A Lactococcus garvieae-t tejtermékekből és állatok mandulájából, ürülékéből mutatták ki (Teuber és mtsai, 2006). A

kiindulási

alapanyag

klónjainak

döntő

többsége

proteobaktérium.

Az

alfaproteobaktériumok közé tartozó Bosea massiliensis-t kórházi vizekből írták le amőbákkal együtt tenyésztve (Scola és mtsai, 2003). A metilotróf Methylobacterium nemzetség tagjai általános elterjedésűek, előfordulnak növényi levelek felszínén, levegőben, de kimutatták már komposztok mezofil fázisából is (Ryckeboer és mtsai, 2003b; Green, 2006). A Rhizobium fajok fontos szerepet játszanak a növények nitrogénellátásában, így ezek a klónok akár a nitrogén-kiegészítésként adagolt lucernából is származhatnak. A klónkönyvtár és a T-RF közösség legdominánsabb tagjai közé tartoznak a Sphingomonas fajok. A nemzetség tagjai általános előterjedésűek, gyakran izolálhatóak levegőből, porból (Busse és mtsai, 2003), és jelentős biodegradatív kapacitással rendelkeznek (Kobayashi és mtsai, 2009). A bétaproteobaktériumok közé tartozik a hidrogén-oxidáló Hydrogenophilus (Hayashi és mtsai, 1999) és az ivóvízből és humán mintákból is leírt Massilia (Gallego és mtsai, 2006) nemzetség. A gammaproteobaktériumokat a Pantoea ananatis és a Pseudomonas nemzetség képviseli. Előbbi egy széles körben elterjedt nemzetség tagja, többek között ananászról és rizsszemekről izolálták (Janda, 2006). A klónkönyvtárban és a T-RF közösségben a Sphingomonas mellett a szintén általános előfordulású Pseudomonas nemzetség tagjai képviselik a másik domináns csoportot. Ez utóbbi képviselői gyakran megtalálhatóak komposztok kezdeti, vagy végső mezofil fázisában (Ryckeboer és mtsai, 2003b; Tiquia és mtsai, 2005; Takaku és mtsai 2006), jelen vannak csiperkekomposzt kezdeti halomfázisában is (Székely és mtsai, 2009). Gyorsan növő, tág szubsztrát-specificitással rendelkező fajok. A nemzetség egyes tagjai a lignocellulóz bontásában is részt vesznek. Az általunk talált klónok a fluoreszcens Pseudomonas-ok közé tartoznak, amelyeket gyakran izolálják növényekről, és fitopatogén típusok is találhatóak köztük (Behrendt és mtsai, 2003). Összegzésként elmondhatjuk, hogy az alapanyag-gyártás első fázisára elsősorban a talajból, levegőből, növényi felületekről (így a búzaszalmáról is) származó mezofil baktériumok jellemzőek. Kevés közöttük az olyan baktérium, amelyeket komposztokból is leírtak már. - 84 -

6/3. táblázat: Az 1. fázis 6-061-1 mintájából készült PBA jelű klónkönyvtár bázissorrendelemzéssel azonosított tagjai. Csak azokat a klónokat soroltuk fel, melyek megfeleltethetőek az 1. fázisra jellemző Simper 50, vagy az 1. fázis mintáiban átlagosan 2% RFU gyakoriság feletti csúcsoknak.

1

A 6-061-1 minta AluI illetve Hin6I enzimmel emésztett futásaiban azonosított T-RF-ek. A csúcsok mögött zárójelben található szám a csúcs relatív területét adja meg 6-061-1 mintában. 2 A táblázatban az EzTaxon adatbázisban található legközelebbi rokon típustörzset adtuk meg. Azon klónok esetében, ahol a legközelebbi rokon típustörzsnél hasonlóbb nem tenyésztett klónt vagy nem típustörzset találtunk a Genbank adatbázisában, azt is megadtuk. 3 Az osztályozást Euzéby (2010) alapján készítettük el. 4 Azon klónokat soroltuk ide, ahol a legközelebbi típustörzzsel való rokonság nem haladta meg a 95,0%-ot.

- 85 -

6.2.2.2

A

3.

fázis

domináns

T-RFLP

csúcsainak

azonosítása

klónkönyvtárak segítségével Klónok száma (darab)

A kész halomkomposzt domináns TRFLP csúcsainak megfelelő bázissorrend elemzéssel azonosított klónokat a 6/4. táblázat

tartalmazza.

Az

1.

fázis

baktériumaival ellentétben, itt már csak a klónok

felét

harmadát

sikerült

faji

nemzetség

szinten

és

6 5 4 3 2 1

meghatározni

88 90 92 94 96 98 100 Hasonlóság (%)

(6/24. ábra). A 3. fázisra jellemző 16 Simper50 csúcsból 11 darabot, míg az

6/24. ábra: A PBB klónkönyvtár azonosított

ezeken kívüli 11 darab 2% RFU átlagos

tagjainak és a legközelebbi leírt rokon fajok

gyakoriság feletti csúcsból 6 darabot

%-os hasonlóságából készült hisztogram. (Színkódok: fehér – közeli rokon leírt fajjal

sikerült azonosítani. Az

aktinobaktériumok

gyakran

nem rendelkező klónok; világosszürke –

a

nemzetség szintjén azonosítható klónok;

komposztok domináns mikróbái jelentős szerepet

játszva

folyamatokban.

a

lebontó

Spóráik

gyakran

sötétszürke – faji szinten azonosítható klónok.)

kikerülnek a levegőbe, ahonnan újra és újra „beolthatják” a komposzthalmot (Lacey, 1997). A Thermobispora bispora – régebbi nevén Microbispora bispora – egy termofil aktinobaktérium, amelyet már többször is leírtak komposztokból (Peters és mtsai, 2000; Ryckeboer és mtsai, 2003b; Adams és Frostick, 2009). A komposztálás termofil fázisának tipikus képviselői a Bacillus fajok (Peters és mtsai, 2000; Takaku és mtsai, 2006). A Strom (1985) által ebből a fázisból izolált termofil baktériumoknak 87%-a ebbe a nemzetségbe tartozott. A Bacillus coagulans a fehérjék lebontásában játszik fontos szerepet (Ishii és mtsai, 2000). A Geobacillus nemzetség tagjai voltak a legnagyobb számban jelen ételmaradékok komposztálása során a termofil fázisban, de izoláltak Ureibacillus-okat is (Takaku és mtsai, 2006). Utóbbi nemzetség tagjait csiperkekomposztban is megtaláltuk molekuláris és tenyésztéses módszerekkel is (Székely és mtsai, 2009). Az alfaproteobaktériumok közé tartozó PBB142 klón legközelebbi rokonát gombakomposztból írták le, és hasonló klónt Székely és munkatársai (2009) is kimutattak csiperkekomposztból. A gammaproteobaktériumok közé tartozó Enterobacter nemzetség inkább klinikai mintákból ismert, de komposztokban is előfordul, ahol lignolitikus kapacitásának - 86 -

köszönhetően játszhat szerepet (Ryckeboer és mtsai, 2003b). A Pseudoxanthomonas taiwanensis az érett csiperkekomposzt domináns tagja, és a laskagomba-alapanyagban is domináns T-RF csúcsokhoz rendelhető. Ez a baktérium serkentheti a cellulózbontást acetát fogyasztásával és a pH semlegesítésével (Székely és mtsai, 2009).

6/4. táblázat: A 3. fázis 6-061-3 mintájából készült PBB jelű klónkönyvtár bázissorrendelemzéssel azonosított tagjai. Csak azokat a klónokat soroltuk fel, amelyek megfeleltethetőek a 3. fázisra jellemző Simper 50,vagy a 3. fázis mintáiban átlagosan 2% RFU gyakoriság feletti csúcsoknak.

1

A 6-061-3 minta AluI illetve Hin6I enzimmel emésztett futásaiban azonosított T-RF-ek. A csúcsok mögött zárójelben található szám a csúcs relatív területét adja meg 6-061-3 mintában. 2 A táblázatban az EzTaxon adatbázisban található legközelebbi rokon típustörzset adtuk meg. Azon klónok esetében, ahol a legközelebbi rokon típustörzsnél hasonlóbb nem tenyésztett klónt vagy nem típustörzset találtunk a Genbank adatbázisában, azt is megadtuk. 3 Az osztályozást Euzéby (2010) alapján készítettük el. 4 Azon klónokat soroltuk ide, ahol a legközelebbi típustörzzsel való rokonság nem haladta meg a 95,0%-ot. 5 Olyan csúcsok, melyek a 6-061-3 mintában nem találhatóak meg, de a 3. fázisra egyébként jellemzőek.

- 87 -

A halomkomposztálás végére tehát más komposztálási rendszerek termofil fázisából már ismert mikrobióta alakul ki, amelynek domináns tagjai a termofil Bacillus és rokon nemzetségei, valamint a Pseudoxanthomonas fajok. Azonban a közösségben még számos, a tudomány számára új baktérium is található.

6.2.2.3 A kész alapanyag domináns T-RFLP csúcsainak azonosítása klónkönyvtárak segítségével csúcsainak

megfelelő

bázissorrend

elemzéssel azonosított klónokat a 6/5. táblázat tartalmazza. Az előző két fázishoz képest itt jóval kevesebb klónt sikerült faj (kb. 30%) illetve nemzetség (kb. 45%) szinten azonosítani. A klónok maradék 55%-a valószínűleg még le nem írt nemzetségekbe tartozik (6/25. ábra). A 7.

Klónok száma (darab)

A kész alapanyag domináns T-RFLP

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 Hasonlóság (%)

fázisra jellemző 21 Simper50 csúcsból 17

6/24. ábra: A PBC, PBD, PBE és PBF

darabot, míg az ezeken kívüli 9 darab 2%

klónkönyvtár azonosított tagjainak és a

RFU átlagos gyakoriság feletti csúcsból 6

legközelebbi leírt rokon fajok %-os

darabot sikerült azonosítani (6/26. ábra). Vagyis a domináns csúcsok nagy részéhez sikerült klónokat rendelni, azonban ezen klónok nagyobb része nem rendelkezik közeli rokonokkal. Utóbbiak közül számos

hasonlóságából készült hisztogram. (Színkódok: fehér – közeli rokon leírt fajjal nem rendelkező klónok; világosszürke – nemzetség szintjén azonosítható klónok; sötétszürke – faji szinten azonosítható klónok.)

95-98%-os hasonlóságot mutat a Takaku és munkatársai (2006) által ételmaradékok komposztjából kimutatott klónokkal. Fontos feladat lenne a kész alapanyagból baktériumokat izolálni, és a tudomány számára új fajokat leírni, hiszen ezek a mikróbák nem csak a laskagomba alapanyagban fordulnak elő. Külön ábrázoltuk a domináns T-RF csúcsok és az egyes minták közötti kapcsolatot a PCA biplot funkciója segítségével (6/26.a. ábra) ábrázoltuk. Az ábrához mellékelt táblázatból (6/26.b.) jól látszik, hogy az egyes csoportok között az eltérés inkább mennyiségi, mint minőségi, vagyis a csoportok T-RF készlete hasonló.

- 88 -

Alu-202 1,2

Alu-235

0 PC2 (19,2%)

- 89 -

PC2 (19,2%)

-1,2

Alu-202

1,2 Hin-377 Hin-377

0

-1,2

-2,4

-2,4

-3,6

-3,6

Hin-249 -4,8 -6,5

-4,8

-9,6

-6

-8

-4,8

-3,2 PC1 (27,2%)

-9,6

Alu-063 Alu-073 Alu-234 Alu-075 Alu-206 Alu-098 Alu-063 Alu-202 Alu-249 Hin-082 Alu-206 Alu-206 Hin-465 Alu-231 Hin-083 Alu-246 Alu-234 Alu-235 Alu-098 Hin-367 Alu-236 Alu-256 Hin-080 Alu-244 Alu-250 Alu-231 Alu-075 Alu-245 Hin-463 Alu-244 Alu-246 Alu-249 Alu-250 Alu-256 Hin-080 Hin-082 Hin-083 Hin-368 Hin-249 Hin-250 Alu-236 Hin-359 Hin-367 Hin-359 Hin-368 Hin-369 Hin-370 -1,6 0 1,6 3,2 Hin-377 Hin-463 Hin-359 Hin-465 Hin-472

Hin-369

-8

-6,4

-4,8

-3,2

-1,6

0

Alu-073

1,6

5,9 5,2

10,0 11,2 0,2 4,3 6,8 10,2 8,8

6,0 7,2 4,7 4,8 1,3

15,6

11,4

0,4 0,7 5,9 4,5 4,5 12,5 4,7

1,3 7,8 2,0 11,8 6,2

11,6 4,1 4,7 10,2 1,6 3,4 2,0 7,6 5,4 3,3 9,5 14,0 5,5 8,4

3,8 8,4

3,1

1,2 7,2 3,0 8,2 14,3 1,8 1,0 0,2

23,0 12,4 3,3 1,9 4,7 5,6 3,7

0,6 0,7 0,7 3,8 9,4 12,5 1,9 5,2 8,4 3,6 0,4 1,9 2,7 0,9 2,7 2,3 8,4 1,4 1,0 6,0

5,8 1,6

0,8 1,2 2,0 1,2 20,4 2,0

15,6 5,1 3,7 5,5 1,1 1,1 0,1 0,9 2,4 1,5 1,3 10,0 15,7

2,8

8,2

26,6 3,6

16,2

22,7 5,1

6,4

3,4

PBC

PBE

9,1

3,2

Nincs

PC1 (27,2%)

3,3 4,6 2,4 1,2 13,7 9,7 1,4 5,2 8,2 1,9 1,0 4,8 7,3 1,7 1,4 2,8 2,5 4,0 1,8 6,2 7,8 2,9

7-019, 7-051, 8-067

Alu-245

2,4

2,4

6-055

Hin-472

7-118

b

6-061

Hin-370

Hin-250

3,6

7-178, 7-187, 7-197, 7-203

a

6-077, 6-093, 6-099, 6-104, 6-110

3,6

PBD

0,2 PBF

Nincs

Az egyes csoportokhoz tartozó klónkönyvtárak

6/25. ábra: A kész alapanyag ujjlenyomat mintáinak elválásáért felelős domináns T-RF-ek. (a) A Simper50 és a 2% RFU átlagos gyakoriság feletti csúcsok a már korábban bemutatott főkomponens elemzés ábrán (6/19.a. ábra). A négyszögekkel körbevett mintákból készültek klónkönyvtárak. (b) A domináns csúcsok csoportonkénti átlagos gyakorisága. Az arany hátterű csúcsokhoz faj illetve nemzetség szinten azonosított klónt tudtunk hozzárendelni, a világossárga hátterűekhez csak olyan klónokat, melyek legközelebbi leírt rokon fajjal való hasonlósága nem érte el a 95%-ot. Az 5%-nál nagyobb RFU

- 89 -

értékeket vastagon szedtük. Az oszlopok tetején lévő színes pontok a PCA ábra mintajelöléseit oldják fel.

Az aktinobaktériumok közé tartozó Thermobifida fusca – régebbi nevén Thermonomospora

fusca

–

és

a

Thermomonospora

nemzetség

a

kész

csiperkekomposztban is domináns mikróba (Song és mtsai, 2001; Székely és mtsai, 2009) jelentős cellulózbontó képességgel (Stutzenberger, 1971; Kukolya és mtsai, 2002). A Thermopolyspora flexuosa – régebbi nevein Nonomuraea flexuosa, Microtetraspora flexuosa, „Acetomadura flexuosa”, „Nocardia flexuosa” (Euzéby, 2010) – szintén gyakori gombakomposztokban (Lacey, 1997). Itt is jelen van a 3. fázisból is kimutatott Thermobispora bispora. Az aktinobaktériumok laskagombaalapanyag gyártás végén történő elszaporodását mutatta ki Choi (2004) is. A Thermus nemzetséget a korábbi fázisokból nem tudtuk kimutatni, bár az irodalom a termofil komposztok mikrobiótájának tárgyalásakor gyakran említi (Beffa és mtsai, 1996). Székely és munkatársai (2009) is a kész halomkomposzt domináns tagjának írja le. Meg kell azonban jegyezni, hogy a néhány klónnal 99-100%-os hasonlóságot mutató Thermus sp. K-39 törzset épp mi izoláltuk korábban laskagomba halomkomposztból (Kanizsai, 2007), és új fajként való leírása jelenleg is tart. Egyes Thermus törzsek nagy xilanáz aktivitással rendelkeznek, így részt vesznek a hemicellulózok lebontásában (Lyon és mtsai, 2000). A Firmicutes csoportból szintén több baktérium megtalálható a 3. és a 7. fázisban is, mint a Bacillus coagulans, a Geobacillus debilis és az Ureibacillus suwonensis. Rajtuk kívül a kész alapanyagban megtalálható még a Thermobacillus xylanilyticus, amely – mint neve is mutatja – xilánbontó képességgel rendelkezik (Touzel és mtsai, 2000) és érett csiperkekomposztból is kimutatták már (Ivors és mtsai, 2000). A legalább nemzetség szintjén meghatározható proteobaktériumokat a kész alapanyagban mindössze két faj képviseli. A Microvirga subterranea-t termofil kútvízből (Kanso és Patel, 2003), a Chelatococcus daeguensis-t textilfestékgyári szennyvízből írták le (Yoon és mtsai, 2008). Utóbbi távolabbi rokonát kész csiperkekomposztban is kimutatták (Székely és mtsai, 2009). A kész alapanyag domináns klónjainak nagy része tehát az aktinobaktériumok, a Thermus nemzetség és a Firmicutes taxon tagjai közé sorolható, amelyek mind a négy klónkönyvtárban jelen voltak, bár a csoportokon belül az egyes klónkönyvtárakban nem mindig ugyanazon fajok rokonait találtuk meg. Ez is részben igazolja, a korábban már említett, funkcionális redundanciát, amely szerint egy adott közösségi funkciót több különböző – jelen esetben rokon – baktérium is elláthat (Pérez-Piqueres és mtsai, 2006).

- 90 -

6/5. táblázat: A 7. fázis 6-061-7, 6-099-7, 7-118-7 és 7-203-7 mintáiból készült klónkönyvtárak bázissorrend-elemzéssel azonosított tagjai. Csak azokat a klónokat soroltuk fel, melyek megfeleltethetőek a 7. fázisra illetve a 7. fázis megfelelő csoportjára jellemző Simper 50 csúcsoknak, vagy a bennük 2% RFU gyakoriság feletti csúcsoknak.

(folytatás a következő oldalon)

- 91 -

6/5. táblázat: (folytatva az előző oldalról)

1

A 6-061-7, 6-099-7, 7-118-7 ill. 7-203-7 minta AluI illetve Hin6I enzimmel emésztett futásaiban azonosított T-RF-ek. A csúcsok mögött zárójelben található szám a csúcs relatív területét adja meg a megfelelő mintában. 2 A szekvenciákat a Blast programmal (Altschul és mtsai, 1997) a Genbank DNS-adatbázissal (Benson és mtsai, 2010), ill. a prokarióta típustörzseket tartalmazó EzTaxon adatbázissal (Chun és mtsai, 2007) vetettük össze. A táblázatban a legközelebbi rokon típustörzset adtuk meg. Azon klónok esetében, ahol a legközelebbi rokon típustörzsnél hasonlóbb nem tenyésztett klónt vagy nem típustörzset találtunk, azt is megadtuk. 3 Az osztályozást Euzéby (2010) alapján készítettük el. 4 Azon klónokat soroltuk ide, ahol a legközelebbi típustörzzsel való rokonság nem haladta meg a 95,0%-ot.

- 92 -

6.2.3 Az eredmények

összegzése és továbblépési lehetőségek a

laskagomba-alapanyag gyártás baktérium-közösségeinek elemzése kapcsán 

A 6.1 részben megalkotott T-RFLP adatfeldolgozási protokollt sikeresen alkalmaztuk a laskagomba alapanyag-gyártás teljes adatsorára. A protokoll tehát a célnak megfelelő. Továbbiakban érdemes lesz más tipusú mintákra is alkalmazni, ahol például kisebb a diverzitás, kevesebb a domináns T-RF, nincs ilyen jól látható szukcesszió.



Kimutattuk, hogy a laskagomba alapanyag-gyártás baktérium-közössége egy jól nyomon követhető szukcessziós útvonalat jár be. Ez más komposztálási rendszerekből már ismert, a csiperketermesztést megalapozó komposztálásánál is kimutatták, de laskagomba esetén ilyen részletességgel még nem írták le. A főkomponens-elemzés ábráin vizuálisan jól követhető változás tényét az egyes fázisok közti szignifikáns eltéréssel támasztottuk alá.



Megállapítottuk, hogy az időben egymás után gyártott kész alapanyagoknak a mikróbaösszetétele is közelebb áll egymáshoz. Ezt azzal a hipotézissel tudtuk megmagyarázni, hogy az alagútban – bár az egyes gyártási sorok között tisztítják és fertőtlenítik – fennmaradhatnak spórás, illetve termofil szervezetek, melyek mennyisége és összetétele folyamatosan változik, és amik újra és újra beolthatják az alagútba érkező alapanyagot. De a hipotézis alátámasztására a továbbiakban meg kell vizsgálni a kitisztított és fertőtlenített alagút mikrobiótáját.



Nem találtunk összefüggést a kész alapanyag bakteriális ujjlenyomata és a vizsgált fizikai-kémiai jellemzői, illetve az adott alapanyagon később termett laskagomba mennyisége között. Ennek hátterében számos ok húzódhat, de az egyik legfontosabb a statisztikai szempontból csekély mintaszám. Ennek ellenére a kanonikus elemzésekkel bemutattuk, hogy milyen módon lehet PCA és korrelációs elemzések segítségével T-RFLP ujjlenyomatokat és más környezeti adatokat összehasonlítani.



Klónkönyvtárak segítségével sikerült a domináns T-RF-ek nagy részét azonosítani, és legközelebbi rokonaikat meghatározni. Az alapanyag-gyártás elejére az általános elterjedésű mezofil baktériumok jellemzőek. A halomkomposztálás végére más komposztálási rendszerek termofil fázisából már ismert mikrobióta alakul ki, amelynek domináns tagjai a termofil Bacillus és rokon nemzetségei valamint a Pseudoxanthomonas fajok. Míg a kész alapanyag domináns klónjainak nagy része az aktinobaktériumok, a Thermus nemzetség és a Firmicutes taxon tagjai közé sorolható.

- 93 -



A kész alapanyagból készült mind a négy klónkönyvtárban jelen voltak a domináns csoportok, bár nem mindig ugyanazon fajok rokonait találtuk meg. Ez részben igazolja a funkcionális redundanciát, amely szerint egy adott közösségi funkciót több különböző – jelen esetben rokon –, baktérium is elláthat.



Az alapanyag-gyártás során folyamatosan nőtt a közeli rokon leírt fajokkal nem rendelkező baktériumklónok aránya. Így érdemes lenne a kész komposztból, ill. alapanyagból baktérium törzsgyűjteményeket létrehozni, hogy a tudomány számára még ismeretlen baktériumokat részletesen meg lehessen vizsgálni.



A továbbiakban azt is fontos lesz megvizsgálni, hogy a munkánk során megismert baktérium-közösség hogyan változik meg a termesztés további részében, az alapanyagnak laskagombával való átszövetése és a termőtestképzés során.

- 94 -

7. Összefoglalás A mikroba közösségek szerepének és működésének jobb megértéséhez alapvető feltétel a közösségek összetételének leírása. Ehhez sok segítséget nyújtanak az elmúlt évtizedben nagy fejlődésen keresztülment molekuláris ujjlenyomat technikák. Ezek közül a T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism [restrikciós enzimmel

hasított

darabok

terminális

hossz-polimorfizmusa])

pontosságával,

reprodukálhatóságával és nagy felbontásával tűnik ki. Azonban a módszert alkalmazók sokszor nem rendelkeznek megfelelő technikai háttérismerettel, elsősorban az adatfeldolgozás során. A dolgozat első részének célja ezért a T-RFLP adatfeldolgozás optimalizálása és egy standardizált T-RFLP adatfeldolgozási protokoll megalkotása volt. Az optimalizálás során meghatároztuk, hogy milyen paraméterekkel kell rendelkeznie egy T-RFLP kromatogramnak, hogy alkalmas legyen a további elemzésre. Elsősorban költséghatékonyság és időtakarékosság miatt minden mintából csak egy futást használtunk fel a vizsgálatokhoz. Ezért meghatároztuk, hogy mekkora hibát okoz az egy minta párhuzamos futásai közötti variancia elhanyagolása. A hiba csökkentésére mintánként egybevontuk az AluI és Hin6I enzimekkel emésztett PCR termékek futásadatait, és a próbaképpen pár mintából készített párhuzamos futások közti varianciák alapján meghatároztuk, hogy az egyes T-RF méreteknél maximum mekkora bázispárban megadott méretkülönbség esetén kerülhet két csúcs azonos kategóriába (binbe). A zajszűréshez a „küszöbérték statisztikai meghatározása” módszert választottuk, majd a futások adatait a T-REX on-line T-RFLP kiértékelő programba betöltve a különböző mintákból származó futások egymáshoz illesztését a programba beépített T-Align modullal végeztük a párhuzamos futások vizsgálata során meghatározott változó binekkel. Az így elkészült mátrixok alapján a minták közötti különbségeket főkomponens elemzéssel tettük „láthatóvá”, amit Bray-Curtis hasonlóság alapján történő UPGMA csoportosítással és SIMPER elemzéssel, valamint a Simper50 csúcsok klónkönyvtárak segítségével történő azonosításával egészítettünk ki. Az így elkészült T-RFLP adatfeldolgozási protokoll közvetlenül alkalmazható más minták esetében is, vagy a felhasznált döntési mechanizmusok útján kialakítható az adott mintához még megfelelőbb protokoll. Az elkészült protokollt laskagomba (Pleurotus spp.) alapanyag gyártás baktériumközösségének monitorozására használtuk fel. Annak ellenére, hogy a laskagombát már régóta termesztik Magyarországon is, nem rendelkezünk elégséges tudással az alapanyag mikrobiotájáról, amely az alapanyag minőségének fontos paramétere. - 95 -

Munkánk

második

részében a részleges komposztáláson, pasztörizáláson és

kondicionáláson alapuló

alapanyag-gyártási folyamatban

jelenlévő

és

változó

összetételű mikroba-közösségek megismerését tűztük ki célul. A laskagomba-alapagyag gyártás reprezentatív pontjairól mintákat vettünk, izoláltuk a közösségi DNS-t, elvégeztük a T-RFLP elemzést, valamint egyes mintákból klónkönyvtárakat hoztunk létre. Kimutattuk a laskagomba alapanyag-gyártás során a baktérium közösségek szukcesszióját. Ez más komposztálási rendszerekből már ismert, még a csiperketermesztést megalapozó komposztálásánál is kimutatták, de laskagomba esetén ilyen részletességgel még nem írták le. A főkomponens-elemzés ábráin a szukcessziót vizuálisan is jól lehetett követni, amit az egyes fázisok közti szignifikáns eltéréssel is alátámasztottunk. Kanonikus elemzéseket végezve nem találtunk összefüggést a kész alapanyag baktérium ujjlenyomata és a vizsgált fizikai-kémiai jellemzők, illetve az adott alapanyagon később termett laskagomba mennyisége között. Ennek hátterében számos ok húzódhat, de az egyik legfontosabb a statisztikai szempontból csekély mintaszám. Végül klónkönyvtárak segítségével sikerült a domináns T-RF-ek nagy részét azonosítani, és legközelebbi rokonaikat meghatározni. Az alapanyag-gyártás elejére az általános elterjedésű mezofil baktériumok voltak jellemzőek. Míg a halomkomposztálás végére más komposztálási rendszerek termofil fázisából már ismert, a termofil Bacillus és rokon nemzetségei, valamint a Pseudoxanthomonas fajok által dominált mikrobiota alakult ki. Végül a kész alapanyag domináns klónjainak nagy része az aktinobaktériumok, a Thermus nemzetség és a Firmicutes taxon tagjai közé volt sorolható.

- 96 -

8. Abstract The description of microbial community structure(s) is a basic requirement for the better understanding of the role of these communities in the given environment. Molecular fingerprinting techniques give major help in such work. One of them, the TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) has gained increased popularity in recent years due to its relative ease, fidelity, reproducibility and high resolution power. Unfortunately, many researchers do not have adequate technical knowledge for the application, particularly in the field of data processing. Thus, the objective of the first part of the thesis was to optimize T-RFLP data processing and to create a standardized T-RFLP data processing protocol. During optimization, firstly the optima of T-RFLP chromatogram parameters were determined. Mainly due to the cost and time limitations, only one run from each sample was used for analysis. Therefore, the extent of error due to neglecting the variance between parallel runs of the same sample was determined. To reduce this kind of error, first the data of the AluI and Hin6I T-RFLP runs were combined; second, on the basis of the variance among several parallel runs, the maximum difference in base pairs between two peaks was determined, when two peaks can still be aggregated into the same category (bin). For noise reduction, the method of „statistical determination of the threshold” was chosen. Then the T-RFLP data were uploaded to the T-REX on-line evaluation program and the alignment of the T-RFLP profiles from different runs was carried out with the built in T-Align module using the variable bins option determined through the analysis of parallel runs. Based on the resulting data matrix, the similarities/dissimilarities among the samples were visualized with principal component analysis, supplemented with hierarchical clustering based on Bray-Curtis similarities and Simper analysis, together with the identification of Simper50 peaks with clone libraries. The resulting T-RFLP data processing protocol is directly applicable to the analysis of other samples, or with the decision-making mechanisms provided more appropriate protocols can be determined. The resulting protocol was used to monitor the bacterial community changes of oyster mushroom (Pleurotus spp.) substrate production. In spite of the far ranging world wide and Hungarian production of oyster mushroom, there is insufficient knowledge on the microbiota of the substrate, though this is an important parameter of substrate quality. The objective of the second part of the work was to get a deeper knowledge of the microbial community changes during substrate production. The process of substrate production is based on partial composting, pasteurisation and conditioning. - 97 -

Samples were collected from representative points of oyster mushroom substrate production, total DNA was isolated, T-RFLP analysis was carried out, and clone libraries were created from representative samples. The succession of bacterial communities during oyster mushroom substrate production was demonstrated. A microbial succession during composting is already known form other composts, and it was detected in button mushroom substrate production too, but in the case of oyster mushroom substrate it has not been described in such details yet. The succession could be well followed on the principal component analysis plots, confirmed by significant differences based on ANOSIM analysis among each phase. Using canonical analysis no significant correlations could be detected among bacterial fingerprints of the mature substrate and measured physico-chemical properties and respective mushroom yield. This negative result can be explained by several factors but the most important is the inadequate number of samples from a statistical point of view. Finally, most of the dominant T-RF-s were identified and their closest relatives were identified with the help of clone libraries. At the beginning of substrate production ubiquitous mesophilic bacteria were typical. While at the end of the partial composting, Bacillus spp. and related species, and Pseudoxanthomonas spp. were the dominant microbes, that are well known from the thermophilic phase of other composts. Most of the dominant bacteria of the mature substrate could be assigned to Actinobacteria, Firmicutes and the genus Thermus.

- 98 -

9. Irodalomjegyzék Abdo, Z., Schüette, U., M., E., Bent, S., J., Williams, C., J., Forney, L., J., Joyce, P. 2006. Statistical methods for characterizing diversity of microbial communities by analysis of terminal restriction fragment length polymorphisms of 16S rRNA genes. Environ. Microbiol. 8, 929-938. Adams, J., D., W., Frostick, L., E. 2009. Analysis of bacterial activity, biomass and diversity during windrow composting. Waste Manage. 29, 598-605. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Anderson, M., J. 2001. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral. Ecol. 26, 32-46. Ashelford, K., E., Chuzhanova, N., A., Fry, J., C., Jones, A., J., Weightman, A., J. 2006. New Screening software shows that most recent large 16S rRNA gene clone libraries contain chimeras. Appl. Environ. Microb. 72, 5734-5741. Avaniss-Aghajani, E., Jones, K., Chapman, D., Brunk, C. 1994. A molecular technique for identification of bacteria using small subunit ribosomal RNA sequences. Biotechniques 17, 144-l49. Avaniss-Aghajani, E., Jones, K., Holtzman, A., Aronson, T., Glover, N., Boian, M., Froman, S., Brunk, C., F. 1996. Molecular technique for rapid indentification of Mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 34, 98-102. Balázs, S. 1982. Termesztett gombáink. Akadémiai kiadó, Budapest. pp. 30-39.; 233259. Beffa, T., Blanc, M., Lyon, P., F., Vogt, G., Marchiani, M., Fischer, J., L., Aragno, M. 1996. Isolation of Thermus strains from hot composts (60 to 80 °C). Appl. Environ. Microb. 62, 1723-1727. Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. 1999. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. Electrophoresis 20,14921507. Behrendt, U., Ulrich, A., Schumann, P. 2003. Fluorescent pseudomonads associated with the phyllosphere of grasses; Pseudomonas trivialis sp. nov., Pseudomonas poae sp. nov. and Pseudomonas congelans sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Micr. 53, 1461-1469.

- 99 -

Bennett, L., T., Kasel, S., Tibbits, J. 2008. Non-parametric multivariate comparisons of soil fungal composition: Sensitivity to thresholds and indications of structural redundancy in T-RFLP data. Soil Biol. Biochem. 40, 1601-1611. Benson, D., A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., J., Ostell, J., Sayers. E., W. 2010. GenBank. Nucleic Acids Res. 38, D46-D51. Blackwood, C., B., Buyer, J., S. 2007. Evaluating the physical capture method of terminal restriction fragment length polymorphism for comparison of soil microbial communities. Soil Biol. Biochem. 39, 590-599. Blackwood, C., B., Hudleston, D., Zak, D., R., Buyer, J., S. 2007. Interpreting ecological diversity indices applied to terminal restriction fragment length polymorphism data: insights from simulated microbial communities. Appl. Environ. Microb. 73, 5276-5283. Blackwood, C., B., Marsh, T., Kim, S., H., Paul, E., A. 2003. Terminal restriction fragment length polymorphism data analysis for quantitative comparison of microbial communities. Appl. Environ. Microb. 69, 926-932. Block, S., S., Tsao, G., Han, L. 1959. Experiments in the cultivation of Pleurotus ostreatus. The proceedings of the Fourth International Conference on Scientific Aspects of Mushroom Growing. Coppenhagen. pp. 309-325. Bonatti, M., Karnopp, P., Soares, H., M., Furlan, S., A. 2004. Evaluation of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju nutritional characteristics when cultivated in different lignocellulosic wastes. Food Chem. 88, 425-428. Bruce, K. D. 1997. Analysis of mer gene subclasses within bacterial communities in soils and sediments resolved by fluorescent-PCR-restriction fragment length polymorphism profiling. Appl. Environ. Microb. 63, 4914-4919. Busse, H-J., Denner, E., B., M., Buczolits, S., Salkinoja-Salonen, M., Bennasar, A., Kämpfer, P. 2003. Sphingomonas aurantiaca sp. nov., Sphingomonas aerolata sp. nov. and Sphingomonas faeni sp. nov., air- and dustborne and Antarctic, orangepigmented, psychrotolerant bacteria, and emended description of the genus Sphingomonas. Int. J. Syst. Evol. Micr. 53, 1253-1260. Cancilla, M., R., Powell, I., B., Hillier, A., J., Davidson, B., E. 1992. Rapid genomic fingerprinting of Lactococcus lactis strains by arbitrarily primed polymerase chain reaction with 32P and fluorescent labels. Appl. Environ. Microb. 58, 1772-l775. Chang, S-T. és Miles, P. G. 2004. Mushrooms: cultivation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact. CRC Press, Boca Raton. pp. 159-160.; 315-316.

- 100 -

Choi, K., W. 2004. Shelf cultivation of oyster mushroom with emphasis on substrate fermentation. In: Mushroom Growers' Handbook 1: Oyster Mushroom Cultivation MushWorld, Seoul. pp. 153-165. Chun, J., Lee, J.-H., Jung, Y., Kim, M., Kim, S., Kim, B. K., Lim, Y. W. 2007. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences. Int. J. Syst. Evol. Micr. 57, 2259-2261. Clarke, K., R. 1993. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Aust. J. Ecol. 18, 117-143. Clarke, K., R., Ainsworth, M. 1993. A method of linking multivariate community structure to environmental variables. Mar. Ecol-Prog. Ser. 92, 205-219. Cohen, R., Persky, L., Hadar, Y. 2002. Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 582-594. Culman, S., W., Bukowski, R., Gauch, H., G., Cadillo-Quiroz, H., Buckley, D., H. 2008a. T-REX: Software for the Processing and Analysis of T-RFLP data. http://trex.biohpc.org/ Culman, S., W., Gauch, H., G., Blackwood, C., B., Thies, J.,E. 2008b. Analysis of TRFLP data using Analysis of Variance and Ordination Methods: A Comparative Study. J. Microbiol. Meth. 75, 55-63. Dai, X., Wang, Y-N., Wang, B-J., Liu, S-J., Zhou, Y-G. 2005. Planomicrobium chinense sp. nov., isolated from coastal sediment, and transfer of Planococcus psychrophilus

and

Planococcus

alkanoclasticus

to

Planomicrobium

as

Planomicrobium psychrophilum comb. nov. and Planomicrobium alkanoclasticum comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 699-702. Dees, P., M., Ghiorse, W., C. 2001. Microbial diversity in hot synthetic compost as revealed by PCR-amplified rRNA sequences from cultivated isolates and extracted DNA. FEMS Microbiol. Ecol. 35, 207-216. Derikx, P., J., L., Op den Camp, H., J., M., van der Drift, C., van Griensven, L., J., L., D., Vogels, G., D. 1990. Biomass and biological activity during the production of compost used as a substrate in mushroom cultivation. Appl. Environ. Microb. 56, 3029-3034. Dickie, I., A., Xu, B., Koide, R., T. 2002. Vertical niche differentiation of ectomycorrhizal hyphae in soil as shown by T-RFLP analysis. New Phytol. 156, 527-535.

- 101 -

Dollhopf, S., L., Hashsham, S., A., Tiedje, J., M. 2001. Interpreting 16S rDNA T-RFLP data: application of self-organizing maps and principal component analysis to describe community dynamics and convergence. Microb. Ecol. 42, 495-505. Dunbar, J., Ticknor, L., O., Kuske, C., R. 2001. Phylogenetic specificity and reproducibility and new method for analysis of terminal restriction fragment profiles of 16S rRNA genes from bacterial communities. Appl. Environ. Microb. 67, 190197. Egert, M., Friedrich, M., W. 2003. Formation of pseudo-terminal restriction fragments, a PCR-related bias affecting terminal restriction fragment length polymorphism analysis of microbial community structure. Appl. Environ. Microb. 69, 2555-2562. Engebretson, J., J., Moyer, C., L. 2003. Fidelity of select restriction endonucleases in determining

microbial

diversity

by

terminal-restriction

fragment

length

polymorphism. Appl. Environ. Microb. 69, 4823-4829. Euzéby, J., P. 2010. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature. URL: www.bacterio.net Földi, M. 2005. Közeli infravörös spektroszkópia felhasználása gomba komposzt szárazanyag tartalmának meghatározására. Mikrobiológus technikus szakdolgozat. Készült az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén. Gallego, V., Sánchez-Porro, C., García, M., T., Ventosa, A. 2006. Massilia aurea sp. nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Micr. 56, 2449-2453. Gerrits, J., P., G. 1988. Nutrition and compost In.: van Griensven, L., J., L., D. The Cultivation of Mushrooms. Darlington Mushroom Ltd., Rushington. Somycel, Langéais pp. 29-72. Grant, A., Ogilvie, L., A. 2004. Name that microbe: rapid identification of taxa responsible for individual fragments in fingerprints of microbial community structure. Mol. Ecol. Notes 4,133-136. Green, P., N. 2006. Methylobacterium. In: Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K-H., Stackebrandt, E. (eds) The Prokaryotes, 3rd edition, Springer, New York. 5, 257-265. Gregori, A., Svagelj, M., Pohleven, J. 2007. Cultivation Techniques and Medicinal Properties of Pleurotus spp. Food Tehcnol. Biotech. 45, 238-249. Hajdú, Cs., Szarvas, J., Bujdosó, L., Nagy Z. 2005. Magasabb hőmérsékleten is termő késői laskagomba (Pleurotus ostreatus) hibridek nemesítésének eredményei. Különkiadás, 187-193.

- 102 -

Hammer, O., Harper, D., A., T., Ryan, P., D. 2001. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica 4: 9pp. Handelsman, J., Smalla, K. 2003. Conversations with the silent majority. Curr. Opin. Microbiol. 6, 271-273. Hayashi, N., R., Ishida, T., Yokota, A., Kodama, T., Igarashi, Y. 1999. Hydrogenophilus thermoluteolus gen. nov., sp. nov., a thermophilic, facultatively chemolithoautotrophic, hydrogen-oxidizing bacterium. Int. J. Syst. Bact. 49, 783786. Heltay, I. 1999. Adatok az ipari jellegű laskagomba-termesztés negyedszázados magyarországi történetéhez és nemzetközi vonatkozásaihoz. Magyar Gomba 10, 912.; 11, 17-20.; 12, 7-10.; 13, 22-25. Herrmann, R., F., Shann, J., F. 1997. Microbial community changes during the composting of municipal solid waste. Microb. Ecol. 33, 78-85. Iiyama, K., Stone, B., A., and Macauley, B., J. 1994. Compositional changes in compost during composting and growth of Agaricus bisporus. Appl. Environ. Microb. 60, 1538-1546. Irwin, D., L., Mitchelson, K., R., Findlay, I. 2003. PCR product cleanup methods for capillary electrophoresis. Biotechniques. 34, 932-936. Ishii, K., Fukui, M., Takii, S. 2000. Microbial succession during a composting process as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis. J. Appl. Microbiol. 89, 768-777. Ivors, K., Beyer, D., Wuest, P., Kang, S. 2002. Survey of fungal diversity in mushroom compost using sequences of PCR-amplified genes encoding 18S ribosomal RNA. In: Insam, H., Riddech, N., Klammer, S. Microbiology of Composting. Springer Verlag, Heidelberg. pp. 18-24. Ivors, K., L., Collopy, P., D., Beyer, D., M., Kang, S. 2000. Identification of bacteria in mushroom compost using ribosomal RNA sequence. Compost Sci. Util. 8, 247-253. Janda, J., M. 2006. New members of the family Enterobacteriaceae. In: Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K-H., Stackebrandt, E. (eds) The Prokaryotes, 3rd edition, Springer, New York. 6, 5-40. Jann, G., J., Howard, D., H., Salle, A., J. 1959. Method for the determination of completion of composting. Appl. Environ. Microb. 7, 271-275.

- 103 -

Kanizsai, S. 2007. A laskagomba-komposztból kitenyészthető mikroorganizmusok klasszikus és molekuláris vizsgálata. Mikrobiológus szakdolgozat. Készült az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén. Kanso, S., Patel, B., K., C. 2003. Microvirga subterranea gen. nov., sp. nov., a moderate thermophile from a deep subsurface Australian thermal aquifer. Int. J. Syst. Evol. Micr. 53, 401-406. Kaplan, C., W., Kitts, C., L. 2003. Variation between observed and true terminal restriction fragment length is dependent on true TRF length and purine content. J. Microbiol. Meth. 54, 121-125. Kent, A., D., Smith, D., J., Benson, B., J., Triplett, E., W. 2003. Web-based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities. Appl. Environ. Microb. 69, 67686776. Kitts, C., L. 2001. Terminal restriction fragment patterns: a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics. Curr. Issues Intest. Microbiol. 2, 17-25. Klamer, M., Bååth, E. 1998. Microbial community dynamics during composting of straw material studied using phospholipid fatty acid analysis. FEMS Microb. Ecol. 27, 9-20. Kobayashi, T., Murai, Y., Tatsumi, K., Iimura, Y. 2009. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Sphingomonas sp. enhanced by water-extractable organic matter from manure compost. Sci. Total Env. 407, 5805-5810. Koronczy, I., Uzonyi, S. 1969. Gombatermesztési útmutató. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. pp. 155-156. Kropf, S., Heuer, H., Grüning, M., Smalla, K. 2004. Significance testing for comparing complex microbial community fingerprints using pairwise similarity measures. J. Microbiol. Meth. 57, 187-195. Kukolya, J., Nagy, I., Láday, M., Tóth, E., Oravecz, O., Márialigeti, K., Hornok, L. 2002. Thermobifida cellulolytica sp. nov., a novel lignocellulose-decomposing actinomycete. Int. J. Syst. Evol. Micr. 52, 1193-1199. Labuschagne, P., M., Eicker, A., Aveling, T., A., S., de Meillon, S., Smith, M., F. 2000. Infuence of wheat cultivars on straw quality and Pleurotus ostreatus cultivation. Biores. Technol. 71,71-75. Lacey, J. 1997. Actinomycetes in composts. Ann. Agric. Environ. Med. 4, 113-121.

- 104 -

Lane, D., J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt, E., Goodfellow, M. (eds) Nucleic acids techniques in bacterial systematics. Wiley, NewYork. pp. 115175. Lee, H-K., Kim, H-R., Mengoni, A., Lee, D-H. 2008. Modified T-RFLP methods for taxonomic interpretation of T-RF. J. Microbiol. Biotechnol. 18, 624-630. Legendre, P., Anderson, M., J. 1999. Distance-based redundancy analysis: testing multispecies responses in multifactorial ecological experiments. Ecol. Monographs 69, 1-24. Legendre, P., Gallagher, E., D. 2001. Ecologically meaningful transformations for ordination of species data. Oecologia 129, 271-280. Legendre, P., Legendre, L. 1998. Numerical ecology. 2nd English edn. Elsevier, Amsterdam Lelley, J., I. 1999. Overview of specialty mushrooms production technology used in eastern and western Europe. Keynote Lecture on the 9th Annual Specialty Mushroom Workshop. June 13-14, 1999. Penn State University. Lepš, J., Šmilauer, P. 2003. Multivariate analysis of ecological data using CANOCOTM. Cambridge University Press, Cambridge. pp. 50-51. Liu, W., Marsh, T., L., Cheng, H., Forney, L., J. 1997. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microb. 63, 4516-4522. Lu, Z., Liu, Z., Wang, L., Zhang, Y., Qi, W., Goodfellow, M. 2001. Saccharopolyspora flava sp. nov. and Saccharopolyspora thermophila sp. nov., novel actinomycetes from soil. Int. J. Syst. Evol. Micr. 51,319-325. Lyon, P., F., Beffa, T., Blanc, M., Auling, G., Aragno, M. 2000. Isolation and characterization of highly thermophilic xylanolytic Thermus thermophilus strains from hot composts. Can. J. Microbiol. 46, 1029-1035. Lyons, G., A., McCall, R., D., Sharma, H., S., S. 2000. Physical degradation of wheat straw by the in-vessel and windrow methods of mushroom compost production. Can. J. Microbiol. 46, 817-825. Lyons, G., A., Sharma, H., S., S., Kilpatrick, M., Cheung, L., Moore, S. 2006. Monitoring of changes in substrate characteristics during mushroom compost production. J. Agric. Food Chem. 54, 4658-4667. Marsh, T., L., Saxman, P., Cole, J., Tiedje, J. 2000. Terminal restriction fragment length polymorphism analysis program, a web-based research tool for microbial community analysis. Appl. Environ. Microb. 66, 3616-3620. - 105 -

Matsumoto, M., Sakamoto, M., Hayashi, H., Benno, Y. 2005. Novel phylogenetic assignment database for terminal-restriction fragment length polymorphism analysis of human colonic microbiota. J. Microbiol. Meth. 61, 305-319. Metzker, M., L. 2010. Sequencing technologies - the next generation. Nature Rev. 11, 31-46. Moeseneder, M., M., Arrieta, J., M., Muyzer, G., Winter, C., Herndl, G., J. 1999. Optimization of terminal restriction fragment length polymorphism analysis for complex marine bacterioplankton communities and comparison with denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. Microb. 65, 3518-3525. Mohr, A. 2006 Klórozott szénhidrogénekkel szennyezett talajvizek bakteriális közösségének elemzése, új bioremediációs technológia fejlesztése. Biológus szakdolgozat. Készült az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén. Moreira, R., F., Noren, C., J. 1995. Minimum duplex requirements for restriction enzyme cleavage near the termini of linear DNA fragments. Biotechniques 19, 5659. Nagashima, K., Hisadi, T., Sato, M., Mochizuki, J. 2003. Application of new primerenzyme combinations to terminal restriction fragment length polymorphism profiling of bacterial populations in human feces. Appl. Environ. Microb. 69, 12511262. Oksanen, J., Blanchet, F., G., Kindt, R., Legendre, P., O'Hara, R., G., Simpson, G., L., Solymos, P., Henry, M., Stevens, H., Wagner, H. 2010. vegan: Community Ecology Package. R package version 1.17-0. http://CRAN.R-project.org/package=vegan Ororbia, M., Á., M., Núñez, J., P. 2001. La preparación del substrato. (Az alapanyag előkészítése.) In: Sánchez, J., E.,. Royse, D., J. La biología y el cultivo de Pleurotus spp. (A Pleurotus spp. biológiája és termesztése.) El Colegio de la Frontera Sur, Chiapas, México. pp. 157-186. Osborn, A., M., Moore, E., R., B., Timmis, K., N. 2000. An evaluation of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics. Environ. Microbiol. 2, 39-50. Osborne, C., A., Rees, G., N., Bernstein, Y., Janssen, P., H. 2006. New threshold and confidence estimates for terminal restriction fragment length polymorphism analysis of complex bacterial communities. Appl. Environ. Microb. 72, 1270-1278. Park, S., Ku, Y., K., Seo, M., J., Kim, D., Y., Yeon, J., E., Lee, K., M., Jeong, S-C., Yoon, W., K., Harn, C., H., Kim, H., M. 2006. Principal component analysis and discriminant analysis (PCA-DA) for discriminating profiles of terminal restriction - 106 -

fragment length polymorphism (T-RFLP) in soil bacterial communities. Soil Biol. Biochem. 38, 2344-2349. Partanen, P., Hultman, J., Paulin, L., Auvinen, P., Romantschuk, M. 2010. Bacterial diversity at different stages of the composting process. BMC Microbiol. 10, 94. pp. 11 Pérez-Piqueres, A., Edel-Hermann, V., Alabouvette, C., Steinberg, C. 2006. Response of soil microbial communities to compost amendments. Soil. Biol. Biochem. 38, 460-470. Peters, S., Koschinsky, S., Schwieger, F., Tebbe, C., C. 2000. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR-single-strand-conformation polymorphism-based genetic profiles of small-subunit rRNA genes. Appl. Environ. Microb. 66, 930-936. Podani, J. 1997. Bevezetés a többváltozós biológiai adatfeltárás rejtelmeibe. Scientia kiadó, Budapest. pp. 211-278.; 305-344. R Development Core Team. 2010. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing. URL http://www.R-project.org Ramette, A. 2007. Multivariate analyses in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 142-160. Rees, G., N., Baldwin, D., S., Watson, G., O., Perryman, S., Nielsen, D., L. 2004. Ordination and significance testing of microbial community composition derived from terminal restriction fragment length polymorphisms: application of multivariate statistics. Antonie van Leeuwenhoek 86, 339-347. Rossi, P., Gillet, F., Rohrbach, E., Diaby, N., Holliger, C. 2009. Statistical assessment of the variability of the T-RFLP analysis applied to complex microbial communities. Appl. Environ. Microb. 75, 7268-7270. Ryckeboer, J., Mergaert, J., Coosemans, J., Deprins, K., Swings, J. 2003a. Microbial aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. J. Appl. Microb. 94, 127-137. Ryckeboer, J., Mergaert, J., Vaes, K., Klammer, S., De Clercq, D., Coosemans, J., Insam, H., Swings, J. 2003b. A survey of bacteria and fungi occurring during composting and self-heating processes. Ann. Microbiol. 53, 349-410. Saari, T., A., Saari, S., K., Campbell, C., D., Alexander, I., J., Anderson, I., C. 2007. FragMatch - a program for the analysis of DNA fragment data. Mycorrhiza 17, 133136. - 107 -

Sait, L., Galic, M., Strugnell, R., A., Janssen, P., H. 2003. Secretory antibodies do not affect the composition of the bacterial microbiota in the terminal ileum of 10-weekold mice. Appl. Environ. Microb. 69, 2100-2109. Sambrook, J., Russell, D., W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York Sánchez, J., E.,. Royse, D., J. 2001. El Cultivo de Pleurotus spp. (A Pleurotus spp. termesztése.) In: Sánchez, J., E.,. Royse, D., J. La biología y el cultivo de Pleurotus spp. (A Pleurotus spp. biológiája és termesztése.) El Colegio de la Frontera Sur, Chiapas, México. pp. 187-203. Schmidt, O. 2006. Wood and tree fungi. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 238239. Schütte, U., M., E., Abdo, Z., Bent, S., J., Shyu, C., Williams, C., J., Pierson, J., D., Forney, L., J. 2008. Advances in the use of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis of 16S rRNA genes to characterize microbial communities. Appl. Microbiol. Biotechnol. 80, 365-380. Schwartz, E., Adair, K., L., Schuur, E., A. 2007. Bacterial community structure correlates with decomposition parameters along a Hawaiian precipitation gradient. Soil Biol. Biochem. 39, 2164-2167. Scola, B., L., Mallet, M-N., Grimont, P., A., D., Raoult, D. 2003. Bosea eneae sp. nov., Bosea massiliensis sp. nov. and Bosea vestrisii sp. nov., isolated from hospital water supplies, and emendation of the genus Bosea (Das et al. 1996). Int. J. Syst. Evol. Micr. 53, 15-20. Sharma, H., S. Kilpatrick, M. 2000. Mushroom (Agaricus bisporus) compost quality factors for predicting potential yield of fruiting bodies. Can. J. Microbiol. 46, 515519. Shyu, C., Soule, T., Bent, S., J., Foster, J., A., Forney, L., J. 2007. MiCA: A web-based tool for the analysis of microbial communities based on terminal-restriction fragment length polymorphisms of 16S and 18S rRNA genes. Microb. Ecol. 53, 562-570. Singh, B., K., Munro, S., Reid, E., Ord, B., Potts, J., M., Paterson, E., Millard, P. 2006. Investigating microbial community structure in soils by physiological, biochemical, and molecular fingerprinting methods. Eur. J. Soil Sci. 57, 72-82. Sipos, R. 2009. Mikroba közösségek fajösszetétel-vizsgálata: A multitemplát PCR és a DGGE elemzése. Doktori disszertáció. Készült az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén.

- 108 -

Sipos, R., Székely, A., J., Palatinszky, M., Révész, S., Márialigeti, K., Nikolausz, M. 2007. Efect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene-targetting bacterial community analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 60, 341-350. Slater, G., W., Kenward, M., McCormick, L., C., Gauthier, M., G. 2003. The theory of DNA separation by capillary electrophoresis. Curr. Opin. Biothechn. 14, 58-64. Smith, C., J., Danilowicz, B., S., Clear, A., K., Costello, F., J., Wilson, B., Meijer, W., G. 2005. T-Align, a web-based tool for comparison of multiple terminal restriction fragment length polymorphism profiles. FEMS Microbiol. Ecol. 54, 375-80. Song, J., Weon, H-Y., Yoon, S-H., Park, D-S., Go, S-J., Suh, J-W. 2001. Phylogenetic diversity of thermophilic actinomycetes and Thermoactinomyces spp. isolated from mushroom composts in Korea based on 16S rRNA gene sequence analysis. FEMS Microbiol. Lett. 202, 97-102. Southern, E., M. 1979. Measurement of DNA Length by Gel Electrophoresis. Anal. Biochem. 100, 319-323. Stajić, M., Sikorski, J., Wasser, S., P., Nevo, E. 2005. Genetic similarity and taxonomic relationships within the genus Pleurotus (higher Basidiomycetes) determined by RAPD analysis. Mycotaxon 93, 247-255. Stamets, P. 2000. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Ten Speed Press. Berkeley. p. 282.; 313. Stamets, P., Chilton, J., S. 1983. The Mushroom Cultivator. Agarikon Press, Olympia, Washington. p. 189. Straatsma, G., Gerrits, J., P., G., Thissen, J., T., N., M., Amsing, J., G., M., Loeffen, H., van Griensven, L., J., L., D. 2000. Adjustment of the composting process for mushroom cultivation based on initial substrate composition. Biores. Technol. 72, 67-74. Straatsma, G., Samson, R., A., Olijnsma, T., W., Gerrits, J., P., G., Op den Camp, H., J., M., and Griensven, L., J., L., D. 1995. Bioconversion of cereal straw into mushroom compost. Can. J. Bot. 73, S1019-S1024. Strom, P., F. 1985. Identification of thermophilic bacteria in solid-waste composting. Appl. Environ. Microb. 50, 906-913. Stutzenberger, F., J., 1971. Cellulase production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl. Microbiol. 22,147-152. Suzuki, M., Rappé, M., S., Giovanni, S., J. 1998. Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit - 109 -

rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl. Environ. Microb. 64, 45224529. Székely, A., J., Sipos, R., Berta, B., Vajna, B., Hajdú, C., Márialigeti, K. 2009. DGGE and T-RFLP Analysis of Bacterial Succession during Mushroom Compost Production and Sequence-aided T-RFLP Profile of Mature Compost. Microb. Ecol. 57, 522-533. Takaku, H., Kodaira, S., Kimoto, A., Nashimoto, M., Takagi, M. 2006. Microbial communities in the garbage composting with rice hull as an amendment revealed by culture-dependent and -independent approaches. J. Biosci. Bioeng. 101, 42-50. Tang, J., Tao, J., Urakawa, H., Corander, J. 2007. T-BAPS: a Bayesian statistical tool for comparison of microbial communities using terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) data. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 6, 30. pp. 21 Teuber, M., Geis, A. 2006. The genus Lactococcus. In: Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K-H., Stackebrandt, E. (eds) The Prokaryotes, 3rd edition, Springer, New York. 4, 205-228. Tindall, B., J., Rosselló-Móra, R., Busse, H-J., Ludwig, W., Kämpfer, P. 2010. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes. Int. J. Syst. Evol. Micr. 60, 249-266. Tiquia, S., M., Ichida, J., M., Keener, H., M., Elwell, D., L., Burtt, E., H., Michel, F., C. 2005. Bacterial community profiles on feathers during composting as determined by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rDNA genes. Appl. Microb. Biotechnol. 67, 412-419. Touzel, J., P., O'Donohue, M., Debeire, P., Samain, E., Breton, C. 2000. Thermobacillus xylanilyticus gen. nov., sp. nov., a new aerobic thermophilic xylan-degrading bacterium isolated from farm soil. Int. J. Syst. Evol. Micr. 50, 315-320. Vajna, B., Nagy, A., Sajben, E., Manczinger, L., Szijártó, N., Kádár, Zs., Bordás, D., Márialigeti, K. 2010. Microbial community structure changes during oyster mushroom substrate preparation. Appl. Microbiol. Biotechn. 86, 367-375. von Wintzingerode, F., Göbel, U., B., Stackebrandt, E. 2007. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiol. Rev. 21, 213-229. Wenz, H., M., Robertson, J., M., Menchen, S., Oaks, F., Demorest, D., M., Scheibler, D., Rosenblum, B., B., Wike, C., Gilbert, D., A., Efcavitch, J., W. 1998. HighPrecision Genotyping by Denaturing Capillary Electrophoresis. Genome Res. 8, 6980. - 110 -

Yoon, J-H., Kang, S-J., Im, W-T., Lee, S-T., Oh, T-K. 2008. Chelatococcus daeguensis sp. nov., isolated from wastewater of a textile dye works, and emended description of the genus Chelatococcus. Int. J. Syst. Evol. Micr. 58, 2224-2228. Yoon, J-H., Lee, M-H., Kang, S-J., Park, S-Y., Oh, T-K. 2006. Pedobacter sandarakinus sp. nov., isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Micr. 56,1273-1277.

- 111 -

- 112 -

10. Köszönetnyilvánítás Itt szeretnék köszönetet mondani:

Márialigeti Károlynak, témavezetőmnek, hogy lehetővé tette munkám elvégzését és dolgozatom megírását az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén. Köszönöm neki az értékes tanácsokat, gondolatokat, kérdéseket, kritikákat és szakmai vitákat.

Dr. Erdei Annának, Dr. Gyurján Istvánnak és Dr. Szigeti Zoltánnak, hogy lehetővé tették számomra Kísérletes Növénybiológia doktori programban való részvételt.

Felföldi Tamásnak, Mészáros Évának, Dr. Sipos Ritának és Homonnay Zalánnak kollégáimnak, valamint az ELTE Mikrobiológiai Tanszék többi munkatársának, akikhez bármikor fordulhattam segítségért, készek voltak a közös gondolkodásra, egy-egy probléma megoldására, és megkaptam az együtt-munkálkodás örömét.

Hideg Krisztinának, Kánainé Sipos Dórának, Kanizsai Szilviának, Páll Csabának és Szili Dánielnek, akik szakdolgozóként kapcsolódtak be a hosszabb-rövidebb időre a munkába.

Nagy Adriennek, a Pilze-Nagy Kft. ügyvezetőjének, aki a cégnél a laskagombaalapanyag gyártásért felelős, hogy annak idején az ELTE Mikrobiológiai Tanszékéhez fordult kérdéseivel, és ezzel megteremtette számomra dolgozatom alapkérdéseit. Köszönöm hogy megtapasztalhattam, milyen jól is lehet egy egyetemnek és egy cégnek együttműködnie, és hogy rávilágított, hogy rávilágított, az elméleti kérdések megválaszolásán kívül, milyen gyakorlati problémák megoldása érdekel egy gombatermesztőt.

Az Oktatási és Kulturális Minisztériumnak, hogy a Deák Ferenc Ösztöndíjjal (DFÖ 0054/2009) támogatták munkám befejezését.

Szüleimnek és nagyszüleimnek, testvéreimnek és barátaimnak, akik alkalmanként feltették a kínos kérdést – „Mikor leszel kész a doktoriddal?” – ezzel is serkentve a dolgozat megírását, lezárását.

- 113 -