Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů - translace Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie
Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Deoxyribonukleová kyselina (DNA) Ribonukleová kyselina (RNA) Každá monomerní jednotka obsahuje: 1) Fosfátovou skupinu 2) Pětiuhlíkatý monosacharid •
Ribosa
•
2-deoxyribosa
3) Base
Purinové a pyrimidinové
stejné
Nukleové báze
Vlastnosti nukleových bází – souvisí s jejich funkcí
• Planární • Keto-enol tautomerie • Slabě bazické • Spektrální - UV
Strukturní jednotky NK Uhlíkové atomy v cukerné části číslovány s čárkou
O O P O HO O base 5´ H2 C O C4´ H H C1´ H C3´ C2´ H O OH H
NUKLEOSID Monosacharid + base
Monomerní jednotka RNA Monomerní jednotka DNA
Glykosidická vazba Mezi C1 monosacharidu a N base
NUKLEOTID C5´- fosforylovaný derivát nukleosidu, monomerní jednotka NK
Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u pyrimidinových bází tvořena mezi N1 a C1´ (deoxy)ribosy
Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u purinových bází tvořena mezi N9 a C1´ (deoxy)ribosy
1
9
Názvosloví Báze se označují jednopísmennými symboly: A T C G U
Nukleosidy: Purinové: přípona – osin (adenosin, guanosin) Pyrimidinové: přípona – idin (thymidin, cytidin, uridin) Nukleotidy: Nukleosid (x‘) mono-, di-, tri- fosfát Adenosin 5‘ trifosfát´= ATP, obecně NTP nebo dNTP
Deoxy-
Funkce nukleotidů • • • •
stavební složky nukleových kyselin přenašeče energie (ATP, GTP, ligasy, hydrolasy) fosforylační činidla (ATP - kinasy) aktivátory meziproduktů biosyntéz: N N CH3 +
O
H3C N CH2 H2C O CH3
P O O
O P
O
H2C
O
H H HO
UDPglukosa
CDPcholin
N
O H
H OH
O
Funkce nukleotidů …. • součásti kofaktorů (NAD(P), FAD, AdoMet, CoA) • regulační molekuly a neuromodulátory (cAMP, cGMP) • Využití v terapii – antivirotika (AIDS, herpes, hepatitida) NH2 N
N
N
N
cAMP H2C
O H
O O P
H
H H
O
OH
O
Cyklický AdenosinMonoFosfát
Struktura DNA • Primární - pořadí nukleotidů 5´ → 3´ • Sekundární • Terciární
Primární struktura Zapisujeme:
TACG..... (dTdAdCdG.....)
Sekundární struktura DNA dvojitá šroubovice 1953 - James Watson, Francis Crick
Rosalind Franklin rentgenostrukturní analysa → meziatomární vzdálenosti, helikální struktura
Chargaffova pravidla: Zastoupení basí v DNA (molární %) Organismus
A
T
G
C
Člověk
30.9
29.4
19.9
19.8
Kuře
28.8
29.2
20.5
21.5
Kobylka luční
29.3
29.3
20.5
20.7
Pšenice
27.3
27.1
22.7
22.8
Kvasinky
31.3
32.9
18.7
17.1
E. coli
24.7
23.6
26.0
25.7
[A] = [T]
a
[G] = [C]
[A] /[T] = [G] / [C] = 1
Princip párování basí
James D.Watson & Francis Crick Nobelova cena 1962
Sekundární struktura 1. Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix, vzájemně svinuté, parametry 2. Monosacharid + fosfát´= páteř vně šroubovice – polární povrch 3. Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů kolmo na osu, stohování basí, patrové hydrofobní interakce 4. Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým pravidlům, vodíkové můstky 5. Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a malý (úzký a hluboký) 6. Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání:
5‘ → 3‘ 3‘ → 5‘ velikost se udává počtem párů bazí – bp
Terciární struktura DNA Prokaryotní 1 molekula kruhové DNA - 1 chromosom (E.coli 2,6x106 kDa, 1400 m!!)
+ Plasmid(ová DNA) - autonomně se replikující (zdvojující) mimochromosomální cirkulární DNA, odlišná od bakteriálního genomu (chromosomální DNA), která není nezbytná pro kontinuální existenci organismu za neselektivních podmínek.
Eukaryotní DNA je lineární Chromosomy + mimojaderná: mitochondriální, plastidová (pozor!! kruhová) Kódující úseky – exony, nekódující úseky - introny Kondenzace, poměr sbalení až 8 000 Základní jednotka - nukleosom
Vlastnosti DNA DNA poměrně málo stabilní - lze poškodit i mechanicky Přechod dvouvláknové struktury na jednovláknovou - porušení hydrofobních interakcí a vodíkových můstků: Pokles optické otáčivosti Pokles viskozity změna spektrálních vlastností Změna pH - protonace N1 v adeninu a N3 v cytosinu Pokles iontové síly - odhalení záporných nábojů fosfátové kostry
Teplotní denaturace DNA Hyperchromní efekt:
Tm se ↑ s ↑ zastoupením GC párů Tm = teplota tání DNA Denaturace může být vratná - annealing
RNA Ribosa x deoxyribosa UxT Jednovláknová! Messenger RNA – mRNA (5%)
Ribosomální RNA – rRNA (80%) Transferová RNA – tRNA (10 – 15%)
Ribosomální RNA, sekundární struktury: smyčky, výdutě, helikální úseky
Transferová RNA
3’ konec
Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti
nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodický přístup molekulární biologie
Přenos genetické informace Centrální dogma molekulární biologie:
x viry
Základní pojmy: Templát - vázán nekovalentně - matrice, vzor Replikace, transkripce, translace – řízené polymerace: Iniciace, elongace, terminace, postsyntetické úpravy (processing) Primer - vázán kovalentně - iniciátor růstu řetězců
Replikace DNA Konzervativní x Semikonzervativní ? Meselson - Stahlův experiment
Meselsonův a Stahlův experiment nově vznikající DNA je kombinací starého a nového řetězce:
hybridizace
E.coli v mediu s 15 N
Replikace Specifické párování bází umožňuje kopírování ssDNA slouží jako templát Vysoká rychlost – genom E.coli 4,8 x 106 bp zkopírován za 40 min!!! tj. inkorporace 2000 bází/s
lidský genom 6 x 1012 bp - replikace zahájena na více místech najednou
Rozvolnění dvojšroubovicové struktury v počátku replikace
Vznik replikační bubliny – replikační vidlička © Espero Publishing, s.r.o.
Polarita DNA-řetězců v replikační vidličce
© Espero Publishing, s.r.o.
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg2+
Specifita: Vazba 3‘→ 5‘ Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘ Na začátku nutná přítomnost volné 3‘OH - primer
Sumárně: dNTP + (DNA)n
(DNA)n+1
+ PPi
Mechanismus replikace
Asymetričnost replikační vidličky
Dokončení synthesy zpožďujícího se vlákna
DNA polymerasa III
DNA polymerasa I
DNA ligasa
DNA ligasa – propojení Okazakiho fragmnetů
ATP
AMP + PPi
Replikace DNA ..... Terminace Prokaryota – kruhová DNA Eukaryota – telomery, telomerasy
Vysoká přesnost kopírování je nezbytná!!! Pravděpodobnost inkorporace chybné base je 1 : 104 Ve skutečnosti pouze 1 : 1010
Opravný mechanismus??
Nukleasová aktivita DNA polymerasy
Stručná historie sekvenování DNA • První DNA sekvence – ~1965 - alanin tRNA (77 basí) z kvasinky • Vývoj metod pro sekvenování DNA – 1977 - Maxam-Gilbert a Sanger
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg2+ Primer s 3‘OH
Specifita: Vazba 3‘→ 5‘ Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘
Sumárně: dNTP + (DNA)n
(DNA)n+1
+ PPi
DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg2+
Specifita: Vazba 3‘→ 5‘ Růst vlákna ve směru 5‘ → 3‘ Na začátku nutná přítomnost volné 3‘OH - primer
Sumárně: dNTP + (DNA)n
(DNA)n+1
+ PPi
Sangerova metoda Založena na použití dideoxynukleotidů
Pro sekvenování je třeba: • • • •
Dostatečný počet kopií DNA Vhodný primer DNA polymerasa „normalní nukleotidy“ v dostatečném množství • Malé množství dideoxynukleotidů nějak označených (radioaktivně, fluorescenční značkou)
Templát 3’ …CCAAGGGT ………………5’ 5’……primer G GG GGT GGTT GGTTC GGTTCC GGTTCCC GGTTCCCA 4 reakční směsi:
-
Elektroforetické dělení fragmentů podle Mh
+
Sangerova metoda
Automatické sekvenování s využitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů
Copyright Bios Publishers Ltd
Realita…..
Amplifikace DNA Metoda PCR - polymerase chain reaction Polymerasová řetězová reakce
Amplifikace DNA - PCR (polymerase chain reaction) Reakční směs: - Taq polymerasa - Primery: levý pravý - Nukleotidy dNTP
Využití PCR:
• Materiál pro sekvenování – – – – –
Sekvenace genomů (HUGO) Diagnostika infekčních onemocnění Identifikace poruch na úrovni DNA Identifikace osob Studium evoluce (zpracování fosilií)
• Základ genových technologií - GMO
Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace
Transkripce Proteosynthesa Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie
Exprese genu DNA RNA
Transkripce
RNA protein
Translace
Transkripce DNA RNA RNA polymerasa katalyzuje většinu kroků v procesu: - rozpoznává iniciační místa – promotory - vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo - nemá nukleasovou aktivitu – neopravuje chyby!
Mechanismus syntézy je stejný pro všechny typy RNA
Transkripce Iniciace
- promotor rozpoznán sigma (σ) podjednotkou RNA polymerasy
prokaryota:
• 1. 2.
σ podjednotka: snižuje afinitu RNA polymerasy k nepřepisovaným oblastem Rozpoznává oblast promotoru
DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou ( DNA dependentní)
5´→ 3´
- vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo
RNAn + NTP → RNAn + 1 + PPi
3´→ 5´
Transkripce dvou genů na snímku z elektronového mikroskopu Transkripce mnoha RNA najednou Není třeba opravovat – RNA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu
© Espero Publishing, s.r.o.
Posttranskripční úpravy RNA Prokaryota - bez úprav Eukaryota replikace a transkripce jsou časoprostorově oddělené procesy • 5' čepička (cap) • 3 ' konec - poly A ocas (tail)
+ Sestřih (splicing)
Sestřih RNA Genom:
5’ Intergenic
Gen
Intergenic
3’
Exon
3’
Transkripce pre-mRNA 5’ Exon
Intron
Exon
GT
AG
Intron GT AG
Sestřih mRNA
Transkriptom:
5’ Exon
Exon
Exon
3’
Translace - proteosynthesa Probíhá na ribosomech Mechanismus u všech organismů prakticky stejný Směr N-konec C-konec
Překlad z jazyka basí do jazyka aminokyselin: Genetický kód – úkol: Ze 4 písmen je třeba vytvořit 20 slov :
42 = 16
43 = 64
Dešifrován pomocí syntetických polynukleotidů: poly U → polyphe
Vlastnosti genetického kódu • • • • •
• • • •
Tripletový Nepřekrývá se – Degenerovaný, pouze trp a met jeden kodon, ostatní více (synonyma) Většina synonym se liší basí na třetí pozici Degenerace minimalizuje vliv mutací → záměna basí neznamená vždy záměnu AK (Ile, Leu) Počet kodonů koreluje s četností výskytu AK v proteinech Pouze tři nemají smysl - stop! Iniciace – start kodon Met Téměř univerzální, výjimky u protozoí a mitochondrií (vlastní sada tRNA)
Proteosynthesa probíhá na ribosomech: rRNA - 80% buněčných RNA Ribozymy 25% sušiny E.coli S = Svedbergův koeficient – míra rychlosti sedimentace při centrifugaci
Base → aminokyselina
Vazba AK na tRNA - aminoacyl tRNA synthetasa (ligasa)
sumárně: AK + tRNA + ATP
aminoacyl tRNA + AMP + PPi
Opravný mechanismus – hydrolasová aktivita některých aminoacyl tRNA synthetas (thr x val)
Iniciace
Elongace – růst peptidového řetězce
Energetická bilance – aktivace AK ekv. 2 ATP elongace 2 GTP Terminace – stop kodon, Rf faktor
Proteosynthesa -shrnutí
Exprese genu u prokaryot a eukaryot - shrnutí
Postranslační modifikace proteinů fosforylace
myristoylace
glykosylace
• N-glykosidická vazba - Asn • O-glykosidická vazba - Ser a Thr
Posttranslační úpravy proteinů - štěpení Doprava na místo určení (targeting) – signální sekvence
pre-
Vznik biologicky aktivní formy z pro – formy Příklad - insulin
Regulace genové exprese Konstitutivní geny - kontinuální transkripce – síla promotoru Indukovatelné a reprimovatelné geny
• • • •
Transkripce a postranskripční procesy Degradace RNA Translace Degradace proteinů
Regulace převážně na úrovni iniciace translace Příklad: lac operon
Regulace genové exprese Operonová teorie:
+ regulátor
lac operon E.coli
Kultivace v mediu s glc
Při nedostatku glc náhrada laktosou
Genové technologie (inženýrství) Manipulace s genomem a s tím související technologie
PRO
PROTI
nejoptimističtější scénář:
nejpesimističtější scénář:
Zvýšení nutriční hodnoty potravin
Zvýšení úmrtnosti díky alergickým reakcím
Boj s chorobami Výživa třetího světa Snížení spotřeby pesticidů
Nevratné zamoření životního prostředí
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: • Sekvenování celých genomů - tvorba DNA knihoven • Transkriptomika - Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci
• Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) • Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) • Klonování organismů produkce geneticky identických populací organismů, ale také tvorba kopií DNA • Genetická modifikace organismů vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Technologie rekombinantní DNA Amplifikace DNA pomocí plasmidů Základ genových manipulací: Plasmid – vektor
Restrikční endonukleasy
Restrikční endonukleasy
Příprava plasmidu (vektor) – rekombinantní DNA
Selekce plasmidů nesoucích vloženou DNA 1. Vhodný plasmid (resistence k amp a tet 2. Štěpení restrikčními endonukleasami 3. ligace insertu
4. Transfekce buněk
5. Selekce buněk nesoucích plasmid s insertem
DNA knihovny, YAC, BAC fragmenty DNA
Chromosom mRNA
cDNA Reversní Transkriptasa
1) Reversní transkriptasa: RNA Dependentní DNA Polymerasa 2) Každý gen je nejméně jednou zastoupen v DNA knihovně
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: • Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven • Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci • Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) • Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) • Klonování organismů • Genetická modifikace organismů -
vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Instead of putting the foreign DNA into a bacterium, put it into a farm animal that can be milked so that the factor will be in he milk. Genetically modified organisms
Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: • Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven • Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci • Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) • Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) • Klonování organismů • Genetická modifikace organismů -
vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů
Konvenční křížení versus genové technologie
škůdce
Vložit do jiné rostliny
Pomalý přirozený výběr resistentních rostlin
škůdce
škůdce
rychle
nepřirozeně – vedlejší účinky? Může trvat mnoho generací Isolace genu resistence
Genetické úpravy rostlin Buněčná kultura
Buňka nesoucí příslušný gen
Rostlinná buňka DNA
A single gene
Rekonstrukce rostliny
transformace
Transgenní rostlina
Dělení buněk
Studium funkce genů SIGnAL- SALK Institute Genomic Analysis Laboratory T-DNA SALK lines resource for systematic genome-wide functional screens, a "phenomeready" genome, Up today 24773 lines, representing 15719 individual genes are available
Agrobacterium tumefaciens
Transkriptom Příprava cDNA
DNA mikročipy - analýza exprese genů • Microarrays detect gene interactions: 4 colors: – – – –
Green: high control Red: High sample Yellow: Equal Black: None
• Problem is to quantify image signals
Proteomika
A toto je realita……
Proteom:
Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA
Genom
Transkripce
Transkriptom DNA array
Translace
Proteiny
Proteom 2D
Vnější prostředí
Biochemické procesy MS
Vnější projevy
Metabolom, Fyziom HPLC
Reversní genetika – studium funkce genů Příprava cDNA
