Úvod do metabolomiky Petr Tarkowski Katedra biochemie
Curriculum vitae • 1990-1994 SPŠ-chemická Ostrava • (Voltametrické stanovení Pb, Cd v půdách) • 1994-1999 ACh, PřF UP (Mgr.) • (Využití PAGE a IEF vybraných proteinů k analýze rostlinných populací) • 1999-2003 Botanika, PřF UP (Ph.D.) • (Analytické metody studia cytokininů, biosyntéza cytokininů a jejich interakce s auxiny) • 2006 Botanika, PřF UP (RNDr.) • (Úloha cytokininů v regulaci růstu a vývoje rostlin) • 2011 Biochemie, PřF UP (doc.) • Bioanalytické matody studia cytokininů a jejich aplikace
2
Obsah přednášky • Základní pojmy
• Řešená problematika • Metody studia metabolomu • Příklady • Shrnutí přednášky, závěr
3
Základní pojmy
Metabolismus • látková přeměna – soubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k přeměně látek a energií v buňkách živých organismů.
Metabolit • produkt látkové přeměny (nízkomolekulární látka, primární a sekundární)
Metabolom • kompletní soubor nízkomolekulárních látek, přítomných v buňce či biologickém systému v daném čase (Oliver, 1998)
Metabolomika • vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu Nezávislá identifikace a kvantifikace všech malých molekul v biolockém systému. Příprava vzorku musí být univerzální, selektivita a 4 citlivost velmi vysoké.(Fiehn,2000; Raamsdonk, 2001)
Základní pojmy
Metabonomika • globální metabolické studie využívající NMR (toxikologie, farmakologie, plant science) (Nicholson, 1999)
• Metabolic profiling • Studium vybraných metabolitů, náleží do jedné metabolické dráhy, či funkční skupiny látek
Metabolic fingerprinting • globální analýza (bez chromatografie a identifikace) – zaměřeno na intracelulární metabolity mající biochemický význam, rychlá analýza (do 1 minuty)
Metabolic footprinting • globální analýza extracelulárních metabolitů
5
Základní pojmy
Metabolomika GENOM>TRANSKRIPTOM>PROTEOM>METABOLOM Metabolom je soubor meziproduktů a koncových produktů genové exprese a enzymatické aktivity • Velikost metabolomu mikroorganismů – několik stovek popsáno či postulováno • E. coli – 1170 záznamu v databázi (EcoCYC) • S. cerevisie – 600 (pod Mr 300) • Velikost metabolomu rostlin – 200 tis. (Fiehn, 2002) • Arabidopsis – 5 tis. (Bino,2004) • Soubor organických (aminokyseliny, mastné kyseliny, sacharidy, organické kyseliny, lipidy, sekundární metabolity) a anorganických látek a elementů 6
Základní pojmy Metabolom •
Je tvořen rozmanitou sadou spojených atomů, ve srovnání s proteomem (20 aminokyselin) a transkriptomem (čtyři nukleotidové báze) • Z toho plyne široká rozmanitost chemických (MW, polarita, rozpustnost) a fyzikálních vlastností (těkavost). • Metabolom koncentračně pokrývá 7-9 řádů (pmol-mmol) Výhody analýzy metabolomu: • Počet metabolitů by měl být nižší než počet genů a proteinů v buňce, S. cerevisiae (6000 genů, 600 metabolitů) • Teorie MCA (Metabolic Control Analysis) říká, že ačkoliv koncentrace enzymu a metabolického toku není signifikantně změněna v průběhu biochemické reakce, koncentrace metabolitu se může výrazně měnit • Metabolom je produktem genové exprese – odráží funkční hladiny přesněji než genová exprese, a změny v hladinách metabolitů jsou násobně vyšší než změny exprese, případně koncentrace proteinů • Experimenty ukazují, že změny hladin metabolitů jsou dány nejen úrovní exprese, ale i enviromentálními stresy a proto přesněji popisuje status daného organismu • Cena metabolomického experimentu je výrazně nižší (2-3x) 7
Převzato z Musilová and Glatz 2011
8
Počty vědeckých publikací (dle WOS 10.11.2008) Počet publikací o metabolomice či metabonomice
Počet publikací obs. termín METABOLOM
450
140
400
120
350 100 počet
počet
300 250 200 150
80 60 40
100 20
50
0
0 2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
2008
rok
rok
Počet publikací obsahujících termín TRANSKRIPTOM
Počet publikací obs. termín GENOM
1200
16000 14000
1000
12000 800 počet
8000
600
6000 400 4000 200
2000
rok
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
0 1990
počet
10000
0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 rok
9
Metabolomika
Fiehn (2002) rozčlenil metabolomiku na:
•
•
•
Cílená analýza (target analysis), kvalitativní i kvantitativní - substrát nebo produkt jediného enzymu Určení metabolického profilu (metabolic profiling) – kvantitativní analýza predefinovaných metabolitů Vlastní metabolomika – analýza „kompletního“ souboru metabolitů 10
Převzato z Goodacre et al. (2004) Trend. Biotechnol
11
Analytické metody Extrakční a purifikační metody K zastavení všech metabolických procesů a zmrazení vzorků je vhodný tekutý dusík. Extrakční proces má zajistit pokud možno kvantitativní převedení analytu či analytů z původní matrice (rostlinné pletivo, semena, plody, buněčná kultura) do rozpouštědla. Požadavky na extrakční proces u cílené analýzy jsou – efektivita (účinnost), jednoduchost, rychlost, časová a finanční nenáročnost. U metabolomické analýzy – PŘEDEVŠÍM UNIVRZÁLNOST A ROBUSTNOST (změny metab profilu) Dále je třeba zabránit tepelné, enzymatické, světelné a oxidační degradaci analytů. Vše udržet v roztoku!!! – sorpce na povrch sraženiny Prostá extrakce • Vodné pufry, vodné roztoky minerálních či organických kyselin • extrakční směsi (vodné roztoky organických rozpouštědel – definované složením, pH příp iontovou silou) • čistá organická rozpouštědla, org. rozpouštědla s upraveným pH. • HOMOGENIZÁTORY!!!, Sonikace, chemická, fyzikální či enzymatická lyze
12
Převzato z Musilová a Glatz 2011
13
Extrakční metody Extrakce na pevné fázi (SPE)
Sorbenty pro SPE •Klasické C18, C8 (omezený rozsah pH!) •Sorbenty ionexového typu (SCX, DEAE-) •Mixed-mode sorbenty (MAX, MCX) •Sorbenty polymerního typu nahrazující C18, C8 (pH 1-14), separace i podle Mr •Speciální sorbenty (PuriPon – proteiny, oligonukleotidy, NK) •Afinitní sorbenty (boronátové – nukleotidy, imunoafinitní) 14
Extrakční metody
Výhody: • Vysoce selektivní (afinitní), snadná optimalizace • Možnost důkladného odsolení (C18) • Účinná prekoncentrace (diskové nosiče) • Některé sorbenty možno regenerovat a používat až do totálního mechanického poškození (ucpání) • Možnost kombinace sorbentů (DEAEnosič s C18 apod.) – frakcionace • Možnost automatizace (viz obrázek)
15
Extrakční metody SPE
Nevýhody: •Některé kolonky pouze na jedno použití (MAX, MCX) • Nutnost optimalizace (neexistuje univerzální řešení) volba organických rozpouštědel, • pH a složení pufrů, objemy pro dávkování – promývaní - eluci 16
Superkritická fluidní extrakce Superkritická fluidní extrakce (SFE) Extrakce analytů z matrice plynem v nadkritickém stavu ( oxid uhličitý - teplota >31°C a tlak >73 atm). CO2 má takto vlastnosti kapaliny i plynu a to poskytuje ideální podmínky pro rychlé extrakce s maximální výtěžností. Regulací tlaku a teploty lze měnit sílu a hustotu nadkritické kapaliny a tím se dosahuje vlastností organických rozpouštědel v rozsahu od chloroformu přes dichlormetan po hexan. Variabilní síly rozpouštědla můžeme využít pro čištění, extrakci, frakcionaci či rekrystalizaci široké řady materiálů. Vhodná zejména k extrakci lipofilních látek. CO2 nepolární - přidává se při extrakci polárních látek k nadkritické kapalině polární rozpouštědlo (tzv. modifikátor). Kombinací tlaku/teploty/modifikátoru může nadkritický CO2 rozpustit širokou oblast polárních i nepolárních sloučenin. 17
Superkritická fluidní extrakce
18
Superkritická fluidní extrakce Superkritická tekutina: • Tlak i teplota překročí kritické hodnoty • Fyzikální vlastnosti tvoří přechod mezi vlastnostmi plynů a kapalin • Hustota je blízká kapalinám = dobré rozpouštěcí schopnosti • Difuzní konstanta blízká plynům = rychlý přesun hmoty • Viskozita nižší než u kapalin = vyšší extrakční účinnost Nízké povrchové napětí = snadná penetrace materiálu
19
Superkritická fluidní extrakce
Výhody SFE • Šetrná technika • V ideálním případě bez použití org. rozpouštědel • Ekologicky nezávadná • Levná a rychlá • Možnost automatizace • Ovlivnění solvatační síly pomocí tlaku
20
Superkritická fluidní extrakce
Nevýhody: Méně vhodná pro polární sloučeniny Náročnější přístrojové vybavení Méně vhodná pro extrakci listů Problematická optimalizace metody Obtížné extrakce čerstvého materiálu (obsah vody) 21
Mikrovlná extrakce Mikrovlnná extrakce (MAE) Mikrovlnná extrakce organickými rozpouštědly. Jedná se o proces využívající mikrovln k ohřevu rozpouštědla nebo složek matrice. Doba extrakce je závislá na typu a teplotě rozpouštědla (minuty). V zásadě jsou možné dva přístupy. V prvním případě se extrakce provádí v uzavřené nádobě, ketrá neabsorbuje mikrovlny. V této nádobě je extrakční rozpouštědlo, které má vysokou dielektrickou konstantu, a proto silně absorbuje mikrovlny. V druhém případě se používá rozpouštědlo, které neabsorbuje mikrovlny (nízká dielektrická konstanta) a otevřená nádobka, která neabsorbuje mikrovlny. V tomto případě vzorek, který obsahuje složky s vysokou dielektrickou konstantou (voda či další složky) absorbuje mikrovlny sám, místní ohřátí způsobuje, že složky vzorku jsou extrahovány do okolního chladného rozpouštědla – tepelně šetrnější extrakce. Výhody: • Kratší extrakční časy • Nižší spotřeba rozpouštědel 22
Analytické metody Purifikační metody: V metabolomice omezené použití – selektivita metody je nevyhovující – příliš velké zjednodušení směsi metabolitů na základě fyzikálně-chemických vlastností Příprava vzorků pro metabolomiku: • pokud možno bez purifikace • Obtíže u stopových analýz • Velké množství kontaminantů vyskytujících se ve vyšších koncentracích
23
Analytické metody Derivatizace Převedení analytu chemickou reakcí na její derivát s požadovanými vlastnostmi. • Větší těkavost (GC), vneseni chromoforu, fluorochoru - absorbce UV.záření (UV), fluorescence, barevnost (VIS) • Změna polarity/hyrdofobicity, změna molekulové hmotnosti (MS) • Příklady: pentafluorobenzylace, permethylace, trimethylsilylace (těkavost), benzoylace (chromofor – polyaminy), dansylace (fluorochor), tvorba 2,4-dinitrofenylhydrazonů s karbonyly (barevné), esterifikace cytokininů (hydrofobicita, změna molekulové hmotnosti) • OBECNĚ – hledáme funkční skupiny – aminy, hydroxy skupiny, karbonyly, karboxyly….
• V metabolomice – kombinace několika přístupů (několik derivatizačních činidel současně, kombinace více rozpouštědel – nevýhoda – vysoké pozadí – příliš mnoho chemie škodí! 24
Analytické metody
• LC, GC, CE s UV/VIS nebo MS detekcí • FT/ICR/MS – Fourier-transform ion cyclotron resonance • NMR
25
GC-MS, LC-MS GC-MS • •
• • • •
Separace těkavých látek, kolony, teplotní gradient Derivatizace – všechny molekuly netěkavé, či termolabilní musí být derivatizovány. Obecně se derivatizuje dvoukrokově. V prvním kroku se modifikují karbonylové skupiny na oximy (O-alkyhydroxylaminy) a poté se silylují – trimethylsilylace pokrytí vyměnitelných protonů TMS deriváty nejsou stálé – na vzduchu hydrolyzují – intenzivní sušení ve vakuu však může vést ke ztrátě velmi těkavých látek (kys. mléčná) Stacionární fáze – DB-5 nebo DB-50) Ionizace nárazem elektronů či chemická ionizace (EI, CI) Analyzátory kvadrupólové, lépe však analyzátory doby letu - TOF
• GC-TOF mají rozlišení až do 1s rozdílu v ret časech LC-MS • • • •
RP-HPLC, UPLC Ionizace elektrosprejem, chemická ionizace za atmosférického tlaku (ESI, APCI) Typy hmotnostních analyzátorů – kvalitativni a kvantitativní analýza Feeding experimenty - 13C – proteinogenní AK - Deutetium in vivo labeling
26
In vivo deuterium labeling
335 336 337 338
27
LC-ESI-MS
28
LC-ESI-MS
29
LC-ESI-MS/MS – tandemová hmotnostní spektrometrie
• mody QqQ •Citlivost versus identifikace (informační obsah,MS/MS experimety u ion-trap, ICR-MS, magnet, TOF- exact mass determination) 30
UPLC-MS/MS phytohormone profiling
31
TOF a Q-TOF • Ionty analyzovány v analyzátoru doby letu (t (m/z)1/2) • určení přesné hmoty – sumární vzorec •Q-TOF předseparace pomocí kvadrupólového analyzátoru
32
Identifikace látek pomocí MS – kolizní spektra
33
Identifikace látek pomocí MS – exact mass determination 4.67
4.39
A
B
MRM ES+ 404 > 272 m/z
MRM ES+ 404 > 272 m/z
31
100
C
MS ES+ 404 m/z
404.1574
31 Mass: 404.1574 Calc. mass: 404.1570 PPM: 1.0
%
%
%
3.66
Formula: C18 H22 N5 O6
34
405.1506 0 2.00
100
4.00 Time
272.0965
D
0 2.00
6.00
MSMS ES+ 404 m/z
4.00 Time 100
0
6.00
E
404
272.0913
MSMS ES+ 404 m/z
412
m/z
F
OCH3 OH
136.0522
m/z 136
%
H
%
N
N
N
N
N
137.0535 0 120
160
200
273.1084 240 280 m/z
320
136.0637
404.1296
360
400
HO
0
O
OH OH
120
160
200
240 280 m/z
320
360
400
m/z 272
34
Zpracování dat hmotnostně-spektrometrické analýzy • Každá analýza nese informaci o m/z, retenčním čase a intenzitě (distribuce izotopů) • Prvním krokem je převedení dat do metabolomického – univerzálního formátu (každý přístroj má vlastní datový formát) • Následuje filtrace – odstraňuje nespecifický (chemický a systémový šum), drift základní linie • Výběr reprezentujících iontů ze surového signálu (feature detection) • Zarovnání (vnitřní standardy retence) • Normalizace – odstraňuje nežádoucí systematické variace mezi vzorky (důležité náhodné pořadí vzorků) 35
Příklady experimentů z oblasti plant science Manneti JXB 2006 Model – kukuřice je nejhojněji pěstovaná plodina, využívaná k evaluaci chemických, fyzikálních a environmentálních faktorů a v genetice. GMO – toxiny produkované Gram-pozitivní bakterií Bacillus thuringiensis (Bt) působí proti hmyzu (Cry1Ab) – selektivně vůči motýlům a můrám Studie zaměřena na studium změn metabolismu rostlin po ko-kultivaci s GMO (transgen přenesen na potomstvo) Postup: semena byla homogenizována v tekutém dusíku, L-L (Methanol/voda/chloroform), vysušení, rozpuštění v měřícím roztoku, NMR (podle knihovny chemických posunů) Výsledky: práce odhalila změny hladin široké škály metabolitů – zejména osmolytů (polyoly, karbohydráty, methylaminy) a aminokyselin
36
Příklady experimentů z oblasti plant science Robinson JXB 2005 Model: topol (Populus tremula x alba), wt a dvě linie s modifikovaným složením ligninu (hydroxylasy) Lignin – aromatický biopolymer ovlivňující vaskulární integritu a pevnost dřeva. V papírenském průmyslu nežádoucí, žádoucí ve stavebnictví, výrobě nábytku apod. Postup: Homogenizace v zařízení pro přípravu zubního amalgámu (v nekutém dusíku, extrakce (methanol/chloroform – navrženo pro Arabidopsis) – přídavek polárního (ribitol ve vodě) a lipofilního (methylester nonadekanové kyseliny) standardu. Derivatizace – trimethylsilylace. GC-MS – analyzovány aminokyseliny, karbohydráty, intermediáty biosyntézy ligninu, organické kysliny Výsledky: Byly identifikovány skupiny metabolitů, jež jsou/nejsou ovlivněny danou mutací. Hladiny aminokyselin a metabolitů s nimi souvisejících nebyly mutací ovlivněny. Na straně druhé byly pozorovány signifikantní rozdíly v profilech karbohydrátů pomocí nichž je možno fenotypické změny popsat. 37
Matabolomika v klinice • 1. 2. 3. 4. 5. 6. •
Studium metabolomu může v humánní medicíně napomoci: Vyhledávání biomarkerů onemocnění (určení diagnózy) Kontrola terapie Evaluace odezvy na terapii Vývoj léčiv Toxikologie farmakologie V preklinických testech může metabolomika napomoci vyhledat biomarkery toxicity a účinnosti, ketré mohou být následně sledovány v průběhu klinického testování
38
Závěr Směr a cíle dalšího rozvoje metabolomiky (rostlin): 1. Vylepšit pokrytí metabolomu rostlin 2. Zajistit srovnatelnost dat mezi laboratořemi 3. Zajistit integrovatelnost metabolomických dat s daty genomickými a proteomickými Směr a cíle dalšího rozvoje metabolomiky v klinice: 1.-3. 4. Urychlit proces identifikace (nejpomalejší krok) 5. Zvýšit citlivost měření NMR (mmol-mmol) 6. Syntéza interních STD pro přesnou kvantifikaci (nevýhoda proti NMR)
39
