UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. katedra farmaceutické technologie. studijní program: farmacie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ katedra farmaceutické technologie studijní program: farmacie

Sublingvální in vitro průnik kyseliny listové jako vitamínu. Sublingual in vitro penetration of folic acid as vitamin.

Diplomová práce Martina Špiritová

Školitel: doc.RNDr. Pavel Doležal,CSc. Hradec Králové, květen 2010

Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškeré informační zdroje, z nichţ jsem při vypracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v textu řádně vyznačeny. V Hradci Králové dne

-----------------------

Děkuji doc. RNDr. Pavlu Doleţalovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady a veškerou

pomoc

při

experimentech,

následném

zpracování

dat

a vypracování diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Pavlu Berkovi a Mgr. Moridu Mahmoudi Majdovi za pomoc poskytovanou během experimentů a samotném měření.

Obsah 1 2 3

Úvod Cíl práce Teoretická část 3.1 Stručná morfologie jazyka

3 4 5 5

3.1.1 Sliznice jazyka

5

3.1.2 Řasy a svaly jazyka

5

3.1.3 Nervové a cévní zásobení jazyka

6

3.2

Sublingvální podání látek

6

3.3

Vitamíny v obecné formě

7

3.4

Vitamíny rozpustné v tucích

10

3.4.1 Vitamín A (retinol, axeroftol),

10

3.4.2 Vitamín D (ergokalciferol a cholekalciferol)

11

3.4.3 Vitamín E (tokoferol, α-tokoferol acetát)

13

3.4.4 Vitamín K

14

3.5

Vitamíny rozpustné ve vodě

15

3.5.1 Vitamin B1 (thiamin, aneurin)

15

3.5.2 Vitamin B2 (riboflavin, laktoflavin)

17

3.5.3 Vitamín B3 (vitamín PP, niacin, kyselina nikotinová)

18

3.5.4 Vitamín B5 (kyselina pantotenová)

19

3.5.5 Vitamín B6 (pyridoxin)

20

3.5.6 Vitamín B7 (biotin, vitamín H)

21

3.5.7 Vitamín B9 (kyselina listová)

21

3.5.8 Vitamín B12 (kyanokobalamin)

22

3.5.9 Vitamín C (kyselina askorbová)

23

3.6

Kyselina listová jako jeden z vitamínů

25

3.6.1 Chemická struktura kyseliny listové

25

3.6.2 Fyzikální a chemické vlastnosti kyseliny listové

26

3.6.3 Farmakokinetika

27 1

3.6.4 Fyziologické funkce

28

3.6.5 Zdroje kyseliny listové

29

3.6.6 Faktory, které omezují vstřebávání kyseliny listové, ovlivňují hladinu či aktivitu kyseliny listové 30

4

3.6.7 Doporučené denní dávky kyseliny listové

31

3.6.8 Hypovitaminóza a avitaminóza kyseliny listové

31

3.6.9 Hypervitaminóza kyseliny listové

32

3.7

Kyselina listová jako prevence vrozených vývojových vad

32

3.8

Vliv kyseliny listové na kardiovaskulární systém

35

Experimentální část 4.1 Suroviny a materiál

36 36

4.2

Přístroje

37

4.3

Biologický materiál

37

4.4

Příprava roztoku s azidem sodným

38

4.5

Příprava roztoku pro trypsinizaci

38

4.6

Příprava mobilní fáze pro stanovení kofeinu

38

4.7

Příprava mobilní fáze pro kyselinu listovou

39

4.8

Příprava fosfátového (akceptorového) pufru

39

4.9

Příprava kofeinových standardů (suspenze a roztok)

40

4.10

Příprava tromethamolového pufru

40

4.11

Příprava vehikul pro kyselinu listovou

41

4.12

Provedení permeačních pokusů

42

5 6 7 8 9 10 11

Dokumentace Výsledky a diskuse Závěry Abstrakt Abstract Pouţité zkratky a symboly Literatura

43 87 93 95 96 97 98

2

1 ÚVOD Výzkum sublingválního podání léčiv probíhá na UK FAF v Hradci Králové teprve druhým rokem, předkládaná diplomová práce je proto součástí pilotní studie k podání léčiv aplikační cestou tohoto typu. Ke studiu sublingválního podání léčiv byl pouţit kofein jako permeační marker a kyselina listová jako modelové léčivo. Sublingvální aplikace léčiv se jeví jako relativně nová, potenciálně atraktivní metoda při podání některých léčiv. Některé poznatky o tomto typu podání jsou známy jiţ z minulosti. Nové technologické postupy a farmaceutické excipienty umoţňují vyuţít tuto cestu podání novými aplikačními prostředky. Práce přináší řadu prvotních dat, které se mohou stát součástí podkladů pro další výzkum tohoto typu podání či pro další diplomanty.

3

2 CÍL PRÁCE

1.

V teoretické části podat stručný přehled o sublingvální aplikační cestě

pro podání léčiv. V kontextu s navazujícím experimentem charakterizovat jednotlivé skupiny vitamínů a samotné moţné vyuţití kyseliny listové jako vitamínu.

2.

V experimentální části:

2.1 Porovnat hodnoty fluxu při pouţití kofeinu jako permeačního markeru a kyseliny listové jako modelového léčiva. Dílčím úkolem je zhodnocení vlastností a) samotné intaktní sublingvální membrány, b) sublingvální membrány zmraţené a uchovávané při -20 °C c) trypsinizované membrány 2.2 Vyhodnocení sublingválního průniku kyseliny listové z 5 zadaných vehikul různé polarity a disperzní struktury.

4

3 TEORETICKÁ ČÁST Jazyk (lingua – glossa) je pohyblivý svalový a slizniční orgán umístěný ve spodině dutiny ústní. Jeho tvar odpovídá tvaru dutiny ústní. Podílí se na zpracování potravy během procesu ţvýkání a posouvání potravy do hltanu při polykání. U člověka slouţí jazyk téţ k tvorbě řeči, u ţivočichů spolupůsobí při vyluzování zvuků. Jazyk je jedním ze smyslových orgánů, na své sliznici obsahuje četné chuťové pohárky, ale má také hmatovou a teplotní citlivost.1,2

3.1 Stručná morfologie jazyka1,2 Základní struktura jazyka je tvořena tělem jazyka (corpus linguae), která je dělena na přední část jazyka, jenţ je pohyblivá a zadní část jazyka (kořen radix linguae), jímţ je jazyk připojen k ústní spodině. Tělo jazyka vybíhá dopředu jako hrot (apex linguae). Horní a spodní plocha jazyka do sebe přecházejí okraji (margines linguae). Ve střední rovině leţí uzdička (frenulum linguae), kterou se jazyk spojuje se spodinou ústní dutiny. 3.1.1 Sliznice jazyka

Povrch jazyka kryje sliznice, která má odlišnou úpravu na hřbetu a spodní části. Sliznici pokrývá nerohovějící vrstevnatý dlaţdicový epitel. Sliznice jazyka vybíhá v drobné četné výrůstky nazývané slizniční papily, kterých je několik typů. Například jsou to papily hrazené, houbovité, listovité a nitkovité. Na sliznici jazyka se také nacházejí chuťové pohárky, kterých je celkem 20, a jsou uloţeny ve stěně epitelu. 3.1.2 Řasy a svaly jazyka

Na spodní ploše jazyka jsou 3 podélné slizniční řasy. Dorzolaterálně od hrotu probíhá párová třásňovitá řasa, jenţ je jako vývojový zbytek slizničního jazyka, na niţ ústí slinná ţláza smíšeného typu. Od báze uzdičky po spodině

5

dutiny ústní je dorzolaterálně uloţena párová podjazyková řasa. Podkladem jazyka jsou příčně pruhované vnější - extra a vnitřní - intraglosální svaly. 3.1.3 Nervové a cévní zásobení jazyka

Jazyk má bohatou nervovou i cévní inervaci. Jazyk je inervován senzitivně, senzoricky a motoricky. Na jeho nervovém zásobení se podílejí 4 hlavové nervy: nervus lingualis, nervus glossopharyngeus, nervus vagus, nervus hypoglossus. Sliznice jazyka je senzitivně inervována dvěma nervy. Přední část je inervována pomocí nervus lingualis, který odvádí především mechanické a termické podněty. Proto jazyk slouţí jako významný hmatový orgán. Oblast kořene jazyka je senzitivně inervována prostřednictvím nervus glossopharyngeus a nervus vagus. Mezi senzorickou inervaci jazyka patří chuťové pohárky, které jsou rozptýleny na sliznici jazyka. Uvnitř chuťových pohárků se nacházejí smyslové chuťové buňky. Smyslové buňky pohárků jsou schopny registrovat 4 základní vjemy: sladké, slané, kyselé a hořké. Motorická inervace je zprostředkována pomocí nervus hypoglossus. Autonomní inervace pomocí pregangliových vláken parasympatiku zajišťuje sekretorickou inervaci ţláz a postgangliová vlákna sympatiku vedou také k příslušné slinné ţláze. Cévní zásobení jazyka zahrnuje tepny, ţíly a mízní cévy. Spodina dutiny ústní je soubor tkání, jenţ vyplňuje podkovovitý prostor těla dolní čelisti. Součástí jsou také svaly jazyka. Tato oblast jazyka je velmi bohatě prokrvena. 3.2 Sublingvální podání látek1 Sublingválním podáním označujeme podání pod jazyk. V této oblasti jazyka se nachází velmi bohaté krevní zásobení jazyka a epiteliální výstelka je poměrně tenká. Díky tomuto můţe látka poměrně rychle difundovat do kapilární sítě a vstupovat přímo do systémové cirkulace. Pokud je takto podáno léčivo, tak dochází k tomu, ţe léčivo míjí játra a není částečně 6

inaktivováno jaterním metabolismem (tzv. „first pass effect“ jater – efekt prvního prostupu játry). Tento efekt je velmi významný u řady léčiv po perorální aplikaci- např. nitroglycerin, buprenorphin, nikotin. Pomocí toho dojde k velmi rychlému nástupu účinku léčiva, obvykle do 2 minut po podání. V této oblasti jazyka se téţ nachází lipidová membrána, toho je také vyuţíváno pro přestup lipofilních látek.

3.3 Vitamíny v obecné formě Vitaminy jsou organické esenciální látky. Jedná se zpravidla o látky exogenního původu, coţ znamená, ţe lidský organismus si většinu vitamínů nemůţe vyrobit sám, anebo je vytváří v nedostatečném mnoţství, a proto je musí přijímat z vnějšího prostředí. Tato definice neplatí úplně pro všechny druhy vitamínů. Vitamin K je syntetizován u lidí ve střevě a nemusí být v dostatečném mnoţství v potravě. Vitamin D také vzniká částečně v lidském organismu a to v kůţi při působení UV záření. Jsou to látky, které patří k základním sloţkám lidské potravy. Právě potrava se stává pro člověka nejdůleţitějším zdrojem vitamínů. Člověk je přijímá buď ve formě jiţ samotných vitamínů, nebo ve formě tzv. provitamínů. Provitamíny jsou látky, které se na vlastní účinnou formu vitamínu přeměňují aţ v lidském organismu. Mezi tzv. provitamíny patří například beta-karoten, který se můţe měnit na vitamin A nebo provitamin vitaminu D. Vitamíny jsou primárně produkovány autotrofními organismy. Nejčastěji rostlinami, ale i houbami nebo bakteriemi. Našli bychom i vitamíny, které jsou syntetizovány v heterotrofních organismech, ovšem jiného typu. V rámci těchto biochemických pochodů ovšem vznikají i jiné látky, které ovšem nepokládáme za vitamin a to z toho důvodu, ţe ho daný heterotrof nepotřebuje.3 Kaţdý vitamin má v lidském organismu svoji funkci a nelze nahradit zvýšeným příjmem jednoho vitamínu, sníţený příjem vitamínu druhého. Vzhledem k tomu, ţe struktura jednotlivých vitaminů je velmi různorodá, jsou různé i funkce, které v organismu plní. Vitamíny jsou obecně 7

označované jako biokatalyzátory chemických reakcí. Zpravidla působí jako kofaktory enzymů nebo mohou mít funkci ko-enzymů. Při této funkci se zúčastní volné vitaminy, které jsou schopné přijímat určitou skupinu. Například tetrahydrolistová kyselina, která se zúčastní při přenosu jednouhlíkatých zbytků.

Některé

vitamíny

mají

i

antioxidační

aktivitu.

Například

vitamíny A, C, E. V lidském organismu mají úlohu zhášečů volných radikálů. Vitamíny hrají významnou úlohu při procesech vstřebávání a výměny látek mezi vnějším prostředím a ţivým organismem. Podílejí se na metabolismu cukrů, tuků i bílkovin. Jsou nezbytné pro reprodukci, metabolismus, pro vznik, normální vývoj a zachování ţivota lidského organismu. Vitamíny také poskytují celkovou ochranu organismu. Ovšem vitamíny nemají funkci stavebního materiálu a ani nejsou zdrojem energie. Tímto se vitamíny odlišují od vitagenů, jenţ plní funkci stavebních jednotek tkání a jsou zdrojem energie. Mezi vitageny patří například esenciální mastné kyseliny, esenciální aminokyseliny, cholin, betain nebo methionin.3,4,5 Vitamíny se nacházejí v organismu zpravidla ve velmi malých dávkách a z toho lze i konstatovat, ţe jejich příjem nemusí být velký. Zpravidla stačí dodrţet správný příjem vybrané potravy, která je bohatá na konkrétní vitamin. Pokud je strava pestrá, lze z ní získat všechny potřebné vitamíny v dostatečném mnoţství, odpovídající doporučeným denním dávkám vitamínů. Odborníci doporučí tzv. doporučené denní dávky vitamínů = referenční příjem ţivin, který je dostatečný pro 97 % lidské populace. Individuální nároky kaţdého jednotlivce se ovšem budou trochu lišit. Jiné mnoţství budou přijímat děti, těhotné a kojící matky, anebo nemocní lidé. Právě tyto situace zpravidla vyţadují zvýšený příjem některých vitamínů.6 Referenční příjem ţivin je zpravidla určován pro zdravého dospělého jedince. Při příjmu vitamínů mohou nastat dvě krajní situace, pramenící z nedostatku či naopak nadbytku toho daného

vitamínu.

Částečný

nedostatek

daného

vitamínu

označujeme

termínem hypovitaminóza. Jedná se o mírnější formu avitaminózy. Termínem avitaminóza se označuje komplexní nedostatek vitamínů. Nedostatek můţe být 8

způsoben několika faktory. Nedostatečným příjmem, poruchou absorpce nebo tvorby v gastrointestinálním traktu, zvýšenými nároky organismu, poruchou ţaludeční sekrece, například u vitamínu B12 nebo působením antivitamínů. Nedostatek vitamínů se projevuje nespecifickými příznaky. U kaţdého vitamínu je

jiný.

Zvýšený

příjem

vitamínů

označujeme

jako

hypervitaminóza.

Hypervitaminóza obvykle nehrozí z potravy, ale spíše ze zvýšeného příjmu potravinových vitamínových doplňků. Projevuje se neţádoucími účinku na náš organismus a v některých případech můţe působit i toxicky. Větší riziko hypervitaminózy hrozí u vitamínů rozpustných v tucích, které se ukládají v našem organismu. Menší riziko je u vitamínů rozpustných ve vodě, kdy zvýšená

hladina

vitamínu

vede

k vyloučení

daného

vitamínu

z těla.7

U antioxidačně působících vitamínů vedou zvýšené dávky ke zvratu účinku a to na prooxidační. Zároveň dochází ke sníţení jejich vstřebávání a vyuţitelnosti uvnitř organismu. Z toho vyplývá, ţe je vhodnější přijímat vitamíny několikrát denně v niţších dávkách. Vitamíny jsou látky, po chemické stránce velmi rozmanité struktury. Vedle názvu bývají označovány často i písmeny, eventuálně i číselným indexem. Vitamíny se dělí do dvou základních skupin podle svých fyzikálně – chemických vlastností. A to především dle jejich rozpustnosti ve vodě a v lipidech.6 Vitamíny rozpustné v tucích. Jejich absorbce probíhá ve střevě a je závislá na sekreci ţluči a obsahu tuku v gastrointestinálním traktu. Tato skupina vitamínů můţe vytvářet v organismu depo, a proto není nutné u zástupců této skupiny jejich pravidelný příjem. Vzhledem k faktu, ţe mohou vytvářet v organismu depo, můţe být jejich nadbytek příčinou mnoha neţádoucích účinků a v krajním případě mohou působit aţ toxicky. Do této skupiny vitamínů patří vitaminy A, D, E a K.6 Vitamíny rozpustné ve vodě se aţ na některé výjimky v lidském organismu neukládají. Jejich zásoby tedy vydrţí na kratší dobu, a proto je 9

nutný jejich pravidelný přísun. Vitamínem z této skupiny, který se ukládá je vitamin B12, který má depo v játrech. Patří sem skupina vitaminů B a vitamin C.6

3.4 Vitamíny rozpustné v tucích 3.4.1 Vitamín A (retinol, axeroftol)8,9

Tento vitamín se vyskytuje v přírodě ve dvou formách - jako retinoidy, které se nachází pouze v ţivočišných zdrojích a dále ve formě karotenoidů (provitaminů

vitaminu

A),

z

nichţ

nejvýznamnější

je

beta-karoten.8

Biotransformace tohoto vitamínu vychází z retinolu (vitamin A), který je reverzibilně přeměněn na retinal (aldehyd retinolu). Právě retinal je výchozí látkou pro oční purpur. Zde je vázán na protein opsin v tyčinkách sítnice a vytváří společně rodopsin. Působením fotonů přechází retinal z cis- do trans-formy. Tato reakce je reversibilní. Touto přeměnou dochází k aktivaci receptorového proteinu. Dochází k uvolnění trans-retinalu a opsinu. Odštěpený retinal je pak znovu přeměněn na cis-formu, která můţe reagovat s volným opsinem a cyklus se můţe opakovat.10 Retinal můţe být dále oxidován na kyselinu retinovou. Tato oxidace je ovšem ireverzibilní. Karotenoidy jsou provitamíny, pocházející z rostlin. Jedná se zpravidla o ţlutá rostlinná barviva. Po absorpci v gastrointestinálním traktu jsou přeměňovány na vitamin A. Nejúčinnějším zástupcem karotenoidů je beta-karoten. Ten má funkci provitaminu, ze kterého vzniká vitamín A. Dalšími zástupci je lykopen, xantofyl, ze kterých ale vitamín A nevzniká.9 Vitamin A je absorbován téměř komplexně z gastrointestinálního traktu. Pokud by došlo k příjmu velmi vysokých dávek tohoto vitamínu, odchází část stolicí. Absorpce je v tomto případě usnadňována přítomností tuků a ţluči. Zejména rostlinných, které jsou přítomny v potravě. Nutno podotknout, ţe není 10

absolutní nutností přítomnost těchto sloţek pro absorpci toho vitamínu, jak je tomu například u jiných v tucích rozpustných vitamínů. Ještě ve střevní stěně je vitamín esterifikován a hydrolyzován. Problém v tomto případě nastává u pacientů, kteří mají těţkou poruchu jater. Co se týče provitamínů karotenoidů, jsou absorbovány hůře. Zde musí být přítomnost ţluči a tuků. Vlastní aktivní formy vitamínu vzniká uţ ve střevě. Vitamín A je v lidském organismu ukládán z větší části v játrech, menší část bychom našli v ledvinách a v tukové tkáni.9 Zdrojem vitamínu A jsou játra, mléčné výrobky, tučné mořské ryby, červené a ţluté ovoce a zelenina (meruňky, mrkev, paprika, rajčata). Funkce vitamínu A, jak uţ bylo zmíněno, je důleţitá pro správné vidění za šera i správnému vidění barev. Pro růst a diferenciaci epiteliálních tkání. Důleţitou roli hraje také při dozrávání spermií a vajíček. Příznaky hypovitaminózy jsou zpomalení adaptace za šera. Dochází také k vysychání sliznic, můţe dojít k poškození rohovky a stav můţe skončit oslepnutím. A právě avitaminóza vitamínu A je nejčastější příčinou slepoty a celkového poškození organismu u dětí v zemích třetího světa. Můţe dojít k atrofii epitelu sliznice, sníţení reprodukční schopnosti, zpomalení aţ zástava růstu. Hypervitaminóza

se

můţe

projevovat

poškozením

jater

(hepatosplenomegalie), suchou kůţí, vypadáváním vlasů, poškozením a bolestivostí kloubů, můţe také dojít k poškození plodu. Nutno podotknout, ţe beta-karotenem se na rozdíl od vitamínu A nelze předávkovat, protoţe se zvyšujícím se příjmem se vstřebávání beta-karotenu sniţuje. Projeví se pouze oranţovým zabarvením kůţe. 3.4.2 Vitamín D (ergokalciferol a cholekalciferol)8,9

Jinak je také tato látka označována jako antirachitický vitamín. Rozlišujeme

dvě

základní

látky

a

to

ergokalciferol

(vitamín

D2)

a

cholekalciferol (vitamín D3). Vitamin D2 pochází z rostlinných zdrojů. Člověk ho 11

přijímá potravou. Vlastní vitamín D2 vzniká ozařování rostlinného ergosterolu pomocí ultrafialového záření. Dochází k rozštěpení k jedné z jeho vazeb a právě toto štěpení je nutnou podmínkou pro vznik antirachitické aktivity. Vitamín D3 vzniká z 7-dehydrocholesterolu, coţ je ţivočišný sterol, který je obsaţený například v kůţi. Pomocí UV záření z něj vzniká cholekalciferol. Takto vzniklé provitaminy musí být přeměny na vlastní účinnou formu vitamínu. Tento důvod vysvětluje i to, ţe účinek vitaminu D nastává aţ po určité době latence. Nejprve musí dojít k oxidaci. Ta probíhá v játrech. Zajímavostí je, ţe vysoká hladina vitaminu D tuto přeměnu sniţuje. Tento fakt je důleţitý pro ochranné opatření proti nadbytku aktivních metabolitů. Další oxidace meziproduktu probíhá v ledvinách. Zde vznikají dihydroxyderiváty, z nichţ je nedůleţitější 1,25-dihydroxyvitamín D označovaný jako kalcitriol. Právě tento poslední krok, který probíhá v ledvinách je místem přísné regulace. Ovlivňuje hladinu fosforu, vápníku i vitamínu D.11 Absorpce tohoto vitamínu je stejná jako u vitamínu A. Probíhá také přímo z gastrointestinálního traktu. Ale zde je právě nutná přítomnost ţluči a tuků. Přesněji tedy řečeno ţlučových kyselin, které vytvářejí micely, ze kterých je následně vitamín D přechází do buněk střevní sliznice. Opět jako u předchozího vitamínu je absorpce sníţena u pacientů s poruchou jater, či obstrukcí ikteru. Depo vytváří tento vitamín také v játrech, méně poté v ledvinách a kostech. Zdrojem vitamínu D jsou především mořské ryby (losos, tuňák, makrela), také bychom ho našli v máslu, mléku, ţloutku. Vitamín D zvyšuje absorpci vápníku a fosfátů v tenkém střevě. V kostech působí zvýšenou mobilizaci minerálních součástí kostí, způsobuje resorpci vápníku a přispívá tak ke zvýšení hladiny vápníku v plazmě. V ledvinách zvyšuje reabsorpci vápníku a fosfátů. Výsledný efekt působení v ledvinách závisí na velikosti dávky. Avšak nutno říci, ţe výsledný efekt je méně významný neţ ve střevě. Vitamín D reguluje plasmatickou hladinu vápníku. 12

Hypovitaminóza můţe být příčinou nedostatečného přívodu potravou, při nedostatku UV záření či při poruchách absorpce. Větší riziko hypovitaminózy hrozí v dětském věku, v těhotenství a laktaci, u potravinových extrémistů, malabsorpci, poruchách ledvin či u starých pacientů. Dojde k tomu, ţe se sníţí absorpce vápníku a fosfátů ze střeva. Sníţí se hladiny vápníku a fosfátů v plazmě, coţ vede ke stimulaci a sekreci parathormonu, který má výrazný osteolytický účinek a dochází k uvolnění vápníku a fosfátů z kostí do extracelulární tekutiny. Dochází k demineralizaci kostí, negativní vápníkové bilanci. Kosti měknou, jsou méně odolné vůči mechanické námaze, snadno se lámou a deformují, coţ je typickým obrazem křivice, která je častější u dětí. U dospělých pak dochází k osteomalacii, coţ je demineralizace kostí. Nadbytek vitamínu D vede k velmi váţné intoxikaci.9 Zvyšuje se hladina vápníku a fosfátů. Vzniká hyperkalcemie, lokalizovaná osteoporosa a zvýšeně se vylučuje vápník močí. Lidí jsou často unavení, dehydratovaní, bolí je hlava, zvrací či mají průjmy.11 Dochází ke kalcifikaci různých orgánů. Je výrazně porušena funkce ledvin. U dětí vede k zástavě růstu a můţe způsobit malformace plodu. 3.4.3 Vitamín E (tokoferol, α-tokoferol acetát)8,9

Je celkem známo 8 tokoferolů, které mají aktivitu vitamínu E. Existují celkem čtyři tokoferoly (alfa, beta, gama a delta tokoferol) a čtyři tokotrienoly (alfa, beta, gama a delta tokotrienol). Jak je patrno, pro jejich rozlišení se uţívá předpon pomocí písmen řecké abecedy. Nejdůleţitější a nejúčinnějším z nich je α-tokoferol. Ostatní formy se od něj liší chyběním některých metylových skupin, nebo přítomností dvojných vazeb v postranním řetězci. Stejně jako ostatní v tucích rozpustné vitaminy, i tento je dobře absorbován z gastrointestinálního traktu. Zásoby, které v organismu vytváří, jsou velké, a proto hypovitaminóza vzniká velmi pomalu a není tolik častá jako u ostatních vitamínů.

13

Vitamín E bychom našly v listové zelenině, rostlinných olejích, ořechách, semenech a klíčcích rostlin, ţloutku, ale také lidské mléko je bohaté na vitamín E. Problémem je průmyslové zpracování surovin bohatých na tento vitamin. Dochází ke sníţení obsahu vitamínu. Například při rafinaci olejů, a proto je nutné poté přidávat k olejům vitamín E. Vlastní účinky tohoto vitamínu nejsou dnes přesně zcela známy. Předpokládá se, ţe má antioxidační působení. Chrání polynenasycené mastné kyseliny v membránách a tkáních.11 Hypovitaminóza tohoto vitamínu můţe mít vliv na funkci erytrocytů. Vede k jejich předčasnému zániku. Můţe způsobit poruchu funkce vaječníků a varlat a v krajním případě můţe vést aţ k neplodnosti. Dále se mohou objevit poruchy funkce svalů, svalová dystrofie, poruchy drţení těla.10,11 Hypervitaminóza není příliš častá. Můţe se projevovat průjmy, nevolností, zvracením. Můţe být zvýšena spotřeba vitamínů A a D a naopak sníţené vstřebávání vitamínů K a tím sníţené sráţení krve. 3.4.4 Vitamín K 9,10

Tímto termínem označujeme řadu naftochinonových derivátů, které mají původ syntetický i přírodní. Vitamínem K1 (fylochinon) obsaţený v rostlinné potravě, hlavně v zelených částech rostlin. Vitamín K2 (menachinon) je produkován střevními bakteriemi a právě z tohoto zdroje můţe být také vyuţit organismem. Vitamín K3 (menadion) a vitamín K4 (menadiol) jsou syntetického původu. Na rozdíl od předchozích dvou vitamínů vytváří ve vodě rozpustné soli. Pro absorpci toho vitamínu je nutná přítomnost ţluči, stejně tak jako u jiných v tucích rozpustných vitamínů. Ovšem vitamíny K3 a K4 ke své absorpci v gastrointestinálním traktu ţluč nepotřebují. Přechodně vytvořený vitamín se hromadí v játrech. Zásoby tohoto vitamínu ale nejsou velké.

14

Zdrojem tohoto vitamínu je zelená listová zelenina, bílé zelí, špenát, rajčata, brokolice. Vaječný ţloutek, luštěniny a také zelený čaj. Samozřejmě také střevní bakterie. Tento vitamín je důleţitý především pro aktivaci koagulačních faktorů tvořených v játrech. A to především faktory VII, IX, X a II. Podílí se tedy na sráţení krve. Pro aktivaci koagulačních faktorů je nutná redukovaná forma vitamínu, která právě vzniká v játrech. Ovlivňuje také tvorbu bílkoviny, které jsou odpovědné za vazbu vápníku v kostech. Hypovitaminóza se objevuje výjimečně. Potřeba je dostatečně kryta produkcí baktérií v tlustém střevě a příjmem potravin bohatých na tento vitamín. Vyskytuje se zpravidla u lidí, kteří mají sníţenou funkci jater, onemocnění ţlučových cest či poruchu vstřebávání tuků. Při vyhubení střevní mikroflóry, například při léčbě antibiotiky, je sice odstraněn zdroj vitaminu K, ale v potravě je ho dostatečné mnoţství. Pokud by tento stav nastal, projevil by se poruchou sráţení krve. Postiţení jedinci by měli dlouhou dobu sráţení. Snadno se jim tvoří krevní podlitiny a výrony, bez známé příčiny. Skutečná hypervitaminóza tohoto vitamínu asi neexistuje. Vitamíny K1 a K2 jsou prakticky netoxické. Ovšem riziko hrozí u vitamínů K3 a K4, které mohou mít celou řadu toxických účinků. Mohou způsobit hemolytickou anémii, hyperbilirubinemii a jádrový ikterus u novorozenců. U novorozenců podáváme vţdy přirozený vitamín K, tedy K1 a K2.

3.5 Vitamíny rozpustné ve vodě 3.5.1 Vitamin B1 (thiamin, aneurin)12,9

Účinná forma toho vitamínu je

thiaminpyrofosfát (TPP). V této

fosforylované formě je koenzymem karboxylasy. Je nutný pro aerobní oxidativní dekarboxylaci pyruvátu.11 Vitamin B1 se absorbuje uţ v proximální části trávicího traktu aktivním transportem, ale i pasivní difúzí. Mnoţství vitamínu, které bude absorbováno, záleţí na podané dávce. Malé podaná 15

dávka se absorbuje lépe, neţ velká. Thiamin je poté v organismu enzymaticky přeměněn na thiaminpyrofosfát. V organismu se neukládá, přebytek tohoto vitamínu je vyloučen ve formě metabolitů. Tento

vitamín

je

obsaţen

v celozrnné

mouce,

neloupané rýţi,

kvasnicích, pšeničných klíčcích, ořechách nebo luštěninách.13 Tím, ţe se thiamin účastní na oxidativní dekarboxylaci pyruvátu, získávají buňky organismu ze sacharidů energii, kterou ukládají ve formě makroergních

vazeb.

Dále

hraje

důleţitou

úlohu

při

přenosu

neuromuskulárních impulzů. Nejčastějším stavem, který doprovází hypovitaminózu je beri-beri. Hypovitaminóza

způsobí

nedostatečné

odbourávání

α-ketokyselin.

To

zpravidla nastává tehdy, kdyţ je nevyváţená strava, především loupaná rýţe nebo alkoholismus. Tato choroba se uţ dnes příliš nevyskytuje, dříve bylo rozšířená především v Číně a Japonsku. Hlavními příznaky, kterými se tato choroba projevovala, bylo postiţení nervového a kardiovaskulárního systému. Rozlišují se dvě formy beri-beri. Suchá forma projevující se periferní neuropatíi s parestéziemi, hypésteziemi aţ s anestézíi (poruchy periferních nervů s poruchami citlivosti). Tato forma je plně reverzibilní. Druhou formou je tzv. mokrá forma s kardiomegalií (rozšíření srdce), tachykardií (zrychlení srdečního rytmu) a nakonec se srdečním selháním.10,11 U mírnější formy hypovitaminózy se objevuje nechutenstvím k jídlu, svalovou slabostí, celkovou podráţděností, neschopností se soustředit nebo celkovou duševní únavou. Nadbytek tohoto vitamínu ve formě hypervitaminózy se zpravidla neobjevuje, neboť tento vitamín se v lidském organismu neukládá. Někdy se u senzitivních lidí mohou vyskytnout alergické reakce, zpravidla po perorálním podání.

16

3.5.2 Vitamin B2 (riboflavin, laktoflavin)9,10

Je to látka charakteristické ţluté barvy, která v UV světle fluoreskuje. V organismu tvoří tento vitamin dva koenzymy, které jsou součástí několika enzymových systému. Účastní se vyuţívání energie ze sacharidů do formy makroergických

fosfátových

vazeb.

Je

to

flavinmononukleotid

(FMN)

a flavinadenindinukleotid (FAD). Riboflavin je syntetizován i střevními bakteriemi, ovšem z toho zdroje není resorbován. Velmi dobře se absorbuje z proximálních částí střeva. Je distribuován do všech tkání. V organismu se neukládá a jeho nadbytek je vyloučen močí v nezměněné formě. Riboflavin se podílí na vzniku energie, jako součást oxidačně-redukčního systému. Je důleţitý pro dobrý stav kůţe a očí. Jeho přirozeným zdrojem jsou kvasnice, mléko, maso, luštěniny a obilniny. Isolovaný nedostatek vitamínu B2 prakticky neexistuje. Můţou se objevit ragády v koutku úst, glositida, bolest v krku, zánět dásní. Někdy se můţe vyskytnout i anémie a poruchy nervového charakteru.13 Spíše je kombinovaný s dalšími vitamíny. Nedostatek riboflavinu ještě i nedostatek thiaminu, niacinu, pyridoxinu a kyseliny listové, je známa pod názvem pelagra. Vyskytovala se v oblastech, kde byla hlavní sloţkou potravy kukuřice (malý obsah vitamínu, který je navíc pevně vázán). Je to onemocnění, které se projevuje tzv. „tři D“. Dermatitida – poškození kůţe, kdy je kůţe začervenalá, později zhnědne, je hrubá, hyperkeratotická. Tyto stavy vedou k trvalé pigmentaci s loţisky ztluštělé či atrofické (ztenčelé) kůţe. Diarrhoea – průjem. Zpravidla hnilobné a páchnoucí. Demencia – nespavost, deprese, poškození paměti aţ halucinace a demence.11 Zvýšená hladina riboflavinu není známa, protoţe přebytečné mnoţství je vyloučeno.

17

3.5.3 Vitamín B3 (vitamín PP, niacin, kyselina nikotinová)9,10

Tento vitamín se vyskytuje ve dvou formách. Jako vitamín a to ve formě kyseliny nikotinové a amid této kyseliny (nikotinamid), který můţe vitamin B3 zcela nahradit. Jejich rozdíl je ale ve farmakologickém účinku. Účinná forma tohoto

vitamínu

je

nikotinamidadenindinukleotid

(NAD)

nebo

nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP). Ve formě koenzymů se účastní oxidačně-redukčních reakcí. Dobře je absorbován, po podání per os je intenzivně metabolizován. Jeho distribuce je do všech tkání. Velké dávky tohoto vitamínu jsou vylučovány močí zpravidla v nezměněné podobě. Je nutná zvýšená opatrnost u těhotných ţen, neboť prochází placentární bariérou. Potřebu toho vitamínu umí tělo krýt i jeho přeměnou z aminokyseliny tryptofanu. Ze 60 mg tryptofanu vznikne 1 mg niacinu.9 Jak

uţ

bylo

zmíněno

v úvodu,

účastní

se

tento

vitamín

oxidačně-redukčních reakcí a díky tomu se podílí na vzniku energie ze sacharidů. Je důleţitý pro správnou činnost nervového systému. Zmírňuje stavy úzkosti a deprese. Podílí se na řízení hladiny krevního cukru, udrţuje zdravou pokoţku.13 Kyselina nikotinová se podílí na sníţení hladiny cholesterolu, má tedy funkci hypolipidemika. Ovšem tento účinkem působí při vyšších dávkách, neţ je účinek vitamínový. Játra, maso, luštěniny, kvasnice, obilniny, zde všude bychom nalezly velký zdroj vitaminu B3. Naopak mléko a vejce jsou chudé na přítomnost tohoto vitamínu. Zde bychom ale naproti tomu nalezli velké mnoţství právě tryptofanu, ze kterého vzniká vitamin B3. Hypovitaminóza se projevuje jiţ zmíněným onemocněným pelagra, která byla popsána u předchozího vitaminu B2. Dále se mohou objevit deprese, únava, poruchy psychiky. Poškození kůţe se můţe projevit vyráţkami. Někdy se vyskytují i poruchy trávení.

18

Nadbytek tohoto vitamínu není znám. Můţe se ale objevit vazodilatace a pocit nepříjemného tepla. Svědění kůţe, vyráţka, suchá kůţe.12 Poruchy trávicího traktu spojeného s nauzeou, zvracením, bolestmi břicha. Dále mírné zvýšení transamináz, vedoucí k poškození jater. 3.5.4 Vitamín B5 (kyselina pantotenová)12,9

Kyselina pantotenová je látka opticky aktivní. V přírodě se vyskytuje pouze pravotočivá D(+) forma, která má funkci vitamínu. Levotočivá L(-) forma nemá vitamínové vlastnosti. Účinná forma této kyselina je 4-fosfopantotenát, který je součástí koenzymu A.11 A právě díky tomuto se podílí na řadě enzymatických reakcí. Jedná se o vitamín rozpustný ve vodě, stejně jako ostatní vitamíny této skupiny se dobře absorbuje z gastrointestinálního traktu a je široce distribuována do všech tkání organismu. Lidský organismus si tento vitamín neumí

syntetizovat,

pouze

dochází

k jeho

metabolické

přeměně

na

4-fosfopantotenát. Díky tomu, ţe tento vitamín je součástí koenzymu A, zúčastní se mnoha enzymatických reakcí. Vlastní funkce koenzymu A spočívá v přenosu acetylačních zbytků. Podílí na metabolismu cukrů, tuků a bílkovin. Ovlivňuje správnou funkci a výţivu pokoţky. Je důleţitý pro její regeneraci, lepší hojení ran a podporu epitelizace. Je důleţitý pro správnou funkci nervového systému. Má také antistresové účinky, díky jeho působení na nadledvinky.13 Samotný název vitamínu pochází z výrazu „všude rozšířený“ coţ vypovídá i o jeho obsahu v jednotlivých potravinách.12 Pochází jak ze ţivočišných tak rostlinných zdrojů, i kdyţ ty ţivočišné jsou přeci jen na tento vitamín bohatší. Našly bychom ho ve vnitřnostech, jako jsou játra a ledviny, bohatým zdrojem jsou i kvasnice či mléčné výrobky. Z rostlinných je obsaţen v luštěninách. Pokud lidé konzumují pestrou normální stravu, hypovitaminóza tohoto vitamínu nehrozí. Pokud by se ale tento stav objevil, můţe dojít k poškození 19

kůţe, její depigmentaci, rohovatění. U vlasů můţe dojít k alopecii. Můţou se objevit gastrointestinální problémy. Nadbytek kyseliny pantotenové není znám, ani ve velkých dávkách nepůsobí na lidský organismus toxicky. Přebytečné mnoţství vitaminu je vyloučeno močí. 3.5.5 Vitamín B6 (pyridoxin)9

Tento vitamín se vyskytuje ve třech jeho aktivních formách. Jednotlivé formy tohoto vitamínu se liší substitucí na uhlíku číslo 4. Piridoxal má aldehydickou skupinu, piridoxol alkoholovou a pyridoxamin má na 4. uhlíku aminometylovou skupinu.9 Piridoxin se dobře vstřebává a v lidském organismu je poté fosforylován na pyridoxal-5-fosfát. V této formě je koenzymem dekarboxylas aminokyselin a transaminas.10 V podobě koenzymu se účastní na metabolismu aminokyselin. Je důleţitý pro syntézu porfyrinu, který je důleţitý pro inkorporaci ţeleza do hemu. Ovlivňuje metabolismus řady transmiterů, kteří jsou součástí nervového systému. Stejně jako předchozí zástupci skupiny vitamínu B má vliv na kvalitu kůţe.13 Zdroje tohoto vitamínu bychom našli mase, kvasnicích, celozrnných obilovinách a luštěninách. Hypovitaminóza se projeví na kůţi. Můţou se vyskytnout seboreickými lézemi zpravidla v oblasti obličeje. V některých případech se můţe zvýšit neuromuskulární dráţdivost a dojít ke křečím. Vzhledem k tomu, ţe je důleţitý pro inkorporaci ţeleza, můţe jeho nedostatek vyvolat sideroblastovou anémii. Poškození nervové soustavy se projevuje podráţděním.10,11 Stejně tak jako u ostatních vitamínů rozpustných ve vodě se klasická hypervitaminóza nevyskytuje. Nadbytek je z těla vyloučen. 20

3.5.6 Vitamín B7 (biotin, vitamín H) 13,9

Tento vitamín, který patří do skupiny vitamínů rozpustných ve vodě, je látka s optickou aktivitou. Po chemické stránce se jedná o karboxylovou kyselinu. Tento vitamín je součástí karboxylas, které umoţňují fixovat molekulu oxidu uhličitého a tím se podílet na četných enzymatických reakcích.9 Stejně jako ostatní vitamíny této skupiny se i tento velmi dobře absorbuje z gastrointestinálního traktu. Vylučování probíhá močí v nezměněné podobě. Syntéza tohoto vitamíny probíhá i částečně v našem zaţívacím traktu, ovšem nasyntetizované neumíme dostatečně utilizovat. Biotin je součástí enzymů a díky tomu se podílí na metabolismu cukrů, tuků a bílkovin. Pomáhá také sniţovat hladinu krevního cukru. Brání vypadávání a šedivění vlasů, zpevňuje nehty a pomáhá udrţovat zdravou pokoţku. Na biotin jsou bohatá kvasnice, ţloutky, vnitřnosti (játra a ledviny)a ořechy. Nedostatek vitamínu není znám. Dostatečná pestrá a pravidelná strava pokrývá dostatek příjmu tohoto vitamínu. Avitaminóza se můţe vyskytnout u osob, které by měly zvýšený příjem syrového bílku. Ten totiţ obsahuje mukoprotein avidin, na který se váţe biotin a tím se tento vitamín stává inaktivním.9 vypadáváním

Projevy vlasů,

případné zvýšenou

hypovitaminózy lomivostí

by

nehtů,

se

mohly

svalovou

projevit

bolestí

a

podráţděností.13 Hypervitaminóza se nevyskytuje, neboť přebytek tohoto vitamínu je vyloučen močí. Ale v některých případech se můţou objevit gastrointestinální problémy, kterými je nevolnost, nauzea či bolest v oblasti břišní dutiny. 3.5.7 Vitamín B9 (kyselina listová)

Tento vitamín bude podrobněji probrán v následující kapitole.

21

3.5.8 Vitamín B12 (kyanokobalamin)10,11

Tento vitamín v lidském organismu existuje ve dvou aktivních formách a to jako metylkobalamin a deoxyadenosylkoblamin. V této formě jsou součástí koenzymů a účastní se metabolismu cukrů, tuků a bílkovin. Ve formě metylkobalaminu je důleţitý pro syntézu methionunu z homocysteinu. Tato forma podporuje symbiotické působení tohoto vitamínu s kyselinou listovou. Jako deoxyadenosylkoblamin je důleţitý pro syntézu fosfolipidů, jeţ jsou součástí buněčných membrán a myelinových pouzder.11 Po perorálním podání tohoto vitamínu dochází k jeho uvolnění z potravy pomocí pankreatických proteás a kyseliny chlorovodíkové. Takto uvolněná forma se naváţe na tzv. „intrinsic faktor – vnitřní faktor“ a dochází k jeho resorpci v distálním ileu.10 Kdyţ je nedostatek toho vnitřního faktoru vstřebává se zhruba okolo 1 % tohoto vitamínu.11 Tento vitamín se skladuje v játrech. Zásoba vydrţí zhruba na měsíce a roky, a proto se nedostatek tohoto vitamínu projeví aţ za delší dobu. Tento vitamín je také částečně syntetizován bakteriemi v tlustém střevě, ovšem takto vzniklý ho nedokáţe lidský organismus vyuţít. Díky tomu, ţe tento vitamín je součástí koenzymu, podílí se na metabolismu cukrů, tuků i bílkovin. Podílí se správné funkci nervového systému, na správném přenosu nervového vzruchu. Podílí se na syntéze purinových a pyrimidinových bází a tím k syntéze DNA.13 Je důleţitý pro tvorbu červených krvinek. Ovlivňuje také hladinu homocysteinu, tím má přímý vztah k zamezení vzniku aterosklerózy a tím vzniku ischemické choroby srdeční. Zdroje tohoto vitamíny bychom nenašli v rostlinné potravě, ale spíše v ţivočišné jako jsou mléko, vejce, játra a ledviny. Hypovitaminóza

se

projevuje

neurologickými

projevy

spojené

s demyelinizací a degenerací axonů. Dále můţe vzniknout perniciózní anemie. Při této formě anemie chybí vnitřní faktor a nedochází k syntéze DNA a erytrocytů.12,7 22

Nadbytek vitaminu B12 se nevyskytuje. 3.5.9 Vitamín C (kyselina askorbová)12,9,10

Kyselina askorbová je ve vodě rozpustný vitamín. V organismu je reverzibilně oxidována na dehydroaskorbovou kyselinu. Metabolitem kyseliny askorbové je kyselina oxalová, která je poté vylučována z lidského organismu. Zajímavostí je, ţe řada ţivočišných druhů si umí tento vitamín nasyntetizovat sama a tudíţ pro ně neplní funkci vitamínu. Ovšem pouze člověk, primáti a morčata musejí tuto látku přijímat z vnějšku a tudíţ má pro ně funkci vitamínu. Tento vitamín, stejně jako ostatní vitamíny této skupiny se z trávicího traktu velmi dobře vstřebává a snadno proniká do všech tkání. Uplatňuje se tzv. „saturabilní mechanismus“. Při vysokých dávkách tohoto vitamínu se procento vstřebané dávky sniţuje. Při dávce do 1 g se vstřebá 75 %, ale při dávce 5 g se vstřebá uţ jen zhruba 20 %.10 Tento vitamín prochází placentární bariérou a také mateřským mlékem. V některých orgánech dosahuje vyšších koncentrací v porovnání s jinými. Jsou jimi například nadledvinky, podvěsek mozkový či leukocyty. Nadbytek tohoto vitamínu vyloučí tělo močí. Působení tohoto vitamínu v lidském organismu je velmi významné. Je známa především jako látka s antioxidační aktivitou. Působí tedy jako zhášeč volných radikálů v lidském organismu. Ve formě kofaktoru se účastní hydroxylačních a amidačních reakcí.12 Při tomto je nezbytný pro hydroxylaci esenciálních aminokyselin serinu a prolinu. Je důleţitý pro syntézu kolagenu, karnitinu, proteoglykanů a intracelulární matrix. Ovlivňuje tvorbu hormonů v nadledvinkách a hypofýze a díky tomu zvyšuje téţ obranyschopnost organismu. Má projektivní účinek na kardiovaskulární systém, tím ţe sniţuje hladinu cholesterolu a díky tomu brání vzniku aterosklerózy. Zvyšuje téţ vstřebání ţeleza. Vitamin C bychom našli v ovoci i zelenině. Především v citrusových plodech (pomeranč, citron, kiwi), jahody a černý rybíz. Bohatý na zdroj vitamínu C jsou i šípky. Ze zeleniny jsou to brambory, zelí, křen a zelené části 23

rostlin.13 Nutno podotknout, ţe tento vitamín je velmi nestálý, je citlivý na světlo, vysoké teploty a vzdušný kyslík. Úpravou při vaření můţe dojít ke ztrátám aţ o 70 %. Tento vitamín je tímto nejméně stálým vitamínem. Avitaminóza vitamínu C se nazývá skorbut (kurděje). Dnes u nás není tak častá choroba jako dříve. Projevuje se celkovou únavou organismu. Sniţuje se syntéza kolagenu a změny mezibuněčné hmoty. Coţ v důsledku vede k univerzálnímu poškození všech orgánů.9 Dochází také ke zvýšené fragilitě cév a kapilár, coţ vede ke zvýšené krvácivosti. V krajním případě se můţe projevit anemie. V dutině ústní se objevuje gingivitida, coţ můţe vést aţ k vypadávání zubů. Vzhledem k tomu, ţe tento vitamín se podílí na posílení obranyschopnosti organismu, dochází při jeho hypovitaminóze ke špatnému hojení ran a sníţenou odolností vůči infekcím. Objevuje se slabost a celková únavnost.9 Zvýšený příjem tohoto vitamínu nad jeho doporučené mnoţství nevede k závaţným zdravotním problémům, z důvodu toho, ţe jako u ostatních vitamínů této skupiny je nadbytek vyloučen močí. Komplikace mohou nastat při dlouhodobém podání velmi vysokých dávek, zpravidla gramových. U tohoto stavu se můţe objevit průjem, acidifikace moči a metabolit kyseliny askorbové, kyselina oxalová se můţe hromadit v ledvinách a tam můţe vytvářet ledvinové kameny.12

název vitamínu

doporučené denní dávky

Vitamín A

800 aţ 1000 µg/den

Vitamín D

5 µg/den

Vitamín E

10 aţ 15 mg/den

Vitamín K

70 aţ 100 µg/den

Vitamín B1

1 aţ 2 mg/den

24

Vitamín B2

1,5 mg/den

Vitamín B3

14 aţ 18 mg/den

Vitamín B5

5 aţ 10 mg/den

Vitamín B6

1,5 aţ 2 mg/den

Vitamín B7

100 aţ 200 µg/den

Vitamín B9

400 µg/den

Vitamín B12

1 aţ 2 µg/den

Vitamín C

75 mg/den

Tab. 3.1: Doporučené denní dávky vitamínů pro dospělého člověka.8,13,11

3.6 Kyselina listová jako jeden z vitamínů Jelikoţ se tato práce zabývá zkoumáním permeačního působení kyseliny listové přes sublingvální membránu, budou uvedeny vybrané informace o kyselině listové jako vitamínu. Vitamín B9, Bc (kyselina listová) 3.6.1 Chemická struktura kyseliny listové3,14,15

Kyselina N-[4-{[2-(amino-4-hydroxy-6-pteridinyl)methyl]amino}benzoyl glutamová Je sloţena ze 3 sloţek: pteridinového jádra, kyseliny p-aminobenzoové a kyseliny L (+) glutamové. Kyselina listová se vyskytuje v různých formách, které se obecně nazývají foláty, které se liší svojí chemickou strukturou od samotné kyseliny listové. Tyto deriváty mají zpravidla polyglutamový charakter a niţší biologickou

25

aktivitu, neţ samotná kyselina. Jednotlivé změny chemické struktury mohou mít charakter typu: 11,12  stupeň redukce pteridinového kruhu  jednouhlíkatý zbytek v poloze 5 a 10  počtem zbytků kyseliny glutamové

Obr. 3.1: Chemický vzorec kyseliny listové11

3.6.2 Fyzikální a chemické vlastnosti kyseliny listové3,14,15

Kyselina listová tvoří ţluté lístkovité krystalky, které se rozkládají při 250 °C. Volná kyselina listová se rozpouští těţko ve vodě. Jsou udávány 26

parametry 0,1 mg/ml při 2 °C; 0,5 mg/ml při 100 °C.3 Ale i přes tuto její vlastnost, je řazena mezi vitamíny rozpustné ve vodě. Jak jiţ vyplývá z její chemické struktury, má kyselý charakter, a proto v roztocích alkálií tvoří soli, které jsou snadno rozpustné ve vodě. Ovšem nutno podotknout, ţe na uhlíku číslo

2

má

bazickou

-NH2

skupinu,

coţ

umoţňuje

její

rozpuštění

v anorganických kyselinách. Při čemţ však snadno podléhá hydrolýze. Vodné roztoky kyseliny listové ozářením UV světlem nebo i světlem slunečním se pomalu rozkládají. Vzhledem k této vlastnosti je nutno roztoky kyseliny listové, které mají zůstat nezměněné uchovávat ve tmě a v prostředí, které neobsahuje ţádná oxidační či redukční činidla, ani kyseliny a zásady. 3.6.3 Farmakokinetika16

Obecně mohou foláty existovat jako monoglutamáty nebo polyglutamáty. Ve formě monoglutamátu je jejich absorpce téměř úplná, zhruba 90 %. Většina folátů, které přijímáme v potravě je ale ve formě polyglutamátů. Z této formy se absorbuje zhruba 50 %. Kyselina listová se dobře vstřebává z proximální části duodena.11 U polyglutamátu musí dojít nejprve k jejich odštěpení pomocí enzymu střevní konjugázy a poté aţ dochází k jejich absorpci. Nutno ale podotknout, ţe některé sloţky potravy mohou obsahovat inhibitory těchto enzymů, a tím můţe být sníţena utilizace folátu ve smíšené potravě. Z tohoto důvodu průměrná vstřebatelnost folátu ze smíšené stravy není vyšší neţ 50 %. Proto, pokud je dnes folát v suplementech nebo ve fortifikované potravě je podáván ve formě monoglutamátu a tudíţ je snadno absorbován. Nalačno téměř ze 100 %, spolu s jídlem asi z 85 %.16 Při tranzitu stěnou střevní jsou foláty v epitelových buňkách transformovány na 5-metyltetrahydrofolát. V této formě vstupují do cirkulace a jsou distribuovány do různých tkání, kde dochází k jejich konverzi na tetrahydrofolát a v další fázi k jeho přeměně na polyglutamát. Metabolismus kyseliny listové probíhá v játrech. Část kyseliny listové

je

z prekurzoru

také

syntetizováno

p-aminobenzoové

střevními kyseliny. 27

bakteriemi. Tato

Syntéza

syntéza

je

probíhá

inhibována

sulfonamidy, které působí jako antagonisté právě proti p-aminobenzoové kyselině. Foláty jsou skladovány v játrech ve formě polyglutamátů. Foláty podléhají také enterohepatálnímu oběhu. Díky tomu můţe dojít k jejich reabsorpci v mnoţství aţ 200 µg za den.11 Absorpce folátu je vyšší ze ţivočišných neţ z rostlinných potravin. Můţe být ovlivněna příjmem alkoholu, interakcí s drogami nebo genetickými dispozicemi. Kyselina listová je dialyzovatelná. Kyselina listová je vylučována ledvinami močí. Denně se vyloučí zhruba 4 aţ 5 µg. Je nutno podotknout, ţe foláty procházejí placentární bariérou a vylučují se do mateřského mléka. 3.6.4 Fyziologické funkce16,12,17

Vlastní aktivní forma kyseliny listové je tetrahydrofolát, který vzniká redukcí enzymem

folátreduktázou.

Tetrahydrofolát,

který

slouţí

k přenosu

aktivovaných jednouhlíkatých zbytků; např. metylu, metylenu, formylu, hydroxymetylu. Všechny jsou metabolicky směnitelné (tj. účinkem specifických enzymů jsou jednouhlíkové zbytky navázané na tetrahydrofolát odstraňovány a případně vyměňovány za jiné). Tetrahydrofolát tedy slouţí jako jakýsi dárce těchto jednouhlíkových zbytků v konkrétní reakci. Příkladem můţe být konverze

homocysteinu

na

methionin.

Reakce

se

účastní

5-metyltetrahydrofolát, který je donorem metylové skupiny pro homocystein. Uvolněním metylové skupiny z 5-metyltetrahydrofolátu vzniká tetrahydrofolát, metylová skupina změní homocystein na methionin. Při této enzymatické reakci je nutná přítomnost kofaktoru, kterým je vitamín B12.11 Díky tomuto se mimo jiné podílí i na syntéze purinových a pyrimidinových bází. A tím k vytvoření DNA. Je tedy nezbytná pro správné dělení buněk a tím pro vývoj a zachování tělesných tkání a systémů a to především nervového systému. Při působení na nervový systém hraje významnou roli pro zachování emočních funkcí a mentálního zdraví. Je jí připisován i účinek antidepresivní. Podílí se na metabolismu aminokyselin. Jak bylo uvedeno dříve, přeměňuje homocystein na methionin. Zajišťuje také konverzi serinu na glycin. Spolu s vitamínem B12 je 28

důleţitá pro krvetvorbu a erytrocyty. Je důleţitá pro správné fungování kostní dřeně.

Obr.3.2:

Konverze

homocysteinu

na

methionin

pomocí

5-methyltetrahydrofolátu a vitamínu B12.18 3.6.5 Zdroje kyseliny listové16,17

Bohatým zdrojem kyseliny listové je rostlinná i ţivočišná potrava. Z rostlinných je to především listová zelenina. Například špenát, bílé zelí, brokolice či chřest. I v ovoci bychom našli kyselinu listovou. Ve velkém mnoţství je obsaţena například v jahodách či pomeranči. Ze ţivočišných zdrojů jsou na kyselinu listovou nejvíce bohatá játra, kvasnice či mléčné výrobky. Samozřejmě je nutné, stejně jako u ostatních vitamínů dodrţet pestrou stravu bohatou jak na rostlinnou tak ţivočišnou sloţku. Nevýhodou pro zdroje kyseliny listové je fakt, ţe kyselina listová je termolabilní. Rozkládá se 29

působením světla a podléhá oxidaci. K jejímu úbytku ve stravě dochází i vyluhováním. Před oxidací v kyselém prostředí je chráněna vitamínem C.

potravina chřest brokolice kapusta zelí květák hrách salát hlávkový špenát cibule petrţel brambory

průměrný obsah kyseliny listové µg/100g potravy 100 aţ 155 34 aţ 111 50 aţ 85 16 aţ 45 30 aţ 125 80 aţ 159 20 aţ 75 80 aţ 130 12,3 38,4 6 aţ 20 6,0 aţ 30,0

třešně

potravina mango jahody chléb ţitný luštěniny mouka pšeničná mouka ţitná houby mléko sýr vejce hovězí maso vepřové maso

průměrný obsah kyseliny listové µg/100g potravy 36 5 aţ 65 15,7 107 16 aţ 150 15 14 aţ 29 29 aţ 32 8 aţ 16 8 aţ 67 15,3 2,5 aţ 3,5

pomeranče

5,1 aţ 40

kuřecí maso

11

jablka banány

6 28 aţ 36

játra vepřová kvasnice

178,5 1250 aţ 1500

Tab. 3. 2: Průměrný obsah kyseliny listové u vybraných potravin16,19, Faktory omezující vstřebávání a aktivitu kyseliny listové  alkohol  stres  kouření  chemoterapie (methotrexat, sulfonamidy)  antiepileptika  orální kontracepce  drogy  genetická zátěţ  kortikosteroidy  antiflogistické látky

30

5

3.6.6 Doporučené denní dávky kyseliny listové16,19

Standardní potrava obsahuje v průměru asi 50 aţ 500 µg. Jak vyplývá z předchozího uvedeného odstavce, při nevhodné úpravě se můţe ztratit aţ 90 % folátů. Denní potřeba kyseliny listové se od 80. let minulého století zvýšila. V 80. letech činila 200 µg na den pro dospělého člověka. Nyní je doporučený příjem 400 µg folátového ekvivalentu (DFE) na jeden den pro adolescenty

i

dospělé

obou

pohlaví.

Folátový

ekvivalent

v

potravě

(DFE = dietary folate equivalent) je nově definován takto: 1 µg folátového ekvivalentu DFE se rovná 1 µg folátu z potravy nebo 0,6 µg kyseliny listové z fortifikované potraviny (popřípadě 0,6 µg kyseliny listové jako suplementu konzumovaného s potravou) a konečně je roven 0,5 µg syntetické kyseliny listové (pteroyl-monoglutamátu), konzumované jako suplement nalačno.16 Zvýšený příjem kyseliny listové je důleţitý především v graviditě, kdy dochází k rychlému dělení buněk. Více tohoto vitamínu by také měli přijímat alkoholici, kuřáci či hemodialyzovaní pacienti. 3.6.7 Hypovitaminóza a avitaminóza kyseliny listové10,11

Avitaminóza kyseliny listové se můţe projevit poruchou krevního obrazu a erytrocytů. Můţe vzniknout anémie, tzv. megaloblastická anemie. Při tomto druhu anémie chybí vitamín B12 a kyselina listová. Je porušena syntéza DNA, a proto je sníţeno dělení buněk. Syntéza RNA a bílkovin je zachována. To vede k tomu, ţe se tvoří velké, makrocytární erytrocyty, které mají vysoký poměr RNA:DNA. Tyto erytrocyty jsou defektní a velmi citlivé k poškození. Kostní dřeň je morfologicky hypercelulární. Obsahuje velký počet abnormálně velkých mladých megaloblastů. Při tomto typu anémie je porušeno zrání jader a dělení buněk. Typickými projevy je dušnost, slabost a celková únava.7 Nejsou přítomny neurologické problémy. Při nedostatku tohoto vitamínu se můţe v lidském organismu hromadit homocystein, který má přímý vztah ke vzniku aterosklerózy a tím ke kardiovaskulárním problémům. Nedochází totiţ k jeho přeměně na methionin. Hypovitaminóza tohoto vitamínu je zvlášť 31

nebezpečná při těhotenství, kdy dochází k dělení buněk a tím k vývoji plodu. Můţe dojít ke špatnému vývoji nervového systému a růstu plodu, coţ má za vznik vrozené vývojové vady u plodu. Obecně se hypovitaminóza můţe projevit celkovou slabostí a únavou. Špatnou náladou aţ depresemi. Byly také zaznamenány porucha trávení. 3.6.8 Hypervitaminóza kyseliny listové9

Tento vitamín není pro lidský organismus toxický. Přebytek je vyloučen močí. Můţe však maskovat nedostatek vitaminu B12. Nadbytek můţe vést k příznakům anémie. U epileptiků můţe vyvolat vznik křečí. Při vyšších dávkách se u některých senzitivních pacientů mohou objevit alergické reakce. Ta

se

můţe

projevit

svěděním,

erytémem

a

v horším

případě

i

bronchospasmem.

3.7 Kyselina listová jako prevence vrozených vývojových vad20 Vrozená vývojová vada je definována: „Odchylka, jejíţ příčina je ve změně genetické informace (mutace gametické nebo somatické) nebo můţe být poškození nedědičné, způsobené faktory zevního prostředí.“ (GÁL, Petr; TECL, František; SKOTÁKOVÁ, Jarmila. Vrozené vývojové vady, část I. Masarykova univerzita v Brně. 1999) Z tohoto lze tedy usoudit, ţe vrozené vývojové vady mají multifaktoriální charakter. Pokud je příčina vrozené vývojové vady v zevním prostředí, označujeme ji jako teratogen. Ty můţou být chemického, fyzikálního či biologického původu. V průmyslových zemích jsou vrozené vady příčinou asi 25 % úmrtí novorozenců, 10 % všech novorozenců je přijato na jednotky intenzívní péče a 26 % z nich na těchto jednotkách umírá. Asi 32% dětí, které pro vrozenou vadu prošly péčí v JIP, umírá během prvního roku ţivota. Celkem asi 5 % jedinců má nějakou vrozenou vadu. 2 aţ 3 % bývají rozpoznána při porodu, ostatní se projeví v dětství.21,22

32

Jak uţ bylo zmíněno, přívod kyseliny listové je nutný pro správný vývoj embrya a plodu. Nynější poznatky potvrzují, ţe saturace organizmu ţeny v perikoncepčním období a v kritických periodách organogeneze do značné míry rozhoduje o vzniku většiny vývojových vad. Především se jedná o defekty neurální trubice, srdečních malformací, obstrukčních anomálií v močovém traktu, malformací končetin, rozštěpů rtu a patra i kongenitální pylorostenózy. Nedostatečná saturace kyselinou listovou také můţe způsobit předčasný porod, retardaci intrauterinního vývoje plodu, odtrţení nebo infarktaci placenty. Se vznikem těchto vad souvisí i zvýšená i hladina homocysteinu.22 Denní doporučená dávka kyseliny listové pro dospělého člověka by měla být 400 µg denně. V České republice je doporučený příjem kyseliny listové u těhotných ţen, či u ţen plánující otěhotnět na 600 µg denně. Doporučuje se zhruba 3 měsíce před plánovaným početím a poté minimálně v průběhu prvního trimestru. Jak uţ bylo zmíněno v předchozí kapitole, příjem kyseliny listové pouze z potravy je v těchto případech nedostačující, neboť velká část tohoto vitamínu je zničena při samotné přípravě potravy bohaté na tento vitamín. Proto se doporučuje u těchto ţen pouţívat suplementaci kyseliny listové

ve

formě

doplňků

stravy.

V řadě

zemí

přistoupili

k opatření,

tzv. fortifikaci potravy, coţ je potrava obohacená kyselinou listovou, která je ve formě monoglutamátu. Lépe se tedy vstřebává bez předchozí enzymatické přeměny. Kyselina listová je důleţitá pro syntézu DNA a tím pro normální vývoj a růst zárodku. Ovlivňuje i správnou funkci nervového systému. Mimo jiné sniţuje

hladinu

homocysteinu.

Bylo

zjištěno,

ţe

i

zvýšená

hladina

homocysteinu vede ke vzniku některých vývojových vad. Nejčastější vývojovou vadou, způsobenou nedostatkem kyseliny listové je tzv. defekt neurální trubice. Defekty neurální trubice patří do malformace CNS a páteře, konkrétně tedy mozku a míchy. Z nichţ část je zcela neslučitelná se ţivotem a část, která postihuje především kaudální konec 33

neurální trubice, vede ve většině případů k trvalé invaliditě. Do této skupiny vad řadíme anencefalii, spinu bifidu, encefalokélu a kraniorachischízu. Anencefalie je typická absence mozkové tkáně a v extrémním případě i míchy. Součástí jsou často malformace dalších orgánů, např. končetin, zaţívacího traktu. Jde o vadu neslučitelnou se ţivotem, postiţení jedinci se rodí mrtví nebo umírají během několika dní po narození. Nejčastější vadou této skupiny je spina bifida. Jedná se o rozštěp páteře, kdy dochází k poruše splynutí obou polovin obratlového oblouku, coţ můţe mít za následek prolaps obsahu páteřního kanálu. Existují dvě formy, lehčí - uzavřená forma Spina bifida oculta a těţší forma - Spina bifida cystica, která jiţ postihuje i míchu. K nejzávaţnějším komplikacím patří hydrocefalus či infekce nervové soustavy. Prognóza závisí na míře a místě postiţení. Při encefalokéle jsou poškozeny membránové i kostěné obaly, které obalují mozek. Část mozku se tímto defektem dostává skrze lebku v útvaru krytém kůţí i mozkovými plenami. Prognóza je kolem 60 aţ 100 %. Kraniorachischíza je chybění kostního kytu mozku a vlastní mozková tkáň je mimo lební dutinu. Velmi důleţitou roli při včasném odhalení těchto vad hraje včasná diagnostika. Uzávěr neurální trubice nastává 25. den gestace. Momentálně se v České republice provádí 2 metody a to stanovení tzv. AFP – alfa- fetoproteinů a ultrazvukové vyšetření. Díky těmto metodám lze včas odhalit moţnou vrozenou vadu a v krajním případě provést předčasné ukončení těhotenství.23,24,25 Závěrem nutno konstatovat, ţe bylo prokázáno na mnoho dlouhodobých studiích, ţe zvýšené podávání kyseliny listové před, během a i po porodu můţe sníţit o 72 % výskyt defektu neurální trubice u ţen, které uţ předtím dítě s takovým defektem porodily. Ovšem bylo také prokázáno, ţe u ţen, které přijímaly kyselinu listovou, se vyskytovala u jejich plodu některá z těchto vad méněkrát, oproti ţenám, které kyselinu listovou nepřijímaly.19

34

3.8 Vliv kyseliny listové na kardiovaskulární systém16 Správná funkce kardiovaskulárního systému má přímou souvislost s hladinou homocysteinu. Homocystein je syntetizován z aminokyseliny methioninu. Velikost příjmu této aminokyseliny v potravě rozhoduje o způsobu degradace homocysteinu. To jaká bude hladina homocysteinu v našem organismu je ovlivněno přítomností kofaktorů, kterými jsou vitamin B6, B12 a také kyselinou listovou. Samozřejmě také důleţitou roli hraje ţivotní styl, kouření či alkohol a řada dalších. Pokud je nedostatek těchto kofaktorů a přítomnost

dalších

rizikových

faktorů,

dochází

ke

zvýšené

hladině

homocysteinu a vzniká hyperhomocysteinemie. Ta je jednou z příčin aterosklerózy, která v důsledku vede k poškození kardiovaskulárního systému. Suplementace kyselinou listovou a vitamínu B12 se ukázala jako účinná při sníţení hladiny homocysteinu a tím zabránění vzniku aterosklerózy, jako jeden z rizikových faktorů pro její vznik.

35

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 26 4.1 Suroviny a materiál Azid sodný p. a.

Fluka, Buchs

Chlorid sodný ČL 2005

Lachema, Brno

Kofein ČL 2005

Kulich, Hradec Králové

Methanol pro HPLC

AlliedSignal, Seelze

Voda čištěná

UK FAF, Hradec Králové

Voda pro HPLC

UK FAF, Hradec Králové

Kyselina listová

Sigma-Aldrich, Praha

Dihydrogenfosforečnan sodný dihydrát ČL 2002 Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát ČL 2002 Propylenglykol ČL 2002 č. š: EC31205002 Isopropyl-myristát 90 %

Kulich, Hradec Králové

Chitosan

Elmarco, Liberec

Polyurethan

Elmarco,Liberec

Propylglycerol-oleát

Goldschmidt, Německo

Diazolidinylmočovina 95 %

Sigma-Aldrich, Praha

Dimethicon co-polyol

Goldschmidt, Německo

Trypsin 1:250 from porcine pancreas

Sigma-Aldrich Chemie, Německo

Kulich, Hradec Králové Kulich, Hradec Králové Sigma-Aldrich, Praha

Uvedené látky komerčně dostupné odpovídaly jakostí deklaracím podle norem výrobců, resp. dodavatelů.

36

4.2 Přístroje Mraznička M 595/6015

Calex, Zlaté Moravce

Lednička Ardo

Ardo, Itálie

Analytické váhy, výr.č. 02C.02.00.0D18 Digitální pH-metr GRYF 209S, výr.č. DDHM17148 Elektronická míchačka, výr.č. 1000208 Liberační zařízení DH 02

Sartorius, Göttingen

Magnetická míchačka MM 2A

Laboratorní přístroje, Praha

Ultratermostat Haake L, výr.č. 630414004 Ultrazvuková lázeň, výr.č. 300259

Haake, Berlín

HPLC sestava HP 1200 Series se softwarem ChemStation

Agilent Technologies, USA

Elektron. přístroje, Havlíčkův Brod Variomag Labortechnik, Mnichov UK FAF, Hradec Králové

Tesla, Vráble

Analytický set pro HPLC sestava HP 1200 Series se skládal z izokratické pumpy, degaseru, autosampleru, termostatu a UV/VIS detektoru. Software: ChemStation

4.3 Biologický materiál K pokusům byly pouţity vzorky prasečích jazyků z čerstvě poraţených prasnic, které nebyly nikterak chemicky upraveny, pouze spařeny horkou vodou. Byly sejmuty všechny intra i extraglosální svaly jazyka a na jeho spodině byly také odstraněny příslušné řasy jazyka. Byla vypreparována pouze sublingvální membrána, zpravidla podkovovitého tvaru. Vzorky byly následně konzervovány ve fyziologickém roztoku s 0,002% roztokem azidu sodného po dobu jedné hodiny. Po vyjmutí z roztoku byla část vzorků důkladně osušena, vloţena do polyethylenových sáčků, zatavena a uchována v mrazničce při -20 °C aţ do doby jejich pouţití. Na kaţdý sáček byl vyznačen datum jeho přípravy. Část vzorků byla naloţena do média, které obsahovalo proteolytický enzym trypsin. 37

4.4 Příprava roztoku s azidem sodným Roztok byl pouţit pro konzervaci biologického materiálu. Sloţení: Chlorid sodný………………….90,0 g Čištěná voda…………………..9910,0 g Azid sodný……………………..0,2 g Po naváţení chloridu sodného a azidu sodného byly látky rozpuštěny v příslušném objemu čištěné vody.

4.5 Příprava roztoku pro trypsinizaci Jednalo

se

o

roztok

trypsinu

v 0,9%

roztoku

chloridu

sodného

vytemperovaného na bakteriologickém termostatu na 37°C. Vzorek membrány byl poloţen na hladinu roztoku, popřípadě za pouţití podpůrné síťky. Po určitém časovém intervalu (18 aţ 36 hodin) okulometrickou metodou byla membrána

sejmuta

a

trypsin

deaktivován

alkalickým

roztokem

fosforečnanového pufru o pH=7,6. Membrána byla důkladně promyta vodou.

4.6 Příprava mobilní fáze pro stanovení kofeinu Jako mobilní fáze byla pouţita směs vody a metanolu v poměru 75:25 s obsahem 0,2%kyseliny mravenčí. K přípravě bylo k dispozici 1400 g 10% metanolu, 100%metanol a 85%kyselina mravenčí. Výpočet: 10 x 1400 + 100 x A = (1400 + A) x 25 75 A = 21 000 A = 280 ml 100% CH3OH Sloţení: Metanol 10%

1400 g

Metanol 100%

280 g

Kyselina mravenčí 85%

3,95 g 38

4.7 Příprava mobilní fáze pro kyselinu listovou Dle ČL 2002 – Dopl. 2003: Směs objemových dílů metanolu R a roztoku obsahujícího

dihydrogenfosforečnan

draselný

R

(11,16 g/l)

a hydrogenfosforečnan draselný (5,50 g/l) (12 + 88). V našem případě byla pouţita koncentrace 15 + 85, která je výhodnější z hlediska kratších retenčních časů pro kyselinu listovou při optimální ostrosti píků analytu. Před pouţitím byla mobilní fáze vloţena do ultrazvukové lázně k odplynění. Doba byla stanovena podle objemu. Minimálně však 5 minut pro jeden litr fáze. Výpočet: NaH2PO4 : 11,16 g ………………………

1000 ml

A g …………………………….. 4000 ml A = 44,64 g NaH2PO4 Na2HPO4 : 5,50 g …………………………. 1000 ml Bg

…………………………… 4000 ml

B = 22,0 g Na2HPO4 Sloţení: Celkový objem mobilní fáze……………………………………………... 4000 ml Metanolu R ………………………………….......................................... 600 ml Roztok dihydrogenfosforečnanu a hydrogenfosforečnanu ……………3400 ml

4.8 Příprava fosfátového (akceptorového) pufru pH 7,4 Sloţení: Dihydrogenfosforečnan sodný dihydrát ……………….2,1 g/l Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát …………..19,1 g/l Chlorid sodný…………………………………………………..4,4 g/l Azid sodný………………………………………………………0,2 g/l 39

Čištěná voda……………………………………………………900 ml Diazolidinylmočovina95%..................................................0,5 g Byl naváţen dihydrát do 500 ml čištěné vody a dodekahydrát do 400 ml čištěné vody. Bylo rozpuštěno 0,2 g azidu sodného v 500 ml připraveného roztoku dihydrátu a přidáno 200 ml roztoku dodekahydrátu. Hodnota pH byla kontrolována pomocí pH metru postupným přiléváním roztoku dodekahydrátu. Nakonec se přidal chlorid sodný kvůli izotonizaci. Do poţadovaného objemu 1 litr byl pufr doplněn čištěnou vodou a uchován v ledničce. V průběhu vyhodnocování výsledků byly na chromatogramu zaznamenány píky navíc, které dle zjištění byly způsobeny mikrobiální kontaminací fosfátového pufru. Proto bylo nutno přidat do pufru diazolidinylmočovina95%, aby bylo zabráněno mikrobiální kontaminaci.

4.9 Příprava kofeinových standardů (suspenze a roztok) V návaznosti na diplomovou práci26 byly pouţity koncentrace: 10 mg/100 ml, 5 mg/100 ml, 1 mg/100 ml, 0,5 mg/100 ml a 0,1 mg/100 ml. Naváţka kofeinu: mcof = 0,01004 g Postup: Kofein byl po naváţení kvantitativně vpraven do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěn ve 100 ml tris-pufru. Ostatní standardy byly připraveny postupným ředěním základního roztoku.

4.10 Příprava tromethamolového pufru Pufr pH 7,1 byl pouţit pro přípravu kofeinových standardů. Sloţení: Trometamol ……………………………24 g Azid sodný…………………………….0,02 g Voda pro HPLC………………………1000 ml 40

Kyselina chlorovodíková na pH 7,1 Postup: Pevné podíly byly naváţeny a rozpuštěny v 1000 ml ultračisté vody. pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 7,1 pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové, za pouţití digitálního pH metru.

4.11 Příprava vehikul pro kyselinu listovou 1. měření Při prvním měření bylo pouţito 6 vzorků z předem zmraţené sublingvální membrány. Byl vytvořen roztok kyseliny listové, kdy se smíchalo 0,02 g kyseliny listové a 1,98 g FP 7,4 bez močoviny. Nebyla pouţita ţádná nosná membrána. Bylo aplikováno 200 µl toho připraveného roztoku přímo na sublingvální membránu.

2. měření Při druhém měření bylo celkem 32 vzorků sublingvální membrány. 16 vzorků pocházelo ze zmraţené sublingvální membrány a 16 vzorků bylo předem upraveno trypsinizací. Ve druhém měření bylo pouţito celkem 5 vehikul pro kyselinu listovou. Těmito připravenými vehikuly byla naimpregnována přes noc membrána z chitosanu o ploše 1 cm2. Všechny vehikula při impregnaci chitosanu protekla, kromě vehikula PPG/FP 7,4 bez močoviny. 1. vehikulum roztok o sloţení: 0,02 g kyseliny listové + 1,98 g FP 7,4 bez močoviny 2. vehikulum roztok o sloţení: 0,02 g kyseliny listové + 1,98 g roztoku o sloţení 60 ml PPG a 40 ml FP 7,4 bez močoviny (poměr 3:2) 3. vehikulum roztok o sloţení: 0,02 g kyseliny listové + 1,98 g IPM 4. vehikulum 41

roztok o sloţení: 0,02 g kyseliny listové + 1,98 EM1 5. vehikulum roztok o sloţení: 0,02 g kyseliny listové + 1,98 EM2

4.12 Provedení permeačních pokusů Celkem byla provedena 2 měření o počtu 44 buněk. Z toho bylo 6 buněk s kofeinem jako permeačním markerem a 38 buněk s kyselinou listovou jako modelovým léčivem. Byly pouţity dva typy membrán. Buď byla pouţita sublingvální membrána zmraţená a uchovaná při -20 °C nebo trypsinizovaná membrána. U druhého měření byly pouţity i speciální vehikula pro kyselinu listovou. Kaţdý vzorek sublingvální membrány byl upevněn mezi dvě destičky z umělé hmoty s kruhovým výřezem o ploše 1 cm2 (permeační plocha tudíţ činila 1 cm2). Na lícovou stranu sublingvální membrány byl nanesen nejprve standard, v našem případě kofein o objemu 200 µl. Po provedení permeace a odebrání vzorků byl akceptorový pufr vyměněn, membrána opláchnuta v čištěné vodě a vysušena a byla nanesena kyselina listová také o objemu 200 µl. Po nanesení vzorků na membránu byly vzorky následně překryty krycím sklíčkem, aby se zabránilo vysychání. Tato sestava byla upevněna mezi donorovou a akceptorovou část permeační buňky, veškeré spoje byly utěsněny silikonovým filmem. Akceptorová

část

buňky

byla

naplněna

roztokem

fosfátového

(akceptorového) pufru o pH=7,4. Pouţitý objem akceptorového pufru činil 20 ml na kaţdou celu. Zbytkové objemy byly vpraveny do kalibrovaných zkumavek a odečteny s přesností na 0,1 ml. Z těchto údajů byl vypočítán přesný objem akceptorové fáze v kaţdé permeační cele. Takto byly buňky vloţeny do temperované vodní lázně (37°C) a během celého pokus promíchávány magnetickým míchadlem. Navíc byla teplota v lázni kontrolována pomocí rtuťového teploměru.

42

Ve stanovených časových intervalech byl odebírán vzorek kofeinu, jako standardu, a kyseliny listové vţdy o objemu 0,6 ml do označených vialek a následně

analyzován

pomocí

HPLC.

Zpracování

chromatografických

záznamů a export dat pro následné pracování realizoval Mgr. Pavel Berka.

43

Protokol

1

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 16,4

[mg/100ml]

[mg/100ml]

t

Cnk

1 2 3 4 0 0 0 0 0

5,150 8,156 10,945 13,152 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

5,150 8,345 11,250 13,564 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Donor:

0,0%

Měření:

Kofein

Qt

844,6 1 368,5 1 845,0 2 224,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

422,3 684,3 922,5 1 112,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 439,1 422,3 669,9 684,3 900,7 922,5 1131,5 1112,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

1 200 Qt [mg/cm2]

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

2

Subling.

800

400

0 0

1

2

3

44

4

5

6 t [h]

4 230,8027 208,3084 0,997501

Protokol

2

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

[mg/100ml]

t

Cnk

1 2 3 4 0 0 0 0 0

8,459 18,906 27,469 28,104 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

8,459 19,176 28,081 29,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Donor:

0,0%

Měření:

Kofein

Qt

1 590,3 3 605,1 5 279,2 5 452,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

795,1 1 802,5 2 639,6 2 726,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 795,1 795,1 1802,5 1802,5 #REF! #REF! 2726,0 2726,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 000 2 500 2 000

Qt [mg/cm2]

t

1 2 #REF! 4 0 0 0 0 0

2

Subling.

1 500 1 000 500 0 0

1

2

3

45

4

5

6 t [h]

3 617,6292 333,4154 0,97693

Protokol

3

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

0

[mg/100ml]

t

Cnk

1 2 3 4 0 0 0 0 0

1,333 4,121 7,490 10,329 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

1,333 4,163 7,623 10,572 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Donor:

0,0%

Měření:

0 Kofein

Qt

250,6 782,7 1 433,1 1 987,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

125,3 391,4 716,5 993,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 117,1 125,3 410,2 391,4 703,3 716,5 996,3 993,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

1 200 1 000 Qt [mg/cm2]

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

Subling.

0 netrypsin.

800 600 400 200 0 0

1

2

3

46

4

5

6 t [h]

4 293,0676 -175,922 0,999297

Protokol

4

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,4

[mg/100ml]

1 2 3 4 0 0 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,113 0,265 0,399 0,498 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

0,113 0,269 0,408 0,512 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Donor:

0,0%

Měření:

0 Kofein

Qt

19,7 46,8 71,0 89,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

9,9 23,4 35,5 44,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 10,9 9,9 22,5 23,4 34,1 35,5 45,8 44,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

50 40 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

30 20 10 0 0

1

2

3

47

4

5

6 t [h]

4 11,62114 -0,71806 0,996142

Protokol

5

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 20

[mg/100ml]

1 2 3 4 0 0 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,015 0,061 0,127 0,188 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

0,015 0,061 0,129 0,192 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Donor:

0,0%

Měření:

0 Kofein

Qt

3,0 12,2 25,7 38,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

1,5 6,1 12,9 19,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 0,9 1,5 6,9 6,1 12,9 12,9 18,9 19,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

50 40 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

30 20 10 0 0

1

2

3

48

4

5

6 t [h]

4 5,978501 -5,03604 0,99698

Protokol

6

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,2

[mg/100ml]

1 2 3 4 0 0 0 0 0

t

2 3 4 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,015 0,040 0,071 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0

Qt

0,000 0,015 0,040 0,072 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Donor:

0,0%

Měření:

0 Kofein

Qt

0,0 2,7 7,3 13,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 1,3 3,7 6,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 1,2 1,3 3,9 3,7 6,5 6,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

50 40 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

30 20 10 0 0

1

2

3

49

4

5

6 t [h]

3 2,614445 -3,98307 0,997879

Protokol

7

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 16

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

Cnk 0,001 0,061 0,111 0,179 3,395 7,611 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

0,001 0,061 0,114 0,184 3,402 7,739 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Donor:

FP 7,4

Měření:

Fol. acid

Qt

0,2 9,8 18,2 29,4 544,4 1 238,2 0,0 0,0 0,0

0,1 4,9 9,1 14,7 272,2 619,1 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 0,0 0,1 4,8 4,9 9,6 9,1 14,4 14,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

20 15 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

10 5 0 0

1

2

3

49

4

5

6 t [h]

4 4,80187 -4,81526 0,998423

Protokol

8

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 19

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

Cnk 0,841 2,069 3,212 4,225 7,386 7,133 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

0,841 2,095 3,278 4,328 7,523 7,370 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Donor:

FP 7,4

Měření:

Fol. acid

Qt

159,8 398,1 622,8 822,4 1 429,4 1 400,4 0,0 0,0 0,0

79,9 199,1 311,4 411,2 714,7 700,2 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 79,9 79,9 199,1 199,1 311,4 311,4 411,2 411,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

500 400 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

300 200 100 0 0

1

2

3

50

4

5

6 t [h]

4 110,6184 -26,1483 0,999223

Protokol

9

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 1,137 1,915 1,772 2,075 8,239 10,052 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

1,137 1,953 1,837 2,136 8,310 10,329 0,000 0,000 0,000

Donor:

FP 7,4

Měření:

0 Fol. acid

Qt

204,7 351,6 330,6 384,5 1 495,9 1 859,3 0,0 0,0 0,0

102,4 175,8 165,3 192,3 747,9 929,6 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 120,1 102,4 146,0 175,8 171,9 165,3 197,8 192,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

1 000 800 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

600 400 200 0 0

1

2

3

51

4

5

6 t [h]

4 25,9209 94,13644 0,851244

Protokol

10

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

1 2 3 4 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,831 1,233 1,807 1,966 7,418 8,803 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

0,831 1,263 1,851 2,032 7,490 9,067 0,000 0,000 0,000

Donor:

FP 7,4

Měření:

0 Fol. acid

Qt

141,2 214,7 314,7 345,4 1 273,3 1 541,5 0,0 0,0 0,0

70,6 107,3 157,4 172,7 636,6 770,7 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 73,6 70,6 109,2 107,3 144,8 157,4 180,4 172,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

1 000 800 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

600 400 200 0 0

1

2

3

52

4

5

6 t [h]

4 35,6303 37,92388 0,982384

Protokol

11

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,4

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

2 3

0 0 0

0

[mg/100ml] 2

DVdop

Cnk 1,864 0,000 1,280 1,538 4,863 6,445 0,000 0,000 0,000

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

1,864 0,061 1,282 1,580 4,914 6,605 0,000 0,000 0,000

Donor:

FP 7,4

Měření:

0 Fol. acid

Qt

343,0 11,2 235,9 290,6 904,2 1 215,4 0,0 0,0 0,0

171,5 5,6 117,9 145,3 452,1 607,7 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 5,6 5,6 117,9 117,9

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0

1 000 800 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

600 400 200 0 0

1

2

3

53

4

5

6 t [h]

2 112,3505 -219,109 1

Protokol

12

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,8

[mg/100ml]

1 2 3 4 21 43 0 0 0

t

4 21 43 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,000 0,000 0,000 1,246 4,830 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0

Qt

0,000 0,000 0,000 0,000 1,246 4,872 0,000 0,000 0,000

Donor:

FP 7,4

Měření:

0 Fol. acid

Qt

0,0 0,0 0,0 0,0 221,7 867,3 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0 110,9 433,6 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) -29,2 0,0 162,7 110,9 411,1 433,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

1 000 800 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

600 400 200 0 0

6

12

18

54

24

30

36

42

48 t [h]

3 11,28937 -74,3903 0,979846

Protokol

13

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,6

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 8 0 0 0 0

Cnk 3,264 3,401 3,453 3,670 5,517 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

3,264 3,506 3,566 3,785 5,639 0,000 0,000 0,000 0,000

netryptin.

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

Fol.acid

Qt

607,0 652,1 663,3 704,0 1 048,9 0,0 0,0 0,0 0,0

303,5 326,1 331,6 352,0 524,5 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 305,7 303,5 320,8 326,1 335,9 331,6 351,0 352,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

400 300 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

200 100 0 0

2

4

55

6

8

10 t [h]

4 7,553924 290,5439 0,97809

Protokol

14

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

Cnk 0,381 0,644 1,115 1,968 8,950 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,381 0,658 1,138 2,009 9,021 0,000 0,000 0,000 0,000

netryptin.

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

Fol.acid

Qt

64,8 111,8 193,5 341,5 1 533,5 0,0 0,0 0,0 0,0

32,4 55,9 96,8 170,7 766,8 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 55,9 55,9 96,8 96,8 170,7 170,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

200 150 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

100 50 0 0

2

4

6

8

10 t [h]

56

3 28,70816 -64,4564 0,986414

Protokol

15

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 16,8 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

netryptin. 0

[mg/100ml]

Cnk 1,363 1,481 1,468 1,912 5,037 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

1,363 1,529 1,522 1,966 5,107 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

0 Fol.acid

Qt

228,9 256,9 255,7 330,4 858,0 0,0 0,0 0,0 0,0

114,5 128,4 127,9 165,2 429,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 122,1 128,4 140,5 127,9 158,9 165,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

200 150 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

100 50 0 0

2

4

57

6

8

10 t [h]

3 9,183145 85,40187 0,859167

Protokol

16

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,592 0,915 1,344 1,902 4,312 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,592 0,934 1,374 1,945 4,374 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

0 Fol.acid

Qt

111,4 175,6 258,3 365,7 822,3 0,0 0,0 0,0 0,0

55,7 87,8 129,1 182,9 411,1 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 54,2 55,7 90,9 87,8 127,6 129,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

200 150 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

100 50 0 0

2

4

58

6

8

10 t [h]

3 18,3591 17,44135 0,997398

Protokol

17

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,4

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

Subling.

0

[mg/100ml]

Cnk 0,038 0,111 0,296 0,467 1,039 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,038 0,112 0,299 0,477 1,055 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol.acid

Qt

7,0 20,7 55,1 87,7 194,1 0,0 0,0 0,0 0,0

3,5 10,3 27,5 43,9 97,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 1,8 3,5 13,8 10,3 25,8 27,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 6,014028 -10,2734 0,970429

50 40 Qt [mg/cm2]

t

0 netrypsin.

30

20 10 0 0

2

59

4

6

8

10 t [h]

Protokol

18

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,4

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,088 0,501 0,937 1,242 1,897 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,088 0,504 0,954 1,273 1,938 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol.acid

Qt

16,1 92,7 175,5 234,2 356,6 0,0 0,0 0,0 0,0

8,1 46,3 87,7 117,1 178,3 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 7,5 8,1 47,4 46,3 87,2 87,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

100 80 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

60 40 20 0 0

2

4

60

6

8

10 t [h]

3 19,92099 -32,3025 0,999743

Protokol

19

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 19

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk

2

DVdop

0,060 0,100 0,183 0,287 0,965 0,000 0,000 0,000 0,000

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,060 0,102 0,186 0,293 0,974 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol.acid

Qt

11,5 19,4 35,4 55,7 185,1 0,0 0,0 0,0 0,0

5,7 9,7 17,7 27,9 92,6 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 9,4 9,7 18,4 17,7 27,5 27,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

50 40 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

30 20 10 0 0

2

4

6

61

8

10 t [h]

3 4,534215 -8,78442 0,997504

Protokol

20

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,257 0,538 0,685 0,772 0,945 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,257 0,546 0,702 0,794 0,970 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol.acid

Qt

48,3 102,6 132,0 149,3 182,3 0,0 0,0 0,0 0,0

24,1 51,3 66,0 74,6 91,2 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 52,3 51,3 64,0 66,0 75,6 74,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 5,83215 28,99018 0,989008

100 80

Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

60 40 20 0 0

2

4

6

8

10 t [h]

62

Protokol

21

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

Cnk 0,038 0,062 0,083 0,098 0,154 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,038 0,063 0,085 0,101 0,157 0,000 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Chitosan

EM1

Měření:

Fol. acid

Qt

7,1 11,8 16,0 19,0 29,5 0,0 0,0 0,0 0,0

3,6 5,9 8,0 9,5 14,7 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 6,0 5,9 7,8 8,0 9,6 9,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,899401 2,411441 0,995197

20 15 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

10 5 0 0

63

2

4

6

8

10 t [h]

Protokol

22

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 19,2

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

#REF! 4 6 8 0 0 0 0 0

Cnk 0,065 0,101 0,123 0,139 0,174 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,065 0,103 0,127 0,143 0,178 0,000 0,000 0,000 0,000

netrypsin.

Chitosan

EM1

Měření:

Fol. acid

Qt

12,5 19,7 24,3 27,4 34,3 0,0 0,0 0,0 0,0

6,3 9,8 12,2 13,7 17,1 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) #REF! #REF! 9,8 9,8 12,2 12,2 13,7 13,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,963283 6,120809 0,993208

20 15 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

10 5 0 0

64

2

4

6

8

10 t [h]

Protokol

23

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,028 0,045 0,058 0,067 0,118 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,028 0,046 0,060 0,069 0,120 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM1

Měření:

0 Fol. acid

Qt

5,3 8,6 11,3 13,0 22,7 0,0 0,0 0,0 0,0

2,7 4,3 5,6 6,5 11,3 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 4,4 4,3 5,5 5,6 6,6 6,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,555388 2,147385 0,993327

20 15 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

10 5 0 0

2

65

4

6

8

10 t [h]

Protokol

24

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

Subling.

0

[mg/100ml]

Cnk 0,070 0,084 0,087 0,088 0,096 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,070 0,086 0,090 0,091 0,099 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM1

Měření:

0 Fol. acid

Qt

13,2 16,2 16,9 17,0 18,6 0,0 0,0 0,0 0,0

6,6 8,1 8,5 8,5 9,3 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 8,2 8,1 8,4 8,5 8,6 8,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,100803 7,75973 0,934336

20 15 Qt [mg/cm2]

t

0 netrypsin.

10 5 0 0

2

66

4

6

8

10 t [h]

Protokol

25

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,000 0,015 0,017 0,027 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,000 0,000 0,015 0,018 0,028 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt 0,0 0,0 2,8 3,3 5,2 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 1,4 1,7 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 0,2 0,0 1,0 1,4 1,9 1,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,4177 -1,47774 0,928385

20 15 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

10 5 0 0

2

4

6

8

10 t [h]

67

Protokol

26

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,4

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,018 0,022 0,025 0,050 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,000 0,018 0,023 0,026 0,051 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt 0,0 3,1 4,0 4,6 8,8 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 1,6 2,0 2,3 4,4 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 1,6 1,6 1,9 2,0 2,3 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

20 15 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

10 5 0 0

2

4

68

6

8

10 t [h]

3 0,178256 0,873984 0,994208

Protokol

27

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,4

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,017 0,017 0,019 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,000 0,017 0,018 0,019 0,032 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt 0,0 2,9 3,1 3,3 5,5 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 1,4 1,5 1,7 2,7 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 1,4 1,4 1,6 1,5 1,7 1,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,054984 1,226292 0,998324

20 15 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

0 netrypsin.

10 5 0 0

2

69

4

6

8

10 t [h]

Protokol

28

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0 0

Subling.

0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,000 0,016 0,023 0,042 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,000 0,000 0,016 0,023 0,043 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt 0,0 0,0 3,1 4,4 8,1 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 1,5 2,2 4,1 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 0,2 0,0 1,2 1,5 2,3 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,544334 -2,02523 0,971946

8

10 t [h]

20 15 Qt [mg/cm2]

t

0 netrypsin.

10 5

0 0

2

70

4

6

Protokol

29

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

Cnk 0,215 0,908 1,809 2,802 4,864 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,215 0,915 1,838 2,861 4,955 0,000 0,000 0,000 0,000

trypsin.

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

Fol. acid

Qt

40,4 172,0 345,5 537,8 931,5 0,0 0,0 0,0 0,0

20,2 86,0 172,7 268,9 465,8 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 84,4 86,0 175,9 172,7 267,3 268,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 45,72403 -98,459 0,999558

300 250 200

Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

150 100 50 0 0

2

4

6

8

10 t [h]

71

Protokol

30

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

Cnk 0,239 0,769 1,428 2,193 4,977 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,239 0,776 1,453 2,239 5,048 0,000 0,000 0,000 0,000

trypsin.

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

Fol. acid

Qt

45,0 145,9 273,2 421,0 949,1 0,0 0,0 0,0 0,0

22,5 73,0 136,6 210,5 474,5 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 73,0 73,0 136,6 136,6 210,5 210,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 34,3858 -66,2991 0,999063

300 250 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

200 150 100 50 0 0

2

72

4

6

8

10 t [h]

Protokol

31

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,470 0,676 2,224 3,464 5,574 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,470 0,692 2,247 3,539 5,692 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

0 Fol. acid

Qt

84,5 124,5 404,5 637,0 1 024,5 0,0 0,0 0,0 0,0

42,3 62,3 202,2 318,5 512,2 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 66,2 62,3 194,3 202,2 322,4 318,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 64,05373 -189,993 0,998578

350 300 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

250 200 150 100 50 0 0

2

73

4

6

8

10 t [h]

Protokol

32

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,2 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,338 1,046 2,102 3,247 5,609 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,338 1,058 2,139 3,322 5,725 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

FP 7,4+PG

Měření:

0 Fol. acid

Qt

58,2 181,9 367,9 571,3 984,7 0,0 0,0 0,0 0,0

29,1 91,0 183,9 285,7 492,3 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 89,5 91,0 186,9 183,9 284,2 285,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 48,67165 -105,174 0,999665

350 300 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

250 200 150 100 50 0 0

2

74

4

6

8

10 t [h]

Protokol

33

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,935 1,673 1,838 1,855 2,381 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,935 1,702 1,892 1,916 2,442 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol. acid

Qt

175,8 320,1 355,8 360,2 459,1 0,0 0,0 0,0 0,0

87,9 160,0 177,9 180,1 229,6 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 97,0 87,9 141,9 160,0 186,9 177,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 22,49357 51,96477 0,944375

250 200 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

150 100 50 0 0

2

75

4

6

8

10 t [h]

Protokol

34

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 1,102 1,156 1,580 1,766 2,744 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

1,102 1,191 1,618 1,818 2,802 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol. acid

Qt

207,3 223,9 304,1 341,8 526,8 0,0 0,0 0,0 0,0

103,6 111,9 152,1 170,9 263,4 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 98,3 103,6 122,5 111,9 146,8 152,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 12,10622 74,11862 0,935088

200 150 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

100 50 0 0

2

76

4

6

8

10 t [h]

Protokol

35

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,178 0,204 0,242 0,241 0,250 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,178 0,209 0,249 0,249 0,258 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol. acid

Qt

33,4 39,4 46,8 46,9 48,4 0,0 0,0 0,0 0,0

16,7 19,7 23,4 23,4 24,2 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 16,6 16,7 19,9 19,7 23,3 23,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 1,673506 13,23169 0,998139

30

24 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

18 12 6 0 0

2

77

4

6

8

10 t [h]

Protokol

36

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,2 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

2 4 6 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,809 1,154 1,243 1,280 1,780 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,809 1,181 1,282 1,322 1,824 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

IPM

Měření:

0 Fol. acid

Qt

147,2 214,9 233,4 240,7 331,9 0,0 0,0 0,0 0,0

73,6 107,5 116,7 120,3 166,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 77,7 73,6 99,3 107,5 120,8 116,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 10,76583 56,19916 0,949541

200

Qt [mg/cm2]Qt [mg/cm2]

t

Subling.

150 200 100 150 50 100

0 50 0

2

4

6

8

10 t [h]

0 0

2

78

4

6

8

10 t [h]

Protokol

37

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

Cnk 0,023 0,036 0,042 0,047 0,098 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,023 0,037 0,043 0,049 0,100 0,000 0,000 0,000 0,000

trypsin.

Chitosan

EM1

Měření:

Fol. acid

Qt

4,3 6,9 8,1 9,2 18,7 0,0 0,0 0,0 0,0

2,1 3,4 4,1 4,6 9,4 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 3,5 3,4 4,0 4,1 4,6 4,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,283319 2,323401 0,998995

15 12 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

9 6 3 0 0

2

79

4

6

8

10 t [h]

Protokol

38

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

Cnk 0,037 0,049 0,063 0,074 0,129 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,037 0,050 0,065 0,077 0,131 0,000 0,000 0,000 0,000

trypsin.

Chitosan

EM1

Měření:

Fol. acid

Qt

6,3 8,5 11,1 13,0 22,3 0,0 0,0 0,0 0,0

3,1 4,2 5,5 6,5 11,2 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 4,2 4,2 5,5 5,5 6,5 6,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,571218 2,003736 0,99722

15 12 Qt [mg/cm2]

t

[mg/100ml]

Subling.

9 6 3 0 0

2

80

4

6

8

10 t [h]

Protokol

39

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,4 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,033 0,055 0,068 0,074 0,106 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,033 0,057 0,070 0,077 0,109 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM1

Měření:

0 Fol. acid

Qt

5,7 9,8 12,2 13,3 18,9 0,0 0,0 0,0 0,0

2,8 4,9 6,1 6,7 9,5 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 5,0 4,9 5,9 6,1 6,8 6,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,433822 3,294511 0,978464

10 8 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

6 4 2 0 0

2

81

4

6

8

10 t [h]

Protokol

40

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 16,4 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,034 0,066 0,083 0,096 0,140 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,034 0,068 0,086 0,099 0,144 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM1

Měření:

0 Fol. acid

Qt

5,6 11,1 14,0 16,3 23,6 0,0 0,0 0,0 0,0

2,8 5,5 7,0 8,1 11,8 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 5,6 5,5 6,9 7,0 8,2 8,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,650259 2,998653 0,997102

15 12 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

9 6 3 0 0

2

82

4

6

8

10 t [h]

Protokol

41

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,4 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,022 0,030 0,038 0,085 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Ck

Qt

0,000 0,022 0,030 0,039 0,087 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt

0,0 4,0 5,6 7,2 15,9 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 2,0 2,8 3,6 8,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 2,0 2,0 2,8 2,8 3,6 3,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,410561 0,334937 0,99998

10 8 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

6 4 2 0 0

83

2

4

6

8

10 t [h]

Protokol

42

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 18,8 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,000 0,024 0,033 0,075 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,000 0,000 0,024 0,034 0,076 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt

0,0 0,0 4,5 6,4 14,3 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 2,2 3,2 7,1 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 2,2 2,2 3,2 3,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

2 0,49056 -0,71332 1

10 8 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

6 4 2 0 0

2

84

4

6

8

10 t [h]

Protokol

43

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,016 0,024 0,025 0,027 0,046 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,016 0,024 0,026 0,027 0,047 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt 2,7 4,1 4,4 4,7 8,1 0,0 0,0 0,0 0,0

1,3 2,1 2,2 2,3 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 2,1 2,1 2,2 2,2 2,3 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,069143 1,784668 0,996323

10 8 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

6 4 2 0 0

2

85

4

6

8

10 t [h]

Protokol

44

Vo

[ml]

t Cnk

[h]

DVdop Ck

[ml]

Qt Qt

[mg]

ve Vo

[mg]

ve Vo / 1cm

Vo = 17,6 0

[mg/100ml]

2 4 6 8 22 0 0 0 0

t

4 6 8 0 0 0 0

trypsin. 0

[mg/100ml]

Cnk 0,000 0,027 0,035 0,039 0,094 0,000 0,000 0,000 0,000

2

DVdop

Ck

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0

Qt

0,000 0,027 0,036 0,041 0,096 0,000 0,000 0,000 0,000

Chitosan

EM2

Měření:

0 Fol. acid

Qt

0,0 4,8 6,4 7,2 16,8 0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 2,4 3,2 3,6 8,4 0,0 0,0 0,0 0,0

Parametry regrese

Qt (exp) Qt (teor) 2,5 2,4 3,1 3,2 3,6 3,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Počet bodů Flux Abs. člen Korelační koef.

n= J= q= r=

3 0,293853 1,293465 0,983374

10 8 Qt [mg/cm2]

t

Subling.

6 4 2 0 0

2

86

4

6

8

10 t [h]

6 VÝSLEDKY A DISKUSE Údaje

získané

z permeačních

pokusů

byly

zpracovány

postupem

standardizovaným na katedře farmaceutické technologie UK FAF v Hradci Králové. Stručně vyjádřeno, byly sestaveny časové průběhy koncentrace analytu v jednotlivých buňkách (permeačních závislostí) příslušných měření. Jednalo se

konkrétně

o

závislost

permeovaného

kofeinu

a

kyseliny

listové

v akceptorové fázi na čase. Tato závislost byla vyjádřena také graficky (viz. 5 Dokumentace). Ze

sestavené závislosti bylo moţno odečíst přímkovou část průběhu

permeace kofeinu a kyseliny listové a vypočítat směrnici tohoto úseku. Tím byl zároveň vyčíslen flux J [ µg /cm2. h-1] kofeinu a kyseliny listové. Ve výsledcích a následném hodnocení je povaţován za hlavní vyhodnocovaný parametr. Tab. 6.1 Výsledky permeace kofeinu a kyseliny listové netrypsinizovanou sublingvální membránou z FP 7,4 Flux [µg /cm2. h-1] KOFEIN

KYS. LISTOVÁ

230,8

4,8

617,6

110,6

293,1

25,9

11,6

35,6

6,0

112,4

2,6

10,1

J= 193,6

J= 71,1

sd= 161,4

sd= 46,8 87

Dílčí hodnoty pro jednotlivé permeační buňky jsou uváděny v Tab. 1 a následujících tabulkách, jak pro kofein tak kyselinu listovou. Průměrné hodnoty fluxů a jejich směrodatná odchylka jsou v tabulkách zvýrazněny tučný písmem, resp. kurzívou. Z uvedených hodnot fluxů a následně vypočítané průměrné hodnoty J fluxu a její směrodatné odchylky sd je patrné, ţe průměrná hodnota fluxu pro kofein jako marker integrity membrány je větší neţ pro kyselinu listovou jako hlavní hodnocený permeant. Permeační podmínky byly pro obě látky stejné. V pořadí 1. a 6. hodnota fluxu u kyseliny listové nebyla zahrnuta do výpočtu průměru (ani směrodatné odchylky) vzhledem k tomu, ţe podklad z průběhu permeace vzbuzoval pochybnosti. Proto byly tyto hodnoty vyškrtnuty Tab. 6.2 Výsledky permeace kysliny listové netrypsinizovanou-mraţenou a trypsinizovanou sublingvální membránou z FP 7,4/PPG z donorové membrány chitosanu Flux [ µg /cm2. h-1] KYS. LISTOVÁ

KYS. LISTOVÁ

NETRYPSIN.

TRYPSIN.

7,6

45,7

28,7

34,4

9,2

64,1

18,4

48,7

J= 16,0

J= 48,2

sd= 9,7

sd= 12,2

Při porovnání permeační charakteristiky sublinguálních membrán, které byly pouţity k permeaci kyseliny listové, je v daném případě, v rámci experimentu vlastně jediném, hodnota fluxu u trypsinizované membrány větší neţ u netrypsinizované. Hodnota fluxu mohla být ovlivněna i samotným vehikulem. 88

Především propylenglykol můţe být v tomto směru aktivní a urychlil průnik přes membránu trypsinizovanou více. Ta totiţ můţe mít strukturu na jeho přídavek citlivější.

Tab. 6.3 Výsledky permeace kyseliny listové netrypsinizovanou-mraţenou a trypsinizovanou sublingvální membránou z IPM z donorové membrány chitosanu. 2

-1

Flux [ µg /cm . h ] KYS. LISTOVÁ

KYS. LISTOVÁ

NETRYPSIN.

TRYPSIN.

6,0

22,5

19,9

12,1

4,5

1,7

5,8

10,8

J= 9,1

J= 11,8

sd= 7,3

sd= 8,5

Z uvedených výsledků můţeme konstatovat, ţe průměrné hodnoty fluxů kyseliny listové u obou membrán jsou v zásadě stejné. Hodnota fluxu J z IPM nebyla ovlivněna charakterem membrány, tedy tím, jestli byla před permeací trypsinizovaná nebo nikoli. Následující Tab. 6.4 poskytuje výsledky získané při pouţití disperzního vehikula a kyseliny listové. U tohoto disperzního vehikula označeného jako EM1 je z výsledků průměrných hodnot fluxů J patrný výrazný zpomalovací efekt. Parametry samotných porovnávaných membrán jsou opět stejné, bez vlivu trypsinizace sublingvální membrány.

89

Tab. 6.4 Výsledky permeace kyseliny listové netrypsinizovanou-mraţenou a trypsinizovanou sublingvální membránou z EM1 z donorové membrány chitosanu. 2

-1

Flux [ µg /cm . h ] KYS. LISTOVÁ

KYS. LISTOVÁ

NETRYPSIN.

TRYPSIN.

0,9

0,3

1,0

0,6

0,6

0,4

0,1

0,7

J= 0,6

J= 0,5

sd= 0,4

sd= 0,2

Tab. 6.5 Výsledky permeace kyseliny listové netrypsinizovanou-mraţenou a trypsinizovanou sublingvální membránou z EM2 z donorové membrány chitosanu. Flux [ µg /cm2. h-1] KYS. LISTOVÁ

KYS. LISTOVÁ

NETRYPSIN.

TRYPSIN.

0,4

0,4

0,2

0,5

0,1

0,1

0,5

0,3

90

J= 0,3

J= 0,3

sd= 0,2

sd= 0,2

Také v posledním případě, jak je uvedeno v Tab. 6.5, pokud byla jako vehikulum pro kyselinu listovou pouţita soustava EM2, je patrný výrazný zpomalovací efekt. Průměrné hodnoty fluxu se od sebe v závislosti na typu pouţité sublingvální membrány neliší, stejně jak tomu bylo u předchozích výsledků s EM1.

Graf. 6.1 Souhrnné výsledky jednotlivých průměrných hodnot fluxů pro kofein a kyselinu listovou s pouţitými druhy membrán a typy vehikul (směrodatné odchylky jsou vyznačeny).

Ze sloupcového grafu je patrné, ţe největší hodnotu fluxu vykazuje kofein, při permeaci přes netrypsinizovanou-mraţenou membránu z vehikula FP 7,4. Za stejných podmínek probíhala i permeace kyseliny listové, hodnoty jejích fluxů jsou ovšem výrazně niţší neţ u kofeinu.

91

Pokud bylo pouţito vehikulum FP 7,4/PPG, kdy byla hodnocena pouze permeace kyseliny listové, byl nárůst fluxu větší u trypsinizované membrány. Tento fakt je pravděpodobně ovlivněn i samotným vehikulem, a to především sloţkou PPG. U vehikula IPM byly hodnoty fluxu u kyseliny listové prakticky stejné. Graf. 6.2 Souhrnné výsledky jednotlivých průměrných hodnot fluxů pro kyselinu listovou s pouţitými druhy membrán a vehikuly EM1 a EM2.

Druhý sloupcový graf zobrazuje jednotlivé průměrné hodnoty fluxu J pro kyselinu listovou a vehikula EM1 a EM2. Oproti pouţití předchozích jednoduchých vehikul je u

těchto disperzních vehikul patrný výrazný

zpomalovací efekt. Hodnoty fluxů nejsou ovlivněny pouţitím jednotlivých typů membrán.

92

7 ZÁVĚRY Pro kofein jako permeační marker a kyselinu listovou jako modelové léčivo v permeačních pokusech s vyuţitím sublingválních membrán byly získány tyto výsledky: 1. Hodnota fluxu pro kofein z FP 7,4 při permeaci sublingvální 2

-1

netrypsinizovanou membránou byla J= 193,6[ µg /cm . h ] ± 161,4 2. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z FP 7, 4 při permeaci sublingvální netrypsinizovanou membránou byla J= 71,1[ µg /cm2. h-1] ± 46,8 Hodnota fluxu pro kofein jako marker integrity membrány je větší neţ pro kyselinu listovou za stejných permeačních podmínek. 3. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z FP 7,4/PPG při permeaci sublingvální netrypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu byla J= 16,0[ µg /cm2. h-1] ± 9,7 4. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z FP 7,4/PPG při permeaci sublingvální

trypsinizovanou

membránou

z donorové

membrány

chitosanu byla J= 48,2[ µg /cm2. h-1] ± 12,2 Hodnota fluxu je větší u sublingvální trypsinizované membrány, neţ u netrypsinizované. Hodnota fluxu mohla být ovlivněna i samotným vehikulem. V tomto směru je zřejmě aktivní především propylenglykol 5. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z IPM při permeaci sublingvální netrypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu byla J= 9,1[ µg /cm2. h-1] ± 7,3 6. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z IPM při permeaci sublingvální trypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu byla J= 11,8[ µg /cm2. h-1] ± 8,5 93

Uvedené průměrné hodnoty fluxů kyseliny listové u obou membrán jsou stejné. 7. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z EM1 při permeaci sublingvální netrypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu 2

-1

byla J= 0,6[ µg /cm . h ] ± 0,4 8. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z EM1 při permeaci sublingvální trypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu 2

-1

byla J= 0,5[ µg /cm . h ] ± 0,2 Při pouţití disperzního vehikula pro kyselinu listovou EM1 je z uvedených průměrných hodnot fluxů patrný výrazný zpomalovací efekt. 9. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z EM2 při permeaci sublingvální netrypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu byla J= 0,3[ µg /cm2. h-1] ± 0,2 10. Hodnota fluxu pro kyselinu listovou z EM2 při permeaci sublingvální trypsinizovanou membránou z donorové membrány chitosanu byla J= 0,3[ µg /cm2. h-1] ± 0,2 Také v tomto případě je z uvedených průměrných hodnot fluxů pro kyselinu listovou při pouţití vehikula EM2 patrný výrazný zpomalovací efekt.

94

8 ABSTRAKT Diplomová

práce

podává

v první

části

obecný

přehled

informací

o sublingválním podání léčiv. V kontextu s testovaným permeantem stručně charakterizuje jednotlivé skupiny vitamínů. V druhé části konkrétněji popisuje kyselinu listovou ve funkci vitamínu, její moţné uplatnění při prevenci vrozených vývojových vad a jejímu protektivnímu účinku na kardiovaskulární systém. Experimentální část je zaměřena na permeaci kofeinu jako permeačního markeru a kyseliny listové jako modelového léčiva přes sublingvální membrány netrypsinizované-mraţené či trypsinizované. Za jeden z hlavních výsledků lze povaţovat změření hodnot permeace kyseliny listové a vlivu pouţitého typu sublingvální membrány. Další z hlavních výsledků jsou hodnoty fluxů kyseliny listové z disperzních vehikul EM1 a EM2. U disperzního vehikula EM1 byla hodnota pro sublingvální netrypsinizovanou membránu J= 0,6[ µg /cm2. h-1] ± 0,4 a pro sublingvální trypsinizovanou membránu byla J= 0,5[ µg /cm2. h-1] ± 0,2. Pro disperzní vehikulum EM2 sublingvální netrypsinizovanou membránu byla hodnota

J= 0,3[ µg /cm2. h-1] ± 0,2 a pro sublingvální trypsinizovanou membránu byla J= 0,3[ µg /cm2. h-1] ± 0,2. Tato hodnota fluxu je ve srovnání s jednoduchými kapalnými vehikuly (např. IPM) velmi nízká. Z toho vyplývá významný zpomalovací efekt těchto disperzních soustav. Tohoto faktu lze vyuţít pro formulaci umoţňující zmírnění vedlejších účinků sublingválně podaných léčiv.

95

9 ABSTRACT Diploma thesis deals with information about sublingual administration of drugs in the first part. In the context with the tested permeant briefly describes individual vitamins groups. In the second part more specifically describes folic acid in the vitamin function and possible use in prevention of the congenital evolution defects and its protective effect on the cardiovascular system. Experimental part is aimed at caffeine permeation as a marker and folic acid as model drug over sublingual membrane non-trypsinized-frozen or trypsinized. As one of the main results it can be considered measuring of the values of folic acid permeation and the effect of used type of sublingual membrane. It is possible to consider measuring of the value folic acid flux values from dispersion vehicles EM1 and EM2 to be one the second main results. In dispersion vehicle EM1 was value for sublingual non-trypsinized membrane

J= 0,6 [µg /cm2. h-1] ± 0,4 and for sublingual trypsinized membrane was J= 0,5 [µg /cm2. h-1] ± 0,2. For dispersion vehicle EM2 sublingual non-trypsinized membrane has value J= 0,3 [µg /cm2. h-1] ± 0,2 and for sublingual trypsinized membrane the same. This flux value compared with simple liquid vehicle (e.g. IPM) is low. This implies significant retardation effect of the dispersion systems. This fact makes possible to use the formulation for reduction of sublingual drugs side effects.

96

10 POUŽITÉ ZKRATKY A SYMBOLY PPG IPM FP 7,4

propylenglykol isopropyl-myristát fosfátový (akceptorový) pufr pH = 7,4 emulze č. 1 emulze č. 2 sublingvální netrypsinizovaná membrána sublingvální trypsinizovaná membrána kyselina listová kofein polyuretan flux permeantu, průměrný flux permeantu nekorigovaná koncentrace permeantu v akceptorové fázi korigovaná koncentrace permenatu v akceptorové fázi čas mnoţství permeantu prošlého sublingvální membránou mnoţství permeantu prošlého přes 1 cm2 sublinguální membrány směrodatná odchylka korelační koeficient počet naměřených bodů celkové mnoţství akceptorové fáze mnoţství doplňované akceptorové fáze

EM1 EM2 Subling. netrypsin. Subling. trypsin. Fol. Acid K Polyur. J, J [ µg /cm2 . h-1] Cnk [mg /100 ml] Ck [mg /100 ml] t [hod] Qt [ µg ] Qt [ µg /cm2]

sd r n Vo [ml] ΔVdop [ml] 97

11 LITERATURA 1

KLEPÁČEK, I.; MAZÁNEK, J. Klinická anatomie ve stomatologii. 1. vyd. Praha:

Grada, 2001. 331 s. ISBN 80–716–77-2.

2

ZÁBRODSKÝ; S.; ŠVEJDA, J. Ústa ve zdraví a nemoci. 2. vyd. Praha: Avicenum,

1986. 172 s. ISBN 08–071–86.

3

FRAGNER, J. Vitamíny, jejich chemie a biochemie. 1. vyd. Praha: Nakladatelství

Československé akademie věd, 1961. díl 1. 647 s. díl. 2. 657 -1297 s.

4

KODÍČEK, M. Vitaminy. Biochemické pojmy : výkladový slovník [online]. Praha: VŠCHT Praha, 2007 [cit. 2009-11-17]. Dostupné z

5

MINDELL, E.; MUNDISOVÁ H. Nová vitamínová bible. 2. vyd. Praha: Ikar, 2006. 572 s. ISBN 80–249–0744-5

6

HYNIE, S. Speciální farmakologie. Díl VI. Hormony a vitamíny. 2. vyd. Praha: Karolinum, 2002. 202 s. ISBN 80–246–0416-7

7

VOKURKA, M.; HUGO J. Velký lékařský slovník. 6. vyd. Praha: Maxdorf, 2006. 1017 s. ISBN 80–7345–105-0

8

BURIANOVÁ, T. Vitamíny rozpustné v tucích [online]. c2009, poslední revize 11. 11 2009 [cit. 2009-11-16]. Dostupné z . 98

9

WENKE, M.; HYNIE S.; MRÁZ, M. Pokroky ve farmakologii hormonů, tkáňových působků a vitamínů. 1. vyd. Praha: SPN, 1981. 185 s.

10

LINCOVÁ, D.; FARGHALI, H. Základní a aplikovaná farmakologie. 2. vyd. Praha: Galén, 2007. 672 s. ISBN 978–80–7262–373–0

11

MLADĚNKA, P. Seminární cvičení z farmakologie – vitamíny, anémie. UKFAF v Hradci Králové, 2008 - 2009

12

SCHREIBER, V. Vitamíny kdy – jak – proč – kolik. 1. vyd. Jinočany: Nakladatelství a vydavatelství H&H, 1993. 112 s. ISBN 80–85787–17–2.

13

BURIANOVÁ, T. Vitamíny rozpustné ve vodě [online]. c2009, poslední revize 11. 11 2009 [cit. 2009-11-16]. Dostupné z .

14

BLAKLEY, R. L. The biochemistry of folic acid and related pteridines. Amsterdam: North-Holland, 1969. 569 s.

15

ANDRÉ P. de Leenheer; WILLY E. Lambert; MARCEL G. M. De Ruyter. Modern chromatographic analysis of the vitamins. New York: M.Dekker, 1985., 556 s.

16

Kyselina listová. Pacient. cz, Informace pro pacienty [online]. c2009, poslední revize 27. 3. 2007 [cit. 2009-10-15]. Dostupné z .

99

17

PATOČKOVÁ, M. Vitamín B9 (kyselina listová, acidum folicum). [online]. c2009, poslední revize 18. 11 2009 [cit. 2009-11-19]. Dostupné z

18

FUKAGAWA, N.; MARTIN, J.; WURTHMANN, A.; PRUE, A.H.; EBSTEIN, D.; O΄ŔOURKE, B.; Sex – related differences in methionine metabolism and plasma homocysteine concentrations[online] 28. 12. 2008 [cit. 2009-11-20]. Dostupné z

19

BURIANOVÁ, T. Kyselina listová (2) [online]. c2009, poslední revize 11. 11 2009 [cit. 2009-11-16]. Dostupné z .

20

ŠANTAVÝ, J. Možnosti prevence a včasné prenatální diagnostiky poruch uzávěru neurální trubice. Olomouc : [s.n.], 1982. 30 s.

21

Vrozené vývojové vady. Genetika – Váš zdroj informací o genetice [online]. 2003-2008 [cit. 2009-10-12]. Dostupné z .

22

Kyselina listová v prevenci vrozených vad. Medicína-odborné fórum lékařů a farmaceutů [online]. 16. 4. 1999 [cit. 2009-11-15]. Dostupné z .

23

Vrozené vývojové vady. Ústav pro péči o matku a dítě [online]. 2004-2009 [cit. 2009-10-12]. Dostupné z .

100

24

ŠÍPEK, A. Vrozené vývojové vady [online]. c2008-2009 [cit. 2009-10-13]. Dostupné z .

25

ŢIŢKA, J. Diagnostika syndromů a malformací. 1. vyd. Praha: Galén, 1994. 414 s. ISBN 80–85824–04–3

26

NEDBÁLKOVÁ, I.; Permeační in vitro studie stability transkarbamu 12 v oleokrémech. Diplomová práce; Hradec Králové, 2008

101